JPWO2017217347A1 - IgG結合ペプチドによる部位特異的RI標識抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)下記の式I:
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgGと結合可能であり、かつ放射性金属核種と結合し得るリガンドを含む、ペプチド。
(2)下記の式I:
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgGと結合可能であり、かつ放射性金属核種で標識された、ペプチド。
(3)下記の式V:
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、アルギニン残基、又はアスパラギン酸残基であり、かつ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgGと結合可能であり、かつ放射性金属核種がリガンドを介して結合している、ペプチド。
(4)ペプチドとIgGとの複合体であって、Xaa1が架橋剤で修飾されている、上記に記載のペプチドとIgGの架橋反応によって形成される、前記複合体。
(5)放射性金属核種がペプチドに結合している、(2)又は(3)に記載のペプチド又は(4)に記載の複合体を含む、核医学画像診断剤又は癌の診断剤。
(6)被験体の癌の罹患の有無を決定する方法であって、
被験体から得られたサンプルに、放射性金属核種がペプチドに結合している、(2)又は(3)に記載のペプチド又は(4)に記載の複合体を反応させる工程、
サンプル中の放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
放射能のレベル又は存在に基づいて、被験体の癌の罹患の有無を決定する工程、
を含む、方法。
(7)被験体の癌の罹患の有無を決定する方法であって、
放射性金属核種がペプチドに結合している、(2)又は(3)に記載のペプチド又は(4)に記載の複合体を、被験体に投与する工程、
被験体において、放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
放射能のレベル又は存在に基づいて、被験体の癌の罹患の有無を決定する工程、
を含む、方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-117395号、2016-227025号の開示内容を包含する。
一態様において、本発明は、放射性金属核種と結合し得るリガンドを含むIgG結合ペプチドに関する。IgG結合ペプチド中におけるリガンドの位置は特に限定しないが、例えばIgG結合ペプチドのN末端又はC末端、好ましくはN末端に連結させることができる。リガンドをペプチドに連結させる方法は当業者には周知である。例えば、リガンドをIgG結合ぺプチドのN末端に連結させる場合には、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS)、イソチオシアノ基(ITC)、スルホン酸クロリド、カルボン酸クロリド、エチレンオキシド、アルキルクロリド、アルデヒド基、及びカルボン酸無水物等の反応基をリガンドに付加し、これをIgG結合ペプチドのN末端のアミノ基と反応させればよい。あるいは、このようなリガンドを含むIgG結合ペプチドを、周知の合成法等により直接合成してもよい。
本明細書中で使用する「IgG」は、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット、マウス、及びウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物のIgG、好ましくはヒトのIgG(IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4)を指すものとする。本明細書におけるIgGは、さらに好ましくは、ヒトIgG1、IgG2、若しくはIgG4、又はウサギIgGであり、特に好ましくはヒトIgG1、IgG2、又はIgG4である。
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgGと結合可能である。
システイン残基を2つ以上、好ましくは2つ含むペプチドと、以下の式:
(X1-3)-C-(X1)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X1-3) (I')
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Nはアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
(X1-3)-C-A-(X1)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3) (I'')
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、かつ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、又はグルタミン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
1番目のアミノ酸残基= S、G、F、R又は、なし
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は、なし
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は、なし、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は、なし。
5番目のアミノ酸残基= A又はT、
6番目のアミノ酸残基= Y又はW。
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、かつ、
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号1)、
2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号2)、
3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(配列番号3)、
4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号4)、
5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号5)、
6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号6)、
7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号7)、
8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号8)、
9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(配列番号9)、
10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号10)、
11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号11)、
12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号12)、
13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号13)、
14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号36)
15)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号14)、
16)DCAYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号15)、
17)DCTYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号16)、及び
18)DCAWH(Xaa1)GELVWCT(配列番号17)、
(式中、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、Xaa2はホモシステインであり、好ましくはホモシステイン同士は互いにジスルフィド結合を形成している)。
1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号1)、
2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号2)、
13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号13)、及び
14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号36)が挙げられ、
特に好ましい例として、2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号2)が挙げられる(式中、Xaa1はリシン残基であり、Xaa2はホモシステインであり、好ましくはシステイン同士及び/又はホモシステイン同士は互いにジスルフィド結合を形成している)。
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、アルギニン残基、又はアスパラギン酸残基であり、かつ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
18)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号18)、
19)DCAYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号19)、
20)DCSYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号20)、
21)DCTWT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号21)、
22)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT(配列番号22)、
23)DCTYR(Xaa1)GNLVWCT(配列番号23)、
24)DCTYS(Xaa1)GNLVWCT(配列番号24)、
25)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT(配列番号25)、
26)DCTYT(Xaa1)GELVWCT(配列番号26)、
27)DCTYT(Xaa1)GRLVWCT(配列番号27)、
28)DCTYT(Xaa1)GDLVWCT(配列番号28)、及び
29)DCTYT(Xaa1)GNLIWCT(配列番号29)、
(式中、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸である)。
一態様において、本発明における上記IgG結合ペプチドは、架橋剤により修飾されていることが好ましい。
一態様において、本発明は、本発明の架橋剤で修飾されているIgG結合ペプチドとIgGを混合する工程を含む、IgG結合ペプチドとIgGの複合体を生産する方法に関する。本工程により、架橋剤で修飾されているIgG結合ペプチドとIgGの間で架橋反応が生じ得る。架橋反応は、特にIgG結合ペプチドの上記Xaa1のアミノ酸残基とIgG FcのLys248又はLys246、好ましくはLys248の間で部位特異的に生じ得る。
一態様において、本発明は、本発明のIgG結合ペプチドとIgGとの複合体に関する。該複合体は、上記架橋反応によって形成され得る。よって、本発明は、好ましくは、IgG結合ペプチドの上記Xaa1のアミノ酸残基とIgG FcのLys248又はLys246、好ましくはLys248とが部位特異的に架橋剤を介して結合したIgG結合ペプチドとIgGとの複合体に関する。
一態様において、本発明は放射性金属核種が結合している上記IgG結合ペプチド、上記架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチド、又は上記架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチドとIgGの複合体を含む、核医学画像診断剤又は癌の診断剤に関する。
被験体から得られたサンプルに、本明細書に記載のIgG結合ペプチド、又はIgG結合ペプチドとIgGの複合体を反応させる工程であって、放射性金属核種が、前記IgG結合ペプチドに結合している工程、
サンプル中の放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
放射能のレベル又は存在に基づいて、被験体の癌の罹患の有無を決定する工程、
を含む、方法に関する。
被験体から得られたサンプルに、本明細書に記載のIgG結合ペプチドとIgGの複合体を反応させる工程であって、放射性金属核種が、前記IgG結合ペプチドに結合している工程、
サンプル中の放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
放射能のレベル又は存在に基づいて、抗原又はIgGを検出する工程、
を含む、方法に関する。サンプルにおける抗原又はIgGを検出することで、被験体における抗原又はIgGの分布状況及び/又は体内動態を推測することができる。
本明細書に記載のIgG結合ペプチド、又はIgG結合ペプチドとIgGの複合体を被験体に投与する工程であって、放射性金属核種が、前記IgG結合ペプチドに結合している工程、
被験体において、放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
放射能のレベル又は存在に基づいて、被験体の癌の罹患の有無を決定する工程、
を含む、方法に関する。
被験体において、放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
放射能のレベル又は存在に基づいて、抗原又はIgGを検出する工程、
を含む、方法に関する。本方法は、好ましくは核医学画像診断法である。本方法により、被験体における抗原又はIgGの分布状況及び/又は体内動態を推測することができる。
<方法>
(1)IgG結合ペプチド溶液の作製
G(HC)DCAYHRGELVWCT(HC)H-NH2の配列(配列番号31、ただし、HCはホモシステインであり、4番目と14番目の2つのCys、2番目と16番目の2つのホモシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成する)を有する環状ホモシステインペプチドを、F-moc法によるペプチド固相合成法にて常法に従い調製した。調製したIgG結合ペプチド0.8mgの粉末を24μLの100%ジメチルスルホキシド(和光純薬)で溶かし、IgG結合ペプチド溶液を調製した。
ヒトIgG(中外製薬)のヒンジ部分を、10mM EDTAおよび1mM L-システインを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)中において37℃でパパイン(ロシュ社製)を用いて切断した。続いて、ヒトIgG Fcを、陽イオン交換カラム(TSKgel SP5-PW(東ソー))を用いて、流速1mL/min、20mM 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH5.0)中、0-0.3 M NaClのグラジエント溶出にて精製した。16mg/mLのヒトIgG Fcを含む63μLの溶液(0.1M 塩化ナトリウム(和光純薬)、0.04M 2−モルホリノエタンスルホン酸(和光純薬)(pH6.0))を、上記(1)で作製したIgG結合ペプチド溶液2μLと混合し、FcとIgG結合ペプチドとの複合体溶液を調製した。
FcとIgG結合ペプチドとの複合体の結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法により得た。すなわち、上記(2)で作製したFcとIgG結合ペプチドとの複合体溶液0.3μLと結晶化剤(20% ポリエチレングリコール3350(シグマアルドリッチ)、0.2Mヨウ化カリウム(和光純薬)(pH6.9))0.3μLを、結晶化用ロボットであるHydoraII+(マトリックス社製)を用いて、インテリ結晶化プレート(ベリタス社製)のS1ウェル上で混合し、結晶化ドロップとした。リザーバー溶液としては、上記結晶化剤70μLを分注した。プレートをPowerSeal CRISTAL VIEW(グライナーバイオ−ワン社製)で密閉後、20℃の恒温槽内に約2週間静置し、結晶を得た。
上記(3)で得られた結晶を、安定化母液(22%ポリエチレングリコール3350、0.2M ヨウ化カリウム、0.1M 塩化ナトリウム、25%グリセロール(w/v)、0.04M 2−モルホリノエタンスルホン酸(pH6.0))に移し、−170℃の窒素ガス気流にて急速凍結し、X線回折データを振動法にて測定した。X線の波長は1オングストローム、振動角は1°/フレームで実施した。次に、回折強度データ処理プログラムHKL2000(HKL Research社製)を使用して、回折強度データを分解能3.0オングストロームで処理した。その結果、結晶の空間群がP21であり、格子定数がa=66.1オングストローム、b=60.5オングストローム、c=69.5オングストローム、α=γ=90°、β=101.3°であった。得られたデータのCompletenessは99.9%、Rmergeは13.8%であった。
DCAYHRGELVWCT(配列番号33)について、上記(4)で得られた回折強度データを、CCP4(Collaborative Computational Project Number 4)に含まれるプログラムPhaserを利用して分子置換法による位相決定を試みた。分子置換法のサーチモデルにはProtein Data Bank(PDB、URL:http://www.rcsb.org/pdb/)にPDB accession code:1DN2として登録されているFc部分のモデルを利用した。その結果、非対称単位中に1分子のモデルを見出すことができた。次にCCP4に含まれる構造精密化プログラムRefmac5を用いた構造精密化とモデル構築プログラムであるX−tal viewを用いたモデルの修正を繰り返し実施し、FcとIgG結合ペプチド(DCAYHRGELVWCT(配列番号33))との複合体の結晶構造を得た。Fcのペプチド結合部位にIgG結合ペプチドに相当する電子密度が観測された。決定した結晶構造の正確さの指標であるR因子は、0.216であった。さらに、精密化の段階で計算に入れなかった全反射の5%に相当する構造因子から計算されるRfree因子は0.317であった。
上記のX線結晶解析の構造を基に、計算科学ソフトウェアMOE(Molecular Operating Environment)上で架橋構造モデルを作成した。DCAYHRGELVWCT(配列番号33)の6番目のアミノ酸をLysに置換後、このLysのεアミノ基と抗体Fcの248番目Lysのεアミノ基の間をつなぐ形で、DSG又はDSSによる架橋構造をモデル化した。
図1Aに示した様に、IgG結合ペプチドは、プロテインAの結合部位と重なるCH2とCH3ドメインの境界領域に結合し、既に報告されているIgG結合ペプチドFc-III(DeLano, W. L. et al., Science, 2000, 287, pp. 1279-1283)と類似した形でIgGと結合していると考えられた。IgG結合ペプチドとFcとの特徴的な相互作用は、IgG結合ペプチドの8番目の残基Argの側鎖のグアニジノ基が、2.91オングストロームでFcのGlu380(EU numberingに基づく。以下同じ)の側鎖のカルボン酸と塩結合している点である。このGlu380の側鎖は、ヒトIgG Fcの中で、Lys248と塩結合して分子内での塩結合のネットワークを形成しており、IgG結合ペプチドのArg8とFcのLys248は、FcのGlu380との相互作用を介して近づいていた。そこで、IgG結合ペプチドの8番目の残基ArgをLysに換え、この塩結合のネットワーク構造に類似した形で、ペプチドのLys8と抗体のLys248の側鎖のアミノ基を架橋剤で架橋することを考案した。実際に、IgG結合ペプチドとヒトIgG Fcとの複合体構造をベースに、DSG(ジスクシンイミジルグルタレート)もしくはDSS(ジスクシンイミジルスベレート)による架橋構造のモデルを作成したところ、空間的にも抗体の主鎖構造のひずみを伴わずに架橋剤の導入が可能であると考えられた(図1B)。
<方法>
アミノ基をBiotinもしくは5/6TAMURA succinimidyl ester(AnaSpec, Inc.)(蛍光色素)で修飾したamino-PEG4化合成ペプチドGPDCAYHXGELVWCTFH(配列番号2)(ただし、C末端はアミド化)はFmoc固相合成法により常法に従って合成した。保護基を除去した後、pH8.5の水溶液中酸化条件下で分子内S-S結合を形成させ、逆相HPLCを用いて、流速1.0ml/min、0.1%のTFAを含む10%から60%のアセトニトリルのグラジエント溶出によって分子内S-S結合を有するペプチドを精製した。
架橋構造の導入が、IgG結合ペプチドの特異性及び親和性に影響を与えるか検討するため、架橋構造を導入したIgG結合ペプチドのIgGへの結合力をSPR解析で測定した(表1)。8残基目のアルギニンをリジンに置換したIgG結合ペプチド(以下、Type I(R8K)とも称する)のヒトIgG に対する親和性は131 nM (Kd) であり、置換前のIgG結合ペプチド(以下、Type Iとも称する)と比べ10倍親和性が低下した。Type I(R8K)ペプチドに各架橋剤を結合させたものでは、ヒトIgG に対する親和性は、Type I(R8K)-DSG-OHで約330 nM (Kd)、Type I(R8K)-DSS-OHで約390 nM (Kd) であり、架橋剤が結合することによる親和性の大きな減少は見られなかった。いずれのペプチドにしても、Kd値でμM以下の親和性を有することから、十分特異的な標識化が可能であると考えられた。
<方法>
実施例2と同様の方法によってN末端にBiotin-PEG4を付加したIgG結合ペプチド(TypeI(R8K))をDSS又はDSGで修飾した標識化試薬ペプチドを調製し、これをヒトIgG Fcを反応させ、ヒトIgG Fcの標識化反応を検討した。即ち、実施例2と同様の方法によって過剰なDSS又はDSGと反応させたIgG結合ペプチド(R8K)(200 pmol/5μL in 0.1% TFA)を逆相カラムにて精製後、減圧下でアセトニトリルを除去した後、0.5M Na2HPO4を約1/8加えて中和し、ただちにタンパク質サンプル(hIgG(中外製薬)、hIgA(Athens Research&Technology)、HSA(シグマアルドリッチ)、又は血清(健常者から採血したもの))(各40 pmol/5μL、血清については、PBSにより10倍希釈したものを使用)に、モル比10倍量で加え、最終量をPBS で20μLにした後、室温で5分放置した。その後、1M Tris-HCl(pH=7.0)を1μl加え反応を停止した後、4xSDSサンプル溶液6.7μl及び2-メルカプトエタノール1.4μl(最終5%)を加え、95℃、10minで処理後、プレキャストゲルSuperSepTMAce,5-20%(和光純薬)を用いてSDS-PAGEを行った。泳動後のゲルは、ホーファー・セミホールTE70(Hoefer Semiphor TE70)トランスブロットシステムを用いて35mA、60分で、PMDF膜に転写後、0.5%BSAでブロッキングを行った。ビオチン化ペプチドで標識されたタンパク質は、SAコンジュゲートHRP(1000倍希釈、Vector Laboratories)を用いて、化学発光試薬(イムノスター(登録商標)ベーシック、和光純薬)により検出した。
図2Bに示した様に、ウエスタンブロッティングにおいて、IgGと反応させた場合にのみ、複合体とみられるバンドが観察されたことから、DSG又はDSSと反応させたIgG結合ペプチドは、ともに、IgAやHAS、血清中のIgG以外のタンパク質とは結合せずに、IgGに選択的に結合していることがわかった。
<方法>
(1)反応モル比の検討
96穴マイクロプレート(Nunc(登録商標)MaxiSorp)のウェルに、各タンパク質(IgG(中外製薬)、IgA(Athens Research & Technology)、又はBovine gelatin(和光純薬))(50 ng(0.33 pmol)/μl/well)を含む0.1 M NaHCO3溶液をプレートに加えて室温で一晩放置することによって、各タンパク質をプレートの表面に吸着させ、0.5 % BSAでブロッキングを行なった後、各ウェルに、実施例2と同様に調製したDSGで修飾したビオチン化IgG結合ペプチド(モル比で、0,1,2,5,10)を加え、1時間経過後、1M Tris-HCl (pH7.0)を3μL加え反応を停止した。0.5 % BSA で2000倍希釈したSA-HRP(Vector Laboratories)を50μL加え、室温で一時間反応後、0.1% PBSTで5回洗浄後、HRPの呈色にTMB溶液(Wako Chemicals)を用いて、5分の発色反応後、450nmの吸光度をELISAプレートリーダー(モデル 680 マイクロプレートリーダー(バイオラッド))にて測定した。
50ng/50μLの溶液により4℃で一晩固定化したhIgG(50 ng)に対しDSGで修飾したビオチン化IgG結合ペプチドをモル比2で加え、各反応時間(0〜60分)で、1M Tris-HCl (pH7.0)を3μL加え反応を停止した。結合の検出は(A)と同様に行った。
DSS標識化IgG結合ペプチドを用いて、抗体と反応させるモル数及び反応時間の違いによる反応効率をELISAにて検討した (図3)。即ち、プラスティックプレートに固定化したIgG結合ペプチドのモル比を1から10まで変化させてhIgGと反応させたところ、ほぼモル比5のあたりで飽和がみられたことから、モル比5程度のペプチド試薬を加えれば、抗体の標識化には充分であると考えられた(図3A)。DSSで修飾していないビオチン化IgG結合(R8K)ペプチド(NO DSS R8K)では極めて弱い結合がみられているが、これは、非共有結合で結合したペプチドによる結合活性と考えられる。さらに、標識化IgG結合ペプチド試薬を過剰に加えても、他のタンパク質(hIgA、Bovine gelatinあるいはブロッキング剤として用いているBSA)への結合は全く検出されなかった。
<方法>
IgG(中外製薬)、IgA(Athens Research & Technology)、又はBSA(シグマアルドリッチ)(15 μg:IgG換算で100 pmol)と実施例2に従って調製したDSG架橋ペプチド又はDSS架橋ペプチド(500 pmol)を200μL中で室温にて60 min反応させ、1M Tris-HCl (pH=7.0)を10μL加え反応を停止させた。その後、SuperdexTM200 10/30GL 直径1.0cm×30cm(GEヘルスケア);流速:0.3ml/min;ランニングバッファー:PBS pH 7.4、にてサイズ排除クロマトグラフィーを行い、蛍光検出器 RF-10A(島津製作所)(励起光:541 nm 蛍光: 565 nm)を用いて測定を行った。
DSS又はDSGを反応させた標識化IgG結合ペプチドを各タンパク質に対するモル比1:5でタンパク質と室温にて60 min反応させ、サイズ排除クロマトグラフィーにて分析した。いずれの標識化IgG結合ペプチド(DSS又はDSG)を用いても、IgGへの反応性の特異性は同程度であり、hIgAやBSA等の他のタンパク質への蛍光標識化は、全く検出されなかった(図4)。以上のことから、作製したいずれのIgG結合ペプチドを用いても、高い特異性を持って、ヒトIgGを蛍光標識できることがわかった。
<方法>
ヒトIgG(中外製薬)のFc溶液(20μM、0.1M酢酸緩衝液pH4.5)200μLと、DMF中に溶解した、実施例2と同様の方法によってDSG修飾したIgG結合ペプチド(RGNCAYHXGQLVWCTYH(配列番号35)、Xはリジン)(4mM)を0.5、1.0、2.0、5.0μL(モル比で0.5、1.0、2.0、5.0)加え、素早く撹拌後、室温で15分反応し、1M Tris-HCl(pH7.0)を10μL加え、反応を停止させた。反応物50μLをShodex IEC SP-825カラムを接続したNGC Chromatography system(バイオラッド)にインジェクトし、25mM Acetate buffer(pH4.5)から1M NaClを含む25mM Acetate buffer(pH4.5)へのグラジエント溶出を行い、タンパク質の溶出を、215nmの吸光度でモニターした。得られた各ピークを分取し、LC/MSによる分子量測定に供した。
ヒトIgG1-FcとDSG修飾したIgG結合ペプチド(4mM、Biotin-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH-NH2;分子量2760、XはDSG化したリジンで、2つのCysは分子内SS結合を形成)をモル比で0.5、1.0、2.0、又は5.0で反応させたところ、図5Aに示した様に、元のヒトIgG1-Fcの溶出位置のピーク(ピーク2)と2つのピーク3、4が現れた(ピーク1は、DSG化したIgG結合ペプチドであると考えられる)。これらの分子種を同定するために、LCMS解析を行った。反応前のIgG1-Fcは、イオン交換クロマトグラムではピーク1のところに溶出され、LCMS解析では、55084という値が得られた。反応後の2、3、4のピークのLCMS解析を行ったところ、それぞれ、55087、57735(55087+2648)、60384(55087+5297)という値が得られた。このことから、反応後のピーク2は、未反応のFcであり、ピーク3と4は、Fcにそれぞれ1つ及び2つのペプチドが結合したものであることがわかった。
<方法>
pH4.0(25mM酢酸緩衝液)、pH5.5(25mM酢酸緩衝液)、又はpH7.0(PBS)にて調製したヒトIgGのFc溶液200μLに対し、実施例5で調製した、DMF中に溶解したDSG修飾したIgG結合ペプチド(4 mM)を1.0μL(モル比で1.0)加え、素早く撹拌後、室温で反応した。反応後1、5、10、又は30分に、1M Tris-HCl(pH7.0)を10μL加え、反応を停止させ、反応物50μLをShodex IEC SP-825カラムを接続したNGC Chromatography system(バイオラッド)にインジェクトし、25mM Acetate buffer(pH4.5)から1M NaClを含む25mM Acetate buffer(pH4.5)へのグラジエント溶出を行い、タンパク質の溶出を、215nmの吸光度でモニターした。得られたクロマトグラムを基に各ピークの比率を計算した。
図6に示した様に、試験したpH 4.0、pH 5.5、及びpH 7.0のいずれにおいても標識化反応は早く、反応の90%以上が1分以内に終了していることがわかった。また、pH4.0では、未反応物の残量が40%を超えており反応収率が低く、特に、2つのペプチドの付加物(ピーク4)の収量が15%程度と他のpHの場合(35-40%)に比べ低かった。pH 5.5及び7.0では、未反応物の収量も10%台と低く、効率よく反応していることがわかった。pH5.5と7.0の差としては、若干、ピーク4の収量がpH 7.0で低くなる傾向が見られた。
1)DTPA含有IgG結合ペプチドの作製
N末のアミノ基をDTPA-tetra(tBu)ester(CheMatech社製)で修飾したアミノPEG4化IgG結合ペプチドGPDCAYHKGELVWCTFH(配列番号37、分子内の2つのCysはSS結合を形成、C末端はアミド化)はFmoc固相合成法により常法に従って合成した。脱保護後、精製したDTPA-IgG結合ペプチドをDMSO20μL(19mM)に溶解した。ペプチド溶液へアセトニトリルに溶解したDSG(500mM)20μLとピリジン0.2μL(最終濃度0.5%)を加え、50℃で3時間反応させた。全量を0.1%TFAを含む15%アセトニトリル10mlに希釈し、遠心後の上清を、InertSustain(登録商標) C18 カラム(7.6mm 1×250mm, GL Science)にインジェクションし、0.1%TFAを含む15%から80%までのアセトニトリルのグラジエントで溶出した。溶出物の質量分析を行い、目的物(DSG修飾DTPA-PEG4化IgG結合ペプチド)を回収後、溶媒を除去し、その後凍結乾燥した。
上記1)で調製したDSG修飾DTPA-PEG4化IgG結合ペプチドを5.0mMの濃度でDMSO中に溶解した溶液1.36μLと、10mM酢酸緩衝液(pH5.5)に溶解した6.8μMの抗HER2ヒト抗体(Trastuzumab)(中外製薬)1mLを混合し、室温で30分間反応(ペプチドと抗体のモル比=1:1)させた。このようにして調製したDTPA修飾ヒト抗体(抗体薬物複合体、ADC)は、陰イオン交換カラムShodex QA825(8.0mm×75mm, Shodex)にて、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.0)を含む0Mから0.5MまでのNaClのグラジエント溶出にて精製した。未反応の抗体以外の2本のピーク(ピークA,B)を分取後、Vivaspin(10000Daカットオフ、Sartorius)上で、3000gで遠心することによって脱塩濃縮を行った。得られたサンプルは、MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG(Bruker Daltonics)で質量を測定し、ピークAが元の抗HER2ヒト抗体に比べ2716(理論値2722)、ピークBが元の抗HER2ヒト抗体に比べ5398(理論値5444)増えていることから、それぞれ、DTPAが付加されたDTPA-PEG4化IgG結合ペプチドが、1つ(抗HER2抗体―DTPA*1)、及び2つ(抗HER2抗体―DTPA*2)導入されていることを確認した。
上記2)で調製したDTPA修飾Trastuzumabをマイクロピペットで正確に量り取り、容量1.5mLのエッペンチューブに入れた。これに10mM クエン酸含有0.15M酢酸-アンモニア緩衝液(pH5.5)を加えた。DTPA修飾Trastuzumab溶液全量をマイジェクターで抜き取り、15mL容量の無色ガラス製バイアルに入れた。DTPA修飾Trastuzumab溶液全量と同量の[111In]Cl3溶液をマイジェクターで抜き取り、無色ガラス製バイアルに入れ、よく混和した。なお、[111In]に対するDTPA修飾Trastuzumabのモル数が20-100倍となるように調製した。これを室温で30分間反応させた。反応終了後、放射能量をラジオアイソトープ・ドーズ・キャリブレーターで測定した。
HER2高発現細胞株SK-OV-3(ヒト由来卵巣癌細胞)及びHER2低発現細胞株MDA-MB-231(ヒト由来乳癌細胞)(いずれもAmerican Type Culture Collectionから入手)をTrypsin-EDTA混合液を用いて回収し、無血清培地で1.5×107個/mLに調製した細胞懸濁液を作製した。細胞懸濁液200μLをマイクロピペットで正確に量り取り、容量1.5mLのマイクロチューブに入れ、氷冷した。なお、サンプル数をそれぞれ3とした。
マウス(BALB/c、nu/nu、19週齢、♀、各1例)の左右下肢にSK-OV-3(HER2高発現細胞株)及びMDA-MB-231(HER2低発現細胞株)を移植した担癌モデルを作製し、SPECT/CTイメージングを行った。SPECTイメージングには2種類の[111In]標識Trastuzumab(Trastuzumab1分子に対してDTPA結合ペプチド1分子又は2分子を修飾したもの)を使用した。
111In標識Trastuzumabは上記「3)DTPA修飾Trastuzumabの111In標識、及び[111In]標識DTPA修飾Trastuzumabの放射化学純度の確認」に記載した方法で調製し、限外ろ過法にて精製したものを以降の実験に使用した。なお抗体1分子内にDTPAを1分子有するものを[111In]標識Trastuzumab-1、2分子有するものを[111In]標識Trastuzumab-2とした。
BALB/c nu/nuヌードマウスの左下肢にHER2高発現細胞株SK-OV-3を移植し、右下肢にHER2低発現細胞株MDA-MB-231を移植した担癌モデルを作製した。なお、各細胞は同一個体に移植した。ヌードマウスは日本エスエルシー株式会社から購入し、6週齢の雌を6匹用いた。イメージング実施日当日に各腫瘍体積を測定し、イメージング実験に適切な腫瘍体積を有するモデルを2例選出した。また、これらのマウスに使用した各癌細胞は、それぞれAmerican Type Culture Collectionから入手したものを用いた。
(SPECT撮像)
移植後13週に、[111In]標識Trastuzumab-1溶液(3.83MBq)または[111In]標識Trastuzumab-2(2.64MBq)溶液をモデル尾静脈から投与した。投与後4時間以降よりSPECT/CTカメラ(製品名:FX3000 Pre-Clinical Imaging System)での撮像を実施した。以降、投与後24時間、48時間の時点で撮像を実施した。
CT撮像は各腫瘍組織が同時にSPECT撮像の視野内に収まっていることを確認するためにSPECT撮像の前に実施した。イソフルランによる麻酔導入を行い、麻酔を維持した状態でアニマルベッドに装着した。当モデルをCT装置内に入れ、X線を照射し、腫瘍が視野の中心になるように位置決めを実施した。CT撮像は以下に示す撮影条件にて実施し、腫瘍のCT画像(rawファイル)を取得した。
Project count:200views
Frames averaged:1frames/view
Detector binning:2x2
X-ray tube current:Default(150 μA)
X-ray tube voltage:60kV
Exposure time:230ms
Magnification:1.8
[111In]標識Trastuzumab-1溶液または[111In]標識Trastuzumab-2溶液投与後の各時間点でSPECT及びCTの融合画像を作製し、冠状面で表示した。
N末アセチル化RRC(Acm保護)-PEG4化合成ペプチドGPDCAYHXGELVWCTFH(配列番号2、Xはリジンで、C末端はアミド化)を、ペプチド合成ビーズ(Rink-amide-Chemmatrix resin、Biotage)上にて、Fmoc固相合成法により常法に従って合成した。樹脂からのペプチドの切り出し、脱保護を行った後、ペプチド(図10、a)を得た。得られたペプチド65mg(15.6μmol)を6 M Gn・HClを含むリン酸緩衝液 (pH =7.3)5 mLに溶解し、これにアセトニトリル120μLに溶解した1, 3-Dichloro-2-propanone (2.9 mg, 23.4 μmol, 1.5等量モル)を加えて、室温で攪拌した。1時間後、HPLC分析によって反応の終了を確認し、反応溶液を直接HPLCにて精製することによって、環化ペプチド(図10、b、33 mg、7.8 μmol、収率50%)を得た。この環化ペプチドに対して、90%酢酸水溶液(8.8 mL)に懸濁した酢酸銀(30.8 mg, 184.5 μmol)を加えて、室温下、遮光で5時間攪拌した。ジチオスレイトール(DTT:352 mg, 2.3 mmol)を加え、生じた沈殿を遠心分離によって除去し、得られた上清をHPLCによって、精製することで、環化ペプチド(図10、c、20.5 mg、5.2 μmol、収率67%)を得た。
<方法>
1)デフェロキサミン含有IgG結合ペプチドの作製
N末のアミノ基をデフェロキサミン-tetra(tBu)ester(CheMatech社製)で修飾したアミノPEG4化IgG結合ペプチドGPDCAYHKGELVWCTFH(配列番号37、分子内の2つのCysはSS結合を形成、C末端はアミド化)はFmoc固相合成法により常法に従って合成した。脱保護後、精製したデフェロキサミン-IgG結合ペプチドをDMSO40μL(18mM)に溶解した。ペプチド溶液へアセトニトリルに溶解したDSG(500mM)40μLとピリジン0.5μL(最終濃度0.6%)を加え、50℃で3時間反応させた。全量を0.1%TFAを含む15%アセトニトリル10mlに希釈し、遠心後の上清を、InertSustain(登録商標) C18 カラム(6.0×250mm, GL Science)にインジェクションし、0.1%TFAを含む10%から66%までのアセトニトリルのグラジエントで溶出した。溶出物の質量分析を行い、目的物(DSG修飾デフェロキサミン-PEG4化IgG結合ペプチド)を回収後、溶媒を除去し、その後凍結乾燥した。
上記1)で調製したDSG修飾デフェロキサミン-PEG4化IgG結合ペプチドを13mMの濃度でDMSO中に溶解した溶液10μLと、10mM酢酸緩衝液(pH5.5)に溶解した22μMの抗HER2ヒト抗体(Trastuzumab)(中外製薬)1mLを混合し、室温で2時間反応(ペプチドと抗体のモル比=6:1)させた。このようにして調製したデフェロキサミン修飾ヒト抗体(抗体薬物複合体,ADC)は、陰イオン交換カラムQA-825(8.0mm×75mm, Shodex)にて、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.0)を含む0Mから0.5MまでのNaClのグラジエント溶出にて精製した。未反応の抗体以外の2本のピーク(ピークA,B)を分取後、Vivaspin(登録商標)(10000Daカットオフ,Sartorius)上で、3000gで遠心することによって脱塩濃縮を行った。得られたサンプルは、MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG(Bruker Daltonics)で質量を測定し、ピークAが元の抗HER2ヒト抗体に比べ2716(理論値2722)、ピークBが元の抗HER2ヒト抗体に比べ5398(理論値5444)増えていることから、デフェロキサミンが付加されたデフェロキサミン-PEG4化IgG結合ペプチドが、それぞれTrastuzumabに1分子または2分子導入されていることを確認した。
89Zrを200MBq/200μLになるように、1Mシュウ酸溶液に溶解した。マイクロチューブに200μLの89Zr -シュウ酸溶液、90μLの2M炭酸ナトリウムを加え、室温で3分間放置した。3分間放置した後のマイクロチューブに、撹拌しながら1030μLの5mg/mLゲンチジン酸含有0.5M HEPES緩衝液(pH7.1-7.3)を加えた。この溶液650μLに、上記2)で調製したデフェロキサミン修飾Trastuzumab(1価または2価)300μLを加え混和し、反応バイアル中の反応液のpHがpH6.8-7.2であることをpH試験紙で確認した。pH確認後、1時間室温にて反応させた。その後、PD-10カラムを20mLの5mg/mLゲンチジン酸含有0.25M酢酸ナトリウム(pH5.4-5.6)で溶媒交換した後、89Zr標識溶液をPD-10カラム(GEヘルスケア)に付した。1.5mLの5mg/mLゲンチジン酸含有0.25M酢酸ナトリウム(pH5.4-5.6)を加え、溶出液を廃棄した。2mLの5mg/mLゲンチジン酸含有0.25M酢酸ナトリウム(pH5.4-5.6)を加え溶出液を0.2mLずつ分取した。放射能を含む分画を集め、限外ろ過用遠心カラム(Amicon Ultra、メルクミリポア社製)による濃縮操作を行った。逆相修飾シリカゲル薄層クロマトグラフィー(TLC)プレート、TLCシリカゲル 60 RP-18 F254s(メルクミリポア)を用い、50mM EDTA(pH5.0)を展開溶媒として、89Zr標識溶液を展開した。展開後のTLCプレートをイメージングプレート(富士フィルム)に曝露し、フルオロ・イメージアナライザー(FLA−7000、GEヘルスケア社製)でオートラジオグラムを取得した。得られたオートラジオグラムの原点のピーク面積の割合から、[89Zr]標識Trastuzumab(1価または2価)の放射化学純度[%]を算出した。
マウス(BALB/c-nu/nu、♀、13週齢)の左右下肢にSK-OV-3(HER2高発現細胞株)及びMDA-MB-231(HER2低発現細胞株)(いずれもAmerican Type Culture Collectionから入手)を移植した担癌モデルを作製し、PETイメージングを行った。PETイメージングには上記3)に従って調製した2種類の[89Zr]標識Trastuzumab(Trastuzumab1分子に対してデフェロキサミン結合ペプチド1分子又は2分子を修飾したもの)を使用した。なお抗体1分子内にデフェロキサミンを1分子有するものを[89Zr]標識Trastuzumab-1、2分子有するものを[89Zr]標識Trastuzumab-2とした。
[89Zr]標識Trastuzumab-1及び[89Zr]標識Trastuzumab-2をそれぞれ投与後6、24及び48時間に撮像したPET画像を、腫瘍を含むスライス画像として、図11に示した。図11に示される通り、[89Zr]標識Trastuzumab-1及び[89Zr]標識Trastuzumab-2は、HER2低発現腫瘍組織と比較して、HER2高発現腫瘍組織への高い集積を認めた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (25)
- 下記の式I:
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgGと結合可能であり、かつ放射性金属核種と結合し得るリガンドを含む、ペプチド。 - 下記の式I:
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (I)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgGと結合可能であり、かつ放射性金属核種で標識された、ペプチド。 - 放射性金属核種が、111In、89Zr、64Cu、67/68Ga、及び99mTcからなる群から選択される、請求項1又は2に記載のペプチド。
- 放射性金属核種が、リガンドを介してペプチドに結合している、請求項2又は3に記載のペプチド。
- 前記リガンドが、N末端に連結されている、請求項1又は4に記載のペプチド。
- 前記リガンドが、キレート剤である、請求項1、4又は5に記載のペプチド。
- 前記キレート剤が、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、デフェロキサミン、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸(DOTA)、1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-三酢酸(NOTA)、及びエチレンジアミン四酢酸(EDTA)からなる群から選択される、請求項6に記載のペプチド。
- 放射性金属核種とリガンドの組み合わせが、111InとDTPA、89Zrとデフェロキサミン、及び64CuとDOTA又はNOTAからなる群から選択される、請求項4又は5に記載のペプチド。
- 下記の式II:
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (II)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、かつ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のペプチド。 - 下記の式III:
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (III)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、又はグルタミン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13〜17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、請求項9に記載のペプチド。 - 17アミノ酸残基とした場合の、N末端から1〜3、15〜17番目の各アミノ酸残基が、
1番目のアミノ酸残基= S、G、F、R又は、なし
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン、又は、なし
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン、又は、なし、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は、なし
である、請求項1〜10のいずれか一項に記載のペプチド。 - 以下の1)〜14)のいずれかのアミノ酸配列からなる、ただし、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、以下の14)においてXaa2はホモシステインである、請求項9に記載のペプチド。
1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(配列番号1)
2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号2)
3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(配列番号3)
4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号4)
5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号5)
6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号6)
7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(配列番号7)
8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(配列番号8)
9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(配列番号9)
10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号10)
11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号11)
12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(配列番号12)
13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(配列番号13)
14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H(配列番号36) - 下記の式IV:
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、かつ、
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のペプチド。 - 下記の式V:
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、アルギニン残基、又はアスパラギン酸残基であり、かつ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgGと結合可能であり、かつ放射性金属核種がリガンドを介して結合している、ペプチド。 - 請求項1〜15のいずれか一項に記載のペプチドにおいて、N末端がPEG化及び/又はC末端がアミド化されている、請求項1〜15のいずれか一項に記載のペプチド。
- Xaa1がリシン残基である、請求項1〜16のいずれか一項に記載のペプチド。
- Xaa1が架橋剤で修飾されている、請求項1〜17のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記架橋剤が、DSG(ジスクシンイミジルグルタレート)、DSS(ジスクシンイミジルスベレート)、DMA(アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩)、DMP(ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩)、DMS(スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩)、DTBP(3,3'-ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩)、及びDSP(ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸)からなる群より選択される、請求項18に記載のペプチド。
- 前記架橋剤がDSG(ジスクシンイミジルグルタレート)又はDSS(ジスクシンイミジルスベレート)である、請求項19に記載のペプチド。
- GPDCAYHKGELVWCTFH(配列番号37、分子内の2つのCys(C)はSS結合を形成)のアミノ酸配列からなる、請求項17〜20のいずれか一項に記載のペプチド。
- ペプチドとIgGとの複合体であって、架橋剤で修飾されている、請求項18〜21のいずれか一項に記載のペプチドとIgGの架橋反応によって形成される、前記複合体。
- 放射性金属核種がペプチドに結合している、請求項2〜21のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項22に記載の複合体を含む、核医学画像診断剤又は癌の診断剤。
- 被験体の癌の罹患の有無を決定する方法であって、
被験体から得られたサンプルに、放射性金属核種がペプチドに結合している、請求項2〜21のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項22に記載の複合体を反応させる工程、
サンプル中の放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
放射能のレベル又は存在に基づいて、被験体の癌の罹患の有無を決定する工程、
を含む、方法。 - 被験体の癌の罹患の有無を決定する方法であって、
放射性金属核種がペプチドに結合している、請求項2〜21のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項22に記載の複合体を、被験体に投与する工程、
被験体において、放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
放射能のレベル又は存在に基づいて、被験体の癌の罹患の有無を決定する工程、
を含む、方法。
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