JPWO2018151225A1 - Muscle differentiation promoting agent, muscle differentiation promoting method, muscle differentiation promoting oligo DNA, enhancer and oligo DNA - Google Patents
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Abstract
本発明に係る筋分化促進剤は、細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡを含む。前記オリゴＤＮＡは好ましくは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有する。さらに前記オリゴＤＮＡと併せてベルベリンもしくはその類縁化合物又はその塩を含んでもよい。The agent for promoting muscle differentiation according to the present invention includes an oligoDNA having an activity of promoting muscle differentiation by being applied to a cell or an individual. The oligo DNA preferably contains a core base sequence represented by 5'TTAGGG3 'or 5'TGAGGGG3', and has a base sequence AGA or a base sequence AAG at the 5 'end. Further, berberine or a compound thereof or a salt thereof may be contained in combination with the oligo DNA.
Description
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１７年２月１６日に出願された、日本国特許出願第２０１７−０２６５４７号明細書及び２０１７年８月３日に出願された、日本国特許出願第２０１７−１５０３２０号明細書（これらの開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。
本発明は、筋分化促進剤、筋分化促進方法、筋分化促進の増強剤及び筋分化促進の増強方法に関する。[Cross-reference of related applications]
This application is based on Japanese Patent Application No. 2017-026547 filed on Feb. 16, 2017 and Japanese Patent Application No. 2017-150320 filed on Aug. 3, 2017 ( The entire disclosures of which are incorporated herein by reference).
The present invention relates to a muscle differentiation promoting agent, a muscle differentiation promoting method, a muscle differentiation promoting enhancing agent, and a muscle differentiation promoting enhancing method.
超高齢社会では、加齢性の骨格筋委縮を主徴とするサルコペニアを含むロコモティブ症候群が急増しており、寝たきりの原因として大きな問題となっている。また近年の研究から、骨格筋の委縮は心不全の予後の独立した危険因子であるなど、運動機能の増進が様々な疾患の治療及び／又は予防にも重要であることが明らかになりつつある。多くの高齢者が自立した生活を送る健康長寿社会を実現するには、生涯に渡って筋力及び／又は筋量を維持していくことが不可欠である。加齢に伴う筋委縮の予防には、食事を介して筋肉に有益な分子を摂取するといった、日常的かつ長期的な取り組みが有効であると考えられており、安全で安価な機能性分子が求められている。 In the super-aged society, locomotive syndrome including sarcopenia, which is mainly characterized by age-related skeletal muscle atrophy, has been rapidly increasing, and has become a major cause of bedriddenness. Recent studies have also revealed that enhancement of motor function is important for the treatment and / or prevention of various diseases, such as atrophy of skeletal muscle is an independent risk factor for the prognosis of heart failure. In order to realize a healthy and long-lived society where many elderly people can live independently, it is essential to maintain muscle strength and / or muscle mass throughout their lives. It is thought that daily and long-term efforts such as ingesting molecules that are beneficial to muscles through diet are effective in preventing muscle atrophy associated with aging. It has been demanded.
骨格筋は、衛星細胞と呼ばれる骨格筋幹細胞の増殖と分化によって再生され、組織としての恒常性が保たれている。老化が進行すると、筋組織中の衛星細胞の数が減少し、また、個々の衛星細胞の再生能力も低下する。衛星細胞の老化を抑制したり、再生能力を活性化する機能性分子を探索及び同定することは、加齢性の筋委縮に対する新しい予防戦略の提唱につながると期待されている。 Skeletal muscle is regenerated by the proliferation and differentiation of skeletal muscle stem cells called satellite cells, and the homeostasis as a tissue is maintained. As aging progresses, the number of satellite cells in muscle tissue decreases, and the regenerative capacity of individual satellite cells also decreases. Exploring and identifying functional molecules that inhibit aging of satellite cells or activate regenerative capacity is expected to lead to the proposal of new preventive strategies against age-related muscle atrophy.
例えば、マウス骨格筋から採取した衛星細胞を初代培養して得られた筋芽細胞を用い、骨格筋分化に作用する分子をスクリーニングする系が確立されており、このスクリーニング系によって、ウコンに含まれるポリフェノールの一種であるクルクミンが筋分化を促進することが見出されている（非特許文献１）。 For example, a system for screening for molecules that act on skeletal muscle differentiation using myoblasts obtained by primary culture of satellite cells collected from mouse skeletal muscle has been established. It has been found that curcumin, a kind of polyphenol, promotes muscle differentiation (Non-Patent Document 1).
しかし、自然由来のクルクミンは、栽培されたウコン等を原材料にし、有機溶媒抽出法、アルコール抽出法などによって、分離及び抽出を行い、生産することが現在でも行われており、今後の世界的な需要の増加に対し高純度なクルクミンが安定にしかも安価に生産できるかどうかが懸念される。また特許文献１の方法はＤＮＡの修復及びＤＮＡ欠損によるガン化の抑制を目的としたものである。
However, curcumin derived from nature is still produced and separated and produced by organic solvent extraction method, alcohol extraction method, etc., using cultivated turmeric as a raw material. There is concern about whether high-purity curcumin can be produced stably and inexpensively as demand increases. The method of
また、老化防止という観点から、テロメア相同オリゴヌクレオチド（配列番号１７、１８）を細胞に曝露することにより、平均テロメア長を増加させる技術が開示されている（特許文献１）。 Moreover, the technique of increasing an average telomere length is disclosed by exposing a telomere homologous oligonucleotide (sequence number 17, 18) to a cell from a viewpoint of aging prevention (patent document 1).
本発明が解決すべき課題は、新たな筋分化促進剤を提供することである。 The problem to be solved by the present invention is to provide a new muscle differentiation promoting agent.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行い、新たな知見を見出すに至った。
具体的には、本発明は、以下の項を提供する
項１．細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡを含む筋分化促進剤。The present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems, and have found new knowledge.
Specifically, the present invention provides the following items: A muscle differentiation promoting agent comprising an oligo DNA having an activity of promoting muscle differentiation when applied to a cell or an individual.
項２．ベルベリンもしくはその類縁体化合物又はその塩をさらに含む項１に記載の筋分化促進剤。
項３．前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結している、項１又は２記載の筋分化促進剤。
項４．前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含む項３記載の筋分化促進剤。
項５．前記オリゴＤＮＡは、塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含む項４記載の筋分化促進剤。
項６．前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’ 又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有する項１記載の筋分化促進剤。
項７．哺乳類又は鳥類の細胞又は個体に対して適用するための項１から６のいずれか１項に記載の筋分化促進剤。
Item 7. Item 7. The muscle differentiation promoting agent according to any one of
項８．前記細胞はマウス筋芽細胞又はニワトリ筋芽細胞又はヒト横紋筋肉腫細胞である項７記載の筋分化促進剤。
項９．前記個体はマウス、ニワトリ又はヒトである項７記載の筋分化促進剤。
Item 9.
項１０．前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含む項２記載の筋分化促進剤。
項１１．５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有した項１０記載の筋分化促進剤。
Item 11. The muscle differentiation promoting agent according to
項１２．前記オリゴＤＮＡと前記ベルベリンもしくはその類縁体化合物又はその塩のモル比は１：１０〜１０：１である、項９記載の筋分化促進剤。
項１３．項１から１２のいずれかの１項に記載の筋分化促進剤を使用する筋分化促進方法。
Item 13. Item 13. A muscle differentiation promoting method using the muscle differentiation promoting agent according to any one of
項１４．５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有するた筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡ。 Item 14.5 'Oligo DNA comprising a core base sequence represented by' TTAGGG3 'or 5'TGAGGG3' and having a base sequence AGA or base sequence AAG on the 5 'end side and an activity of promoting muscle differentiation.
項１５．５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結している項１４記載のオリゴＤＮＡ。
Item 15. The oligo DNA according to
項１６．５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含む項１５記載のオリゴＤＮＡ。 Item 15. The oligo DNA according to Item 15, comprising a core base sequence represented by 5'TTAGGG3 'or 5'TGAGGG3' linked to a core base sequence represented by Item 16.5'TTAGGG3 '.
項１７．塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含む項１６記載のオリゴＤＮＡ。
Item 17.
項１８．細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有し、塩基長が６から２５のいずれかであるオリゴＤＮＡ。
項１９．前記塩基長が９から１８のいずれかである項１８記載のオリゴＤＮＡ。
Item 19. Item 19. The oligo DNA according to
項２０．前記塩基長が１８である項１８記載のオリゴＤＮＡ。
項２１．５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有した項１８記載のオリゴＤＮＡ。
項２２．５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結したことを特徴とする項１９記載のオリゴＤＮＡ。
項２３．オリゴＤＮＡによる筋分化促進を増強するための増強剤であって、ベルベリンもしくはその類縁化合物又はその塩を含む増強剤。 Item 23. An enhancer for enhancing muscle differentiation promotion by oligo DNA, comprising berberine or a related compound thereof or a salt thereof.
項２４．前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含む項２３記載の増強剤。
本発明によれば、筋分化を強力に促進することが可能となる。 According to the present invention, muscle differentiation can be strongly promoted.
本発明の一態様に係る筋分化促進剤は、細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡを含む。本発明において、「筋分化を促進する活性を有する」とは、本発明の属する分野における技術常識を参酌して適宜解釈し得るが、一般的には、対照群と比較して、骨格筋細胞の最終分化マーカーであるミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性細胞の出現割合を増加させる性質を指す。ＭＨＣ陽性細胞の出現割合は、例えば、後述の実施例１（図３）に示す試験において、測定、評価することができる。 The muscle differentiation promoting agent according to one embodiment of the present invention includes an oligo DNA having an activity of promoting muscle differentiation when applied to a cell or an individual. In the present invention, “having an activity of promoting muscle differentiation” can be appropriately interpreted in consideration of technical common sense in the field to which the present invention belongs, but generally, compared with the control group, skeletal muscle cells The property which increases the appearance ratio of the myosin heavy chain (MHC) positive cell which is a terminal differentiation marker of (2). The appearance ratio of MHC positive cells can be measured and evaluated, for example, in the test shown in Example 1 (FIG. 3) described later.
前記筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含んでいてもよい。本発明において、「５’ＸＸＸＸＸＸ３’又は５’ＹＹＹＹＹＹ３’を含む」には、５’ＸＸＸＸＸＸ３’及び５’ＹＹＹＹＹＹ３’の一方のみを含む場合と、これらの両方を含む場合とを包含する。本発明にかかるオリゴＤＮＡがコア塩基配列を含む実施形態においては、当該オリゴＤＮＡは、５’末端側に、塩基配列ＧＡＡ、塩基配列ＡＧＡ、塩基配列ＡＡＧ又は塩基配列ＡＡＡ；好ましくは塩基配列ＡＧＡ、塩基配列ＡＡＧ又は塩基配列ＡＡＡ；より好ましくは塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有してもよい。かかる実施形態において、「５’末端側に塩基配列ＸＸＸを有する」とは、コア塩基配列よりも５’末端側に塩基配列ＸＸＸを有することを意味し、オリゴＤＮＡの５’末端に塩基配列ＸＸＸを有する場合だけでなく、塩基配列ＸＸＸのさらに５’末端に塩基配列（例えば、Ａ及びＧからなる群より選択される少なくとも１個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個）からなる塩基配列）を有する場合も包含される。また、当該実施形態において、上記塩基配列（塩基配列ＧＡＡ、塩基配列ＡＧＡ、塩基配列ＡＡＧ又は塩基配列ＡＡＡ；好ましくは塩基配列ＡＧＡ、塩基配列ＡＡＧ又は塩基配列ＡＡＡ；より好ましくは塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧ）は、コア配列に連結していることが好ましいが、上記塩基配列とコア配列との間に別の塩基配列（例えば、Ａ及びＧからなる群より選択される少なくとも１個（例えば、好ましくは１〜３個）からなる塩基配列）を介していてもよい。 In the muscle differentiation promoting agent, the oligo DNA may contain a core base sequence represented by 5'TTAGGG3 'or 5'TGAGGG3'. In the present invention, “including 5′XXXXXXX3 ′ or 5′YYYYYY3 ′” includes a case where only one of 5′XXXXXX3 ′ and 5′YYYYYY3 ′ is included, and a case where both are included. In an embodiment in which the oligo DNA according to the present invention includes a core base sequence, the oligo DNA has a base sequence GAA, a base sequence AGA, a base sequence AAG or a base sequence AAA on the 5 ′ end side; preferably a base sequence AGA, It may have the base sequence AAG or the base sequence AAA; more preferably the base sequence AGA or the base sequence AAG. In this embodiment, “having the base sequence XXX on the 5 ′ end side” means having the base sequence XXX on the 5 ′ end side from the core base sequence, and the base sequence XXX on the 5 ′ end of the oligo DNA. As well as at least one selected from the group consisting of A and G (for example, 1 to 5, preferably 1 to 3) at the 5 ′ end of the base sequence XXX. A base sequence) is also included. In this embodiment, the base sequence (base sequence GAA, base sequence AGA, base sequence AAG or base sequence AAA; preferably base sequence AGA, base sequence AAG or base sequence AAA; more preferably base sequence AGA or base sequence AAG) is preferably linked to the core sequence, but at least one selected from the group consisting of the above base sequence and the core sequence (for example, A and G) (for example, preferably 1 to 3) may be interposed.
前記筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上（好ましくは２〜３、より好ましくは２）連結して含んでもよい。すなわち、前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ３’（配列番号２８）；５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’（配列番号２９）；５’ＴＧＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ３’（配列番号３０）；又は５’ＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’（配列番号３１）を含んでもよい。これらのコア塩基配列のうち、５’ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ３’、５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’等が好ましい。
In the muscle differentiation promoting agent, the oligo DNA may contain two or more (preferably 2 to 3, more preferably 2) core base sequences represented by 5'TTAGGG3 'or 5'TGAGGG3'. That is, the oligo DNA may include 5 ′
前記筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含んでもよい。 In the muscle differentiation promoting agent, the oligo DNA may contain a core base sequence represented by 5'TTAGGG3 'linked to a core base sequence represented by 5'TTAGGG3' or 5'TGAGGG3 '.
前記筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含んでもよい。 In the muscle differentiation promoting agent, the oligo DNA may contain a base sequence 5'TTAGGGTGAGGG3 '.
前記筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは哺乳類又は鳥類の細胞又は個体に対して適用してもよい。 In the muscle differentiation promoting agent, the oligo DNA may be applied to mammalian or avian cells or individuals.
前記筋分化促進剤において前記細胞はマウス筋芽細胞又はニワトリ筋芽細胞又はヒト横紋筋肉腫細胞であってもよい。 In the muscle differentiation promoting agent, the cells may be mouse myoblasts, chicken myoblasts or human rhabdomyosarcoma cells.
前記筋分化促進剤において前記個体はマウス又はニワトリ又はヒトであってもよい。 In the muscle differentiation promoting agent, the individual may be a mouse, a chicken or a human.
本発明の一態様に係る筋分化促進方法は、前記筋分化促進剤を使用する。 The muscle differentiation promoting method according to one embodiment of the present invention uses the muscle differentiation promoting agent.
本発明の一態様に係る筋分化促進オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有する。 The muscle differentiation promoting oligo DNA according to one embodiment of the present invention includes a core base sequence represented by 5'TTAGGG3 'or 5'TGAGGG3', and has a base sequence AGA or a base sequence AAG on the 5 'end side.
前記筋分化促進オリゴＤＮＡにおいて５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結してもよい。 Two or more core base sequences represented by 5'TTAGGG3 'or 5'TGAGGG3' may be linked in the muscle differentiation promoting oligo DNA.
前記筋分化促進オリゴＤＮＡにおいて５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列に５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を連結して含んでもよい。 In the muscle differentiation promoting oligo DNA, a core base sequence represented by 5'TTAGGG3 'or 5'TGAGGG3' may be linked to a core base sequence represented by 5'TTAGGG3 '.
前記筋分化促進オリゴＤＮＡにおいて塩基配列５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’を含んでもよい。 The muscle differentiation promoting oligo DNA may contain the base sequence 5'TTAGGGTGAGGG3 '.
本発明の一態様に係る筋分化促進剤は細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有するオリゴＤＮＡとベルベリン又はその類縁体化合物とを含む。 The muscle differentiation promoting agent according to one embodiment of the present invention includes an oligo DNA having an activity of promoting muscle differentiation when applied to a cell or an individual, and berberine or an analog compound thereof.
前記筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡは５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含む。 In the muscle differentiation promoting agent, the oligo DNA contains a core base sequence represented by 5'TTAGGG3 '.
前記筋分化促進剤において前記オリゴＤＮＡ５’は末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有してもよい。 In the muscle differentiation promoting agent, the oligo DNA 5 'may have a base sequence AGA or a base sequence AAG on the terminal side.
前記オリゴＤＮＡと前記ベルベリン又はその類縁体化合物のモル比は等しくあってもよい。 The molar ratio of the oligo DNA and the berberine or its analog compound may be equal.
本発明の一態様に係る筋分化促進方法は５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含むオリゴＤＮＡとベルベリン又はその類縁体化合物とを含む筋分化促進剤を使用する。 The method for promoting muscle differentiation according to one embodiment of the present invention uses a muscle differentiation promoting agent containing an oligo DNA containing a core base sequence represented by 5'TTAGGG3 'and berberine or an analog compound thereof.
本発明の一態様に係る増強剤は、オリゴＤＮＡと併用され、細胞又は、個体に対して適用することにより筋分化を促進する増強剤であって、ベルベリン又はその類縁化合物を含む。 The enhancer according to one embodiment of the present invention is an enhancer that is used in combination with an oligo DNA and promotes muscle differentiation when applied to a cell or an individual, and includes berberine or a similar compound thereof.
前記増強剤において、５’ＴＴＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含むオリゴＤＮＡと併用されてもよい。 The enhancer may be used in combination with an oligo DNA containing a core base sequence represented by 5 'TTAGGG3'.
本発明の一態様に係るオリゴＤＮＡは細胞又は個体に対して適用することにより筋分化を促進する活性を有し、塩基長が６から２５のいずれかである。 The oligo DNA according to one embodiment of the present invention has an activity of promoting muscle differentiation when applied to a cell or an individual, and has a base length of 6 to 25.
前記オリゴＤＮＡにおいて前記塩基長が９から１８のいずれかであってもよい。 In the oligo DNA, the base length may be any of 9 to 18.
前記オリゴＤＮＡにおいて前記塩基長が１３から２３のいずれか、好ましくは１５から２１のいずれか、より好ましくは１７から１９のいずれか、さらに好ましくは１８であってもよい。 In the oligo DNA, the base length may be any of 13 to 23, preferably any of 15 to 21, more preferably any of 17 to 19, and even more preferably 18.
前記オリゴＤＮＡにおいて５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列を含み、５’末端側に塩基配列ＡＧＡ又は塩基配列ＡＡＧを有しているのが好ましい。 The oligo DNA preferably contains a core base sequence represented by 5'TTAGGG3 'or 5'TGAGGG3' and has a base sequence AGA or a base sequence AAG on the 5 'end side.
前記オリゴＤＮＡにおいて５’ＴＴＡＧＧＧ３’又は５’ＴＧＡＧＧＧ３’で表されるコア塩基配列が２以上連結しているのが好ましい。
また、本発明において、オリゴＤＮＡは、後述する配列番号１〜７、１６のいずれかで示される塩基配列からなるもの；配列番号１〜７、１６のいずれかにおいて１個又は数個（好ましくは１〜３個、より好ましく１個）の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列からなるもの等が好ましい。また、本発明において、オリゴＤＮＡとしては、５’ＡＡＡＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡ３’（配列番号３２）又は５’ＡＡＡＡＡＧＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡ３’（配列番号３３）で示される塩基配列からなるもの、当該配列番号３２又は３３で示される塩基配列のうち連続する１５〜２１個（好ましくは１７〜１９固、さらに好ましくは１８個）の塩基で示される塩基配列からなるもの、これらの塩基配列いずれかにおいて１個又は数個（好ましくは１〜３個、より好ましく１個）の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列からなるもの等が好ましい。 また、本発明において、オリゴＤＮＡとしては、
５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７ＡＧＧＧＴＸ８ＡＧＧＧＴＸ９Ａ３’（配列番号３４）
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は、それぞれ独立して、Ａ又はＧを示す。Ｘ７及びＸ８、Ｘ９は、それぞれ独立して、Ｔ又はＧを示す。］
で示される塩基配列のうち連続する１５〜２１個（好ましくは１７〜１９固、さらに好ましくは１８個）の塩基で示される塩基配列からなるもの等が好ましい。上記実施形態において、オリゴＤＮＡは、Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＸ７ＡＧＧＧＴＸ８ＡＧＧＧを含むものが好ましい。また、配列番号３２においてＸ７としてはＴが好ましい。配列番号３２においてＸ８としてはＧが好ましい。配列番号３２においてＸ９としてはＧが好ましい。It is preferable that two or more core base sequences represented by 5′TTAGGG3 ′ or 5′TGAGGG3 ′ are linked in the oligo DNA.
In the present invention, the oligo DNA is composed of a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 7, 16 described later; one or several (preferably, any of SEQ ID NOs: 1 to 7, 16) Those having a base sequence in which 1 to 3 bases, more preferably 1 base) are substituted, deleted, inserted or added are preferred. In the present invention, the oligo DNA includes a nucleotide sequence represented by 5′AAAAGATTTAGGGTGAGGGGTGA3 ′ (SEQ ID NO: 32) or 5 ′ AAAAAGTTTAGGGTGGAGGGTGA3 ′ (SEQ ID NO: 33), and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 32 or 33 Among them, one consisting of 15 to 21 consecutive bases (preferably 17 to 19 solids, more preferably 18 bases), one or several (preferably 1 to several) of any of these base sequences. Those having a base sequence in which 3 bases, more preferably 1 base) are substituted, deleted, inserted or added are preferred. In the present invention, as the oligo DNA,
5′X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 TX 7 AGGGTX 8 AGGGTX 9 A3 ′ (SEQ ID NO: 34)
[Wherein, X 1 , X 2 , X 3 , X 4 , X 5 and X 6 each independently represent A or G. X 7 and X 8 and X 9 each independently represent T or G. ]
Among these, a sequence consisting of 15 to 21 consecutive bases (preferably 17 to 19 solids, more preferably 18 bases) is preferred. In the above embodiment, the oligo DNA preferably contains X 4 X 5 X 6 TX 7 AGGGTX 8 AGGG. Also, T is preferred as X 7 in SEQ ID NO: 32. G is preferably an X 8 in SEQ ID NO: 32. G is preferably an X 9 in SEQ ID NO: 32.
本発明において、上記オリゴＤＮＡは、筋分化を促進することができる。具体的には、後述するように、筋分化を強力に促進する一連のオリゴＤＮＡ群を曝露した筋芽細胞では、細胞増殖が抑制され、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性の筋管形成が促進されることが確認された。しかも、上記オリゴＤＮＡ群は化学合成が可能で安定構造を有すため、将来的に大量に供給及び保存ができ、また乳酸菌のゲノム配列に由来するため、安全性も高いことが期待される。
そのため、本発明の筋分化促進剤は、筋肉減弱症の予防及び／又は治療、横紋筋肉腫の増殖及び／又は転移の抑制、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞又は体性幹細胞の筋分化誘導、筋疾患の再生医療、創薬のスクリーニングに供する骨格筋幹細胞（衛星細胞）、骨格筋前駆細胞（筋芽細胞）及び骨格筋細胞からなる群より選択される少なくとも１種の作成、食肉用家畜及び／又は家禽の飼料の添加物、食肉用家畜及び／又は家禽の骨格筋の形成及び／又は生育の促進に利用可能である。In the present invention, the oligo DNA can promote muscle differentiation. Specifically, as described later, in myoblasts exposed to a series of oligo DNA groups that strongly promote muscle differentiation, cell proliferation is suppressed and myosin heavy chain (MHC) positive myotube formation is promoted. It was confirmed that Moreover, since the oligo DNA group can be chemically synthesized and has a stable structure, it can be supplied and stored in large quantities in the future, and since it is derived from the genomic sequence of lactic acid bacteria, it is expected to have high safety.
Therefore, the muscle differentiation-promoting agent of the present invention is used for the prevention and / or treatment of muscle weakness, the suppression of the proliferation and / or metastasis of rhabdomyosarcoma, the induction of muscle differentiation of ES cells, iPS cells or somatic stem cells, muscle diseases Regenerative medicine, preparation of at least one selected from the group consisting of skeletal muscle stem cells (satellite cells), skeletal muscle progenitor cells (myoblasts) and skeletal muscle cells for screening for drug discovery, livestock for meat and / or It can be used to promote the formation and / or growth of poultry feed additives, meat livestock and / or poultry skeletal muscle.
本発明においては、本発明の有効成分である上記オリゴＤＮＡそのものを筋分化促進剤として用いても、薬学的に許容される各種担体（例えば、例えば等張化剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤、防腐剤等）と組み合わせた医薬組成物として用いてもよい。
等張化剤としては、例えば、グルコース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール等の糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の無機塩類等が挙げられる。
ｐＨ調節剤としては、例えば、塩酸、炭酸、酢酸、クエン酸等の酸が挙げられ、さらに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩又は炭酸水素塩、酢酸ナトリウム等のアルカリ金属酢酸塩、クエン酸ナトリウム等のアルカリ金属クエン酸塩、トロメタモール等の塩基等が挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム等が挙げられる。
溶解補助剤としては、例えば、安息香酸ナトリウム、グリセリン、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、プロピレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
粘稠化剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロースナトリウム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
防腐剤としては、例えば、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩、アルキルポリアミノエチルグリシン、クロロブタノール、ポリクォード、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン等が挙げられる。
また、上記医薬組成物は、オリゴＤＮＡ以外に、筋分化促進作用を有することが知られている化合物をさらに含んでいてもよい。
医薬組成物の実施形態において、組成物中のオリゴＤＮＡの含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。
製剤中の本発明のオリゴＤＮＡの含有量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、オリゴＤＮＡの１日投与量が通常１０〜５０００ｍｇ程度、より好ましくは１００〜１０００ｍｇ程度になる量とすればよい。１日１回投与する場合は、１製剤中にこの量が含まれていればよく、１日３回投与する場合は、１製剤中にこの３分の１量が含まれていればよい。In the present invention, even when the oligo DNA itself, which is the active ingredient of the present invention, is used as a muscle differentiation promoter, various pharmaceutically acceptable carriers (for example, isotonic agents, stabilizers, pH regulators, etc.) , Antioxidants, solubilizers, thickeners, preservatives, etc.).
Examples of isotonic agents include sugars such as glucose, trehalose, lactose, fructose, mannitol, xylitol, and sorbitol, polyhydric alcohols such as glycerin, polyethylene glycol, and propylene glycol, sodium chloride, potassium chloride, and calcium chloride. Examples include inorganic salts.
Examples of the pH regulator include acids such as hydrochloric acid, carbonic acid, acetic acid, and citric acid, and further alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, alkali metal carbonates such as sodium carbonate, or hydrogen carbonate. Salts, alkali metal acetates such as sodium acetate, alkali metal citrates such as sodium citrate, bases such as trometamol, and the like.
Examples of the antioxidant include sodium bisulfite, dry sodium sulfite, and sodium pyrosulfite.
Examples of the solubilizer include sodium benzoate, glycerin, D-sorbitol, glucose, propylene glycol, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, macrogol, D-mannitol and the like.
Examples of the thickening agent include polyethylene glycol, methyl cellulose, ethyl cellulose, carmellose sodium, xanthan gum, sodium chondroitin sulfate, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol and the like.
Examples of the preservative include, for example, paraoxybenzoic acid esters such as sorbic acid, potassium sorbate, methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, butyl paraoxybenzoate, chlorhexidine gluconate, benzalkonium chloride, chloride Quaternary ammonium salts such as benzethonium and cetylpyridinium chloride, alkyl polyaminoethylglycine, chlorobutanol, polyquad, polyhexamethylene biguanide, chlorhexidine and the like can be mentioned.
In addition to the oligo DNA, the pharmaceutical composition may further contain a compound known to have a muscle differentiation promoting action.
In the embodiment of the pharmaceutical composition, the content of the oligo DNA in the composition is not particularly limited, for example, 90% by mass or more, 70% by mass or more, 50% by mass or more, 30% by mass or more, 10% by mass or more, It can set suitably from conditions, such as 5 mass% or more and 1 mass% or more.
The content of the oligo DNA of the present invention in the preparation varies depending on the administration route, patient age, body weight, symptoms, etc., and cannot be defined unconditionally, but the daily dosage of oligo DNA is usually about 10 to 5000 mg, more preferably 100. The amount may be about ˜1000 mg. When it is administered once a day, it is sufficient that this amount is contained in one preparation, and when it is administered three times a day, this one-third amount may be contained in one preparation.
（本発明の実施形態）
以下、本発明の一態様に係る実施の形態（以下、本実施形態）について図面を参照して詳細に説明する。(Embodiment of the present invention)
Hereinafter, an embodiment (hereinafter, this embodiment) according to one embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
まず骨格筋の再生メカニズムについて図１を参照しながら説明する。 First, the regeneration mechanism of skeletal muscle will be described with reference to FIG.
図１において、筋肉組織の一部に損傷又は劣化が生じた場合、まず衛星細胞と呼ばれる幹細胞が活性化し、筋芽細胞と呼ばれる前駆細胞となる。筋芽細胞は増殖を繰り返した後、筋細胞へと分化する。筋細胞は細胞融合により多核の筋管となる。筋管はさらに構造的成熟を遂げ、最終的に筋線維となり、骨格筋組織を再生する。 In FIG. 1, when a part of muscle tissue is damaged or deteriorated, stem cells called satellite cells are first activated to become progenitor cells called myoblasts. Myoblasts repeatedly proliferate and then differentiate into muscle cells. Myocytes become multinucleated myotubes by cell fusion. The myotubes undergo further structural maturation and eventually become muscle fibers that regenerate skeletal muscle tissue.
本発明者らは、乳酸菌Lactobacillus rhamnosus GGのゲノム配列に由来するオリゴＤＮＡライブラリを用いて筋分化促進作用の検証実験を行った。本実施形態において、オリゴＤＮＡとは６から２５の塩基からなる短いＤＮＡを意味する。好ましくは９から１８の塩基からなる。さらに好ましくは１８の塩基からなる。これらのオリゴＤＮＡは免疫調節作用を有する核酸素材として、医療及び食品の分野で研究が進んでおり、これまでに免疫系を制御する分子機構が明らかにされてきている。しかし免疫系以外の組織及び／又は細胞を標的とするオリゴＤＮＡの研究は行われていなかった。そこで本発明者らはマウス筋芽細胞への作用をスクリーニングし、その結果、筋分化を強力に促進する一連の新規のオリゴＤＮＡ群を同定した。これらを曝露した筋芽細胞では、細胞増殖が抑制され、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性の筋管形成が促進される。 The present inventors conducted a verification experiment of the muscle differentiation promoting action using an oligo DNA library derived from the genomic sequence of the lactic acid bacterium Lactobacillus rhamnosus GG. In this embodiment, oligo DNA means short DNA consisting of 6 to 25 bases. Preferably it consists of 9 to 18 bases. More preferably, it consists of 18 bases. These oligo DNAs have been studied in the medical and food fields as nucleic acid materials having an immunomodulating action, and molecular mechanisms for controlling the immune system have been elucidated so far. However, research on oligo DNA targeting tissues and / or cells other than the immune system has not been conducted. Therefore, the present inventors screened the action on mouse myoblasts, and as a result, identified a series of novel oligo DNA groups that strongly promote muscle differentiation. In myoblasts exposed to these, cell proliferation is suppressed and myosin heavy chain (MHC) positive myotube formation is promoted.
＜ｍｙｏＤＮ＞
本実施形態における筋分化促進剤は、例えば次に示す配列番号のオリゴＤＮＡを含む：
ｉＳＮ０１：５’ＡＡＡＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’（配列番号１）
ｉＳＮ０２：５’ＡＡＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴ３’（配列番号２）
ｉＳＮ０３：５’ＡＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧ３’（配列番号３）
ｉＳＮ０４：５’ＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡ３’（配列番号４）
ｉＳＮ０５：５’ＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧ３’（配列番号５）
ｉＳＮ０６：５’ＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴ３’（配列番号６）
ｉＳＮ０７：５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴＴ３’（配列番号７）
ｉＳＮ０４’：５’ＡＡＧＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡ３’（配列番号１６）<MyoDN>
The muscle differentiation promoting agent in the present embodiment includes, for example, oligo DNA having the following SEQ ID NO:
iSN01: 5 'AAAAGATTTAGGGTGAGGG 3' (SEQ ID NO: 1)
iSN02: 5′AAAGATTTAGGGTGAGGGGT3 ′ (SEQ ID NO: 2)
iSN03: 5 ′ AAGATTTAGGGTGAGGGTG3 ′ (SEQ ID NO: 3)
iSN04: 5'AGATTTAGGGTGGGGTGA3 '(SEQ ID NO: 4)
iSN05: 5 ′ GATTTAGGGTGGGGGTGAG3 ′ (SEQ ID NO: 5)
iSN06: 5 'ATTAGGGTGAGGGTGGAGT 3' (SEQ ID NO: 6)
iSN07: 5′TTAGGGTGAGGGTGGATT3 ′ (SEQ ID NO: 7)
iSN04 ′: 5 ′ AAGTTAGGGTGAGGGGTGA3 ′ (SEQ ID NO: 16)
前記配列番号１〜７、及び１６のオリゴＤＮＡはいずれもコア配列ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ（配列番号２９）を含む。前記配列番号２８で示されるコア配列の５’末端側から２番目と８番目の塩基はＴでもＧでもよい。また前記コア配列の４〜６番目と９〜１１番目に配列ＧＧＧを有するが、筋分化を活性させるに後者の配列がより重要である。なお、配列ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列（ＴＴＡＧＧＧ）ｎはテロメアと呼ばれ、真核生物の染色体の末端部に存在する。テロメアは細胞***に先立つＤＮＡ複製とともに短くなり、細胞の老化が進むとされる（特許文献１）。 The oligo DNAs of SEQ ID NOs: 1 to 7 and 16 all contain the core sequence TTAGGGTGAGGG (SEQ ID NO: 29). The second and eighth bases from the 5 'end of the core sequence represented by SEQ ID NO: 28 may be T or G. Moreover, although it has arrangement | sequence GGG in the 4th-6th and 9th-11th of the said core arrangement | sequence, the latter arrangement | sequence is more important for activating muscle differentiation. The repeated sequence (TTAGGG) n of the sequence TTAGGG is called a telomere and is present at the end of the eukaryotic chromosome. Telomeres are shortened with DNA replication prior to cell division, and aging of cells proceeds (Patent Document 1).
本実施形態における筋分化促進剤は、より好ましくは、配列番号４及び／又は５１のオリゴＤＮＡ（以下、ｉＳＮ０４、ｉＳＮ０４’）を含む。これらのオリゴＤＮＡは前記コア配列の５’側に配列ＡＧＡ又はＡＡＧを含む。以下、ｉＳＮ０４、ｉＳＮ０４’を併せて、「ｍｙｏＤＮ」と称する。 More preferably, the muscle differentiation promoting agent in the present embodiment includes the oligo DNA of SEQ ID NO: 4 and / or 51 (hereinafter, iSN04, iSN04 '). These oligo DNAs contain the sequence AGA or AAG on the 5 'side of the core sequence. Hereinafter, iSN04 and iSN04 'are collectively referred to as “myoDN”.
本実施形態における前記オリゴＤＮＡは一本鎖であってもよい。また、核酸分解酵素に対して耐性を高めるためにホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドのリン酸基の酸素原子を硫黄原子で置換したもの（例えばホスホロチオエート結合）であってもよいが、これらに限定されない。また、前記オリゴＤＮＡは乳酸菌、大腸菌などの生物からＤＮＡを抽出し断片化したもの、あるいは、化学合成、遺伝子組替え技術によって作成したものであってもよいが、これらに限定されない。 The oligo DNA in this embodiment may be single-stranded. In addition, in order to increase resistance to nucleolytic enzymes, it may be one in which the oxygen atom of the phosphate group of an oligonucleotide having a phosphodiester bond is substituted with a sulfur atom (for example, phosphorothioate bond), but is not limited thereto. . The oligo DNA may be DNA extracted from a living organism such as lactic acid bacteria or Escherichia coli and fragmented, or prepared by chemical synthesis or gene recombination techniques, but is not limited thereto.
＜ｍｙｏＤＮの構造的特徴＞
図２の左上及び左下にｉＳＮ０４（配列番号４）の立体構造をシミュレートした結果を示す。当シミュレーションにおいてはｉＳＮ０４はホスホロチオエート骨格を有する一本鎖ＤＮＡであることを前提としていない。左上の図はｉＳＮ０４の分子構造図であり、左下の図は各塩基間の距離を濃淡描画したマップである。縦軸、横軸の数字はそれぞれ５’末端側から何番目の塩基であるかを示し、縦軸の番号の塩基と横軸の番号の塩基との距離が近いほど濃く表示される。左下図において、１３〜１５番目の塩基配列ＧＧＧの周辺が濃く表示されているが、これはｉＳＮ０４においてこれらのグアニン塩基群が他の塩基と比較して互いに近接していることを示している。<Structural features of myoDN>
The results of simulating the three-dimensional structure of iSN04 (SEQ ID NO: 4) are shown in the upper left and lower left of FIG. This simulation does not assume that iSN04 is a single-stranded DNA having a phosphorothioate backbone. The upper left figure is a molecular structure diagram of iSN04, and the lower left figure is a map in which the distance between each base is drawn with shading. The numbers on the vertical axis and the horizontal axis respectively indicate the number of the base from the 5′-end side, and the darker the distance between the base with the number on the vertical axis and the base with the number on the horizontal axis is displayed. In the lower left figure, the periphery of the 13th to 15th base sequence GGG is darkly displayed, and this indicates that these guanine base groups are close to each other compared to other bases in iSN04.
＜筋分化促進剤の適用対象＞
本実施の形態における筋分化促進剤は、個体を構成する細胞に対しても培地上で培養された細胞に対しても適用可能である。また、前記筋分化促進剤はマウス、ヒトを含む哺乳類又はニワトリを含む鳥類を対象とすることができるが、これらに限定されない。<Application target of muscle differentiation promoting agent>
The muscle differentiation promoting agent in the present embodiment is applicable to both cells constituting an individual and cells cultured on a medium. Further, the muscle differentiation promoting agent can be targeted to mammals including mice, humans or birds including chickens, but is not limited thereto.
＜筋分化促進剤の利用形態＞
本実施の形態における筋分化促進剤は、通常使用されている各種の担体、賦形剤の成分を配合し、公知の方法に従って、注射薬、塗布薬、錠剤、カプセル剤、シロップ、座薬等に製剤化できるが、これらに限定されない。また、前記筋分化促進剤は、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、経腸、局所、舌下又は直腸手段によって投与することができるが、これらに限定されない。<Usage form of muscle differentiation promoting agent>
The muscle differentiation promoting agent in the present embodiment is blended with various commonly used carriers and excipient components, and in accordance with known methods, it can be used for injections, coatings, tablets, capsules, syrups, suppositories, etc. Although it can formulate, it is not limited to these. The agent for promoting muscle differentiation is oral, intravenous, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, percutaneous, subcutaneous, intraperitoneal, enteral, topical, sublingual or rectal. It can be administered by means of, but not limited to.
（本発明の第２の実施形態）
以下、本発明の第２の実施形態について説明する。第２の実施形態の筋分化促進剤はオリゴＤＮＡにベルベリンもしくはその類縁体化合物（例えば、パルマチン、ヤテオリジン、コランバミン等）又はその塩を併用したものである。好ましくは、オリゴＤＮＡとベルベリン又はその類縁体化合物のモル比を、１：１０〜１０：１、より好ましくは１：５〜５：１、さらに好ましくは１：２〜２：１、なおさらに好ましくは１：１で用いる。オリゴＤＮＡとしては、前述のものが挙げられる。当該実施形態において、筋分化促進剤中のオリゴＤＮＡの含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。筋分化促進剤中のオリゴＤＮＡの含有量の上限も特に限定されず、例えば、９０質量％以下、７０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下等の条件から適宜設定できる。当該実施形態において、筋分化促進剤中のベルベリンの含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。筋分化促進剤中のベルベリンの含有量の上限も特に限定されず、例えば、９０質量％以下、７０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下等の条件から適宜設定できる。(Second embodiment of the present invention)
Hereinafter, a second embodiment of the present invention will be described. The muscle differentiation promoting agent of the second embodiment is a combination of berberine or an analog compound thereof (for example, palmatin, yateoridine, colambamine, etc.) or a salt thereof with oligo DNA. Preferably, the molar ratio of oligo DNA to berberine or its analog compound is 1:10 to 10: 1, more preferably 1: 5 to 5: 1, more preferably 1: 2 to 2: 1, still more preferably. Is used 1: 1. Examples of the oligo DNA include those described above. In the embodiment, the content of the oligo DNA in the muscle differentiation promoting agent is not particularly limited, and for example, 90% by mass or more, 70% by mass or more, 50% by mass or more, 30% by mass or more, 10% by mass or more, 5% It can set suitably from conditions, such as mass% or more and 1 mass% or more. The upper limit of the content of oligo DNA in the muscle differentiation promoter is not particularly limited, and is, for example, 90% by mass or less, 70% by mass or less, 50% by mass or less, 30% by mass or less, 10% by mass or less, and 5% by mass or less. It can set suitably from conditions, such as 1 mass% or less. In the embodiment, the content of berberine in the muscle differentiation promoter is not particularly limited, and for example, 90% by mass or more, 70% by mass or more, 50% by mass or more, 30% by mass or more, 10% by mass or more, 5% by mass. % Or more, and can be appropriately set from conditions such as 1% by mass or more. The upper limit of the content of berberine in the muscle differentiation promoter is not particularly limited, for example, 90 mass% or less, 70 mass% or less, 50 mass% or less, 30 mass% or less, 10 mass% or less, 5 mass% or less, It can set suitably from conditions, such as 1 mass% or less.
当該実施形態においては、安価で安全なベルベリン又はその類縁体化合物をオリゴＤＮＡに併用することによりオリゴＤＮＡの筋分化促進作用を増強することが可能となる。ベルベリンの類縁体化合物としては、特に限定されず、天然の誘導体、人工の誘導体のいずれも使用し得る。 In this embodiment, it is possible to enhance the muscle differentiation promoting action of oligo DNA by using inexpensive and safe berberine or an analog compound thereof together with oligo DNA. The analog compound of berberine is not particularly limited, and any of natural derivatives and artificial derivatives can be used.
＜ベルベリンと組み合わせたｍｙｏＤＮの構造的特徴＞
図２の右上及び右下にベルベリンと組み合わせたｉＳＮ０４（配列番号４）の立体構造をシミュレートした結果を示す。当シミュレーションにおいてはｉＳＮ０４はホスホロチオエート骨格を有する一本鎖ＤＮＡであることを前提としていない。図２の右上はベルベリンと組み合わせた状態（ベルベリン存在下）におけるｉＳＮ０４の複合体構造図（ベルベリン分子は空間充填モデルで表示）であり、右下の図はベルベリンと組み合わせた状態での各塩基間およびベルベリン（残基番号０）の距離を濃淡描画したマップである。図２の右下においては、１３〜１５番目の塩基配列ＧＧＧの周辺だけでなく、７〜９番目の塩基配列ＧＧＧの周辺も濃く表示されている。これはベルベリンと組み合わせた状態のｉＳＮ０４においてこれらのグアニン塩基群が他の塩基と比較して互いに近接していることを示している。<Structural features of myoDN combined with berberine>
The results of simulating the three-dimensional structure of iSN04 (SEQ ID NO: 4) combined with berberine are shown in the upper right and lower right of FIG. This simulation does not assume that iSN04 is a single-stranded DNA having a phosphorothioate backbone. The upper right of FIG. 2 is a complex structure diagram of iSN04 in the state combined with berberine (in the presence of berberine) (berberine molecule is shown in a space-filling model), and the lower right diagram shows the relationship between each base in the state combined with berberine. It is a map in which the distance of berberine (residue number 0) is drawn in gray. In the lower right of FIG. 2, not only the periphery of the 13th to 15th base sequences GGG but also the periphery of the 7th to 9th base sequences GGG are displayed darkly. This indicates that in iSN04 combined with berberine, these guanine base groups are close to each other as compared with other bases.
＜ベルベリン＞
ベルベリン（式１）はオウバク(黄檗)から抽出される生薬の成分で、アルカロイドの一種であり、窒素を含む塩基性の天然有機化合物として知られている。主に、抗菌、抗炎症、中枢抑制又は血圧降下剤として、下痢の止瀉薬、目薬として利用されており、人体に対して安全である。<Berberine>
Berberine (formula 1) is a crude drug component extracted from duck (yellow tuna), is a kind of alkaloid, and is known as a basic natural organic compound containing nitrogen. It is mainly used as an antibacterial, anti-inflammatory, central depressant or antihypertensive agent as an antidiarrheal and eye drop for diarrhea and is safe for the human body.
ベルベリンは単体では筋分化促進効果は無く、後述の実施例で示されるように、むしろ弱い筋分化抑制効果を有する。しかし、ベルベリンをｉＳＮ０４又は所定の変異体とともに筋芽細胞に作用させたとき、筋分化促進効果が劇的に亢進する。変異体はｉＳＮ０４’でもよく、あるいはｉＳＮ０４の５’末端側より１１番目のＧをＴに置換したオリゴＤＮＡ（配列番号２６）であってもよい。ただし、後述の実施例で示されるように、ｉＳＮ０４の５番目のＴをＧに置換させるとベルベリンによる顕著な増強効果は見られなくなる。 Berberine alone has no muscle differentiation-promoting effect, but rather has a weak muscle differentiation-inhibiting effect, as shown in the examples described later. However, when berberine is allowed to act on myoblasts together with iSN04 or a predetermined mutant, the muscle differentiation promoting effect is dramatically enhanced. The mutant may be iSN04 ', or may be an oligo DNA (SEQ ID NO: 26) in which the 11th G from the 5' end of iSN04 is replaced with T. However, as shown in Examples described later, when the fifth T of iSN04 is replaced with G, the remarkable enhancement effect by berberine is not observed.
＜パルマチン＞
ベルベリンに代えて、パルマチンをオリゴＤＮＡと併用してもよい。パルマチンはベルベリンと同じくオウバク(黄檗)から抽出される生薬成分であり、式２で示されるように、ベルベリンのメチレンジオキシ基の代わりにジメトキシ基を有す類縁体化合物である。当該実施形態において、筋分化促進剤中のパルマチンの含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。筋分化促進剤中のパルマチンの含有量の上限も特に限定されず、例えば、９０質量％以下、７０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下等の条件から適宜設定できる。<Parmatine>
Instead of berberine, palmatin may be used in combination with oligo DNA. Palmatin, like berberine, is a crude drug component extracted from buckwheat (yellow japonicus), and as shown in
ベルベリンもパルマチンも（Ｓ）−レチクリン（Ｃ１９Ｈ２３ＮＯ４）を前駆体としコランバミン（Ｃ２０Ｈ２０ＮＯ４）を経て生合成される。ベルベリンシターゼという酵素がコランバミンをメチレンジオキシ基を有するベルベリンに変換する。また他の酵素がコランバミンをメチル化してパルマチンを生成する。Both berberine and palmatin are biosynthesized with (S) -reticuline (C 19 H 23 NO 4 ) as a precursor and via colambamine (C 20 H 20 NO 4 ). An enzyme called berberine sidase converts columbamine into berberine having a methylenedioxy group. Other enzymes methylate columbamine to produce palmatin.
＜その他の類縁体＞
ベルベリンの類縁体としては、パルマチン以外に、ヤテオリジン、コランバミン等が挙げられる：<Other analogs>
Berberine analogs include, besides palmatin, yateoridine, colambamine and the like:
当該実施形態において、筋分化促進剤中の、ヤテオリジン、コランバミン等のベルベリンの類縁体の含有量は特に限定されず、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。筋分化促進剤中のヤテオリジン、コランバミン等のベルベリンの類縁体の含有量の上限も特に限定されず、例えば、９０質量％以下、７０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、１質量％以下等の条件から適宜設定できる。 In the embodiment, the content of berberine analogs such as yateoridine and colambamine in the muscle differentiation promoter is not particularly limited, and is, for example, 90% by mass or more, 70% by mass or more, 50% by mass or more, 30% by mass. As described above, it can be appropriately set based on conditions such as 10% by mass or more, 5% by mass or more, 1% by mass or more. The upper limit of the content of berberine analogs such as yateoridine and colambamine in the muscle differentiation promoter is not particularly limited, and is, for example, 90% by mass, 70% by mass, 50% by mass, 30% by mass, 10% by mass. % Or less, 5% by mass or less, 1% by mass or less and the like.
ベルベリン及びパルマチン等の類縁体を生合成する植物からこれらを抽出及び精製する方法は既に確立されており、安価で利用することが可能である。さらにオリゴＤＮＡよりも安価なベルベリン又はパルマチン等の類縁体を併用することで、効果を高めつつオリゴＤＮＡの利用コストをさらに下げることが可能である。 Methods for extracting and purifying analogs such as berberine and palmatin have already been established and can be used at low cost. Further, by using an analog such as berberine or palmatin that is less expensive than oligo DNA, it is possible to further reduce the cost of using oligo DNA while enhancing the effect.
本発明においてベルベリン又はその誘導体は、塩の状態で用いてもよい。また、ベルベリン又はその誘導体の塩としては、ハロゲン化物（塩化物等）等が挙げられる。また、ベルベリン又はその誘導体の塩としては、酸付加塩及び塩基との塩も挙げられる。酸付加塩の具体例として、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩等の有機酸塩、及びグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等の酸性アミノ酸塩が挙げられる。塩基との塩の具体例としては、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩のようなアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩、ピリジン塩、トリエチルアミン塩のような有機塩基との塩、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。 In the present invention, berberine or a derivative thereof may be used in the form of a salt. Examples of the salt of berberine or a derivative thereof include a halide (such as a chloride). Examples of the salt of berberine or a derivative thereof include acid addition salts and salts with bases. Specific examples of acid addition salts include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, perchlorate, phosphate and other inorganic acid salts, oxalate, malonate, succinic acid Salt, maleate, fumarate, lactate, malate, citrate, tartrate, benzoate, trifluoroacetate, acetate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate, trifluoromethane Examples include organic acid salts such as sulfonates, and acidic amino acid salts such as glutamates and aspartates. Specific examples of salts with bases include alkali metal or alkaline earth metal salts such as sodium salt, potassium salt or calcium salt, salts with organic bases such as pyridine salt and triethylamine salt, bases such as lysine and arginine. And salts with sexual amino acids.
本発明において、ベルベリンもしくはその誘導体又はこれらの塩は、前述したオリゴＤＮＡによる筋分化促進作用を増強することができる。従って、本発明は、オリゴＤＮＡによる筋分化促進を増強するための増強剤であって、ベルベリンもしくはその類縁化合物又はその塩を含む増強剤を提供する。当該実施形態において、ベルベリンもしくはその類縁化合物又はその塩の種類、配合量、オリゴＤＮＡの種類、使用量、その他成分等については、筋分化促進剤について前述したのと同様の条件を適宜適用し得る。 In the present invention, berberine or a derivative thereof or a salt thereof can enhance the muscle differentiation promoting action by the oligo DNA described above. Accordingly, the present invention provides an enhancer for enhancing muscle differentiation promotion by oligo DNA, which comprises berberine or a related compound thereof or a salt thereof. In this embodiment, the same conditions as described above for the muscle differentiation promoting agent can be applied as appropriate to the type, compounding amount, type of oligo DNA, amount used, other components, etc. of berberine or its related compounds or salts thereof. .
以下、本発明の実施例について説明する。
（実施例１）
本発明者らは、マウス骨格筋から採取した衛星細胞を初代培養して得られた筋芽細胞を用い、骨格筋分化に作用する分子をスクリーニングする系を確立した。コラーゲンコートした９６ｗｅｌｌプレートで培養した筋芽細胞に、オリゴＤＮＡなどの分子を添加する。所定時間経過後に、免疫染色によって骨格筋の最終分化マーカーであるミオシン重鎖（ＭＨＣ）の発現を定量化する。このときＤＡＰＩ染色によって細胞核を可視化する。さらにイメージアナライザーを用いて、画像の撮影と解析を自動的に行い、筋分化効率と細胞数をハイスループットで定量する。このようにして、筋芽細胞に対する多種多様な分子の作用を効率的に検討することができる。Examples of the present invention will be described below.
(Example 1)
The present inventors have established a system for screening molecules that act on skeletal muscle differentiation using myoblasts obtained by primary culture of satellite cells collected from mouse skeletal muscle. Molecules such as oligo DNA are added to myoblasts cultured in a collagen-coated 96-well plate. After a predetermined time has elapsed, the expression of myosin heavy chain (MHC), which is a skeletal muscle final differentiation marker, is quantified by immunostaining. At this time, cell nuclei are visualized by DAPI staining. Furthermore, using an image analyzer, it automatically captures and analyzes images and quantifies the efficiency of muscle differentiation and the number of cells with high throughput. In this way, the action of a wide variety of molecules on myoblasts can be examined efficiently.
配列番号１〜３、及び５〜５１の５０種類のオリゴＤＮＡ群（表１）を用いたスクリーニング結果を図３に示す。マウス筋芽細胞（１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にそれぞれ１０μＭの濃度のオリゴＤＮＡを曝露し、４８時間後にＭＨＣ陽性細胞の出現割合を測定した。なお、以下の実施例におけるオリゴＤＮＡは一本鎖で構成され、しかも核酸分解酵素に対して耐性を高めるためにホスホジエステル結合のリン酸基の酸素原子を硫黄原子で置換する処理（Ｓ化）を予め行っている。The screening results using 50 types of oligo DNA groups (Table 1) of SEQ ID NOs: 1 to 3 and 5 to 51 are shown in FIG. Mouse myoblasts (10 4 cells / well) were each exposed to oligo DNA at a concentration of 10 μM, and the appearance rate of MHC positive cells was measured 48 hours later. In the following examples, the oligo DNA is composed of a single strand, and in order to increase resistance to nucleolytic enzymes, the oxygen atom of the phosphate group of the phosphodiester bond is replaced with a sulfur atom (S). Is performed in advance.
＜表１＞
iSN01 : 5’AAAAGATTAGGGTGAGGG3’(配列番号1)
iSN02 : 5’AAAGATTAGGGTGAGGGT3’(配列番号2)
iSN03 : 5’AAGATTAGGGTGAGGGTG3’(配列番号3)
iSN04’: 5’AAGTTAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号16)
iSN05 : 5’GATTAGGGTGAGGGTGAG3’(配列番号5)
iSN06 : 5’ATTAGGGTGAGGGTGAGT3’(配列番号6)
iSN07 : 5’TTAGGGTGAGGGTGAGTT3’(配列番号7)
iSN08 : 5’AGTTCAACATTAGGGTGA3’(配列番号8)
iSN09 : 5’GTTCAACATTAGGGTGAA3’(配列番号9)
iSN10 : 5’TTCAACATTAGGGTGAAA3’(配列番号10)
iSN11 : 5’TCAACATTAGGGTGAAAA3’(配列番号11)
iSN12 : 5’CAACATTAGGGTGAAAAT3’(配列番号12)
iSN13 : 5’AACATTAGGGTGAAAATG3’(配列番号13)
iSN14 : 5’ACATTAGGGTGAAAATGA3’(配列番号14)
iSN15 : 5’CATTAGGGTGAAAATGAA3’(配列番号15)<Table 1>
iSN01: 5'AAAAGATTAGGGTGAGGG3 '(SEQ ID NO: 1)
iSN02: 5'AAAGATTAGGGTGAGGGT3 '(SEQ ID NO: 2)
iSN03: 5'AAGATTAGGGTGAGGGTG3 '(SEQ ID NO: 3)
iSN04 ': 5'AAGTTAGGGTGAGGGTGA3' (SEQ ID NO: 16)
iSN05: 5'GATTAGGGTGAGGGTGAG3 '(SEQ ID NO: 5)
iSN06: 5'ATTAGGGTGAGGGTGAGT3 '(SEQ ID NO: 6)
iSN07: 5'TTAGGGTGAGGGTGAGTT3 '(SEQ ID NO: 7)
iSN08: 5'AGTTCAACATTAGGGTGA3 '(SEQ ID NO: 8)
iSN09: 5'GTTCAACATTAGGGTGAA3 '(SEQ ID NO: 9)
iSN10: 5'TTCAACATTAGGGTGAAA3 '(SEQ ID NO: 10)
iSN11: 5'TCAACATTAGGGTGAAAA3 '(SEQ ID NO: 11)
iSN12: 5'CAACATTAGGGTGAAAAT3 '(SEQ ID NO: 12)
iSN13: 5'AACATTAGGGTGAAAATG3 '(SEQ ID NO: 13)
iSN14: 5'ACATTAGGGTGAAAATGA3 '(SEQ ID NO: 14)
iSN15: 5'CATTAGGGTGAAAATGAA3 '(SEQ ID NO: 15)
図３において、右側のグラフはミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性細胞の割合を、左側のグラフは細胞数を示したものである。いずれも最上段の白色のバー（Ｃｔｒｌ）はオリゴＤＮＡを全く投与しなかった対照群（コントロール）である。なお、左側のグラフにおいては対照群の細胞数は１と正規化している。明らかにＭＨＣ陽性細胞の割合と細胞数とは相補的な関係にある。これは筋芽細胞の分化が促進されれば増殖が抑制されることを意味する。対照群におけるＭＨＣ陽性細胞の比率は高々３％程度である。 In FIG. 3, the graph on the right shows the percentage of myosin heavy chain (MHC) positive cells, and the graph on the left shows the number of cells. In each case, the uppermost white bar (Ctrl) is a control group (control) in which no oligo DNA was administered. In the left graph, the number of cells in the control group is normalized to 1. Clearly, the proportion of MHC positive cells and the number of cells are in a complementary relationship. This means that proliferation is suppressed if differentiation of myoblasts is promoted. The ratio of MHC positive cells in the control group is about 3% at most.
一方、オリゴＤＮＡを投与した筋芽細胞のうち、ｉＳＮ０１、０２、０３、０４’、０５、０６及び０７のグループに属するオリゴＤＮＡが投与された筋芽細胞においては６％以上の割合でＭＨＣ陽性細胞が出現した。特にｉＳＮ０４’（配列番号１６）のオリゴＤＮＡが投与された筋芽細胞におけるＭＨＣ陽性細胞の割合は４０％超と非常に高い。 On the other hand, among myoblasts administered with oligo DNA, myoblasts administered with oligo DNA belonging to the group of iSN01, 02, 03, 04 ′, 05, 06 and 07 were MHC positive at a rate of 6% or more. Cells appeared. In particular, the proportion of MHC positive cells in myoblasts administered with oligo DNA of iSN04 '(SEQ ID NO: 16) is as high as more than 40%.
さらに、このｉＳＮ０４’と配列が２塩基異なるｉＳＮ０４（表２、配列番号４）のオリゴＤＮＡとで、同様の条件で比較実験を行った。結果を図４に示す。 Further, a comparative experiment was performed under the same conditions using this iSN04 'and an oligo DNA of iSN04 (Table 2, SEQ ID NO: 4) having a different base sequence. The results are shown in FIG.
＜表２＞
iSN04: 5’AGATTAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号4)<Table 2>
iSN04: 5'AGATTAGGGTGAGGGTGA3 '(SEQ ID NO: 4)
図４より明らかなように、配列番号４のオリゴＤＮＡ（ｉＳＮ０４）は配列番号１６のオリゴＤＮＡ（ｉＳＮ０４’）と同程度かそれ以上の筋分化促進作用を示す。 As is clear from FIG. 4, the oligo DNA (iSN04) of SEQ ID NO: 4 exhibits the same or higher muscle differentiation promoting action as the oligo DNA (iSN04 ') of SEQ ID NO: 16.
ここで注目すべきことは、前記ｉＳＮ０１〜０７及び前記ｉＳＮ０４’のグループに属するオリゴＤＮＡは、共通して５’ＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧ３’（配列番号２９）という塩基配列を有している。 What should be noted here is that the oligo DNAs belonging to the groups of iSN01 to 07 and iSN04 'have a base sequence of 5'TTAGGGTGAGGG3' (SEQ ID NO: 29) in common.
（実施例２）
図５にｉＳＮ０１〜０３（配列番号１〜３）、ｉＳＮ０５〜０７（配列番号５〜７）、ｉＳＮ０４’（配列番号１６）のオリゴＤＮＡを３μＭ及び１０μＭの濃度で筋芽細胞に曝露したときの、４８時間後におけるミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性細胞の割合を測定した結果を示す。同図によれば、オリゴＤＮＡの濃度が３μＭに比べて１０μＭで極端にＭＨＣ陽性細胞割合が増えることから、筋分化の促進には一定量以上の濃度のオリゴＤＮＡが必要であることが判る。(Example 2)
FIG. 5 shows iSN01-03 (SEQ ID NO: 1 to 3), iSN05-07 (SEQ ID NO: 5-7), iSN04 ′ (SEQ ID NO: 16) oligo DNA exposed to myoblasts at concentrations of 3 μM and 10 μM. The result of having measured the ratio of the myosin heavy chain (MHC)
さらに、ｉＳＮ０２（配列番号２）を加熱により変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）させた１０μＭのオリゴＤＮＡ（ｄｅ−ｉＳＮ０２）を４８時間、マウス筋芽細胞（１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に曝露したときのＭＨＣ陽性細胞割合を図６に示す。熱変性処理はオリゴＤＮＡを９５℃で５分間加熱して行った。熱変性によって、ｉＳＮ０２の筋分化促進作用が明らかに失われていることがわかる。この結果は、オリゴＤＮＡの活性が立体構造に依存していることを示唆する。Furthermore, the proportion of MHC positive cells when 10 μM oligo DNA (de-iSN02) obtained by denaturing iSN02 (SEQ ID NO: 2) by heating was exposed to mouse myoblasts (10 4 cells / well) for 48 hours. Is shown in FIG. The heat denaturation treatment was performed by heating the oligo DNA at 95 ° C. for 5 minutes. It can be seen that due to heat denaturation, the muscle differentiation promoting action of iSN02 is clearly lost. This result suggests that the activity of the oligo DNA is dependent on the conformation.
（実施例３）
図７は、ｍｙｏＤＮすなわちｉＳＮ０４又はｉＳＮ０４’（配列番号４、５１のオリゴＤＮＡ）によるヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１の増殖の抑制効果を示したものである。図３で説明したとおり筋芽細胞の分化と増殖は相補的な関係にある。言い換えればオリゴＤＮＡにより筋芽細胞の分化が促進されれば、その一方で増殖は抑制される。この性質を利用すれば、オリゴＤＮＡによる癌などの悪性腫瘍の増殖及び転移を抑制する効果が期待できる。(Example 3)
FIG. 7 shows the inhibitory effect on proliferation of human rhabdomyosarcoma cells KYM1 by myoDN, iSN04 or iSN04 ′ (oligo DNA of SEQ ID NOs: 4 and 51). As explained in FIG. 3, myoblast differentiation and proliferation are in a complementary relationship. In other words, if differentiation of myoblasts is promoted by oligo DNA, proliferation is suppressed on the other hand. By utilizing this property, an effect of suppressing the growth and metastasis of malignant tumors such as cancer by oligo DNA can be expected.
図７において（ａ）はヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にオリゴＤＮＡ（ｉＳＮ０４’）を曝露したときの骨格筋分化マーカー遺伝子（ＭＹＨ２）の発現量を、（ｂ）は細胞増殖マーカー遺伝子（ＭＫＩ６７）の発現量を、それぞれコントロール（Ｃｔｒｌ）を１．０として定量したものである。両図より明らかなように、筋分化の促進と細胞増殖の抑制は互いに逆の関係にある。7A shows the expression level of the skeletal muscle differentiation marker gene (MYH2) when the oligo DNA (iSN04 ′) is exposed to human rhabdomyosarcoma cells KYM1 (5 × 10 4 cells / well), (b) ) Quantifies the expression level of the cell proliferation marker gene (MKI67), assuming that the control (Ctrl) is 1.0. As is clear from both figures, the promotion of muscle differentiation and the suppression of cell proliferation are opposite to each other.
図７（ｃ）は時間経過に伴う横紋筋肉腫の細胞数を計測した結果である。コントロール（Ｃｔｒｌ）と比較すると、ｉＳＮ０４（配列番号４のオリゴＤＮＡ）を曝露したときは明らかにヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１の増殖が抑制されている。 FIG. 7C shows the result of measuring the number of rhabdomyosarcoma cells over time. Compared with the control (Ctrl), the proliferation of human rhabdomyosarcoma cells KYM1 is clearly suppressed when iSN04 (the oligo DNA of SEQ ID NO: 4) is exposed.
（実施例４）
表３に示すｉＳＮ０４（配列番号４）の一部の塩基を置換又は削除して作成したオリゴＤＮＡの変異型（配列５４〜６２）をマウス筋芽細胞に対しそれぞれ１０μＭの濃度で曝露し、４８時間後にＭＨＣ陽性細胞の出現割合を測定した。表３において「-」は塩基配列が削除されその両端の塩基が直に結合していることを表す。例えばｉＳＮ０４（ｄｅｌ１３−１５）において、５’末端側から１２番目の塩基Ａと、３’末端側から４番目の塩基Ｔは直に結合している。(Example 4)
The oligo DNA mutants (sequences 54 to 62) prepared by substituting or deleting a part of bases of iSN04 (SEQ ID NO: 4) shown in Table 3 were exposed to mouse myoblasts at a concentration of 10 μM, respectively. The appearance ratio of MHC positive cells was measured after time. In Table 3, “-” indicates that the base sequence is deleted and the bases at both ends thereof are directly bonded. For example, in iSN04 (del13-15), the 12th base A from the 5 ′ end side and the 4th base T from the 3 ′ end side are directly bonded.
＜表３＞
iSN04 :5’AGATTAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号4)
iSN04(4-18) :5’---TTAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号19)
iSN04(7-18) :5’------GGGTGAGGGTGA3’(配列番号20)
iSN04(10-18) :5’---------TGAGGGTGA3’(配列番号21)
iSN04(dell5) :5’AGATTAGGGTGAGG-TGA3’(配列番号22)
iSN04(del14-15) :5’AGATTAGGGTGAG--TGA3’(配列番号23)
iSN04(del13-15) :5’AGATTAGGGTGA---TGA3’(配列番号24)
iSN04(T5G) :5’AGATGAGGGTGAGGGTGA3’(配列番号25)
iSN04(G11T) :5’AGATTAGGGTTAGGGTGA3’(配列番号26)
iSN04(T5G,G11T) :5’AGATGAGGGTTAGGGTGA3’(配列番号27)<Table 3>
iSN04: 5'AGATTAGGGTGAGGGTGA3 '(SEQ ID NO: 4)
iSN04 (4-18): 5 '--- TTAGGGTGAGGGTGA3' (SEQ ID NO: 19)
iSN04 (7-18): 5 '------ GGGTGAGGGTGA3' (SEQ ID NO: 20)
iSN04 (10-18): 5 '--------- TGAGGGTGA3' (SEQ ID NO: 21)
iSN04 (dell5): 5'AGATTAGGGTGAGG-TGA3 '(SEQ ID NO: 22)
iSN04 (del14-15): 5'AGATTAGGGTGAG--TGA3 '(SEQ ID NO: 23)
iSN04 (del13-15): 5'AGATTAGGGTGA --- TGA3 '(SEQ ID NO: 24)
iSN04 (T5G): 5'AGATGAGGGTGAGGGTGA3 '(SEQ ID NO: 25)
iSN04 (G11T): 5'AGATTAGGGTTAGGGTGA3 '(SEQ ID NO: 26)
iSN04 (T5G, G11T): 5'AGATGAGGGTTAGGGTGA3 '(SEQ ID NO: 27)
結果を図８に示す。同図より明らかなように、ｉＳＮ０４の５’末端側から５番目、１１番目の塩基をＴ、Ｇのいずれに変えても、ＭＨＣ陽性細胞の出現割合は殆ど変わらない。その一方で、５’末端側の３塩基を削除したｉＳＮ０４（４−１８）（配列番号１９）を曝露したときのＭＨＣ陽性細胞の出現割合はＭＱ（コントロール）と同程度であり、当変異型適用による筋分化促進効果は全く認められない。６塩基削除したｉＳＮ０４（７−１８）（配列番号２０）、９塩基削除したｉＳＮ０４（１０−１８）（配列番号２１）を適用した場合においても結果はほぼ同じである。以上の結果は、ｍｙｏＤＮの筋分化促進作用には５’末端側の３塩基（ＡＧＡ又はＡＡＧ）の存在が重要であることを示している。 The results are shown in FIG. As is clear from the figure, even when the 5th and 11th bases from the 5 'end of iSN04 are changed to either T or G, the appearance ratio of MHC positive cells is hardly changed. On the other hand, the appearance ratio of MHC positive cells when exposed to iSN04 (4-18) (SEQ ID NO: 19) from which 3 bases at the 5 ′ end were deleted is similar to that of MQ (control), and this mutant type The effect of promoting muscle differentiation by application is not recognized at all. When iSN04 (7-18) (SEQ ID NO: 20) from which 6 bases have been deleted and iSN04 (10-18) (SEQ ID NO: 21) from which 9 bases have been deleted are applied, the results are almost the same. The above results indicate that the presence of 3 bases (AGA or AAG) on the 5 'end side is important for myoDN's muscle differentiation promoting action.
さらにｉＳＮ０４の５’側から１３〜１５番目のＧをそれぞれ１個、２個、すべて除去したオリゴＤＮＡ（配列番号２２、２３、２４）でも筋分化活性の低下がみられることから、特に当位置における塩基ＧＧＧの役割が大きいことが示唆される。図２で示されたように、当位置におけるグアニン塩基群は他の塩基と比較してより互いに近接しており、この構造的な特徴がｍｙｏＤＮの筋分化促進効果に寄与している可能性がある。 Furthermore, since oligosaccharides (SEQ ID NOs: 22, 23, and 24) from which all of the 13th to 15th Gs from the 5 ′ side of iSN04 have been removed also show reduced muscle differentiation activity, This suggests that the role of the base GGG is large. As shown in FIG. 2, the guanine base group at this position is closer to each other than other bases, and this structural feature may contribute to the muscle differentiation promoting effect of myoDN. is there.
（実施例５）
ｍｙｏＤＮが筋分化を特異的に促進することを検証するため、ｉＳＮ０４（配列番号４）を用いた実験を行った。それぞれ５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で培養したマウス筋芽細胞又はマウス胎児線維芽細胞にｉＳＮ０４（配列番号４）を１μＭ又は３μＭ、７２時間曝露し、細胞に対する増加抑制効果を観察した。実験はそれぞれ３回行いその平均をプロットした。(Example 5)
In order to verify that myoDN specifically promotes muscle differentiation, an experiment using iSN04 (SEQ ID NO: 4) was performed. ISN04 (SEQ ID NO: 4) was exposed to mouse myoblasts or mouse fetal fibroblasts cultured at a density of 5 × 10 4 cells / well for 72 hours for 1 hour, and an increase inhibitory effect on the cells was observed. Each experiment was performed in triplicate and the average was plotted.
図９上のグラフはマウス筋芽細胞に対する増加抑制効果を示したもので、コントロール（Ｃｔｒｌ）の細胞（ｉＳＮ０４を加えていない細胞）が７２時間後に約２倍に増殖したのに対し、ｉＳＮ０４を３μＭ曝露したものは０．０５未満のｐ値で約２割程度の増加に抑えられた。 The upper graph in FIG. 9 shows an increase-inhibitory effect on mouse myoblasts. Control (Ctrl) cells (cells without iSN04) proliferated approximately twice after 72 hours, whereas iSN04 Those exposed to 3 μM were suppressed to an increase of about 20% with a p value of less than 0.05.
しかし、同図下のグラフに示されるように、マウス胎児線維芽細胞に対しては、ｉＳＮ０４の３μＭ程度の曝露では、細胞の増殖を抑え込むことができなかった。すなわち、ｍｙｏＤＮは筋分化を特異的に促進する結果として細胞増殖を抑制するのであり、全ての細胞の増殖を抑制するわけではない。 However, as shown in the lower graph, exposure of mouse fetal fibroblasts to iSN04 of about 3 μM failed to suppress cell proliferation. That is, myoDN suppresses cell growth as a result of specifically promoting muscle differentiation, and does not suppress the growth of all cells.
（実施例６）
ベルベリン又はパルマチンによるｍｙｏＤＮの筋分化促進作用の増強効果を検証する実験を行った。それぞれ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で培養したマウス筋芽細胞にベルベリンのみ又はパルマチンのみをそれぞれ１μＭ、３μＭ又は１０μＭ曝露したものと、併せてｉＳＮ０４を０又は３μＭの濃度で曝露したサンプルについて、４８時間後にＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合を測定した。(Example 6)
Experiments were conducted to verify the enhancement effect of myoDN on muscle differentiation promoting action by berberine or palmatin. 48 hours for samples exposed to mouse myoblasts cultured at a density of 10 4 cells / well, respectively, with berberine alone or palmatin alone at 1 μM, 3 μM, or 10 μM, respectively, and iSN04 at a concentration of 0 or 3 μM Later, the appearance ratio of MHC positive muscle cells was measured.
図１０にその結果を示す。同図より明らかなように、ベルベリン（Ｂｅｒ）単体ではコントロール（白棒のＭＱ）よりもＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合が却って低下する。これはベルベリンは本来筋分化を抑制する作用を有する可能性があることを意味する。ところがｉＳＮ０４を３μＭ併せて曝露した場合、ｉＳＮ０４単体を投与したもの（黒棒のＭＱ）に対しＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合が１．５〜２倍程度増加する。これはベルベリンはｍｙｏＤＮの効果を増強する機能を有していることを意味する。 FIG. 10 shows the result. As is clear from the figure, berberine (Ber) alone has a lower appearance rate of MHC positive muscle cells than the control (white MQ). This means that berberine may originally have an action of suppressing muscle differentiation. However, when 3 μM of iSN04 is exposed together, the appearance ratio of MHC positive myocytes increases by about 1.5 to 2 times that of iSN04 administered alone (black MQ). This means that berberine has a function of enhancing the effect of myoDN.
パルマチン（Ｐａｌ）についても、ベルべリンよりも効果は穏やかであるが、ｍｙｏＤＮの効果を増強する性質を有している。一方で、ベルベリン単体投与で観察された弱い筋分化抑制効果は、パルマチン単体投与では認められなかった。 Palmatin (Pal) is also milder than berberine but has the property of enhancing the effect of myoDN. On the other hand, the weak muscle differentiation inhibitory effect observed with berberine alone was not observed with palmatin alone.
なお、ベルベリン又はパルマチンによるｉＳＮ０４の増強作用は、いずれの場合も、ｉＳＮ０４とベルベリン又はパルマチンのモル比が１：１のときに最も効果的であった。例えば図１０においてｍｙｏＤＮ（ｉＳＮ０４）３μＭに対してベルベリンを１０μＭ投与したとき（Ｂｅｒ１０）のＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合はベルベリンを３μＭ投与したとき（Ｂｅｒ３）の割合よりも若干低い。 The enhancement of iSN04 by berberine or palmatin was most effective in all cases when the molar ratio of iSN04 to berberine or palmatin was 1: 1. For example, in FIG. 10, when 10 μM of berberine is administered to 3 μM of myoDN (iSN04) (Ber10), the appearance ratio of MHC positive myocytes is slightly lower than that of 3 μM of berberine (Ber3).
（実施例７）
＜表３＞で示されたベルベリンによるｉＳＮ０４変異体（配列番号１９〜２７）の筋分化促進作用の増強効果を明らかにする実験を行った。それぞれ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で培養したマウス筋芽細胞にｉＳＮ０４又はその変異体のみを３μＭの濃度で曝露したサンプルと、併せてベルベリン３μＭを投与したサンプルについて、４８時間後にＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合を測定した。(Example 7)
An experiment was conducted to clarify the effect of enhancing the muscle differentiation promoting action of the iSN04 mutant (SEQ ID NOs: 19 to 27) by berberine shown in <Table 3>. MHC-positive myocytes were tested 48 hours later for samples in which iSN04 or its mutant alone was exposed to mouse myoblasts cultured at a density of 10 4 cells / well at a concentration of 3 μM, and in which 3 μM of berberine was administered. Appearance rate was measured.
結果を図１１に示す。ベルベリン（Ｂｅｒ）を加えない場合（白棒）、この条件下ではｉＳＮ０４又は変異型を曝露したときのＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合は２０％前後であるが、ベルベリンを加えた場合（黒棒）、変異型によって顕著な差が発生する。ｉＳＮ０４及び５’末端側から１１番目のＧをＴに置換したＧ１１Ｔ（配列番号２６）にのみベルベリンによる顕著なｍｙｏＤＮ活性増強効果が確認された。他の変異型については殆ど効果に変化が無いか（配列番号２２のｄｅｌ１５等）、却って効果が抑制される（配列番号１９の４−１８等）。 The results are shown in FIG. When berberine (Ber) is not added (white bar), the appearance ratio of MHC positive myocytes when exposed to iSN04 or a mutant is about 20% under this condition, but when berberine is added (black bar) A significant difference occurs depending on the mutant type. A significant myoDN activity-enhancing effect by berberine was confirmed only for iSN04 and G11T (SEQ ID NO: 26) in which the 11th G from the 5′-terminal side was replaced with T. For other mutants, there is almost no change in the effect (such as del15 of SEQ ID NO: 22), or the effect is suppressed (4-18 of SEQ ID NO: 19).
図８（実施例４）では、５番目と１１番目の塩基がＴかＧかはｍｙｏＤＮの筋分化促進効果には関係ないことが示されたが、ベルベリンによる増強作用の点からすれば、５番目の塩基として、Ｔがより好適であることが示される。 In FIG. 8 (Example 4), it was shown that whether the fifth and eleventh bases are T or G is not related to myoDN's muscle differentiation promoting effect, but in terms of the potentiating action by berberine, 5 T is shown to be more suitable as the second base.
（実施例８）
なお、上記実施例においては筋分化の検証にマウス筋芽細胞が用いられたが、本発明はこれに制限されるものではない。他の動物、例えば、鳥類であるニワトリの筋芽細胞を用いた実験でも、オリゴＤＮＡによる筋分化促進作用が認められた。(Example 8)
In the above examples, mouse myoblasts were used for verification of muscle differentiation, but the present invention is not limited to this. In experiments using myoblasts of other animals, for example, chickens such as birds, the muscle differentiation promoting action by oligo DNA was recognized.
本実施例ではそれぞれ直径３ｃｍのディッシュあたり１０５ｃｅｌｌｓの密度で培養したニワトリ筋芽細胞にｉＳＮ０４’を０μＭ、３μＭ又は１０μＭ曝露したものと、ベルベリン１０μＭを併用したサンプルについて、４８時間後にＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合を測定した。In this example, MHC
結果を図１２（ａ）に示す。コントロール（図中横軸０μＭの白棒）と比べ、ｉＳＮ０４’を３μＭ又は１０μＭ投与したサンプルではＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合は倍増している。ベルベリン（Ｂｅｒ）を併用した場合、ＭＨＣ陽性筋細胞の出現割合はさらに倍増している。本実験でも、ｉＳＮ０４’とベルベリンのモル比が１：１のとき（ともに１０μＭ）に、最も高い筋分化促進作用が認められた。 The results are shown in FIG. Compared with the control (white bar with 0 μM on the horizontal axis in the figure), in the sample administered with iSN04 ′ at 3 μM or 10 μM, the appearance ratio of MHC positive muscle cells is doubled. When berberine (Ber) is used in combination, the appearance ratio of MHC positive muscle cells is further doubled. Also in this experiment, when the molar ratio of iSN04 'to berberine was 1: 1 (both 10 μM), the highest muscle differentiation promoting effect was observed.
さらに図１０（実施例６）と同様の実験をニワトリ筋芽細胞に対しても行った。結果を図１２（ｂ）に示す。ニワトリ筋芽細胞に対しても、ベルベリン（Ｂｅｒ）単体では筋分化を抑制するように作用し、ｉＳＮ０４と組み合わせると顕著な筋分化促進作用が確認された。また、パルマチン（Ｐａｌ）についても、ベルべリンよりも効果は穏やかであるが、ｉＳＮ０４の効果を増強することが確認された。 Further, an experiment similar to that shown in FIG. 10 (Example 6) was performed on chicken myoblasts. The results are shown in FIG. Also for chick myoblasts, berberine (Ber) alone acted to suppress muscle differentiation, and when combined with iSN04, a remarkable muscle differentiation promoting action was confirmed. In addition, it was confirmed that palmatin (Pal) enhances the effect of iSN04, although the effect is milder than that of berberine.
（実施例９）
ｍｙｏＤＮのヒト横紋筋肉腫細胞の増殖の抑制効果について併せてベルベリンの効果について実験を行った。ヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１、ＲＤ、ＥＲＭＳ１の５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのサンプルそれぞれに対し、１０μＭのｉＳＮ０４を曝露し、２４〜９６時間経過後の細胞数を測定した。結果を図１３に示す。腫瘍株によってｉＳＮ０４の抑制効果が異なることが示されている。Example 9
Experiments were also conducted on the effect of berberine on the inhibitory effect of myoDN on the growth of human rhabdomyosarcoma cells. 10 μM iSN04 was exposed to each sample of 5 × 10 4 cells / well of human rhabdomyosarcoma cells KYM1, RD, and ERMS1, and the number of cells after 24 to 96 hours was measured. The results are shown in FIG. It has been shown that the suppressive effect of iSN04 varies depending on the tumor line.
図１３において（ａ）のグラフはヒト横紋筋肉腫細胞ＫＹＭ１にｉＳＮ０４を曝露した結果を示すものであり、図７（ｃ）で示されたグラフとほぼ同じ条件で追試されたものである。コントロール（Ｃｔｒｌ）と比べて筋肉腫細胞の増殖が半分以下（７２時間後）に抑えられていることが本実施例においても再現されている。一方で、ＲＤ株については９６時間後に０．０５未満のｐ値で２５％程度の抑制が認められた（図１３（ｂ））。ＥＲＭＳ１株では抑制効果が１０％程度であった（同図（ｃ））。 In FIG. 13, the graph of (a) shows the result of exposing iSN04 to human rhabdomyosarcoma cells KYM1, and was examined under substantially the same conditions as the graph shown in FIG. 7 (c). It is also reproduced in this example that the growth of myoma cells is suppressed to half or less (after 72 hours) as compared with the control (Ctrl). On the other hand, about RD strain | stump | stock, about 25% suppression was recognized by p value less than 0.05 after 96 hours (FIG.13 (b)). In the ERMS1 strain, the inhibitory effect was about 10% ((c) in the figure).
ＲＤ株についてはｉＳＮ０４と併せてベルベリンを投与すると増殖抑制効果が劇的に改善することが判った。図１４にコントロール（Ｃｔｒｌ）、ｉＳＮ０４のみ（１０μＭ）、ｉＳＮ０４と等モルのベルベリン（Ｂｅｒ）（１０μＭ）を併用したときの９６時間後の細胞数の測定結果を示す。ｉＳＮ０４とベルベリンを併用した場合、ｉＳＮ０４のみの場合と比べて約２５％、コントロールと比べて約５０％の増殖抑制効果が示された。 For RD strains, it was found that when berberine was administered in combination with iSN04, the growth inhibitory effect was dramatically improved. FIG. 14 shows the measurement results of the number of cells after 96 hours when control (Ctrl), iSN04 alone (10 μM), and iSN04 and equimolar berberine (Ber) (10 μM) were used in combination. When iSN04 and berberine were used in combination, the growth inhibitory effect was about 25% as compared with iSN04 alone and about 50% compared with control.
以上、本発明によれば、オリゴＤＮＡにより筋分化を強力に促進することが可能となる。しかも、上記オリゴＤＮＡは化学合成が可能で安定構造を有すため、将来的に大量に供給及び保存ができ、また乳酸菌のゲノム配列由来であるため、安全性も高いと期待される。さらに、安価でしかも安全なベルベリン又はその類縁体化合物を併用することによりオリゴＤＮＡの筋分化促進作用を増強することが可能となる。 As described above, according to the present invention, muscle differentiation can be strongly promoted by oligo DNA. Moreover, since the oligo DNA can be chemically synthesized and has a stable structure, it can be supplied and stored in large quantities in the future, and since it is derived from the genomic sequence of lactic acid bacteria, it is expected to be highly safe. Furthermore, it becomes possible to enhance the muscle differentiation promoting action of oligo DNA by using inexpensive and safe berberine or its analog compound.
本発明は、筋肉減弱症状（サルコペニア）を含むロコモティブ症候群の予防及び／又は治療、横紋筋肉腫の増殖及び／又は転移の抑制、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞又は体性幹細胞の筋分化誘導、筋疾患の再生医療、創薬のスクリーニングに供する骨格筋幹細胞（衛星細胞）、骨格筋前駆細胞（筋芽細胞）及び骨格筋細胞からなる群より選択される少なくとも１種の作成、食肉用家畜及び/又は家禽の飼料の添加物、食肉用家畜及び/又は家禽の骨格筋の形成及び／又は生育の促進に利用することができる。 The present invention relates to the prevention and / or treatment of locomotive syndrome including muscle weakness symptoms (sarcopenia), the suppression of the proliferation and / or metastasis of rhabdomyosarcoma, the induction of muscle differentiation of ES cells, iPS cells or somatic stem cells, muscle diseases Regenerative medicine, preparation of at least one selected from the group consisting of skeletal muscle stem cells (satellite cells), skeletal muscle progenitor cells (myoblasts) and skeletal muscle cells used for drug discovery screening, livestock for meat and / or It can be used to promote the formation and / or growth of poultry feed additives, livestock for meat and / or skeletal muscle of poultry.
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