JPWO2018042776A1 - Dna結合タンパク質の結合領域の近傍に所望のdna断片を挿入する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)DNA分子に結合したDNA結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のDNA断片を挿入する方法であって、前記DNA結合タンパク質に対する特異的結合物質を利用して、トランスポザーゼ結合配列と前記所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するDNA断片と、前記結合領域とを近接させる工程と、前記トランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼを結合させる工程と、前記トランスポザーゼを活性化し、その結果、前記所望の塩基配列のDNA断片が前記結合領域の近傍に挿入される工程と、を備える方法。
(2)前記所望の塩基配列を起点として前記DNA分子を遺伝子増幅し、増幅産物を得る工程と、前記増幅産物の塩基配列を解析する工程と、を更に備える、(1)に記載の方法。
(3)前記所望の塩基配列がプロモーター配列を含み、前記遺伝子増幅が、前記プロモーター配列にRNAポリメラーゼを接触させて前記プロモーター配列の下流のDNAを転写してRNAを生成することにより行われる、(2)に記載の方法。
(4)前記所望の塩基配列が前記プロモーター配列の下流に識別配列を更に含む、(3)に記載の方法。
(5)トランスポザーゼ結合配列と所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するDNA断片と、DNA結合タンパク質に対する特異的結合物質又は前記特異的結合物質に対する特異的結合物質との結合体。
(6)前記所望の塩基配列がプロモーター配列を含む、(5)に記載の結合体。
(7)前記所望の塩基配列が前記プロモーター配列の下流に識別配列を更に含む、(6)に記載の結合体。
1実施形態において、本発明は、DNA分子に結合したDNA結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のDNA断片を挿入する方法であって、前記DNA結合タンパク質に対する特異的結合物質を利用して、トランスポザーゼ結合配列と前記所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するDNA断片と、前記結合領域とを近接させる工程(a)と、前記トランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼを結合させる工程(b)と、前記トランスポザーゼを活性化し、その結果、前記所望の塩基配列のDNA断片が前記結合領域の近傍に挿入される工程(c)と、を備える方法を提供する。以下、本実施形態の方法をChromatin Integration Labeling Technology(ChILT)法という場合がある。
図1Cの例では、パラホルムアルデヒド固定された細胞標本Sを試料としてChILT法を実施している。まず、ヒストン20に対する特異的結合物質30を利用して、DNA断片40と結合領域11とを近接させる。ここで、特異的結合物質30を利用して近接させるとは、図1Cの例のようにDNA断片40が結合した特異的結合物質30を、その抗原であるヒストン20に結合させることにより、DNA断片40と結合領域11とを近接させることであってもよい。あるいは、特異的結合物質30が、例えばヒストン20に対するマウスIgG抗体であり、このマウスIgG抗体を1次抗体としてヒストン20に結合させ、続いて、DNA断片40が結合した抗マウスIgG抗体を2次抗体として上記の1次抗体に結合させることにより、DNA断片40と結合領域11とを近接させることであってもよい。
続いて、トランスポザーゼ結合配列41にトランスポザーゼ50を結合させる。図2は、試料にトランスポザーゼ50を添加して、トランスポザーゼ結合配列41にトランスポザーゼ50を結合させた状態をを示す。
続いて、上記のトランスポザーゼ50を活性化する。トランスポザーゼ50の活性化は、例えば、2価の金属イオンをバッファー中に添加すること等により実施することができる。
ChILT法において、特異的結合物質としては、抗体の他にも、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に標的物質又はその断片を抗原として免疫することによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Fv、Fab、scFv等が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
また、図1C〜図5の例では、ゲノムDNA10に挿入する所望の塩基配列は、T7プロモーター配列42の下流に識別配列43が連結した塩基配列であったが、所望の塩基配列はこれに限定されない。例えば、所望の塩基配列として、T7プロモーター配列42の代わりにSP6プロモーター配列等の別のプロモーター配列を用いてもよい。あるいは、所望の塩基配列は、プロモーター配列のみから構成されていてもよい。あるいは、所望の塩基配列は、識別配列のみから構成されていてもよい。また、識別配列としては、確率的に出現頻度が低い塩基配列であれば特に制限されず、例えば約4〜20塩基程度の任意の塩基配列を用いることができる。
ChILT法は、前記所望の塩基配列(図1C〜図5の例ではT7プロモーター配列42の下流に識別配列43が連結した塩基配列)を起点としてDNA10を遺伝子増幅し、増幅産物を得る工程と、前記増幅産物の塩基配列を解析する工程と、を更に備えていてもよい。これにより、所望のDNA断片が挿入されたゲノム上の位置を解析することができる。
遺伝子増幅としては、例えば、挿入した塩基配列に相補的なプライマーとランダムプライマーとを組み合わせたPCR、ポリメラーゼ(RNAポリメラーゼ、DNA依存性DNAポリメラーゼ等)を用いた転写等が挙げられる。本明細書において、「所望の塩基配列を起点として遺伝子増幅する」とは、結合領域11の近傍に挿入された所望の塩基配列の一部又は全部を利用してゲノムDNA10を遺伝子増幅することを意味する。
図6(a)は、図4又は図5(a)に示すDNA10にT7ポリメラーゼを作用させて、T7プロモーター配列42の下流のDNA10をRNA60に転写した状態を示す図である。また、図6(b)は、図5(b)に示すDNA10にT7ポリメラーゼを作用させて、T7プロモーター配列42の下流のDNA10をRNA60に転写した状態を示す図である。
1実施形態において、本発明は、トランスポザーゼ結合配列と所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するDNA断片と、DNA結合タンパク質に対する特異的結合物質又は前記特異的結合物質に対する特異的結合物質との結合体を提供する。
従来法であるChIP−Seq解析により、約1000個のマウス骨格筋芽細胞を用いて、DNA結合タンパク質である、リジン4トリメチル化修飾されたヒストンH3(H3K4me3)の、ゲノムDNA上の結合位置を解析した。
マウス骨格筋芽細胞1000個を1mLの培地に懸濁し、1.5mLシリコナイズチューブに入れた。続いて、100μLの固定溶液(37%ホルムアルデヒド)を添加し、5分間、室温で静置し、DNAとDNA結合タンパク質とをクロスリンクした。
上記の可溶性クロマチン分画に、2μgのウサギ抗マウスIgG抗体と2μgのマウス抗H3K4me3抗体とを予め反応させた抗体複合体溶液と、20μLのヤギ抗ウサギIgG抗体が結合した磁性粒子(Dynabeads M−280)とを添加し、ローテーターで一晩、4℃で撹拌した。
100μLのChIP溶出バッファー(50mM Tris−HCl(pH8.0),10mM EDTA,1%SDS)を上記の磁性粒子に加え、ボルテックスミキサーで懸濁し、更に5M NaCl 5μLを添加した。続いて、65℃で4時間以上加熱し、DNAとDNA結合タンパク質のクロスリンクをはずした。
続いて、次世代シークエンサーにより回収されたDNAの塩基配列を解析した。
図7(a)は、従来法であるChIP−Seq解析により、約1000個の細胞を用いてEef1a1遺伝子座へのH3K4me3の結合をマッピングした結果を示すグラフである。
マウス骨格筋芽細胞を用いて、ChILT法により、DNA結合タンパク質である、リジン4トリメチル化修飾されたヒストンH3(H3K4me3)の、ゲノムDNA上の結合位置を1細胞レベルで解析した。
まず、スライドガラスにマウス骨格筋芽細胞を播種した。続いて、16時間培養後、培地を除去し、PBSで洗浄した。続いて、1%パラホルムアルデヒド溶液を添加して室温で5分間静置し、細胞を固定後、PBSで洗浄した。
続いて、固定した細胞試料にブロッキング剤(商品名「Blocking One−P」、ナカライテスク社)を加え室温で10分間静置後、PBSで洗浄した。続いて、0.1×Blocking One−Pで希釈した抗体複合体(2μg/mL抗H3K4me3抗体及び核酸標識2次抗体を予め反応させたもの)を添加し、37℃で2時間反応させた後、PBSで洗浄した。この結果、核酸標識2次抗体に標識したDNA断片とゲノムDNA上のH3K4me3結合領域とが近接した。
続いて、試料にTN5トランスポザーゼを85μg/mLずつ添加し、室温で10分間放置した。これにより、核酸標識2次抗体に標識されたDNA断片中のトランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼが結合した。
続いて、試料に、トランスポザーゼ結合配列を有する遊離のDNA断片(以下、「oligo3−4」という。)を添加し、室温で1時間反応させた後、PBSで洗浄した。oligo3−4は、配列番号3に記載の塩基配列からなるDNA断片と、配列番号4に記載の塩基配列からなるDNA断片とをアニーリングさせたものであった。oligo3−4の2本鎖DNA領域は、TN5トランスポザーゼの結合配列であった。
続いて、レーザーマイクロダイセクションにより、対象細胞を1個ずつ切り出し、それぞれマイクロチューブに回収した。
ここでは、遺伝子増幅として、T7RNAポリメラーゼによる転写を行った。まず、切り出した各細胞を1×T7RNAポリメラーゼバッファーで洗浄した。続いて、インビトロ転写溶液(T7RNAポリメラーゼバッファー,ATP,CTP,GTP,UTP,RNaseインヒビター,T7RNAポリメラーゼ)を加え、37℃で16時間反応させた。これにより、挿入したDNA断片に含まれていたT7RNAプロモーター配列を起点として、ゲノムDNAが転写された。
続いて、精製したRNAを逆転写してcDNAを調製し、次世代シークエンサーを用いて塩基配列を解析し、ゲノム上にマッピングした。
図7(b)〜(d)は、それぞれ、Eef1a1遺伝子座へのH3K4me3の結合を、ChILT法により1細胞レベルで解析してマッピングした代表的な結果を示すグラフである。
ChILT法により、様々なDNA結合タンパク質のゲノムDNA上の結合を1細胞レベルで解析した。細胞としてマウス骨格筋芽細胞を用いた。また、1次抗体として、下記表1に示す抗DNA結合タンパク質抗体を使用した。また、2次抗体として、実験例2で用いたものと同様のDNA断片で標識した、抗マウスIgG抗体又は抗ウサギIgG抗体を使用した。
実験例2と同様にして、スライドガラス上でマウス骨格筋芽細胞を培養して固定し、PBSで洗浄した。
続いて、実験例2と同様にして、固定した細胞試料にブロッキング剤(商品名「Blocking One−P」、ナカライテスク社)を加え室温で10分間静置後、PBSで洗浄した。続いて、0.1×Blocking One−Pで希釈した抗体複合体(1次抗体及び核酸標識2次抗体を予め反応させたもの)を添加し、37℃で2時間反応させた後、PBSで洗浄した。
続いて、レーザーマイクロダイセクションにより、対象細胞を1個ずつ切り出し、それぞれマイクロチューブに回収した。
回収した各細胞について、実験例2と同様にしてT7RNAポリメラーゼによる転写を行い、転写されたRNAを精製した。続いて、精製したRNAを逆転写してcDNAを調製し、次世代シークエンサーを用いて塩基配列を解析し、ゲノム上にマッピングした。
図8Aは、表1に示す様々な1次抗体を用いたChILT法により、DNA結合タンパク質の結合を1細胞レベルで解析してマッピングした結果を示すグラフである。各抗体複合体につき2細胞ずつ解析を行った。
Claims (7)
- DNA分子に結合したDNA結合タンパク質の結合領域の近傍に所望の塩基配列のDNA断片を挿入する方法であって、
前記DNA結合タンパク質に対する特異的結合物質を利用して、トランスポザーゼ結合配列と前記所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するDNA断片と、前記結合領域とを近接させる工程と、
前記トランスポザーゼ結合配列にトランスポザーゼを結合させる工程と、
前記トランスポザーゼを活性化し、その結果、前記所望の塩基配列のDNA断片が前記結合領域の近傍に挿入される工程と、
を備える方法。 - 前記所望の塩基配列を起点として前記DNA分子を遺伝子増幅し、増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物の塩基配列を解析する工程と、
を更に備える、請求項1に記載の方法。 - 前記所望の塩基配列がプロモーター配列を含み、
前記遺伝子増幅が、前記プロモーター配列にRNAポリメラーゼを接触させて前記プロモーター配列の下流のDNAを転写してRNAを生成することにより行われる、
請求項2に記載の方法。 - 前記所望の塩基配列が前記プロモーター配列の下流に識別配列を更に含む、請求項3に記載の方法。
- トランスポザーゼ結合配列と所望の塩基配列とを含む塩基配列を有するDNA断片と、DNA結合タンパク質に対する特異的結合物質又は前記特異的結合物質に対する特異的結合物質との結合体。
- 前記所望の塩基配列がプロモーター配列を含む、請求項5に記載の結合体。
- 前記所望の塩基配列が前記プロモーター配列の下流に識別配列を更に含む、請求項6に記載の結合体。
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