JPWO2019065735A1 - Method of manufacturing fiber or fabric - Google Patents
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Abstract
本発明は、一側面において、タンパク質繊維を含む原料繊維又は原料布帛を用意する第一工程と、前記原料繊維又は前記原料布帛を変形可能な容器に収容し、前記容器内を減圧する第二工程と、減圧された前記容器の外部から前記原料繊維又は前記原料布帛を加熱及び加圧する第三工程と、を含む、繊維又は布帛の製造方法を提供する。In one aspect, the present invention has a first step of preparing a raw material fiber or a raw material cloth containing a protein fiber, and a second step of storing the raw material fiber or the raw material cloth in a deformable container and reducing the pressure inside the container. A method for producing a fiber or a cloth is provided, which comprises a third step of heating and pressurizing the raw material fiber or the raw material cloth from the outside of the decompressed container.
Description
本発明は、繊維又は布帛の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a fiber or a fabric.
タンパク質繊維は、近年の環境保全意識の高まりから、繊維強化プラスチック（ＦＲＰ）等の複合材料に使用されるガラス繊維、炭素繊維等の繊維の代替繊維として期待されている。複合材料に使用されるタンパク質繊維としては、より強度（特に、引張強さ）に優れていることが望ましい。 Protein fibers are expected as substitute fibers for fibers such as glass fibers and carbon fibers used for composite materials such as fiber reinforced plastics (FRP) due to the growing awareness of environmental conservation in recent years. It is desirable that the protein fiber used for the composite material has higher strength (particularly, tensile strength).
特許文献１には、被処理繊維の表面を、中性グルコマンナンを有効成分とする繊維強度向上剤で処理することを特徴とする繊維の強度向上方法が開示されている。特許文献２には、表面に抗菌処理した絹繊維を用いて編んだ絹靴下であって、前記抗菌処理は、柿渋の成分と樹脂化合物とを含有した処理液によって行うことを特徴とする絹靴下が開示されている。
しかしながら、特許文献１、２に開示されている加工方法は、繊維強度向上剤、又は処理液といった繊維処理剤を使用することから、必ずしも簡便な方法とはいえない。
However, the processing methods disclosed in
そこで、本発明は、特別な繊維処理剤を用いることなく、タンパク質繊維を含む繊維又は布帛の引張強さを向上させる方法を提供することを目的とする。本発明はまた、特別な繊維処理剤を用いることなく、引張強さに優れるタンパク質繊維を含む繊維又は布帛の製造方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for improving the tensile strength of a fiber or fabric containing protein fibers without using a special fiber treatment agent. Another object of the present invention is to provide a method for producing a fiber or fabric containing a protein fiber having excellent tensile strength without using a special fiber treatment agent.
本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
タンパク質繊維を含む原料繊維又は原料布帛を用意する第一工程と、
前記原料繊維又は前記原料布帛を変形可能な容器に収容し、前記容器内を減圧する第二工程と、
減圧された前記容器の外部から前記原料繊維又は前記原料布帛を加熱及び加圧する第三工程と、
を含む、繊維又は布帛の製造方法。
［２］
前記変形可能な容器がバッグ材である、［１］に記載の繊維又は布帛の製造方法。
［３］
前記タンパク質繊維が構造タンパク質繊維を含む、［１］又は［２］に記載の繊維又は布帛の製造方法。
［４］
前記構造タンパク質繊維がフィブロイン様タンパク質繊維を含む、［３］に記載の繊維又は布帛の製造方法。
［５］
前記フィブロイン様タンパク質繊維がクモ糸フィブロイン様タンパク質繊維を含む、［４］に記載の繊維又は布帛の製造方法。The present invention relates to, for example, the following inventions.
[1]
The first step of preparing raw material fibers or raw material fabrics containing protein fibers,
The second step of storing the raw material fiber or the raw material cloth in a deformable container and depressurizing the inside of the container,
A third step of heating and pressurizing the raw material fiber or the raw material cloth from the outside of the decompressed container, and
A method for producing a fiber or fabric, including.
[2]
The method for producing a fiber or fabric according to [1], wherein the deformable container is a bag material.
[3]
The method for producing a fiber or fabric according to [1] or [2], wherein the protein fiber contains a structural protein fiber.
[4]
The method for producing a fiber or fabric according to [3], wherein the structural protein fiber contains a fibroin-like protein fiber.
[5]
The method for producing a fiber or fabric according to [4], wherein the fibroin-like protein fiber contains a spider silk fibroin-like protein fiber.
本発明によれば、特別な繊維処理剤を用いることなく、タンパク質繊維を含む繊維又は布帛の引張強さを向上させる方法を提供することができる。本発明によればまた、特別な繊維処理剤を用いることなく、引張強さに優れるタンパク質繊維を含む繊維又は布帛の製造方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a method for improving the tensile strength of a fiber or fabric containing protein fibers without using a special fiber treatment agent. According to the present invention, it is also possible to provide a method for producing a fiber or a fabric containing a protein fiber having excellent tensile strength without using a special fiber treatment agent.
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。ただし、本発明は下記実施形態に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. However, the present invention is not limited to the following embodiments.
本実施形態に係る繊維又は布帛の製造方法は、タンパク質繊維を含む原料繊維又は布帛を用意する第一工程と、上記原料繊維又は上記原料布帛を変形可能な容器に収容し、上記容器内を減圧する第二工程と、減圧された上記容器の外部から上記原料繊維又は上記原料布帛を加熱及び加圧する第三工程と、をこの順に備えている。 The method for producing a fiber or cloth according to the present embodiment includes a first step of preparing a raw material fiber or cloth containing protein fiber, and the raw material fiber or the raw material cloth is housed in a deformable container, and the inside of the container is depressurized. A second step of heating and pressurizing the raw material fiber or the raw material fabric from the outside of the decompressed container is provided in this order.
本実施形態に係る繊維又は布帛の製造方法では、まず、タンパク質繊維を含む原料繊維又は原料布帛を用意する（第一工程）。原料繊維は、タンパク質繊維を含む繊維であり、好ましくはタンパク質繊維からなる繊維である。原料布帛は、タンパク質繊維を含む布帛であり、好ましくはタンパク質繊維からなる布帛である。 In the method for producing a fiber or a cloth according to the present embodiment, first, a raw material fiber or a raw material cloth containing a protein fiber is prepared (first step). The raw material fiber is a fiber containing a protein fiber, and is preferably a fiber made of a protein fiber. The raw material cloth is a cloth containing protein fibers, and is preferably a cloth made of protein fibers.
本実施形態に係るタンパク質繊維は、例えば、後述するタンパク質を紡糸した繊維を挙げることができる。タンパク質繊維は、好ましくは構造タンパク質を紡糸した繊維（構造タンパク質繊維）であり、より好ましくはフィブロイン様タンパク質を紡糸した繊維（フィブロイン様タンパク質繊維）、特に好ましくはクモ糸フィブロイン様タンパク質を紡糸した繊維（クモ糸フィブロイン様タンパク質繊維）である。 Examples of the protein fiber according to the present embodiment include fibers obtained by spinning a protein described later. The protein fiber is preferably a fiber in which a structural protein is spun (structural protein fiber), more preferably a fiber in which a fibroin-like protein is spun (fibroin-like protein fiber), and particularly preferably a fiber in which a spider silk fibroin-like protein is spun (a fiber). Spider fibroin-like protein fiber).
タンパク質繊維は、短繊維であっても、長繊維であってもよい。また、タンパク質繊維は、単独で、又は他の繊維と組み合わされて使用されてもよい。すなわち、タンパク質繊維を含む原料繊維を用意する際には、タンパク質繊維のみからなる単独糸若しくはタンパク質繊維と他の繊維とを組み合わせてなる複合糸を、それぞれ単独で用意してもよく、又は上記単独糸若しくは上記複合糸を、それぞれ組み合わせたものを用意してもよい。上記単独糸及び上記複合糸は、短繊維を撚り合わせたスパン糸であってもよく、長繊維を撚り合わせたフィラメント糸であってもよい。上記単独糸及び上記複合糸としては、好ましくはフィラメント糸である。単独糸は、好ましくは撚糸である。撚糸は、Ｚ撚りの撚糸であってもよく、Ｓ撚りの撚糸であってもよい。複合糸には、例えば、混紡糸、混繊糸、及びカバーリング糸等が含まれる。 The protein fiber may be a short fiber or a long fiber. In addition, protein fibers may be used alone or in combination with other fibers. That is, when preparing the raw material fiber containing the protein fiber, a single yarn composed of only the protein fiber or a composite yarn composed of a combination of the protein fiber and another fiber may be prepared individually, or the above-mentioned single yarn may be prepared. A yarn or a combination of the above composite yarns may be prepared. The single yarn and the composite yarn may be spun yarns in which short fibers are twisted, or filament yarns in which long fibers are twisted. The single yarn and the composite yarn are preferably filament yarns. The single yarn is preferably a twisted yarn. The twisted yarn may be a Z-twisted twisted yarn or an S-twisted twisted yarn. The composite yarn includes, for example, a blended yarn, a mixed fiber yarn, a covering yarn and the like.
他の繊維とは、タンパク質を含まない繊維等をいう。他の繊維としては、例えば、ナイロン及びポリエステル等の合成繊維、キュプラ及びレーヨン等の再生繊維、並びに、綿及び麻等の天然繊維が挙げられる。他の繊維と組み合わせて使用する場合には、タンパク質繊維を含む原料繊維全量を基準として、タンパク質繊維の含有量が、好ましくは５質量％以上であり、より好ましくは２０質量％以上であり、更に好ましくは５０質量％以上である。 Other fibers refer to fibers and the like that do not contain proteins. Examples of other fibers include synthetic fibers such as nylon and polyester, regenerated fibers such as cupra and rayon, and natural fibers such as cotton and linen. When used in combination with other fibers, the content of the protein fibers is preferably 5% by mass or more, more preferably 20% by mass or more, and further, based on the total amount of the raw material fibers including the protein fibers. It is preferably 50% by mass or more.
タンパク質繊維を含む原料布帛の種類は特に限定されない。布帛は、例えば、織物、編物、及び不織布等であってよい。布帛は、好ましくは織布である。布帛が織布である場合、その織組織は、例えば、平織、綾織、及び朱子織等であってよい。布帛が編物である場合、その編物は、トリコット、及びラッセル等の経編物であってよく、横編、及び丸編等の緯編物であってよい。 The type of raw material fabric containing protein fibers is not particularly limited. The fabric may be, for example, a woven fabric, a knitted fabric, a non-woven fabric, or the like. The fabric is preferably a woven fabric. When the fabric is a woven fabric, the woven structure may be, for example, plain weave, twill weave, satin weave, or the like. When the fabric is a knit, the knit may be a warp knit such as tricot and Russell, and may be a weft knit such as a horizontal knit and a circular knit.
本明細書において、構造タンパク質とは、生体構造を形成するタンパク質又はそれに由来するタンパク質を示す。すなわち、構造タンパク質は、天然由来の構造タンパク質であってよく、天然由来の構造タンパク質のアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列の一部（例えば、当該アミノ酸配列の１０％以下）を改変した改変タンパク質であってよい。 As used herein, the structural protein refers to a protein that forms a biological structure or a protein derived from the same. That is, the structural protein may be a naturally occurring structural protein, and is a modified protein in which a part of the amino acid sequence (for example, 10% or less of the amino acid sequence) is modified depending on the amino acid sequence of the naturally occurring structural protein. May be.
構造タンパク質は、具体的には、フィブロイン（例えば、スパイダーシルク、カイコシルク等）、コラ−ゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン、並びにこれらに由来するタンパク質等を挙げることができる。 Specific examples of the structural protein include fibroin (for example, spider silk, silkworm silk, etc.), collagen, resilin, elastin, keratin, and proteins derived from these.
フィブロイン様タンパク質（フィブロイン又はそれに由来するタンパク質）としては、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ１］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフの、Ａはアラニン残基を示し、ｎは好ましくは２〜２７の整数であり、４〜２０の整数、８〜２０の整数、１０〜２０の整数、４〜１６の整数、８〜１６の整数、又は１０〜１６の整数であってよい。また式１において、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する）であってもよい。ＲＥＰ１は１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０〜３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰ１は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。フィブロイン様タンパク質としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。Examples of the fibroin-like protein (fibroin or a protein derived from it) include a protein containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP1] m . Here, in the
コラーゲン様タンパク質（コラーゲン又はそれに由来するタンパク質）としては、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式２中、ｐは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。コラーゲン様タンパク質としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。Examples of the collagen-like protein (collagen or a protein derived from it) include a protein containing a domain sequence represented by the formula 2: [REP2] p . Here, in
レシリン様タンパク質（レシリン又はそれに由来するタンパク質）としては、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式３中、ｑは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ−Ｊ−Ｊ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、好ましくはＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基である。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、好ましくはＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基である。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。レシリン様タンパク質としては、例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。ここで、配列番号３で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈがＳｅｒに置換され、かつ９５残基目のＡｓｎがＡｓｐに置換された配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列）が付加されたものである。Examples of the resilin-like protein (resilin or a protein derived from the resilin) include a protein containing a domain sequence represented by the formula 3: [REP3] q . Here, in
エラスチン様タンパク質（エラスチン又はそれに由来するタンパク質）としては、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。エラスチン様タンパク質としては、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。ここで、配列番号４で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。 Examples of the elastin-like protein (elastin or a protein derived from it) include proteins having an amino acid sequence such as NCBI GenBank accession numbers AAC98395 (human), I47076 (sheep), and NP786966 (bovine). Examples of the elastin-like protein include proteins containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. Here, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6 at the N-terminal of the amino acid sequence from the 121st residue to the 390th residue of the amino acid sequence of accession number AAC98395 of GenBank of NCBI. (Tag arrangement and hinge arrangement) are added.
ケラチン様タンパク質（ケラチン又はそれに由来するタンパク質）として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等が挙げられる。ケラチン様タンパク質としては、例えば、配列番号５で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。 Examples of the keratin-like protein (keratin or a protein derived from the keratin) include Type I keratin of Capra hilcus. Examples of the keratin-like protein include a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (amino acid sequence of accession number ACY30466 of GenBank of NCBI).
構造タンパク質は、好ましくはフィブロイン様タンパク質であり、より好ましくはクモ糸フィブロイン様タンパク質である。 The structural protein is preferably a fibroin-like protein, more preferably a spider silk fibroin-like protein.
本実施形態にかかるタンパク質は、例えば、目的とするタンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることによって生産したものを用いることができる。 The protein according to this embodiment is, for example, by a host transformed with an expression vector having a nucleic acid sequence encoding a protein of interest and one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence. Those produced by expressing the nucleic acid can be used.
目的とするタンパク質をコードする核酸の製造方法は特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどから入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって核酸を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質、をコードする核酸を合成してもよい。 The method for producing the nucleic acid encoding the target protein is not particularly limited. For example, the nucleic acid can be produced by a method of amplifying and cloning by a polymerase chain reaction (PCR) or the like using a gene encoding a natural structural protein, or by chemical synthesis. The chemical synthesis method of nucleic acid is not particularly limited, and for example, based on the amino acid sequence information of the structural protein obtained from the NCBI web database or the like, AKTA oligonucleotide plus 10/100 (manufactured by GE Healthcare Japan Co., Ltd.) Nucleic acid can be chemically synthesized by a method of linking oligonucleotides automatically synthesized by the above method by PCR or the like. At this time, in order to facilitate purification and confirmation of the protein, a nucleic acid encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a start codon and a His10 tag is added to the N-terminal of the above amino acid sequence may be synthesized. Good.
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、及び転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因によって、転写を制御できるプロモーターである。 The regulatory sequence is a sequence that controls the expression of the recombinant protein in the host (for example, a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a transcription termination sequence, etc.), and can be appropriately selected depending on the type of host. As the promoter, an inducible promoter that functions in the host cell and can induce the expression of the protein of interest may be used. An inducible promoter is a promoter that can control transcription by the presence of an inducing substance (expression inducer), the absence of a repressor molecule, or physical factors such as an increase or decrease in temperature, osmotic pressure, or pH value.
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、及び人工染色体ベクター等であってよく、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。 The type of expression vector may be a plasmid vector, a viral vector, a cosmid vector, a phosmid vector, an artificial chromosome vector, or the like, and can be appropriately selected depending on the type of host. As the expression vector, a vector containing a promoter at a position capable of autonomous replication in a host cell, integration into the chromosome of the host, and transcription of a nucleic acid encoding a protein of interest is preferably used. ..
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。 As the host, any of prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells and plant cells can be preferably used.
原核生物の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。 Preferred examples of prokaryotes include bacteria belonging to the genus Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas and the like.
原核生物を宿主とする場合、目的とするタンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、及びｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。 When a prokaryote is used as a host, as a vector into which a nucleic acid encoding a target protein is introduced, for example, pBTrp2 (manufactured by Boehringer Mannheim), pGEX (manufactured by Pharmacia), pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold, etc. Examples thereof include pUB110 and pNCO2 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-238569).
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、及びシゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。 Eukaryotic hosts include, for example, yeast and filamentous fungi (molds, etc.). Examples of the yeast include yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces and the like. Examples of the filamentous fungus include filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Trichoderma, and the like.
真核生物を宿主とする場合、目的とするタンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、及びＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。 When a eukaryote is used as a host, examples of the vector into which the nucleic acid encoding the target protein is introduced include YEp13 (ATCC37115) and YEp24 (ATCC37051).
上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，６９，２１１０ （１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、及びコンピテント法等を挙げることができる。 As a method for introducing an expression vector into the host cell, any method for introducing DNA into the host cell can be used. As a method for introducing the expression vector into the host cell, for example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], electroporation method, spheroplast method, protoplast method, lithium acetate method, competent method and the like can be mentioned.
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、及び融合タンパク質発現等を行うことができる。 As a method for expressing nucleic acid by a host transformed with an expression vector, in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, etc. may be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd Edition. it can.
目的とするタンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することによって製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。 The protein of interest can be produced, for example, by culturing a host transformed with an expression vector in a culture medium, producing and accumulating the protein in the culture medium, and collecting the protein from the culture medium. The method of culturing the host in the culture medium can be carried out according to the method usually used for culturing the host.
宿主が大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、宿主の培養培地として、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、該宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、及び合成培地のいずれを用いてもよい。 When the host is a prokaryotic organism such as Escherichia coli or a eukaryotic organism such as yeast, the host culture medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the host, and the host can be efficiently cultured. Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can be used.
炭素源としては、上記形質転換された宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類などを用いることができる。 The carbon source may be any assimilated by the transformed host, for example, glucose, fructose, sucrose, and carbohydrates such as molasses, starch and starch hydrolyzate containing them, acetic acid and propionic acid. Organic acids such as, and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物などを用いることができる。 Examples of the nitrogen source include ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract and corn steep liquor. Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented bacterial cells and digested products thereof can be used.
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムなどを用いることができる。 As the inorganic salt, for example, primary potassium phosphate, secondary potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。 Culturing of prokaryotes such as Escherichia coli or eukaryotes such as yeast can be carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture. The culture temperature is, for example, 15-40 ° C. The culture time is usually 16 hours to 7 days. The pH of the culture medium during culturing is preferably maintained at 3.0 to 9.0. The pH of the culture medium can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。 Antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium as needed during the culture. When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as needed. For example, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside or the like is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter, and indol acrylic is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter. Acids and the like may be added to the medium.
宿主が生成蓄積した目的とするタンパク質の単離、及び精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離によって回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等によって宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することによって得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法によって精製標品を得ることができる。また、当該タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことによって、沈殿画分としてタンパク質の不溶体を回収する。回収したタンパク質の不溶体は、タンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によってタンパク質の精製標品を得ることができる。 Isolation and purification of the target protein produced and accumulated by the host can be performed by a commonly used method. For example, when the protein is expressed in a lysed state in cells, after the culture is completed, the host cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer solution, and then an ultrasonic crusher, a French press, or manton gaulin. Crush the host cells with a homogenizer, dynomil, or the like to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, a purified preparation can be obtained by a method usually used for isolation and purification of proteins. When the protein is expressed by forming an insoluble matter in the cell, the insoluble matter of the protein is recovered as a precipitation fraction by similarly collecting the host cell, crushing the host cell, and centrifuging the cell. The insoluble form of the recovered protein can be solubilized with a protein denaturing agent. After the operation, a purified protein preparation can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法によって処理することで培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることによって、精製標品を得ることができる。 When the protein is secreted extracellularly, the protein can be recovered from the culture supernatant. That is, a purified sample can be obtained by treating the culture by a method such as centrifugation to obtain a culture supernatant, and using the same isolation and purification method as described above from the culture supernatant.
タンパク質の単離精製に通常用いられている方法としては、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、及びフェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、並びに、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を挙げることができる。これらの方法は、単独又は組み合わせて使用してもよい。 Commonly used methods for isolating and purifying proteins include solvent extraction method, salting out method using sulfite, desalting method, precipitation method using organic solvent, diethylaminoethyl (DEAE) -cepharose, and DIAION HPA-75 (Mitsubishi). Anion exchange chromatography method using a resin such as (manufactured by Kasei Co., Ltd.), cation exchange chromatography method using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia), and a resin such as butyl Sepharose and phenyl Sepharose. Examples thereof include a hydrophobic chromatography method, a gel filtration method using a molecular sieve, an affinity chromatography method, a chromatographic focusing method, and an electrophoresis method such as isoelectric point electrophoresis. These methods may be used alone or in combination.
タンパク質繊維は、タンパク質を公知の紡糸方法によって紡糸することによって製造することができる。すなわち、タンパク質繊維を製造する際には、まず、上述した方法に準じて製造したタンパク質を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、又はヘキサフルオロイソプロノール（ＨＦＩＰ）等の溶媒に、溶解促進剤としての無機塩と共に添加し、溶解させてドープ液を作製する。次いで、このドープ液（紡糸原液）を用いて、湿式紡糸、乾式紡糸又は乾湿式紡糸等の公知の紡糸方法によって紡糸して、目的とするタンパク質繊維を得ることができる。 Protein fibers can be produced by spinning proteins by known spinning methods. That is, when producing protein fibers, first, the protein produced according to the above-mentioned method is prepared by using dimethyl sulfoxide (DMSO), N, N-dimethylformamide (DMF), hexafluoroisopronol (HFIP) or the like. It is added to a solvent together with an inorganic salt as a dissolution accelerator and dissolved to prepare a dope solution. Then, using this doping solution (spinning stock solution), the desired protein fiber can be obtained by spinning by a known spinning method such as wet spinning, dry spinning, or dry wet spinning.
図１は、タンパク質繊維を製造するための紡糸装置の一例を示す概略図である。図１に示す紡糸装置１０は、乾湿式紡糸用の紡糸装置の一例であり、押出し装置１と、凝固浴槽２０と、洗浄浴槽２１と、乾燥装置４とを、上流側から順に有している。
FIG. 1 is a schematic view showing an example of a spinning apparatus for producing protein fibers. The
押出し装置１は貯槽７を有しており、ここにドープ液（紡糸原液）６が貯留される。凝固浴槽２０に凝固液１１（例えば、メタノール）が貯留される。ドープ液６は、貯槽７の下端部に取り付けられたギヤポンプ８によって、凝固液１１との間にエアギャップ１９を開けて設けられたノズル９から押し出される。押し出されたドープ液６は、エアギャップ１９を経て凝固液１１内に供給される。凝固液１１内でドープ液６から溶媒が除去されてタンパク質が凝固する。凝固したタンパク質は、洗浄浴槽２１に導かれ、洗浄浴槽２１内の洗浄液１２によって洗浄された後、洗浄浴槽２１内に設置された第一ニップローラ１３と第二ニップローラ１４によって、乾燥装置４へと送られる。このとき、例えば、第二ニップローラ１４の回転速度を第一ニップローラ１３の回転速度よりも速く設定すると、回転速度比に応じた倍率で延伸されたタンパク質繊維３６が得られる。洗浄液１２中で延伸されたタンパク質繊維３６は、洗浄浴槽２１内を離脱してから、乾燥装置４内を通過する際に乾燥され、その後、ワインダーにて巻き取られる。このようにして、タンパク質繊維３６が、紡糸装置１０によって、最終的にワインダーに巻き取られた巻回物５として得られる。なお、１８ａ〜１８ｇは糸ガイドである。
The
凝固液１１としては、ノズル９から押し出されたドープ液６から、溶媒を抽出（脱溶媒）できる有機溶剤であればよい。このような有機溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール及び２−プロパノール等の炭素数１〜５の低級アルコール、並びにアセトン等を挙げることができる。凝固液１１は、適宜水を含んでいてもよい。凝固液１１の温度は、０〜３０℃であることが好ましい。凝固したタンパク質が凝固液１１中を通過する距離（実質的には、糸ガイド１８ａから糸ガイド１８ｂまでの距離）は、脱溶媒が効率的に行える長さがあればよく、例えば、２００〜５００ｍｍである。凝固液１１中での滞留時間は、例えば、０．０１〜３分であってよく、０．０５〜０．１５分であることが好ましい。また、本実施形態においては、凝固したタンパク質を含む繊維を、凝固液１１中で延伸（前延伸）してもよい。
The coagulating
洗浄液１２としては、主として水を用いることができる。洗浄液１２は、凝固液１１に使用できるよう剤として列挙したものを含んでいてもよい。なお、タンパク質繊維を得る際に洗浄浴槽２１内で実施される延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中等で行う、いわゆる湿熱延伸であってもよい。この湿熱延伸の温度としては、例えば、５０〜９０℃であってよく、７５〜８５℃が好ましい。湿熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、１倍〜１０倍延伸することができ、２〜８倍延伸することが好ましい。
Water can be mainly used as the cleaning liquid 12. The cleaning liquid 12 may contain those listed as agents so that they can be used in the
本実施形態における乾燥装置４内を通過する際に、タンパク質繊維を更に延伸（いわゆる乾熱延伸）してもよい。
When passing through the drying
最終的なタンパク質繊維の延伸倍率は、その下限値が、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、好ましくは、１倍超、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、又は９倍以上であり、その上限値が、好ましくは、４０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１４倍以下、１３倍以下、１２倍以下、１１倍以下、又は１０倍以下である。 The lower limit of the draw ratio of the final protein fiber is preferably more than 1 time, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more with respect to the undrawn yarn (or pre-drawn yarn). , 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, or 9 times or more, and the upper limit values are preferably 40 times or less, 30 times or less, 20 times or less, 15 times or less, 14 times or less, 13 times. Below, it is 12 times or less, 11 times or less, or 10 times or less.
タンパク質繊維を含む原料布帛を作製する方法としては、公知の方法を使用することができる。原料布帛は、織機や編機によって作製される。原料布帛が不織布である場合、ニードルパンチ法等の公知の方法によって作製される。 As a method for producing a raw material cloth containing protein fibers, a known method can be used. The raw material fabric is produced by a loom or a knitting machine. When the raw material fabric is a non-woven fabric, it is produced by a known method such as a needle punching method.
原料布帛の厚みは、例えば１ｍｍ以下、又は０．２ｍｍ以下であってよい。原料布帛の目付は、例えば１ｇ／ｍ２以上、５０ｇ／ｍ２以上、８０ｇ／ｍ２以上又は１００ｇ／ｍ２以上であってよい。The thickness of the raw material cloth may be, for example, 1 mm or less, or 0.2 mm or less. The basis weight of the raw material fabric may be, for example, 1 g / m 2 or more, 50 g / m 2 or more, 80 g / m 2 or more, or 100 g / m 2 or more.
第一工程に続き、上述のとおり用意したタンパク質繊維を含む原料繊維又は原料布帛を、変形可能な容器に収容し、容器内を減圧する（第二工程）。 Following the first step, the raw material fiber or the raw material cloth containing the protein fiber prepared as described above is housed in a deformable container, and the inside of the container is depressurized (second step).
変形可能な容器とは、容器内部を減圧して、真空度を高めた際に、容器内に収容された原料繊維に密着するように変形することができ、かつ真空度を維持することができる容器をいう。 The deformable container can be deformed so as to be in close contact with the raw material fibers contained in the container when the inside of the container is depressurized to increase the degree of vacuum, and the degree of vacuum can be maintained. Refers to a container.
容器内に原料繊維又は原料布帛を収容し、容器内を減圧することによって、当該容器自体が原料繊維又は原料布帛を外部の雰囲気から遮断する。換言すれば、容器内に収容された原料繊維又は原料布帛は、該容器によって外部の気体等から遮蔽されている。また、容器内の真空度を高めた際に、変形可能な容器が、内部に収容された原料繊維又は原料布帛に密着するように変形することによって、原料繊維又は原料布帛を固定する。そして、容器内の真空度が維持された状態で、容器の内部の圧力と、容器外部の圧力との圧力差によって、容器内部に在る原料繊維又は原料布帛が加圧される。 By accommodating the raw material fiber or the raw material cloth in the container and reducing the pressure inside the container, the container itself shields the raw material fiber or the raw material cloth from the outside atmosphere. In other words, the raw material fiber or the raw material cloth contained in the container is shielded from external gas or the like by the container. Further, when the degree of vacuum in the container is increased, the deformable container is deformed so as to be in close contact with the raw material fiber or the raw material cloth contained therein, thereby fixing the raw material fiber or the raw material cloth. Then, while the degree of vacuum inside the container is maintained, the raw material fiber or the raw material cloth inside the container is pressurized by the pressure difference between the pressure inside the container and the pressure outside the container.
変形可能な容器は、好ましくは、フィルム材からなる袋体を有するバッグである。変形可能な容器としては、例えば、バッグフィルム等が挙げられる。変形可能な容器は、気密性のあるフィルム状のものであればよく、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）及びポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）などのフッ素系フィルム、ナイロン６、ナイロン６，６、ポリエチレン、ゴム、ポリイミド、並びに、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）等によって形成されている。
The deformable container is preferably a bag having a bag body made of a film material. Examples of the deformable container include a bag film and the like. The deformable container may be in the form of an airtight film, and is, for example, a fluorine-based container such as polyethylene terephthalate (PET), polypropylene (PP), polytetrafluoroethylene (PTFE) and polyfluorovinylidene (PVDF). It is made of film,
上記容器内の真空度は、好ましくは３０ｋＰａ以下であり、より好ましくは２０ｋＰａ以下であり、更に好ましくは１０ｋＰａ以下である。容器内の真空度は、マノメーターによって確認することができる。 The degree of vacuum in the container is preferably 30 kPa or less, more preferably 20 kPa or less, and further preferably 10 kPa or less. The degree of vacuum inside the container can be confirmed by a manometer.
第二工程は、上記原料繊維を容器内に収容した後、容器内を減圧する前に、容器内を、例えば、乾燥空気、不活性ガス雰囲気などに置換することを含む工程であってもよい。不活性ガスとしては、窒素、及びアルゴン等を挙げることができる。 The second step may be a step including replacing the inside of the container with, for example, dry air, an inert gas atmosphere, or the like after the raw material fibers are stored in the container and before the inside of the container is depressurized. .. Examples of the inert gas include nitrogen, argon and the like.
第二工程に続き、上述のとおり減圧された前記容器の外部から、上記原料繊維又は上記原料布帛を加熱及び加圧する（第三工程）。第三工程における、加熱及び加圧は、同時に行ってもよく、原料繊維又は原料布帛を加熱した後に、加圧してもよい。加熱及び加圧は、好ましくは同時に行われる。 Following the second step, the raw material fiber or the raw material cloth is heated and pressurized from the outside of the container under reduced pressure as described above (third step). The heating and pressurization in the third step may be performed at the same time, or the raw material fiber or the raw material cloth may be heated and then pressurized. Heating and pressurization are preferably performed simultaneously.
第三工程は、例えば、オートクレーブ等を用いて行うことができる。 The third step can be performed using, for example, an autoclave or the like.
加熱温度は、好ましくは５０℃以上であり、より好ましくは７０℃以上であり、更に好ましくは１００℃以上である。加熱温度が、１００℃以上であると、繊維及び布帛の引張強さの向上効果により優れる。加熱温度は、タンパク質の分解等をより抑制する観点から、好ましくは２４０℃以下であり、より好ましくは１８０℃以下であり、さらに好ましくは１５０℃以下である。本明細書において、加熱温度とは、上記原料繊維又は上記原料布帛が収容された容器がおかれている環境温度を意味し、通常は、オートクレーブ等の設定温度を意味する。加熱温度は、一定であってもよく、又は段階的に昇温するように調整してもよい。 The heating temperature is preferably 50 ° C. or higher, more preferably 70 ° C. or higher, and even more preferably 100 ° C. or higher. When the heating temperature is 100 ° C. or higher, the effect of improving the tensile strength of the fibers and the fabric is more excellent. The heating temperature is preferably 240 ° C. or lower, more preferably 180 ° C. or lower, and further preferably 150 ° C. or lower, from the viewpoint of further suppressing protein decomposition and the like. In the present specification, the heating temperature means the environmental temperature in which the container containing the raw material fiber or the raw material cloth is placed, and usually means a set temperature of an autoclave or the like. The heating temperature may be constant or may be adjusted to gradually increase the temperature.
加熱時間は、特に制限されるものではなく、例えば、３０分以上であってよく、又は５０分以上であってよい。加熱時間はまた、例えば、５時間以下であってよく、又は３時間以下であってよい。 The heating time is not particularly limited and may be, for example, 30 minutes or more, or 50 minutes or more. The heating time may also be, for example, 5 hours or less, or 3 hours or less.
加圧する際の圧力は、好ましくは０．０５ＭＰａ以上であり、より好ましくは０．０８ＭＰａ以上であり、更に好ましくは０．１ＭＰａ以上である。圧力が、０．０５ＭＰａ以上であることによって、繊維及び布帛の引張強さの向上効果により優れる。また圧力が、０．０５ＭＰａ以上であることによって、引張強さの向上効果だけでなく、伸度の向上効果や熱による収縮防止効果を得ることもできる。本明細書において、圧力とは、上記原料繊維又は上記原料布帛が収容された容器がおかれている環境の圧力を意味し、通常は、オートクレーブ等の設定圧力を意味する。 The pressure at the time of pressurization is preferably 0.05 MPa or more, more preferably 0.08 MPa or more, still more preferably 0.1 MPa or more. When the pressure is 0.05 MPa or more, the effect of improving the tensile strength of the fiber and the fabric is more excellent. Further, when the pressure is 0.05 MPa or more, not only the effect of improving the tensile strength but also the effect of improving the elongation and the effect of preventing shrinkage due to heat can be obtained. In the present specification, the pressure means the pressure of the environment in which the container containing the raw material fiber or the raw material cloth is placed, and usually means a set pressure of an autoclave or the like.
本実施形態に係る製造方法によって得られる、タンパク質繊維を含む繊維又は布帛は、引張強さに優れる。本実施形態に係る製造方法によって得られる、タンパク質繊維を含む繊維又は布帛の引張強さは、例えば、５Ｎ以上とすることができ、初期引張強さから５０％以上向上させることができる。本明細書において、引張強さは、引張試験機（ミネベアミツミ社製、荷重測定器ＬＴＳ）によって測定される値であり、破断までに観測される最大荷重値を示す。 The fiber or fabric containing the protein fiber obtained by the production method according to the present embodiment has excellent tensile strength. The tensile strength of the fiber or fabric containing the protein fiber obtained by the production method according to the present embodiment can be, for example, 5N or more, and can be improved by 50% or more from the initial tensile strength. In the present specification, the tensile strength is a value measured by a tensile tester (MinebeaMitsumi Co., Ltd., load measuring device LTS), and indicates the maximum load value observed before breaking.
以下、実施例及び比較例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples, but the present invention is not limited to the Examples.
＜クモ糸フィブロイン様タンパク質の製造＞
（１）プラスミド発現株の作製
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）を設計した。なお、配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。<Manufacturing of spider silk fibroin-like protein>
(1) Preparation of plasmid expression strain Based on the nucleotide sequence and amino acid sequence of fibroin (GenBank accession number: P4684.1, GI: 11744415) derived from Nephila clavipes, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained. A modified fibroin having (hereinafter, also referred to as “PRT799”) was designed. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence in which amino acid residues are substituted, inserted or deleted for the purpose of improving productivity with respect to the amino acid sequence of fibroin derived from Nephila clavipes. Further, the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown by SEQ ID NO: 6 is added to the N-terminal.
次に、ＰＲＴ７９９をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。 Next, a nucleic acid encoding PRT799 was synthesized. An NdeI site was added to the nucleic acid at the 5'end and an EcoRI site was added downstream of the stop codon. The nucleic acid was cloned into a cloning vector (pUC118). Then, the nucleic acid was cut out by restriction enzyme treatment with NdeI and EcoRI, and then recombinant into a protein expression vector pET-22b (+) to obtain an expression vector.
（２）タンパク質の発現
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。(2) Expression of protein Escherichia coli BLR (DE3) was transformed with a pET22b (+) expression vector containing a nucleic acid encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The transformed E. coli was cultured in 2 mL of LB medium containing ampicillin for 15 hours. The culture solution was added to 100 mL of seed culture medium (Table 1) containing ampicillin so that the OD 600 was 0.005. The temperature of the culture solution was kept at 30 ° C., and flask culture was carried out until the OD 600 reached 5, (about 15 hours) to obtain a seed culture solution.
当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。The seed culture solution was added to a jar fermenter to which 500 mL of the production medium (Table 2) was added so that the OD 600 was 0.05. The temperature of the culture solution was maintained at 37 ° C., and the cells were cultured at a constant pH of 6.9. In addition, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現によって、目的とするタンパク質の発現を確認した。 Immediately after the glucose in the production medium was completely consumed, the feed solution (glucose 455 g / 1 L, Yeast Extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 mL / min. The temperature of the culture solution was maintained at 37 ° C., and the cells were cultured at a constant pH of 6.9. Further, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration, and the culture was carried out for 20 hours. Then, 1 M of isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce the expression of the target protein. When 20 hours had passed after the addition of IPTG, the culture solution was centrifuged and the cells were collected. SDS-PAGE was performed using cells prepared from the culture broth before and after the addition of IPTG, and the expression of the target protein was confirmed by the appearance of a band of the target protein size depending on the addition of IPTG.
（３）タンパク質の精製
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離によって回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収することによって、クモ糸フィブロイン様タンパク質「ＰＲＴ７９９」を得た。(3) Purification of protein The cells collected 2 hours after the addition of IPTG were washed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4). The washed cells were suspended in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing about 1 mM PMSF, and the cells were disrupted with a high-pressure homogenizer (manufactured by GEA Niro Soavi). The crushed cells were centrifuged to obtain a precipitate. The resulting precipitate was washed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) until high purity. The washed precipitate was suspended in 8M guanidine buffer (8M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0) to a concentration of 100 mg / mL and 30 at 60 ° C. Stir for minutes with a stirrer to dissolve. After dissolution, dialysis was performed with water using a dialysis tube (
＜クモ糸フィブロイン様タンパク質繊維の調製＞
（１）ドープ液の調製
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、上述のクモ糸フィブロイン様タンパク質（ＰＲＴ７９９）を濃度２４質量％となるよう添加した後、溶解促進剤としてＬｉＣｌを濃度４．０質量％となるように添加した。その後、シェーカーを使用して、クモ糸フィブロイン様タンパク質を３時間かけて溶解させ、ＤＭＳＯ溶液を得た。得られたＤＭＳＯ溶液中のゴミと泡を取り除き、ドープ液とした。ドープ液の溶液粘度は９０℃において５０００ｃＰ（センチポアズ）であった。<Preparation of spider silk fibroin-like protein fiber>
(1) Preparation of Dope Solution After adding the above-mentioned spider fibroin-like protein (PRT799) to dimethyl sulfoxide (DMSO) at a concentration of 24% by mass, LiCl as a dissolution accelerator has a concentration of 4.0% by mass. Was added. Then, using a shaker, the spider silk fibroin-like protein was dissolved over 3 hours to obtain a DMSO solution. Dust and bubbles in the obtained DMSO solution were removed to prepare a doping solution. The solution viscosity of the dope solution was 5000 cP (centipores) at 90 ° C.
（２）紡糸
上記のようにして得られたドープ液と図１に示される紡糸装置１０を用いて公知の乾湿式紡糸を行って、クモ糸フィブロイン様タンパク質からなるモノフィラメントを得た。なお、ここでは、乾湿式紡糸を下記の条件で行った。
押出しノズル直径：０．１ｍｍ
押出し速度：３２７．６ｍＬ／時間
凝固液（メタノール）の温度：２℃
巻取り速度：９９．５ｍ／分
延伸倍率：４．５２倍
乾燥温度：８０℃
エアギャップ長さ：５ｍｍ(2) Spinning A known dry-wet spinning was performed using the doping solution obtained as described above and the
Extrusion nozzle diameter: 0.1 mm
Extrusion rate: 327.6 mL / hour Temperature of coagulation liquid (methanol): 2 ° C
Winding speed: 99.5 m / min Stretching ratio: 4.52 times Drying temperature: 80 ° C
Air gap length: 5 mm
（実施例１）
＜クモ糸フィブロイン様タンパク質繊維を用いた諸撚糸の調製＞
上記のようにして得られたモノフィラメントを複数本束ねて１８０デニールとし、Ｚ撚りの撚糸を得た。この撚糸を２本用いて、３６０デニールの諸撚糸（原料繊維１）を得た。得られた原料繊維１を得た。(Example 1)
<Preparation of twisted yarn using spider silk fibroin-like protein fiber>
A plurality of monofilaments obtained as described above were bundled to obtain 180 denier to obtain a Z-twisted twisted yarn. Using two of these twisted yarns, 360 denier twisted yarns (raw material fiber 1) were obtained. The obtained
上記原料繊維１をバッグ材に収容して、当該バッグ材内部を真空ポンプによって、内圧が４００Ｐａになるまで、真空度を調整した。真空バッグに収容され、減圧下に置かれた原料繊維１をバッグ材に収容したまま、オートクレーブ装置内に入れ、次いで下記条件で加熱及び加圧した。
まず、オートクレーブの設定温度を、４０℃に昇温した。装置内温度が４０℃になってから、２℃／分の昇温速度で１３０℃まで徐々に昇温し、１３０℃に達した後、当該温度で２時間温度を維持した。この間、圧力は０．３ＭＰａで維持した。
加熱及び加圧後の真空バッグから、繊維を取り出すことで目的の繊維１を得た。The
First, the set temperature of the autoclave was raised to 40 ° C. After the temperature inside the apparatus reached 40 ° C., the temperature was gradually raised to 130 ° C. at a heating rate of 2 ° C./min, and after reaching 130 ° C., the temperature was maintained at the temperature for 2 hours. During this time, the pressure was maintained at 0.3 MPa.
The
＜評価＞
上記加熱及び加圧を経た繊維を、乾燥状態で、５時間保管した後、引張試験機（ミネベアミツミ社製、荷重測定器ＬＴＳ）を用いて、引張試験を行った。図２は、実施例１における引張試験の結果を示す図であり、実施例１で得られた応力−歪み特性を示す図である。<Evaluation>
The heated and pressurized fibers were stored in a dry state for 5 hours, and then a tensile test was performed using a tensile tester (MinebeaMitsumi Co., Ltd., load measuring device LTS). FIG. 2 is a diagram showing the results of the tensile test in Example 1, and is a diagram showing the stress-strain characteristics obtained in Example 1.
（比較例１）
実施例１において調製した原料繊維１（加熱及び加圧を行う前の繊維）をサンプルとして、実施例１と同様に引張試験を行った。図３は、比較例１における引張試験の結果を示す図であり、比較例１で得られた応力−歪み特性を示す図である。(Comparative Example 1)
Using the raw material fiber 1 (fiber before heating and pressurizing) prepared in Example 1 as a sample, a tensile test was conducted in the same manner as in Example 1. FIG. 3 is a diagram showing the results of the tensile test in Comparative Example 1, and is a diagram showing the stress-strain characteristics obtained in Comparative Example 1.
（比較例２）
実施例１において調製した原料繊維１を、バッグ材に入れ、バッグ材内を減圧にする操作に代えて、原料繊維１を台板（アルミ板）に載せ、両端部を粘着テープによって台板に固定した。固定した台板と共に上記原料繊維１をオートクレーブ装置内に入れ、オートクレーブ装置内の空間に原料繊維が露出した状態で、その他、実施例１と同じ条件で加熱及び加圧した。こうして得られた繊維をサンプルとして、実施例１と同様に引張試験を行った。図４は、比較例２における引張試験の結果を示す図であり、比較例２で得られた応力−歪み特性を示す図である。(Comparative Example 2)
Instead of the operation of putting the
引張試験の結果、図２〜図４に示されるように、本発明に係る方法によって得られる繊維は、原料繊維と比較して、引張強さが向上することが確認された。 As a result of the tensile test, as shown in FIGS. 2 to 4, it was confirmed that the fiber obtained by the method according to the present invention has improved tensile strength as compared with the raw material fiber.
１…押出し装置、４…乾燥装置、６…ドープ液、１０…紡糸装置、２０…凝固浴槽、２１…洗浄浴槽、３６…タンパク質繊維。 1 ... Extruder, 4 ... Drying device, 6 ... Doping solution, 10 ... Spinning device, 20 ... Coagulation bathtub, 21 ... Washing bathtub, 36 ... Protein fiber.
Claims (5)
前記原料繊維又は前記原料布帛を変形可能な容器に収容し、前記容器内を減圧する第二工程と、
減圧された前記容器の外部から前記原料繊維又は前記原料布帛を加熱及び加圧する第三工程と、
を含む、繊維又は布帛の製造方法。The first step of preparing raw material fibers or raw material fabrics containing protein fibers,
The second step of storing the raw material fiber or the raw material cloth in a deformable container and depressurizing the inside of the container,
A third step of heating and pressurizing the raw material fiber or the raw material cloth from the outside of the decompressed container, and
A method for producing a fiber or fabric, including.
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