JPWO2019039545A1 - クロマトグラフィー用担体、リガンド固定担体、クロマトグラフィーカラム、標的物質の精製方法、及びクロマトグラフィー用担体の製造方法 - Google Patents
クロマトグラフィー用担体、リガンド固定担体、クロマトグラフィーカラム、標的物質の精製方法、及びクロマトグラフィー用担体の製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
そのため、親水性を高めた担体として、水溶性ポリマーで細孔内部が固定された特定の固相担体(特許文献2)や、アクリルアミドモノマー等の親水性モノマーを逆相懸濁重合して形成した固相担体、親水性モノマーを保護基等で疎水化処理した後に重合し、脱保護して得た固相担体が開発されている(特許文献3〜5)。
このような背景の下、3,6−ジオキサ−1,8−オクタンジチオールを用いて架橋構造を導入した担体が提案されているが(特許文献6)、この担体は親水性が不十分であり、防汚性の更なる改善が望まれるものであった。また、耐圧性能や耐破損性能にも改善の余地があった。
<2> 前記部分構造が、下記式(1)で表される2価以上の架橋構造である、<1>に記載の担体。
R1は、n価の有機基を示し、
X1は、−C(=O)−NH−を示し、
X2は、単結合又は2価の連結基を示し、
nは、2以上の整数を示し、
*は、結合手を示す。
但し、nが2の場合、R1は、単結合であってもよい。〕
<3> 前記部分構造が、下記式(1−2)で表される架橋構造である、<1>又は<2>に記載の担体。
R2は、単結合又は2価の有機基を示し、
X1a及びX1bは、−C(=O)−NH−を示し、
X2a及びX2bは、それぞれ独立して、単結合又は2価の連結基を示し、
*は、結合手を示す。〕
<5> R2が、炭素数1〜40のアルカンジイル基、又は炭素数2〜40のアルカンジイル基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる1種以上を有する基である、<3>又は<4>に記載の担体。
<6> X2a及びX2bが、それぞれ独立して、単結合、−NH−、又は−R4−C(=O)O−である(R4は、2価の有機基を示す)、<3>〜<5>のいずれかに記載の担体。
<7> 粒子状の担体である、<1>〜<6>のいずれかに記載の担体。
<8> 多孔質担体である、<1>〜<7>のいずれかに記載の担体。
<9> 前記重合体が、リガンドを固定可能な官能基を更に有する、<1>〜<8>のいずれかに記載の担体。
<11> 前記リガンドがタンパク質又はペプチドである、<10>に記載のリガンド固定担体。
<14> クロマトグラフィーによって標的物質を精製する方法であって、<10>又は<11>に記載のリガンド固定担体と、標的物質を含む試料とを接触させる工程を含む、標的物質の精製方法。
したがって、本発明によれば、優れた防汚性を有し、且つ耐圧性能及び耐破損性能に優れ、更に標的物質に対する動的結合容量が大きいリガンド固定担体及びクロマトグラフィーカラムを提供できる。
本発明のクロマトグラフィー用担体は、−C(=O)−NH−で示される基を少なくとも2個含む部分構造を有する重合体を含むものである。
特定部分構造としては、本発明の所望の効果を高める点から、下記式(1)で表される2価以上の架橋構造が好ましい。
R1は、n価の有機基を示し、
X1は、−C(=O)−NH−を示し、
X2は、単結合又は2価の連結基を示し、
nは、2以上の整数を示し、
*は、結合手を示す。
但し、nが2の場合、R1は、単結合であってもよい。〕
nは、2以上の整数を示すが、本発明の所望の効果を高める点から、2〜6が好ましく、2〜4がより好ましく、2又は3が更に好ましく、2が特に好ましい。なお、n個のX1は同一であっても異なっていてもよく、また、n個のX2も同一であっても異なっていてもよい。
X2としては、本発明の所望の効果を高める点から、2価の連結基が好ましい。当該2価の連結基としては、本発明の所望の効果を高める点から、−NH−、−R4−C(=O)O−が好ましく、−NH−が特に好ましい。特にX2が−NH−の場合に、耐圧性能が更に良好なものとなる。
また、上記R4は、2価の有機基を示す。なお、−R4−C(=O)O−は、当該化学構造中のR4がX1と結合していてもよく、また、化学構造中の酸素原子がX1と結合していてもよい。
R4で示される2価の有機基が、2価の炭化水素基である場合、その炭素数は、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくは1〜20、より好ましくは1〜14、更に好ましくは1〜8、特に好ましくは1〜4である。一方、2価の有機基が、「炭素数2以上の2価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる1種以上を有する基」である場合、斯かる基における2価の炭化水素基の炭素数は、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくは2〜20、より好ましくは2〜14、更に好ましくは2〜8、特に好ましくは2〜4である。
なお、R4で示される2価の炭化水素基、「炭素数2以上の2価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる1種以上を有する基」における2価の炭化水素基は、置換基を有していてもよい。当該置換基としては、例えば、塩素原子、臭素原子等のハロゲン原子、ヒドロキシ基等が挙げられる。なお、置換基の置換位置及び個数は任意であり、置換基を2個以上有する場合、該置換基は同一でも異なっていてもよい。
また、2価の脂肪族炭化水素基は分子内に不飽和結合を有していてもよいが、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくはアルカンジイル基である。アルカンジイル基の具体例としては、メタン−1,1−ジイル基、エタン−1,1−ジイル基、エタン−1,2−ジイル基、プロパン−1,1−ジイル基、プロパン−1,2−ジイル基、プロパン−1,3−ジイル基、プロパン−2,2−ジイル基、ブタン−1,1−ジイル基、ブタン−1,2−ジイル基、ブタン−1,3−ジイル基、ブタン−1,4−ジイル基、ペンタン−1,1−ジイル基、ペンタン−1,2−ジイル基、ペンタン−1,3−ジイル基、ペンタン−1,4−ジイル基、ペンタン−1,5−ジイル基、ヘキサン−1,1−ジイル基、ヘキサン−1,2−ジイル基、ヘキサン−1,3−ジイル基、ヘキサン−1,4−ジイル基、ヘキサン−1,5−ジイル基、ヘキサン−1,6−ジイル基、ヘプタン−1,7−ジイル基、オクタン−1,8−ジイル基等が挙げられる。これらの中では、本発明の所望の効果を高める点から、メタン−1,1−ジイル基、エタン−1,2−ジイル基、プロパン−1,3−ジイル基、ブタン−1,4−ジイル基、ペンタン−1,5−ジイル基、ヘキサン−1,6−ジイル基、ヘプタン−1,7−ジイル基、オクタン−1,8−ジイル基が特に好ましい。
上記2価の芳香族炭化水素基の炭素数は、好ましくは6〜18であり、より好ましくは6〜12である。具体的には、フェニレン基、ナフチレン基等のアリーレン基が挙げられる。
なお、2価の脂環式炭化水素基の結合部位、及び2価の芳香族炭化水素基の結合部位は、環上のいずれの炭素上でもよい。
R2は、単結合又は2価の有機基を示し、
X1a及びX1bは、−C(=O)−NH−を示し、
X2a及びX2bは、それぞれ独立して、単結合又は2価の連結基を示し、
*は、結合手を示す。〕
R3は、m価の有機基を示し、
X1は、−C(=O)−NH−を示し、
X2は、単結合又は2価の連結基を示し、
mは、3以上の整数を示し、
*は、結合手を示す。〕
式(1−2)中のX2a及びX2b、式(1−3)中のX2は、それぞれ独立して、単結合又は2価の連結基を示す。式(1−2)中のX2a及びX2b、式(1−3)中のX2は、式(1)中のX2と同義であり、これらで示される2価の連結基としては、−NH−、−R4−C(=O)O−が好ましく、−NH−が特に好ましい。特にX2が−NH−の場合に、耐圧性能が更に良好なものとなる。なお、R4は前述のとおりであり、2価の有機基を示す。
式(2−3)〜(2−4)中のR4a及びR4bは、それぞれ独立して、2価の有機基を示す。式(2−3)〜(2−4)中のR4a及びR4bは、上記式(1)におけるR4と同義である。
R2で示される2価の有機基としては、本発明の所望の効果を高める点から、2価の炭化水素基、炭素数2以上の2価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる1種以上を有する基、2価の含窒素複素環基が好ましく、2価の炭化水素基、炭素数2以上の2価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる1種以上を有する基がより好ましい。なお、R2で示される2価の炭化水素基、「炭素数2以上の2価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる1種以上を有する基」における2価の炭化水素基、2価の含窒素複素環基は、置換基を有していてもよい。当該置換基としては、例えば、塩素原子、臭素原子等のハロゲン原子、ヒドロキシ基等が挙げられる。なお、置換基の置換位置及び個数は任意であり、置換基を2個以上有する場合、該置換基は同一でも異なっていてもよい。
R2で示される2価の炭化水素基、「炭素数2以上の2価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる1種以上を有する基」における2価の炭化水素基としては、2価の脂肪族炭化水素基、2価の脂環式炭化水素基、2価の芳香族炭化水素基が挙げられるが、本発明の所望の効果を高める点から、2価の脂肪族炭化水素基が好ましい。なお、2価の脂肪族炭化水素基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、「炭素数2以上の2価の脂肪族炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる1種以上を有する基」としては、炭素数2以上の2価の脂肪族炭化水素基の炭素−炭素原子間にエステル結合を有する基が好ましい。例えば、−(CH2)2−OC(=O)−CH2−が挙げられる。
また、2価の脂肪族炭化水素基は分子内に不飽和結合を有していてもよいが、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくはアルカンジイル基である。アルカンジイル基の具体例としては、メタン−1,1−ジイル基、エタン−1,1−ジイル基、エタン−1,2−ジイル基、プロパン−1,1−ジイル基、プロパン−1,2−ジイル基、プロパン−1,3−ジイル基、プロパン−2,2−ジイル基、ブタン−1,1−ジイル基、ブタン−1,2−ジイル基、ブタン−1,3−ジイル基、ブタン−1,4−ジイル基、ペンタン−1,1−ジイル基、ペンタン−1,2−ジイル基、ペンタン−1,3−ジイル基、ペンタン−1,4−ジイル基、ペンタン−1,5−ジイル基、ヘキサン−1,1−ジイル基、ヘキサン−1,2−ジイル基、ヘキサン−1,3−ジイル基、ヘキサン−1,4−ジイル基、ヘキサン−1,5−ジイル基、ヘキサン−1,6−ジイル基、ヘプタン−1,7−ジイル基、オクタン−1,8−ジイル基等が挙げられる。これらの中では、本発明の所望の効果を高める点から、メタン−1,1−ジイル基、エタン−1,2−ジイル基、プロパン−1,3−ジイル基、ブタン−1,4−ジイル基、ペンタン−1,5−ジイル基、ヘキサン−1,6−ジイル基、ヘプタン−1,7−ジイル基、オクタン−1,8−ジイル基が特に好ましい。
上記2価の芳香族炭化水素基の炭素数は、好ましくは6〜18であり、より好ましくは6〜12である。具体的には、フェニレン基、ナフチレン基等のアリーレン基が挙げられる。
3価の炭化水素基の炭素数としては、1〜40が好ましく、1〜30がより好ましく、1〜20が更に好ましく、1〜10が特に好ましい。
3価の炭化水素基としては、3価の脂肪族炭化水素基、3価の脂環式炭化水素基、3価の芳香族炭化水素基が挙げられるが、3価の脂肪族炭化水素基、3価の脂環式炭化水素基が好ましい。なお、3価の脂環式炭化水素基の結合部位及び3価の芳香族炭化水素基の結合部位は、環上のいずれの炭素上でもよい。
3価の脂環式炭化水素基の炭素数は、好ましくは3〜20であり、より好ましくは3〜16であり、更に好ましくは3〜12であり、特に好ましくは3〜8である。具体的には、シクロプロパントリイル基、シクロブタントリイル基、シクロペンタントリイル基、シクロへキサントリイル基等のシクロアルカントリイル基が挙げられる。
リガンドを固定可能な官能基としては、環状エーテル基、カルボキシ基、−C(=O)−O−C(=O)−、コハク酸イミドオキシカルボニル基、ホルミル基及びイソシアネート基からなる群より選ばれる1種以上の官能基が挙げられるが、本発明の所望の効果を高める点から、環状エーテル基が好ましい。
ここで、「環状エーテル基」としては、環を構成する原子数が3〜7個の環状エーテル基が好ましい。環状エーテル基は、置換基としてアルキル基を有していてもよい。環状エーテル基の具体例としては、以下の式(3)〜(8)で表される環状エーテル基が挙げられるが、式(3)、(5)又は(8)で表される環状エーテル基が好ましく、式(3)で表される環状エーテル基がより好ましい。
リガンドを固定可能な官能基の残基は、上記リガンドを固定可能な官能基が架橋剤によって架橋されたときに残る残基を意味する。当該残基としては、具体的には、環状エーテル基が開環してなる2価の基、−C(=O)−、−NH−C(=O)−が挙げられ、本発明の所望の効果を高める点から、環状エーテル基が開環してなる2価の基が好ましい。当該環状エーテル基が開環してなる2価の基における「環状エーテル基」としては、リガンドを固定可能な官能基として挙げたものと同様のものが好ましい。
特定重合体中のリガンドを固定可能な官能基とその残基との合計含有量(α)に対する特定重合体中の特定部分構造の含有量(β)のモル比〔(β)/(α)〕は、本発明の所望の効果を高める点から、好ましくは0.01〜0.8であり、より好ましくは0.05〜0.7であり、更に好ましくは0.1〜0.6であり、特に好ましくは0.2〜0.5である。本発明によれば、モル比〔(β)/(α)〕が0.2以上の場合であっても優れた防汚性が得られる。
なお、特定重合体中の各構造の含有量は、元素分析や熱分解ガスクロマトグラフィー等により測定可能である。
R8は、水素原子又はメチル基を示し、
R9は、単結合又は2価の連結基を示し、
Z1は、リガンドを固定可能な官能基を示す。〕
R10は、水素原子又はメチル基を示し、
R11は、単結合又は2価の連結基を示し、
Z2は、リガンドを固定可能な官能基の残基を示し、
**は、特定部分構造と結合する結合手を示す。〕
また、R12〜R15は、それぞれ独立して、アルカンジイル基、又は炭素数2以上のアルカンジイル基の炭素−炭素原子間にエーテル結合を有する基を示す。
Ra、Rb及びRcで示されるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。具体的には、メタン−1,1−ジイル基、エタン−1,1−ジイル基、エタン−1,2−ジイル基、プロパン−1,1−ジイル基、プロパン−1,2−ジイル基、プロパン−1,3−ジイル基、プロパン−2,2−ジイル基、ブタン−1,1−ジイル基、ブタン−1,2−ジイル基、ブタン−1,3−ジイル基、ブタン−1,4−ジイル基が挙げられる。pとしては、0〜20の整数が好ましく、0〜10の整数がより好ましく、0〜5の整数が更に好ましく、0が特に好ましい。なお、pが2〜30の整数の場合、p個のRbは同一であっても異なっていてもよい。炭素数2以上のアルカンジイル基の炭素−炭素原子間にエーテル結合を有する基の好適な具体例としては、C1-4アルカンジイルオキシC1-4アルカンジイル基が挙げられる。
なお、R9、R11、R12〜R15で示されるアルカンジイル基、炭素数2以上のアルカンジイル基の炭素−炭素原子間にエーテル結合を有する基は、置換基を有していてもよい。当該置換基としては、例えば、ヒドロキシ基等が挙げられる。
これらモノマーの中では、本発明の所望の効果を高める点から、環状エーテル基を有する(メタ)アクリレート系モノマーが好ましく、グリシジル(メタ)アクリレートが特に好ましい。
また、上記(メタ)アクリロニトリル系非架橋性モノマーとしては、例えば、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等が挙げられる。これらは1種を単独で又は2種以上を組み合わせて使用できる。
また、上記N−ビニルアミド系非架橋性モノマーとしては、例えば、N−ビニルアセトアミド、N−ビニルプロピオンアミド等が挙げられる。これらは1種を単独で又は2種以上を組み合わせて使用できる。
さらに、架橋性モノマーとしては、上記例示したものの他に、ジアミノプロパノール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グルコサミン等のアミノアルコールと(メタ)アクリル酸との脱水縮合反応物や、ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィン等を挙げることができる。
また、特定重合体の含有量は、本発明のクロマトグラフィー用担体中、好ましくは80〜100質量%であり、より好ましくは90〜100質量%であり、特に好ましくは99〜100質量%である。
また、本発明のクロマトグラフィー用担体は、支持体(固相担体)として使用できる形態であればよい。このような形態としては、例えば、粒子状、モノリス状、板状、膜状(中空糸を含む)、繊維状、カセット状、チップ状等が挙げられ、好ましくは粒子状である。また、本発明のクロマトグラフィー用担体としては、多孔質粒子等の多孔質担体が好ましい。また、多孔質粒子としては、多孔質ポリマー粒子が好ましい。
また、本発明のクロマトグラフィー用担体の比表面積は、好ましくは1〜500m2/gであり、より好ましくは10〜300m2/gである。
また、本発明のクロマトグラフィー用担体の体積平均細孔径は、好ましくは10〜300nmである。
なお、上記平均粒径、変動係数、比表面積及び体積平均細孔径は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定等により測定できる。
本発明のクロマトグラフィー用担体は、常法を適宜組み合わせて製造できるが、環状エーテル基、カルボキシ基、−C(=O)−O−C(=O)−、コハク酸イミドオキシカルボニル基、ホルミル基及びイソシアネート基からなる群より選ばれる1種以上の官能基を有する固相と、−C(=O)−NH−で示される基を分子内に少なくとも2個含む架橋剤とを接触させる工程を含む方法により、簡便且つ効率よく製造することができる。
以下、上記各工程について、具体的に説明する。
工程1は、環状エーテル基、カルボキシ基、−C(=O)−O−C(=O)−、コハク酸イミドオキシカルボニル基、ホルミル基及びイソシアネート基からなる群より選ばれる1種以上の官能基を有するモノマー(以下、官能基含有モノマーとも称する)を(共)重合させ、上記官能基を有する固相を得る工程である。(共)重合の方法は、好ましくは懸濁重合である。
官能基含有モノマーとしては、構造単位(A)、(B)を構成するモノマーとして例示したものが挙げられる。また、官能基含有モノマーとともに上記他のモノマー(非架橋性モノマー、架橋性モノマー)を共重合させてもよい。
官能基含有モノマーの合計使用量としては、本発明の所望の効果を高める点から、工程1で使用するモノマー総量100質量部に対して、1〜99質量部が好ましく、20〜95質量部がより好ましく、40〜90質量部が特に好ましい。
架橋性モノマーの合計使用量としては、本発明の所望の効果を高める点から、工程1で使用するモノマー総量100質量部に対して、1〜70質量部が好ましく、3〜60質量部がより好ましく、5〜50質量部が特に好ましい。
なお、非架橋性モノマーを使用する場合、その合計使用量は、官能基含有モノマーや架橋性モノマー以外の残余の量である。
上記多孔化剤の合計使用量は、通常、モノマー総量100質量部に対して40〜600質量部程度である。
水系媒体の合計使用量は、通常、モノマー総量100質量部に対して200〜7000質量部程度である。
また、水系媒体の分散媒として水を用いる場合、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、硫酸ナトリウム、燐酸カルシウム、塩化ナトリウム等の分散安定剤を使用してもよい。
工程2は、官能基含有モノマーに由来する官能基の一部に、−C(=O)−NH−で示される基を分子内に少なくとも2個含む架橋剤を付加反応させ、当該架橋剤由来の特定部分構造を導入する工程である。これにより、上記官能基の残基同士が特定部分構造を介して架橋される。
固相が環状エーテル基を有する場合には、具体的には、架橋性基として−C(=O)−NH−NH2で示される基を分子内に少なくとも2個含む架橋剤、−C(=O)−NH−で示される基を分子内に少なくとも2個含むとともに、架橋性基としてカルボキシ基を分子内に少なくとも2個含む架橋剤等を使用することができる。
固相がカルボキシ基、−C(=O)−O−C(=O)−、コハク酸イミドオキシカルボニル基、ホルミル基を有する場合には、具体的には、架橋性基として−C(=O)−NH−NH2で示される基を分子内に少なくとも2個含む架橋剤等を使用することができる。
固相がイソシアネート基を有する場合には、具体的には、架橋性基として−C(=O)−NH−NH2で示される基を分子内に少なくとも2個含む架橋剤等を使用することができる。
なお、架橋剤は、1種を単独で又は2種以上を組み合わせて使用できる。
本発明のクロマトグラフィー用担体は、アフィニティクロマトグラフィー用担体として特に有用である。
本発明のリガンド固定担体は、本発明のクロマトグラフィー用担体に、リガンドを固定してなるものである。すなわち、本発明のクロマトグラフィー用担体を支持体(固相担体)としたものである。支持体とする担体としては、本発明の所望の効果を高める点から、特定部分構造とリガンドを固定可能な官能基とを有する重合体を含む担体が好ましい。
上記リガンドは、標的物質と結合する分子であればよいが、例えば、プロテインA、プロテインG、アビジン等のタンパク質;インシュリン等のペプチド;DNA、RNA等の核酸;酵素;イミノジ酢酸等のキレート化合物;抗体;抗原;ホルモン;ヘパリン、ルイスX、ガングリオシド等の糖質;レセプター;アプタマー;ビオチンやその誘導体等のビタミン類;金属イオン;合成色素の他、2−アミノフェニルホウ素酸、4−アミノベンズアミジン、グルタチオンのような低分子化合物等が挙げられる。なお、上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
上記リガンドの中でも、タンパク質、ペプチド、核酸、酵素、キレート化合物が好ましく、タンパク質、ペプチドがより好ましく、タンパク質が特に好ましい。特に、抗体を標的物質とする抗体アフィニティリガンドの中では、イムノグロブリン結合性タンパク質が好ましい。
また、リガンドの配向性を制御する方法(米国特許第6,399,750号、LjungquistC.他著,rEur.J.Biochem.」,1989年,186巻,557−561頁)や、リンカー(スペーサー)を介してリガンドを担体に固定する方法(米国特許第5,260,373号、特開2010−133733号公報、特開2010−133734号公報)、会合性基によりリガンドを担体上に集積させる方法(特開2011−256176号公報)等を利用して固定してもよい。
なお、リガンドが固定された担体を、メタンチオール、チオグリセロール等のチオール化合物と接触させ、未反応の官能基を開環等させてもよい。この処理は、国際公開第2015/119255号パンフレット等の記載を参考にして行えばよい。
本発明のリガンド固定担体は、クロマトグラフィーへの使用に適し、アフィニティクロマトグラフィーへの使用に特に適する。
本発明のクロマトグラフィーカラムは、本発明のリガンド固定担体がカラム容器に充填されているものである。
本発明のクロマトグラフィーカラムは、アフィニティクロマトグラフィーへの使用に適する。
本発明の標的物質の精製方法は、クロマトグラフィーによって標的物質を精製する方法であって、本発明のリガンド固定担体を用いることを特徴とする。
本発明の標的物質の精製方法は、本発明のリガンド固定担体を用いる以外は常法に従い行えばよいが、本発明のリガンド固定担体と、標的物質を含む試料とを接触させる工程を含む方法が挙げられる。また、当該工程によって担体に捕捉された標的物質を溶出させる溶出工程を更に含んでいてもよい。溶出工程には、リガンドと標的物質を解離させる解離液が通常使用される。
また、精製は、本発明のクロマトグラフィーカラムを用いて行ってもよい。このような方法としては、本発明のクロマトグラフィーカラムに標的物質を含む試料を通液する工程を含む方法が挙げられ、上記と同様に溶出工程を更に含んでいてもよい。
本発明における標的物質としては、例えば、抗原;モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の抗体;細胞(正常細胞;大腸がん細胞、血中循環がん細胞等のがん細胞);DNA、RNA等の核酸;タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖、多糖、脂質、ビタミン等の生体関連物質が挙げられ、創薬ターゲットとなる薬物、ビオチン等の低分子化合物でもよい。
(1)448gの純水にポリビニルアルコール(クラレ社製 PVA−217)2.69gを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム(和光純薬工業製)0.045gを添加し、撹拌して水溶液Sを調製した。
一方、ジビニルベンゼン(和光純薬工業製)3.63g、1−エチル−4−ビニルベンゼン(ChemSampCo社製)0.36g及びグリシジルメタクリレート(三菱ガス化学社製)14.15gからなる単量体組成物を、2−オクタノン(東洋合成社製)29.38gに溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、前記水溶液Sを、セパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に前記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が85℃に到達したところで2,2'−アゾイソブチロニトリル(和光純薬工業社製)1.34gを添加し、内温を86℃にした。
(3)その後、多孔質粒子分散液100gにアジピン酸ジヒドラジド(東京化成工業株式会社製)0.956g及びジイソプロピルエチルアミン1.418gを加え、70℃まで加温し、70℃を維持したまま、8時間撹拌を行った。次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。次いで、粒子の濃度が10質量%となるように粒子を純水に分散させ、多孔質架橋粒子分散液を得た。この分散液に含まれる多孔質架橋粒子を、「クロマトグラフィー用担体V1」と称する。
(4)次いで、改変プロテインA(Repligen製 rSPA)0.15gを、1.2M 硫酸ナトリウム/0.1M リン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)40mLに溶解させプロテインA溶解液を得て、このプロテインA溶解液に多孔質架橋粒子分散液(粒子乾燥質量換算で1g相当)を添加した。この分散液を25℃で10時間振とう撹拌し、プロテインAを粒子に固定した。
次いで、生成したプロテインA固定粒子を、1.0M α−チオグリセロール(東京化成工業株式会社製)/0.1M 硫酸ナトリウム(pH8.3)40mLに分散させ、25℃で17時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインA固定粒子を、0.1M リン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)、0.1M 水酸化ナトリウム水溶液、0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)で洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤含有液を得た。この液に含まれる充填剤を、「リガンド固定担体W1」と称する。
実施例1の工程(3)において、アジピン酸ジヒドラジドの使用量を2.390gに、ジイソプロピルエチルアミンの使用量を3.546gにそれぞれ変更した以外は、実施例1の工程(1)〜(3)と同様の操作を行い、多孔質架橋粒子分散液を得た。この分散液に含まれる多孔質架橋粒子を、「クロマトグラフィー用担体V2」と称する。
次いで、実施例1の工程(4)と同様の工程を実施することで、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤含有液を得た。この液に含まれる充填剤を、「リガンド固定担体W2」と称する。
実施例1の工程(3)において、アジピン酸ジヒドラジドの使用量を3.823gに、ジイソプロピルエチルアミンの使用量を5.673gにそれぞれ変更した以外は、実施例1の工程(1)〜(3)と同様の操作を行い、多孔質架橋粒子分散液を得た。この分散液に含まれる多孔質架橋粒子を、「クロマトグラフィー用担体V3」と称する。
次いで、実施例1の工程(4)と同様の工程を実施することで、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤含有液を得た。この液に含まれる充填剤を、「リガンド固定担体W3」と称する。
実施例1の工程(3)において、アジピン酸ジヒドラジドをコハク酸ジヒドラジド(東京化成工業株式会社製)0.802gに変更した以外は、実施例1の工程(1)〜(3)と同様の操作を行い、多孔質架橋粒子分散液を得た。この分散液に含まれる多孔質架橋粒子を、「クロマトグラフィー用担体V4」と称する。
次いで、実施例1の工程(4)と同様の工程を実施することで、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤含有液を得た。この液に含まれる充填剤を、「リガンド固定担体W4」と称する。
実施例1の工程(3)において、アジピン酸ジヒドラジドをセバシン酸ジヒドラジド(東京化成工業株式会社製)1.264gに変更した以外は、実施例1の工程(1)〜(3)と同様の操作を行い、多孔質架橋粒子分散液を得た。この分散液に含まれる多孔質架橋粒子を、「クロマトグラフィー用担体V5」と称する。
次いで、実施例1の工程(4)と同様の工程を実施することで、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤含有液を得た。この液に含まれる充填剤を、「リガンド固定担体W5」と称する。
実施例1の工程(3)において、アジピン酸ジヒドラジドを、下記式で示されるN1,N1−(エタン−1,2−ジイル)ビス(コハク酸モノアミド)1.428gに変更した以外は、実施例1の工程(1)〜(3)と同様の操作を行い、多孔質架橋粒子分散液を得た(なお、N1,N1−(エタン−1,2−ジイル)ビス(コハク酸モノアミド)は、コハク酸無水物とエチレンジアミンから合成した)。この分散液に含まれる多孔質架橋粒子を、「クロマトグラフィー用担体V6」と称する。
次いで、実施例1の工程(4)と同様の工程を実施することで、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤含有液を得た。この液に含まれる充填剤を、「リガンド固定担体W6」と称する。
実施例1の工程(1)〜(2)と同様の操作を行い、「多孔質担体1」を得た。この担体を、「クロマトグラフィー用担体X1」と称する。
次いで、実施例1の工程(4)と同様の工程を実施することで、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤含有液を得た。この液に含まれる充填剤を、「リガンド固定担体Y1」と称する。
実施例1の工程(3)において、アジピン酸ジヒドラジドを3,6−ジオキサ−1,8−オクタンジチオール(東京化成工業株式会社製)1.000gに変更した以外は、実施例1の工程(1)〜(3)と同様の操作を行い、多孔質架橋粒子分散液を得た。この分散液に含まれる多孔質架橋粒子を、「クロマトグラフィー用担体X2」と称する。
次いで、実施例1の工程(4)と同様の工程を実施することで、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤含有液を得た。この液に含まれる充填剤を、「リガンド固定担体Y2」と称する。
各実施例及び比較例で得られた担体V1〜V3、X1〜X2を内径16mm、充填高さ100mmとなるようにカラム容器に充填し、このカラムをGEヘルスケアバイオサイエンス社製AKTA pilotに接続した。次いで、線流速100cm/hrで純水の通液を開始して、線流速を100cm/hrずつ1分間毎に段階的に上げていき、2.0MPaに達したときの線流速を圧密線流速として記録した。そして、圧密線流速について以下の基準で評価した。結果を表1に示す。
AAA:圧密線流速が3500cm/hr以上
AA:圧密線流速が3100cm/hr以上3500cm/hr未満
A:圧密線流速が2900cm/hr以上3100cm/hr未満
B:圧密線流速が2900cm/hr未満
各実施例及び比較例で得られた担体V1〜V3、X1〜X2を、固形分濃度10質量%となるように純水に加え、定量制御ダイヤフラムポンプ(タクミナ社製)を用いて6L/minの吐出速度で60回の循環処理を行った。
その後、循環処理後の担体を、固形分濃度が2.5質量%程度となるように純水で希釈し、シスメックス社製フロー式粒子像分析装置(型番 FPIA−3000)を用いてトータルカウント500個にセットして各粒子の円形度(=(粒子投影面積と同じ面積の円の周囲長/粒子投影像の周囲長)×100)を測定した。
次いで、全測定対象粒子のうち円形度0.95以上の粒子の個数を全測定粒子数で除することにより円形度0.95以上の粒子分布(=円形度0.95以上の粒子数/測定粒子数×100)を算出し、以下の基準で評価した。結果を表1に示す。
AA:円形度0.95以上の粒子分布が93%以上
A:円形度0.95以上の粒子分布が89%以上93%未満
B:円形度0.95以上の粒子分布が89%未満
各実施例及び比較例で得られた担体W1〜W3、Y1〜Y2に結合したプロテインAの結合量を、ビシンコニン酸(BCA)試薬を用いて定量した。
具体的には、固形分換算で1mgの担体W1〜W3、Y1〜Y2と、参照値を測定するためにプロテインAを結合する前の担体V1〜V3、X1〜X2をテストチューブにそれぞれ採取し、ThermoFisher Scientific社のBCA Protein Assay液に浸透させ、37℃で30分間、転倒混和した。
その後、各反応液の吸光度(波長:570nm)と検量線(担体に結合させたプロテインAと同一)の吸光度から結合量を算出した。表2に示す結合量は参照値を差し引いた値である。
各実施例及び比較例の担体W1〜W3、Y1〜Y2の親水性を評価した。
すなわち、GEヘルスケア社製AKTAprime plusを用いて、20mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム水溶液(pH7.5)を線流速300cm/hrで通液することで、それぞれの担体を容量4mL(5mmφ×200mm長)のカラムに充填高さ約20cmでパッキングした。
その後、1体積%アセトン/1Mナトリウム水溶液(100μL)をカラムに注入し、次いで20mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム水溶液(pH7.5)を線流速300cm/hrで通液することで、アセトンの保持時間(RT(アセトン))をUV検出器で測定した。次いで、1体積%シクロヘキサノン/1Mナトリウム水溶液(100μL)を用いて、同様にシクロヘキサノンの保持時間(RT(シクロヘキサノン))を測定した後、RT(シクロヘキサノン)/RT(アセトン)の値(CHN/ACN)を算出し、親水性を以下の基準で評価した。結果を表2に示す。なお、CHN/ACNが小さいほど親水性が高いといえる。
AA:CHN/ACNが1.060以下
A:CHN/ACNが1.060超1.078以下
B:CHN/ACNが1.078超
GEヘルスケア社製AKTAprime plusを用いて、線流速300cm/hrにおけるタンパク質(ヒトIgG抗体、Equitech Bio社製 HGG−1000)に対する各実施例及び比較例の担体W1〜W3、Y1〜Y2のDBCを測定した。カラム容器は容量4mL(5mmφ×200mm長)のものを、タンパク質は20mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム水溶液(pH7.5)にタンパク質を5mg/mL溶解したものをそれぞれ使用し、溶出先端10%ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からDBCを求めた。結果を表2に示す。
カラム容器(GEヘルスケア社製Tricorn10/50 column)に、各実施例及び比較例の担体W1〜W3、Y1〜Y2を、充填高さ約5cmで充填してカラムを作製した。得られたカラムをGEヘルスケア社製AKTA Prime Plusにそれぞれ接続し、20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)を5カラム容量(カラム容積の5倍)、流速1mL/分にて通液し、平衡化させた。
次いで、モノクローナル抗体Trastuzumabを含有するCHO細胞培養上清を、約23mg抗体/mL担体の負荷量で、流速1mL/分にてカラムに通液した。
次いで、20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)、20mMリン酸ナトリウム/1M塩化ナトリウムバッファー(pH7.5)、及び20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)を、それぞれ5カラム容量、流速1mL/分にてカラムに順次通液した。
その後、50mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)を、流速1mL/分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、Abs.280>100mAuの溶出フラクションを回収した。
そして、分光光度計を用い、回収したフラクション中に含有される抗体濃度(mg/mL)を測定した。また、Cygnus Technologies社製 CHO HCP ELISA kit,3Gを用い、回収したフラクション中に含有されるHost Cell Protein(HCP)の濃度(ng/mL)を測定した。さらにHCPの濃度を抗体濃度で除することにより、単位抗体量当たりのHCP量を算出し、以下の基準で評価した。結果を表2に示す。
(HCPの評価基準)
A:HCPが3300ppm以下
B:HCPが3300ppm超
Claims (15)
- −C(=O)−NH−で示される基を少なくとも2個含む部分構造を有する重合体を含む、クロマトグラフィー用担体。
- 前記部分構造が、下記式(1)で表される2価以上の架橋構造である、請求項1に記載の担体。
R1は、n価の有機基を示し、
X1は、−C(=O)−NH−を示し、
X2は、単結合又は2価の連結基を示し、
nは、2以上の整数を示し、
*は、結合手を示す。
但し、nが2の場合、R1は、単結合であってもよい。〕 - 前記部分構造が、下記式(1−2)で表される架橋構造である、請求項1又は2に記載の担体。
R2は、単結合又は2価の有機基を示し、
X1a及びX1bは、−C(=O)−NH−を示し、
X2a及びX2bは、それぞれ独立して、単結合又は2価の連結基を示し、
*は、結合手を示す。〕 - R2が、炭素数1〜40の2価の炭化水素基、又は炭素数2〜40の2価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる1種以上を有する基である、請求項3に記載の担体。
- R2が、炭素数1〜40のアルカンジイル基、又は炭素数2〜40のアルカンジイル基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる1種以上を有する基である、請求項3又は4に記載の担体。
- X2a及びX2bが、それぞれ独立して、単結合、−NH−、又は−R4−C(=O)O−である(R4は、2価の有機基を示す)、請求項3〜5のいずれか1項に記載の担体。
- 粒子状の担体である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の担体。
- 多孔質担体である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の担体。
- 前記重合体が、リガンドを固定可能な官能基を更に有する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の担体。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の担体にリガンドを固定してなる、リガンド固定担体。
- 前記リガンドがタンパク質又はペプチドである、請求項10に記載のリガンド固定担体。
- 請求項10又は11に記載のリガンド固定担体がカラム容器に充填されている、クロマトグラフィーカラム。
- クロマトグラフィーによって標的物質を精製する方法であって、請求項10又は11に記載のリガンド固定担体を用いることを特徴とする、標的物質の精製方法。
- クロマトグラフィーによって標的物質を精製する方法であって、請求項10又は11に記載のリガンド固定担体と、標的物質を含む試料とを接触させる工程を含む、標的物質の精製方法。
- 環状エーテル基、カルボキシ基、−C(=O)−O−C(=O)−、コハク酸イミドオキシカルボニル基、ホルミル基及びイソシアネート基からなる群より選ばれる1種以上の官能基を有する固相と、−C(=O)−NH−で示される基を分子内に少なくとも2個含む架橋剤とを接触させる工程を含む、クロマトグラフィー用担体の製造方法。
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