JPWO2018207888A1 - ラメルテオンの製造法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、睡眠導入剤ラメルテオンの簡便、且つ効率的な製造法を提供する。本発明によれば、入手容易なエナール(E)−2−[1,2,6,7−tetrahydro−8H−indeno[5,4−b]furan−8−ylidene]acetaldehydeを不斉還元することにより光学活性アルデヒド(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehydeを製造する工程を実施することにより、短工程でラメルテオンを製造することができる。
Description
本発明は、ラメルテオンの製造法に関する。
睡眠導入剤として使用されているラメルテオンの製造法としては、以下のような方法が知られている。
1)1,2,6,7−tetrahydro−8H−indeno[5,4−b]furan−8−oneをリン酸エステル誘導体を用いて(E)−2−[1,2,6,7−tetrahydro−8H−indeno[5,4−b]furan−8−ylidene]acetonitrileに変換し、ニトリル官能基を還元してアミン化合物とした後、オレフィンを不斉水素化して、得られた光学活性体の化合物を還元反応し、次いでアシル化させることによりラメルテオンに誘導する方法(特許文献1)。
2)1,2,6,7−tetrahydro−8H−indeno[5,4−b]furan−8−oneをリン酸エステル誘導体を用いて(E)−2−[1,2,6,7−tetrahydro−8H−indeno[5,4−b]furan−8−ylidene]acetonitrileに変換し、ニトリル官能基を水和してアミド官能基とした後、オレフィンを異性化させ、これを不斉水素化してラメルテオンに誘導する方法(非特許文献1)。
3)ラセミ2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineを光学活性なカルボン酸誘導体を用いて造塩し、前記光学活性なカルボン酸塩を光学分割する方法(特許文献2)。
4)ラセミ2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetic acidを光学活性なアミン誘導体を用いて造塩し、前記光学活性なアミン誘導体塩を光学分割する方法(特許文献3)。
Tetrahedron:Asymmetry,2006,17,184−190.
しかしながら従来技術(1)と(2)では、高価な遷移金属触媒を用いて、更に特殊設備が必要な高圧水素化を行っているため、工業的規模での実施には不適である。また、従来技術(3)と(4)は光学分割法であるため、基質重量の半分を占める不要なエナンチオマーは廃棄しなければならず、これらもまた効率的な方法とは言い難い。
上記の従来技術に対して本発明が解決しようとする課題は、ラメルテオンの簡便、且つ効率のよい製造法を提供することにある。
本発明者らは鋭意検討の結果、入手容易な出発原料から簡便、且つ効率よく、更に高圧水素化などの特殊設備を必要としないラメルテオンの製造法を見出し、本発明を完成するに至った。
[1] 下記式(1);
で表されるエナールを不斉還元することにより、下記式(2);
で表される光学活性アルデヒドを製造し、続いてこれを下記式(4);
で表されるラメルテオンに変換することを特徴とするラメルテオンの製造法。
で表されるエナールを不斉還元することにより、下記式(2);
で表される光学活性アルデヒドを製造し、続いてこれを下記式(4);
で表されるラメルテオンに変換することを特徴とするラメルテオンの製造法。
[2] 前記不斉還元が、下記式(5);
(式中、Rは置換基を有しても良い炭素数1〜20のアルキル基、置換基を有しても良い炭素数2〜20のアルケニル基、置換基を有しても良い炭素数7〜20のアラルキル基、置換基を有しても良い炭素数6〜20のアリール基、カルボキシル基、又は1H−テトラゾール基を表す。*は不斉炭素原子を表す。A-はカウンター陰イオンを表す。)で表される光学活性ピロリジン塩誘導体を不斉有機触媒に用いて、下記式(6);
で表わされるHantzshエステルを還元剤に用いて行うことを特徴とする、[1]に記載のラメルテオンの製造法。
(式中、Rは置換基を有しても良い炭素数1〜20のアルキル基、置換基を有しても良い炭素数2〜20のアルケニル基、置換基を有しても良い炭素数7〜20のアラルキル基、置換基を有しても良い炭素数6〜20のアリール基、カルボキシル基、又は1H−テトラゾール基を表す。*は不斉炭素原子を表す。A-はカウンター陰イオンを表す。)で表される光学活性ピロリジン塩誘導体を不斉有機触媒に用いて、下記式(6);
で表わされるHantzshエステルを還元剤に用いて行うことを特徴とする、[1]に記載のラメルテオンの製造法。
[3] 前記光学活性ピロリジン塩誘導体(5)において、Rがジフェニルメチル基、(トリメチルシリルオキシ)ジフェニルメチル基、又は(ヒドロキシ)ジフェニルメチル基であり、絶対立体配置がR体であり、A-がトリクロロアセテート、又はトリフルオロアセテートである、[2]に記載のラメルテオンの製造法。
[4] 前記不斉還元がエノンリダクターゼを用いて行うことを特徴とする、[1]に記載のラメルテオンの製造法。
[5] 前記エノンリダクターゼがOYE2、NemA、YersER、NCR−Rである、[4]に記載のラメルテオンの製造法。
[7] 前記光学活性アミン(3)に変換する方法が、アミノ基供与体の存在下、トランスアミナーゼを用いて行うことを特徴とする、[6]に記載のラメルテオンの製造法。
[8] 前記アミノ基供与体がイソプロピルアミンであり、前記トランスアミナーゼがω−トランスアミナーゼである、[7]に記載のラメルテオンの製造法。
[9] 前記アミノ基供与体がα−フェネチルアミンであり、前記トランスアミナーゼがω−トランスアミナーゼである、[7]に記載のラメルテオンの製造法。
[10] 前記アミノ基供与体がα−アミノ酸であり、前記トランスアミナーゼがω−トランスアミナーゼである、[7]に記載のラメルテオンの製造法。
[11] 前記トランスアミナーゼを有機溶媒中で反応させる、[7]〜[10]のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
[12] 樹脂に固定化された前記トランスアミナーゼを有機溶媒中で反応させる、[7]〜[11]のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
本発明によれば、ラメルテオンを簡便、且つ効率よく製造することができる。
以下、本発明に係るラメルテオンの製造方法について、詳細に述べる。
まずは、本発明の製造法に使用する原料、中間生成物、及び目的生成物について説明する。
本発明の出発原料としては、例えば下記式(7)で表されるα,β−不飽和ニトリル、即ち(E)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−ylidene)acetonitrileを使用することができる。ここで、化合物(7)は例えば、特許第4081161号公報に記載の方法に従って、シアノメチルホスホン酸ジエチルと水素化ナトリウムから調製したカルボアニオンと、1,2,6,7−tetrahydro−8H−indeno[5,4−b]furan−8−oneを反応させることなどにより簡便に製造できる。
また、本発明の中間生成物であるエナール、即ち(E)−2−[1,2,6,7−tetrahydro−8H−indeno[5,4−b]furan−8−ylidene]acetaldehydeは、下記式(1)で表される。ここで、前記化合物(1)は文献未記載の新規化合物である。
また、本発明の中間生成物である光学活性アルデヒド、即ち(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehydeは、下記式(2)で表される。
また、本発明の中間生成物である光学活性アミン、即ち(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineは、下記式(3)で表される。
また、本発明の生成物であるラメルテオン、即ち(S)−N−[2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethyl]propionamideは、下記式(4)で表される。
本発明の好ましい態様を図で表すと以下のとおりである。また本願では、「式(2)で表される光学活性アルデヒドを製造し、続いてこれを式(4)で表されるラメルテオンに変換すること」には、光学活性アルデヒド(2)から工程3を経てラメルテオン(4)を製造する方法、及び光学活性アルデヒド(2)から工程4〜5を経てラメルテオン(4)を製造する方法の両方が含まれることとする。
以下に各工程を順を追って説明する。
(工程1)
本工程で、前記式(7)で表されるα,β−不飽和ニトリルにヒドリド還元剤を反応させることにより、前記式(1)で表されるエナールを製造する。
本工程で、前記式(7)で表されるα,β−不飽和ニトリルにヒドリド還元剤を反応させることにより、前記式(1)で表されるエナールを製造する。
前記ヒドリド還元剤としては例えば、水素化リチウムアルミニウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、水素化ビス(2−メトキシエトキシ)アルミニウムナトリウム、水素化リチウムトリ(tert−ブトキシ)アルミニウム、ボラン、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリエチルホウ素リチウム、カテコールボラン等が挙げられ、好ましくは水素化ジイソブチルアルミニウムである。
前記ヒドリド還元剤の使用量として、上限として好ましくは前記化合物(7)に対して10倍モル量であり、更に好ましくは5倍モル量である。下限としては、前記化合物(7)に対して0.5倍モル量であり、更に好ましくは1倍モル量である。
本工程の反応溶媒としては、反応に影響を与えない限りにおいては特に制限はなく、具体的には例えば、テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、1,4−ジオキサン、メチルtert−ブチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、4−メチルテトラヒドロピラン等のエーテル系溶媒;ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒;ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、メシチレン等の芳香族炭化水素系溶媒;N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N,N−ジエチルアセトアミド、N−メチル−2−ピロリドン、N−エチル−2−ピロリドン、N−メチル−ε−カプロラクタム、ヘキサメチルホスホルアミド等のアミド系溶媒;ジメチルプロピレンウレア等のウレア系溶媒;ヘキサメチルホスホン酸トリアミド等のホスホン酸トリアミド系溶媒等を用いることができる。これらは単独で用いても良く、2種以上を併用してもよい。2種以上を併用する場合、その混合比は特に制限されない。好ましくはまたは芳香族炭化水素系溶媒であり、更に好ましくはテトラヒドロフラン、4−メチルテトラヒドロピラン、またはトルエンである。
前記溶媒の使用量は、上限としては、前記化合物(7)に対して好ましくは100倍重量であり、更に好ましくは50倍重量であり、特に好ましくは20倍重量である。下限としては、前記化合物(7)に対して好ましくは0.1倍重量であり、更に好ましくは0.5倍重量であり、特に好ましくは1倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
本反応における反応温度には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、副生成物の生成を少なくするため、上限として好ましくは120℃であり、更に好ましくは80℃であり、特に好ましくは40℃である。下限としては好ましくは−100℃であり、更に好ましくは−80℃であり、特に好ましくは−70℃である。
本反応における反応時間には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、上限としては好ましくは100時間であり、更に好ましくは50時間であり、特に好ましくは25時間である。下限として好ましくは0.1時間であり、更に好ましくは0.5時間であり、特に好ましくは1時間である。
本工程の混合順序について特に制限はないが、化合物(7)と溶媒を含む溶液に対し、ヒドリド還元剤を添加するのが好ましい。
反応後の処理としては、反応液から生成物を取得するための一般的な処理を行えばよい。例えば、反応終了後の反応液を水、又は塩酸、硫酸等の酸水溶液に加え、一般的な抽出溶媒、例えば酢酸エチル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、トルエン、ヘキサン等を用いて抽出操作を行うとよい。得られた抽出液から、減圧加熱、真空乾燥等の操作や、無水硫酸マグネシウム等の乾燥剤の使用により、反応溶媒及び抽出溶媒を留去すると目的物が得られる。このようにして得られた目的物は、後続工程に使用できる十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。
(工程2)
本工程で、前記式(1)で表されるエナールを不斉還元することにより、前記式(2)で表される光学活性アルデヒドを製造する。ここで、前記エナール(1)は工程1に記載の方法に従って製造してもよく、又はそれ以外の方法で製造したものであっても本発明の範囲に含まれる。
本工程で、前記式(1)で表されるエナールを不斉還元することにより、前記式(2)で表される光学活性アルデヒドを製造する。ここで、前記エナール(1)は工程1に記載の方法に従って製造してもよく、又はそれ以外の方法で製造したものであっても本発明の範囲に含まれる。
前記不斉還元する方法としては、不斉有機触媒存在下に還元剤を用いる方法、若しくはエノンリダクターゼを用いる方法が挙げられる。
まずは不斉有機触媒存在下に還元剤を用いる方法について説明する。
前記不斉有機触媒としては例えば、(2S,5S)−2−tert−Butyl−3−methyl−5−benzyl−4−oxoimidazolidinium trichloroacetate、(R)−2−(tert−Butyl)−3−methyl−4−oxoimidazolidinium trichloroacetate、(2S,5S)−5−Benzyl−3−methyl−2−(5−methyl−2−furyl)−2−imidazolidinium trichloroacetate、(5S)−2,2,3−Trimethyl−5−phenylmethyl−4−oxoimidazolidinium trichloroacetate、(2S,5S)−2−tert-Butyl−3−methyl−5−benzyl−4−oxoimidazolidinium trifluoroacetate、(R)−2−(tert−Butyl)−3−methyl−4−oxoimidazolidinium trifluoroacetate、(2S,5S)−5−Benzyl−3−methyl−2−(5−methyl−2−furyl)−2−imidazolidinium trifluoroacetate、(5S)−2,2,3−Trimethyl−5−phenylmethyl−4−oxoimidazolidinium trifluoroacetate等のマクミラン型触媒、
及び下記式(5);
及び下記式(5);
で表される光学活性ピロリジン塩誘導体等が挙げられ、好ましくは、式(5)で表わされる光学活性ピロリジン塩誘導体である。
ここで、式(5)中、Rは置換基を有しても良い炭素数1〜20のアルキル基、置換基を有しても良い炭素数2〜20のアルケニル基、置換基を有しても良い炭素数7〜20のアラルキル基、置換基を有しても良い炭素数6〜20のアリール基、カルボキシル基、又は1H−テトラゾール基を表し、置換基を有しても良い炭素数1〜20(より好ましくは炭素数1〜10)のアルキル基、カルボキシル基、又は1H−テトラゾール基が好ましい。前記置換基としては、フェニル基等の炭素数6〜10の芳香族炭化水素基;メトキシ基、エトキシ基等の炭素数1〜6のアルコキシ基;ヒドロキシ基;トリメチルシリルオキシ基、トリエチルシリルオキシ基等のトリアルキルシリルオキシ基;ピロリジニル基、ピペリジニル基等の五〜七員複素環基;等が例示され、これらの置換基は1又は2以上を組み合わせてもよい。
Rとして好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基、メトキシメチル基、(1−ピロリジニル)メチル基、ビニル基、ベンジル基、フェニル基、ジフェニルメチル基、(トリメチルシリルオキシ)ジフェニルメチル基、(ヒドロキシ)ジフェニルメチル基、カルボキシル基、又は1H−テトラゾール基であり、より好ましくはジフェニルメチル基、(トリメチルシリルオキシ)ジフェニルメチル基、又は(ヒドロキシ)ジフェニルメチル基であり、よりさらに好ましくはジフェニルメチル基である。
式(5)中、*は不斉炭素原子を表し、絶対立体配置はS体またはR体のいずれでもよく、好ましくは絶対立体配置がR体である。
式(5)中、A-はカウンター陰イオンを表す。前記カウンター陰イオンとして特に制限はないが、好ましくは塩化物イオン、臭化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、メシレート、トシレート、トリフレート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、アセテート、又はベンゾエートであり、更に好ましくはトリクロロアセテート、又はトリフルオロアセテートである。また、ポリマーに担持されたカウンター陰イオンでもよく、具体的には例えば、カウンター陰イオンがスルホネートである陽イオン交換樹脂などが挙げられる。
また、前記光学活性ピロリジン塩誘導体は、反応系中で光学活性ピロリジンと、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、トリフロオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、安息香酸等の酸を混合することにより調製してもよい。酸として好ましくは、トリフルオロ酢酸、又はトリクロロ酢酸であり、より好ましくはトリフルオロ酢酸である。
前記酸の使用量としては、上限としては前記光学活性ピロリジンの10倍重量であり、更に好ましくは5倍重量であり、特に好ましくは3倍重量である。下限としては、前記化合物(1)に対して好ましくは0.001倍重量であり、更に好ましくは0.01倍重量であり、特に好ましくは0.1倍重量である。
前記不斉有機触媒の使用量としては、上限としては、前記化合物(1)に対して好ましくは10倍重量であり、更に好ましくは5倍重量であり、特に好ましくは1倍重量である。下限としては、前記化合物(1)に対して好ましくは0.001倍重量であり、更に好ましくは0.01倍重量であり、特に好ましくは0.1倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
前記還元剤としては、水素ガス、蟻酸、蟻酸ナトリウム、蟻酸トリエチルアンモニウム、1,4−ジヒドロピリジン誘導体等が挙げられるが、好ましくは1,4−ジヒドロピリジン誘導体である。前記1,4−ジヒドロピリジン誘導体として更に好ましくは、下記式(6);
で表わされるHantzshエステル、即ち、Diethyl 1,4−Dihydro−2,6−dimethyl−3,5−pyridinedicarboxylateである。
前記還元剤の使用量としては、上限としては、前記化合物(1)に対して好ましくは100倍重量であり、更に好ましくは50倍重量であり、特に好ましくは10倍重量である。下限としては、前記化合物(1)に対して好ましくは0.1倍重量であり、更に好ましくは0.5倍重量であり、特に好ましくは1倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
本工程の溶媒としては、反応に影響を与えない限りにおいては特に制限はなく、具体的には例えば、水;メタノール、エタノール、n−プロパノール、イソプロパノール、n−ブタノール、tert−ブタノール、エチレングリコール等のアルコール系溶媒;テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、1,4−ジオキサン、メチルtert−ブチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、4−メチルテトラヒドロピラン等のエーテル系溶媒;アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒;酢酸エチル、酢酸n−プロピル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒;ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒;ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、メシチレン等の芳香族炭化水素系溶媒;塩化メチレン、1,2−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒;ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒;N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N,N−ジエチルアセトアミド、N−メチル−2−ピロリドン、N−エチル−2−ピロリドン、N−メチル−ε−カプロラクタム、ヘキサメチルホスホルアミド等のアミド系溶媒;ジメチルプロピレンウレア等のウレア系溶媒;ヘキサメチルホスホン酸トリアミド等のホスホン酸トリアミド系溶媒等を用いることができる。これらは単独で用いても良く、2種以上を併用してもよい。2種以上を併用する場合、その混合比は特に制限されない。好ましくはエーテル系溶媒;エステル系溶媒;芳香族炭化水素系溶媒;ニトリル系溶媒であり、更に好ましくはテトラヒドロフラン、4−メチルテトラヒドロピラン、酢酸エチル、トルエン、又はアセトニトリルであり、特に好ましくはテトラヒドロフラン、トルエン、又はアセトニトリルである。
前記溶媒の使用量は、上限としては、前記化合物(1)に対して好ましくは100倍重量であり、更に好ましくは50倍重量であり、特に好ましくは20倍重量である。下限としては、前記化合物(1)に対して好ましくは0.1倍重量であり、更に好ましくは0.5倍重量であり、特に好ましくは1倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
本反応における反応温度には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、副生成物の生成を少なくするため、上限としては好ましくは150℃であり、更に好ましくは100℃であり、特に好ましくは50℃である。下限としては好ましくは−80℃であり、更に好ましくは−30℃であり、特に好ましくは0℃である。
本反応における反応時間には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、上限としては好ましくは100時間であり、更に好ましくは50時間であり、特に好ましくは25時間である。下限として好ましくは0.1時間であり、更に好ましくは0.5時間であり、特に好ましくは1時間である。
本工程の化合物(1)、不斉有機触媒、還元剤、溶媒の混合順序については、特に制限はない。
反応後の処理としては、反応液から生成物を取得するための一般的な処理を行えばよい。例えば、反応終了後の反応液を水、又は塩酸、硫酸等の酸水溶液に加え、一般的な抽出溶媒、例えば酢酸エチル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、トルエン、ヘキサン等を用いて抽出操作を行うとよい。得られた抽出液から減圧加熱等の操作により、反応溶媒及び抽出溶媒を留去すると目的物が得られる。このようにして得られた目的物は、後続工程に使用できる十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。
続いて、エノンリダクターゼを用いる方法について説明する。
前記式(1)で表されるエナールの炭素−炭素間二重結合を立体選択的に還元する能力を有するエノンリダクターゼを作用させることで、前記式(2)で表される光学活性アルデヒドを製造する。
エノンリダクターゼは、エナール(1)のエノン部位の炭素−炭素間二重結合を立体選択的に還元して、光学活性アルデヒド(2)を生成する能力を有するものであればいずれを用いても良い。
エノンリダクターゼは、目的とする還元活性を有する限りにおいては、酵素そのものだけでなく、当該酵素を生成する微生物の菌体そのもの、微生物の培養液、又は菌体処理物であってもよい。また、当該微生物由来の還元活性を有する酵素をコードするDNAが導入された形質転換体も含むものとする。
上記微生物の菌体処理物としては特に限定されず、例えば、乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体又は菌体を破砕した無細胞抽出液などを挙げることができる。更には、培養物より不斉還元反応を触媒する酵素を精製し、これを使用してもよい。
これらは、単独で用いても、2種以上組み合わせて用いても良い。また、これら微生物は周知の方法で固定化して用いてもよい。
エナール(1)のエノン部位の炭素−炭素間二重結合を立体選択的に還元して光学活性アルデヒド(2)を生成する能力を有するエノンリダクターゼとしては、通常エノンリダクターゼと認識されている旧黄色酵素(Old Yellow Enzyme)を含み、そのようなものとしては、国際生化学・分子生物学連合の酵素分類法によりEC1.6.99に分類される酸化還元酵素が挙げられる。EC1.6.99に分類される酸化還元酵素としては、EC1.6.99.1:NADPHデヒドロゲナーゼ、EC1.6.99.2:NAD(P)Hデヒドロゲナーゼ(キノン)、EC1.6.99.3:NADHデヒドロゲナーゼ、EC1.6.99.5:NADHデヒドロゲナーゼ(キノン)、またはEC1.6.99.6:NADPHデヒドロゲナーゼ(キノン)に分類される酸化還元酵素が挙げられ、好ましくは、EC1.6.99.1:NADPHデヒドロゲナーゼである。
上記EC1.6.99.1:NADPHデヒドロゲナーゼとしては、具体的には、キャンディダ(Candida)属、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、又はシゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属等の酵母由来のもの、バシラス(Bacillus)属、エシェリヒア(Escherichia)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、エルシニア(Yersinia)属、ザイモモナス(Zymomonas)属等の細菌由来のものが挙げられ、好ましくはサッカロマイセス(Saccharomyces)属、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)属、バシラス(Bacillus)属、エシェリヒア(Escherichia)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、エルシニア(Yersinia)属、ザイモモナス(Zymomonas)属等の微生物に由来するものが挙げられ、最も好ましい例にはサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevislae)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、バシラス・サブティリス(Bacillus subtilis)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、エルシニア・ベルコビエリ(Yersinia bercovieri)、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)が含まれる。
エノンリダクターゼとしては、例えば、OYE2、OYE3(サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevislae)由来。国際公開第2006/129628号に記載)、KYE(クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)由来。Adv.Synth.Catal.,349,1521(2007)に記載)、YqjM(バシラス・サブティリス(Bacillus subtilis)由来。J.Biol.Chem.,278,19891(2003)に記載)、NemA(エシェリヒア・コリ(Escherichi coli)由来。Biol.Pharm.Bull.20,110(1997)に記載)、XeaA、XenEなど(シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)由来。Appl.Environ.Microbiol.,74,6703(2008)に記載)、YersER(エルシニア・ベルコビエリ(Yersinia bercovieri)由来。Adv.Synth.Catal.,349,1521(2007)に記載)、NCR−R(ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)由来。Biotechnol.Bioeng.,98,22(2007)に記載)などが含まれ、好ましくは、OYE2、NemA、YersER、又はNCR−Rであり、より好ましくはNemA、YersER、又はNCR−Rであり、更に好ましくはNemAである。
酵素を生成する微生物は、通常、入手または購入が容易な保存株から得ることができる。例えば、以下のカルチャーコレクションより入手可能である。
・独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門(NBRC)(〒292−0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)
・独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室(JCM)(〒351−0198 埼玉県和光市広沢2−1)
・German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH(DSMZ)(Marschroder Weg 1b,D−38124 Brunswick,Germany)
・独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門(NBRC)(〒292−0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)
・独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室(JCM)(〒351−0198 埼玉県和光市広沢2−1)
・German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH(DSMZ)(Marschroder Weg 1b,D−38124 Brunswick,Germany)
また、本発明に利用するエノンリダクターゼ(例えば、OYE2)は、目的の還元酵素活性を有している限りにおいては、その公知のアミノ酸配列(例えば、J.Biol.Chem.268,6097−6106(1993)に記載のOYE2のアミノ酸配列)において1若しくは複数個(例えば、40個、好ましくは20個、より好ましくは15個、さらに好ましくは10個、さらに好ましくは5個、4個、3個、または2個以下)のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び/または付加されたポリペプチドであってもよい。あるいは、そのアミノ酸配列が公知の配列と比較した際に、相同性85%以上、好ましくは、90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、または99%以上のアミノ酸配列を有していても良い。また、目的の還元酵素活性を有する限り、本発明に利用する還元酵素のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合してもよい。例えばヒスチジンタグやHAタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また目的の還元酵素活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
本発明においては、エノンリダクターゼをコードするDNAを含む形質転換体を使用すると、より効率的に光学活性アルデヒド(2)を製造することができる。なお、本明細書において記述されている、DNAの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 4th Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012)、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley−Interscience)等の成書に記載されている方法により実施できる。
上記の形質転換体に用いるベクターとしては、適当な宿主生物内で本発明に利用する還元酵素をコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では通常、lacUV5プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、lppプロモーター、tufBプロモーター、recAプロモーター、pLプロモーター等の制御因子を含み、本発明のDNAと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUCNT(国際公開第94/03613号)などが挙げられる。
なお、「制御因子」とは、機能的プロモーター、及び、任意の関連する転写要素(例えばエンハンサー、CCAATボックス、TATAボックス、SPI部位など)を有する塩基配列をいう。
なお、「制御因子」とは、機能的プロモーター、及び、任意の関連する転写要素(例えばエンハンサー、CCAATボックス、TATAボックス、SPI部位など)を有する塩基配列をいう。
また、「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。なお、制御因子のタイプ及び種類が宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
各酵素を発現させるために用いる宿主生物は、各酵素をコードするDNAを含む酵素発現ベクターにより形質転換され、DNAを導入した酵素を発現することができる生物であれば、特に制限するものではない。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌(エシェリヒア・コリ(Escherichia coli))が特に好ましい。
本発明に利用する還元酵素をコードするDNAを含むベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入することができる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のエシェリヒア・コリ(Escherichia coli HB101(以下、E.coli HB101)コンピテントセル(タカラバイオ社製))を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入することができる。
エナール(1)のエノン部位の炭素−炭素間二重結合を還元する酵素をコードするDNAを含む形質転換体の例としては、ベクターpTSYE2でE.coli HB101を形質転換して得られる、E.coli HB101(pTSYE2)、同様の方法で得られる、E.coli HB101(pTSYE3)、E.coli HB101(pNKYE)、E.coli HB101(pNYqjM)、E.coli HB101(pNNemA)、E.coli HB101(pNXenA)、E.coli HB101(pNXenE)、E.coli HB101(pNYersER)、E.coli HB101(pNNCR−R)などが挙げられる。
また、本発明においては、目的とする還元活性を有する酵素をコードするDNA、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするDNAの両者を含む形質転換体を用いることにより、より効率的に本発明の光学活性化合物を製造することができる。例えば、エナール(1)のエノン部位の炭素−炭素間二重結合を還元する酵素をコードするDNA、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするDNAの両者を含む形質転換体は、エナール(1)のエノン部位の炭素−炭素間二重結合を還元する酵素をコードするDNA、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするDNAの両者を同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら2種のDNAを不和合性グループの異なる2種のベクターにそれぞれ組み込み、それら2種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。また、酵素を細胞外へ放出する宿主細胞を用いる場合や、宿主細胞の破砕液などを反応に用いる場合には、エナール(1)のエノン部位の炭素−炭素間二重結合を還元する酵素をコードするDNAと補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするDNAをそれぞれ別の宿主細胞へ導入し、これら宿主細胞を同一培養液内または異なる培養液を使って培養してもよい。
補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、NAD+(酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド)もしくはNADP+(酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸)をNADH(還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド)、もしくはNADPH(還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸)に変換する能力を有している酸化還元酵素が好ましい。
このような酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、グルコース−6−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素などが挙げられる。好適には、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素が使用される。
このような酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、グルコース−6−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素などが挙げられる。好適には、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素が使用される。
ギ酸脱水素酵素としては、例えば、キャンディダ(Candida)属、クロイッケラ(Kloeckera)属、ピキア(Pichia)属、リポマイセス(Lipomyces)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、モラキセラ(Moraxella)属、ハイホマイクロビウム(Hyphomicrobium)属、パラコッカス(Paracoccus)属、チオバシラス(Thiobacillus)属、アンシロバクター(Ancylobacter)属、などの微生物に由来する酵素が挙げられ、特にチオバシラス・エスピー(Thiobacillus sp.)から得られる酵素が挙げられる。
グルコース脱水素酵素としては、例えば、バシラス(Bacillus)属、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属などの微生物に由来する酵素が挙げられ、特にバシラス・メガテリウム(Bacillusmegaterium)、ラクトバシラス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバシラス・ペントサス(Lactobacillus pentosus)、ペディオコッカス・パーブラス(Pediococcus parvulus)から得られる酵素が挙げられる。
前記酵素としては、例えば、クリプトコッカス(Cryptococcus)属(特開2006−262767号公報)、グルコノバクター(Gluconobacter)属(J.Bacteriol.,184,672−678,(2002))、サッカロマイセス(Saccharomyces)属(Methods Enzymol.,89,159−163,(1982))、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属(国際公開第2009/041415号)由来のグルコース脱水素酵素やクリプトコッカス(Cryptococcus)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属由来のグルコース−6−リン酸脱水素酵素が知られている(Arch. Biochem. Biophys.,228,113−119(1984))。
次に、エノンリダクターゼを用いたエナール(1)の還元反応について説明する。
エノンリダクターゼを用いた還元反応の際には、適当な溶媒と基質のエナール(1)、上記微生物、その培養物、またはその処理物等の酵素源を混合し、pH調整下に攪拌、振とうまたは静置する。
エノンリダクターゼを用いたエナール(1)の還元反応を促進させるために、前記反応液に、NAD+及び/またはNADP+をそれぞれの還元型へ還元する酵素と、該還元のための基質を共存させて反応を行うのが好ましい。例えば、還元型へ還元する酵素としてグルコース脱水素酵素、還元のための基質としてグルコースをそれぞれ共存させるか、または、還元型へ還元する酵素としてギ酸脱水素酵素、還元のための基質としてギ酸をそれぞれ共存させるのがよい。
一般に、生物学的方法による還元反応に必要とされているNADH、NADPH等の補酵素を添加することにより、反応を促進させることができる。この場合、通常は、反応液に直接これらを添加する。
更に、トリトン(ナカライテスク株式会社製)、スパン(関東化学株式会社製)、ツイーン(ナカライテスク株式会社製)などの界面活性剤を反応液に添加することも、還元反応をより促進することに効果的である。
また、反応系に有機溶剤を共存させてもよい。酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサン等の水に不溶な有機溶媒を反応液に添加すれば、基質及び/又は還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避できる。また、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加すれば、基質の溶解度を高めることができる。
また、反応系に有機溶剤を共存させてもよい。酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサン等の水に不溶な有機溶媒を反応液に添加すれば、基質及び/又は還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避できる。また、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加すれば、基質の溶解度を高めることができる。
反応溶媒としては、通常、水や緩衝液等の水性媒体を用いる。緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液やトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液が挙げられる。
酵素源は、通常、上記微生物の菌体を含んだ培養液をそのまま反応に使用する。培養液を濃縮して用いてもよい。また、培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、培養液を遠心分離等により処理して得られる菌体または菌体処理物を使用するとよい。
基質であるエナール(1)は、反応の初期に一括添加してもよく、反応の進行にあわせて逐次分割して添加してもよい。
反応時の温度は、上限として好ましくは60℃であり、更に好ましくは40℃である。下限としては好ましくは10℃であり、更に好ましくは20℃である。
反応時のpHは、上限として好ましくは10であり、更に好ましくは9である。下限として好ましくは2.5であり、更に好ましくは5である。
反応液中の酵素源の量は、これらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよく、上限として好ましくは50%(W/V)であり、更に好ましくは10%(W/V)である。下限として好ましくは0.01%(W/V)であり、更に好ましくは0.1%(W/V)である。
反応液中の基質濃度は、上限として好ましくは50%(W/V)であり、更に好ましくは30%(W/V)である。下限として好ましくは0.01%(W/V)であり、更に好ましくは0.1%(W/V)である。
反応は、通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。
反応時間は、基質濃度、微生物の量及びその他の反応条件により適宜決定される。反応時間の上限として好ましくは336時間であり、更に好ましくは168時間である。下限として好ましくは0.1時間であり、更に好ましくは1時間である。
還元反応を促進させるために、反応液にグルコース、エタノール、イソプロパノールなどのエネルギー源を加えるのが好ましい。添加量の上限として好ましくは50%(W/V)であり、更に好ましくは30%(W/V)である。下限として好ましくは0.1(W/V)であり、更に好ましくは0.5%(W/V)である。
還元反応により生成した光学活性アルデヒド(2)を取り出す方法は特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後に、酢酸エチル、トルエン、t−ブチルメチルエーテル、ヘキサン、n−ブタノール、ジクロロメタン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製することにより、高純度の光学活性アルデヒド(2)を容易に得ることができる。
このようにして得られた光学活性アルデヒド(2)は、いかなる変換方法を用いてラメルテオン(4)に誘導しても本発明の範囲に含まれる。好ましくは、光学活性アルデヒド(2)をプロピオン酸アミドと縮合して還元する方法(工程3)、若しくは光学活性アルデヒド(2)を光学活性アミン(3)に変換した後(工程4)、プロピロオニル化する方法(工程5)である。以下に、各工程について詳細に説明する。
(工程3)
本工程では、前記式(2)で表される光学活性アルデヒドをプロピオン酸アミドと縮合して還元することにより、前記式(4)で表されるラメルテオンを製造する。具体的には例えば、Adv.Synth.Catal 2013,355,717−733.に記載の方法に従って、ジグライム溶液中、プロピオンアミド、金属触媒として[Rh(COD)Cl]2、配位子としてXantphos(4,5−Bis(diphenylphosphino)−9,9−dimethylxanthene)を共存させ、水素ガスを加えることによって目的物が得られる。
本工程では、前記式(2)で表される光学活性アルデヒドをプロピオン酸アミドと縮合して還元することにより、前記式(4)で表されるラメルテオンを製造する。具体的には例えば、Adv.Synth.Catal 2013,355,717−733.に記載の方法に従って、ジグライム溶液中、プロピオンアミド、金属触媒として[Rh(COD)Cl]2、配位子としてXantphos(4,5−Bis(diphenylphosphino)−9,9−dimethylxanthene)を共存させ、水素ガスを加えることによって目的物が得られる。
このようにして得られた目的物は十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。
(工程4)
本工程で、前記式(2)で表される光学活性アルデヒドから、前記式(3)で表される光学活性アミンを製造する。ここで、前記光学活性アルデヒド(2)は工程2に記載の方法に従って製造してもよく、又はそれ以外の方法で製造したものであっても本発明の範囲に含まれる。
本工程で、前記式(2)で表される光学活性アルデヒドから、前記式(3)で表される光学活性アミンを製造する。ここで、前記光学活性アルデヒド(2)は工程2に記載の方法に従って製造してもよく、又はそれ以外の方法で製造したものであっても本発明の範囲に含まれる。
具体的な変換方法としては例えば、アンモニアとヒドリド還元剤を用いる方法、アンモニアと金属触媒存在下に水素化する方法、金属触媒存在下に蟻酸を用いる方法、酵素(トランスアミナーゼ)存在下にトランスアミノ化する方法が挙げられる。
前記アンモニアとヒドリド還元剤を用いる方法については例えば、J.Org.Chem.,2010,75,5470−5477.に記載の方法に従えばよい。即ち、エタノール溶媒中にアンモニア水と酢酸アンモニウムを加えて、シアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元することにより目的物が得られる。
また、前記アンモニアと金属触媒存在下に水素化する方法については例えば、特許第4059978号公報に記載の方法に従えばよい。即ち、均一系のニッケル、ロジウム、パラジウム、イリジウム等の遷移金属触媒存在下に、アンモニアガスと水素ガスを加えることにより目的物が得られる。若しくは、Catalysts 2015,5,2258−2270.に記載の方法に従ってもよく、即ち、アルミナに担持されたルテニウム触媒存在下に、アンモニアガスと水素ガスを加えることによっても目的物が得られる。
また、前記金属触媒存在下に蟻酸を用いる方法については例えば、国際公開第2016/096905号に記載の方法に従えばよい。即ち、パラジウム触媒存在下に蟻酸アンモニウムを用いることにより目的物が得られる。
更に、酵素(トランスアミナーゼ)存在下でトランスアミノ化する方法について説明する。即ち、前記式(2)で表される光学活性アルデヒドに、アミノ基供与体の存在下、前記式(3)で表される光学活性アミンを生成する能力を有するトランスアミナーゼを作用させることで、前記式(3)で表される光学活性アミンを製造する。
トランスアミナーゼは、光学活性アルデヒド(2)から、アミノ基供与体の存在下、光学活性アミン(3)を生成する能力を有するものであればいずれを用いても良い。また、トランスアミナーゼは、目的とするトランスアミノ化活性を有する限りにおいては、酵素そのものだけでなく、当該酵素を生成する微生物の菌体そのもの、微生物の培養液、または菌体処理物であってもよい。また、当該微生物由来の還元活性を有する酵素をコードするDNAが導入された形質転換体も含むものとする。
上記微生物の菌体処理物としては特に限定されず、例えば、乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体または菌体を破砕した無細胞抽出液などをあげることができる。更には、培養物より不斉還元反応を触媒する酵素を精製し、これを使用してもよい。これらは、単独で用いても、2種以上組み合わせて用いても良い。
また、これら微生物は周知の方法で固定化して用いてもよい。固定化方法としては、一般に、担体結合法、架橋法、包括法が挙げられるが、いずれを用いても良い。
また、前記トランスアミナーゼを、水中で反応させてもよく、有機溶媒中で反応、すなわち反応系に有機溶媒を共存、あるいは、有機溶媒のみを用いて反応させてもかまわない。有機溶媒のみを使用する場合には、若干の水を添加することで反応性が改善することが期待される。溶媒を使用する場合の溶剤としては、グリセロール、エチレングリコール、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール等のアルコール系溶媒;ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒;N,N−ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒;n−ヘキサン、n−ヘプタン等の脂肪族炭化水素系溶媒;酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒;ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒;アセトン、2−ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒;ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−tert−ブチルエーテル、エチル−tert−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、1,2−ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒;アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒;ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、1,2−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒;等が挙げられる。好ましい溶媒としては、ジメチルスルホキシド、N,N−ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル−tert−ブチルエーテル、エチル−tert−ブチルエーテルが挙げられ、さらに好ましい溶媒としては、メチル−tert−ブチルエーテルが挙げられる。
光学活性アルデヒド(2)から、アミノ基供与体の存在下、光学活性アミン(3)を生成する能力を有するトランスアミナーゼとしては、例えば、国際生化学・分子生物学連合の酵素分類法によりEC2.6.1.Xに分類される酵素群が挙げられる。
本発明の特に好ましい実施形態において、トランスアミナーゼは、一般にω−トランスアミナーゼと呼ばれるものが好ましい。ω−トランスアミナーゼとはαアミノ酸以外のアミンを生成する活性を持つものを示す。
上記ω−トランスアミナーゼとしては、具体的には、アースロバクター(Arthrobacter)属、バシラス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ビブリオ(Vibrio)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、メソリゾビウム(Mesorhizobium)属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属、カウロバクター(Caulobacter)属、ロドバクター(Rhodobacter)属、等の細菌由来のものが挙げられる。
好ましくは、アースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)、ビブリオ・フルビアリス(Vibrio fluvialis)、アースロバクター・シトレウス(Arthrobacter citreus)、アルカリゲネス・デネトリフィカンス(Alcaligenes denitrificans)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・コルガータ(Pseudomonas corrugata)、メソリゾビウム・エスピー(Mesorhizobium sp.)、クロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum)、カウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)、ロドバクター・スファエロイデス(Rhodobacter sphaeroides)が挙げられる。
最も好ましい例には、アースロバクター・エスピーKNK168(Arthrobacter sp.KNK168)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、シュードモナス・エスピーKNK425(Pseudomonas sp.KNK425)、シュードモナス・エスピーMV37(Pseudomonas sp.MV37)、ビブリオ・フルビアリスJS17(Vibrio fluvialis JS17)、アースロバクター・シトレウス(Arthrobacter citreus)、アルカリゲネス・デネトリフィカンスY2k−2(Alcaligenes denitrificans Y2k−2)、シュードモナス・フルオレッセンスKNK08−18(Pseudomonas fluorescens KNK08−18)、シュードモナス・コルガータ10F6(Pseudomonas corrugata 10F6)、メソリゾビウム・エスピーLUK(Mesorhizobium sp.LUK)、クロモバクテリウム・ビオラセウムDSM 30191(Chromobacterium violaceum DSM 30191)、バシラス・メガテリウムSC6394(Bacillus megaterium SC6394)、カウロバクター・クレセンタスCB15(Caulobacter crescentus CB15)、ロドバクター・スファエロイデスDSM 158(Rhodobacter sphaeroides DSM 158)などが挙げられる。
これらのω−トランスアミナーゼは、例えば、Iwasaki et al.,Biotechnol.Lett.(2003)25,1843−1846,Shin et al.,Biotechnol.Bioeng.(1997)55,348−358,Shin and Kim,Book of Abstracts,217th ACS National Meeting,Anaheim,Calif.,March 21−25,(1999)180,Shin and Kim,Biosc.Biotechnol.Biochem.(2001)65,1782−1788 and Shin and Kim,Biotechnol.Bioeng.(1998)60,534−540,M.Shaheer et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.(2012)94,1163−1171,Sam et al.,ACS catal.(2012)2,993−1001,Rudat et al.,AMB Express(2012)2:11,Par et al.,Biotechnol.Bioeng.,(2011)108,1479−1493,国際公開第2012/124639号,国際公開第2012/043653号,国際公開第2012/043622号,国際公開第2012/007548号,国際公開第2011/026556号等に記載されている。
これら微生物は、通常、入手または購入が容易な保存株から得ることができる。例えば、以下のカルチャーコレクションより入手可能である。
・独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門(NBRC)(〒292−0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)
・独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室(JCM)(〒351−0198 埼玉県和光市広沢2−1)
・German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH(DSMZ)(Marschroder Weg 1b,D−38124 Brunswick,Germany)
・独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門(NBRC)(〒292−0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)
・独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室(JCM)(〒351−0198 埼玉県和光市広沢2−1)
・German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH(DSMZ)(Marschroder Weg 1b,D−38124 Brunswick,Germany)
また、本発明に利用するトランスアミナーゼは、目的のトランスアミノ化活性を有している限りにおいては、その公知のアミノ酸配列において1、若しくは複数個(例えば、40個、好ましくは20個、より好ましくは15個、さらに好ましくは10個、さらに好ましくは5個、4個、3個、または2個以下)のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び/または付加されたポリペプチドであってもよい。あるいは、そのアミノ酸配列が公知のアミノ酸配列に対して相同性85%以上、好ましくは、90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、または99%以上のアミノ酸配列を有していても良い。また、トランスアミノ化活性を有する限り、本発明に利用する還元酵素のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合してもよい。たとえば、ヒスチジンタグやHAタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、目的の還元酵素活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
本発明においては、トランスアミナーゼをコードするDNAを含む形質転換体を使用すると、より効率的に光学活性アミン(3)を製造することができる。なお、本明細書において記述されている、DNAの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 4th Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012)、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley−Interscience)等の成書に記載されている方法により実施できる。
上記の形質転換体に用いるベクターとしては、適当な宿主生物内で本発明に利用するトランスアミナーゼをコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、lacUV5プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、lppプロモーター、tufBプロモーター、recAプロモーター、pLプロモーター等の制御因子を含み、本発明のDNAと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUCNT(国際公開第94/03613号)などが挙げられる。
なお、「制御因子」とは、機能的プロモーター、及び、任意の関連する転写要素(例えばエンハンサー、CCAATボックス、TATAボックス、SPI部位など)を有する塩基配列をいう。
なお、「制御因子」とは、機能的プロモーター、及び、任意の関連する転写要素(例えばエンハンサー、CCAATボックス、TATAボックス、SPI部位など)を有する塩基配列をいう。
また、「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。なお、制御因子のタイプ及び種類が宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
各酵素を発現させるために用いる宿主生物は、各酵素をコードするDNAを含む酵素発現ベクターにより形質転換され、DNAを導入した酵素を発現することができる生物であれば、特に制限するものではない。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌(エシェリヒア・コリ(Escherichia coli))が特に好ましい。
本発明に利用する還元酵素をコードするDNAを含むベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入することができる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のエシェリヒア・コリ(Escherichia coli HB101(以下、E.coli HB101)コンピテントセル(タカラバイオ社製))を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入することができる。
トランスアミナーゼを用いたアミノ化反応は一般的に可逆反応であるため、一般的に平衡点で見かけ上反応が停止する。これらの反応平衡を解消する公知の方法を組み合わせることで、本発明のポリペプチドを用いた反応を改善することができる。例えば、国際公開第2007/139055号に記載のように、アミノ基供与体としてアラニンを用いて、副生成するピルビン酸を乳酸脱水素酵素と補酵素再生用のグルコース脱水素酵素を共役させることで乳酸へ変換し、反応平衡を解消する方法が有効である。同様に、アミノ基供与体としてアラニンを用いて、副生成するピルビン酸を、ピルビン酸デカルボキシラーゼで除く方法(国際公開第2007/093372号)、アラニン脱水素酵素を用いる方法(US2009/0117627A1公報)、過酸化水素で除く方法(US2008/0213845A1公報)、アセト酪酸合成酵素を用いる方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.72(11),3030−3033(2008))、イソプロピルアミンを用いて生成するアセトンを除去する方法なども有効である。
上記の反応平衡を解消するために複数の酵素を共役させる場合には、それら複数の酵素を同一宿主細胞内で生産する形質転換体を用いることにより、より効率的に本発明の光学活性化合物を製造することができる。当該形質転換体は必要な複数の酵素遺伝子コードするDNAを同一ベクターに組み込み、これを同一の宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら2種のDNAを不和合性グループの異なる複数のベクターに組み込み、同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。
アミノ基供与体としては、酵素源の存在下で前記式(3)で表される光学活性アミンを生成するものであればいかなるものでも使用できる。具体例としては、α−フェネチルアミン、2−ブチルアミン、2−ペンチルアミン、2−ヘプチルアミン、3−ヘプチルアミン、n−エチルアミン、n−プロピルアミン、n−ブチルアミン、n−アミルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、α−アミノ酸(例えば、グリシン、アラニン等)、3−アミノ−1−フェニルブタン、ベンジルアミン、β−フェネチルアミン、シクロヘキシルアミンおよびそれらの光学活性体が挙げられる。なかでも、α−フェネチルアミン、イソプロピルアミン、又はα−アミノ酸(例えば、アラニン等)が好ましく、α−フェネチルアミン又はα−アミノ酸がより好ましい。
ω−トランスアミナーゼとアミノ基供与体の好ましい組み合わせとしては、以下のものが例示される。
1)アミノ基供与体がイソプロピルアミンのときは、好ましくはアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)、ビブリオ・フルビアリス(Vibrio fluvialis)、またはシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)であり、より好ましくはアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)である。
2)アミノ基供与体がα−フェネチルアミンのときは、好ましくはアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)、ビブリオ・フルビアリス(Vibrio fluvialis)、またはシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)であり、より好ましくはアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)、またはシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)であり、更に好ましくはシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)である。
3)アミノ基供与体がα−アミノ酸(特にアラニン)のときは、好ましくはアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)、ビブリオ・フルビアリス(Vibrio fluvialis)、またはシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)であり、より好ましくはアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)、またはシュードモナス・エスピーMV37(Pseudomonas sp.MV37)である。
1)アミノ基供与体がイソプロピルアミンのときは、好ましくはアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)、ビブリオ・フルビアリス(Vibrio fluvialis)、またはシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)であり、より好ましくはアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)である。
2)アミノ基供与体がα−フェネチルアミンのときは、好ましくはアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)、ビブリオ・フルビアリス(Vibrio fluvialis)、またはシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)であり、より好ましくはアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)、またはシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)であり、更に好ましくはシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)である。
3)アミノ基供与体がα−アミノ酸(特にアラニン)のときは、好ましくはアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)、ビブリオ・フルビアリス(Vibrio fluvialis)、またはシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)であり、より好ましくはアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)、またはシュードモナス・エスピーMV37(Pseudomonas sp.MV37)である。
次に、トランスアミナーゼを用いた光学活性アルデヒド(2)のトランスアミノ化反応について説明する。
酵素源を用いたトランスアミノ化反応の際には、適当な溶媒と基質の光学活性アルデヒド(2)、上記微生物、その培養物、またはその処理物等を混合し、pH調整下に攪拌、振とうまたは静置する。
反応溶媒としては、通常、水や緩衝液等の水性媒体を用いる。緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液やトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液が挙げられる。
トランスアミナーゼは、上記微生物の菌体を含んだ培養液をそのまま反応に使用してもよいし、培養液を濃縮して用いてもよい。また、培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、培養液を遠心分離等により処理して得られる菌体または菌体処理物を使用するとよい。
基質である光学活性アルデヒド(2)は、反応の初期に一括添加してもよく、反応の進行にあわせて逐次分割して添加してもよい。
反応時の温度は、上限として好ましくは60℃であり、更に好ましくは40℃である。下限としては好ましくは10℃であり、更に好ましくは20℃である。
反応時のpHは、上限として好ましくは10であり、更に好ましくは9である。下限として好ましくは2.5であり、更に好ましくは5である。
反応液中の酵素源の量は、これらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよく、上限として好ましくは50%(W/V)であり、更に好ましくは10%(W/V)である。下限として好ましくは0.01%(W/V)であり、更に好ましくは0.1%(W/V)である。
反応液中の基質濃度は、上限として好ましくは50%(W/V)であり、更に好ましくは30%(W/V)である。下限として好ましくは0.01%(W/V)であり、更に好ましくは0.1%(W/V)である。
反応は、通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。
反応時間は、基質濃度、微生物の量及びその他の反応条件により適宜決定される。反応時間の上限として好ましくは336時間であり、更に好ましくは168時間である。下限として好ましくは0.1時間であり、更に好ましくは1時間である。
還元反応を促進させるために、反応液にグルコース、エタノール、イソプロパノールなどのエネルギー源を加えるのが好ましい。添加量の上限として好ましくは50%(W/V)であり、更に好ましくは30%(W/V)である。下限として好ましくは0.1(W/V)であり、更に好ましくは0.5%(W/V)である。
更に、トリトン(ナカライテスク株式会社製)、スパン(関東化学株式会社製)、ツイーン(ナカライテスク株式会社製)などの界面活性剤を反応液に添加することも効果的である。
更に、基質及び/又は還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避する目的で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒(不水溶性有機溶媒)を反応液に添加してもよい。
更に、基質の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒(水溶性有機溶媒)を添加することもできる。
上記の反応により、光学活性アミンが生成する。生成した光学活性アミンは、反応混合液から抽出、蒸留、再結晶、カラム分離など公知の方法によって単離することができる。
例えば、pHを酸性に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類;酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類;ヘキサン、オクタン、ベンゼン等の炭化水素類;塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等一般的な溶媒により、生成した光学活性アミノ化合物を水相に残したまま、未反応の基質およびアミノ基転移反応により生じたアミノ基供与体に対応するケトン化合物を選択的に除くことができる。
生成した光学活性アミノ化合物および未反応のアミノ基供与体は、例えば、pHを塩基性に調節し、同様に一般的な有機溶媒で抽出することができる。
生成した光学活性アミノ化合物と未反応のアミノ基供与体は、例えば、蒸留により分離することができる。
このようにして得られた目的物は、後続工程に使用できる十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、転溶洗浄、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。好ましくは、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、シュウ酸、蟻酸、酢酸、安息香酸、p−ニトロ安息香酸、トリフルオロ酢酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、カンファースルホン酸等の酸と塩を形成させて晶析する方法である。具体的には例えば、国際公開第2006/030739号に記載された方法、即ち、前記光学活性アミン(3)の塩酸塩をn−ブタノールから晶析する方法である。
(工程5)
本工程で、工程4に記載の方法で製造された前記式(3)で表される光学活性アミンを、更にプロピオニル化することにより、前記式(4)で表されるラメルテオンを製造する。
本工程で、工程4に記載の方法で製造された前記式(3)で表される光学活性アミンを、更にプロピオニル化することにより、前記式(4)で表されるラメルテオンを製造する。
前記プロピオニル化する方法としては、塩基存在下に塩化プロピオニル、臭化プロピオニル、又は無水プロピオン酸等のプロピオニル化剤を用いればよい。
前記塩基としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどの無機塩基;リチウムメトキシド、リチウムエトキシド、リチウムイソプロポキシド、リチウムtert−ブトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムイソプロポキシド、ナトリウムtert−ブトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、カリウムイソプロポキシド、カリウムtert−ブトキシド等のアルコキシド;水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物;トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N−メチルピロリジン、N−メチルモルホリン、1,8−ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデク−7−エン、ピリジン、キノリン、イミダゾール等のアミンが挙げられる。これらは単独で用いても良く、2種以上を併用してもよい。2種以上を併用する場合、その混合比は特に制限されない。好ましくは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、又はトリブチルアミンであり、更に好ましくは、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、又はトリエチルアミンである。
前記塩基の使用量としては、上限としては、前記化合物(3)に対して好ましくは100倍重量であり、更に好ましくは50倍重量であり、特に好ましくは10倍重量である。下限としては、前記化合物(3)に対して好ましくは0.1倍重量であり、更に好ましくは0.5倍重量であり、特に好ましくは1倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
前記プロピオニル化剤の使用量としては、上限としては、前記化合物(3)に対して好ましくは50倍重量であり、更に好ましくは10倍重量であり、特に好ましくは5倍重量である。下限としては、前記化合物(3)に対して好ましくは0.5倍重量であり、更に好ましくは0.8倍重量であり、特に好ましくは1倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
本工程の溶媒としては、反応に影響を与えない限りにおいては特に制限はなく、具体的には例えば、水;テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、1,4−ジオキサン、メチルtert−ブチルエーテル(MTBE)、エチレングリコールジメチルエーテル、4−メチルテトラヒドロピラン等のエーテル系溶媒;アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒;酢酸エチル、酢酸n−プロピル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒;ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒;ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、メシチレン等の芳香族炭化水素系溶媒;アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒;塩化メチレン、1,2−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒;ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒;N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N,N−ジエチルアセトアミド、N−メチル−2−ピロリドン、N−エチル−2−ピロリドン、N−メチル−ε−カプロラクタム、ヘキサメチルホスホルアミド等のアミド系溶媒;ジメチルプロピレンウレア等のウレア系溶媒;ヘキサメチルホスホン酸トリアミド等のホスホン酸トリアミド系溶媒等を用いることができる。これらは単独で用いても良く、2種以上を併用してもよい。2種以上を併用する場合、その混合比は特に制限されない。好ましくは水;テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、1,4−ジオキサン、メチルtert−ブチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、4−メチルテトラヒドロピラン等のエーテル系溶媒;アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒;アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒であり、更に好ましくは水、テトラヒドロフラン、アセトン、又はアセトニトリルであり、特に好ましくはテトラヒドロフラン、又はアセトニトリルである。
前記溶媒の使用量は、上限としては、前記化合物(3)に対して好ましくは100倍重量であり、更に好ましくは50倍重量であり、特に好ましくは20倍重量である。下限としては、前記化合物(3)に対して好ましくは0.1倍重量であり、更に好ましくは0.5倍重量であり、特に好ましくは1倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
本反応における反応温度には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、副生成物の生成を少なくするため、上限としては好ましくは150℃であり、更に好ましくは100℃であり、特に好ましくは50℃である。下限としては好ましくは−80℃であり、更に好ましくは−30℃であり、特に好ましくは0℃である。
本反応における反応時間には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、上限としては好ましくは100時間であり、更に好ましくは50時間であり、特に好ましくは25時間である。下限として好ましくは0.1時間であり、更に好ましくは0.5時間であり、特に好ましくは1時間である。
本工程の化合物(3)、プロピオニル化剤、塩基、溶媒の混合順序については、特に制限はない。
反応後の処理としては、反応液から生成物を取得するための一般的な処理を行えばよい。例えば、反応終了後の反応液を水、又は塩酸、硫酸等の酸水溶液に加え、一般的な抽出溶媒、例えば酢酸エチル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、トルエン、ヘキサン等を用いて抽出操作を行う。得られた抽出液から減圧加熱等の操作により、反応溶媒及び抽出溶媒を留去すると目的物(4)が得られる。好ましくは、反応液に水を加えることで析出する目的物を濾別し、水、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、塩化メチレン、トルエン、ヘプタン等で洗浄するとよい。このようにして得られた目的物であるラメルテオン(4)は十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。
本願は、2017年5月10日に出願された日本国特許出願第2017−094201号に基づく優先権の利益を主張するものである。2017年5月10日に出願された日本国特許出願第2017−094201号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
以下に、実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例は本発明を何ら限定するものではない。
(実施例1) (E)−2−[1,2,6,7−tetrahydro−8H−indeno[5,4−b]furan−8−ylidene]acetaldehydeの製造
(E)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−ylidene)acetonitrile(純度:97.6重量%、252.5mg、1.25mmol)、トルエン(10mL)からなる溶液を−70℃に冷却し、ここに水素化ジイソブチルアルミニウム/トルエン溶液(1.0mol/L、2.5mL、2.5mmol)を15分で滴下した。25℃まで自然に昇温させながら16時間攪拌した後、酢酸エチル(5mL)を添加した(反応収率:75%)。水(30mL)、トルエン(20mL)、濃塩酸(5mL)を加えて抽出した。水層を更にトルエン(20mL)で2回抽出し、有機層を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、濾液から減圧下に溶媒を留去し、残査にヘキサン(10mL)を加えて晶析した。結晶を減圧濾別し、ヘキサン(10mL)で洗浄後、真空乾燥することにより標題化合物を赤色固体として得た(68.7mg、純度:93.8重量%、単離収率:26%)。
1H NMR(CDCl3):δ10.05(1H,d)、7.13(1H,d)、6.90(1H,d)、6.33(1H,d)、4.67(2H,dd)、3.41(2H,dd)、3.33(2H,m)、3.10(2H,m)
(E)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−ylidene)acetonitrile(純度:97.6重量%、252.5mg、1.25mmol)、トルエン(10mL)からなる溶液を−70℃に冷却し、ここに水素化ジイソブチルアルミニウム/トルエン溶液(1.0mol/L、2.5mL、2.5mmol)を15分で滴下した。25℃まで自然に昇温させながら16時間攪拌した後、酢酸エチル(5mL)を添加した(反応収率:75%)。水(30mL)、トルエン(20mL)、濃塩酸(5mL)を加えて抽出した。水層を更にトルエン(20mL)で2回抽出し、有機層を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、濾液から減圧下に溶媒を留去し、残査にヘキサン(10mL)を加えて晶析した。結晶を減圧濾別し、ヘキサン(10mL)で洗浄後、真空乾燥することにより標題化合物を赤色固体として得た(68.7mg、純度:93.8重量%、単離収率:26%)。
1H NMR(CDCl3):δ10.05(1H,d)、7.13(1H,d)、6.90(1H,d)、6.33(1H,d)、4.67(2H,dd)、3.41(2H,dd)、3.33(2H,m)、3.10(2H,m)
(実施例2) (S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehydeの製造
(E)−2−[1,2,6,7−tetrahydro−8H−indeno[5,4−b]furan−8−ylidene]acetaldehyde(400mg、2mmol)、Diethyl 1,4−Dihydro−2,6−dimethyl−3,5−pyridinedicarboxylate(608mg、2.4mmol)、(R)−2−(ジフェニルメチル)ピロリジン(47.5mg、0.2mmol)、テトラヒドロフラン(3mL)、トリフルオロ酢酸(22.8mg、0.2mmol)からなる溶液を20℃、16時間攪拌した(反応収率:80%)。反応液を減圧濃縮後、得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、標題化合物を淡黄色油状物として得た(260.0mg、純度:93.3%、単離収率:60%、光学純度:85.2%ee)。
1H NMR(CDCl3):δ9.85(1H,s)、6.98(1H,d)、6.64(1H,d)、4.60−4.52(2H,m)、3.70(1H,m)、3.15−3.09(2H,m)、2.90−2.81(3H,m)、2.81−2.61(1H,m)、2.50−2.40(1H,m)、1.76−1.70(1H,m)
(E)−2−[1,2,6,7−tetrahydro−8H−indeno[5,4−b]furan−8−ylidene]acetaldehyde(400mg、2mmol)、Diethyl 1,4−Dihydro−2,6−dimethyl−3,5−pyridinedicarboxylate(608mg、2.4mmol)、(R)−2−(ジフェニルメチル)ピロリジン(47.5mg、0.2mmol)、テトラヒドロフラン(3mL)、トリフルオロ酢酸(22.8mg、0.2mmol)からなる溶液を20℃、16時間攪拌した(反応収率:80%)。反応液を減圧濃縮後、得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、標題化合物を淡黄色油状物として得た(260.0mg、純度:93.3%、単離収率:60%、光学純度:85.2%ee)。
1H NMR(CDCl3):δ9.85(1H,s)、6.98(1H,d)、6.64(1H,d)、4.60−4.52(2H,m)、3.70(1H,m)、3.15−3.09(2H,m)、2.90−2.81(3H,m)、2.81−2.61(1H,m)、2.50−2.40(1H,m)、1.76−1.70(1H,m)
(光学純度分析条件)
カラム:ダイセルキラルセルOD−H 4.6×250mm
溶離液:エタノール/ヘキサン=2/98(v/v)
カラム温度:30℃
流速:1.0mL/min.
検出器:UV210nm
保持時間:S体=14.1分、R体=17.6分
カラム:ダイセルキラルセルOD−H 4.6×250mm
溶離液:エタノール/ヘキサン=2/98(v/v)
カラム温度:30℃
流速:1.0mL/min.
検出器:UV210nm
保持時間:S体=14.1分、R体=17.6分
(実施例3〜20) (S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehydeの製造
(E)−2−[1,2,6,7−tetrahydro−8H−indeno[5,4−b]furan−8−ylidene]acetaldehyde(200mg、1mmol)、Diethyl 1,4−Dihydro−2,6−dimethyl−3,5−pyridinedicarboxylate(304mg、1.2mmol)に溶媒、不斉有機触媒、酸を加えて、種々条件を変えて実施した結果を以下に示す。
(E)−2−[1,2,6,7−tetrahydro−8H−indeno[5,4−b]furan−8−ylidene]acetaldehyde(200mg、1mmol)、Diethyl 1,4−Dihydro−2,6−dimethyl−3,5−pyridinedicarboxylate(304mg、1.2mmol)に溶媒、不斉有機触媒、酸を加えて、種々条件を変えて実施した結果を以下に示す。
(実施例21〜24) (S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehydeの製造
(E)−2−[1,2,6,7−tetrahydro−8H−indeno[5,4−b]furan−8−ylidene]acetaldehyde(0.05mmol)、D−グルコース(0.15mmol)、NAD+(0.05μmol)、NADP+(0.05μmol)、を下記に示すエノンリダクターゼとグルコース脱水素酵素の存在下でリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)1mL中で、30℃で一晩攪拌した。その結果を以下に示す。なお、(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehydeへの変換率は、反応液200μLを酢酸エチル1mLで抽出した後、下記条件のガスクロマトグラフィーで確認した。光学純度は下記条件にて分析した。
(E)−2−[1,2,6,7−tetrahydro−8H−indeno[5,4−b]furan−8−ylidene]acetaldehyde(0.05mmol)、D−グルコース(0.15mmol)、NAD+(0.05μmol)、NADP+(0.05μmol)、を下記に示すエノンリダクターゼとグルコース脱水素酵素の存在下でリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)1mL中で、30℃で一晩攪拌した。その結果を以下に示す。なお、(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehydeへの変換率は、反応液200μLを酢酸エチル1mLで抽出した後、下記条件のガスクロマトグラフィーで確認した。光学純度は下記条件にて分析した。
(変換率分析条件)
カラム:RESTEK社、Rtx(登録商標)−35 Amine 30ミリ×0.25mm ID
溶離液:エタノール/ヘキサン=2/98(v/v)
カラム温度:220℃
インジェクター温度:200℃
ディテクター温度:200℃
キャリアガス:He(150kPa)
検出:FID
カラム:RESTEK社、Rtx(登録商標)−35 Amine 30ミリ×0.25mm ID
溶離液:エタノール/ヘキサン=2/98(v/v)
カラム温度:220℃
インジェクター温度:200℃
ディテクター温度:200℃
キャリアガス:He(150kPa)
検出:FID
(光学純度分析条件)
カラム:ダイセルキラルセルOD−H 4.6×250mm
溶離液:エタノール/ヘキサン=2/98(v/v)
カラム温度:30℃
流速:1.0mL/min.
検出器:UV210nm
カラム:ダイセルキラルセルOD−H 4.6×250mm
溶離液:エタノール/ヘキサン=2/98(v/v)
カラム温度:30℃
流速:1.0mL/min.
検出器:UV210nm
(実施例25) (S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineの製造
(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehyde(純度:94.2重量%、360mg、1.68mmol)、酢酸アンモニウム(2.59g、33.6mmol)、エタノール(30mL)、25重量%アンモニア水(10mL)からなる溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム317mg(5.0mmol)を25℃で加え、70℃に昇温して6時間攪拌した。室温まで冷却後、30重量%水酸化ナトリウム水溶液(1.344g、10.1mmol)を加え、減圧下にエタノールを留去した。得られた残査に4−メチルテトラヒドロピラン(15mL×2回)を加えて抽出し、有機層を合わせて飽和食塩水10mLで2回洗浄、減圧濃縮することにより黄色油状物(810.0mg)を得た(純度:12.3重量%、収率:29%)。
続いて、転溶洗浄操作により精製を行った。前記黄色油状物(810.0mg)に酢酸エチル(10mL)と水(5mL)を加え、濃塩酸でpH=0.1に調整した。有機層を分離後、水層に30重量%水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH=12に調整し、酢酸エチル(10mL)で2回抽出した。有機層を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮することにより、標題化合物を無色油状物として得た(純度:93.3重量%、転溶洗浄回収率:97%)。
1H NMR(CDCl3):δ6.87(1H,d)、6.53(1H,d)、4.51−4.42(2H,m)、3.16−3.03(3H,m)、2.80−2.67(4H,m)、2.15(1H,m)、1.93−1.87(3H,m)、1,70(1H,m)、1.50(1H,m)
(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehyde(純度:94.2重量%、360mg、1.68mmol)、酢酸アンモニウム(2.59g、33.6mmol)、エタノール(30mL)、25重量%アンモニア水(10mL)からなる溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム317mg(5.0mmol)を25℃で加え、70℃に昇温して6時間攪拌した。室温まで冷却後、30重量%水酸化ナトリウム水溶液(1.344g、10.1mmol)を加え、減圧下にエタノールを留去した。得られた残査に4−メチルテトラヒドロピラン(15mL×2回)を加えて抽出し、有機層を合わせて飽和食塩水10mLで2回洗浄、減圧濃縮することにより黄色油状物(810.0mg)を得た(純度:12.3重量%、収率:29%)。
続いて、転溶洗浄操作により精製を行った。前記黄色油状物(810.0mg)に酢酸エチル(10mL)と水(5mL)を加え、濃塩酸でpH=0.1に調整した。有機層を分離後、水層に30重量%水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH=12に調整し、酢酸エチル(10mL)で2回抽出した。有機層を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮することにより、標題化合物を無色油状物として得た(純度:93.3重量%、転溶洗浄回収率:97%)。
1H NMR(CDCl3):δ6.87(1H,d)、6.53(1H,d)、4.51−4.42(2H,m)、3.16−3.03(3H,m)、2.80−2.67(4H,m)、2.15(1H,m)、1.93−1.87(3H,m)、1,70(1H,m)、1.50(1H,m)
(実施例26) (S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineの製造
(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehyde(0.05mmol)、α−phenetylamine(0.075mmol)、ピリドキサルリン酸(0.5μmol)、をω−トランスアミナーゼの存在下、リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)1mL中で、30℃で一晩攪拌した。反応終了後、反応液200μLを30重量%水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH=12に調整し、酢酸エチル1mLで抽出した後、下記条件のガスクロマトグラフィーで分析したところ、(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineが生成していた。
(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehyde(0.05mmol)、α−phenetylamine(0.075mmol)、ピリドキサルリン酸(0.5μmol)、をω−トランスアミナーゼの存在下、リン酸カリウム緩衝液(pH7.5)1mL中で、30℃で一晩攪拌した。反応終了後、反応液200μLを30重量%水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH=12に調整し、酢酸エチル1mLで抽出した後、下記条件のガスクロマトグラフィーで分析したところ、(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineが生成していた。
(変換率分析条件)
カラム:RESTEK社、Rtx(登録商標)−35 Amine 30ミリ×0.25mm ID
カラム温度:220℃
インジェクター温度:200℃
ディテクター温度:200℃
キャリアガス:He(150kPa)
検出:FID
カラム:RESTEK社、Rtx(登録商標)−35 Amine 30ミリ×0.25mm ID
カラム温度:220℃
インジェクター温度:200℃
ディテクター温度:200℃
キャリアガス:He(150kPa)
検出:FID
(実施例27) ω−トランスアミナーゼ発現大腸菌の凍結乾燥菌体調製
以下のω−トランスアミナーゼ遺伝子、酵素A:アースロバクター・エスピーKNK168(Arthrobacter sp.KNK168)(特許第5410089号公報、配列番号25)、酵素B:シュードモナス・エスピーKNK425(Pseudomonas sp.KNK425)(特許第5410089号公報、配列番号2)、酵素C:シュードモナス・フルオレッセンスKNK08−18(Pseudomonas fluorescens)(特許第5410089号公報、配列番号5)、酵素D:シュードモナス・エスピーMV37(Pseudomonas sp.MV37)(特許第5878871号公報、配列番号2)、酵素E:ビブリオ・フルビアリスJS17(Vibrio fluvialis JS17)(Appl.Microbiol.Biotechnol.61.463−471(2003)に記載の配列)、をpUCNT(国際公開第94/03613号)のlacプロモーターの下流のNdeI認識部位とマルチクローニングサイトの間に挿入し、組換えベクターを得た。組換えベクターを用いて大腸菌E.coli HB101(タカラバイオ株式会社製)を形質転換し、組換え大腸菌を得た。得られた組換え大腸菌を200μg/mlのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%、イーストエキス1.0%、NaCl 0.5%、pH7.0)で培養し、菌体を回収した。得られた菌体をドライアイスを溶解したメタノール中で凍結させた後、凍結乾燥機(東京理化器械、FDS−1000)で終夜乾燥させ、凍結乾燥菌体を取得した。
以下のω−トランスアミナーゼ遺伝子、酵素A:アースロバクター・エスピーKNK168(Arthrobacter sp.KNK168)(特許第5410089号公報、配列番号25)、酵素B:シュードモナス・エスピーKNK425(Pseudomonas sp.KNK425)(特許第5410089号公報、配列番号2)、酵素C:シュードモナス・フルオレッセンスKNK08−18(Pseudomonas fluorescens)(特許第5410089号公報、配列番号5)、酵素D:シュードモナス・エスピーMV37(Pseudomonas sp.MV37)(特許第5878871号公報、配列番号2)、酵素E:ビブリオ・フルビアリスJS17(Vibrio fluvialis JS17)(Appl.Microbiol.Biotechnol.61.463−471(2003)に記載の配列)、をpUCNT(国際公開第94/03613号)のlacプロモーターの下流のNdeI認識部位とマルチクローニングサイトの間に挿入し、組換えベクターを得た。組換えベクターを用いて大腸菌E.coli HB101(タカラバイオ株式会社製)を形質転換し、組換え大腸菌を得た。得られた組換え大腸菌を200μg/mlのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%、イーストエキス1.0%、NaCl 0.5%、pH7.0)で培養し、菌体を回収した。得られた菌体をドライアイスを溶解したメタノール中で凍結させた後、凍結乾燥機(東京理化器械、FDS−1000)で終夜乾燥させ、凍結乾燥菌体を取得した。
(実施例28) ω−トランスアミナーゼを用いた(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineの製造(水中反応、1酵素法)
(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehyde(0.05mmol)、アミノ基供与体((S)−α−phenetylamine(0.075mmol)(以下、S−PEA)、あるいは、(R)−α−phenetylamine(0.075mmol)(以下、R−PEA)、あるいは、イソプロピルアミン(0.375mmol)(以下、ISPA))、ピリドキサルリン酸(0.5μmol)、とω−トランスアミナーゼの凍結乾燥菌体(酵素A、B、C、D、Eのいずれか)5mgを加えたリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)0.5mL中で、30℃で一晩攪拌して反応した。反応終了後、反応液200μLを30重量%水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH=12に調整し、酢酸エチル1mLで抽出した後、実施例26と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析した結果を表4に示す。その結果、全ての酵素で(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineが生成していた。
(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehyde(0.05mmol)、アミノ基供与体((S)−α−phenetylamine(0.075mmol)(以下、S−PEA)、あるいは、(R)−α−phenetylamine(0.075mmol)(以下、R−PEA)、あるいは、イソプロピルアミン(0.375mmol)(以下、ISPA))、ピリドキサルリン酸(0.5μmol)、とω−トランスアミナーゼの凍結乾燥菌体(酵素A、B、C、D、Eのいずれか)5mgを加えたリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)0.5mL中で、30℃で一晩攪拌して反応した。反応終了後、反応液200μLを30重量%水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH=12に調整し、酢酸エチル1mLで抽出した後、実施例26と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析した結果を表4に示す。その結果、全ての酵素で(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineが生成していた。
(実施例29) ω−トランスアミナーゼを用いた(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineの製造(水中反応、3酵素法)
国際公開第2007/139055号の実施例13に記載のペディオコッカス・アシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)JCM8797株由来のL−乳酸脱水素酵素PALDHとバシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)IAM1030由来グルコース脱水素酵素GDHを共発現する組換え大腸菌を、200μg/mlのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%、イーストエキス1.0%、NaCl 0.5%、pH7.0)で培養し、遠心分離により集菌した。得られた菌体をドライアイスを溶解したメタノール中で凍結させた後、凍結乾燥機(東京理化器械、FDS−1000)で終夜乾燥させ、PAL・GDH凍結乾燥菌体を取得した。
国際公開第2007/139055号の実施例13に記載のペディオコッカス・アシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)JCM8797株由来のL−乳酸脱水素酵素PALDHとバシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)IAM1030由来グルコース脱水素酵素GDHを共発現する組換え大腸菌を、200μg/mlのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%、イーストエキス1.0%、NaCl 0.5%、pH7.0)で培養し、遠心分離により集菌した。得られた菌体をドライアイスを溶解したメタノール中で凍結させた後、凍結乾燥機(東京理化器械、FDS−1000)で終夜乾燥させ、PAL・GDH凍結乾燥菌体を取得した。
(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehyde(50μmol)、アミノ基供与体(L−アラニン(561μmol)、あるいは、D−アラニン(561μmol))、ピリドキサルリン酸(0.5μmol)、D−グルコース(333μmol)、NAD+(1.3μmol)と、ω−トランスアミナーゼ凍結乾燥菌体(酵素A、B、C、D、Eのいずれか)5mg、PAL・GDH凍結乾燥菌体2.5mgを加えたリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)1mL中で、30℃で4時間攪拌した。
反応終了後、反応液200μLに30重量%水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH=12に調整し、酢酸エチル1mLで抽出した後、実施例26と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析した結果を表5に示す。その結果、全ての酵素で(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineが生成していた。
(実施例30) ω−トランスアミナーゼを用いた(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineの製造(溶媒中反応)
(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehyde(0.05mmol)、アミノ基供与体((S)−α−phenetylamine(0.075mmol)(S−PEA))を、pH7.5に調整した0.5Mピリドキサルリン酸水溶液0.5μLとω−トランスアミナーゼ凍結乾燥菌体(酵素D)5mgを加えた水飽和MTBE0.5mL中で、30℃で3時間攪拌して反応した。反応終了後、反応液を実施例26と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析した結果を表6に示す。その結果、(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineが生成していた。
(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehyde(0.05mmol)、アミノ基供与体((S)−α−phenetylamine(0.075mmol)(S−PEA))を、pH7.5に調整した0.5Mピリドキサルリン酸水溶液0.5μLとω−トランスアミナーゼ凍結乾燥菌体(酵素D)5mgを加えた水飽和MTBE0.5mL中で、30℃で3時間攪拌して反応した。反応終了後、反応液を実施例26と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析した結果を表6に示す。その結果、(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineが生成していた。
(実施例31) 酵素フローリアクターを用いた(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineの製造
ダイヤイオンHP2MG(三菱ケミカル社製)7.5gを7.5mLの0.1MKPB(リン酸カリウム緩衝液)(pH7.5)で2回洗浄した後に、TPMの凍結乾燥菌体250mgとPLP(ピリドキサルリン酸)20mgを溶解させた10mLの0.1MKPB(pH7.5)を加えて、室温で2時間攪拌した。ピペットで水分を除去した後に、窒素を吹きかけて湿気がなくなるまで乾燥させ、酵素固定化樹脂を調製した。除去した水分中のタンパク含量を測定したところ、添加したタンパクの38%が樹脂に吸着していた。
当該固定化樹脂をΦ5mm×50mmのガラス管に詰めて固定化樹脂カラムを作製した。
ダイヤイオンHP2MG(三菱ケミカル社製)7.5gを7.5mLの0.1MKPB(リン酸カリウム緩衝液)(pH7.5)で2回洗浄した後に、TPMの凍結乾燥菌体250mgとPLP(ピリドキサルリン酸)20mgを溶解させた10mLの0.1MKPB(pH7.5)を加えて、室温で2時間攪拌した。ピペットで水分を除去した後に、窒素を吹きかけて湿気がなくなるまで乾燥させ、酵素固定化樹脂を調製した。除去した水分中のタンパク含量を測定したところ、添加したタンパクの38%が樹脂に吸着していた。
当該固定化樹脂をΦ5mm×50mmのガラス管に詰めて固定化樹脂カラムを作製した。
A液として、100mMの(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehydeのMTBE溶液、B液として、水飽和させたMTBE溶液を用いて調製した100mM(S)−α−phenetylamine溶液を調製した。シリンジポンプ(YSP−101、YMC社製)を用いて、A液、B液、それぞれを0.025mL/minで送液し、T字型の混合部で混合させ、30℃に保温された固定化樹脂カラムに通液した。溶出された反応液を実施例26と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析し、(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamineと(S)−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)acetaldehydeの比から変換率を算出した。その結果を表7及び図1に示す。送液開始40分から180分にかけて安定して目的化合物への変換活性が持続した。
なお、酵素フローリアクターを用いたラメルテオン製造の実用化の際には、カラム長の延長や、通液回数の増加、流速の低減等の方法により変換率をより高くして使用することも可能である。
なお、酵素フローリアクターを用いたラメルテオン製造の実用化の際には、カラム長の延長や、通液回数の増加、流速の低減等の方法により変換率をより高くして使用することも可能である。
(実施例32) ラメルテオン((S)−N−[2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethyl]propionamide)の製造
(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamine(純度:93.3重量%、60.0mg、0.28mmol)、アセトニトリル(5mL)、トリエチルアミン(56mg、0.56mmol)、塩化プロピオニル(31mg、0.34mmol)からなる溶液を25℃、1時間攪拌した。水(5mL)を加えて均一溶液とした後、減圧下にアセトニトリルを留去した。残査に酢酸エチル(15mL)を加えて抽出し、有機層を更に水(5mL)で2回洗浄、減圧濃縮することにより白色固体を得た(75.9mg、純度:89.3重量%、反応収率:95%、光学純度:83.5%ee)。
前記白色固体(60mg、0.23mmol)に酢酸エチル(1mL)を加えて溶解し、ヘキサン(5mL)を加えて晶析を行った。5℃に冷却して30分攪拌後、結晶を減圧濾別し、ヘキサン(5mL)で洗浄、真空乾燥することにより標題化合物を白色結晶として得た(38.1mg、純度:97.3重量%、晶析回収率:97%、光学純度:97.9%ee)。
1H NMR(CDCl3):δ6.95(1H,d)、6.61(1H,d)、5.4(1H,brs)、4.59(1H,dd)、4.55(1H,dd)、3.36(2H,m)、3.24−3.10(3H,m)、2.89(1H,dd)、2.77(1H,dd)、2.20(1H,m)、2.17(2H,q)、2.03(1H,m)、1.85(1H,m)、1.82(1H,m)、1.14(3H,t)
(S)−2−(1,6,7,8−tetrahydro−2H−indeno[5,4−b]furan−8−yl)ethanamine(純度:93.3重量%、60.0mg、0.28mmol)、アセトニトリル(5mL)、トリエチルアミン(56mg、0.56mmol)、塩化プロピオニル(31mg、0.34mmol)からなる溶液を25℃、1時間攪拌した。水(5mL)を加えて均一溶液とした後、減圧下にアセトニトリルを留去した。残査に酢酸エチル(15mL)を加えて抽出し、有機層を更に水(5mL)で2回洗浄、減圧濃縮することにより白色固体を得た(75.9mg、純度:89.3重量%、反応収率:95%、光学純度:83.5%ee)。
前記白色固体(60mg、0.23mmol)に酢酸エチル(1mL)を加えて溶解し、ヘキサン(5mL)を加えて晶析を行った。5℃に冷却して30分攪拌後、結晶を減圧濾別し、ヘキサン(5mL)で洗浄、真空乾燥することにより標題化合物を白色結晶として得た(38.1mg、純度:97.3重量%、晶析回収率:97%、光学純度:97.9%ee)。
1H NMR(CDCl3):δ6.95(1H,d)、6.61(1H,d)、5.4(1H,brs)、4.59(1H,dd)、4.55(1H,dd)、3.36(2H,m)、3.24−3.10(3H,m)、2.89(1H,dd)、2.77(1H,dd)、2.20(1H,m)、2.17(2H,q)、2.03(1H,m)、1.85(1H,m)、1.82(1H,m)、1.14(3H,t)
(光学純度分析条件)
カラム:ダイセルキラルセルOD−H 4.6×250mm
溶離液:エタノール/ヘキサン=1/9(v/v)
カラム温度:30℃
流速:1.0mL/min.
検出器:UV210nm
保持時間:S体=12.3分、R体=16.0分
カラム:ダイセルキラルセルOD−H 4.6×250mm
溶離液:エタノール/ヘキサン=1/9(v/v)
カラム温度:30℃
流速:1.0mL/min.
検出器:UV210nm
保持時間:S体=12.3分、R体=16.0分
Claims (14)
- 前記光学活性ピロリジン塩誘導体(5)において、Rがジフェニルメチル基、(トリメチルシリルオキシ)ジフェニルメチル基、又は(ヒドロキシ)ジフェニルメチル基であり、絶対立体配置がR体であり、A-がトリクロロアセテート、又はトリフルオロアセテートである、請求項2に記載のラメルテオンの製造法。
- 前記不斉還元がエノンリダクターゼを用いて行うことを特徴とする、請求項1に記載のラメルテオンの製造法。
- 前記エノンリダクターゼがOYE2、NemA、YersER、NCR−Rである、請求項4に記載のラメルテオンの製造法。
- 前記光学活性アミン(3)に変換する方法が、アミノ基供与体の存在下、トランスアミナーゼを用いて行うことを特徴とする、請求項6に記載のラメルテオンの製造法。
- 前記アミノ基供与体がイソプロピルアミンであり、前記トランスアミナーゼがω−トランスアミナーゼである、請求項7に記載のラメルテオンの製造法。
- 前記アミノ基供与体がα−フェネチルアミンであり、前記トランスアミナーゼがω−トランスアミナーゼである、請求項7に記載のラメルテオンの製造法。
- 前記アミノ基供与体がα−アミノ酸であり、前記トランスアミナーゼがω−トランスアミナーゼである、請求項7に記載のラメルテオンの製造法。
- 前記トランスアミナーゼを有機溶媒中で反応させる、請求項7〜10のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
- 樹脂に固定化された前記トランスアミナーゼを有機溶媒中で反応させる、請求項7〜11のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
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