JPWO2018004004A1 - 核酸複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
また、核酸医薬は、細胞内における標的選択性と活性の高さから抗体、低分子医薬に次ぐ、次世代医薬として期待されている。
しかしながら、核酸医薬は、標的組織への送達が困難であることが問題点として挙げられる。
また、特許文献3には、特許文献1および2と同様の糖リガンド−テザーユニットを有する以下の構造を有する核酸複合体が開示されている。
CD209(別名 DC−SIGN, Dendritic Cell−Specific Intercellular Adhesion Molecule−3−Grabbing Nonintegrin)およびCD206(別名 MR1, Macrophage Mannose Rceptor 1)等のC型レクチンは、樹状細胞、マクロファージ、好中球等の免疫系細胞に発現しており、その機能の一つとしてウイルスや細菌等の外来異物の捕捉が報告されている。CD206は、マクロファージや樹状細胞の表面に発現し、CD209は皮膚や粘膜組織上の樹状細胞、扁桃、リンパ節、脾臓といったリンパ組織の樹状細胞の表面に発現しており、両者ともにHIV等のウイルスの補足に関与することが知られている(非特許文献2,3)。
CD206およびCD209を利用した送達技術として、特許文献5には、マンノースやフコース等の糖分子と抗原のコンジュゲートを免疫誘導に利用することが開示されている。
(1)
糖鎖リガンドがリンカーを介してオリゴヌクレオチドと結合した核酸複合体であって、糖鎖リガンドが、糖鎖リガンドの非還元末端にO結合マンノースを有する、核酸複合体。
(2)
糖鎖リガンドが、CD209および/またはCD206に結合親和性を示す構造を有する、(1)に記載の核酸複合体。
(3)
糖鎖リガンドが、O結合マンノースの1位でエーテル結合を介してシクロヘキサン骨格と結合している、(1)または(2)に記載の核酸複合体。
(4)
糖鎖リガンドが、下記構造を有する、(1)〜(3)のいずれかに記載の核酸複合体。
R1およびR2は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基、置換または非置換の炭素数2〜20のアルケニル基、置換または非置換の炭素数3〜20のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Y1およびY2は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびNR3からなる群から選択される基であり、
R3は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基である。)
(5)
糖鎖リガンドが、下記構造で示される、(1)〜(4)のいずれかに記載の核酸複合体。
R1 ’およびR2 ’は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基、置換または非置換の炭素数2〜20のアルケニル基、置換または非置換の炭素数3〜20のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Y1 ’およびY2 ’は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびNR3 ’からなる群から選択される基であり、
R3 ’は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基である。)
(6)
Y1およびY2またはY1 ’およびY2 ’がNHである、(4)または(5)に記載の核酸複合体。
(7)
R1およびR2、またはR1 ’およびR2 ’が置換または非置換のアラルキル基である、(6)に記載の核酸複合体。
(8)
糖鎖リガンドが、下記構造で示される、(1)〜(7)のいずれかに記載の核酸複合体。
R1 ’’およびR2 ’’は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基、置換または非置換の炭素数2〜20のアルケニル基、置換または非置換の炭素数3〜20のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Y1 ’’およびY2 ’’は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびNR3 ’’からなる群から選択される基であり、
R3 ’’は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基である。)
(9)
糖鎖リガンドが、下記構造で示される、(8)に記載の核酸複合体。
R1 ’’’およびR2 ’’’は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基、置換または非置換の炭素数2〜20のアルケニル基、置換または非置換の炭素数3〜20のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Y1 ’ ’’およびY2 ’ ’’は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびNR3 ’’からなる群から選択される基であり、
R3 ’ ’’は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基である。)
(10)
糖鎖リガンドを2〜8個有する、(1)〜(9)のいずれかに記載の核酸複合体。
(11)
リンカーが、下記構造のいずれかの構造を有する、(1)〜(10)のいずれかに記載の核酸複合体。
X1は、CHまたは窒素原子である。
X2〜X4は、それぞれ独立して、CHまたは窒素原子である。)
(12)
リンカーが、下記構造を有する、(1)〜(11)のいずれかに記載の核酸複合体。
リンカーが、下記構造のいずれかの構造を有する、(1)〜(12)のいずれかに記載の核酸複合体。
リンカーが、下記構造を有する、(1)〜(13)のいずれかに記載の核酸複合体。
n1は、1〜100の整数である。)
(15)
リンカーが、下記構造のいずれかの構造を有する、(1)〜(13)のいずれかに記載の核酸複合体。
n2およびn3は、それぞれ独立して、1〜100の整数である。)
(16)
前記オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、(1)〜(15)のいずれかに記載の核酸複合体。
(17)
(1)〜(16)のいずれかに記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
(18)
細胞内に導入するための、(17)に記載の医薬組成物。
(19)
前記細胞が樹状細胞またはマクロファージである、(18)に記載の医薬組成物。
(20)
静脈内投与または皮下投与される、(17)〜(19)のいずれかに記載の医薬組成物。
(21)
(1)〜(16)のいずれかに記載の核酸複合体または(17)〜(20)のいずれかに記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
(22)
前記患者が哺乳動物である、(21)に記載の治療または予防方法。
核酸複合体は、糖鎖リガンドと、リンカーと、オリゴヌクレオチドとをその分子内構成要素として有し、糖鎖リガンドと、オリゴヌクレオチドとが、リンカーを介して結合することにより連結する。糖鎖リガンド又はオリゴヌクレオチドと、リンカーとの結合は、好ましくは共有結合である。
本発明の核酸複合体は、糖鎖リガンド―リンカー―オリゴヌクレオチドという構造を有する。
すなわち、糖鎖リガンド、リンカー及びオリゴヌクレオチドの各構造を有する従来公知の核酸複合体において、糖鎖リガンドを本発明における非還元末端にO結合マンノースを有する糖鎖リガンドとした核酸複合体は、本発明の範囲内となる。
O結合マンノースの構造としては、下記構造が挙げられる。
非還元末端がO結合マンノースであるとは、糖鎖リガンドの最外部において、O結合マンノースを有し、他の構造をさらに有していないことを意味する。
糖類のユニットである単糖としては、天然に存在するものとして、例えば、アロース、アルトース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリスルロース、フルクトース、フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、ガラクトサミニトール、N−アセチル−ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、N−アセチル−グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース−6−リン酸、グロース、グリセルアルデヒド、グリセロマンノ−ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース−6−リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロース、およびキシルロース等が挙げられ、これら単糖がグリコシド結合により結合し糖類として天然に存在している。
本発明においては、糖鎖リガンドは、非天然構造を含むものが好ましく、非天然構造として上記単糖以外の構造を含むことを意味する。
糖類における各単糖は、D体またはL体であってもよく、D体とL体の任意割合による混合物であってもよい。
糖類は、デオキシ糖(アルコールヒドロキシ基を水素原子に置換したもの)、アミノ糖(アルコールヒドロキシ基をアミノ基に置換したもの)、チオ糖(アルコールヒドロキシ基をチオールに置換したもの、またはC=OをC=Sに置換したもの、または環酸素を硫黄に置換したもの)、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖(環炭素を窒素に置換したもの)、イミノ糖(環酸素を窒素に置換したもの)、ホスファノ糖(環酸素をリンに置換したもの)、ホスファ糖(環炭素をリンに置換したもの)、C−置換単糖(非末端炭素原子における水素原子を炭素原子で置換したもの)、不飽和単糖、アルジトール(カルボニル基をCHOH基で置換したもの)、アルドン酸(アルデヒド基をカルボキシ基に置換したもの)、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸などを含んでいてもよい。
アミノ糖としては、糖類におけるアミノ単糖として、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン(kansosamine)、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン(purpurosamine)、ロドサミンなどが挙げられる。また、アミノ糖のアミノ基は、アセチル基などで置換されていてもよい。
本発明においては、非還元末端がO結合マンノースであることにより、CD209および/またはCD206に結合親和性を示すこととなる。
糖鎖リガンドが、CD209および/またはCD206に結合親和性を示すことにより、樹状細胞またはマクロファージの細胞表面に発現する受容体に核酸複合体が結合し、当該細胞にオリゴヌクレオチドを核酸医薬として送達し得る。
シクロヘキサン骨格は、糖鎖リガンドにおける非天然構造として存在し、マンノースの1位でエーテル結合を介してシクロヘキサン骨格と結合した構造としては、下記構造を有することが挙げられる。
R1およびR2は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基、置換または非置換の炭素数2〜20のアルケニル基、置換または非置換の炭素数3〜20のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Y1およびY2は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびNR3からなる群から選択される基であり、
R3は、水素原子または置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基である。
本明細書において、それぞれ独立してとは、各基が、同時に規定される他の基と独立して選択肢の中から選択される基であることを意味し、同一または異なっていてもよい。
置換基の数は、例えば、1〜3であり、複数の置換基を有する場合、複数の置換基は、同一または異なっていてもよい。
本明細書において、置換または非置換の炭素数2〜20のアルケニル基、置換または非置換の炭素数3〜20のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、お置換または非置換のアラルキル基における置換基について、置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基における置換基と同義である。
置換または非置換のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基等の芳香環が挙げられるが、特に限定されない。
置換または非置換のヘテロアリール基としては、窒素原子、酸素原子または硫黄原子を環内に有する複素芳香環を意味し、例えば、1〜3個の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有する5〜6員の芳香環が挙げられる。
置換または非置換のヘテロ脂環基としては、窒素原子、酸素原子または硫黄原子を環内に有する複素脂肪族環を意味し、例えば、1〜3個の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有する5〜6員の脂肪族環が挙げられる。
置換または非置換のアラルキル基としては、置換または非置換のアルキル基が、置換または非置換のアリール基で置換された基であればよく、置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基において置換基として1以上のアリール基を含む基が挙げられ、具体的には、置換または非置換のベンジル基もしくはフェネチル基等が挙げられる。
R1 ’、R2 ’、Y1 ’、Y2 ’およびR3 ’は、それぞれ対応する、R1、R2、Y1、Y2およびR3と同義である。
R1、R2、Y1およびY2は、上記と同義であり、
R1 ’’、R2 ’’、Y1 ’’、Y2 ’’およびR3 ’’は、それぞれ対応する、R1、R2、Y1、Y2およびR3と同義であり、好ましい置換基の組み合わせも同義である。
R1 ’、R2 ’、Y1 ’およびY2 ’は、前記と同義であり、
R1 ’’’、R2 ’’’、Y1 ’’’、Y2 ’’’およびR3 ’’’は、それぞれ対応する、R1、R2、Y1、Y2およびR3と同義であり、好ましい置換基の組み合わせも同義である。
本発明においては、リンカーとオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドを構成する糖部分の3’位または5’位を介してリンカーと結合するだけでなく、ヌクレオチドを構成する塩基部分を介してリンカーと結合していてもよい。本発明においては、オリゴヌクレオチドは、リンカーとオリゴヌクレオチドを結合する構造を有する基として理解されてよく、例えば、オリゴヌクレオチドが、−O−P(Z)(Z’)O−(式中、ZおよびZ’は、それぞれ独立して、酸素原子またはイオウ原子である。)を介してリンカーと結合している場合、Xとしてのオリゴヌクレオチドとしては、−O−P(Z)(Z’)O−オリゴヌクレオチドとして理解されてもよい。
また、オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドであってもよい。
核酸複合体におけるリンカーとオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドなどのヌクレオチドで結合してもよいが、例えばオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端で結合する。オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合には、リンカーは、二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3’末端または5’末端と結合していることが好ましいが、当該結合に限定されるものではない。
本発明において、標的mRNAに対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンスヌクレオチドと称し、アンチセンスヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンスヌクレオチドとも称する。
ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えば、ヌクレオチドに修飾を施したヌクレオチド誘導体等が挙げられ、例えばDNAまたはRNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、または可視化させるために、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’−修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
2’−修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの2’−OH基がOR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、BrおよびIからなる群(Rはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数1〜6のアルキルであり、R’はアルキレン、好ましくは炭素数1〜6のアルキレンである)から選択される置換基で置換された2’−修飾ヌクレオチドが挙げられ、2’−修飾としては、好ましくはF、メトキシ基およびエトキシ基での置換が挙げられる。また、2−(methoxy)ethoxy基、3−aminopropoxy基、2−[(N,N−dimethylamino)oxy]ethoxy基、3−(N,N−dimethylamino)propoxy基、2−[2−(N,N−Dimethylamino)ethoxy]ethoxy基、2−(methylamino)−2−oxoethoxy基、2−(N−methylcarbamoyl)ethoxy基および2−cyanoethoxy 基からなる群から選択される置換基で置換された2’−修飾ヌクレオチド等も挙げられる。
また、糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)も好適に用いられる。具体的には、2´位の酸素原子と4´位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA) [Tetrahedron Letters, 38, 8735 (1997)およびTetrahedron, 54, 3607 (1998)]、エチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)]、Constrained Ethyl (cEt)[The Journal of Organic Chemistry 75, 1569 (2010)]、Amido−Bridged Nucleic Acid (AmNA)[Chem Bio Chem 13, 2513 (2012)]および2’−O,4’−C−Spirocyclopropylene bridged nucleic acid (scpBNA)[Chem. Commun., 51, 9737 (2015)]等が挙げられる。
さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、ペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等も糖部修飾ヌクレオチドとして挙げられる。
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられ、好ましくはリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチドが挙げられる。
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜6のアルキル基、ハロゲン基で置換されたもの、メチル基が水素原子、ヒドロキシメチル基、炭素数2〜6のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルカノイル基、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものが挙げられる。なお、シトシン(C)の代わりに5−メチルシトシン(5−mC)を塩基修飾ヌクレオチドとして用いることも、本発明の好ましい形態の一つである。
ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に、ペプチド、蛋白質、糖、脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素など、別の化学物質を、直接またはリンカーを介して付加したものもあげられ、具体的には、5’−ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6−FAM付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等があげられる。
ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
オリゴヌクレオチドは、その分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子(同位体)で置換されたものも包含する。
本明細書において「相補的」とは、2つのヌクレオチド配列が完全に相補する場合だけでなく、ヌクレオチド配列間で0〜30%、0〜20%または0〜10%のミスマッチ塩基を有することができ、例えば、標的mRNAに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的mRNAの部分塩基配列と完全に相補する塩基配列において、1つまたは複数の塩基の置換を含んでよいことを意味する。具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の標的配列に対して1〜8個、好ましくは1〜6個、1〜4個、1〜3個、特に2個または1個のミスマッチ塩基を有していてもよい。
また、「相補的」とは、一方のヌクレオチド配列が、他方のヌクレオチド配列と完全に相補する塩基配列において、1つまたは複数の塩基が付加および/または欠失した配列である場合を包含する。例えば、標的mRNAとアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける塩基の付加および/または欠失により、アンチセンス鎖および/または標的mRNA領域に1個または2個のバルジ塩基を有してもよい。
ただし、以下、「相補的」と記載する箇所において、「相補」の意味も包含する形で記載する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドには、標的となるDNA、mRNA前駆体、mRNA、microRNA前駆体またはmicroRNAと完全に相補的であるもののみならず、DNA、mRNA前駆体、mRNA、microRNA前駆体またはmicroRNAとストリジェントな条件でハイブリダイズできる限り、1もしくは数個のミスマッチが存在するものも含まれる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、標的遺伝子にハイブリダイズする核酸であれば、ヘアピンオリゴマー、環状オリゴマーの形態中に導入されてもよく、内部または末端のバルジまたはループなどの構造要素を含有してもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内に導入されると、相補的なmRNA前駆体またはmRNAと結合し蛋白質に翻訳されるのを立体的に阻害して、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
またアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内において、相補的なmicroRNA前駆体またはmicroRNAと結合し、microRNAの機能を立体的に阻害することもできる。
またアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内において、相補的なmRNA及びmRNA前駆体と結合し、mRNA及びmRNA前駆体を切断することもある。このような例として、RNAとDNAの二重鎖のRNA鎖を切断するエンドヌクレアーゼであるRNaseHを介した作用が知られている。本発明の細胞内のアンチセンスオリゴヌクレオチドがmRNA及びmRNA前駆体と二重鎖を形成するとRNaseHに認識され、相補的なmRNA鎖を酵素的に分解することができる。
RNaseHによるmRNA及びmRNA前駆体の切断を誘導するには、4〜80個の連続したDNA領域を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。この場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは0〜80%の糖部修飾ヌクレオチドを持つことが好ましく、10〜60%がより好ましく、20〜50%がさらに好ましい。また、糖部修飾ヌクレオチドを持つ場合の連続したDNA領域は、4〜20個がより好ましく、4〜15個がさらに好ましく、5〜10個が最も好ましい。更に、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける糖部修飾ヌクレオチドの位置は、5’末端近傍および/または3’末端近傍に配置することが好ましく、5’端から全長の長さの25%以内の位置および/または3’端から全長の長さの25%以内の位置に配置することがより好ましい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴ核酸と二重鎖を形成させ、二重鎖核酸として細胞内に導入することで標的遺伝子の発現抑制を誘導することもできる(国際公開第2005/113571号を参照)。この場合の二重鎖核酸をリガンドで修飾する位置は、相補的なオリゴ核酸の5’末端または3’末端が好ましい。
本発明で用いられる二本鎖のオリゴヌクレオチドは、標的mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とが、二重鎖を形成することができればいずれの長さでもよいが、二重鎖を形成できる配列の長さは、通常11〜35塩基であり、15〜30塩基が好ましく、17〜25塩基がより好ましく、17〜23塩基がさらに好ましく、19〜23塩基が特に好ましい。
本発明で用いられる、標的タンパク質の発現を抑制する二本鎖のオリゴヌクレオチドとしては、標的mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であって、かつ標的タンパク質の発現を抑制する一本鎖核酸、もしくは標的mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなり、かつ標的タンパク質の発現を抑制する二本鎖核酸が好適に用いられる。
二本鎖のオリゴヌクレオチドを構成する一本鎖のオリゴヌクレオチドは、通常11〜30塩基からなるが、15〜29塩基からなることが好ましく、15〜27塩基からなることがより好ましく、15〜25塩基からなることがさらに好ましく、17〜23塩基からなることが特に好ましい。
突出部を有する二本鎖のオリゴヌクレオチドとしては、少なくとも一方の鎖の3’末端または5’末端に1〜6塩基、通常は1〜3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、例えばdTdTまたはUUからなる突出部を有するものがあげられる。突出部は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのみ、センスオリゴヌクレオチドのみ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドとセンスオリゴヌクレオチドの両方に有することができるが、アンチセンスオリゴヌクレオチドに突出部を有する二本鎖のオリゴヌクレオチドが好ましく用いられる。なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、二重鎖領域とそれに続く突出部とを含む。
二本鎖のオリゴヌクレオチドは、RNA同士が二重鎖を形成した二本鎖RNA(dsRNA)、DNA同士が二重鎖を形成した二本鎖DNA(dsDNA)、またはRNAとDNAが二重鎖を形成したハイブリッド核酸であってもよい。あるいは、二本鎖のうちの一方もしくは両方の鎖がDNAとRNAとのキメラ核酸であってもよい。好ましくは二本鎖RNA(dsRNA)である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から2番目のヌクレオチドは、標的mRNA配列の3’末端から2番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から2〜7番目のヌクレオチドが、標的mRNA配列の3’末端から2〜7番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から2〜11番目のヌクレオチドが、標的mRNA配列の3’末端から2〜11番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から11番目のヌクレオチドが、標的mRNA配列の3’末端から11番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から9〜13番目のヌクレオチドが、標的mRNA配列の3’末端から9〜13番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端から7〜15番目のヌクレオチドが、標的mRNA配列の3’末端から7〜15番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。
RNAは、酵素的または部分/全有機合成によって生成してもよく、また修飾されたリボヌクレオチドは、インビトロで酵素的または有機合成によって導入することができる。一つの態様において、それぞれの鎖は、化学的に調製される。RNA分子を化学的に合成する方法は、当該技術分野において公知である[Nucleic Acids Research, 32, 936 (1998)を参照]。
配列Xを含むセンスオリゴヌクレオチドとしては、塩基として配列Xのみを含んでいるRNA(以下、配列X鎖とする)、配列X鎖の3’端もしくは5’端または両端に1〜6個、好ましくは2〜4個のヌクレオチドが同一または異なって付加されたRNAが挙げられる。
相補的配列X’を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、塩基として相補的配列X’のみを含んでいるRNA(以下、相補的配列X’鎖とする)、相補的配列X’鎖の3’端もしくは5’端または両端に1〜6個、好ましくは2〜4個のヌクレオチドが同一または異なって付加された、二本鎖RNA等が挙げられる。
配列X鎖および相補的配列X’鎖に付加されるヌクレオチド、ならびにスペーサーオリゴヌクレオチドの塩基は、グアニン、アデニン、シトシン、チミンおよびウラシルのいずれか1種または複数種でもよく、またそれぞれの塩基に結合する糖が、リボース、デオキシリボースまたは2’位の水酸基が修飾基で置換されたリボースのいずれでもよいが、付加されるヌクレオチドとしては、ウリジル酸(U)およびデオキシチミジル酸(dT)のいずれか1種または2種がより好ましい。また、配列X鎖の3’端に付加されるヌクレオチドの塩基の配列を、標的遺伝子のmRNA内で配列Xと隣接するヌクレオチドの塩基の配列と同じ塩基配列としてもよい。また、相補的配列X’鎖の3’端に付加されるヌクレオチドの塩基の配列を、標的遺伝子のmRNA内で配列Xと隣接するヌクレオチドの塩基の配列と相補的な塩基配列としてもよい。
また、本発明で用いられるRNAとしては、好ましくはRNA干渉(RNAi)を利用した該標的遺伝子の発現抑制作用を有するRNAが挙げられる。
一本鎖のオリゴヌクレオチドは、100mmol/L 酢酸カリウム、30mmol/L HEPES、pH 7.5からなる緩衝液中に100μmol/L濃度にて再懸濁させる。相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を同等のモル量で混合して、50μmol/L二本鎖のオリゴヌクレオチドの最終溶液を得る。試料を95℃まで5分間加熱して、使用前に室温に冷却させる。二本鎖核酸は、−20℃にて保存する。一本鎖のオリゴヌクレオチドは、凍結乾燥させるか、またはヌクレアーゼフリー水中に、−80℃で貯蔵する。
リンカー構造の例示としては、例えば、国際公開第2009/073809号、国際公開第2013/075035号、国際公開第2015/105083号、国際公開第2014/179620号、国際公開第2015/006740号、国際公開第2017/010575号に開示される構造を採用することができる。
例えば下記分岐を有することにより、複数の糖鎖リガンドを分子内に有する核酸複合体とすることができ、糖鎖リガンドを2〜8個有することが好適である。
X1は、CHまたは窒素原子である。
X2〜X4は、それぞれ独立して、CHまたは窒素原子である。
式1:
Xは、オリゴヌクレオチドであり、
X2〜X4は、それぞれ独立して、上記と同義である。
L1およびL2は、それぞれ独立して、糖鎖リガンドであり、
S1、S2およびS3は、それぞれ独立して、リンカーを構成する部分構造である。
X2〜X4は、それぞれ独立して、上記と同義である。
なお、以下、上記式1の核酸複合体について説明するが、核酸複合体が、以下の構造を有するとして置き換えて、式1での説明を適用できる。
式1−1:
X、L1、L2、S1、S2およびS3は、それぞれ前記と同義である。
本明細書において、前記と同義とは、式1−1中を例示して説明すると、式1−1中のX、L1、L2、S1およびS2それぞれについて、式1において前記するX、L1、L2、S1およびS2それぞれについての定義と同様の基であり得ることを意味している。
糖鎖リガンドであるL1とL2は、S1およびS2とグリコシド結合により連結していることが好ましく、S1およびS2は、ベンゼン環と、例えば、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−結合によりそれぞれ連結していてもよい。
オリゴヌクレオチドであるXは、S3とホスホジエステル結合により連結していることが好ましく、S3は、ベンゼン環と、例えば、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−結合により連結していてもよい。
式2:
X、X2〜X4、L1、L2およびS3は、それぞれ前記と同義であり、
P1、P2、P3、P4、P5およびP6、ならびにT1およびT2は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q1、Q2、Q3およびQ4は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは非置換の炭素数2〜12のアルキレン、−(CH2CH2O)n−CH2CH2−であり、nは0〜99の整数であり、
B1およびB2は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式2−1で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、P2またはP3あるいはP5またはP6との結合点であり、m1、m2、m3およびm4は、それぞれ独立して、0〜10の整数であり、
式2−1:
q1、q2、q3およびq4は、それぞれ独立して、0〜10の整数であり、
ただし、p1およびp2がそれぞれ2または3の整数であるとき、それぞれのP3およびP6、Q2およびQ4、T1およびT2ならびにL1およびL2は、同一または異なっていてもよい。
P1またはP4が、例えば、−NH−CO−である場合、−NH−CO−ベンゼン環という部分構造を有する。
式3−1:
m5およびm6は、それぞれ独立して、0〜10の整数であり、式3−1〜式3−3の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、B1またはB2あるいはP1またはP4との結合点である。
式4−1:
X、L1、L2、S3、P3、P6、T1、T2、Q2、Q4、q2およびq4はそれぞれ前記と同義である。
式5では、式2におけるP1とP4、P2とP5、P3とP6、Q1とQ3、Q2とQ4、B1とB2、T1とT2、L1とL2、p1とp2、q1とq3ならびにq2とq4がそれぞれ同一である。
式5:
X、S3、P1、P2、P3、Q1、Q2、B1、T1、L1、p1、q1およびq2はそれぞれ前記と同義である。
また、式5におけるX、S3、P1、P2、P3、Q1、Q2、B1、T1、L1、p1、q1およびq2は、各々、上述した好適な基であって良いが、P1が−CO−NH−、−NH−CO−または−O−であることが好ましい。
式5における−(P2−Q1)q1−は、存在しないか、または上記式3−1〜式3−3で表されるいずれかの構造であることが好適である。
式6−1:
X、S3、P3、Q2、T1、およびL1は、それぞれ前記と同義である。
式7−1:
X、L1、L2、S3、n2またはn3は、それぞれ前記と同義である。L1とL2は同一であってもよく、異なっていてもよく、同一であることが好適である。
式7−1〜式7−9において、各アルキレン基部分を鎖長の異なるアルキレン鎖を導入することにより、また、アミド結合等を他の結合に置換することにより、式7−1〜式7−9で表される構造を有する核酸複合体以外の核酸誘導体を製造することもできる。
n1は、1〜100の整数である。)
n1は5〜95の整数であることが好ましく、10〜80の整数であることがより好ましく、15〜60の整数であることがさらに好ましく、20〜40の整数であることがよりさらに好ましい。
式11:
L1、L2、S1およびS2は、それぞれ前記と同義であり、
P7およびP8は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q5、Q6およびQ7は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数1〜12のアルキレンまたは−(CH2CH2O)n8−CH2CH2−であり、n8は0〜99の整数であり、
B3は、、下記式11−1で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Q5およびQ6との結合手を意味し、
式11−1:
式12−1:
X、L1、L2、S1およびS2は、それぞれ前記と同義であり、n1’〜n12’はそれぞれ独立して、1〜10の整数である。
X、L1、S3またはn2はそれぞれ前記と同義である。
本発明において、製薬上許容し得る陰イオンとしては、例えば塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の無機イオン、酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン等の有機酸イオン等が挙げられる。
式1で表される核酸重合体は、固相合成によっても合成することができる。
式1で表される核酸複合体における、S1をリンカーとしたL1−ベンゼン環ユニットやS2をリンカーとしたL2−ベンゼン環ユニットの合成は、例えば、式2で表される核酸複合体を例として説明する。
式2で表される核酸複合体におけるL1−ベンゼン環ユニットやL2−ベンゼン環ユニットは、P1、P2、P3、P4、P5、およびP6ならびにT1およびT2により連結している。
P1、P2、P3、P4、P5、およびP6ならびにT1およびT2の−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−または−CO−NH−結合は、例えば、第4版実験化学講座19「有機化合物の合成I」丸善(1992年)、第4版実験化学講座20「有機化合物の合成II」、丸善(1992年))等に記載の結合反応の方法を参考にして、式2で表される構造を形成するのに適切な原料を選択することにより適宜合成することができる。
また、ベンゼン環から順次、Q1を部分構造として有する化合物、B1を部分構造として有する化合物を結合させることで、L1−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
L1とQ2を部分構造として有する化合物を別途合成し、L1とQ2を部分構造として有する化合物をベンゼン環、Q1およびB1を部分構造として有するL1−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させることにより、L1−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
L2−ベンゼン環ユニットについても同様に、ベンゼン環から順次、Q3を部分構造として有する化合物、B2を部分構造として有する化合物を結合させることで、L2−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
L2とQ4を部分構造として有する化合物を別途合成し、L2とQ4を部分構造として有する化合物をベンゼン環、Q3およびB2を部分構造として有するL2−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させることにより、L2−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
B1を部分構造として有する化合物、B2を部分構造として有する化合物としては、下記式2−1で表されるいずれかの構造を有し、各構造における末端の黒丸点において、それぞれ、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、またはチオール基を有する化合物が挙げられる。
式2−1:
L2、Q4およびB2を部分構造として有する化合物を合成してから、Q3とベンゼン環を有する化合物と結合することにより、L2−ベンゼン環ユニット構造を製造してもよい。
本発明においては、[L1−T1−(Q2−P3)q2−]p1−B1−(P2−Q1)q1−P1−である部分構造と、[L2−T2−(Q3−P6)q4−]p2−B2−(P5−Q3)q3−P2−である部分構造とは同一または異なっていても良いが、同一であることが好ましい。
L3は、脱保護することにより、L1となる糖鎖リガンド誘導体であれば特に限定されない。糖鎖リガンドの置換基としては、糖質化学の分野で汎用される置換基であれば特に限定されないが、Ac基が好ましい。
式11で表される核酸複合体におけるX−ベンゼン環ユニットは、オリゴヌクレオチドの結合以外に、P7およびP8により表される結合を有する。
P7およびP8の−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−または−CO−NH−結合は、例えば、第4版実験化学講座19「有機化合物の合成I」丸善(1992年)、第4版実験化学講座20「有機化合物の合成II」、丸善(1992年))に記載の結合反応の方法を参考にして、式11で表される構造を形成するのに適切な原料を選択することにより適宜合成することができる。
また、ベンゼン環から順次、Q5を部分構造として有する化合物、B3を部分構造として有する化合物を結合させることで、X−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
具体的には、ベンゼン環およびQ5を部分構造として有するX−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物の末端にアジド基を有する場合を例にとると、実施例に開示するような末端結合性官能基化したオリゴヌクレオチドを反応させることにより、環化付加させて、トリアゾール環を形成させて、B3部分を構築することにより、X−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
式1−1においてP1およびP4が−NH−CO−、−O−CO−または−S−CO−である、L1−ベンゼン環ユニット構造およびL2−ベンゼン環ユニット構造は以下の方法で製造することができる。
式:
化合物(I−C)は、化合物(I−A)と化合物(I−B)を、テトロヒドロフラン等の溶媒中、トリフェニルホスフィンポリマー担持体を加え、氷冷下、ジイソプロピルアゾジカルボキシレートトルエン溶液を反応させる事により製造する事ができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2−ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
化合物(I−A)は市販品として得る事ができる。
化合物(I−D)は化合物(I−C)を用い、メタノール等の溶媒中、氷冷下、塩基の存在下、反応させる事により製造する事ができる。
溶媒としては、製造方法1工程1で例示したものが挙げられる。
塩基としては、例えば炭酸セシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert−ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N−メチルモルホリン、ピリジン、1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]−7−ウンデセン(DBU)、N,N−ジメチル−4−アミノピリジン(DMAP)等が挙げられる。
化合物(I−F)は化合物(I−D)および化合物(I−E)を、無溶媒でまたは溶媒中、1〜30当量の塩基、縮合剤および必要に応じて0.01〜30当量の添加剤の存在下、室温と200 ℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2−ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリドン、ピリジンがあげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、製造方法1工程2で例示したものが挙げられる。
縮合剤としては、例えば1,3−ジシクロヘキサンカルボジイミド(DCC)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩(EDC)、カルボニルジイミダゾール、ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルホロホスファート、(ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスファート、O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスファート(HATU)、O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスファート(HBTU)、ヨウ化 2−クロロ−1−メチルピリジニウム等が挙げられる。
添加剤としては、例えば1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)等が挙げられる。
化合物(I−H)は化合物(I−F)および化合物(I−G)を用い、製造方法1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(I−J)は化合物(I−H)および化合物(I−I)を用い、製造方法1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
また、DP工程と工程5を繰り返し行うことで、望みのq1の値に調整された化合物(I−J)を製造することができる。
化合物(I−L)は化合物(I−J)および化合物(I−K)を用い、製造方法1の工程3製造方法1の工程2と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(I−N)は化合物(I−L)および化合物(I−M)を用い、製造方法1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(I’)は化合物(I−O)、化合物(I−P)および化合物 (I−Q)を用い、製造方法1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
また、DP工程と工程8を繰り返し行うことで、望みのq3の値に調整された化合物(I’)を製造することができる。
有機合成化学で常用される方法[例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley&Sons Inc.(1999年)等に記載の方法等]を適切に用いることで製造することができる。
化合物(I−B)、化合物(I−E)、化合物(I−G)、化合物(I−I)、化合物(I−K)、化合物(I−M)、化合物(I−O)、化合物(I−P)および化合物(I−Q)は市販品として、または「実験化学講座第4版 有機合成、p. 258、丸善(1992年)」、「March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7th Edition」に記載の方法を組み合わせる事、もしくはそれに準じた方法で得る事ができる。
式2においてP1およびP4が−O−であり、X2〜X4がCHであるL1−ベンゼン環ユニット構造およびL2−ベンゼン環ユニット構造は以下の方法で製造することができる。
化合物(II−C)は化合物(II−A)と化合物(II−B)をN,N’−ジメチルホルムアミドな等の溶媒に溶解し、炭酸水素カリウム等の塩基を加えて、室温〜200℃にて5分間〜100時間反応させる事により製造する事ができる。
溶媒としては、製造工程1の工程2に例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造方法1の工程3で例示したものが挙げられる。
化合物(II−E)は化合物化合物(II−C)と化合物(II−D)をN,N’−ジメチルホルムアミド等の溶媒に溶解し、炭酸水素カリウム等の塩基を加えて、室温〜200℃で5分間〜100時間反応させる事により製造する事ができる。
溶媒としては、製造工程1の工程2で例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造方法1の工程3で例示したものが挙げられる。
化合物(II−A)は市販品として得る事ができる。
化合物(II−G)は化合物(II−E)および化合物(II−F)を用い、製造方法1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(II−I)は化合物(II−G)および化合物(II−H)を用い、製造方法1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
また、DP工程と工程16を繰り返し行うことで、望みのq1の値に調整された化合物(II−I)を製造することができる。
化合物(II−K)は化合物(II−I)および化合物(II−J)を用い、製造方法1の工程2と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(II−M)は化合物(II−K)および化合物(II−L)を用い、製造方法1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
化合物(II’)は化合物(II−M), 化合物(II−N), 化合物(II−O)および化合物(II−P)を用い、製造方法1の工程3と同様の条件で製造する事ができる。
また、DP工程と工程19を繰り返し行うことで、望みのq3に調整された化合物(II’)を製造することができる。
有機合成化学で常用される方法[例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley&Sons Inc.(1999年)等に記載の方法等]を適切に用いることで製造することができる。
式6:
Y9およびY10は、P1およびP4として示される基であってもよいが、好適には、酸素原子または−NH−であり、
R17およびR18は、それぞれ独立して、水素原子、マレイミド基、置換もしくは非置換の炭素数1〜20のアルキル基、t−ブトキシカルボニル基(Boc基)、ベンジルオキシカルボニル基(Z基)、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)、−[Q8−P9]q7−R19、または−[Q9−P10]q8−B4−[(P11−Q10)q7]p3−T3−L3であり、
P9〜P11およびT3は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−CO−、−NH−、−O−、−S−、−O−CO−、−S−CO−、−NH−CO−、−CO−O−、−CO−S−もしくは−CO−NH−であり、
Q8〜Q10は、存在しないか、または、置換もしくは非置換の炭素数2〜12のアルキレン、−CH2CH2−(OCH2CH2O)n−または−CH2CH2−(CH2CH2O)n−CH2CH2−であり、nは0〜99の整数であり、
R19は、水素原子、マレイミド基、置換もしくは非置換の炭素数1〜20のアルキル基、t−ブトキシカルボニル基(Boc基)、ベンジルオキシカルボニル基(Z基)、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc基)であり、
B4は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式で表される群からなる炭素骨格構造であり、各炭素骨格構造における末端の黒丸点は、それぞれ、カルボニル基またはP9との結合点であり、m1およびm2は、それぞれ独立して、0〜10の整数であり、
q7は、0〜10の整数であり、
L3は、保護されていてもよい糖鎖リガンドである。
式7:
本発明の核酸複合体は、哺乳動物に投与して、生体内において、標的遺伝子の発現を低下または停止させることで抑制し、標的遺伝子に関連する疾患の治療に用いることができる。
本発明の核酸複合体を治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、特に限定されるものではないが、例えば、静脈内投与、皮下投与及び筋肉内投与等が挙げられ、好ましくは静脈内投与である。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えば二本鎖のオリゴヌクレオチドに換算した1日投与量が0.1μg〜1000 mgとなるように投与すればよく、1日投与量が1〜100 mgとなるように投与することがより好ましい
注射剤の場合、液剤または溶媒を除去または凍結乾燥した組成物に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理食塩水またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤、またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
化合物9合成
5-ヒドロキシイソフタル酸ジメチル(化合物1, 和光純薬工業社製, 5.0443 g, 24 mmol)をテトラヒドロフラン(和光純薬工業社製25 mL)に溶解し、2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-1-エタノール((東京化成工業社製, 4.0343 g, 25.03 mmol)、およびトリフェニルホスフィン ポリマー担持体(アルドリッチ社製, 6.61 g, 25.2 mmol)を加えた後、氷冷下、40%ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(DIAD)トルエン溶液 (東京化成工業社製, 13.26 mL, 25.2 mmol)を加え、室温にて一晩攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、ろ液を留去した後、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=95/5〜80/20)で精製することにより、化合物2(5.3071 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 254 (M + H)+, 脱Boc体として検出
工程1で合成した化合物2(5.3071 g, 15.02 mmol)をメタノール(25 mL)に溶解し、氷冷下、2mol/L水酸化ナトリウム水溶液(和光純薬工業社製, 13 mL)を加え、室温にて4時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 324 (M - H)-
工程2で合成した化合物3(0.9372 g, 2.8809 mmol)、βアラニンメチルエステル塩酸塩(東京化成工業株式会社製, 0.8082 g, 5.7902 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド(10 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(2.52 mL, 14.40 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (2.1908 g, 5.76 mmol)を加えて、室温にて終夜撹拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物4を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 496 (M + H)+
工程3で合成した化合物4(0.9622 g, 1.9518 mmol)を用い、ジクロロメタン(10 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸(2.5mL, 32.4 mmol)を加えて、室温にて2時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物5を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 396 (M + H)+
工程4で合成した化合物5(0.1146 g, 0.290 mmol)およびN-スクシンイミジル15-アジド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸(N3-PEG4-NHS, 東京化成工業株式会社製, 0.0750 g, 0.1931 mmol)をテトラヒドロフラン(6 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(0.337 mL, 1.931 mmol)を加えて、室温にて2時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物6を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 669 (M + H)+
工程5で合成した化合物6(0.1291 g, 0.193 mmol)を用い、工程2と同様の方法で化合物7を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 641 (M + H)+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 2.35 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.51-2.54 (4H, m), 3.38-3.65 (24H, m), 4.07 (2H, t, J = 5.4 Hz), 7.51 (2H, br s), 7.89 (1H, br s), 8.13 (1H, dd, J = 5.3, 2.7 Hz), 8.63 (2H, t, J = 5.4 Hz)
工程6で合成した化合物7(0.1252 g, 0.193 mmol)およびL-グルタミン酸 ジ-tert-ブチルエステル(渡辺化学株式会社製, 0.1180 g, 0.399 mmol)を用い、工程3と同様の方法で化合物8(0.0521 g, 収率24%)を得た。
ESI-MS m/z: 1124 (M + H)+
工程7で合成した化合物8(0.0521 g, 0.0464 mmol)を用い、ジクロロメタン(2 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸(0.2 mL, 32.4 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物9を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 899 (M + H)+
1H -NMR (DMSO-D6) δ: 1.70-1.82 (2H, m), 1.90-2.02 (2H, m), 2.23-2.30 (4H, m), 2.35 (2H, t, J = 5.3 Hz), 2.44 (4H, t, J = 7.4 Hz), 3.38-3.65 (24H, m), 4.07 (2H, t, J = 5.3 Hz), 4.17-4.26 (2H, m), 7.51 (2H, d, J = 1.3 Hz), 7.89 (1H, br s), 8.13 (1H, dd, J = 10.0, 5.0 Hz), 8.21 (2H, d, J = 7.6 Hz), 8.57 (2H, t, J = 5.8 Hz)
化合物19の合成
実施例1の工程1で合成した化合物2(2.1 g, 5.940 mmol)を用い、実施例1の工程4と同様の方法で化合物10を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 254 (M + H)+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 3.26 (2H, t, J = 5.1 Hz), 3.90 (6H, s), 4.30 (2H, t, J = 5.1 Hz), 7.77 (2H, dd, J = 1.5, 0.8 Hz), 8.13 (1H, dd, J = 1.4, 0.7 Hz).
工程9で合成した化合物10 (0.427 g, 1.686 mmol)とオーガニック・アンド・バイオモレキュラー・ケミストリー (Organic & Biomolecular chemistry), 第13巻, 1778?1791頁, 2015年に記載された方法で合成した6-アジドヘキサン酸ピロリジニルエステル(0.6 g, 2.360 mmol)を用い、実施例1の工程5と同様の方法で化合物11(0.248 g, 収率38%)を得た。
ESI-MS m/z: 393 (M + H)+
1H-NMR (CDCl3) δ: 1.37-1.44 (2H, m), 1.64-1.69 (4H, m), 2.23 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.25 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.71 (2H, dd, J = 5.3, 2.7 Hz), 3.95 (6H, s), 4.13 (2H, t, J = 6.7 Hz), 7.75 (2H, dd, J = 1.5, 0.8 Hz), 8.30 (1H, dd, J = 1.4, 0.7 Hz).
工程10で合成した化合物11(0.248 g, 0.632 mmol)を用い、実施例1の工程2と同様の方法で化合物12を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 365 (M + H)+
1H-NMR (MeOD) δ: 1.37-1.41 (2H, m), 1.60-1.65 (4H, m), 2.25 (2H, t, J = 7.4 Hz), 3.25 (2H, t, J = 6.7 Hz), 3.63 (2H, t, J = 4.9 Hz), 4.18 (2H, t, J = 5.2 Hz), 7.79 (2H, dd, J = 1.6, 0.8 Hz), 8.27 (1H, dd, J = 1.4, 0.7 Hz).
工程11で得られた化合物12(0.230 mg, 0.631 mmol)をテトラヒドロフラン(274.7μL)に溶解し、N-ヒドロキシスクシイミド(0.174 g, 1.515 mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (0.313 g, 1.515 mmol)を加え、室温、アルゴン雰囲気下にて一晩撹拌した。減圧下で溶媒留去し、その後、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物13の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 559 (M + H)+
工程12で合成した化合物13(0.200 g, 0.358 mmol)、6-アミノヘキサン酸(ナカライテスク社製、0.141 g, 1.074 mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(0.139 mL, 1.074 mmol)を用い、リン酸緩衝液/ジメチルスルホキシド混合溶媒中 (v/v = 1/1, 50 mL)にて、室温で終夜攪拌した。反応液に10%クエン酸溶液(50 mL)を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することで化合物14(0.157 g, 収率74%)を得た。
ESI-MS m/z: 591 (M + H)+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.26-1.33 (8H, m), 1.51-1.53 (10H, m), 2.10 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.21 (4H, t, J = 7.4 Hz), 3.25 (8H, t, J = 6.5 Hz), 4.08 (2H, t, J = 5.4 Hz), 7.48-7.51 (2H, br m), 7.87-7.89 (1H, br m), 8.07-8.08 (1H, br m), 8.53-8.54 (2H, br m).
工程13で合成した化合物14(0.1442 g, 0.2441 mmol)を用い、工程12と同様の方法で化合物15を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 785 (M + H)+
工程14で合成した化合物15(0.0958 g, 0.1221 mmol)を用い、工程13と同様の方法で化合物16を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 818 (M + H)+
1)化合物17の合成
工程12で合成した化合物13(0.0209 g, 0.0375 mmol)とカルボキシル-(12エチレングリコール)エチルアミン(サーモサイエンティフィック社製, 0.0674 g, 0.1091 mmol)を用い、工程13と同様の方法で化合物17(0.0580 g, 収率99%)を得た。
ESI-MS m/z: 1564 (M + H)+
2)化合物18の合成
工程12で合成した化合物13(0.0047 g, 0.00654 mmol)とカルボキシル-(24エチレングリコール)エチルアミン(サーモサイエンティフィック社製,0.0225 g, 0.01963 mmol)を用い、工程13と同様の方法で化合物18(0.0144 g, 収率79%)を得た。
ESI-MS m/z: 2622 (M + H)+
1)化合物19の合成
工程16で合成した化合物17(0.0580 g, 0.0375 mmol)を用い、工程12と同様の方法で化合物19を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1759 (M + H)+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.22-1.25 (6H, m), 2.10 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.81 (8H, br s), 2.93 (4H, t, J = 6.1 Hz), 3.26-3.27 (6H, m), 3.43-3.45 (2H, m), 3.49-3.50 (92H, m), 3.71 (4H, t, J = 6.0 Hz), 4.07 (2H, t, J = 6.0 Hz), 7.53 (2H, dd, J = 1.5, 0.8 Hz), 7.93 (1H, dd, J = 1.5, 0.8 Hz), 8.05-8.07 (1H, br m), 8.59-8.61 (2H, br m).
2)化合物20の合成
工程16で合成した化合物18(0.0580 g, 0.0375 mmol)を用い、工程12と同様の方法で化合物20を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 2817 (M + H)+
化合物22の合成
(a);実施例2の工程12で合成した化合物13(10 mg, 17.9 μmol)をテトラヒドロフラン(90 μL)とリン酸緩衝液 (90 μL)との混合溶液に溶解し、カルボキシル-(12オリゴエチレングリコール)エチルアミン(サーモサイエンティフィック社製,22.1 mg, 35.8 μmol)を加え、室温、アルゴン雰囲気下にて1h撹拌した。減圧下で溶媒留去し、その後、クロロホルム、10%クエン酸水溶液にて抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物17の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1564 (M+H)+
(b);実施例2の工程12で合成した化合物13(10 mg, 17.9 μmol)をテトラヒドロフラン(90 μL)とリン酸緩衝液 (90μL)との混合溶液に溶解し、カルボキシル-(24オリゴエチレングリコール)エチルアミン(サーモサイエンティフィック社製,41 mg, 35.8μmol)を加え、室温、アルゴン雰囲気下にて1h撹拌した。減圧下で溶媒留去し、その後、クロロホルム、10%クエン酸水溶液にて抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物18の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 2622 (M + H)+
(a);工程18で合成した化合物17(14 mg, 8.9 μmol)をテトラヒドロフラン(90μL)に溶解し、L-グルタミン酸 ジ-tert-ブチルエステル(渡辺化学株式会社製, 5.2 mg, 17.9 μmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (6.8 mg, 17.9 μmol)、ジイソプロピルエチルアミン(3.1 μL, 17.9μmol)を加え、室温でアルゴン雰囲気下、一晩撹拌した。減圧下で溶媒留去し、その後、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し、化合物21a (4.5 mg, 収率25%)を得た。
ESI-MS m/z: 2046 (M + H)+
1H-NMR (CDCl3) δ: 1.44-1.46 (36H, m), 1.61-1.66 (4H, m), 1.89-1.91 (4H, m), 2.06-2.16 (2H, m), 2.20-2.37 (6H, m), 2.50 (4H, t, J = 6.0 Hz), 3.26 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.59-3.68 (98H, m), 3.71-3.76 (4H, m), 4.14 (2H, t, J = 5.2 Hz), 4.48-4.50 (2H, m), 7.59 (2H, dd, J = 1.3, 0.6 Hz), 7.92 (1H, br s).
(b);工程18で合成した化合物18(23.4 mg, 8.9 μmol)をテトラヒドロフラン(90 μL)に溶解し、L-グルタミン酸α,γ-ジ(t-ブチルエステル)塩酸塩(5.2 mg, 17.9 μmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩(6.8 mg, 17.9 μmol)、ジイソプロピルエチルアミン(3.1 μL, 17.9 μmol)を加え、室温でアルゴン雰囲気下、一晩撹拌した。減圧下で溶媒留去し、その後、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し、化合物21b(7.4 mg, 収率27%)を得た。
ESI-MS m/z: 1553 (M - 2H)2-
1H-NMR (CDCl3) δ: 1.44 (18H, s), 1.46 (18H, s), 1.62-1.67 (4H, m), 1.86-1.89 (2H, m), 2.20-2.36 (10H, m), 2.51 (4H, t, J = 5.8 Hz), 3.26 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.63-3.65 (194H, m), 3.73-3.76 (4H, m), 4.14 (2H, t, J = 5.1 Hz), 4.46-4.50 (2H, m), 7.60 (2H, dd, J = 1.0, 0.5 Hz), 7.92 (1H, br s)
(a);工程19で合成した化合物21a(4.5 mg, 2.1 μmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法により化合物22aを定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1822 (M + H)+
(b);工程19で合成した化合物21b(4.5 mg, 2.1 μmol)を用い、実施例1の工程8と同様の方法により化合物22bを定量的に得た。
ESI-MS m/z: 2878 (M + H)+
化合物26の合成
実施例2の工程11で合成した化合物12(10 mg, 27.4 μmol)をテトラヒドロフラン(274.7 μmol)に溶解し、L-グルタミン酸 ジ-tert-ブチルエステル(渡辺化学株式会社製, 32.5 mg, 109.8 μmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩(41.7 mg, 109.8 μmol)、ジイソプロピルエチルアミン(24.2 μL, 137.3 μmol)を加え、室温でアルゴン雰囲気下、一晩撹拌した。減圧下で溶媒留去し、その後、クロロホルム、10%クエン酸水溶液にて抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物23の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 847 (M + H)+
工程21で合成した化合物23(139.4 mg, 164.6 μmol)を塩化メチレン(1.3 mL)およびトリフルオロ酢酸(0.3 mL)に溶解し、室温で一晩撹拌した。減圧下で溶媒留去し、化合物24を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 623 (M + H)+
工程22で合成した化合物24(100 mg, 160.7 μmol)をジメチルアミン(1 mL)に溶解し、N-ヒドロキシスクシイミド (81.3 mg, 707 μmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(135.4 mg, 707 μmol)を加え、室温、アルゴン雰囲気下にて一晩撹拌し、化合物25の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1011 (M + H)+
(a);工程23で合成した化合物25(16.2 mg, 16 μmol)をリン酸緩衝液(95 μL)に溶解し、カルボキシル-(エチレングリコール)エチルアミン(80.4 mg, 129.8 μmol)を加え、室温、アルゴン雰囲気下にて1h撹拌した。減圧下で溶媒留去し、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し、化合物26a(6.2 mg, 収率21%)を得た。
ESI-MS m/z: 1511 (M + 2H)2+
(b);工程23で合成した化合物25(16.2 mg, 16 μmol)をリン酸緩衝液 (95 μL)に溶解し、カルボキシル-(エチレングリコール)エチルアミン(149.3 mg, 129.8 μmol)を加え、室温、アルゴン雰囲気下にて1h撹拌した。減圧下で溶媒留去し、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し、化合物26b(5.5 mg, 収率11%)を得た。
ESI-MS m/z: 2566 (M + 2H)2+
化合物27,28の合成
実施例1の工程6で合成した化合物7(0.8 mg, 1.249 μmol)、エーシーエス・ケミカル・バイオロジー (ACS Chemical Biology), 第5巻, 301?312頁, 2010年に記載された方法で合成したアミノエチル基が修飾されたα(1,2)α(1,6)シュードマンノトリオース (3.0 mg, 5.0 μmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (3.8 mg, 10 μmol)、ジイソプロピルエチルアミン (1.7 μL, 10 μmol)をN,N-ジメチルアセトアミド (1 mL)に溶解し、室温で二日間静置した。混合物を、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し、化合物25(1.6 mg, 収率71%)を得た。
ESI-MS m/z: 1802 (M - H)-
実施例1の工程8で合成した化合物9(0.9 mg, 1.04 μmol)、工程25に記載のα(1,2)α(1,6)シュードマンノトリオース (8.34 g, 8.34 μmol)を用い、工程25と同様の方法で化合物26(2.3 mg, 収率68%)を得た。
ESI-MS m/z: 1611 (M - 2H)2-
化合物29,30,31,32,33の合成
実施例2の工程12で合成した化合物13(0.6 mg, 0.00111 mmol)および実施例5の工程25に記載のα(1,2)α(1,6)シュードマンノトリオース(2.0 mg, 0.00334 mmol)を用い、実施例2の工程13と同様の方法で化合物29(1.1 mg, 収率65%)を得た。
ESI-MS m/z: 1528 (M + H)+
実施例2の工程13で合成した化合物14(0.66 mg, 0.00111 mmol)を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物30 (0.3 mg, 収率15%)を得た。
ESI-MS m/z: 1754 (M + H)+
実施例2の工程15で合成した化合物16(0.91 mg, 0.00111 mmol)を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物31 (0.4 mg, 収率18%)を得た。
ESI-MS m/z: 1981 (M + H)+
実施例2の工程17で合成した化合物19(1.95 mg, 0.00111 mmol)を用い、実施例2の工程13と同様の方法で化合物32(0.5 mg, 収率17%)を得た。
ESI-MS m/z: 2728 (M + H)+
実施例2の工程16で合成した化合物18(2.91 mg, 0.00111 mmol)を用い 、実施例5の工程25と同様の方法で化合物33 (2.2 mg, 収率52%)を得た。
ESI-MS m/z: 1892 (M + 2H)2+
化合物34,35の合成
(a);実施例3の工程20で得られた化合物22a(2 mg, 1.1 μmol)を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物34a(2 mg, 収率44%)を得た。
ESI-MS m/z: 2073 (M - 2H)2-
(b);実施例3の工程20で得られた化合物22a(3.1 mg, 1.1 μmol)を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物34b(1.8 mg, 収率37%)を得た。
ESI-MS m/z: 2601 (M - 2H)2-
(a);実施例4の工程24で得られた化合物26a(3.1 mg, 1.1 μmol)を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物35a(3 mg, 収率55%)を得た。
ESI-MS m/z;;2671 (M - 2H)2-
(b);実施例4の工程24で得られた化合物26b(2.7 mg, 0.5 μmol)を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物35b(2.2 mg, 収率56%)を得た。
ESI-MS m/z; 2486 (M - 2H)2-
化合物38の合成
ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958?16961頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物36 (0.9602 g, 2.1460 mmol)をN,N’-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、N-Boc-エチレンジアミン (シグマアルドリッチ社製, 0.6877 g, 4.292 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (1.90 mL, 10.87 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩 (和光純薬工業社製, 1.6437 g, 4.3229 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物37の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 590 (M + H)+
工程34で合成した化合物37 (1.2654 g, 2.1460 mmol)をジクロロメタン (15 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸 (4 mL)を加えて、室温にて一晩攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、逆相カラムクロマトグラフィー (水/メタノール=80/20)で溶出させることにより、化合物38(0.3879 g, 収率37 %)を得た。
ESI-MS m/z: 490 (M + H)+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.46-1.52 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 2.00 (3H, s), 2.08 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.11 (3H, s), 2.85 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.27 (2H, dd, J = 12.3, 6.2 Hz), 3.67-3.69 (1H, m), 3.68-3.73 (1H, m), 3.86-3.90 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.49 (1H, d, J = 8.4 Hz), 4.97 (1H, dd, J = 11.3, 3.4 Hz), 5.22 (1H, d, J = 3.5 Hz), 7.86 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.95-8.02 (1H, m).
工程36
実施例1の工程6で合成した化合物7(4.36 mg, 0.006 mmol)、比較例1の工程35で合成した化合物38(10 mg, 0.02 mmol) を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物39 (7 mg, 収率65%)を得た。
ESI-MS m/z: 1581 (M - H)-
工程37
実施例1の工程8で合成した化合物9(10 mg, 0.011 mmol))、比較例1の工程35で合成した化合物38(43.9 mg, 0.090 mmol) を用い、実施例5の工程25と同様の方法で化合物39 (22 mg, 収率72%)を得た。
ESI-MS m/z: 2785 (M - 2H)2-
モレキュールズ(Molecules), 第17巻, 13825-13854頁, 2012年に記載された方法で合成した末端結合性官能基化した化合物41を用いて、エーシーエスナノ(ACS nano)、第9巻、9652-9664頁、2015年に記載された方法により化合物42を得た。
Symmetric Doubler Phosphoramidite(Glen Research社製, カタログ番号 10-1920-90)を用い モレキュールズ(Molecules), 第17巻, 13825-13854頁, 2012年に記載された方法で合成した末端結合性官能基化した化合物43にN-スクシイミジル3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネートのジメチルスルホキシド溶液を加え、リン酸緩衝液中で室温、4時間静置した。反応溶液にジチオトレイトールを添加し、室温で一晩静置した。混合物をゲルろ過処理(Napカラム、GEヘルスケア社製、溶出溶媒; 20mmol/L酢酸/酢酸ナトリウム緩衝液 (pH5.0)および限外ろ過を行うことで化合物44を得た。
ジベンゾサイクロオクチン-N-ヒドロキシスクシイミドエステルを用い、工程39と同様の方法で化合物45を得た。
ACSケミカルバイオロジー、第5巻、3号、301-312頁, 2010年に記載された方法で合成した化合物46に実施例8の工程38で合成した化合物42を加えて、室温にて1時間静置した。陰イオン交換クロマトグラフィー(GE Healthcare, MonoQ 5/50GL, 10μm, 5.0 mm x 50 mm、A液: 10mM Tris緩衝液/30%アセトニトリル, B液: 10mM Tris緩衝液/30%アセトニトリル/1M NaBrによるグラジエント)あるいは逆相液体クロマトグラフィー (ウォーターズ, X BridgeC18, 5μm, 4.6 mmx250 mm、0.1M酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液, B液:アセトニトリルによるグラジエント)のいずれかの方法で精製する事により、1本鎖の核酸複合体47を得た。
表1の化合物群もしくはバイオコンジュゲートケミストリー(Bioconjugate Chemistry), 第14巻, 232-238頁、2003年に記載された方法で合成した糖鎖マレイミド付加体に、モレキュールズ(Molecules), 第17巻, 13825-13854頁, 2012年に記載された方法で合成した末端結合性官能基化したチオール核酸、化合物42、44もしくは45を用い、同様の方法により表2の核酸複合体を得た。
工程41で合成した1本鎖の核酸複合体は、混合緩衝液(100 mmol/L酢酸カリウム、30 mmol/L 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、HEPES)-KOH(pH 7.4)、2 mmol/L酢酸マグネシウム)にて濃度調整(50 μmol/L)した。センス鎖とアンチセンス鎖(50 μmol/L)を各々等量混合し、80℃で10分間静置した。アンチセンス鎖配列は、表2に記載されている通りである。徐々に温度を下げ、37℃で1時間静置し、2本鎖の核酸複合体を得た。
本実施例により合成した核酸複合体を表4に示し、核酸複合体における核酸の配列を表5に示す。なお、表5における「化合物欄」の記載は、[表中の化合物番号]_[核酸複合体における核酸配列の略号]−[核酸の種類(siRNA)]を示し、また「一本鎖名称」欄の記載おいて、センス鎖(ss)は[表中の化合物番号]_[核酸おけるリガンド等が結合する位置]_[核酸複合体における核酸配列の略号]-[核酸の種類(ssRNA)]を示し、アンチセンス鎖(as)は[核酸複合体における核酸配列の略号]−[核酸の種類(as-RNA)]をそれぞれ示す。
工程43
比較例2の工程36および37で合成した化合物39および40に実施例8の工程37で合成した化合物42を添加し、室温にて1時間静置した。反応混合物に炭酸ナトリウムを加え、4℃で一晩静置した。実施例8の工程41と同様の方法で精製する事により、表6の核酸複合体を得た。
工程43で合成した1本鎖の糖鎖複合体は、実施例8の工程42と同様の方法で2本鎖の糖鎖複合体を得た。
本比較例により合成した核酸複合体を表8に示し、核酸複合体における核酸の配列を表9に示す。なお、表9における「化合物欄」の記載は、[表中の化合物番号]_[核酸複合体における核酸配列の略号]_[核酸の種類(siRNA)]を示し、また「一本鎖名称」欄の記載おいて、センス鎖(ss)は[表中の化合物番号]_[核酸おけるリガンド等が結合する位置]_[核酸複合体における核酸配列の略号]-核酸の種類(ssRNA)を示し、アンチセンス鎖(as)は[核酸複合体における核酸配列の略号]−[核酸の種類(as-RNA)]をそれぞれ示す。
実施例1の工程1で合成した化合物2 (8.17 g, 23.12 mmol)を用い、実施例1の工程4と同様の方法で化合物75を(3.7 g, 14.63 mmol, 収率63%)得た。
ESI-MS m/z: 254 (M + H)+
実施例9の工程42で合成した化合物75 (3.70 g, 14.63 mmol)をテトラヒドロフラン (10 mL)に溶解し、氷冷下、塩化ベンゾイル (4.12 mL, 29.3 mmol)を加えて、室温にて1時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物76 (3.82 g, 9.86 mmol, 収率67%)を得た。
ESI-MS m/z: 432 (M + HCOO)-
実施例9の工程43で合成した化合物76 (3.82 g, 9.86 mmol)を用い、実施例1の工程2と同様の方法で化合物77を(3.07 g, 8.56 mmol, 収率87%)得た。
ESI-MS m/z: 360 (M + H)+
実施例9の工程44で合成した化合物77 (213 mg, 0.592 mmol)およびイミノ二酢酸ジ-tert-ブチルエステル (375 mg, 1.529 mmol)を用い、実施例1の工程7と同様の方法で化合物78を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 858 (M + HCOO)-
STEP1: 実施例9の工程45で合成した化合物78 (482 mg, 0.593 mmol)を用い、をメタノール (10 mL)に溶解し、パラジウム/炭素による接触水素還元を行った。得られた溶液留分を減圧下、溶媒を留去をした。
STEP2: 得られた粗生成物を用い、実施例2の工程9と同様の方法でアルキルアジド基を有するカップリング化合物を得た。
STEP3: STEP2で得られた化合物を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物79 (238 mg,収率92%)を得た。
ESI-MS m/z: 595 (M + H)+
実施例9の工程46で合成した化合物79 (0.8 mg, 1.346 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物80を(1.3 mg, 0.445 μmol,)得た。
ESI-MS m/z: 2918 (M - H)-
1,3-ジヒドロキシ2-アミノプロパン81 (東京化成工業社製, 0.55 g, 6.03 mmol)をジメチルスルホキシド(15 mL)に溶解し、氷冷下、水酸化ナトリウム水溶液(2 mmol/L, 3 mL)を加えた後、ジメチルスルホキシド(2.2 mL)に溶解したアクリル酸tert-ブチルエステル (1.93 g, 15.07 mmol)を徐々に添加し、室温で4時間反応した。混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール= 98/2 ⇒ 90/10)で精製することにより、化合物82 (0.74 g, 収率35%)を得た。
ESI-MS m/z: 348 (M + H)+
実施例10の工程48で合成した化合物82 (0.150 g, 0.433 mmol)を用い、実施例1の工程7と同様の方法で化合物83を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1062 (M + HCOO)-
実施例10の工程49で合成した化合物83 (0.149 g, 0.147 mmol)を用い、実施例9の工程46と同様の方法で化合物84を(91.4 mg, 0.114 mmol, 収率67%)得た。
ESI-MS m/z: 799 (M + H)+
実施例10の工程51で合成した化合物84 (1.3 mg, 1.4 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物85を(2.4 mg, 0.768 μmol, 収率54.9%)得た。
ESI-MS m/z: 1562 (M + 2H) 2+
3,5-ジヒドロキシ安息香酸86(東京化成工業社製, 2.11 g, 13.69 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド(35 mL)に溶解し、炭酸水素カリウム(1.716 g, 17.14 mmol)および臭化ベンジル(3.51 g, 2.439 mL, 20.54 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウムを加え、ジクロロメタンで抽出した後、有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(へプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物87を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 245 (M + H)+
工程52で合成した化合物87(3.34 g, 13.69 mmol)をN, N’-ジメチルホルムアミド(40 mL)に溶解し、炭酸カリウム(7.57 g, 54.8 mmol)およびtert-ブチルブロモ酢酸(4.42 mL, 30.1 mmol)を加え、90℃で4時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウムを加え、ジクロロメタンで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(へプタン/酢酸エチル=75/25)で精製することにより、化合物88(5.67 g, 収率88%)を得た。
ESI-MS m/z: 471 (M - H)-
工程53で合成した化合物88(5.67 g, 12.00 mmol)をジクロロメタン(40 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸(10 mL, 130.0 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物89の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 359 (M - H)-
イミノ二酢酸ジ-tert-ブチルエステル (0.407 g, 1.660 mmol)および実施例11の工程54で合成した化合物89 (0.239 g, 0.664 mmol)を用い、実施例1の工程7と同様の方法で化合物90を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 813 (M - H)-
[STEP1] 実施例11の工程55で合成した化合物90 (541 mg, 0.664 mmol)を用い、メタノール (8 mL)に溶解し、パラジウム/炭素による接触水素還元を行った。得られた溶液留分を減圧下、溶媒を留去をした。
[STEP2] 得られた粗生成物および3-アジドプロパン-1-アミン(0.101 g, 1.009 mmol)を用い、実施例1の工程7と同様の方法ででカップリング化合物を得た。
STEP3: 得られた化合物引退して粗生成物を用い、実施例1の工程8と同様の方法で化合物91を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 583 (M + H)+
実施例10の工程50で合成した化合物84 (2.0 mg, 1.476 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物92を(2.0 mg, 収率47%)得た。
ESI-MS m/z: 1456 (M + 2H) 2+
実施例9の工程44で合成した化合物77(63 mg, 0.175 mmol)をジクロロメタン(5 mL)に溶解し、トリエチルアミン(0.24 mL, 1.75 mmol)を加えた後にペンタフルオロフェニル-2,2,2-トリフルオロ酢酸(0.119 mL, 0.699 mmol)を加えて、室温で4時間撹拌した。混合物にクロロホルム添加し、有機層を10%クエン酸水溶液、飽和食塩水、および炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することで化合物93を定量的に取得した。
ESI-MS m/z:(モノエステル体(PEPが一つ付加した化合物)として検出) 524 (M - H)-
実施例12の工程58で合成した化合物93 (0.121 g, 0.175 mmol)をジメチルスルホキシド (8 mL)に溶解し、カルボキシル-(12オリゴエチレングリコール)エチルアミン(0.510 g, 0.444 mmol)を加え、室温、アルゴン雰囲気下にて1h撹拌した。減圧下で溶媒留去し、その後、クロロホルム、10%クエン酸水溶液にて抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物94の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 2614 (M-H)-
実施例12の工程59で合成した化合物94 (0.333 g, 0.092 mmol)を用い、実施例1の工程7と同様の方法で化合物95を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1537 (M + 2H)2+
実施例12の工程60で合成した化合物95 (0.138 g, 0.045 mmol)を用い、実施例9の工程42と同様の方法で化合物96を(0.0825 g, 収率58%)得た。
ESI-MS m/z: 1426 (M + 2H)2+
実施例12の工程61で合成した化合物96 (4.2 mg, 14.04 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物97を(2.1 mg, 収率29%)得た。
ESI-MS m/z: 2590 (M + 2H) 2+
実施例12の工程59で合成した化合物94 (0.189 g, 0.052 mmol)および実施例10 の工程48で合成した化合物 82(0.051 g, 0.148 mmol)を用い、実施例1の工程7と同様の方法で化合物98を(0.087 g, 収率51%)得た。
ESI-MS m/z: 1639 (M + 2H) 2+
実施例13の工程63で合成した化合物98 (0.087 g, 0.027 mmol)を用い、実施例9の工程42と同様の方法で化合物99を(38.5 mg,収率43%)得た。
ESI-MS m/z: 1529 (M + 2H) 2+
実施例13の工程64で合成した化合物99 (4.7 mg, 1.403 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物100を(2.4 mg,収率32%)得た。
ESI-MS m/z: 2689 (M + 2H)2+
[STEP1] 実施例11の工程54で合成した化合物86(0.0678 g, 0.1888 mmol)を用い、実施例12の工程58と同様の方法により活性エステル体を取得した。
[STEP2] STEP1より取得した活性エステル(0.1283 g, 0.185 mmol)を用い、実施例12 の工程59と同様の方法により化合物101(0.2819 g, 0.108 mmol, 収率58.1%)を取得した。
ESI-MS m/z: 2615 (M - H)-
実施例14の工程66で合成した化合物101 (0.282 g, 0.108 mmol)を用い、実施例9の工程45と同様の方法で化合物102(0.085 g, 0.028 mmol, 収率26%)を得た。
ESI-MS m/z:( tBu基が脱離した状態で検出) 712 (M + 4H)4+
実施例14の工程67で合成した化合物102 (84.5 mg, 0.028 mmol)を用い、実施例11の工程56と同様の方法で化合物103を(57.9 mg,収率66%)得た。
ESI-MS m/z: 2837 (M - H)-
実施例14の工程69で合成した化合物103 (4.8 mg, 1.528 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物104(2.6 mg,収率33%)を得た。
ESI-MS m/z: 2584 (M + 2H) 2+
[STEP1] 実施例11の工程54で合成した化合物86(4 mg, 0.011 mmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法でリガンド付加した化合物を(6.0 mg,収率36%)取得した。
[STEP2] STEP1より取得した化合物(6.0 mg, 3.94 μmol)を用い、実施例9 工程42のSTEP1と同様の方法により化合物105(5.6 mg,収率99%)を取得した。
ESI-MS m/z: 1522 (M - H)-
実施例14の工程67で合成した化合物99 (0.204 g, 0.067 mmol)を用い、実施例9の工程45と同様の方法で化合物106を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 2846 (M - H)-
実施例16の工程71で合成した化合物106 (16.7 mg, 5.22 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物107(6.3 mg,収率23%)を得た。
ESI-MS m/z: 2586 (M - H)-
実施例16の工程72で合成した化合物107(6.3 mg, 1.218 μmol)を用い、実施例9 工程46のSTEP1と同様の方法により化合物108(5.6 mg,収率90%)を取得した。
ESI-MS m/z: 2540 (M - 2H) 2-
国際公開2009/073809号に記載された方法で合成した化合物109(0.209 g, 0.414 mmol)を用いて、実施例2の工程9と同様の方法により化合物110(0.116 g,収率43%)を取得した。
ESI-MS m/z: 645 (M + H)+
実施例17の工程74で合成した化合物110 (0.116 g, 0.179 mmol)を用い、実施例9の工程44と同様の方法で化合物111を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 477 (M + H)+
実施例17の工程75で合成した化合物111 (1.1 mg, 1.821 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物112(1.6 mg,収率40%)を得た。
ESI-MS m/z: 2219 (M - H)-
実施例17の工程75で合成した化合物111 (30 mg, 0.05 mmol)を用い、実施例14の工程62と同様の方法で化合物113(88.2 mg,収率43%)を得た。
ESI-MS m/z: 1930 (M - 2H) 2-
実施例18の工程77で合成した化合物113 (8.1 mg, 2.098 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物114(5.9 mg,収率50. %)を得た。
ESI-MS m/z: 2801 (M - 2H)2-
イミノ二酢酸ジ-tert-ブチルエステル115(東京化成工業社製, 0.197 g, 0.803 mmol)を用いて、実施例2の工程9と同様の方法により化合物116を定量的に取得した。
ESI-MS m/z:[ tBu基が脱離した状態で検出] 273 (M + H)+
実施例19の工程79で合成した化合物116 (0.309 g, 0.803 mmol)を用い、実施例9の工程45と同様の方法で化合物117を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 273 (M + H)+
実施例17の工程76で合成した化合物117 (1.2 g, 2.62 mmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物118(1.1 mg, 0.766 mmol, 収率29%)を得た。
ESI-MS m/z: 1436 (M + H)+
実施例10の工程47で合成した化合物82 (0.159 g, 0.459 mmol)を用いて、実施例2の工程9と同様の方法により化合物119(0.096 g, 0.197 mmol, 収率43%)を取得した。
ESI-MS m/z: 487 (M + H)+
実施例20の工程82で合成した化合物119 (96 mg, 0.197 mmol)を用い、実施例9の工程41と同様の方法で化合物120を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 375 (M + H)+
実施例20の工程83で合成した化合物120 (1.0 mg, 2.55 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物121(2.6 mg,収率66%)を得た。
ESI-MS m/z: 1539 (M + H)+
ケミストリー ヨーロピアンジャーナル(Chemistry European Journal), 第19巻, 4786-4797頁, 2013年に記載された方法で合成した化合物122 (1 g, 0.914 mmol)および4-(アミノメチル)フェノール塩酸塩(0.362 g, 2.287 mmol)を用い、前述記載の文献方法により化合物123(0.22 g, 収率23%)を得た。
ESI-MS m/z: 1062 (M + H)+
実施例21の工程85で合成した化合物123(0.2 g, 0.191 mmol)を25%アンモニア水溶液に溶解し、ピリジン(2 mL)およびトリメチルホスフィン(0.12 mL)を添加した後、室温で16時間撹拌した。 混合物を減圧濃縮し、残査をカラムクロマトグラフィーで精製する事で化合物124(0.048 g, 収率25%)を取得した。
ESI-MS m/z: 1037 (M + H)+
[STEP1] ケミストリー ヨーロピアンジャーナル(Chemistry European Journal), 第19巻, 4786-4797頁, 2013年に記載された方法で合成した化合物122 (0.5 g, 0.457 mmol)を用い、工程84と同様の方法によりカップリング化合物 (0.2 g, 収率42%)を得た。
[STEP2] STEP1で合成した化合物 (0.2 g, 0.191 mmol)をノルマルブタノール(2 mL)に溶解し、白金/炭素(200 mg)を用いて12時間接触還元を行った。反応液を減圧濃縮し、残査をカラムクロマトグラフィーで精製する事で化合物125(0.060 g, 収率30%)を取得した。
ESI-MS m/z: 1019 (M + H)+
[STEP1] 実施例1の工程4で合成した化合物5(3.39 g, 8.584 mmol)を用い実施例2の工程10と同様の方法でアジド基を有するカップリング化合物を粗生成物(2.293 g, 収率50%)として得た。
[STEP2] STEP1得られた化合物 (2.293 g, 4.29 mmol)を用い、実施例1の実の工程2と同様の方法により、カルボン酸エステルを加水分解体(2.021 g, 収率93%)を取得した
[STEP3] STEP2で得られた化合物(0.100 g, 0.197 mmol)を用いて実施例12の工程54と同様の方法により活性エステル体を定量的に取得した。
[STEP3] STEP3の方法で得られた活性エステル(0.214g, 0.255 mmol)を用い、実施例12の工程55と同様の方法により化合物126(0.216 g, 収率85%)を得た。
ESI-MS m/z: 2763 (M - H)-
R= R1における結果を以下に示した。 R2の場合においても同様の結果が得られる
[STEP1] 実施例21の工程86で合成した化合物124(9.9 mg, 0.069 mmol)をメタノール(500 μL)に溶解し、28%ナトリウムメトキシド/メタノール溶液(14 uL)を添加した後、室温で一晩静置した。混合物を逆相クロマトグラフィー(水/アセトニトリル)で精製する事によりベンゾイル基が脱保護された目的物を定量的に取得した。
[STEP2] 実施例21の工程87で取得した化合物125(1.4 mg, 0.502 μmol)およびSTEP1より取得した化合物(4.2 mg, 5.02 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物127(0.6 mg, 収率30%)を取得した。
ESI-MS m/z: 1982 (M - 2H) 2-
実施例3の工程18で合成した化合物126 (24 mg, 7.30 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物129(11 mg, 48%)を得た。
ESI-MS m/z: 1608 (M - 2H) 2-
化合物130の合成
[STEP1] 実施例3の工程20で合成した化合物22b (4 mg, 1.342 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法でリガンド付加体 (0.9 mg, 10%)を得た。
[STEP2] STEP1より取得した化合物(0.9 mg, 0.129 μmol)をメタノール(0.6 mL)に溶解し、ナトリウムメトキシド(2 μL, 10 μmol)を添加後、室温で3時間反応させた。 反応液を逆相クロマトグラフィーで分取し、凍結乾燥する事で化合物130(0.3 mg, 44%)を取得した。
ESI-MS m/z: 2642 (M - 2H)2-
化合物131の合成
実施例3の工程20で合成した化合物22b (22 mg, 5.88 μmol)を用い、実施例5の工程26と同様の方法で化合物131(3.6 mg, 17%)を得た。
ESI-MS m/z: 1851 (M + 2H) 2+
工程92
[Method 1]実施例9の工程38と同様の方法で表10-1〜表10-3記載の化合物を用いて第表11-1〜表11-4記載の一本鎖の核酸複合体132〜151を得た。表11-3中のX,Yはオリゴヌクレオチドの3’末端のヌクレオチド構造を表す。
[Method 2] モレキュールズ(Molecules)、第17巻、13825-13843頁、2012年に記載された方法で合成した末端がアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドおよび化合物105を用い、バイオコンジュゲートケミストリー, 第22巻,1723-1728頁, 2011年の方法にて表11-3記載の一本鎖の核酸複合体152および153を得た。
本実施例により合成した核酸複合体の配列および質量分析結果を表12に示す。
表10-1
工程91で合成した1本鎖の糖鎖複合体は、実施例8の工程38と同様の方法で2本鎖の糖鎖複合体154-175を得た。本実施例により合成した核酸複合体を表13-1〜表13-4に示す。表13-3中のX,Yはセンス鎖の3’末端のヌクレオチドを表す。
工程93
実施例26, 27と同様の方法で、化合物148において配列の異なる核酸複合体をそれぞれ得た。以下に核酸複合体の配列および質量分析結果を表15、二本鎖複合体の配列を表16に示す。
10%ウシ胎児血清を含むアールピーエムアイ1640培地 (RPMI1640培地, ナカライテスク社製, 30264-56)(以下10%FBS RPMI1640培地と記載)及びDNase I溶液 (DNase I Solution , StemCell Technology社製, 07900)を用い、ヒトCD14陽性単球細胞 (Untouched Frozen NPB-CD14+ Monocytes, Allcells社製, PB011F)を添付のプロトコルに従って融解した。
その後、組み換えヒトインターロイキン-4 (Recombinant Human IL-4 Protein, R&D System社製, 204-IL)(以下IL-4と記載)を最終濃度100 ng/mL、組み換えヒト顆粒球単球コロニー刺激因子 (Recombinant Human GM-CSF Protein CF, R&D System社製, 215-GM-050/CF) (以下GM-CSFと記載)を最終濃度50 ng/mLとなるように添加し、106 cells/mLの密度で浮遊培養用マルチプレート (SUMILON社製, MS-8006R)に播種し、37 ℃、5%CO2条件下で培養した。
培養開始から3日後及び6日後にIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 50 ng/mLを含む10%FBS RPMI1640培地で培地を半量交換し、樹状細胞へ誘導した。
培養開始から8日後に細胞を回収し、また接着細胞もエチレンジアミン四酢酸溶液 (0.2g/L‐EDTA Solution, ナカライテスク社製, 14367-74)を用いて回収した。遠心操作の後に新しいIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 50 ng/mLを含む10%FBS RPMI1640培地に1,250,000 cells/mLとなるよう再懸濁させ、超低吸着96wellプレート (Corning社製, 3474)に80uLずつ播種した。
被験サンプルとしてはKAC_008及びKAC_009を用い、比較対照としてリガンドを持たないKAC_CTR_001及びCD45遺伝子には相補部位を有さないKAC_CTR_002を設けた。KAC_008の最終濃度は1 μmol/L及び0.3 μmol/Lの2点、KAC_009及びKAC_CTR_001は1 μmol/L, 0.3 μmol/L, 0.1 μmol/Lおよび0.03 umol/Lの4点、KAC_CTR_002は1 μmol/L、N=3で実施した。
核酸複合体溶液の希釈については以下の手順で行った。クエン酸緩衝液 (20 mM Citrate(pH7), 150 mM NaCl)に50 μMで調製された核酸複合体溶液をオプティメム (Opti-MEM(登録商標) I Reduced Serum Medium, Life technologies社製, 31985-070)で5 μMへ希釈し、更なる溶液の希釈にはクエン酸緩衝液とオプティメムが1対9となるように調製した溶液を用いて希釈を行った。希釈した核酸複合体溶液を20 μLずつ細胞溶液に添加、陰性対照群には希釈溶液を20 μL添加して、37 ℃、5%CO2条件下で2日間培養した。
RNAを含む細胞溶解液の調製にはスーパープレップセルライシスキット (SuperPrep(登録商標) Cell Lysis & RT Kit for qPCR, TOYOBO社製, SCQ-101)を用い、同キット付属のアールティーキット (RT Kit for qPCR)を用いてキットに添付された説明書に従って逆転写反応を行い、cDNAを作成した。
このcDNAをPCR反応の鋳型に用い、QuantStudio 12K Flex リアルタイムPCRシステム (アプライドバイオシステムズ社製)を用い、タックマンプローブ (Taqman probe)法によりCD45の遺伝子、及び対照としてグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)(以下GAPDHと記載)の遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、GAPDHのmRNA増幅量を内部対照として、CD45のmRNAの準定量値を算出した。また、陰性対照群におけるCD45及びGAPDHのmRNA増幅量を同様にそれぞれ測定し、CD45のmRNAの準定量値を算出した。
CD45遺伝子の測定にはタックマンプローブHs00894727_m1 (アプライドバイオシステムズ社製)を、GAPDH遺伝子の測定にはHs02758991_g1 (アプライドバイオシステムズ社製)を用い、反応試薬にはTaqMan Gene Expression Master Mix (アプライドバイオシステムズ社製, 4369542)を用いて添付のプロトコルに従って実施した。核酸複合体(ASO導入検体)の標的mRNA量は、陰性対照群(ASO未導入群)におけるCD45のmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図1に示す。
本結果から、被験サンプル(KAC_008, KAC_009) が比較対照 (KAC_CTR_001, KAC_CTR_002)に比べ、強いノックダウン効果を示す事を確認した。
試験例1と同様の手順でヒトCD14陽性単球細胞から樹状細胞を誘導し、超低吸着6 well plate (Corning社製, 3471)に播種し、37 ℃、5%CO2条件下で培養した。3日後にIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 50 ng/mLを含む10%FBS RPMI1640培地で培地を半量交換させ、樹状細胞へ誘導した。
培養開始から6日後に細胞を回収し、遠心操作の後に新しいIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 50ng/mLを含む10%FBS RPMI1640培地に125000 cells/mLとなるよう再懸濁させ、超低吸着96 well plate (Corning社製, 3474)に80 μLずつ播種した。
被験サンプルとしてKAC_010及びKAC_012を用い、比較対照としてリガンドを有さないKAC_CTR_003及びGalNAcリガンドを有するKAC_013, KAC_014を設けた。各ASOの最終濃度は0.3 μmol/L, 0.1 μmol/Lの2点、N=2で実施した。
核酸複合体溶液の希釈については以下の手順で行った。クエン酸緩衝液に40 μMで調製された各核酸複合体溶液をオプティメムで1.5 μMに希釈し、更なる溶液の希釈にはクエン酸緩衝液とオプティメムが3対77となるように調製した溶液を用い希釈を行った。希釈した核酸複合体溶液を20uLずつ細胞溶液に添加し、陰性対照群には希釈溶液を20 μL添加し、37 ℃、5%CO2条件下で培養した。
核酸添加1日後に細胞を回収し、遠心操作後に新しいIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 50 ng/mLを含む10%FBS RPMI1640培地 80 μLに再懸濁させ37 ℃、5%CO2条件下でさらに3日間培養した。
細胞の洗浄溶液は、1%(w/v) BSA含有リン酸緩衝生理食塩水 500 mLに対し、10%アジ化ナトリウム溶液(ナカライテスク社製)を2.5 mL, 0.5 M EDTA溶液 (EDTA (0.5 M), pH 8.0, Ambion社製, AM9260G)を685 μL加えることで調製した。また、上記洗浄溶液に対し20 %(v/v)となるようFcR ブロッキング試薬, ヒト (ミルテニーバイオテク社製、130-059-901)を加えることでFcRブロッキング溶液調製した。
核酸添加4日後に細胞を回収、遠心操作を行った後に、洗浄溶液で一度洗浄操作を行った。上清を除いた後にFcRブロッキング溶液を90 μLずつ添加し、氷上30分静置することでブロッキング反応を行った。
新しいプレートにFcRブロッキング溶液15 μLとB2Mタンパク質に対する抗体 (APC anti-human β2-microglobulin Antibody, Biolegend社製, 316312) 5 μLの混合液を用意しておき、FcRブロッキング後の細胞溶液を80uL加え氷上静置することで抗体を反応させた。
1時間後細胞を回収し、洗浄溶液で3回洗浄を行ったのちに200 μLに再懸濁してBD FACSCantoTM II フローサイトメーター (ベクトン・ディッキンソン社製)にて測定した。
解析ではFlowJo 7.6.5 (トミーデジタルバイオロジー社製)を用い、前方散乱光(FSC)と側方散乱光(SSC)で細胞画分にゲートをかけ、平均蛍光強度 (Mean Fluorescence Intensity)(以下MFIと記載)として幾何平均(Geometric means of the fluorescence intensity)の値により、細胞表面抗原の発現量を測定した。
MFI値の平均値を表した結果を図2に示す。本結果から、被験サンプル(KAC_010, KAC_012)が、比較対照 (KAC_013, KAC_014, KAC_CTR_003)に比べ、低濃度域においてB2Mタンパク質を強くノックダウンする事を確認した。
試験2と同様の手順で樹状細胞を誘導し、培養開始から6日後に超低吸着96 wellプレートに細胞を播種した。
被験サンプルとしてKsiRC_010, KsiRC_011及びKsiRC_012を用い、比較対照としてリガンドを有さないKsiRC_CTR_001及びGalNAcリガンドを有するKsiRC_013及びKsiRC_014を設けた。各siRNAの最終濃度は3 μmol/L, 1 μmol/L, 0.3 μmol/Lの3点、N=1で実施し、核酸を含まない陰性対照群に関してはN=3で実施した。
核酸複合体溶液の希釈については以下の手順で行った。クエン酸緩衝液に40 μMで調製された各核酸をオプティメムで15 μMへ希釈し、更なる溶液の希釈にはクエン酸緩衝液とオプティメムが21対35となるように調製した溶液を用い希釈を行った。希釈した核酸複合体溶液を20 μLずつ細胞溶液に添加し、陰性対照群には希釈溶液を20 μL添加して37 ℃、5%CO2条件下で培養した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、遠心操作を行った後に洗浄溶液で一度洗浄操作を行い、その後は試験例2と同様の手法で細胞表面抗原のB2Mタンパク質の発現量を測定及び解析を実施した。
その結果を図3に示す。陰性対照群については平均±標準偏差を示す。被験サンプル(KsiRC_010, KsiRC_011, KsiRC_012)は、比較対照(KsiRC_013, KsiRC_014, KsiRC_CTR_001)に比べ、顕著なB2Mタンパク質のノックダウンを示した。
試験例2と同様の手順で樹状細胞を誘導し、培養開始から6日後に超低吸着96wellプレートに細胞を播種した。
被験サンプルとしてはKsiRC_010を用い、比較対照としてリガンドを有さないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は3 μmol/L, 1 μmol/L, 0.3 μmol/Lの3点、N=3で実施した。
核酸複合体溶液の希釈及び添加については試験例3と同様の手法で行い、37 ℃、5%CO2条件下で培養した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、遠心操作を行った後に洗浄溶液で一度洗浄操作を行い、その後は試験例1と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。
B2M遺伝子の測定にはタックマンプローブHs00984230_m1 (アプライドバイオシステムズ社製) を、GAPDH遺伝子の測定にはHs02758991_g1 (アプライドバイオシステムズ社製)を用い、反応試薬にはTaqMan Gene Expression Master Mixを用いて添付のプロトコルに従って実施した。siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図4に示す。
被験サンプル (KsiRC_010)は, 比較対照 (KsiRC_CTR_001)に比べ顕著なノックダウン活性の向上を示した。
試験例3と同様の手順で樹状細胞を誘導し、培養開始から6日後に超低吸着96 wellプレートに細胞を播種した。
被験サンプルとしてKsiRC_010, KsiRC_003, KsiRC_004, KsiRC_005, KsiRC_006, KsiRC_008, KsiRC_001, KsiRC_002, KsiRC_007を用い、比較対照にはリガンドを有さないKsiRC_CTR_001、KsiRC_008のsiRNA配列を変更したコントロール体KsiRC_009 (GAPDH標的配列)を設けた。各siRNAの最終濃度は1 μmol/L, 0.3 μmol/Lの2点、N=1で実施し、核酸を含まない陰性対照群に関してはN=2で実施した。
核酸複合体溶液の希釈については以下の手順で行った。クエン酸緩衝液に20 μMで調製された各核酸をオプティメムで5 μMに希釈し、更なる溶液の希釈にはクエン酸緩衝液とオプティメムが1対3となるように調製した溶液を用い希釈を行った。希釈した核酸複合体溶液を20 μLずつ細胞溶液に添加し、陰性対照群には希釈溶液を20 μL添加して37 ℃、5%CO2条件下で培養した。
核酸添加4日後細胞を回収し、遠心操作を行った後に、洗浄溶液で一度洗浄操作を行った。上清を除いた後にFcRブロッキング溶液を75 μLずつ添加し、氷上30分静置することでブロッキング反応を行った。
新しいプレートにB2Mに対する抗体 (APC anti-human β2-microglobulin Antibody, Biolegend社製, 316312) 5 μL、LIVE/DEAD(登録商標) Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific社 L34957) 1 μL、HLA-DRに対する抗体 (Brilliant Violet 421TM anti-human HLA-DR Antibody, Biolegend社製, 307635) 5 μL、CD11cに対する抗体 (PE anti-human CD11c Antibody, Biolegend社製, 301606) 5 μLを含む混合液を用意し、ブロッキング操作をした細胞溶液を65uL加え氷上で1時間静置した。
その後細胞を回収し、洗浄溶液で3回洗浄を行ったのちに、200 μLに再懸濁してBD FACSVerseTM フローサイトメーター (ベクトン・ディッキンソン社製)にて測定した。
解析ではFlowJo 7.6.5を用いた。前方散乱光 (FSC)と側方散乱光 (SSC)で細胞にゲートをかけ、LIVE DEADの陰性画分を生細胞としてHLA-DR及びCD11c陽性画分を解析対象とした。APCチャネルの平均蛍光強度として幾何平均 (Geometric means of the fluorescence intensity)の値により、細胞表面抗原の発現量を測定した。
得られた値を図5に示す。陰性対照群については平均値を示す。被験サンプル (KsiRC_010, KsiRC_003, KsiRC_004, KsiRC_005, KsiRC_006, KsiRC_008, KsiRC_001, KsiRC_002, KsiRC_007)は、比較対照 (KsiRC_CTR_001, KsiRC_009)に比べ、顕著なB2Mタンパク質のノックダウンを示した。
X-VIVO15TM培地 (X-VIVOTM 15 Chemically Defined, Serum-free Hematopoietic Cell Medium, Lonza社製, 04-418Q)を用い、ヒトCD14陽性単球細胞 (Untouched Frozen NPB-CD14+ Monocytes, Allcells社製, PB011F)を添付のプロトコルに従って融解した。
その後、組み換えヒトインターロイキン-4 (Recombinant Human IL-4 Protein, R&D System社製, 204-IL)(以下IL-4と記載)を最終濃度100 ng/mL、組み換えヒト顆粒球単球コロニー刺激因子 (Human GM-CSF premium grade, Miltenyi Biotec社製, 130-093-864, 130-093-865) (以下GM-CSFと記載)を最終濃度100 ng/mLとなるように添加し、106 cells/mLの密度で6 wellプレート (Falcon(R) マルチウェルセルカルチャープレート 6 well, Corning社製, 353046)に播種し、37 ℃、5%CO2条件下で培養した。培養開始から2日後及び3日後に培地を交換し、樹状細胞へ誘導した。
培養開始から6日後に細胞を回収し、また接着細胞もエチレンジアミン四酢酸溶液 (0.2g/L‐EDTA Solution, ナカライテスク社製, 14367-74)を用いて回収した。遠心操作の後に新しいIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 100 ng/mLを含むX-VIVO15TM培地に500,000 cells/mLとなるよう再懸濁させ、超低吸着96wellプレート (Corning社製, 3474)に200 μLずつ播種し、37 ℃、5%CO2条件下でさらに3日間培養した。
培養開始から9日後に細胞を回収し、遠心操作の後に新しいIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 100 ng/mLを含むX-VIVO15TM培地に625,000 cells/mLとなるよう再懸濁させ、超低吸着96wellプレートに80μLずつ播種した。
被験サンプルとしてはKsiRC_025, KsiRC_027及びKsiRC_029を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は0.3 μmol/L, 0.1 μmol/L、N=3で実施した。
試験例1-5と同様にオプティメム (Opti-MEM(登録商標) I Reduced Serum Medium, Life technologies社製, 31985-070, 31985-088)を用いて希釈した核酸複合体溶液を20 μLずつ細胞溶液に添加、陰性対照群には希釈溶液を20 μL添加して、37 ℃、5%CO2条件下で4日間培養した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例4と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図6に示す。
被験サンプル (KsiRC_025, KsiRC_027及びKsiRC_029)は, 比較対照 (KsiRC_CTR_001)に比べ顕著なノックダウン活性の向上を示した。
試験例6と同様の手法でヒト単球由来樹状細胞を誘導し、各種B2M siRNAの活性を評価した。
被験サンプルとしてはKsiRC_030, KsiRC_031, KsiRC_032, KsiRC_015, KsiRC_016, KsiRC_018, KsiRC_019及びKsiRC_017を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は0.03 μmol/L, 0.01 μmol/L、N=3で実施した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例6と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図7に示す。
被験サンプル (KsiRC_030, KsiRC_031, KsiRC_032, KsiRC_015, KsiRC_016, KsiRC_018, KsiRC_019及びKsiRC_017)は, 比較対照 (KsiRC_CTR_001)に比べノックダウン活性の向上を示した。
試験例6と同様の手法でヒト単球由来樹状細胞を誘導し、各種B2M siRNAの活性を評価した。
被験サンプルとしてはKsiRC_020を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は0.03 μmol/L, 0.01 μmol/L、N=3で実施した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例7と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図8に示す。
被験サンプル (KsiRC_020)は, 比較対照 (KsiRC_CTR_001)に比べノックダウン活性の向上を示した。
試験例6と同様の手法でヒト単球由来樹状細胞を誘導し、各種B2M siRNAの活性を評価した。
被験サンプルとしてはKsiRC_023, KsiRC_024, KsiRC_021及びKsiRC_028を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は0.03 μmol/L, 0.01 μmol/L、N=3で実施した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例8と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図9に示す。
被験サンプル (KsiRC_023, KsiRC_024, KsiRC_021, KsiRC_028)は, 比較対照(KsiRC_CTR_001)に比べノックダウン活性の向上を示した。
試験例6と同様の手法でヒト単球由来樹状細胞を誘導し、各種B2M siRNAの活性を評価した。
被験サンプルとしてはKsiRC_035, KsiRC_036, KsiRC_022, KsiRC_033, KsiRC_034)を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は0.01 μmol/L, 0.003 μmol/L、N=3で実施した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例9と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図10に示す。
被験サンプル (KsiRC_035, KsiRC_036, KsiRC_022, KsiRC_033, KsiRC_034)は, 比較対照 (KsiRC_CTR_001)に比べノックダウン活性の向上を示した。
試験例6と同様の手法でヒト単球由来樹状細胞を誘導し、培養開始から6日後に細胞を回収後、新しいIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 100 ng/mLを含むX-VIVO15TM培地に500,000 cells/mLとなるよう再懸濁させ、超低吸着96wellプレート (Corning社製, 3474)に200μLずつ播種した。この際、特許記載のCD40 抗体(国際公開第02/088186号,Clone:KM341-1-19)を添加し、37 ℃、5%CO2条件下で3日間培養することで成熟樹状細胞を調製した。
培養開始から9日後に細胞を回収し、遠心操作の後に新しいIL-4 100 ng/mL及びGM-CSF 100 ng/mL, CD40抗体を含むX-VIVO15TM培地に625,000 cells/mLとなるよう再懸濁させ、超低吸着96wellプレート (Corning社製, 3474)に80μLずつ播種した。
被験サンプルとしてはKsiRC_003, KsiRC_031, KsiRC_001を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は0.3 μmol/L, 0.1 μmol/L、N=3で実施した。
試験例1-5と同様にオプティメムを用いて希釈した核酸複合体溶液を20 μLずつ細胞溶液に添加、陰性対照群には希釈溶液を20 μL添加して、37 ℃、5%CO2条件下で4日間培養した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例10と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図11に示す。
被験サンプル (KsiRC_003, KsiRC_031, KsiRC_001)は, 比較対照(KsiRC_CTR_001)に比べノックダウン活性の向上を示した。
試験例11と同様の手法で成熟ヒト単球由来樹状細胞を誘導し、各種HPRT1 siRNAの活性を評価した。
被験サンプルとしてはKsiRC_037を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_002を設けた。各siRNAの最終濃度は0.3 μmol/L, 0.1 μmol/L, 0.03 μmol/L、N=3で実施した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例11と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。
HPRT1遺伝子の測定にはタックマンプローブHs99999909_m1 (アプライドバイオシステムズ社製) を、GAPDH遺伝子の測定にはHs02758991_g1 (アプライドバイオシステムズ社製)を用い、反応試薬にはTaqMan Gene Expression Master Mixを用いて添付のプロトコルに従って実施した。siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、HPRT1のmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図12に示す。
被験サンプル (KsiRC_037)は, 比較対照 (KsiRC_CTR_002)に比べノックダウン活性の向上を示した。
X-VIVO15TM培地を用い、ヒトCD14陽性単球細胞 (Untouched Frozen NPB-CD14+ Monocytes, Allcells社製, PB011F)を添付のプロトコルに従って融解した。
その後、GM-CSFを最終濃度100 ng/mLとなるように添加し、375,000 cells/mLの密度に希釈後、96 wellプレート (NuncTM MicroWellTM 96-Well Microplates, Thermo Fisher Scientific社製, 167008)に200 μL播種、37 ℃、5%CO2条件下で培養することで単球由来マクロファージ細胞を調製した。
培養開始から7日後に上清を除去し、新しい GM-CSF 125 ng/mLを含むX-VIVO15TM培地を80 μLずつ添加した。
被験サンプルとしてはKsiRC_001, KsiRC_030, KsiRC_031及びKsiRC_032を用い、比較対照としてリガンドを持たないKsiRC_CTR_001を設けた。各siRNAの最終濃度は1 μmol/L, 0.3 μmol/L, 0.1 μmol/L、N=3で実施した。
試験例1-5と同様にオプティメムを用いて希釈した核酸複合体溶液を20 μLずつ細胞溶液に添加、陰性対照群には希釈溶液を20 μL添加して、37 ℃、5%CO2条件下で4日間培養した。
核酸添加4日後に細胞を回収し、その後は試験例12と同様の手法でmRNAの発現量を測定した。siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群 (陰性対照群)における、B2MのmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。そのmRNA量の相対的な割合を平均±標準偏差で表した結果を図13に示す。
被験サンプル (KsiRC_001, KsiRC_030, KsiRC_031及びKsiRC_032)は, 比較対照 (KsiRC_CTR_001)に比べノックダウン活性の向上を示した。
配列番号2は、ApoB-ASOの塩基配列を示す。
配列番号3は、B2M-ASOの塩基配列を示す。
配列番号4は、B2M-ssRNAの塩基配列を示す。
配列番号5は、B2M-asRNAの塩基配列を示す。
配列場号6は、GAPDH-ssRNAの塩基配列を示す。
配列番号7は、GAPDH-asRNAの塩基配列を示す。
配列番号8は、Hprt-1ssRNAの塩基配列を示す。
配列番号9は、Hprt-1asRNAの塩基配列を示す。
Claims (20)
- 糖鎖リガンドがリンカーを介してオリゴヌクレオチドと結合した核酸複合体であって、糖鎖リガンドが、糖鎖リガンドの非還元末端にO結合マンノースを有する、核酸複合体。
- 糖鎖リガンドが、CD209および/またはCD206に結合親和性を示す構造を有する、請求項1に記載の核酸複合体。
- 糖鎖リガンドが、O結合マンノースの1位でエーテル結合を介してシクロヘキサン骨格と結合している、請求項1または2に記載の核酸複合体。
- 糖鎖リガンドが、下記構造を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸複合体。
R1およびR2は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基、置換または非置換の炭素数2〜20のアルケニル基、置換または非置換の炭素数3〜20のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Y1およびY2は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびNR3からなる群から選択される基であり、
R3は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基である。) -
R1 ’およびR2 ’は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基、置換または非置換の炭素数2〜20のアルケニル基、置換または非置換の炭素数3〜20のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Y1 ’およびY2 ’は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびNR3 ’からなる群から選択される基であり、
R3 ’は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基である。) - Y1およびY2またはY1 ’およびY2 ’がNHである、請求項4または5に記載の核酸複合体。
- R1およびR2またはR1 ’およびR2 ’が置換または非置換のアラルキル基である、請求項6に記載の核酸複合体。
- 糖鎖リガンドが、下記構造で示される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸複合体。
R1 ’’およびR2 ’’は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基、置換または非置換の炭素数2〜20のアルケニル基、置換または非置換の炭素数3〜20のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Y1 ’’およびY2 ’’は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびNR3 ’’からなる群から選択される基であり、
R3 ’’は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基である。) - 糖鎖リガンドが、下記構造で示される、請求項8に記載の核酸複合体。
R1 ’’’およびR2 ’’’は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基、置換または非置換の炭素数2〜20のアルケニル基、置換または非置換の炭素数3〜20のアルキニル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、置換または非置換のヘテロ脂環基、および置換または非置換のアラルキル基からなる群から選択される基であり、
Y1 ’ ’’およびY2 ’ ’’は、それぞれ独立して、酸素原子、硫黄原子、およびNR3 ’’からなる群から選択される基であり、
R3 ’ ’’は、水素原子あるいは置換または非置換の炭素数1〜20のアルキル基である。) - 糖鎖リガンドを2〜8個有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸複合体。
- リンカーが、下記構造のいずれかの構造を有する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸複合体。
X1は、CHまたは窒素原子である。
X2〜X4は、それぞれ独立して、CHまたは窒素原子である。) - リンカーが、下記構造を有する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸複合体。
- リンカーが、下記構造を有する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の核酸複合体。
n1は、1〜100の整数である。) - リンカーが、下記構造のいずれかの構造を有する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の核酸複合体。
n2およびn3は、それぞれ独立して、1〜100の整数である。) - 前記オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の核酸複合体。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
- 細胞内に導入するための、請求項16に記載の医薬組成物。
- 前記細胞が樹状細胞またはマクロファージである、請求項17に記載の医薬組成物。
- 静脈内投与または皮下投与される、請求項16〜18のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸複合体または請求項16〜19のいずれか1項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
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