JPWO2018163947A1 - Protein crystallization using porous protein crystals - Google Patents
Protein crystallization using porous protein crystals Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2018163947A1 JPWO2018163947A1 JP2019504514A JP2019504514A JPWO2018163947A1 JP WO2018163947 A1 JPWO2018163947 A1 JP WO2018163947A1 JP 2019504514 A JP2019504514 A JP 2019504514A JP 2019504514 A JP2019504514 A JP 2019504514A JP WO2018163947 A1 JPWO2018163947 A1 JP WO2018163947A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- crystal
- fusion protein
- crystallization
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 118
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 116
- 239000013078 crystal Substances 0.000 title claims abstract description 77
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 title description 34
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 title description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 53
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 238000003696 structure analysis method Methods 0.000 claims description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 97
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 15
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 14
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 6
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 101710158030 Endonuclease Proteins 0.000 description 5
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011549 crystallization solution Substances 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-2,4-diol Chemical compound CC(O)CC(C)(C)O SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000005469 synchrotron radiation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220539090 40S ribosomal protein S15_C55S_mutation Human genes 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- BJSKBZUMYQBSOQ-UHFFFAOYSA-N Jeffamine M-600 Chemical compound COCCOCC(C)OCC(C)OCC(C)OCC(C)OCC(C)OCC(C)OCC(C)OCC(C)OCC(C)N BJSKBZUMYQBSOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012835 hanging drop method Methods 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- INHCSSUBVCNVSK-UHFFFAOYSA-L lithium sulfate Inorganic materials [Li+].[Li+].[O-]S([O-])(=O)=O INHCSSUBVCNVSK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 102220321788 rs1554654142 Human genes 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- RBTVSNLYYIMMKS-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 3-aminoazetidine-1-carboxylate;hydrochloride Chemical compound Cl.CC(C)(C)OC(=O)N1CC(N)C1 RBTVSNLYYIMMKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- -1 transformants Proteins 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
開示されているのは、R1-EN、及び該R1-ENのC末端若しくはN末端に融合したタンパク質又はループ中に該R1-ENを有するタンパク質を含有する融合タンパク質、該融合タンパク質を結晶化させる工程を含むタンパク質結晶の製造方法、該融合タンパク質を含むタンパク質結晶、該方法により得られるタンパク質結晶又は該タンパク質結晶を用いてX線結晶構造解析を行う工程を含むタンパク質の構造解析方法、該融合タンパク質をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター、該核酸が導入された形質転換体、並びに該融合タンパク質を使用するハニカム構造をした結晶格子の空隙に任意のタンパク質を配置させる方法である。Disclosed are fusion proteins comprising R1-EN and a protein fused to the C-terminus or N-terminus of the R1-EN or having the R1-EN in a loop, crystallizing the fusion protein A protein crystal comprising the fusion protein, a protein crystal obtained by the method, or a protein structural analysis method comprising a step of performing X-ray crystal structure analysis using the protein crystal, the fusion protein , An expression vector containing the nucleic acid, a transformant into which the nucleic acid has been introduced, and a method of disposing an arbitrary protein in the space of a honeycomb-structured crystal lattice using the fusion protein.
Description
本発明は、任意のタンパク質の結晶を効率的に製造できる融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター、及び該核酸が導入された形質転換体に関する。また、本発明は、タンパク質結晶、タンパク質結晶の製造方法、タンパク質の構造解析方法、及び結晶格子の空隙に任意のタンパク質を配置させる方法に関する。 The present invention relates to a fusion protein capable of efficiently producing crystals of any protein, a nucleic acid encoding the fusion protein, an expression vector containing the nucleic acid, and a transformant into which the nucleic acid has been introduced. The present invention also relates to a protein crystal, a method for producing a protein crystal, a method for analyzing the structure of a protein, and a method for arranging an arbitrary protein in a void of a crystal lattice.
タンパク質の立体構造は多くの生化学的理解を与え、疾病の発症機構解明、有効薬剤設計等に必須である。タンパク質の立体構造を解析する方法としては、X線結晶構造解析が広く用いられているが、タンパク質を結晶化するためには多数の結晶化条件をスクリーニングする必要がある上、必ずしも結晶が得られるとは限らないことがネックとなっている。このように、タンパク質の結晶構造解析は、結晶化の壁を越えなければならないという問題点を有する。結晶化を容易にする研究は今までにも多く行われてきたが、有効な方法は未だ存在していない。 The three-dimensional structure of a protein provides a great deal of biochemical understanding, and is essential for elucidating the pathogenesis of disease and designing effective drugs. X-ray crystal structure analysis is widely used as a method for analyzing the three-dimensional structure of a protein.However, in order to crystallize a protein, it is necessary to screen a large number of crystallization conditions and it is not always possible to obtain crystals This is not always the case. As described above, the crystal structure analysis of a protein has a problem that it has to cross the crystallization wall. Although much research has been done to facilitate crystallization, no effective method has yet been found.
結晶構造解析ではタンパク質の結晶化が不可欠であるが、実際はタンパク質分子が規則的に整列している状態であればよい。そこで、予め三次元格子を構築して、それに特定の分子を結合させるというアプローチが考えられる。このような方法として、非特許文献1では「結晶スポンジ」を開発し、これに低分子有機化合物を結合させて構造解析を行ったことが報告されている。しかしながら、この方法は、タンパク質では分子が大きいため適用することはできない。
In crystal structure analysis, protein crystallization is indispensable, but it is sufficient that protein molecules are in a state of being regularly arranged. Therefore, an approach of constructing a three-dimensional lattice in advance and binding specific molecules to it is conceivable. As such a method, Non-Patent
また、非特許文献2ではDNA配列を設計して三次元的に組み上げる方法が報告されている。しかしながら、この方法は、特異的配列に結合するDNA結合タンパク質に限られるという問題点がある。 Non-Patent Document 2 reports a method of designing a DNA sequence and assembling it three-dimensionally. However, this method has a problem that it is limited to DNA binding proteins that bind to a specific sequence.
その他の結晶化に利用するための高多孔性素材としては、低分子化合物による高多孔性素材、人工設計タンパク質による高多孔性素材などが報告されているが、大きなタンパク質には適用できない、分解能が低い、デザインが困難などの問題がある。 Other highly porous materials to be used for crystallization include highly porous materials made of low molecular weight compounds and highly porous materials made of artificially designed proteins. There are problems such as low and difficult design.
高多孔性素材以外の結晶化を促進する技術としては、特許文献1においてタンパク質の二量体化を促進するポリペプチドを目的のタンパク質と融合させることで、目的のタンパク質の結晶化が効果的に促進されることが報告されている。しかしながら、この方法では、結晶化条件について決定する必要がある。
As a technique for promoting crystallization of materials other than high-porosity materials,
R1はカイコ(Bombyx mori)で見出されたレトロトランスポゾンの1つであり、2つのオープンリーディングフレームの内のORF2pは、逆転写酵素(RT)及びエンドヌクレアーゼ(EN)をコードしている。そして、本発明者らは、このR1のENドメイン(R1-EN)について分解能2.0Åの結晶構造(空間群P321, 単位胞a=b=141.3Å, c=37.5Å)を報告している(非特許文献3)。 R1 is one of the retrotransposons found in the silkworm, Bombyx mori, and ORF2p in the two open reading frames encodes reverse transcriptase (RT) and endonuclease (EN). Then, the present inventors have reported a crystal structure with a resolution of 2.0 ° (space group P321, unit cell a = b = 141.3 °, c = 37.5 °) for the EN domain of R1 (R1-EN) ( Non-patent document 3).
本発明は、任意のタンパク質の結晶を効率的に製造できる融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター、及び該核酸が導入された形質転換体を提供することを目的とする。また、本発明は、上記融合タンパク質を含むタンパク質結晶、上記融合タンパク質を用いたタンパク質結晶の製造方法、該タンパク質結晶を用いたタンパク質の構造解析方法、及び上記融合タンパク質を使用する結晶格子の空隙に任意のタンパク質を配置させる方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a fusion protein capable of efficiently producing crystals of any protein, a nucleic acid encoding the fusion protein, an expression vector containing the nucleic acid, and a transformant into which the nucleic acid has been introduced. I do. The present invention also provides a protein crystal containing the fusion protein, a method for producing a protein crystal using the fusion protein, a method for analyzing the structure of a protein using the protein crystal, and a crystal lattice using the fusion protein. An object is to provide a method for arranging an arbitrary protein.
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、R1-ENの結晶は溶媒領域が多く(69.7%)、中空のハニカム構造をしており、N末端及びC末端は共に溶媒領域に露出しているので、末端に融合させたタンパク質は溶媒領域に配置させることができること、このような融合タンパク質はR1-ENと同一の精製条件及び結晶化条件を適用できるという知見を得た。 The present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, the R1-EN crystal has a large number of solvent regions (69.7%), has a hollow honeycomb structure, and both the N-terminus and the C-terminus. Since it is exposed to the solvent region, it has been found that proteins fused to the ends can be placed in the solvent region, and that such fusion proteins can be applied to the same purification and crystallization conditions as R1-EN. Was.
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の融合タンパク質、核酸、発現ベクター、形質転換体、タンパク質結晶、タンパク質結晶の製造方法、タンパク質の構造解析方法等を提供するものである。 The present invention has been completed by further studies based on these findings, and includes the following fusion proteins, nucleic acids, expression vectors, transformants, protein crystals, methods for producing protein crystals, methods for analyzing the structure of proteins, and the like. Is provided.
項1.R1-EN、及び該R1-ENのC末端若しくはN末端に融合したタンパク質又はループ中に該R1-ENを有するタンパク質を含有する融合タンパク質。
項2.項1に記載の融合タンパク質を結晶化させる工程を含む、
タンパク質結晶の製造方法。
項3.項1に記載の融合タンパク質を含むタンパク質結晶。
項4.項2に記載の方法により得られるタンパク質結晶、又は項3に記載のタンパク質結晶を用いてX線結晶構造解析を行う工程を含む、
タンパク質の構造解析方法。
項5.項1に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
項6.項5に記載の核酸を含む発現ベクター。
項7.項5に記載の核酸が導入された形質転換体。
項8.項1に記載の融合タンパク質を使用するハニカム構造をした結晶格子の空隙に任意のタンパク質を配置させる方法。
Item 2. A step of crystallizing the fusion protein according to
A method for producing a protein crystal.
Item 3. Item 7. A protein crystal comprising the fusion protein according to
Item 4. Item 2, comprising a step of performing X-ray crystal structure analysis using the protein crystal obtained by the method according to Item 2 or the protein crystal according to Item 3.
Protein structure analysis method.
Item 5. Item 7. A nucleic acid encoding the fusion protein according to
Item 6. Item 6. An expression vector comprising the nucleic acid according to Item 5.
Item 7. A transformant into which the nucleic acid according to item 5 has been introduced.
Item 8. Item 10. A method for disposing an arbitrary protein in a space of a crystal lattice having a honeycomb structure using the fusion protein according to
本発明のR1-ENに任意のタンパク質を融合させた融合タンパク質は、R1-ENと同じ精製条件及び結晶化条件により精製及び結晶化が可能であるので、結晶化条件のスクリーニングの必要が無く、任意のタンパク質の結晶化を効率的に行うことが可能である。また、本発明では、R1-EN結晶の溶媒領域中に任意のタンパク質を配置させることができ、この溶媒用領域の内径はおよそ110Åであるので、分子量の大きなタンパク質の結晶化も可能である。 The fusion protein obtained by fusing any protein to R1-EN of the present invention can be purified and crystallized under the same purification conditions and crystallization conditions as R1-EN, so there is no need to screen for crystallization conditions, It is possible to efficiently crystallize any protein. Further, in the present invention, an arbitrary protein can be arranged in the solvent region of the R1-EN crystal, and the inside diameter of the solvent region is approximately 110 °, so that a protein having a large molecular weight can be crystallized.
結晶化ができないために構造が不明の重要なタンパク質は未だ数多くあるが、本発明によって結晶化の問題が解消されることにより、構造が未知であったタンパク質の構造解析が促進されることが期待される。 Although there are still many important proteins whose structures are unknown because they cannot be crystallized, the present invention is expected to solve the problem of crystallization and promote the structural analysis of proteins whose structures are unknown. Is done.
以下、本発明について詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
なお、本明細書において「含む、含有する(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。 In this specification, the term “comprise” includes the meaning of “essentially consist of” and the meaning of “consist of”.
本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、2本鎖DNA、1本鎖DNA(センス鎖又はアンチセンス鎖)、及びそれらの断片が含まれる。また、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。 In the present invention, the term “gene” includes double-stranded DNA, single-stranded DNA (sense strand or antisense strand), and fragments thereof, unless otherwise specified. In the present invention, the term “gene” means a regulatory region, a coding region, an exon, and an intron without distinction unless otherwise specified.
また、本発明において、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は同義であって、これらはDNA及びRNAの両方を含み、2本鎖であっても1本鎖であってもよい。 In the present invention, “nucleic acid”, “nucleotide” and “polynucleotide” are synonymous, and include both DNA and RNA, and may be double-stranded or single-stranded.
本発明の融合タンパク質は、(1)R1-EN、及び(2)該R1-ENのC末端若しくはN末端に融合したタンパク質又はループ中に該R1-ENを有するタンパク質(以下、本明細書において「タンパク質A」と称することもある)を含有することを特徴とする。 The fusion protein of the present invention comprises (1) R1-EN, and (2) a protein fused to the C-terminus or N-terminus of the R1-EN or a protein having the R1-EN in a loop (hereinafter, referred to herein as the present specification). (Sometimes referred to as "protein A").
本発明における「R1-EN」は、R1のオープンリーディングフレームの1つであるORF2pにコードされるENドメインを意味する。ENドメインはORF2pにコードされるアミノ酸配列の1-240番目の領域である。本発明のように結晶化を目的とする場合は、R1-ENとしては結晶化した際にハニカム構造の結晶格子が得られる部分のアミノ酸配列を有していればよく、そのようなアミノ酸配列としてはORF2pにコードされるアミノ酸配列の5-223番目の配列が挙げられる。R1はカイコ(Bombyx mori)で見出されたレトロトランスポゾンの1つである。 “R1-EN” in the present invention means an EN domain encoded by ORF2p which is one of R1 open reading frames. The EN domain is a region at the 1-240th position in the amino acid sequence encoded by ORF2p. When crystallization is intended as in the present invention, R1-EN may have an amino acid sequence of a portion where a crystal lattice of a honeycomb structure is obtained when crystallized, and such an amino acid sequence may be used. Represents the sequence at position 5-223 of the amino acid sequence encoded by ORF2p. R1 is one of the retrotransposons found in silkworms (Bombyx mori).
R1のORF2pのアミノ酸配列については、UniProt Accession No. Q7M4J4 (配列番号1)としてUniProtのweb siteに登録されている。また、R1-ENの立体構造がPDB ID: 2EI9としてPDBに登録されている。 The amino acid sequence of ORF2p of R1 is registered on the UniProt web site as UniProt Accession No. Q7M4J4 (SEQ ID NO: 1). Further, the three-dimensional structure of R1-EN is registered in the PDB as PDB ID: 2EI9.
本発明における「R1-EN」には、前述するようなデータベースに登録されているアミノ酸配列を有するもの以外であっても、その改変体も含まれ、改変体としては上記アミノ酸配列からなるタンパク質と同等のハニカム構造の結晶格子を作るタンパク質が望ましい。また、改変体としては、凝集を防ぐ目的で2つのシステイン(Cys55、Cys72)を他のアミノ酸に置換した物、DNA切断活性を無くす目的で活性残基(Glu44)を他の残基に置換した物などが挙げられる。 The `` R1-EN '' in the present invention includes, besides those having an amino acid sequence registered in the database as described above, also includes variants thereof, and the variants include proteins having the above amino acid sequences. A protein that forms a crystal lattice with an equivalent honeycomb structure is desirable. As a variant, two cysteines (Cys55, Cys72) were substituted with other amino acids for the purpose of preventing aggregation, and the active residue (Glu44) was substituted with another residue for the purpose of eliminating DNA cleavage activity. Things.
改変体としては、前述するようなデータベースに登録されているアミノ酸配列において、1又は2個以上、例えば1〜50個、1〜25個、1〜12個、1〜9個、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質などが挙げられる。特定のアミノ酸配列において、1個若しくは2個以上のアミノ酸を置換、欠失、挿入及び/又は付加させる技術は公知である。 As a variant, in the amino acid sequence registered in the database as described above, one or more, for example, 1 to 50, 1 to 25, 1 to 12, 1 to 9, 1 to 5 A protein comprising an amino acid sequence in which the amino acid has been substituted, deleted, inserted and / or added. Techniques for substituting, deleting, inserting and / or adding one or more amino acids in a specific amino acid sequence are known.
アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。アミノ酸配列の同一性(%)は、当該分野で慣用のプログラム(例えば、BLAST、FASTA等)を初期設定で用いて決定することができる。 Amino acid sequence identity can be calculated using analysis tools that are commercially available or available through a telecommunications line (the Internet). The amino acid sequence identity (%) can be determined using a program commonly used in the art (eg, BLAST, FASTA, etc.) by default.
本発明における「タンパク質A」としては、特に制限されず、天然のタンパク質、人工のタンパク質などが挙げられ、また、天然又は人工のペプチドも包含される。「タンパク質A」としては、立体構造が未知であるタンパク質又はペプチド、及び結晶化が可能ではなかったタンパク質又はペプチドが特に好適である。タンパク質Aの分子質量としては、R1-ENの結晶の溶媒領域に配置可能である限り特に制限されず、好ましくは5 kDa以上、より好ましくは5〜50 kDa、更に好ましくは5〜25 kDaである。また、タンパク質Aの大きさとしては、R1-ENの結晶の溶媒領域に配置可能である限り特に制限されず、好ましくは10〜60Å、より好ましくは10〜40Åである。 The “protein A” in the present invention is not particularly limited, and includes natural proteins, artificial proteins, and the like, and also includes natural or artificial peptides. As “Protein A”, a protein or peptide whose tertiary structure is unknown and a protein or peptide whose crystallization has not been possible are particularly suitable. The molecular mass of protein A is not particularly limited as long as it can be arranged in the solvent region of the R1-EN crystal, and is preferably 5 kDa or more, more preferably 5 to 50 kDa, and still more preferably 5 to 25 kDa. . The size of protein A is not particularly limited as long as it can be arranged in the solvent region of the R1-EN crystal, and is preferably 10 to 60 °, more preferably 10 to 40 °.
R1-ENの結晶は、図1に示すような中空のハニカム構造であって(ハニカムの内径はおよそ110Å)、空隙がc軸方向に続いており、N末端及びC末端は共に溶媒領域に露出しているので、N末端及びC末端のいずれに融合させてもタンパク質Aを溶媒領域に配置させることができる。また、R1-ENの結晶ではN末端とC末端が隣接しているので、タンパク質Aの外側に突出しているループ中に別のタンパク質を融合させてもタンパク質Aの構造に変化が生じない場合には、R1-ENの配列をタンパク質Aのループ中に挿入することでもR1-ENの結晶の溶媒領域にタンパク質Aを配置させることができる。 The R1-EN crystal has a hollow honeycomb structure as shown in Fig. 1 (honeycomb inner diameter is about 110 mm), voids continue in the c-axis direction, and both N-terminal and C-terminal are exposed to the solvent region. Therefore, protein A can be placed in the solvent region regardless of whether the protein is fused to the N-terminus or the C-terminus. In addition, since the N-terminus and C-terminus are adjacent to each other in the R1-EN crystal, when the structure of protein A does not change even if another protein is fused in the loop protruding outside of protein A, Can also place protein A in the solvent region of the R1-EN crystal by inserting the R1-EN sequence into the loop of protein A.
本発明における「ハニカム構造」とは、図1に示すような六角柱を隙間無く敷き詰めた構造を意味し、六角柱は正六角柱であることが望ましい。 The “honeycomb structure” in the present invention means a structure in which hexagonal columns as shown in FIG. 1 are spread without gaps, and the hexagonal columns are desirably regular hexagonal columns.
本発明の融合タンパク質において、R1-EN及びタンパク質Aは直接結合していてもよく、又は間に任意のアミノ酸配列が存在して結合していてもよい。本発明の融合タンパク質には、これら2種のタンパク質以外にも、他のタンパク質及びペプチドが結合していてもよい。 In the fusion protein of the present invention, R1-EN and protein A may be directly bound, or may be bound by any amino acid sequence present therebetween. In addition to these two proteins, other proteins and peptides may be bound to the fusion protein of the present invention.
本発明の融合タンパク質は、後述するような該融合タンパク質をコードする核酸を導入した形質転換体を培養することなどにより生産することができる。当該形質転換体の培養は、融合タンパク質の発現が可能となる条件下で宿主細胞に適切な栄養培地中で行うことで、形質転換体に融合タンパク質を細胞内又は培地中に生産させることができる。 The fusion protein of the present invention can be produced, for example, by culturing a transformant into which a nucleic acid encoding the fusion protein has been introduced as described below. By culturing the transformant in a nutrient medium suitable for host cells under conditions that allow expression of the fusion protein, the transformant can cause the fusion protein to be produced intracellularly or in the medium. .
生産したポリペプチドの精製は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、メンブレンフィルター、限外濾過、精密濾過、硫酸アンモニウム塩析法、蒸留処理、晶析などにより行うことができる。また、精製は、これらを単独で又は2種以上を任意の順序で適宜組み合わせて行うことができる。 Purification of the produced polypeptide includes affinity chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydroxyapatite column chromatography, hydrophobic interaction chromatography, membrane filter, ultrafiltration, microfiltration, ammonium sulfate salting-out method, It can be performed by distillation treatment, crystallization, or the like. Further, purification can be performed alone or in an appropriate combination of two or more kinds in any order.
本発明の融合タンパク質は、R1-ENと同じ又は同様の精製条件(例えば、非特許文献3参照)で精製可能であるので、精製条件について検討を行う必要が無く効率的な精製が可能なため、R1-ENと同じ又は同様の精製条件を適用することが望ましい。 Since the fusion protein of the present invention can be purified under the same or similar purification conditions as R1-EN (for example, see Non-Patent Document 3), it is possible to purify efficiently without having to study the purification conditions. , R1-EN, it is desirable to apply the same or similar purification conditions.
本発明の核酸は、上記融合タンパク質をコードすることを特徴とする。当該核酸は、融合タンパク質を構成する各タンパク質をコードする核酸を用いて、生化学的切断/再結合などの常法で作製することができる。当該核酸は、上記融合タンパク質の作製等に使用することができる。R1-EN及びタンパク質Aをコードする核酸は、市販品を入手することもできるし、GenBank等の公共のデータベースに登録されている公知の塩基配列の情報を利用し、cDNAライブラリーを鋳型としたPCR法等の常法により製造することも可能である。また、当該核酸を導入する宿主細胞で使用頻繁の高いコドンに変更することにより発現効率を上げることができる。 The nucleic acid of the present invention encodes the above-mentioned fusion protein. The nucleic acid can be prepared by a conventional method such as biochemical cleavage / recombination using a nucleic acid encoding each protein constituting the fusion protein. The nucleic acid can be used for producing the fusion protein and the like. The nucleic acid encoding R1-EN and protein A can be obtained as a commercial product, or using information of a known base sequence registered in a public database such as GenBank, using a cDNA library as a template. It can also be produced by a conventional method such as a PCR method. In addition, the expression efficiency can be increased by changing to codons frequently used in the host cell into which the nucleic acid is introduced.
本発明の発現ベクターは、上記核酸を含むことを特徴とする。当該発現ベクターとしては、特に制限されず、公知の発現ベクターを広く使用することができる。上記核酸を導入する宿主細胞の種類等を考慮し、適切な発現ベクターを適宜選択し得る。発現ベクターは、上記核酸以外にも、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点などを含有し得る。発現ベクターは、自立的に複製するベクター、及び宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製される物のいずれも使用することができる。上記核酸は、公知の方法により発現ベクターに挿入することができる。 The expression vector of the present invention is characterized by containing the above nucleic acid. The expression vector is not particularly limited, and a known expression vector can be widely used. An appropriate expression vector can be appropriately selected in consideration of the type of the host cell into which the nucleic acid is introduced, and the like. The expression vector may contain a promoter, an enhancer, a terminator, a polyadenylation signal, a selection marker, an origin of replication, and the like, in addition to the nucleic acid. As the expression vector, any of an autonomously replicating vector and a vector that is integrated into the genome of the host cell when introduced into the host cell and replicated together with the integrated chromosome can be used. The nucleic acid can be inserted into an expression vector by a known method.
本発明の発現ベクターとしては、上記核酸の一方又は両方の末端にタグをコードする核酸が付加される物も使用することができる。当該タグとしては、Flag、Myc、HA(ヘマグルチニン)、GST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)、ヒスチジン等が挙げられる。このように、融合タンパク質がタグ化されることで、当該タグを利用した精製を行うことが可能となる。また、融合タンパク質とタグの間にプロテアーゼの認識配列を付加させておくことで、精製後にタグを切断することが可能となる。 As the expression vector of the present invention, a vector in which a nucleic acid encoding a tag is added to one or both ends of the above nucleic acid can also be used. The tag includes Flag, Myc, HA (hemagglutinin), GST (glutathione S-transferase), histidine and the like. In this way, by tagging the fusion protein, purification using the tag can be performed. In addition, by adding a protease recognition sequence between the fusion protein and the tag, the tag can be cleaved after purification.
発現ベクターの構築法、及び当該発現ベクターの宿主細胞への導入法は周知であり、例えば、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等の記載を参考にして実施することができる。 Methods for constructing an expression vector and for introducing the expression vector into a host cell are well-known. Can be implemented.
本発明の形質転換体は、上記核酸が導入されていることを特徴とする。核酸の導入は上記のように当該核酸を含む発現ベクターを利用することにより行うことができる。宿主細胞への発現ベクターの導入は、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、酢酸リチウム法等の周知の方法により行うことができる。上記核酸を導入する宿主としては、例えば、細菌(例えば、大腸菌(Escherichia coli)、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属)、真菌(例えば、酵母(サッカロマイセス(Saccharomyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属など)、アスペルギルス(Aspergillus)属)、昆虫細胞(例えば、ドロソフィラ(Drosophila)S2、スポドプテラ(Spodoptera)SF)、哺乳類動物細胞、植物細胞などが挙げられる。 The transformant of the present invention is characterized in that the above nucleic acid has been introduced. Introduction of a nucleic acid can be performed by using an expression vector containing the nucleic acid as described above. Introduction of an expression vector into a host cell can be performed by a known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method, a liposome method, a microinjection method, and a lithium acetate method. As a host for introducing the nucleic acid, for example, bacteria (e.g., Escherichia coli, Streptomyces (Streptomyces), Rhodococcus (Rhodococcus), Streptococcus (Streptococcus), Staphylococcus (Staphylococcus)), Fungi (e.g., yeasts (Saccharomyces), Schizosaccharomyces, etc.), Aspergillus (Aspergillus), insect cells (e.g., Drosophila S2, Spodoptera SF), mammalian cells And plant cells.
本発明のタンパク質結晶の製造方法は、上記融合タンパク質を結晶化させる工程を含むことを特徴とする。 The method for producing a protein crystal of the present invention includes a step of crystallizing the fusion protein.
結晶化工程に用いる溶液(以下、「結晶化溶液」と称する)は、上記融合タンパク質に加えて、必要により沈殿剤、緩衝剤、R1-EN等を含む。結晶化溶液中の融合タンパク質の濃度は、特に制限されず、通常、1〜10 mg/mL程度である。結晶化溶液にR1-ENを混ぜておくことで、後述するように、より大きなタンパク質Aについて結晶化を行える。 The solution used in the crystallization step (hereinafter, referred to as “crystallization solution”) contains a precipitant, a buffer, R1-EN, and the like, if necessary, in addition to the fusion protein. The concentration of the fusion protein in the crystallization solution is not particularly limited, and is usually about 1 to 10 mg / mL. By mixing R1-EN with the crystallization solution, larger proteins A can be crystallized as described later.
沈殿剤としては、例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム、クエン酸ナトリウムなどの塩、ポリエチレングリコール、Jeffamine (商標) M-600などの高分子化合物、2-メチル-2,4-ペンタンジオール、メタノール、2-プロパノールなどのアルコール類が挙げられる。これらは、単独で又は2種以上を組み合わせて使用できる。沈殿剤の濃度としては、通常、塩が0.5〜3M、高分子化合物が0.1〜2%(v/v)、アルコール類が2〜20%(v/v)程度である。 As the precipitant, for example, salts such as lithium chloride, sodium chloride, magnesium chloride, potassium chloride, sodium acetate, ammonium acetate, ammonium sulfate, lithium sulfate, magnesium sulfate, sodium citrate, polyethylene glycol, Jeffamine (trademark) M-600 And alcohols such as 2-methyl-2,4-pentanediol, methanol and 2-propanol. These can be used alone or in combination of two or more. The concentration of the precipitant is usually about 0.5 to 3 M for a salt, about 0.1 to 2% (v / v) for a polymer compound, and about 2 to 20% (v / v) for alcohols.
緩衝剤としては、例えば、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、HEPES緩衝剤、MES緩衝剤などが挙げられる。これらは、単独で又は2種以上を組み合わせて使用できる。 Examples of the buffer include acetate buffer, citrate buffer, borate buffer, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, HEPES buffer, MES buffer and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
結晶化溶液の溶媒としては、水、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられ、好ましくは水である。 Examples of the solvent for the crystallization solution include water, methanol, ethanol, isopropanol, and the like, with water being preferred.
結晶化溶液には、種結晶が含まれていることが好ましく、種結晶が存在することで結晶化を促進させることが可能となる。 The crystallization solution preferably contains a seed crystal, and the presence of the seed crystal can promote crystallization.
タンパク質を結晶化させる方法としては、公知の結晶化方法を利用することができ、例えば、蒸気拡散法(ハンギング・ドロップ法、シッティング・ドロップ法等)、バッチ法、液液拡散法、透析法、シーディング法等が挙げられる。 As a method of crystallizing a protein, a known crystallization method can be used, for example, a vapor diffusion method (a hanging drop method, a sitting drop method, etc.), a batch method, a liquid-liquid diffusion method, a dialysis method, Seeding method and the like can be mentioned.
結晶化の温度としては、結晶化が可能な限り特に制限されず、通常、0〜20℃である。結晶化を行う時間としては、結晶が得られる限り特に制限されず、通常、20時間〜30日である。 The crystallization temperature is not particularly limited as long as crystallization is possible, and is usually 0 to 20 ° C. The time for crystallization is not particularly limited as long as crystals can be obtained, and is usually 20 hours to 30 days.
本発明のタンパク質結晶は、上記融合タンパク質を含むことを特徴とする。このようなタンパク質結晶は、例えば、上記の方法により製造することができる。 The protein crystal of the present invention is characterized by containing the fusion protein. Such a protein crystal can be produced, for example, by the method described above.
上記融合タンパク質は、R1-ENと同じ又は同様の結晶化条件により結晶化が可能であるので、R1-ENと同じ又は同様の結晶化条件(例えば、非特許文献3参照)を適用することが、結晶化条件のスクリーニングの必要が無く、効率的な結晶化が可能なため望ましい。 Since the fusion protein can be crystallized under the same or similar crystallization conditions as R1-EN, it is possible to apply the same or similar crystallization conditions as R1-EN (for example, see Non-Patent Document 3). This is desirable because there is no need to screen for crystallization conditions and efficient crystallization is possible.
本発明のタンパク質結晶は、結晶格子がハニカム構造をしており、空隙は内径約110Åの孔がc軸方向に続いているため(図1参照)、結晶格子の空隙に入れることが可能であれば、形状及び種類に制限無く任意のタンパク質(すなわち、タンパク質A)を配置させることができる。ハニカムの内径はおよそ110Åであるので、分子量の大きな任意のタンパク質も孔に入れることが可能である。また、上記融合タンパク質に(タンパク質を融合させていない)R1-ENを一定量混ぜて結晶化することで、より分子量の大きなタンパク質Aについても結晶化が可能となると考えられる。そのような結晶における上記融合タンパク質とR1-ENの分子の割合としては、例えば、3:1〜1:3が挙げられる。また、本発明のタンパク質結晶は溶媒領域が中空の管状になっているので、棒状のタンパク質Aであれば、ある程度の長さを有する物であっても結晶化できると考えられる。 In the protein crystal of the present invention, the crystal lattice has a honeycomb structure, and the pores have pores with an inner diameter of about 110 ° extending in the c-axis direction (see FIG. 1). For example, an arbitrary protein (ie, protein A) can be arranged without limitation in shape and type. Since the inner diameter of the honeycomb is approximately 110 °, any protein with a high molecular weight can be put into the pores. It is also considered that by mixing a certain amount of R1-EN (without fusion of the protein) with the above-mentioned fusion protein and crystallizing the same, protein A having a larger molecular weight can be crystallized. The ratio of the fusion protein to the R1-EN molecule in such a crystal is, for example, 3: 1 to 1: 3. Further, since the solvent region of the protein crystal of the present invention has a hollow tubular shape, it is considered that rod-shaped protein A can be crystallized even if it has a certain length.
後述する実施例では、タンパク質Aの一例としてユビキチンを使用しているが、ユビキチン以外の任意のタンパク質であっても、溶媒領域に配置させることができればユビキチンと同様に結晶化が可能であると考えられる。 In the examples described below, ubiquitin is used as an example of protein A, but it is considered that any protein other than ubiquitin can be crystallized in the same manner as ubiquitin if it can be arranged in the solvent region. Can be
本発明のタンパク質の構造解析方法は、上記方法により得られるタンパク質結晶、又は上記タンパク質結晶を用いてX線結晶構造解析を行う工程を含むことを特徴とする。 The method for analyzing the structure of a protein of the present invention is characterized by including a step of performing X-ray crystal structure analysis using the protein crystal obtained by the above method or the above protein crystal.
X線結晶構造解析は、公知の方法に従って実施可能である。X線結晶構造解析も、R1-ENの構造を基にすることで、システマチックに行うことができるので、効率的な解析が可能である。また、2.0Å以下の高分解能の回折データを得ることが可能である。以下、X線結晶構造解析の一般的な手順について概説する。 X-ray crystal structure analysis can be performed according to a known method. X-ray crystal structure analysis can also be performed systematically based on the structure of R1-EN, so that efficient analysis is possible. It is also possible to obtain high-resolution diffraction data of 2.0 ° or less. The general procedure of X-ray crystal structure analysis will be outlined below.
まず、大型放射光施設のビームライン、X線照射装置等を用いて、タンパク質結晶にX線の照射を行うことでX線回折データを得る。当該X線回折データに基づいて、融合タンパク質を構成する分子の電子密度図を求め、更に、この電子密度図に基づいて該分子のモデリングを行うことにより、融合タンパク質の三次元構造を構築する。 First, X-ray diffraction data is obtained by irradiating a protein crystal with X-rays using a beam line or an X-ray irradiator of a large synchrotron radiation facility. Based on the X-ray diffraction data, an electron density diagram of a molecule constituting the fusion protein is obtained, and the molecule is modeled based on the electron density diagram to construct a three-dimensional structure of the fusion protein.
電子密度図を導き出すためには、分子置換法による位相の決定が必要である。本発明においては、R1-ENの構造を基にして分子置換法で最適解を得ることができる。分子置換法にて良好な初期位相が得られれば、その電子密度図を描くことができる。このようにして得られた電子密度図に基づいて、公知のプログラムを用いることで、三次元グラフィックス上にてタンパク質Aのモデルの構築を行える。その次に、構築された分子のモデルは、より正確に近い構造へと近づけていくために、公知のプログラムを用いて精密化(リファインメント)を行う。 In order to derive an electron density diagram, it is necessary to determine a phase by a molecular replacement method. In the present invention, an optimal solution can be obtained by a molecular replacement method based on the structure of R1-EN. If a good initial phase is obtained by the molecular replacement method, the electron density diagram can be drawn. A model of protein A can be constructed on three-dimensional graphics by using a known program based on the electron density diagram thus obtained. Next, the constructed molecule model is refined (refined) using a known program in order to approach a more accurate structure.
X線の照射をタンパク質結晶を凍結させたまま行う場合は、タンパク質結晶の凍結を防ぐため、ポリエチレングリコール、グリセロール、スクロースなどのクライオプロテクタントを含む抗凍結溶液を用いてタンパク質結晶の抗凍結処理を行うことが望ましい。 If X-ray irradiation is performed while the protein crystals are frozen, use antifreeze solutions containing cryoprotectants such as polyethylene glycol, glycerol, and sucrose to prevent protein crystals from freezing. It is desirable to do.
本発明の融合タンパク質は、R1-ENと同じ精製条件及び結晶化条件により精製及び結晶化が可能であるので、結晶化条件のスクリーニングの必要が無く、任意のタンパク質の結晶化を効率的に行える。また、本発明の融合タンパク質を使用することで、R1-EN結晶の溶媒領域中に任意のタンパク質を配置させることができるので、分子量の大きなタンパク質の結晶化も可能である。 Since the fusion protein of the present invention can be purified and crystallized under the same purification conditions and crystallization conditions as R1-EN, there is no need to screen for crystallization conditions, and any protein can be efficiently crystallized. . Further, by using the fusion protein of the present invention, any protein can be arranged in the solvent region of the R1-EN crystal, so that a protein having a large molecular weight can be crystallized.
結晶化ができないために構造が不明の重要なタンパク質は未だ数多くあるが、本発明の融合タンパク質を利用することで結晶化の問題が解消されることにより、構造が未知であったタンパク質の構造解析も可能となる。 There are still many important proteins whose structures are unknown because they cannot be crystallized. However, by using the fusion protein of the present invention, the problem of crystallization is solved, and the structure of proteins whose structure is unknown is analyzed. Is also possible.
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。 Hereinafter, examples will be given to explain the present invention in more detail. However, the present invention is not limited to these Examples and the like.
<参考例>
R1-ENの発現方法(非特許文献3参照)
pET16b (Novagen)の制限酵素NdeI/XhoIの間にR1-ORF2pの5-243の配列と、直後に停止コドンを挿入し、発現用プラスミドベクターとした。<Reference example>
R1-EN expression method (see Non-Patent Document 3)
The 5-243 sequence of R1-ORF2p and a stop codon were inserted immediately after the restriction enzyme NdeI / XhoI of pET16b (Novagen) to obtain an expression plasmid vector.
このプラスミドを大腸菌BL21(DE3) pLysS株に形質転換し、アンピシリン(シグマアルドリッチ社)とクロラムフェニコール(和光純薬工業株式会社)を加えた800 mLのLB培地で対数増殖期(濁度(OD600)が0.8程度)まで37℃で激しく振盪培養した後、最終濃度0.2 mMのIPTGを加えて20℃でゆっくりと振盪しながらおよそ20時間放置する。その後、遠心分離機で大腸菌体を沈殿させて回収し、-80℃で冷凍保存する。This plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS strain, and a logarithmic growth phase (turbidity (turbidity ()) was added to 800 mL of an LB medium containing ampicillin (Sigma-Aldrich) and chloramphenicol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After vigorous shaking culture at 37 ° C. until the OD 600 reaches about 0.8), IPTG having a final concentration of 0.2 mM is added, and the mixture is left at 20 ° C. for about 20 hours with gentle shaking. Then, the Escherichia coli body is precipitated and collected by a centrifuge, and stored frozen at -80 ° C.
R1-ENの精製方法
大腸菌の菌体15 gに対し50 mLのバッファーA(注1)に懸濁し、0.1% Triton X100 (シグマアルドリッチ社)、1 mM PMSF (和光純薬工業株式会社)、10μg/mL RNaseA (シグマアルドリッチ社)、10μg/mL Lysozyme (和光純薬工業株式会社)(いずれも最終濃度)を加えて氷上で超音波破砕する。 R1-EN Purification method E. coli cells were suspended in 50 mL of buffer A (Note 1) for 15 g of E. coli cells, 0.1% Triton X100 (Sigma-Aldrich), 1 mM PMSF (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 10 μg / mL RNaseA (Sigma-Aldrich) and 10 μg / mL Lysozyme (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (all in final concentration) and sonicate on ice.
破砕液を6000 g×30 min、4℃で遠心し、上清を取る。さらに、上清に最終濃度0.5%のポリエチレンイミン(シグマアルドリッチ社)を加え、懸濁後6000 g×30 min、4℃で遠心する。上清を0.45μmのフィルターに通し、ろ液をHisTrap HP 5 mLカラム(GEヘルスケア社)に通す。 The lysate is centrifuged at 6000 g × 30 min at 4 ° C, and the supernatant is collected. Further, polyethyleneimine (Sigma-Aldrich) having a final concentration of 0.5% is added to the supernatant, and the suspension is centrifuged at 6000 g × 30 min at 4 ° C. The supernatant is passed through a 0.45 μm filter, and the filtrate is passed through a HisTrap HP 5 mL column (GE Healthcare).
次に、30 mLのバッファーAでカラムを洗い、30 mLのバッファーB(注2)で溶出させる。 Next, wash the column with 30 mL of buffer A and elute with 30 mL of buffer B (Note 2).
溶出液に、60%飽和となるように硫酸アンモニウム(和光純薬工業株式会社)を加え、硫酸アンモニウムを完全に溶解させた後で6000 g×20 min、4℃で遠心する。上清を捨て、沈殿にファクターXa用バッファー(注3)を10 mL加えて緩やかに沈殿を懸濁する。 Ammonium sulfate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to the eluate to 60% saturation, and the ammonium sulfate is completely dissolved, followed by centrifugation at 6000 g × 20 min at 4 ° C. Discard the supernatant, add 10 mL of Factor Xa buffer (Note 3) to the precipitate, and suspend the precipitate gently.
吸光度計(nano-drop ND-1000(サーモフィッシャーサイエンティフィック社))でUV280からタンパク質濃度を測り、タンパク質量の重量比300分の1のファクターXa (New England Biolab社)を加えて、10℃で一晩放置する。 Measure the protein concentration from UV280 with an absorbance meter (nano-drop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific)), add Factor Xa (New England Biolab) of 1/300 by weight of the protein amount, and add 10 ° C. And leave overnight.
反応液を再び60%飽和硫酸アンモニウムとし、6000 g×20 min、4℃で遠心し、上清を捨てる。沈殿物を20 mLのSPバッファーA(注4)に懸濁し、0.45μmのフィルター(メルク社)に通した後、HiTrap SP HP 1 mL (GEヘルスケア社)にロードする。続いて、カラムを50-800 mM NaClの直線勾配にかける。R1-ENは、およそ500 mM NaClの画分に溶出される。 The reaction solution is again converted to 60% saturated ammonium sulfate, centrifuged at 6000 g × 20 min at 4 ° C., and the supernatant is discarded. The precipitate is suspended in 20 mL of SP buffer A (Note 4), passed through a 0.45 μm filter (Merck), and then loaded into 1 mL of HiTrap SP HP (GE Healthcare). Subsequently, the column is subjected to a linear gradient of 50-800 mM NaCl. R1-EN elutes in a fraction of approximately 500 mM NaCl.
R1-EN画分に60%飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、6000 g×20 min、4℃で遠心し、上清を捨てる。沈殿を1-2 mLのゲルろ過用バッファー(注5)に溶かし、0.22μmのフィルター(メルク社)に通した後、HPLCを用いてゲルろ過カラム(Superdex200 10/300 (GEヘルスケア社))で分離する。R1-ENは、およそ18 mLの画分に溶出される。R1-EN画分を回収し、10kDaの限外ろ過膜(Amicon Ultra(メルク社))で7-8 mg/mLまで濃縮する。
(注1)バッファーAの組成:30 mM Tris, 50 mM Imidazole, pH7.5, 0.5 M NaCl
(注2)バッファーBの組成:30 mM Tris, 350 mM Imidazole, pH7.5, 0.5 M NaCl
(注3)ファクターXa用バッファーの組成:50 mM Tris-HCl pH7.5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM DTT
(注4)SPバッファーAの組成:40 mM リン酸ナトリウム pH5.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT
(注5)ゲルろ過用バッファーの組成:40 mM Hepes-NaOH pH7.2, 180 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTAAdd ammonium sulfate to the R1-EN fraction so that it becomes 60% saturated, centrifuge at 6000 g × 20 min at 4 ° C, and discard the supernatant. The precipitate is dissolved in 1-2 mL of a gel filtration buffer (Note 5), passed through a 0.22 μm filter (Merck), and then subjected to gel filtration using HPLC (Superdex200 10/300 (GE Healthcare)). To separate. R1-EN elutes in approximately 18 mL fractions. The R1-EN fraction is collected and concentrated to 7-8 mg / mL using a 10 kDa ultrafiltration membrane (Amicon Ultra (Merck)).
(Note 1) Composition of buffer A: 30 mM Tris, 50 mM Imidazole, pH 7.5, 0.5 M NaCl
(Note 2) Composition of buffer B: 30 mM Tris, 350 mM Imidazole, pH 7.5, 0.5 M NaCl
(Note 3) Composition of buffer for Factor Xa: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 , 1 mM DTT
(Note 4) Composition of SP buffer A: 40 mM sodium phosphate pH 5.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT
(Note 5) Composition of buffer for gel filtration: 40 mM Hepes-NaOH pH 7.2, 180 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA
R1-ENの結晶化
結晶化方法は非特許文献3に詳細に記載されている。 The crystallization method of R1-EN is described in detail in Non-Patent Document 3.
結晶化はハンギングドロップ蒸気拡散法で行う。上記の精製で得られた7-8 mg/mLの R1-EN溶液1.5μLに沈殿剤溶液(1.8 M 酢酸ナトリウム(和光純薬工業株式会社)(pH7.3)、10 mM 硫酸アンモニウム、1.0% Jeffamine M-600 (ハンプトンリサーチ社)) 1.5μLを加えて10℃で静置する。結晶はおよそ7-10日で成長する。 The crystallization is performed by a hanging drop vapor diffusion method. Precipitant solution (1.8 M sodium acetate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (pH 7.3), 10 mM ammonium sulfate, 1.0% Jeffamine) was added to 1.5 μL of the 7-8 mg / mL R1-EN solution obtained by the above purification. Add 1.5 μL of M-600 (Hampton Research) and leave at 10 ° C. The crystals grow in about 7-10 days.
マイクロシーディングを行うと、再現性良く結晶が得られる。 When microseeding is performed, crystals can be obtained with good reproducibility.
<製造例>
融合タンパク質作製のためのプラスミドベクターのデザイン(pET16b-R1EN)
1)R1-ENの安定化
結晶構造から、タンパク質表面上にフリーのシステイン残基が2つ見られた。凝集を防ぐ目的でこれらの残基をセリンに置換した(C55S/C72S)。また、R1-ENの本来のDNA切断活性を無くす目的で活性残基であるE44をアラニンに置換した。<Production Example>
Design of plasmid vector for fusion protein production (pET16b-R1EN)
1) Stabilization of R1-EN The crystal structure revealed two free cysteine residues on the protein surface. These residues were replaced with serine to prevent aggregation (C55S / C72S). The active residue E44 was replaced with alanine in order to eliminate the original DNA cleavage activity of R1-EN.
2)余分な配列の除去
結晶構造ではC末端側の222番目のグリシンまでしか見えていなかった。見えていない領域は21残基あり、これが物理的に孔の内部で邪魔になるので、224-243の部分を除去した。2) Removal of extra sequence In the crystal structure, only the 222nd glycine at the C-terminal side was visible. The unseen region has 21 residues, which physically hindered the inside of the hole, so portions 224-243 were removed.
3)マルチクローニングサイトの挿入
様々なタンパク質をコードする配列を挿入可能とするため、R1-ENの直後にマルチクローニングサイトを導入した。3) Insertion of a multi-cloning site A multi-cloning site was introduced immediately after R1-EN to enable insertion of sequences encoding various proteins.
・CATATGはNdeIサイトで、これより前の部分はpET16bと共通である。
・太字の部分はR1-ENの5-223の配列である。
・GCAは元の配列gaaに変異を入れて、Glu44→Ala44としている
・TCCは元の配列tgtに変異を入れて、Cys55→Ser55としている
・TCGは元の配列tgcに変異を入れて、Cys72→Ser72としている
・イタリック体はマルチクローニングサイトで、5'側から、BamHI (GGATCC), SmaI (CCCGGG), SalI (GTCGAC), XhoI (TCTGAG), SacI (GAGTCT)の認識配列が並んでいる。
・灰色の部分以降はpET16bの5392以降と同じ配列である。・CATATG is an NdeI site, and the part before this is common to pET16b.
-The part in bold is the arrangement of 5-223 of R1-EN.
· GCA is to put a mutation in the original sequence gaa, · TCC that you are Glu44 → Ala44 is to put a mutation in the original sequence tgt, · TCG that you are Cys55 → Ser55 is to put a mutation in the original sequence tgc, Cys72 → Ser72 ・ Italics are multiple cloning sites, and recognition sequences for BamHI (GGATCC), SmaI (CCCGGG), SalI (GTCGAC), XhoI (TCTGAG), and SacI (GAGTCT) are aligned from the 5 'side.
・ The sequence after the gray part is the same as that after 5392 of pET16b.
融合タンパク質作製のためのプラスミドベクターのデザイン2
上はR1-ENのC末にタンパク質を融合させるデザインであるが、R1-ENのN末に融合させるためのプラスミドもデザインした。 Design of plasmid vector for production of fusion protein 2
Above is a design for fusing the protein to the C-terminal of R1-EN, but a plasmid for fusing to the N-terminal of R1-EN was also designed.
上の1)、2)を踏襲した上で、今度はpGEX6P-1をベースにコンストラクトを作製した。 Following 1) and 2) above, this time a construct was made based on pGEX6P-1.
・GGATCCはBamHIの認識配列で、AAGCTTはHindIIIの認識配列である。これにより、この2つの制限酵素で任意のタンパク質を導入可能となる。また、GGATCCより前はpGEX6P-1と共通である。
・太字の部分はR1-ENの9-222の配列である。
・灰色のtaaは停止コドンである。
・CTCGAGはXhoIの認識配列で、これ以降はpGEX6P-1と同一である。 GGATCC is a recognition sequence for BamHI, and AAGCTT is a recognition sequence for HindIII. This makes it possible to introduce an arbitrary protein with these two restriction enzymes. Before GGATCC, it is common with pGEX6P-1.
-The part in bold is the sequence of 9-222 of R1-EN.
• Gray taa is a stop codon.
・CTCGAG is a recognition sequence of XhoI, and is the same as pGEX6P-1 thereafter.
R1-EN_hUbiの発現ベクターの作製
ヒトユビキチン(hUbi)の配列をpET16b-R1ENのBamHI/XhoIを用いて挿入し、R1-EN_hUbiを発現するプラスミドを作製した。 Preparation of R1-EN_hUbi Expression Vector A human ubiquitin (hUbi) sequence was inserted using BamHI / XhoI of pET16b-R1EN to prepare a plasmid expressing R1-EN_hUbi.
挿入した配列は以下であった。 The inserted sequence was as follows.
GGATCC: BamHI、CTCGAG: XhoI GGATCC: BamHI, CTCGAG: XhoI
R1-EN_hUbiの精製
上で作製したR1-EN_hUbiを発現するプラスミドを大腸菌BL21(DE3) pLysS株に形質転換し、[R1-ENの発現方法]の項に記した方法で発現させた。また、[R1-ENの精製方法]の項に記した方法と同じ方法で精製を行った。Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS strain was transformed with the plasmid expressing R1-EN_hUbi prepared in the purification of R1-EN_hUbi, and expressed by the method described in the section of [Method for Expression of R1-EN]. Purification was performed in the same manner as described in [R1-EN Purification Method].
ただし、R1-EN_Ubiは陽イオン交換カラムではおよそ600 mM NaClの画分に溶出され(図2)、ゲルろ過カラムではおよそ17.4 mLの画分に溶出された(図3)。 However, R1-EN_Ubi was eluted in a fraction of about 600 mM NaCl on the cation exchange column (FIG. 2), and was eluted in a fraction of about 17.4 mL on the gel filtration column (FIG. 3).
R1-EN_hUbi画分を回収し、10 kDaの限外ろ過膜(Amicon Ultra)で2 mg/mLまで濃縮した。 The R1-EN_hUbi fraction was collected and concentrated to 2 mg / mL using a 10 kDa ultrafiltration membrane (Amicon Ultra).
<試験例>
R1-EN_hUbiの結晶化
上で精製したR1-EN_hUbiを沈殿剤(1.8 M 酢酸ナトリウム pH7.6, 10 mM 硫酸アンモニウム, 0.8% Jeffamine M600 pH7.0)で[R1-ENの結晶化]の項と同じ方法で結晶化を行った。この際、[R1-ENの結晶化]で得られたR1-EN結晶を微小ホモジナイザーで砕いたものを種結晶としてシーディングを行うと、再現性良く結晶が得られた。<Test example>
R1-EN_hUbi purified on the crystallization of R1-EN_hUbi was treated with a precipitant (1.8 M sodium acetate pH 7.6, 10 mM ammonium sulfate, 0.8% Jeffamine M600 pH 7.0) as in [R1-EN crystallization]. Crystallization was performed by the method. At this time, when seeding was performed using the R1-EN crystal obtained by [crystallization of R1-EN] obtained by crushing with a microhomogenizer as a seed crystal, a crystal was obtained with good reproducibility.
R1-EN_hUbiの結晶構造解析
上で得られた結晶をナイロンループ(ハンプトンリサーチ社)で掬い、抗凍結溶液(グリセリン1μL+沈殿剤5μL)に移して再度掬って液体窒素に浸して結晶を凍結させた。凍結させたまま放射光施設SPring-8 BL44XUでX線照射し、最大1.8Å分解能のデータを得た。 The crystal obtained on the crystal structure analysis of R1-EN_hUbi was scooped with a nylon loop (Hampton Research), transferred to an anti-freezing solution (1 μL of glycerin + 5 μL of precipitant), again scooped, and immersed in liquid nitrogen to freeze the crystal . X-ray irradiation was performed at the synchrotron radiation facility SPring-8 BL44XU while frozen, and data with a maximum resolution of 1.8 mm was obtained.
このデータは空間群P321、a=b=141.21, c=37.67Åであり、R1-ENの空間群(P321、a=b=141.30, c=37.51Å)と誤差範囲内で同一であった。R1-ENの構造を基に分子置換法で最適解が得られ、その位相を用いて電子密度を計算したところ、空隙部分に電子密度が得られた。βシートの特徴からユビキチン構造を当てはめることができた(図4)。 This data was in the space group P321, a = b = 141.21, c = 37.67 °, and was the same as the R1-EN space group (P321, a = b = 141.30, c = 37.51 °) within the error range. The optimal solution was obtained by the molecular replacement method based on the structure of R1-EN, and the electron density was calculated using the phase. As a result, the electron density was obtained in the void. A ubiquitin structure could be applied from the characteristics of the β-sheet (FIG. 4).
Claims (8)
タンパク質結晶の製造方法。Crystallizing the fusion protein of claim 1,
A method for producing a protein crystal.
タンパク質の構造解析方法。A protein crystal obtained by the method according to claim 2, or a step of performing an X-ray crystal structure analysis using the protein crystal according to claim 3,
Protein structure analysis method.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017042456 | 2017-03-07 | ||
JP2017042456 | 2017-03-07 | ||
PCT/JP2018/007697 WO2018163947A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-03-01 | Protein crystallization utilizing porous protein crystal |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2018163947A1 true JPWO2018163947A1 (en) | 2020-02-06 |
Family
ID=63448394
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019504514A Pending JPWO2018163947A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-03-01 | Protein crystallization using porous protein crystals |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPWO2018163947A1 (en) |
WO (1) | WO2018163947A1 (en) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001085962A1 (en) * | 2000-05-05 | 2001-11-15 | Imperial College Innovations Limited | Crystallography methods |
JP2012125190A (en) * | 2010-12-15 | 2012-07-05 | Kakei Gakuen | Linker peptide for making association unit |
JP2014212722A (en) * | 2013-04-24 | 2014-11-17 | 学校法人加計学園 | Hepatitis b virus-like particle crystal of octahedral structure |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014181786A1 (en) * | 2013-05-07 | 2014-11-13 | 国立大学法人北海道大学 | Crystallization-promoting polypeptide |
-
2018
- 2018-03-01 JP JP2019504514A patent/JPWO2018163947A1/en active Pending
- 2018-03-01 WO PCT/JP2018/007697 patent/WO2018163947A1/en active Application Filing
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001085962A1 (en) * | 2000-05-05 | 2001-11-15 | Imperial College Innovations Limited | Crystallography methods |
JP2012125190A (en) * | 2010-12-15 | 2012-07-05 | Kakei Gakuen | Linker peptide for making association unit |
JP2014212722A (en) * | 2013-04-24 | 2014-11-17 | 学校法人加計学園 | Hepatitis b virus-like particle crystal of octahedral structure |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MAITA N., ET AL.: "Characterization of the sequence specificity of the R1Bm endonuclease domain by structural and bioch", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 35, no. 12, JPN6018019412, 2007, pages 3918 - 3927, XP055555163, ISSN: 0004705999, DOI: 10.1093/nar/gkm397 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2018163947A1 (en) | 2018-09-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7118510B2 (en) | Variants of polX family DNA polymerases | |
Fabian et al. | Structural basis for the recruitment of the human CCR4–NOT deadenylase complex by tristetraprolin | |
Virgili et al. | Structural analysis of the DAP5 MIF4G domain and its interaction with eIF4A | |
Wiens et al. | Isolation of the silicatein-α interactor silintaphin-2 by a novel solid-phase pull-down assay | |
Arora et al. | Structural insights into actin isoforms | |
Blikstad et al. | Discovery of a carbonic anhydrase-Rubisco complex within the alpha-carboxysome | |
EP2714727B1 (en) | High affinity sumo traps | |
JP4333880B2 (en) | Chondroitin synthase and DNA encoding the enzyme | |
JPWO2018163947A1 (en) | Protein crystallization using porous protein crystals | |
Chauviac et al. | The RpfC (Rv1884) atomic structure shows high structural conservation within the resuscitation-promoting factor catalytic domain | |
KR20080113247A (en) | The use of protein s fusion for protein solubilization | |
Lee et al. | Structural and functional studies of the yeast class II Hda1 histone deacetylase complex | |
Rufer et al. | X-ray structure of glutathione S-transferase from Schistosoma japonicum in a new crystal form reveals flexibility of the substrate-binding site | |
Opatowsky et al. | Expression, purification and crystallization of a functional core of the voltage-dependent calcium channel β subunit | |
Vassylyeva et al. | Crystallization and preliminary crystallographic analysis of the transcriptional regulator RfaH from Escherichia coli and its complex with ops DNA | |
Blikstad | Discovery of a carbonic anhydrase-Rubisco complex within the alpha-carboxysome | |
Echizen et al. | Crystallization and preliminary X-ray diffraction of the first periplasmic domain of SecDF, a translocon-associated membrane protein, from Thermus thermophilus | |
JP4231928B2 (en) | Antifreeze protein containing sequence of ice nucleoprotein | |
Nishimiya et al. | Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of Ca2+-independent and Ca2+-dependent species of the type II antifreeze protein | |
Shin et al. | Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of the N domain of p97/VCP in complex with the UBX domain of FAF1 | |
Yates et al. | Improved crystallization and diffraction of caffeine-induced death suppressor protein 1 (Cid1) | |
JP5441022B2 (en) | Method for preparing Spo11-related protein of higher plant having DNA binding ability | |
Preisler et al. | Recombinant production of membrane proteins in yeast | |
Miyazono et al. | Expression, high-pressure refolding, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of a novel single-strand-specific 3′–5′ exonuclease PhoExo I from Pyrococcus horikoshii OT3 | |
Lannes et al. | Formation of the active Hermes transpososome is driven by asymmetric DNA binding of BED domains |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210217 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220215 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220809 |