JPWO2018212071A1 - Prognostic predictor of diffuse large B-cell lymphoma and prognostic method - Google Patents
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Abstract
ＤＬＢＣＬの予後因子を見出し、予後予測を行うことが可能となった。Ｒ-ＣＨＯＰまたは、それに類似した治療に対し、転帰が極端な２群について、全エクソームシーケンス解析を行った結果、抵抗症例群に、片方のアリルにＴＰ５３の変異が、他方のアリルに１７ｐ欠損が併存している症例、反応症例群にＯＳＢＰＬ１０変異が偏って同定された。これら予後因子により、予後予測を行うことができる。The prognostic factor of DLBCL was found, and it became possible to predict the prognosis. The whole exome sequence analysis was performed on two groups with extreme outcomes for R-CHOP or similar treatments. As a result, in the resistant case group, one allele had a TP53 mutation and the other allele had a 17p deletion. The OSBPL10 mutation was biased and identified in the cases where coexistence was present and the reaction case group. Prognostic prediction can be performed by using these prognostic factors.
Description
本発明はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ-ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ、以下ＤＬＢＣＬと記載する。）の予後予測因子、及び予後予測を検査する方法に関する。 The present invention relates to a prognostic factor for diffuse large B-cell lymphoma (Diffuse large B-cell Lymphoma, hereinafter referred to as DLBCL) and a method for testing the prognostic value.
ＤＬＢＣＬは、リンパ腫の１種であり、Ｂ細胞から発生する非ホジキンリンパ腫である。我が国の非ホジキンリンパ腫のうち３０〜５０％はＤＬＢＣＬであると言われており最も頻度の高いリンパ腫である。ＤＬＢＣＬとしての初発例以外に、他の低悪性度Ｂ細胞リンパ腫から組織学的進展する例もあり、様々な病態を示す疾患群である。 DLBCL is a type of lymphoma and is a non-Hodgkin's lymphoma that arises from B cells. It is said that 30-50% of non-Hodgkin's lymphoma in Japan is DLBCL, and is the most frequent lymphoma. In addition to the first case of DLBCL, there are cases in which histological progression has been made from other low-grade B-cell lymphomas, and this is a disease group showing various pathologies.
ＤＬＢＣＬは、形態学的、分子生物学的、免疫組織学的に不均一な集団であり、種々のバリアント、あるいはサブグループに分類される。２００４年、Ｈａｎｓのクライテリアと呼ばれる胚中心Ｂ細胞（ｇｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ Ｂ−ｃｅｌｌ、ＧＣＢ）とｎｏｎ-ＧＣ（ＣＤ１０、ＢＣＬ−６、ＭＵＭ−１の発現により分類）サブタイプの２群への分類が提唱された（非特許文献１）。その後、ＷＨＯのＤＬＢＣＬの分類では、幾度かの変遷を経て、２０１６年にＧＣＢと活性化Ｂ細胞（ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ−ｃｅｌｌ、ＡＢＣ）のサブタイプの２群に分類するようになった（非特許文献２）。 DLBCL is a heterogeneous population morphologically, molecularly biologically, and immunohistologically, and is classified into various variants or subgroups. In 2004, a classification into two groups of germinal center B-cell (GCB) and non-GC (classified by expression of CD10, BCL-6, and MUM-1) called Hans criteria was proposed. (Non-Patent Document 1). After that, in the classification of DLBCL of WHO, after several transitions, in 2016, it was classified into two groups of subtypes of GCB and activated B-cell (activated B-cell, ABC) (Non-Patent Document) 2).
ＤＬＢＣＬの治療は、現在ＣＨＯＰ療法（シクロホスファミド、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、オンコビン（商品名）（ビンクリスチン）、プレドニゾロン）に抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブを加えたＲ-ＣＨＯＰが標準療法となっている。ＤＬＢＣＬはＲ−ＣＨＯＰ療法の導入により飛躍的に予後が改善されたが、一方でＲ−ＣＨＯＰ療法の効かない患者群が存在する。ＷＨＯの分類も患者の予後とは対応しておらず、分類はされてはいるものの治療の層別化は行われていないのが現状である。 Currently, the standard treatment for DLBCL is R-CHOP, which is a combination of CHOP therapy (cyclophosphamide, adriamycin (doxorubicin), oncovin (trade name) (vincristine), prednisolone) and rituximab, an anti-CD20 antibody. . Although the prognosis of DLBCL has been dramatically improved by the introduction of R-CHOP therapy, there are some patient groups who do not respond to R-CHOP therapy. The classification of WHO also does not correspond to the prognosis of patients, and although it is classified, stratification of treatment is not performed at present.
免疫組織学的な解析や、全ゲノムシーケンス、全エクソームシーケンス、トランスクリプトームシーケンスなどの解析手法を用いてＤＬＢＣＬの変異が解析されているが（非特許文献３−７）、これら解析間で体細胞変異が一致しているものは１０−２０％に過ぎない（非特許文献８）。すなわち、ＤＬＢＣＬは、体細胞変異の観点から見ても多様な疾患であることが示唆される。また、遺伝子変異を治療効果予測につなげようという試みもされているが、実用化には至っていない（特許文献１、２）。 Mutations in DLBCL have been analyzed using immunohistological analysis and analysis techniques such as whole genome sequence, whole exome sequence, and transcriptome sequence (Non-Patent Documents 3-7). Only 10-20% have somatic mutation matches (Non-Patent Document 8). That is, it is suggested that DLBCL is a variety of diseases even from the viewpoint of somatic mutation. Attempts have also been made to link gene mutations to prediction of therapeutic effects, but they have not been put to practical use (Patent Documents 1 and 2).
近年、変異とＲ-ＣＨＯＰ療法などの治療法と予後との関連が解析されている（非特許文献９−１３）。２１５症例の再発、難治性のＤＬＢＣＬについて、文献や全エクソーム解析より選択した３４遺伝子を解析した報告によれば、ＴＮＦＡＩＰ３及びＧＮＡ１３の変異が、ＡＢＣ（活性化Ｂ細胞）に分類される患者においてＲ-ＣＨＯＰ療法の予後が悪いことと相関している（非特許文献９）。また、他の再発、難治症例の全エクソーム解析によれば、ＡＢＣサブタイプでは、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＩＲＦ４の変異、ＲＥＬ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＨＹＡＬ２、及びＴＰ５３のコピー数に変異が生じていることが報告されている（非特許文献１０）。さらに、他の３８症例の難治性のＤＬＢＣＬの全エクソーム解析によれば、ＴＰ５３、ＦＯＸＯ１、ＫＭＴ２Ｃ、ＣＣＮＤ３、ＮＦＫＢ１Ｚ、及びＳＴＡＴ６の変異と治療抵抗性とが相関することが報告されている（非特許文献１１）。また、ＴＰ５３のミスセンス変異やコピー数の欠失、ＣＤ５８の変異などが予後と相関することが報告されている（非特許文献１２、１３）。 In recent years, the relationship between mutation, treatment methods such as R-CHOP therapy, and prognosis has been analyzed (Non-Patent Documents 9-13). According to reports on the analysis of 34 genes selected from the literature and total exome analysis for 215 cases of relapsed or refractory DLBCL, mutations in TNFAIP3 and GNA13 show that in patients classified as ABC (activated B cells), It is correlated with poor prognosis of -CHOP therapy (Non-Patent Document 9). According to the whole exome analysis of other relapsed or refractory cases, it has been reported that the ABC subtypes have mutations in the TBL1XR1, IRF4 mutations, REL, CDKN2A, HYAL2, and TP53 copy numbers. (Non-Patent Document 10). Furthermore, according to the whole exome analysis of the intractable DLBCL of the other 38 cases, it has been reported that the mutation of TP53, FOXO1, KMT2C, CCND3, NFKB1Z, and STAT6 correlates with the treatment resistance (non-patent). Reference 11). In addition, it has been reported that a missense mutation or a copy number deletion of TP53, a mutation of CD58 and the like are correlated with prognosis (Non-patent Documents 12 and 13).
上述のように、難治性のＤＬＢＣＬと関連の高い遺伝子変異に関する報告は、数多くあるものの、変異の報告されている遺伝子が多岐にわたっており、再現性が必ずしも高くはない。そのため、遺伝子変異と治療抵抗性との関連が報告間で必ずしも一致しておらず、予後予測が十分になされているとは言えない。ＤＬＢＣＬに対してＲ−ＣＨＯＰ療法を行っても、治療効果がさほど期待できない患者を予め検出することができれば、代替する療法としてサルベージ療法を行うなど、患者に合わせてより良い長期治療計画を立てることが可能となる。効果のあまりない治療を継続することは、患者にとって望ましいことではないだけでなく、医療経済上も望ましいことではない。 As described above, there are many reports on gene mutations highly related to intractable DLBCL, but the genes for which mutations are reported are diverse, and reproducibility is not always high. Therefore, the relationship between gene mutation and treatment resistance does not always match between reports, and it cannot be said that prognosis is sufficiently predicted. If R-CHOP therapy for DLBCL can be detected beforehand for patients whose therapeutic effects are not expected to be significant, a better long-term treatment plan can be established for patients, such as salvage therapy as an alternative therapy. Becomes possible. Continuing ineffective treatment is not only desirable for the patient, but also for the medical economy.
また、Ｒ-ＣＨＯＰ療法に対して反応性が高い患者を検出することも重要なことである。Ｒ-ＣＨＯＰ療法で用いられるドキソルビシンは心毒性があるため、過剰な治療を避ける必要があるからである。すなわち、ＤＬＢＣＬの予後不良、及び予後の良い患者の両方を検出することは、治療計画を立てるうえで重要なことである。本発明は、種々の病態を示す疾患群であるＤＬＢＣＬを層別化し、ＤＬＢＣＬの予後因子、予後予測を検査する方法を提供し、有効な治療を可能とすることを課題とする。 It is also important to detect patients who are highly responsive to R-CHOP therapy. This is because doxorubicin used in R-CHOP therapy is cardiotoxic and it is necessary to avoid excessive treatment. That is, detecting both the poor prognosis of DLBCL and the patient with a good prognosis is important in making a treatment plan. An object of the present invention is to stratify DLBCL, which is a group of diseases showing various disease states, to provide a method for examining the prognostic factors and prognostic prediction of DLBCL, and to enable effective treatment.
本発明は以下に示すびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の予後予測の検査方法、予後予測因子、予後予測を行うための検査キットを提供する。
（１）ＤＬＢＣＬの予後予測検査方法であって、ＴＰ５３及び／又はＯＳＢＰＬ１０の変異を検出することを特徴とする検査方法。
（２）一方のアリルにＴＰ５３の変異が、他方のアリルに１７ｐ欠損が併存している場合に、予後不良であるとする（１）記載の検査方法。
（３）ＯＳＢＰＬ１０の変異を有する場合に、予後良好であるとする（１）記載の検査方法。
（４）ＤＬＢＣＬの予後予測因子であって、一方のアリルにＴＰ５３の変異が存在し、他方のアリルの１７ｐ欠損が併存していること、及び／又はＯＳＢＰＬ１０の変異であることを特徴とする予後予測因子。
（５）（４）記載のＤＬＢＣＬの予後予測因子を検出するための検出試薬を含む検出キット。The present invention provides a test method for predicting the prognosis of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), a prognostic predictor, and a test kit for performing the prognostic prediction described below.
(1) A prognostic prediction method for DLBCL, which comprises detecting a mutation in TP53 and / or OSBPL10.
(2) The test method according to (1), wherein the prognosis is poor when a mutation of TP53 is present in one allele and a 17p deletion is present in the other allele.
(3) The test method according to (1), wherein a prognosis is favorable when the mutation has OSBPL10.
(4) a prognostic predictor of DLBCL, wherein one allele has a TP53 mutation and the other allele has a 17p deletion coexisting therewith, and / or a prognosis characterized by an OSBPL10 mutation Predictor.
(5) A detection kit comprising a detection reagent for detecting the DLBCL prognostic predictor according to (4).
本発明では、変異を解析するために全エクソームシーケンスを行ったが、ＤＬＢＣＬの予後と相関の見られる遺伝子である１７番染色体短腕（１７ｐ）の欠損（１７ｐ欠損）を伴うＴＰ５３の変異、ＯＳＢＰＬ１０の変異を検出することができればどのような手法を用いてもよい。 In the present invention, whole exome sequencing was performed to analyze mutations. However, mutations in TP53 with deletion (17p deletion) of chromosome 17 short arm (17p), which is a gene correlated with the prognosis of DLBCL, Any method may be used as long as a mutation in OSBPL10 can be detected.
以下で詳細に説明するが、ＴＰ５３の変異は、ＤＮＡ結合領域に変異が集中している。したがって、ＤＮＡ結合領域の変異の解析を行うことにより検出してもよいが、変異がコーディング領域全域にわたっていることから、コーディング領域全域のシーケンスを行うことが好ましい。ＯＳＢＰＬ１０の変異はエクソン１に偏在しているため、この領域のみをシーケンス解析すればよい。 As will be described in detail below, TP53 mutations are concentrated in the DNA binding region. Therefore, although the detection may be performed by analyzing the mutation of the DNA binding region, it is preferable to perform the sequence of the entire coding region since the mutation extends over the entire coding region. Since the OSBPL10 mutation is localized in exon 1, sequence analysis of this region alone is sufficient.
ここで、ＴＰ５３の変異とは、ミスセンス変異、フレームシフト変異などｐ５３タンパク質の機能が変わるような変異をさす。また、１７ｐ欠損とは、ＴＰ５３遺伝子の存在する領域を含む１７番染色体短腕が広範囲に欠失している状態を示す。後述のように、ＤＬＢＣＬでは、片方のアリルのＴＰ５３遺伝子にｐ５３タンパク質の機能が変わる変異が存在し、他方のアリルの１７番染色体短腕が広範囲に欠失している場合に、予後不良であることが明らかとなった。 Here, the TP53 mutation refers to a mutation such as a missense mutation or a frameshift mutation that alters the function of the p53 protein. 17p deletion refers to a state in which the short arm of chromosome 17 including the region where the TP53 gene is present is extensively deleted. As described later, in DLBCL, the prognosis is poor when a mutation that alters the function of the p53 protein is present in the TP53 gene of one allele and the short arm of chromosome 17 of the other allele is extensively deleted. It became clear.
ＴＰ５３の変異は、次世代シーケンサを用いてコーディング領域全域を対象としたアンプリコンシーケンス、ターゲットキャプチャーシーケンスをすることで検出することが可能である。また、簡易的には、ＴＰ５３のコーディング領域のうち、ＤＮＡ結合領域に変異が集中していること（図２）から、この領域のダイレクトシーケンスにより、変異の検出が可能である。ＯＳＢＰＬ１０の変異も同様に、アンプリコンシーケンス、ターゲットキャプチャーシーケンスをすることで検出することが可能であり、さらに、エクソン１に偏在していることから、この領域のダイレクトシーケンスのみでも検出が可能である。また、１７番染色体の短腕の欠損は、１７番染色体の短腕に存在する一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）のターゲットキャプチャーシーケンス、ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＧＨ）、リアルタイムＰＣＲ法、Ｆｕｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）などの方法を用いて検出することが可能である。 The mutation of TP53 can be detected by performing an amplicon sequence and a target capture sequence for the entire coding region using a next-generation sequencer. In addition, in a simplified manner, mutations are concentrated in the DNA-binding region of the coding region of TP53 (FIG. 2), and thus the mutation can be detected by direct sequencing of this region. Similarly, a mutation in OSBPL10 can be detected by amplicon sequence and target capture sequence, and furthermore, since it is localized in exon 1, it can be detected only by direct sequence in this region. . In addition, deletion of the short arm of chromosome 17 is caused by target capture sequence of single nucleotide polymorphism (SNP) present in the short arm of chromosome 17, comparative genomic hybridization (CGH), real-time PCR method, and fluoescence. It can be detected using a method such as situ hybridization (FISH).
２００６年以降に、がん研有明病院で治療を行い、インフォームドコンセントが得られた患者の中から、標準療法であるＲ-ＣＨＯＰまたは、それに類似した治療に対して転帰が極端な２群（Ｒ-ＣＨＯＰ抵抗性症例９例、反応性症例２６例）を探索群（ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｃｏｈｏｒｔ）とし、８５例の検証群（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｃｏｈｏｒｔ）で確認した。 From 2006, patients who had been treated at the Cancer Institute Ariake Hospital and received informed consent, two groups with extreme outcomes for R-CHOP, a standard therapy, or similar treatment ( R-CHOP resistant cases (9 cases, reactive cases 26 cases) were set as a search group (discovery cohort) and confirmed in 85 verification groups (validation cohort).
解析対象とする患者は、凍結組織が存在する、あるいは凍結組織か新鮮材料から抽出したＤＮＡが得られることを選択基準とした。３５のＤＬＢＣＬ症例（２００６年１月〜２０１１年１２月に診断）を探索群として、８５症例（２０１２年１月〜２０１４年１２月に診断）を検証群としてした。 Patients to be analyzed were selected based on the presence of frozen tissue or the availability of DNA extracted from frozen tissue or fresh material. 35 DLBCL cases (diagnosed from January 2006 to December 2011) were set as a search group, and 85 cases (diagnosed from January 2012 to December 2014) were set as a verification group.
探索群におけるＲ-ＣＨＯＰ抵抗性症例９例は、初期治療（Ｒ-ＣＨＯＰまたは、それに類似した治療）に対して不変、あるいは進行性であり、予後が極端に悪い症例（ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｃａｓｅ ｉｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｃｏｈｏｒｔ、以下、Ｄｐと記載する。）である。反応性症例２６例は、初期治療に反応し、２０１６年１１月までの観察期間において少なくとも３年間無増悪生存であった症例（ｇｏｏｄ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｃａｓｅ ｉｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｃｏｈｏｒｔ、以下、Ｄｇと記載する。）である。探索群のうち３３症例では、リンパ腫が浸潤していない骨髄試料を正常試料として解析を行った。また、骨髄試料が得られなかったＤｇ２４、Ｄｇ２５症例は、末梢血から得たＤＮＡを正常試料として解析を行った。また、検証群８５症例もＲ-ＣＨＯＰまたは、それに類似した治療を受けた症例である。すべての症例は、通常の組織学的検査を行った後、病理学者によって２００８年のＷＨＯ分類により分類を行った。 Nine R-CHOP-resistant cases in the search group were unchanged or progressive with respect to the initial treatment (R-CHOP or a similar treatment) and had an extremely poor prognosis (poor prognosis case in discovery cohort). , Hereinafter referred to as Dp). The 26 responding cases were those who responded to the initial treatment and had progression-free survival for at least 3 years during the observation period up to November 2016 (good prognosis case in discovery cohort, hereinafter referred to as Dg). . In 33 cases in the search group, analysis was performed using a bone marrow sample not infiltrated with lymphoma as a normal sample. Dg24 and Dg25 cases where bone marrow samples could not be obtained were analyzed using DNA obtained from peripheral blood as a normal sample. The 85 cases in the verification group also received R-CHOP or a treatment similar thereto. All cases were classified by a pathologist according to the 2008 WHO classification after routine histological examination.
遺伝子変異は、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＸＴ Ｈｕｍａｎ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ Ｖ５（アジレント・テクノロジー株式会社）に基づいた特別仕様のキャプチャープローブセットを用いて、３５の探索群のがん部及び正常組織について全エクソームシーケンスを行った。ライブラリーはＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｉｍｅｎｔ ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用い、次世代シーケンサＨｉＳｅｑ（イルミナ株式会社）を用いて行った。解析したがん組織におけるがん細胞の含有率は平均５６．４％（３０．９８−８９．１６％）と推測された。 For the gene mutation, the entire exome sequence was performed on cancerous parts and normal tissues in 35 search groups using a specially-designed capture probe set based on SureSelect XT Human All Exon V5 (Agilent Technology Co., Ltd.). The library was performed using SureSelect Target Enrichment kit (Agilent Technology Co., Ltd.) and the next-generation sequencer HiSeq (Illumina Co., Ltd.). The average cancer cell content in the analyzed cancer tissue was estimated to be 56.4% (30.98-89.16%).
予後の良い群（Ｄｇ群）と悪い群（Ｄｐ群）における検出された体細胞変異の数を示す（図１）。Ｄｇ群、Ｄｐ群の２群間で最も変異の出現頻度に差が見られるのは、ＴＰ５３であり、次にＯＳＢＰＬ１０、ＣＴＢＰ２に差が認められる（図１中、両群で出現頻度に差が見られるＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０、ＣＴＢＰ２を↓で示す。）。 The numbers of detected somatic mutations in the group with good prognosis (Dg group) and the group with poor prognosis (Dp group) are shown (FIG. 1). The difference in the frequency of occurrence of the mutation between the Dg group and the Dp group is the highest in TP53, followed by the difference in OSBPL10 and CTBP2 (FIG. 1 shows a difference in the frequency of appearance between the two groups). TP53, OSBPL10 and CTBP2 that can be seen are indicated by ↓).
Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ、非特許文献１４）を用いて結果を検討し、偽陽性と考えられる変異を除き解析を行った。例えば、ＣＴＢＰ２の変異は、がん組織、正常組織両者に同じ変異が多数見られたことからリファレンスゲノムへのマッピングの誤りであると考えられた。したがって、ＴＰ５３、及びＯＳＢＰＬ１０（図１中★印で示す。）をＤｇ群、Ｄｐ群の２群を区別することのできる変異であると結論づけ、ＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０の変異について詳細に検討を行った。 The results were examined using Integrative Genomics Viewer (IGV, Non-Patent Document 14), and the analysis was performed except for mutations considered to be false positives. For example, the CTBP2 mutation was considered to be an error in mapping to the reference genome because many of the same mutations were found in both cancer tissues and normal tissues. Therefore, it was concluded that TP53 and OSBPL10 (indicated by ★ in FIG. 1) are mutations that can distinguish between the Dg group and the Dp group, and the TP53 and OSBPL10 mutations were examined in detail.
ＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０の変異がＤＬＢＣＬの予後と相関しているとの結果が探索群で得られたことから検証群を用いてさらに解析を進めた。探索群でＤＬＢＣＬの予後と相関が見出された変異（ＴＰ５３、及びＯＳＢＰＬ１０）については、サンガーシーケンスによって確認を行った。シーケンスに用いたプライマーを以下に示す。 Since the result that the mutation of TP53 and OSBPL10 correlated with the prognosis of DLBCL was obtained in the search group, the analysis was further performed using the verification group. Mutations (TP53 and OSBPL10) found to be correlated with the prognosis of DLBCL in the search group were confirmed by Sanger sequencing. The primers used for the sequence are shown below.
ＯＳＢＰＬ１０
Ｆ：ＡＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＣＴＧＡＡＧＧ（配列番号１）
Ｒ：ＣＡＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＧＧＡＧ（配列番号２）
ＴＰ５３
Ｆ１：ＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＧ（配列番号３）
Ｒ１：ＴＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＧＡＧＣＣＴＧ（配列番号４）
Ｆ２：ＧＣＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＴＧ（配列番号５）
Ｒ２：ＣＣＣＣＡＴＧＡＧＡＴＧＴＧＣＡＡＡＧＴ（配列番号６）
Ｆ３：ＡＴＴＴＡＣＴＴＴＧＣＡＣＡＴＣＴＣＡＴＧＧＧ（配列番号７）
Ｒ３：ＣＡＣＴＴＧＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡ（配列番号８）
なお、Ｆはフォワードプライマーを、Ｒはリバースプライマーを示し、ＴＰ５３のシーケンスは、１〜３の３組のプライマーを用いて行った。OSBPL10
F: ATCACTGGGGTTCGCTGAAGG (SEQ ID NO: 1)
R: CATTTCCCGGGGGATTTGGAG (SEQ ID NO: 2)
TP53
F1: AGAGGAGCTGGTGTTTGTTGGG (SEQ ID NO: 3)
R1: TTGGGAGGTAGTGGAGCTG (SEQ ID NO: 4)
F2: GCCAGAGAAAAGAAAAACTGAGTG (SEQ ID NO: 5)
R2: CCCCATGAGATGTGCAAAGT (SEQ ID NO: 6)
F3: ATTACTTTTGCACATCTCATGGGG (SEQ ID NO: 7)
R3: CACTTGGTCCCCTGACTTTCA (SEQ ID NO: 8)
F indicates a forward primer, R indicates a reverse primer, and the sequence of TP53 was performed using three sets of primers 1 to 3.
検証群については、ＴｒｕＳｅｑ Ｃｕｓｔｏｍ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｋｉｔ（イルミナ社）を用いてアンプリコンシーケンス解析を行った。なお、解析した領域は、探索群でＤＬＢＣＬの予後と相関が見られたＴＰ５３の全コーディング領域、及びＯＳＢＰＬ１０のエクソン１の領域である。解析は次世代シーケンサＭｉＳｅｑ（イルミナ株式会社）を用いて行った。 For the verification group, amplicon sequence analysis was performed using a TruSeq Custom Amplicon Low Input Kit (Illumina). The analyzed regions are the entire coding region of TP53 and the region of exon 1 of OSBPL10 that have been correlated with the prognosis of DLBCL in the search group. The analysis was performed using a next-generation sequencer MiSeq (Illumina Corporation).
まず、ＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０に、どのような変異が生じているか解析した。探索群（図２Ａ）、検証群（図２Ｂ）に、ＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０の変異の位置や種類を示す。ＴＰ５３の変異は、コーディング領域全体にわたっているものの、主としてＤＮＡ結合領域に見られることが明らかとなった。また、ＯＳＢＰＬ１０の変異はエクソン１でコードされる領域に偏在していた。 First, what kind of mutation occurred in TP53 and OSBPL10 was analyzed. The positions and types of mutations in TP53 and OSBPL10 are shown in the search group (FIG. 2A) and the verification group (FIG. 2B). The mutation of TP53 was found to be found mainly in the DNA-binding region, though it extends over the entire coding region. In addition, the mutation of OSBPL10 was localized in the region encoded by exon 1.
まず、ＴＰ５３の変異について解析すると、Ｄｐ群においてＴＰ５３に変異が見られた５人の患者全てにおいて１７番染色体短腕に欠損が見られたのに対し（ＴＰ５３ ｍｉｓｓｅｎｃｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ＋１７ｐ ｄｅｌｅｔｉｏｎ：３人、ＴＰ５３ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｉｎｄｅｌ＋１７ｐ ｄｅｌｅｔｉｏｎ：２人）、Ｄｇ群ではそのような欠損が見られたのは１人の患者のみ（ＴＰ５３ ｍｉｓｓｅｎｃｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ＋１７ｐ ｄｅｌｅｔｉｏｎ：１人）であった。Ｄｇ群では、１７ｐ欠損を有する患者は６人、ＴＰ５３変異が見られた患者は３人いたが、１７ｐ欠損を伴いＴＰ５３変異を有していた患者は１人のみで、ＴＰ５３変異が見られた他の２人の患者は１７ｐ欠損を伴っていなかった。 First, when the mutation of TP53 was analyzed, the short arm of chromosome 17 was found to be deficient in all of the five patients with the mutation of TP53 in the Dp group (TP53 mismutation + 17p deletion: 3 persons, TP53 frameshift). Indel + 17p deletion: 2), and in the Dg group, such a deficiency was found only in one patient (TP53 mismutation + 17p deletion: 1). In the Dg group, there were 6 patients with a 17p deletion and 3 patients with a TP53 mutation, but only one patient with a 17p deletion and a TP53 mutation had a TP53 mutation. The other two patients did not have a 17p deletion.
検証群において、ＴＰ５３の変異と予後について検討すると、ＴＰ５３変異のみ１２例、欠損のみ７例の各群は、ともに陰性６０例の群と比較し、全生存期間、無増悪生存期間とも差は認められなかった。これに対し、ＴＰ５３の変異かつ欠損がある症例群６例は、全生存期間（ｐ＝０．００１６）、無増悪生存期間（ｐ＝０．０２３）ともに、有意に予後不良であった（図３Ａ）。 Examination of the TP53 mutation and prognosis in the test group revealed that each of the 12 groups of TP53 mutation alone and 7 cases of deficiency only showed no difference in the overall survival time and progression-free survival time compared with the group of 60 negative cases. I couldn't. On the other hand, in the group of 6 cases with mutation and deficiency of TP53, both the overall survival time (p = 0.0016) and the progression-free survival time (p = 0.023) were significantly poor prognosis (FIG. 3A).
したがって、ＴＰ５３の変異かつ欠損は、ＤＬＢＣＬにおける予後不良因子であると結論づけた。また、表１は、検証群におけるＴＰ５３の変異かつ欠損を有するＤＬＢＣＬ患者群と、ＴＰ５３が野生型、あるいはＴＰ５３変異、欠損のどちらかを単独で有している患者群との比較を示したものである。ＴＰ５３の変異かつ欠損を有する患者群は、ＥＣＯＧ−ＰＳ（全身状態、ＥＣＯＧ（Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）が定めるＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｔａｔｕｓ）が有意に悪かった（ｐ＜０．０１）。 Therefore, it was concluded that the mutation and deletion of TP53 was a poor prognostic factor in DLBCL. Table 1 shows a comparison between a DLBCL patient group having a mutation and a deficiency of TP53 in a verification group and a patient group having TP53 alone or having either a TP53 mutation or a deficiency in the verification group. It is. The group of patients having a mutation and deficiency in TP53 had significantly worse ECOG-PS (general condition, Performance status determined by ECOG (Eastern Oncology Group)) (p <0.01).
次に、ＯＳＢＰＬ１０の変異について解析を行った（表２）。ＯＳＢＰＬ１０の変異を有しているものは、検証群において、全生存期間（ｐ＝０．０３７）、無増悪生存期間（ｐ＝０．０４１）と有意に予後良好であった（図３Ｂ）。また、ＯＳＢＰＬ１０に変異を有する検証群２１人の患者のＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、乳酸脱水素酵素）値は有意に低かった（ｐ＝０．０４）。ＬＤＨ値は、ＩＰＩ（国際予後指標）において予後因子の一つとして用いられている指標である。 Next, the mutation of OSBPL10 was analyzed (Table 2). Those having the mutation of OSBPL10 had significantly better prognosis in the test group, with overall survival (p = 0.037) and progression-free survival (p = 0.041) (FIG. 3B). In addition, the LDH (lactate dehydrogenase, lactate dehydrogenase) value of 21 patients in the verification group having a mutation in OSBPL10 was significantly lower (p = 0.04). The LDH value is an index used as one prognostic factor in IPI (International Prognostic Index).
ＩＰＩの影響を除くために、傾向スコア解析（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ Ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ法）を行った。解析は、Ｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．３．２（非特許文献１５）及びＩＰＷ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐａｃｋａｇｅ（非特許文献１６）を用いて行った（図４）。 In order to remove the influence of IPI, a propensity score analysis (Inverse Probability Weighting method) was performed. The analysis was performed using R version 3.3.2 (Non-Patent Document 15) and IPW survival package (Non-Patent Document 16) (FIG. 4).
ＩＰＷ法を適用しても、１７ｐ欠損を伴うＴＰ５３変異は、有意に全生存率（ｐ＜０．０１）、無増悪生存期間（ｐ＜０．０１）ともに予後不良であった（図４Ａ）。ＯＳＢＰＬ１０の変異に関しては、ＩＰＷ法を適用した後は、変異を有する群は、全生存率（ｐ＝０．０５）、無増悪生存期間（ｐ＝０．０５）ともに、予後が良い傾向が見られた（図４Ｂ）。 Even when the IPW method was applied, the TP53 mutation associated with the 17p deletion had significantly poor prognosis in both the overall survival rate (p <0.01) and progression-free survival time (p <0.01) (FIG. 4A). . Regarding the mutation of OSBPL10, after applying the IPW method, the group having the mutation had a favorable prognosis in both the overall survival rate (p = 0.05) and the progression-free survival period (p = 0.05). (FIG. 4B).
一般的にＤＬＢＣＬの予後の指標として用いられているＩＰＩと本発明の方法との比較を行った。ＩＰＩは、年齢、臨床病期、乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＬＤＨ）、ＰＳ（全身状態、ＥＣＯＧ−ＰＳ）、リンパ節以外の病変（Ｅｘｔｒａｎｏｄａｌ ｌｅｓｉｏｎ）の予後因子から算出される値を示す。図５Ｂに検証群におけるＩＰＩの分類による全生存期間を示す。 IPI, which is generally used as a prognostic indicator of DLBCL, was compared with the method of the present invention. IPI indicates a value calculated from age, clinical stage, lactate dehydrogenase (lactate dehydrogenase, LDH), PS (general condition, ECOG-PS), and prognostic factors of lesions other than lymph nodes (extranal length). FIG. 5B shows the overall survival time according to the classification of IPI in the verification group.
これに対し、本発明の方法による予後予測方法（ＴＰ５３の変異かつ欠損とＯＳＢＰＬ１０の変異を組み合わせたＧｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ：ＧＰＩ）による予後を検証群にて確認した（図５Ａ）。ＩＰＩとＧＰＩを比較すると、ＧＰＩは非常に精度良くＤＬＢＣＬの予後を予測可能であった（ｐ＝０．００３４）。 On the other hand, the prognosis by the prognosis prediction method (Genomic Prognostic Index: GPI in which the mutation and deletion of TP53 and the mutation of OSBPL10 were combined) by the method of the present invention was confirmed in the verification group (FIG. 5A). Comparing IPI and GPI, GPI was able to predict the prognosis of DLBCL very accurately (p = 0.0034).
以上、示したように、極端な転帰を示した２群の全エクソームシーケンス解析より、予後を予測し得る因子として、１７番の染色体短腕の欠損を伴うＴＰ５３変異、ＯＳＢＰＬ１０の変異を見出し、検証群にて確認した。これら変異を予後予測因子として用いることによって、ＤＬＢＣＬの予後を予測が可能となり、ＤＬＢＣＬ患者に対して長期の治療計画を立てることができるようになった。 As described above, from the analysis of all exome sequences of the two groups that showed extreme outcomes, TP53 mutation with deletion of the short arm of chromosome 17 and mutation of OSBPL10 were found as factors that can predict the prognosis, It was confirmed in the verification group. By using these mutations as prognostic predictors, the prognosis of DLBCL can be predicted, and a long-term treatment plan can be established for DLBCL patients.
Claims (5)
他方のアリルに１７ｐ欠損が併存している場合に、
予後不良であるとする請求項１記載の検査方法。Mutation of TP53 in one allele,
When 17p deletion coexists in the other allele,
The inspection method according to claim 1, wherein the prognosis is poor.
一方のアリルにＴＰ５３の変異が存在し、他方のアリルの１７ｐ欠損が併存していること、
及び／又はＯＳＢＰＬ１０の変異であることを特徴とする予後予測因子。A prognostic predictor of DLBCL,
Mutation of TP53 is present in one allele and 17p deletion of the other allele coexists,
And / or an OSBPL10 mutation.
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