JPWO2018207888A1 - ラメルテオンの製造法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、睡眠導入剤ラメルテオンの簡便、且つ効率的な製造法を提供する。本発明によれば、入手容易なエナール（Ｅ）−２−［１，２，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅを不斉還元することにより光学活性アルデヒド（Ｓ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅを製造する工程を実施することにより、短工程でラメルテオンを製造することができる。

Description

本発明は、ラメルテオンの製造法に関する。
睡眠導入剤として使用されているラメルテオンの製造法としては、以下のような方法が知られている。
１）１，２，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｏｎｅをリン酸エステル誘導体を用いて（Ｅ）−２−［１，２，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅに変換し、ニトリル官能基を還元してアミン化合物とした後、オレフィンを不斉水素化して、得られた光学活性体の化合物を還元反応し、次いでアシル化させることによりラメルテオンに誘導する方法（特許文献１）。
Figure 2018207888
２）１，２，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｏｎｅをリン酸エステル誘導体を用いて（Ｅ）−２−［１，２，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５,４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅに変換し、ニトリル官能基を水和してアミド官能基とした後、オレフィンを異性化させ、これを不斉水素化してラメルテオンに誘導する方法（非特許文献１）。
Figure 2018207888
３）ラセミ２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅを光学活性なカルボン酸誘導体を用いて造塩し、前記光学活性なカルボン酸塩を光学分割する方法（特許文献２）。
Figure 2018207888
４）ラセミ２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ)ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄを光学活性なアミン誘導体を用いて造塩し、前記光学活性なアミン誘導体塩を光学分割する方法（特許文献３）。
Figure 2018207888
特許第４３５８９１７号公報 中国特許出願公開第１０４５２９９５９号明細書 中国特許出願公開第１０１６５４４４５号明細書
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，２００６，１７，１８４−１９０．
しかしながら従来技術（１）と（２）では、高価な遷移金属触媒を用いて、更に特殊設備が必要な高圧水素化を行っているため、工業的規模での実施には不適である。また、従来技術（３）と（４）は光学分割法であるため、基質重量の半分を占める不要なエナンチオマーは廃棄しなければならず、これらもまた効率的な方法とは言い難い。
上記の従来技術に対して本発明が解決しようとする課題は、ラメルテオンの簡便、且つ効率のよい製造法を提供することにある。
本発明者らは鋭意検討の結果、入手容易な出発原料から簡便、且つ効率よく、更に高圧水素化などの特殊設備を必要としないラメルテオンの製造法を見出し、本発明を完成するに至った。
[１] 下記式（１）；
Figure 2018207888
で表されるエナールを不斉還元することにより、下記式（２）；
Figure 2018207888
で表される光学活性アルデヒドを製造し、続いてこれを下記式（４）；
Figure 2018207888
で表されるラメルテオンに変換することを特徴とするラメルテオンの製造法。
[２] 前記不斉還元が、下記式（５）；
Figure 2018207888
（式中、Ｒは置換基を有しても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有しても良い炭素数２〜２０のアルケニル基、置換基を有しても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、置換基を有しても良い炭素数６〜２０のアリール基、カルボキシル基、又は１Ｈ−テトラゾール基を表す。＊は不斉炭素原子を表す。Ａ-はカウンター陰イオンを表す。）で表される光学活性ピロリジン塩誘導体を不斉有機触媒に用いて、下記式（６）；
Figure 2018207888
で表わされるＨａｎｔｚｓｈエステルを還元剤に用いて行うことを特徴とする、［１］に記載のラメルテオンの製造法。
[３] 前記光学活性ピロリジン塩誘導体（５）において、Ｒがジフェニルメチル基、（トリメチルシリルオキシ）ジフェニルメチル基、又は（ヒドロキシ）ジフェニルメチル基であり、絶対立体配置がＲ体であり、Ａ-がトリクロロアセテート、又はトリフルオロアセテートである、［２］に記載のラメルテオンの製造法。
[４] 前記不斉還元がエノンリダクターゼを用いて行うことを特徴とする、［１］に記載のラメルテオンの製造法。
[５] 前記エノンリダクターゼがＯＹＥ２、ＮｅｍＡ、ＹｅｒｓＥＲ、ＮＣＲ−Ｒである、［４］に記載のラメルテオンの製造法。
[６] 前記光学活性アルデヒド（２）を、下記式（３）；
Figure 2018207888
で表される光学活性アミンに変換した後、これをプロピオニル化することを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
[７] 前記光学活性アミン（３）に変換する方法が、アミノ基供与体の存在下、トランスアミナーゼを用いて行うことを特徴とする、［６］に記載のラメルテオンの製造法。
[８] 前記アミノ基供与体がイソプロピルアミンであり、前記トランスアミナーゼがω−トランスアミナーゼである、［７］に記載のラメルテオンの製造法。
[９] 前記アミノ基供与体がα−フェネチルアミンであり、前記トランスアミナーゼがω−トランスアミナーゼである、［７］に記載のラメルテオンの製造法。
[１０] 前記アミノ基供与体がα−アミノ酸であり、前記トランスアミナーゼがω−トランスアミナーゼである、［７］に記載のラメルテオンの製造法。
[１１] 前記トランスアミナーゼを有機溶媒中で反応させる、［７］〜［１０］のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
[１２] 樹脂に固定化された前記トランスアミナーゼを有機溶媒中で反応させる、［７］〜［１１］のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
[１３] 前記エナール（１）が、下記式（７）；
Figure 2018207888
で表されるα，β−不飽和ニトリルとヒドリド還元剤を反応させて製造したものである、［１］〜［１２］のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
[１４] 下記式（１）；
Figure 2018207888
で表されるエナール（（Ｅ）−２−［１，２，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）。
本発明によれば、ラメルテオンを簡便、且つ効率よく製造することができる。
酵素フローリアクターを用いた（Ｓ）−２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅ製造での変換率の経時安定性を示すグラフである。
以下、本発明に係るラメルテオンの製造方法について、詳細に述べる。
まずは、本発明の製造法に使用する原料、中間生成物、及び目的生成物について説明する。
本発明の出発原料としては、例えば下記式（７）で表されるα，β−不飽和ニトリル、即ち（Ｅ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌｉｄｅｎｅ）ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅを使用することができる。ここで、化合物（７）は例えば、特許第４０８１１６１号公報に記載の方法に従って、シアノメチルホスホン酸ジエチルと水素化ナトリウムから調製したカルボアニオンと、１，２，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｏｎｅを反応させることなどにより簡便に製造できる。
Figure 2018207888
また、本発明の中間生成物であるエナール、即ち（Ｅ）−２−［１，２，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅは、下記式（１）で表される。ここで、前記化合物（１）は文献未記載の新規化合物である。
Figure 2018207888
また、本発明の中間生成物である光学活性アルデヒド、即ち（Ｓ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅは、下記式（２）で表される。
Figure 2018207888
また、本発明の中間生成物である光学活性アミン、即ち（Ｓ）−２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅは、下記式（３）で表される。
Figure 2018207888
また、本発明の生成物であるラメルテオン、即ち（Ｓ）−Ｎ−［２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ)ｅｔｈｙｌ］ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅは、下記式（４）で表される。
Figure 2018207888
本発明の好ましい態様を図で表すと以下のとおりである。また本願では、「式（２）で表される光学活性アルデヒドを製造し、続いてこれを式（４）で表されるラメルテオンに変換すること」には、光学活性アルデヒド（２）から工程３を経てラメルテオン（４）を製造する方法、及び光学活性アルデヒド（２）から工程４〜５を経てラメルテオン（４）を製造する方法の両方が含まれることとする。
Figure 2018207888
以下に各工程を順を追って説明する。
（工程１）
本工程で、前記式（７）で表されるα，β−不飽和ニトリルにヒドリド還元剤を反応させることにより、前記式（１）で表されるエナールを製造する。
前記ヒドリド還元剤としては例えば、水素化リチウムアルミニウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム、水素化リチウムトリ（ｔｅｒｔ−ブトキシ）アルミニウム、ボラン、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリエチルホウ素リチウム、カテコールボラン等が挙げられ、好ましくは水素化ジイソブチルアルミニウムである。
前記ヒドリド還元剤の使用量として、上限として好ましくは前記化合物（７）に対して１０倍モル量であり、更に好ましくは５倍モル量である。下限としては、前記化合物（７）に対して０．５倍モル量であり、更に好ましくは１倍モル量である。
本工程の反応溶媒としては、反応に影響を与えない限りにおいては特に制限はなく、具体的には例えば、テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、４−メチルテトラヒドロピラン等のエーテル系溶媒；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、メシチレン等の芳香族炭化水素系溶媒；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ−エチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチル−ε−カプロラクタム、ヘキサメチルホスホルアミド等のアミド系溶媒；ジメチルプロピレンウレア等のウレア系溶媒；ヘキサメチルホスホン酸トリアミド等のホスホン酸トリアミド系溶媒等を用いることができる。これらは単独で用いても良く、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その混合比は特に制限されない。好ましくはまたは芳香族炭化水素系溶媒であり、更に好ましくはテトラヒドロフラン、４−メチルテトラヒドロピラン、またはトルエンである。
前記溶媒の使用量は、上限としては、前記化合物（７）に対して好ましくは１００倍重量であり、更に好ましくは５０倍重量であり、特に好ましくは２０倍重量である。下限としては、前記化合物（７）に対して好ましくは０．１倍重量であり、更に好ましくは０．５倍重量であり、特に好ましくは１倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
本反応における反応温度には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、副生成物の生成を少なくするため、上限として好ましくは１２０℃であり、更に好ましくは８０℃であり、特に好ましくは４０℃である。下限としては好ましくは−１００℃であり、更に好ましくは−８０℃であり、特に好ましくは−７０℃である。
本反応における反応時間には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、上限としては好ましくは１００時間であり、更に好ましくは５０時間であり、特に好ましくは２５時間である。下限として好ましくは０．１時間であり、更に好ましくは０．５時間であり、特に好ましくは１時間である。
本工程の混合順序について特に制限はないが、化合物（７）と溶媒を含む溶液に対し、ヒドリド還元剤を添加するのが好ましい。
反応後の処理としては、反応液から生成物を取得するための一般的な処理を行えばよい。例えば、反応終了後の反応液を水、又は塩酸、硫酸等の酸水溶液に加え、一般的な抽出溶媒、例えば酢酸エチル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、トルエン、ヘキサン等を用いて抽出操作を行うとよい。得られた抽出液から、減圧加熱、真空乾燥等の操作や、無水硫酸マグネシウム等の乾燥剤の使用により、反応溶媒及び抽出溶媒を留去すると目的物が得られる。このようにして得られた目的物は、後続工程に使用できる十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。
（工程２）
本工程で、前記式（１）で表されるエナールを不斉還元することにより、前記式（２）で表される光学活性アルデヒドを製造する。ここで、前記エナール（１）は工程１に記載の方法に従って製造してもよく、又はそれ以外の方法で製造したものであっても本発明の範囲に含まれる。
前記不斉還元する方法としては、不斉有機触媒存在下に還元剤を用いる方法、若しくはエノンリダクターゼを用いる方法が挙げられる。
まずは不斉有機触媒存在下に還元剤を用いる方法について説明する。
前記不斉有機触媒としては例えば、（２Ｓ，５Ｓ）−２−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ−５−ｂｅｎｚｙｌ−４−ｏｘｏｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ）−３−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｏｘｏｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、（２Ｓ，５Ｓ）−５−Ｂｅｎｚｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ−２−（５−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｆｕｒｙｌ）−２−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、（５Ｓ）−２，２，３−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−４−ｏｘｏｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、（２Ｓ，５Ｓ）−２−ｔｅｒｔ-Ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ−５−ｂｅｎｚｙｌ−４−ｏｘｏｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、（Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ）−３−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｏｘｏｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、（２Ｓ，５Ｓ）−５−Ｂｅｎｚｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ−２−（５−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｆｕｒｙｌ）−２−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、（５Ｓ）−２，２，３−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−４−ｏｘｏｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ等のマクミラン型触媒、
及び下記式（５）；
Figure 2018207888
で表される光学活性ピロリジン塩誘導体等が挙げられ、好ましくは、式（５）で表わされる光学活性ピロリジン塩誘導体である。
ここで、式（５）中、Ｒは置換基を有しても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有しても良い炭素数２〜２０のアルケニル基、置換基を有しても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、置換基を有しても良い炭素数６〜２０のアリール基、カルボキシル基、又は１Ｈ−テトラゾール基を表し、置換基を有しても良い炭素数１〜２０（より好ましくは炭素数１〜１０）のアルキル基、カルボキシル基、又は１Ｈ−テトラゾール基が好ましい。前記置換基としては、フェニル基等の炭素数６〜１０の芳香族炭化水素基；メトキシ基、エトキシ基等の炭素数１〜６のアルコキシ基；ヒドロキシ基；トリメチルシリルオキシ基、トリエチルシリルオキシ基等のトリアルキルシリルオキシ基；ピロリジニル基、ピペリジニル基等の五〜七員複素環基；等が例示され、これらの置換基は１又は２以上を組み合わせてもよい。
Ｒとして好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基、メトキシメチル基、（１−ピロリジニル）メチル基、ビニル基、ベンジル基、フェニル基、ジフェニルメチル基、（トリメチルシリルオキシ）ジフェニルメチル基、（ヒドロキシ）ジフェニルメチル基、カルボキシル基、又は１Ｈ−テトラゾール基であり、より好ましくはジフェニルメチル基、（トリメチルシリルオキシ）ジフェニルメチル基、又は（ヒドロキシ）ジフェニルメチル基であり、よりさらに好ましくはジフェニルメチル基である。
式（５）中、＊は不斉炭素原子を表し、絶対立体配置はＳ体またはＲ体のいずれでもよく、好ましくは絶対立体配置がＲ体である。
式（５）中、Ａ-はカウンター陰イオンを表す。前記カウンター陰イオンとして特に制限はないが、好ましくは塩化物イオン、臭化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、メシレート、トシレート、トリフレート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、アセテート、又はベンゾエートであり、更に好ましくはトリクロロアセテート、又はトリフルオロアセテートである。また、ポリマーに担持されたカウンター陰イオンでもよく、具体的には例えば、カウンター陰イオンがスルホネートである陽イオン交換樹脂などが挙げられる。
また、前記光学活性ピロリジン塩誘導体は、反応系中で光学活性ピロリジンと、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフロオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、安息香酸等の酸を混合することにより調製してもよい。酸として好ましくは、トリフルオロ酢酸、又はトリクロロ酢酸であり、より好ましくはトリフルオロ酢酸である。
前記酸の使用量としては、上限としては前記光学活性ピロリジンの１０倍重量であり、更に好ましくは５倍重量であり、特に好ましくは３倍重量である。下限としては、前記化合物（１）に対して好ましくは０．００１倍重量であり、更に好ましくは０．０１倍重量であり、特に好ましくは０．１倍重量である。
前記不斉有機触媒の使用量としては、上限としては、前記化合物（１）に対して好ましくは１０倍重量であり、更に好ましくは５倍重量であり、特に好ましくは１倍重量である。下限としては、前記化合物（１）に対して好ましくは０．００１倍重量であり、更に好ましくは０．０１倍重量であり、特に好ましくは０．１倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
前記還元剤としては、水素ガス、蟻酸、蟻酸ナトリウム、蟻酸トリエチルアンモニウム、１，４−ジヒドロピリジン誘導体等が挙げられるが、好ましくは１，４−ジヒドロピリジン誘導体である。前記１，４−ジヒドロピリジン誘導体として更に好ましくは、下記式（６）；
Figure 2018207888
で表わされるＨａｎｔｚｓｈエステル、即ち、Ｄｉｅｔｈｙｌ １，４−Ｄｉｈｙｄｒｏ−２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３，５−ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅである。
前記還元剤の使用量としては、上限としては、前記化合物（１）に対して好ましくは１００倍重量であり、更に好ましくは５０倍重量であり、特に好ましくは１０倍重量である。下限としては、前記化合物（１）に対して好ましくは０．１倍重量であり、更に好ましくは０．５倍重量であり、特に好ましくは１倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
本工程の溶媒としては、反応に影響を与えない限りにおいては特に制限はなく、具体的には例えば、水；メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、エチレングリコール等のアルコール系溶媒；テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、４−メチルテトラヒドロピラン等のエーテル系溶媒；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒；酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、メシチレン等の芳香族炭化水素系溶媒；塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ−エチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチル−ε−カプロラクタム、ヘキサメチルホスホルアミド等のアミド系溶媒；ジメチルプロピレンウレア等のウレア系溶媒；ヘキサメチルホスホン酸トリアミド等のホスホン酸トリアミド系溶媒等を用いることができる。これらは単独で用いても良く、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その混合比は特に制限されない。好ましくはエーテル系溶媒；エステル系溶媒；芳香族炭化水素系溶媒；ニトリル系溶媒であり、更に好ましくはテトラヒドロフラン、４−メチルテトラヒドロピラン、酢酸エチル、トルエン、又はアセトニトリルであり、特に好ましくはテトラヒドロフラン、トルエン、又はアセトニトリルである。
前記溶媒の使用量は、上限としては、前記化合物（１）に対して好ましくは１００倍重量であり、更に好ましくは５０倍重量であり、特に好ましくは２０倍重量である。下限としては、前記化合物（１）に対して好ましくは０．１倍重量であり、更に好ましくは０．５倍重量であり、特に好ましくは１倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
本反応における反応温度には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、副生成物の生成を少なくするため、上限としては好ましくは１５０℃であり、更に好ましくは１００℃であり、特に好ましくは５０℃である。下限としては好ましくは−８０℃であり、更に好ましくは−３０℃であり、特に好ましくは０℃である。
本反応における反応時間には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、上限としては好ましくは１００時間であり、更に好ましくは５０時間であり、特に好ましくは２５時間である。下限として好ましくは０．１時間であり、更に好ましくは０．５時間であり、特に好ましくは１時間である。
本工程の化合物（１）、不斉有機触媒、還元剤、溶媒の混合順序については、特に制限はない。
反応後の処理としては、反応液から生成物を取得するための一般的な処理を行えばよい。例えば、反応終了後の反応液を水、又は塩酸、硫酸等の酸水溶液に加え、一般的な抽出溶媒、例えば酢酸エチル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、トルエン、ヘキサン等を用いて抽出操作を行うとよい。得られた抽出液から減圧加熱等の操作により、反応溶媒及び抽出溶媒を留去すると目的物が得られる。このようにして得られた目的物は、後続工程に使用できる十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。
続いて、エノンリダクターゼを用いる方法について説明する。
前記式（１）で表されるエナールの炭素−炭素間二重結合を立体選択的に還元する能力を有するエノンリダクターゼを作用させることで、前記式（２）で表される光学活性アルデヒドを製造する。
エノンリダクターゼは、エナール（１）のエノン部位の炭素−炭素間二重結合を立体選択的に還元して、光学活性アルデヒド（２）を生成する能力を有するものであればいずれを用いても良い。
エノンリダクターゼは、目的とする還元活性を有する限りにおいては、酵素そのものだけでなく、当該酵素を生成する微生物の菌体そのもの、微生物の培養液、又は菌体処理物であってもよい。また、当該微生物由来の還元活性を有する酵素をコードするＤＮＡが導入された形質転換体も含むものとする。
上記微生物の菌体処理物としては特に限定されず、例えば、乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体又は菌体を破砕した無細胞抽出液などを挙げることができる。更には、培養物より不斉還元反応を触媒する酵素を精製し、これを使用してもよい。
これらは、単独で用いても、２種以上組み合わせて用いても良い。また、これら微生物は周知の方法で固定化して用いてもよい。
エナール（１）のエノン部位の炭素−炭素間二重結合を立体選択的に還元して光学活性アルデヒド（２）を生成する能力を有するエノンリダクターゼとしては、通常エノンリダクターゼと認識されている旧黄色酵素（Ｏｌｄ Ｙｅｌｌｏｗ Ｅｎｚｙｍｅ）を含み、そのようなものとしては、国際生化学・分子生物学連合の酵素分類法によりＥＣ１．６．９９に分類される酸化還元酵素が挙げられる。ＥＣ１．６．９９に分類される酸化還元酵素としては、ＥＣ１．６．９９．１：ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．６．９９．２：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン）、ＥＣ１．６．９９．３：ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．６．９９．５：ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（キノン）、またはＥＣ１．６．９９．６：ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ（キノン）に分類される酸化還元酵素が挙げられ、好ましくは、ＥＣ１．６．９９．１：ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼである。
上記ＥＣ１．６．９９．１：ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼとしては、具体的には、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、又はシゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母由来のもの、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等の細菌由来のものが挙げられ、好ましくはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等の微生物に由来するものが挙げられ、最も好ましい例にはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、バシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、エルシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）が含まれる。
エノンリダクターゼとしては、例えば、ＯＹＥ２、ＯＹＥ３（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）由来。国際公開第２００６／１２９６２８号に記載）、ＫＹＥ（クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）由来。Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．，３４９，１５２１（２００７）に記載）、ＹｑｊＭ（バシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，１９８９１（２００３）に記載）、ＮｅｍＡ（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ｃｏｌｉ）由来。Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０，１１０（１９９７）に記載）、ＸｅａＡ、ＸｅｎＥなど（シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来。Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７４，６７０３（２００８）に記載）、ＹｅｒｓＥＲ（エルシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）由来。Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．，３４９，１５２１（２００７）に記載）、ＮＣＲ−Ｒ（ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）由来。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９８，２２（２００７）に記載）などが含まれ、好ましくは、ＯＹＥ２、ＮｅｍＡ、ＹｅｒｓＥＲ、又はＮＣＲ−Ｒであり、より好ましくはＮｅｍＡ、ＹｅｒｓＥＲ、又はＮＣＲ−Ｒであり、更に好ましくはＮｅｍＡである。
酵素を生成する微生物は、通常、入手または購入が容易な保存株から得ることができる。例えば、以下のカルチャーコレクションより入手可能である。
・独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）
・独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室（ＪＣＭ）（〒３５１−０１９８ 埼玉県和光市広沢２−１）
・Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（Ｍａｒｓｃｈｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
また、本発明に利用するエノンリダクターゼ（例えば、ＯＹＥ２）は、目的の還元酵素活性を有している限りにおいては、その公知のアミノ酸配列（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，６０９７−６１０６（１９９３）に記載のＯＹＥ２のアミノ酸配列）において１若しくは複数個（例えば、４０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下）のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたポリペプチドであってもよい。あるいは、そのアミノ酸配列が公知の配列と比較した際に、相同性８５％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、または９９％以上のアミノ酸配列を有していても良い。また、目的の還元酵素活性を有する限り、本発明に利用する還元酵素のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合してもよい。例えばヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また目的の還元酵素活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
本発明においては、エノンリダクターゼをコードするＤＮＡを含む形質転換体を使用すると、より効率的に光学活性アルデヒド（２）を製造することができる。なお、本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等の成書に記載されている方法により実施できる。
上記の形質転換体に用いるベクターとしては、適当な宿主生物内で本発明に利用する還元酵素をコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第９４／０３６１３号）などが挙げられる。
なお、「制御因子」とは、機能的プロモーター、及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
また、「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。なお、制御因子のタイプ及び種類が宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
各酵素を発現させるために用いる宿主生物は、各酵素をコードするＤＮＡを含む酵素発現ベクターにより形質転換され、ＤＮＡを導入した酵素を発現することができる生物であれば、特に制限するものではない。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））が特に好ましい。
本発明に利用する還元酵素をコードするＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入することができる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（以下、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１）コンピテントセル（タカラバイオ社製））を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入することができる。
エナール（１）のエノン部位の炭素−炭素間二重結合を還元する酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体の例としては、ベクターｐＴＳＹＥ２でＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換して得られる、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＹＥ２）、同様の方法で得られる、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＹＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＫＹＥ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＹｑｊＭ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＮｅｍＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＸｅｎＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＸｅｎＥ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＹｅｒｓＥＲ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＮＣＲ−Ｒ）などが挙げられる。
また、本発明においては、目的とする還元活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を用いることにより、より効率的に本発明の光学活性化合物を製造することができる。例えば、エナール（１）のエノン部位の炭素−炭素間二重結合を還元する酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、エナール（１）のエノン部位の炭素−炭素間二重結合を還元する酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。また、酵素を細胞外へ放出する宿主細胞を用いる場合や、宿主細胞の破砕液などを反応に用いる場合には、エナール（１）のエノン部位の炭素−炭素間二重結合を還元する酵素をコードするＤＮＡと補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをそれぞれ別の宿主細胞へ導入し、これら宿主細胞を同一培養液内または異なる培養液を使って培養してもよい。
補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、ＮＡＤ+（酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド）もしくはＮＡＤＰ+（酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸）をＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド）、もしくはＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸）に変換する能力を有している酸化還元酵素が好ましい。
このような酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素などが挙げられる。好適には、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素が使用される。
ギ酸脱水素酵素としては、例えば、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クロイッケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、ハイホマイクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アンシロバクター（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、などの微生物に由来する酵素が挙げられ、特にチオバシラス・エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）から得られる酵素が挙げられる。
グルコース脱水素酵素としては、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属などの微生物に由来する酵素が挙げられ、特にバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ペディオコッカス・パーブラス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｒｖｕｌｕｓ）から得られる酵素が挙げられる。
前記酵素としては、例えば、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（特開２００６−２６２７６７号公報）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４，６７２−６７８，（２００２））、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８９，１５９−１６３，（１９８２））、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属（国際公開第２００９／０４１４１５号）由来のグルコース脱水素酵素やクリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来のグルコース−６−リン酸脱水素酵素が知られている（Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２２８，１１３−１１９（１９８４））。
次に、エノンリダクターゼを用いたエナール（１）の還元反応について説明する。
エノンリダクターゼを用いた還元反応の際には、適当な溶媒と基質のエナール（１）、上記微生物、その培養物、またはその処理物等の酵素源を混合し、ｐＨ調整下に攪拌、振とうまたは静置する。
エノンリダクターゼを用いたエナール（１）の還元反応を促進させるために、前記反応液に、ＮＡＤ+及び／またはＮＡＤＰ+をそれぞれの還元型へ還元する酵素と、該還元のための基質を共存させて反応を行うのが好ましい。例えば、還元型へ還元する酵素としてグルコース脱水素酵素、還元のための基質としてグルコースをそれぞれ共存させるか、または、還元型へ還元する酵素としてギ酸脱水素酵素、還元のための基質としてギ酸をそれぞれ共存させるのがよい。
一般に、生物学的方法による還元反応に必要とされているＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素を添加することにより、反応を促進させることができる。この場合、通常は、反応液に直接これらを添加する。
更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも、還元反応をより促進することに効果的である。
また、反応系に有機溶剤を共存させてもよい。酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサン等の水に不溶な有機溶媒を反応液に添加すれば、基質及び／又は還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避できる。また、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加すれば、基質の溶解度を高めることができる。
反応溶媒としては、通常、水や緩衝液等の水性媒体を用いる。緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液やトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液が挙げられる。
酵素源は、通常、上記微生物の菌体を含んだ培養液をそのまま反応に使用する。培養液を濃縮して用いてもよい。また、培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、培養液を遠心分離等により処理して得られる菌体または菌体処理物を使用するとよい。
基質であるエナール（１）は、反応の初期に一括添加してもよく、反応の進行にあわせて逐次分割して添加してもよい。
反応時の温度は、上限として好ましくは６０℃であり、更に好ましくは４０℃である。下限としては好ましくは１０℃であり、更に好ましくは２０℃である。
反応時のｐＨは、上限として好ましくは１０であり、更に好ましくは９である。下限として好ましくは２．５であり、更に好ましくは５である。
反応液中の酵素源の量は、これらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよく、上限として好ましくは５０％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは１０％（Ｗ／Ｖ）である。下限として好ましくは０．０１％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは０．１％（Ｗ／Ｖ）である。
反応液中の基質濃度は、上限として好ましくは５０％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは３０％（Ｗ／Ｖ）である。下限として好ましくは０．０１％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは０．１％（Ｗ／Ｖ）である。
反応は、通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。
反応時間は、基質濃度、微生物の量及びその他の反応条件により適宜決定される。反応時間の上限として好ましくは３３６時間であり、更に好ましくは１６８時間である。下限として好ましくは０．１時間であり、更に好ましくは１時間である。
還元反応を促進させるために、反応液にグルコース、エタノール、イソプロパノールなどのエネルギー源を加えるのが好ましい。添加量の上限として好ましくは５０％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは３０％（Ｗ／Ｖ）である。下限として好ましくは０．１（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは０．５％（Ｗ／Ｖ）である。
還元反応により生成した光学活性アルデヒド（２）を取り出す方法は特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後に、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン、ｎ−ブタノール、ジクロロメタン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製することにより、高純度の光学活性アルデヒド（２）を容易に得ることができる。
このようにして得られた光学活性アルデヒド（２）は、いかなる変換方法を用いてラメルテオン（４）に誘導しても本発明の範囲に含まれる。好ましくは、光学活性アルデヒド（２）をプロピオン酸アミドと縮合して還元する方法（工程３）、若しくは光学活性アルデヒド（２）を光学活性アミン（３）に変換した後（工程４）、プロピロオニル化する方法（工程５）である。以下に、各工程について詳細に説明する。
（工程３）
本工程では、前記式（２）で表される光学活性アルデヒドをプロピオン酸アミドと縮合して還元することにより、前記式（４）で表されるラメルテオンを製造する。具体的には例えば、Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ ２０１３，３５５，７１７−７３３．に記載の方法に従って、ジグライム溶液中、プロピオンアミド、金属触媒として［Ｒｈ（ＣＯＤ）Ｃｌ］2、配位子としてＸａｎｔｐｈｏｓ（４，５−Ｂｉｓ（ｄｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｏ）−９，９−ｄｉｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｅｎｅ）を共存させ、水素ガスを加えることによって目的物が得られる。
このようにして得られた目的物は十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。
（工程４）
本工程で、前記式（２）で表される光学活性アルデヒドから、前記式（３）で表される光学活性アミンを製造する。ここで、前記光学活性アルデヒド（２）は工程２に記載の方法に従って製造してもよく、又はそれ以外の方法で製造したものであっても本発明の範囲に含まれる。
具体的な変換方法としては例えば、アンモニアとヒドリド還元剤を用いる方法、アンモニアと金属触媒存在下に水素化する方法、金属触媒存在下に蟻酸を用いる方法、酵素（トランスアミナーゼ）存在下にトランスアミノ化する方法が挙げられる。
前記アンモニアとヒドリド還元剤を用いる方法については例えば、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，７５，５４７０−５４７７．に記載の方法に従えばよい。即ち、エタノール溶媒中にアンモニア水と酢酸アンモニウムを加えて、シアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元することにより目的物が得られる。
また、前記アンモニアと金属触媒存在下に水素化する方法については例えば、特許第４０５９９７８号公報に記載の方法に従えばよい。即ち、均一系のニッケル、ロジウム、パラジウム、イリジウム等の遷移金属触媒存在下に、アンモニアガスと水素ガスを加えることにより目的物が得られる。若しくは、Ｃａｔａｌｙｓｔｓ ２０１５，５，２２５８−２２７０．に記載の方法に従ってもよく、即ち、アルミナに担持されたルテニウム触媒存在下に、アンモニアガスと水素ガスを加えることによっても目的物が得られる。
また、前記金属触媒存在下に蟻酸を用いる方法については例えば、国際公開第２０１６／０９６９０５号に記載の方法に従えばよい。即ち、パラジウム触媒存在下に蟻酸アンモニウムを用いることにより目的物が得られる。
更に、酵素（トランスアミナーゼ）存在下でトランスアミノ化する方法について説明する。即ち、前記式（２）で表される光学活性アルデヒドに、アミノ基供与体の存在下、前記式（３）で表される光学活性アミンを生成する能力を有するトランスアミナーゼを作用させることで、前記式（３）で表される光学活性アミンを製造する。
トランスアミナーゼは、光学活性アルデヒド（２）から、アミノ基供与体の存在下、光学活性アミン（３）を生成する能力を有するものであればいずれを用いても良い。また、トランスアミナーゼは、目的とするトランスアミノ化活性を有する限りにおいては、酵素そのものだけでなく、当該酵素を生成する微生物の菌体そのもの、微生物の培養液、または菌体処理物であってもよい。また、当該微生物由来の還元活性を有する酵素をコードするＤＮＡが導入された形質転換体も含むものとする。
上記微生物の菌体処理物としては特に限定されず、例えば、乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体または菌体を破砕した無細胞抽出液などをあげることができる。更には、培養物より不斉還元反応を触媒する酵素を精製し、これを使用してもよい。これらは、単独で用いても、２種以上組み合わせて用いても良い。
また、これら微生物は周知の方法で固定化して用いてもよい。固定化方法としては、一般に、担体結合法、架橋法、包括法が挙げられるが、いずれを用いても良い。
また、前記トランスアミナーゼを、水中で反応させてもよく、有機溶媒中で反応、すなわち反応系に有機溶媒を共存、あるいは、有機溶媒のみを用いて反応させてもかまわない。有機溶媒のみを使用する場合には、若干の水を添加することで反応性が改善することが期待される。溶媒を使用する場合の溶剤としては、グリセロール、エチレングリコール、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール等のアルコール系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒；ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の脂肪族炭化水素系溶媒；酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒；アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒；ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒；等が挙げられる。好ましい溶媒としては、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルが挙げられ、さらに好ましい溶媒としては、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルが挙げられる。
光学活性アルデヒド（２）から、アミノ基供与体の存在下、光学活性アミン（３）を生成する能力を有するトランスアミナーゼとしては、例えば、国際生化学・分子生物学連合の酵素分類法によりＥＣ２．６．１．Ｘに分類される酵素群が挙げられる。
本発明の特に好ましい実施形態において、トランスアミナーゼは、一般にω−トランスアミナーゼと呼ばれるものが好ましい。ω−トランスアミナーゼとはαアミノ酸以外のアミンを生成する活性を持つものを示す。
上記ω−トランスアミナーゼとしては、具体的には、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、等の細菌由来のものが挙げられる。
好ましくは、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）、アルカリゲネス・デネトリフィカンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・コルガータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ）、メソリゾビウム・エスピー（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、ロドバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）が挙げられる。
最も好ましい例には、アースロバクター・エスピーＫＮＫ１６８（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス・エスピーＫＮＫ４２５（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＫＮＫ４２５）、シュードモナス・エスピーＭＶ３７（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＶ３７）、ビブリオ・フルビアリスＪＳ１７（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）、アルカリゲネス・デネトリフィカンスＹ２ｋ−２（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ Ｙ２ｋ−２）、シュードモナス・フルオレッセンスＫＮＫ０８−１８（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＫＮＫ０８−１８）、シュードモナス・コルガータ１０Ｆ６（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６）、メソリゾビウム・エスピーＬＵＫ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＬＵＫ）、クロモバクテリウム・ビオラセウムＤＳＭ ３０１９１（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＤＳＭ ３０１９１）、バシラス・メガテリウムＳＣ６３９４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＳＣ６３９４）、カウロバクター・クレセンタスＣＢ１５（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ ＣＢ１５）、ロドバクター・スファエロイデスＤＳＭ １５８（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ １５８）などが挙げられる。
これらのω−トランスアミナーゼは、例えば、Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（２００３）２５，１８４３−１８４６，Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９７）５５，３４８−３５８，Ｓｈｉｎ ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｂｏｏｋ ｏｆ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，２１７ｔｈ ＡＣＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｎａｈｅｉｍ，Ｃａｌｉｆ．，Ｍａｒｃｈ ２１−２５，（１９９９）１８０，Ｓｈｉｎ ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｂｉｏｓｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００１）６５，１７８２−１７８８ ａｎｄ Ｓｈｉｎ ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９８）６０，５３４−５４０，Ｍ．Ｓｈａｈｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１２）９４，１１６３−１１７１，Ｓａｍ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ ｃａｔａｌ．（２０１２）２，９９３−１００１，Ｒｕｄａｔ ｅｔ ａｌ．，ＡＭＢ Ｅｘｐｒｅｓｓ（２０１２）２：１１，Ｐａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，（２０１１）１０８，１４７９−１４９３，国際公開第２０１２／１２４６３９号，国際公開第２０１２／０４３６５３号，国際公開第２０１２／０４３６２２号，国際公開第２０１２／００７５４８号，国際公開第２０１１／０２６５５６号等に記載されている。
これら微生物は、通常、入手または購入が容易な保存株から得ることができる。例えば、以下のカルチャーコレクションより入手可能である。
・独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）
・独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室（ＪＣＭ）（〒３５１−０１９８ 埼玉県和光市広沢２−１）
・Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（Ｍａｒｓｃｈｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
また、本発明に利用するトランスアミナーゼは、目的のトランスアミノ化活性を有している限りにおいては、その公知のアミノ酸配列において１、若しくは複数個（例えば、４０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下）のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたポリペプチドであってもよい。あるいは、そのアミノ酸配列が公知のアミノ酸配列に対して相同性８５％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、または９９％以上のアミノ酸配列を有していても良い。また、トランスアミノ化活性を有する限り、本発明に利用する還元酵素のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合してもよい。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、目的の還元酵素活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
本発明においては、トランスアミナーゼをコードするＤＮＡを含む形質転換体を使用すると、より効率的に光学活性アミン（３）を製造することができる。なお、本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等の成書に記載されている方法により実施できる。
上記の形質転換体に用いるベクターとしては、適当な宿主生物内で本発明に利用するトランスアミナーゼをコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第９４／０３６１３号）などが挙げられる。
なお、「制御因子」とは、機能的プロモーター、及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
また、「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。なお、制御因子のタイプ及び種類が宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
各酵素を発現させるために用いる宿主生物は、各酵素をコードするＤＮＡを含む酵素発現ベクターにより形質転換され、ＤＮＡを導入した酵素を発現することができる生物であれば、特に制限するものではない。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））が特に好ましい。
本発明に利用する還元酵素をコードするＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入することができる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（以下、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１）コンピテントセル（タカラバイオ社製））を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入することができる。
トランスアミナーゼを用いたアミノ化反応は一般的に可逆反応であるため、一般的に平衡点で見かけ上反応が停止する。これらの反応平衡を解消する公知の方法を組み合わせることで、本発明のポリペプチドを用いた反応を改善することができる。例えば、国際公開第２００７／１３９０５５号に記載のように、アミノ基供与体としてアラニンを用いて、副生成するピルビン酸を乳酸脱水素酵素と補酵素再生用のグルコース脱水素酵素を共役させることで乳酸へ変換し、反応平衡を解消する方法が有効である。同様に、アミノ基供与体としてアラニンを用いて、副生成するピルビン酸を、ピルビン酸デカルボキシラーゼで除く方法（国際公開第２００７／０９３３７２号）、アラニン脱水素酵素を用いる方法（ＵＳ２００９／０１１７６２７Ａ１公報）、過酸化水素で除く方法（ＵＳ２００８／０２１３８４５Ａ１公報）、アセト酪酸合成酵素を用いる方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１１），３０３０−３０３３（２００８））、イソプロピルアミンを用いて生成するアセトンを除去する方法なども有効である。
上記の反応平衡を解消するために複数の酵素を共役させる場合には、それら複数の酵素を同一宿主細胞内で生産する形質転換体を用いることにより、より効率的に本発明の光学活性化合物を製造することができる。当該形質転換体は必要な複数の酵素遺伝子コードするＤＮＡを同一ベクターに組み込み、これを同一の宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる複数のベクターに組み込み、同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。
アミノ基供与体としては、酵素源の存在下で前記式（３）で表される光学活性アミンを生成するものであればいかなるものでも使用できる。具体例としては、α−フェネチルアミン、２−ブチルアミン、２−ペンチルアミン、２−ヘプチルアミン、３−ヘプチルアミン、ｎ−エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｎ−アミルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、α−アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン等）、３−アミノ−１−フェニルブタン、ベンジルアミン、β−フェネチルアミン、シクロヘキシルアミンおよびそれらの光学活性体が挙げられる。なかでも、α−フェネチルアミン、イソプロピルアミン、又はα−アミノ酸（例えば、アラニン等）が好ましく、α−フェネチルアミン又はα−アミノ酸がより好ましい。
ω−トランスアミナーゼとアミノ基供与体の好ましい組み合わせとしては、以下のものが例示される。
１）アミノ基供与体がイソプロピルアミンのときは、好ましくはアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、またはシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）であり、より好ましくはアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）である。
２）アミノ基供与体がα−フェネチルアミンのときは、好ましくはアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、またはシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）であり、より好ましくはアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、またはシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）であり、更に好ましくはシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）である。
３）アミノ基供与体がα−アミノ酸（特にアラニン）のときは、好ましくはアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、またはシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）であり、より好ましくはアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、またはシュードモナス・エスピーＭＶ３７（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＶ３７）である。
次に、トランスアミナーゼを用いた光学活性アルデヒド（２）のトランスアミノ化反応について説明する。
酵素源を用いたトランスアミノ化反応の際には、適当な溶媒と基質の光学活性アルデヒド（２）、上記微生物、その培養物、またはその処理物等を混合し、ｐＨ調整下に攪拌、振とうまたは静置する。
反応溶媒としては、通常、水や緩衝液等の水性媒体を用いる。緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液やトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液が挙げられる。
トランスアミナーゼは、上記微生物の菌体を含んだ培養液をそのまま反応に使用してもよいし、培養液を濃縮して用いてもよい。また、培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、培養液を遠心分離等により処理して得られる菌体または菌体処理物を使用するとよい。
基質である光学活性アルデヒド（２）は、反応の初期に一括添加してもよく、反応の進行にあわせて逐次分割して添加してもよい。
反応時の温度は、上限として好ましくは６０℃であり、更に好ましくは４０℃である。下限としては好ましくは１０℃であり、更に好ましくは２０℃である。
反応時のｐＨは、上限として好ましくは１０であり、更に好ましくは９である。下限として好ましくは２．５であり、更に好ましくは５である。
反応液中の酵素源の量は、これらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよく、上限として好ましくは５０％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは１０％（Ｗ／Ｖ）である。下限として好ましくは０．０１％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは０．１％（Ｗ／Ｖ）である。
反応液中の基質濃度は、上限として好ましくは５０％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは３０％（Ｗ／Ｖ）である。下限として好ましくは０．０１％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは０．１％（Ｗ／Ｖ）である。
反応は、通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。
反応時間は、基質濃度、微生物の量及びその他の反応条件により適宜決定される。反応時間の上限として好ましくは３３６時間であり、更に好ましくは１６８時間である。下限として好ましくは０．１時間であり、更に好ましくは１時間である。
還元反応を促進させるために、反応液にグルコース、エタノール、イソプロパノールなどのエネルギー源を加えるのが好ましい。添加量の上限として好ましくは５０％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは３０％（Ｗ／Ｖ）である。下限として好ましくは０．１（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは０．５％（Ｗ／Ｖ）である。
更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも効果的である。
更に、基質及び／又は還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避する目的で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒（不水溶性有機溶媒）を反応液に添加してもよい。
更に、基質の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒（水溶性有機溶媒）を添加することもできる。
上記の反応により、光学活性アミンが生成する。生成した光学活性アミンは、反応混合液から抽出、蒸留、再結晶、カラム分離など公知の方法によって単離することができる。
例えば、ｐＨを酸性に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；ヘキサン、オクタン、ベンゼン等の炭化水素類；塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等一般的な溶媒により、生成した光学活性アミノ化合物を水相に残したまま、未反応の基質およびアミノ基転移反応により生じたアミノ基供与体に対応するケトン化合物を選択的に除くことができる。
生成した光学活性アミノ化合物および未反応のアミノ基供与体は、例えば、ｐＨを塩基性に調節し、同様に一般的な有機溶媒で抽出することができる。
生成した光学活性アミノ化合物と未反応のアミノ基供与体は、例えば、蒸留により分離することができる。
このようにして得られた目的物は、後続工程に使用できる十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、転溶洗浄、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。好ましくは、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シュウ酸、蟻酸、酢酸、安息香酸、ｐ−ニトロ安息香酸、トリフルオロ酢酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、カンファースルホン酸等の酸と塩を形成させて晶析する方法である。具体的には例えば、国際公開第２００６／０３０７３９号に記載された方法、即ち、前記光学活性アミン（３）の塩酸塩をｎ−ブタノールから晶析する方法である。
（工程５）
本工程で、工程４に記載の方法で製造された前記式（３）で表される光学活性アミンを、更にプロピオニル化することにより、前記式（４）で表されるラメルテオンを製造する。
前記プロピオニル化する方法としては、塩基存在下に塩化プロピオニル、臭化プロピオニル、又は無水プロピオン酸等のプロピオニル化剤を用いればよい。
前記塩基としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどの無機塩基；リチウムメトキシド、リチウムエトキシド、リチウムイソプロポキシド、リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムイソプロポキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、カリウムイソプロポキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等のアルコキシド；水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルモルホリン、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデク−７−エン、ピリジン、キノリン、イミダゾール等のアミンが挙げられる。これらは単独で用いても良く、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その混合比は特に制限されない。好ましくは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、又はトリブチルアミンであり、更に好ましくは、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、又はトリエチルアミンである。
前記塩基の使用量としては、上限としては、前記化合物（３）に対して好ましくは１００倍重量であり、更に好ましくは５０倍重量であり、特に好ましくは１０倍重量である。下限としては、前記化合物（３）に対して好ましくは０．１倍重量であり、更に好ましくは０．５倍重量であり、特に好ましくは１倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
前記プロピオニル化剤の使用量としては、上限としては、前記化合物（３）に対して好ましくは５０倍重量であり、更に好ましくは１０倍重量であり、特に好ましくは５倍重量である。下限としては、前記化合物（３）に対して好ましくは０．５倍重量であり、更に好ましくは０．８倍重量であり、特に好ましくは１倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
本工程の溶媒としては、反応に影響を与えない限りにおいては特に制限はなく、具体的には例えば、水；テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、エチレングリコールジメチルエーテル、４−メチルテトラヒドロピラン等のエーテル系溶媒；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒；酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、メシチレン等の芳香族炭化水素系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒；塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ−エチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチル−ε−カプロラクタム、ヘキサメチルホスホルアミド等のアミド系溶媒；ジメチルプロピレンウレア等のウレア系溶媒；ヘキサメチルホスホン酸トリアミド等のホスホン酸トリアミド系溶媒等を用いることができる。これらは単独で用いても良く、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その混合比は特に制限されない。好ましくは水；テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、４−メチルテトラヒドロピラン等のエーテル系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒であり、更に好ましくは水、テトラヒドロフラン、アセトン、又はアセトニトリルであり、特に好ましくはテトラヒドロフラン、又はアセトニトリルである。
前記溶媒の使用量は、上限としては、前記化合物（３）に対して好ましくは１００倍重量であり、更に好ましくは５０倍重量であり、特に好ましくは２０倍重量である。下限としては、前記化合物（３）に対して好ましくは０．１倍重量であり、更に好ましくは０．５倍重量であり、特に好ましくは１倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
本反応における反応温度には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、副生成物の生成を少なくするため、上限としては好ましくは１５０℃であり、更に好ましくは１００℃であり、特に好ましくは５０℃である。下限としては好ましくは−８０℃であり、更に好ましくは−３０℃であり、特に好ましくは０℃である。
本反応における反応時間には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、上限としては好ましくは１００時間であり、更に好ましくは５０時間であり、特に好ましくは２５時間である。下限として好ましくは０．１時間であり、更に好ましくは０．５時間であり、特に好ましくは１時間である。
本工程の化合物（３）、プロピオニル化剤、塩基、溶媒の混合順序については、特に制限はない。
反応後の処理としては、反応液から生成物を取得するための一般的な処理を行えばよい。例えば、反応終了後の反応液を水、又は塩酸、硫酸等の酸水溶液に加え、一般的な抽出溶媒、例えば酢酸エチル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、トルエン、ヘキサン等を用いて抽出操作を行う。得られた抽出液から減圧加熱等の操作により、反応溶媒及び抽出溶媒を留去すると目的物（４）が得られる。好ましくは、反応液に水を加えることで析出する目的物を濾別し、水、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、塩化メチレン、トルエン、ヘプタン等で洗浄するとよい。このようにして得られた目的物であるラメルテオン（４）は十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。
本願は、２０１７年５月１０日に出願された日本国特許出願第２０１７−０９４２０１号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１７年５月１０日に出願された日本国特許出願第２０１７−０９４２０１号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
以下に、実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例は本発明を何ら限定するものではない。
（実施例１） （Ｅ）−２−［１，２，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅの製造
（Ｅ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌｉｄｅｎｅ）ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（純度：９７．６重量％、２５２．５ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）、トルエン（１０ｍＬ）からなる溶液を−７０℃に冷却し、ここに水素化ジイソブチルアルミニウム／トルエン溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ、２．５ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）を１５分で滴下した。２５℃まで自然に昇温させながら１６時間攪拌した後、酢酸エチル（５ｍＬ）を添加した（反応収率：７５％）。水（３０ｍＬ）、トルエン（２０ｍＬ）、濃塩酸（５ｍＬ）を加えて抽出した。水層を更にトルエン（２０ｍＬ）で２回抽出し、有機層を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、濾液から減圧下に溶媒を留去し、残査にヘキサン（１０ｍＬ）を加えて晶析した。結晶を減圧濾別し、ヘキサン（１０ｍＬ）で洗浄後、真空乾燥することにより標題化合物を赤色固体として得た（６８．７ｍｇ、純度：９３．８重量％、単離収率：２６％）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１０．０５（１Ｈ，ｄ）、７．１３（１Ｈ，ｄ）、６．９０（１Ｈ，ｄ）、６．３３（１Ｈ，ｄ）、４．６７（２Ｈ，ｄｄ）、３．４１（２Ｈ，ｄｄ）、３．３３（２Ｈ，ｍ）、３．１０（２Ｈ，ｍ）
（実施例２） （Ｓ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅの製造
（Ｅ）−２−［１，２，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（４００ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、Ｄｉｅｔｈｙｌ １，４−Ｄｉｈｙｄｒｏ−２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３，５−ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（６０８ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）、（Ｒ）−２−（ジフェニルメチル）ピロリジン（４７．５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（３ｍＬ）、トリフルオロ酢酸（２２．８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）からなる溶液を２０℃、１６時間攪拌した（反応収率：８０％）。反応液を減圧濃縮後、得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、標題化合物を淡黄色油状物として得た（２６０．０ｍｇ、純度：９３．３％、単離収率：６０％、光学純度：８５．２％ｅｅ）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ９．８５（１Ｈ，ｓ）、６．９８（１Ｈ，ｄ）、６．６４（１Ｈ，ｄ）、４．６０−４．５２（２Ｈ，ｍ）、３．７０（１Ｈ，ｍ）、３．１５−３．０９（２Ｈ，ｍ）、２．９０−２．８１（３Ｈ，ｍ）、２．８１−２．６１（１Ｈ，ｍ）、２．５０−２．４０（１Ｈ，ｍ）、１．７６−１．７０（１Ｈ，ｍ）
（光学純度分析条件）
カラム：ダイセルキラルセルＯＤ−Ｈ ４．６×２５０ｍｍ
溶離液：エタノール／ヘキサン＝２／９８（ｖ／ｖ）
カラム温度：３０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ．
検出器：ＵＶ２１０ｎｍ
保持時間：Ｓ体＝１４．１分、Ｒ体＝１７．６分
（実施例３〜２０） （Ｓ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅの製造
（Ｅ）−２−［１，２，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（２００ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、Ｄｉｅｔｈｙｌ １，４−Ｄｉｈｙｄｒｏ−２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３，５−ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（３０４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）に溶媒、不斉有機触媒、酸を加えて、種々条件を変えて実施した結果を以下に示す。
Figure 2018207888
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＣＡ：トリクロロ酢酸
Figure 2018207888
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
４−ＭＴＨＰ：４−メチルテトラヒドロピラン
ＤＭＡ：ジメチルアセトアミド
Figure 2018207888
Figure 2018207888
（実施例２１〜２４） （Ｓ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅの製造
（Ｅ）−２−［１，２，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（０．０５ｍｍｏｌ）、Ｄ−グルコース（０．１５ｍｍｏｌ）、ＮＡＤ+（０．０５μｍｏｌ）、ＮＡＤＰ+（０．０５μｍｏｌ）、を下記に示すエノンリダクターゼとグルコース脱水素酵素の存在下でリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬ中で、３０℃で一晩攪拌した。その結果を以下に示す。なお、（Ｓ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅへの変換率は、反応液２００μＬを酢酸エチル１ｍＬで抽出した後、下記条件のガスクロマトグラフィーで確認した。光学純度は下記条件にて分析した。
Figure 2018207888
（変換率分析条件）
カラム：ＲＥＳＴＥＫ社、Ｒｔｘ（登録商標）−３５ Ａｍｉｎｅ ３０ミリ×０．２５ｍｍ ＩＤ
溶離液：エタノール／ヘキサン＝２／９８（ｖ／ｖ）
カラム温度：２２０℃
インジェクター温度：２００℃
ディテクター温度：２００℃
キャリアガス：Ｈｅ（１５０ｋＰａ）
検出：ＦＩＤ
（光学純度分析条件）
カラム：ダイセルキラルセルＯＤ−Ｈ ４．６×２５０ｍｍ
溶離液：エタノール／ヘキサン＝２／９８（ｖ／ｖ）
カラム温度：３０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ．
検出器：ＵＶ２１０ｎｍ
（実施例２５） （Ｓ）−２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅの製造
（Ｓ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（純度：９４．２重量％、３６０ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）、酢酸アンモニウム（２．５９ｇ、３３．６ｍｍｏｌ）、エタノール（３０ｍＬ）、２５重量％アンモニア水（１０ｍＬ）からなる溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム３１７ｍｇ（５．０ｍｍｏｌ）を２５℃で加え、７０℃に昇温して６時間攪拌した。室温まで冷却後、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液（１．３４４ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）を加え、減圧下にエタノールを留去した。得られた残査に４−メチルテトラヒドロピラン（１５ｍＬ×２回）を加えて抽出し、有機層を合わせて飽和食塩水１０ｍＬで２回洗浄、減圧濃縮することにより黄色油状物（８１０．０ｍｇ）を得た（純度：１２．３重量％、収率：２９％）。
続いて、転溶洗浄操作により精製を行った。前記黄色油状物（８１０．０ｍｇ）に酢酸エチル（１０ｍＬ）と水（５ｍＬ）を加え、濃塩酸でｐＨ＝０．１に調整した。有機層を分離後、水層に３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝１２に調整し、酢酸エチル（１０ｍＬ）で２回抽出した。有機層を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮することにより、標題化合物を無色油状物として得た（純度：９３．３重量％、転溶洗浄回収率：９７％）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ６．８７（１Ｈ，ｄ）、６．５３（１Ｈ，ｄ）、４．５１−４．４２（２Ｈ，ｍ）、３．１６−３．０３（３Ｈ，ｍ）、２．８０−２．６７（４Ｈ，ｍ）、２．１５（１Ｈ，ｍ）、１．９３−１．８７（３Ｈ，ｍ）、１，７０（１Ｈ，ｍ）、１．５０（１Ｈ，ｍ）
（実施例２６） （Ｓ）−２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅの製造
（Ｓ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（０．０５ｍｍｏｌ）、α−ｐｈｅｎｅｔｙｌａｍｉｎｅ（０．０７５ｍｍｏｌ）、ピリドキサルリン酸（０．５μｍｏｌ）、をω−トランスアミナーゼの存在下、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬ中で、３０℃で一晩攪拌した。反応終了後、反応液２００μＬを３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝１２に調整し、酢酸エチル１ｍＬで抽出した後、下記条件のガスクロマトグラフィーで分析したところ、（Ｓ）−２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ)ｅｔｈａｎａｍｉｎｅが生成していた。
（変換率分析条件）
カラム：ＲＥＳＴＥＫ社、Ｒｔｘ（登録商標）−３５ Ａｍｉｎｅ ３０ミリ×０．２５ｍｍ ＩＤ
カラム温度：２２０℃
インジェクター温度：２００℃
ディテクター温度：２００℃
キャリアガス：Ｈｅ（１５０ｋＰａ）
検出：ＦＩＤ
（実施例２７） ω−トランスアミナーゼ発現大腸菌の凍結乾燥菌体調製
以下のω−トランスアミナーゼ遺伝子、酵素Ａ：アースロバクター・エスピーＫＮＫ１６８（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８）（特許第５４１００８９号公報、配列番号２５）、酵素Ｂ：シュードモナス・エスピーＫＮＫ４２５（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＫＮＫ４２５）（特許第５４１００８９号公報、配列番号２）、酵素Ｃ：シュードモナス・フルオレッセンスＫＮＫ０８−１８（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（特許第５４１００８９号公報、配列番号５）、酵素Ｄ：シュードモナス・エスピーＭＶ３７（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＶ３７）（特許第５８７８８７１号公報、配列番号２）、酵素Ｅ：ビブリオ・フルビアリスＪＳ１７（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７）（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６１．４６３−４７１（２００３）に記載の配列）、をｐＵＣＮＴ（国際公開第９４／０３６１３号）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とマルチクローニングサイトの間に挿入し、組換えベクターを得た。組換えベクターを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（タカラバイオ株式会社製）を形質転換し、組換え大腸菌を得た。得られた組換え大腸菌を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ７．０）で培養し、菌体を回収した。得られた菌体をドライアイスを溶解したメタノール中で凍結させた後、凍結乾燥機（東京理化器械、ＦＤＳ−１０００）で終夜乾燥させ、凍結乾燥菌体を取得した。
（実施例２８） ω−トランスアミナーゼを用いた（Ｓ）−２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅの製造（水中反応、１酵素法）
（Ｓ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（０．０５ｍｍｏｌ）、アミノ基供与体（（Ｓ）−α−ｐｈｅｎｅｔｙｌａｍｉｎｅ（０．０７５ｍｍｏｌ）（以下、Ｓ−ＰＥＡ）、あるいは、（Ｒ）−α−ｐｈｅｎｅｔｙｌａｍｉｎｅ（０．０７５ｍｍｏｌ）（以下、Ｒ−ＰＥＡ）、あるいは、イソプロピルアミン（０．３７５ｍｍｏｌ）（以下、ＩＳＰＡ））、ピリドキサルリン酸（０．５μｍｏｌ）、とω−トランスアミナーゼの凍結乾燥菌体（酵素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのいずれか）５ｍｇを加えたリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．５ｍＬ中で、３０℃で一晩攪拌して反応した。反応終了後、反応液２００μＬを３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝１２に調整し、酢酸エチル１ｍＬで抽出した後、実施例２６と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析した結果を表４に示す。その結果、全ての酵素で（Ｓ）−２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅが生成していた。
Figure 2018207888
（実施例２９） ω−トランスアミナーゼを用いた（Ｓ）−２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅの製造（水中反応、３酵素法）
国際公開第２００７／１３９０５５号の実施例１３に記載のペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）ＪＣＭ８７９７株由来のＬ−乳酸脱水素酵素ＰＡＬＤＨとバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０由来グルコース脱水素酵素ＧＤＨを共発現する組換え大腸菌を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ７．０）で培養し、遠心分離により集菌した。得られた菌体をドライアイスを溶解したメタノール中で凍結させた後、凍結乾燥機（東京理化器械、ＦＤＳ−１０００）で終夜乾燥させ、ＰＡＬ・ＧＤＨ凍結乾燥菌体を取得した。
（Ｓ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（５０μｍｏｌ）、アミノ基供与体（Ｌ−アラニン（５６１μｍｏｌ）、あるいは、Ｄ−アラニン（５６１μｍｏｌ））、ピリドキサルリン酸（０．５μｍｏｌ）、Ｄ−グルコース（３３３μｍｏｌ）、ＮＡＤ+（１．３μｍｏｌ）と、ω−トランスアミナーゼ凍結乾燥菌体（酵素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのいずれか）５ｍｇ、ＰＡＬ・ＧＤＨ凍結乾燥菌体２．５ｍｇを加えたリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬ中で、３０℃で４時間攪拌した。
反応終了後、反応液２００μＬに３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝１２に調整し、酢酸エチル１ｍＬで抽出した後、実施例２６と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析した結果を表５に示す。その結果、全ての酵素で（Ｓ）−２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅが生成していた。
Figure 2018207888
（実施例３０） ω−トランスアミナーゼを用いた（Ｓ）−２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅの製造（溶媒中反応）
（Ｓ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（０．０５ｍｍｏｌ）、アミノ基供与体（（Ｓ）−α−ｐｈｅｎｅｔｙｌａｍｉｎｅ（０．０７５ｍｍｏｌ）（Ｓ−ＰＥＡ））を、ｐＨ７．５に調整した０．５Ｍピリドキサルリン酸水溶液０．５μＬとω−トランスアミナーゼ凍結乾燥菌体（酵素Ｄ）５ｍｇを加えた水飽和ＭＴＢＥ０．５ｍＬ中で、３０℃で３時間攪拌して反応した。反応終了後、反応液を実施例２６と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析した結果を表６に示す。その結果、（Ｓ）−２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅが生成していた。
Figure 2018207888
（実施例３１） 酵素フローリアクターを用いた（Ｓ）−２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅの製造
ダイヤイオンＨＰ２ＭＧ（三菱ケミカル社製）７．５ｇを７．５ｍＬの０．１ＭＫＰＢ（リン酸カリウム緩衝液）（ｐＨ７．５）で２回洗浄した後に、ＴＰＭの凍結乾燥菌体２５０ｍｇとＰＬＰ（ピリドキサルリン酸）２０ｍｇを溶解させた１０ｍＬの０．１ＭＫＰＢ（ｐＨ７．５）を加えて、室温で２時間攪拌した。ピペットで水分を除去した後に、窒素を吹きかけて湿気がなくなるまで乾燥させ、酵素固定化樹脂を調製した。除去した水分中のタンパク含量を測定したところ、添加したタンパクの３８％が樹脂に吸着していた。
当該固定化樹脂をΦ５ｍｍ×５０ｍｍのガラス管に詰めて固定化樹脂カラムを作製した。
Ａ液として、１００ｍＭの（Ｓ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅのＭＴＢＥ溶液、Ｂ液として、水飽和させたＭＴＢＥ溶液を用いて調製した１００ｍＭ（Ｓ）−α−ｐｈｅｎｅｔｙｌａｍｉｎｅ溶液を調製した。シリンジポンプ（ＹＳＰ−１０１、ＹＭＣ社製）を用いて、Ａ液、Ｂ液、それぞれを０．０２５ｍＬ／ｍｉｎで送液し、Ｔ字型の混合部で混合させ、３０℃に保温された固定化樹脂カラムに通液した。溶出された反応液を実施例２６と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析し、（Ｓ）−２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅと（Ｓ）−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅの比から変換率を算出した。その結果を表７及び図１に示す。送液開始４０分から１８０分にかけて安定して目的化合物への変換活性が持続した。
なお、酵素フローリアクターを用いたラメルテオン製造の実用化の際には、カラム長の延長や、通液回数の増加、流速の低減等の方法により変換率をより高くして使用することも可能である。
Figure 2018207888
（実施例３２） ラメルテオン（（Ｓ）−Ｎ−［２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈｙｌ］ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ）の製造
（Ｓ）−２−（１，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅ（純度：９３．３重量％、６０．０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（５ｍＬ）、トリエチルアミン（５６ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、塩化プロピオニル（３１ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）からなる溶液を２５℃、１時間攪拌した。水（５ｍＬ）を加えて均一溶液とした後、減圧下にアセトニトリルを留去した。残査に酢酸エチル（１５ｍＬ）を加えて抽出し、有機層を更に水（５ｍＬ）で２回洗浄、減圧濃縮することにより白色固体を得た（７５．９ｍｇ、純度：８９．３重量％、反応収率：９５％、光学純度：８３．５％ｅｅ）。
前記白色固体（６０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）に酢酸エチル（１ｍＬ）を加えて溶解し、ヘキサン（５ｍＬ）を加えて晶析を行った。５℃に冷却して３０分攪拌後、結晶を減圧濾別し、ヘキサン（５ｍＬ）で洗浄、真空乾燥することにより標題化合物を白色結晶として得た（３８．１ｍｇ、純度：９７．３重量％、晶析回収率：９７％、光学純度：９７．９％ｅｅ）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ６．９５（１Ｈ，ｄ）、６．６１（１Ｈ，ｄ）、５．４（１Ｈ，ｂｒｓ）、４．５９（１Ｈ，ｄｄ）、４．５５（１Ｈ，ｄｄ）、３．３６（２Ｈ，ｍ）、３．２４−３．１０（３Ｈ，ｍ）、２．８９（１Ｈ，ｄｄ）、２．７７（１Ｈ，ｄｄ）、２．２０（１Ｈ，ｍ）、２．１７（２Ｈ，ｑ）、２．０３（１Ｈ，ｍ）、１．８５（１Ｈ，ｍ）、１．８２（１Ｈ，ｍ）、１．１４（３Ｈ，ｔ）
（光学純度分析条件）
カラム：ダイセルキラルセルＯＤ−Ｈ ４．６×２５０ｍｍ
溶離液：エタノール／ヘキサン＝１／９（ｖ／ｖ）
カラム温度：３０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ．
検出器：ＵＶ２１０ｎｍ
保持時間：Ｓ体＝１２．３分、Ｒ体＝１６．０分

Claims (14)

  1. 下記式（１）；
    Figure 2018207888
    で表されるエナールを不斉還元することにより、下記式（２）；
    Figure 2018207888
    で表される光学活性アルデヒドを製造し、続いてこれを下記式（４）；
    Figure 2018207888
    で表されるラメルテオンに変換することを特徴とするラメルテオンの製造法。
  2. 前記不斉還元が、下記式（５）；
    Figure 2018207888
    （式中、Ｒは置換基を有しても良い炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有しても良い炭素数２〜２０のアルケニル基、置換基を有しても良い炭素数７〜２０のアラルキル基、置換基を有しても良い炭素数６〜２０のアリール基、カルボキシル基、又は１Ｈ−テトラゾール基を表す。＊は不斉炭素原子を表す。Ａ-はカウンター陰イオンを表す。）で表される光学活性ピロリジン塩誘導体を不斉有機触媒に用いて、下記式（６）；
    Figure 2018207888
    で表わされるＨａｎｔｚｓｈエステルを還元剤に用いて行うことを特徴とする、請求項１に記載のラメルテオンの製造法。
  3. 前記光学活性ピロリジン塩誘導体（５）において、Ｒがジフェニルメチル基、（トリメチルシリルオキシ）ジフェニルメチル基、又は（ヒドロキシ）ジフェニルメチル基であり、絶対立体配置がＲ体であり、Ａ-がトリクロロアセテート、又はトリフルオロアセテートである、請求項２に記載のラメルテオンの製造法。
  4. 前記不斉還元がエノンリダクターゼを用いて行うことを特徴とする、請求項１に記載のラメルテオンの製造法。
  5. 前記エノンリダクターゼがＯＹＥ２、ＮｅｍＡ、ＹｅｒｓＥＲ、ＮＣＲ−Ｒである、請求項４に記載のラメルテオンの製造法。
  6. 前記光学活性アルデヒド（２）を、下記式（３）；
    Figure 2018207888
    で表される光学活性アミンに変換した後、これをプロピオニル化することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
  7. 前記光学活性アミン（３）に変換する方法が、アミノ基供与体の存在下、トランスアミナーゼを用いて行うことを特徴とする、請求項６に記載のラメルテオンの製造法。
  8. 前記アミノ基供与体がイソプロピルアミンであり、前記トランスアミナーゼがω−トランスアミナーゼである、請求項７に記載のラメルテオンの製造法。
  9. 前記アミノ基供与体がα−フェネチルアミンであり、前記トランスアミナーゼがω−トランスアミナーゼである、請求項７に記載のラメルテオンの製造法。
  10. 前記アミノ基供与体がα−アミノ酸であり、前記トランスアミナーゼがω−トランスアミナーゼである、請求項７に記載のラメルテオンの製造法。
  11. 前記トランスアミナーゼを有機溶媒中で反応させる、請求項７〜１０のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
  12. 樹脂に固定化された前記トランスアミナーゼを有機溶媒中で反応させる、請求項７〜１１のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
  13. 前記エナール（１）が、下記式（７）；
    Figure 2018207888
    で表されるα，β−不飽和ニトリルとヒドリド還元剤を反応させて製造したものである、請求項１〜１２のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
  14. 下記式（１）；
    Figure 2018207888
    で表されるエナール（（Ｅ）−２−［１，２，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−８Ｈ−ｉｎｄｅｎｏ［５，４−ｂ］ｆｕｒａｎ−８−ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）。
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