JPWO2017135348A1 - 標的ｄｎａの測定方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後に標的ＤＮＡを適切に解析できる方法を提供する。より具体的には、本発明は、以下を含む、標的ＤＮＡの測定方法を提供する：
（１）溶液中においてゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して、（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片、（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片、及び（ｃ）標的ＤＮＡを含まないＤＮＡ断片を含有する混合液を得ること；
（２）（ｂ）のＤＮＡ断片を前記混合液から除去して、（ａ）のＤＮＡ断片、及び（ｃ）のＤＮＡ断片を含有する溶液を得ること；並びに
（３）前記（２）で得られた溶液において標的ＤＮＡを解析すること。

Description

本発明は、標的ＤＮＡの測定方法に関する。
標的核酸の解析前に、標的核酸の純度又は濃度がしばしば高められている。例えば、特許文献１は、標的核酸及び非標的核酸を含有する混合液から非標的核酸を除去することを開示している。特許文献２は、標的核酸及び非標的核酸を含有する混合液から標的核酸を単離又は精製することを開示している。
国際公開第２０１０／０９１８７０号 国際公開第２００６／１２１８８８号
本発明者らは、制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応を要する標的ＤＮＡの解析において、ゲノムＤＮＡが完全に切断されていない場合、標的ＤＮＡを適切に解析できないおそれがあるという課題があることを見出した。
例えば、制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後に標的ＤＮＡ中に存在する修飾核酸塩基を検出する場合、標的ＤＮＡ中に存在する修飾核酸塩基のみならず、ゲノムＤＮＡにおいて標的ＤＮＡの５’又は３’末端側にある１以上の未切断部位を介して標的ＤＮＡに連結する非標的ＤＮＡ中に存在する修飾核酸塩基もまた検出されるおそれがある。
また、当該非標的ＤＮＡの少なくとも一部の領域が標的ＤＮＡと対合し得る場合、単一鎖内において非標的ＤＮＡが標的ＤＮＡと効率良く相補結合し得ることから、核酸プローブを用いた標的ＤＮＡの解析に支障をきたすおそれがある。
すなわち、本発明の課題は、制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後に標的ＤＮＡを適切に解析できる方法を提供することである。
本発明者らは、鋭意検討した結果、制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後に標的ＤＮＡを解析する場合、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去後に標的ＤＮＡを解析すればよいことを着想し（例、図１を参照）、本発明を完成するに至った。特許文献１及び２は、標的核酸の純度又は濃度を高めることについて記載しているが、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片を除去すること、及び標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去後に標的ＤＮＡを解析することについては記載も示唆もしていない。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、標的ＤＮＡの測定方法：
（１）溶液中においてゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して、（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片、（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片、及び（ｃ）標的ＤＮＡを含まないＤＮＡ断片を含有する混合液を得ること；
（２）（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片を前記混合液から除去して、（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片、及び（ｃ）標的ＤＮＡを含まないＤＮＡ断片を含有する溶液を得ること；並びに
（３）前記（２）で得られた溶液において標的ＤＮＡを解析すること。
〔２〕前記除去が非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いて行われる、〔１〕の方法。
〔３〕非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブが以下の核酸プローブである、〔２〕の方法：
（１）５’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ；
（２）３’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ；又は
（３）５’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ、及び３’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブの組み合わせ。
〔４〕前記解析が標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いて行われる、〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕標的ＤＮＡ中の修飾核酸塩基が解析される、〔１〕〜〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕修飾核酸塩基がメチルシトシンである、〔５〕の方法。
〔７〕前記解析が、イムノアッセイ、質量分析、電気化学分析、高速液体クロマトグラフィー分析、又はナノポア分析により行われる、〔１〕〜〔６〕のいずれかの方法。
本発明の方法は、制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後に標的ＤＮＡを適切に解析することができる。切断効率の低い制限酵素をゲノムＤＮＡの切断に用いる場合、本発明の方法は特に有用である。また、標的ＤＮＡの測定に要する総時間の短縮のため、制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応の時間を短縮する必要がある場合、本発明の方法は特に有用である。
図１は、本発明の方法の概要を示す図である。 図２は、種々の反応時間における制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後の未切断ＤＮＡ量を示す図である。 図３は、標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブにより捕捉された未切断ＤＮＡ量を示す図である。 図４は、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いた、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去効率（未切断率の相対評価）を示す図である。
本発明の方法は、下記（１）〜（３）により行われる：
（１）溶液中においてゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して、（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片、（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片、及び（ｃ）標的ＤＮＡを含まないＤＮＡ断片を含有する混合液を得ること；
（２）（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片を前記混合液から除去して、（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片、及び（ｃ）標的ＤＮＡを含まないＤＮＡ断片を含有する溶液を得ること；並びに
（３）前記（２）で得られた溶液において標的ＤＮＡを解析すること。
（１）ゲノムＤＮＡの切断
本発明で用いられるゲノムＤＮＡは、任意の生物学的サンプルから得られるものである。このような生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、魚類、ウイルスが挙げられる。生物学的サンプルはまた、血液自体又は血液に由来するサンプルである血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、乳汁、組織又は細胞抽出液、あるいはこれらの混合物であってもよい。生物学的サンプルはさらに、疾患（例、癌、白血病）に罹患している哺乳動物、又は疾患に罹患している可能性がある哺乳動物に由来するものであってもよい。ゲノムＤＮＡは、このような生物学的サンプルから、任意の方法（例、ゲノムＤＮＡ抽出法）により適宜入手することができる。
溶液中においてゲノムＤＮＡを制限酵素で切断することにより、以下のＤＮＡ断片を含有する混合液が得られる（例、図１を参照）：
（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片；
（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片；及び
（ｃ）標的ＤＮＡを含まない種々のＤＮＡ断片。
制限酵素によるゲノムＤＮＡの切断は、制限酵素の種類に応じた適切な温度及び反応時間で行うことができる。本発明で用いられる制限酵素は、２本鎖ＤＮＡを切断する能力を有する酵素であり、２本鎖ＤＮＡの切断により平滑末端又は粘着末端のいずれを生じるものであってもよい。このような制限酵素としては、例えば、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｃＩＩＩ、ＡｃｌＩ、ＡｆａＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｌｕＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ５１ＨＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｓｕＩＩ、ＢａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｃｉＴ１３０Ｉ、ＢｃｎＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｎＩ、ＢｍｅＴ１１０Ｉ、ＢｍｇＴ１２０Ｉ、Ｂｐｕ１１０２Ｉ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、Ｂｓｐ１４０７Ｉ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｐＴ１０７Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、Ｂｓｔ１１０７Ｉ、ＢｓｔＰＩ、ＢｓｔＸＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、ＤｄｅＩ、ＤｒａＩ、ＤｐｎＩ、ＥａｅＩ、Ｅａｍ１１０５Ｉ、Ｅｃｏ５２Ｉ、Ｅｃｏ８１Ｉ、Ｅｃｏ０６５Ｉ、Ｅｃｏ０１０９Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＴ１４、ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＦｂａＩ、ＦｏｋＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ１Ｉ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｆｌＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｐＩ、ＭｕｎＩ、ＮａｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｈＢＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓｐＲＳＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｃａＩ、ＳｆｉＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｉＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、Ｓｓｅ８３８７Ｉ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＴａｑＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、Ｖａｎ９１Ｉ、ＶｐａＫ１１ＢＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、及びＸｓｐＩが挙げられる。標的ＤＮＡの測定に要する総時間の短縮のため、制限酵素によるゲノムＤＮＡの切断反応時間は短縮されてもよい。本発明の方法は、制限酵素によるゲノムＤＮＡの切断が不完全であっても、ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡを適切に解析できるためである。
（２）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去
標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去は、不完全切断ＤＮＡ断片中の非標的ＤＮＡを利用して行うことができる。例えば、このような除去は、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いた不完全切断ＤＮＡ断片の除去、又は標的ＤＮＡ及び非標的ＤＮＡの総和の分子量に基づく分画による不完全切断ＤＮＡ断片の除去により行うことができる。
好ましくは、除去は、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いて行うことができる。非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブとは、ゲノムＤＮＡにおいて標的ＤＮＡの５’又は３’末端側にある１以上（例えば１〜３、好ましくは１または２、より好ましくは１）の制限酵素認識部位（未切断部位）を介して標的ＤＮＡに連結する非標的ＤＮＡ（例、図１を参照）の一部又は全部に相補的な核酸プローブを意味する。
非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、ＤＮＡプローブ又は異種核酸プローブであってもよい。
異種核酸プローブとは、標的ＤＮＡの主鎖構造（糖部分及びリン酸部分から構成される構造）と異なる主鎖構造を、主鎖構造の一部又は全体として有する核酸プローブを意味する。異種核酸プローブとしては、例えば、ＲＮＡプローブ（例、２’位にヒドロキシル基を有する天然リボヌクレオチドから構成されるノーマルＲＮＡプローブ、及び２’位のヒドロキシル基がメチル基等のアルキル基で修飾されているリボヌクレオチドから構成される修飾ＲＮＡプローブ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ロック型核酸（ＬＮＡ）プローブ又は架橋型核酸（ＢＮＡ）プローブ、ホスホロチオエート（Ｓ化）核酸プローブ、並びにこのような２以上の核酸プローブが連結したキメラ型核酸プローブ、このような１以上の核酸プローブとＤＮＡプローブが連結したキメラ型核酸プローブが挙げられる。
低コストの観点から、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、ＤＮＡプローブであってもよい。
非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを構成するヌクレオチド残基の個数（即ち、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブの長さ）は、非標的ＤＮＡとハイブリダイズし得る程度に十分な長さである限り特に限定されないが、例えば１２個以上、好ましくは１５個以上、好ましくは１８個以上、より好ましくは２０個以上であってもよい。非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを構成するヌクレオチドの個数はまた、例えば、１００個以下、８０個以下、６０個以下又は５０個以下であってもよい。非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、当該分野で公知のプローブ合成法により調製できる。
非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、遊離の形態、又は固相に固定された形態で用いることができる。非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、固相への固定を可能にする物質又は基で標識されていてもよい。標識は、例えば、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブの５’末端又は３’末端にて行うことができる。固相への固定を可能にする基又は物質としては、例えば、共有結合的な固相への結合を可能にする基又は物質、及び親和性物質が挙げられる。共有結合的な固相への結合を可能にする基又は物質としては、例えば、チオール基又はチオール基を有する物質（非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブに導入されたこのようなチオール基は、固相上のマレイミド基と結合できる）、アミノ基又はアミノ基を有する物質（非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブに導入されたこのようなアミノ基は、固相上の無水マレイン酸と結合できる）が挙げられる。親和性物質としては、例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、及び二本鎖核酸の形成能を有する互いに相補的な一本鎖核酸の対（例、ポリＡ配列を有する一本鎖核酸とポリＴ配列を有する一本鎖核酸の対）が挙げられる。この場合、固相としては、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブが有する親和性物質と親和性を有する別の親和性物質でコーティングされたものを用いることができる。非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、遊離の形態で用いられる場合、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片とのハイブリッド形成後に、固相に固定されてもよい。
固相としては、例えば、粒子（例、磁性粒子）；メンブレン（例、ニトロセルロース膜）、ガラス、プラスチック及び金属等の支持体；並びにプレート（例、マルチウェルプレート）、チューブ等の容器が挙げられる。
より好ましくは、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、以下である：
（ｉ）５’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ；
（ｉｉ）３’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ；
（ｉｉｉ）５’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ、及び３’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブの組み合わせ。
５’隣接ＤＮＡとは、ゲノムＤＮＡにおいて標的ＤＮＡの５’末端側にある制限酵素認識部位（未切断部位）を介して標的ＤＮＡに隣接する非標的ＤＮＡ（制限酵素切断単位）を意味する（例、図１を参照）。したがって、５’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブとは、このような５’隣接ＤＮＡの一部又は全部に相補的な核酸プローブを意味する。
３’隣接ＤＮＡとは、ゲノムＤＮＡにおいて標的ＤＮＡの３’末端側にある制限酵素認識部位（未切断部位）を介して標的ＤＮＡに隣接する非標的ＤＮＡ（制限酵素切断単位）を意味する（例、図１を参照）。したがって、３’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブとは、このような３’隣接ＤＮＡの一部又は全部に相補的な核酸プローブを意味する。
このような５’隣接ＤＮＡ及び／又は３’隣接ＤＮＡを用いることで、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片を効率良く除去することができる。
５’隣接ＤＮＡ及び３’隣接ＤＮＡは、ＤＮＡプローブ又は異種核酸プローブであるが、低コストの観点から、ＤＮＡプローブであってもよい。
より詳細には、工程（２）は、以下により行われてもよい：
（２−１）非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを混合液に合わせること；
（２−２）混合液をインキュベートして、上記核酸プローブ及び上記（ｂ）のＤＮＡ断片を含むハイブリダイゼーション複合体を得ること；
（２−３）混合液から又は混合液中でハイブリダイゼーション複合体を分離して、上記（ａ）及び（ｃ）のＤＮＡ断片を含む溶液を得ること。
工程（２−１）では、適量の上記核酸プローブが混合液と合わせられる。例えば、上記核酸プローブが混合液に添加されてもよい。あるいは、上記核酸プローブが固定された固相に混合液が移されてもよい。上記核酸プローブは、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片を効率良く除去するため、ゲノムＤＮＡにおけるその標的部位（１当量）に対して過剰量で用いられてもよい。
工程（２−２）では、混合液のインキュベーションによりハイブリダイゼーション複合体が得られる。インキュベーションは、ハイブリダイゼーション複合体を形成し得る任意の条件下で行うことができる。このような条件（例、溶液の塩濃度、インキュベーション温度、インキュベーション時間）は周知である（例、国際公開第２０１０／０９１８７０号、国際公開第２００６／１２１８８８号、国際公開第２０１５／０２５８６２号；国際公開第２０１５／０２５８６３号；国際公開第２０１５／０２５８６４号；国際公開第２０１５／１０８１７７号を参照）。
工程（２−３）では、分離は、例えば、固相を利用して行うことができる。上記核酸プローブが固相として磁性粒子に固定されている場合、磁力操作することにより混合液中の磁性粒子を収集することができるので、磁性粒子を含まない混合液上清を回収することで、上記（ｂ）のＤＮＡ断片の量が低減された、上記（ａ）及び（ｃ）のＤＮＡ断片を含む目的の溶液を得ることができる。上記核酸プローブが固相として支持体又は容器に固定されている場合、混合液を支持体又は容器から移すことで、目的の溶液を得ることができる。上記核酸プローブは、固相に固定されていない場合であっても、固相への固定を可能にする物質又は基で標識されているときには、ハイブリダイゼーション複合体形成後に固相に固定することが可能であるので、上記と同様にして、目的の溶液を得ることができる。
（３）標的ＤＮＡの解析
標的ＤＮＡの解析は、任意の方法により行うことができる（例、国際公開第２０１５／０２５８６２号；国際公開第２０１５／０２５８６３号；国際公開第２０１５／０２５８６４号；国際公開第２０１５／１０８１７７号；ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３，３７−４２（２００６）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７７（２），５０４−５１０（２００５）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８３，７５９５−７５９９（２０１１）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４（８），ｅ６１（２００６）；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５０１（２），ｓｒｅｐ００５０１（２０１２））。例えば、標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いて、標的核酸を捕捉した後に、標的ＤＮＡが解析されてもよい。
標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブとは、ゲノムＤＮＡ中に見出される標的ＤＮＡ（制限酵素による切断単位。図１を参照）の一部又は全部に相補的な核酸プローブを意味する。標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、上述したようなＤＮＡプローブ又は異種核酸プローブであるが、高特異性等の観点から、異種核酸プローブであってもよい。
標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを構成するヌクレオチド残基の個数は、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブについて述べたものと同様である。
標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、遊離の形態、又は固相に固定された形態で用いることができる。標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブは、固相への固定を可能にする物質又は基で標識されていてもよい。標識、固相、固相への固定を可能にする基、固相への固定を可能にする物質の詳細は、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブについて述べたものと同様である。
本発明の方法では、標的ＤＮＡ中の特定の領域、例えば、当該領域中の修飾核酸塩基が解析されてもよい。修飾核酸塩基とは、核酸塩基に対して修飾された構造を有する核酸塩基をいう。用語「核酸塩基」としては、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）が挙げられる。核酸塩基は、好ましくはシトシン（Ｃ）である。修飾としては、例えば、核酸塩基への置換基の導入、核酸塩基が有する基（例、アミノ基、オキソ基、メチル基）の脱離、核酸塩基が有する基の置換基への交換が挙げられる。置換基としては、天然に存在する核酸塩基が保有し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２，Ｔａｂｌｅ ２：Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチド中の修飾核酸塩基が保有する置換基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、日本特許庁により公開されている「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン（平成１４年７月）又は（平成２１年１２月）」の附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。置換基は、好ましくは、メチル、ヒドロキシメチル、カルボキシルであり、より好ましくは、メチル、ヒドロキシメチルであり、さらにより好ましくはメチルである。置換等の修飾の位置は、特に限定されないが、ピリミジン環を有する核酸塩基（Ｃ又はＴ）の場合には、例えば、２位、４〜６位であり、好ましくは５位であり、プリン環を有する核酸塩基（Ａ又はＧ）の場合には、例えば、２位、６位、８位である。
修飾核酸塩基は、天然に存在し得るものである限り特に限定されないが、例えば、Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｔｒｅａｔｙ（２００９年１月１日施行版），Ａｎｎｅｘ Ｃ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２，Ｔａｂｌｅ ２：Ｌｉｓｔ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓに記載される修飾ヌクレオチドが保有する修飾核酸塩基が挙げられる。本資料中に記載される修飾ヌクレオチドは、上記ガイドラインの附属書２，表２：修飾塩基表に記載される修飾ヌクレオチドと同一であり得る。したがって、修飾核酸塩基については、上記ガイドラインもまた参照できる。修飾核酸塩基は、好ましくは、メチルシトシン（例、５−メチルシトシン）、ヒドロキシメチルシトシン（例、５−ヒドロキシメチルシトシン）、カルボキシルシトシン（例、５−カルボキシルシトシン）であり、より好ましくは、メチルシトシン及びヒドロキシメチルシトシンであり、さらにより好ましくはメチルシトシンである。修飾核酸塩基は、核酸の機能の変化をもたらすこと（例、所定の遺伝子の転写調節能の変化）が知られている。
上述したような修飾核酸塩基の解析は、当該分野で公知である任意の方法により行うことができる。例えば、修飾核酸塩基の解析は、イムノアッセイ（例、国際公開第２０１５／０２５８６２号；国際公開第２０１５／０２５８６３号；国際公開第２０１５／０２５８６４号；国際公開第２０１５／１０８１７７号；ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３，３７−４２（２００６））、質量分析（例、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７７（２），５０４−５１０（２００５））、電気化学分析（例、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８３，７５９５−７５９９（２０１１））、高速液体クロマトグラフィー分析（例、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４（８），ｅ６１（２００６））、またはナノポア分析（例、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５０１（２），ｓｒｅｐ００５０１（２０１２））により行うことができる。例えば、標的ＤＮＡを固相に捕捉した後、解析が行われてもよい。例えば、質量分析、電気化学分析、または高速液体クロマトグラフィー分析により修飾核酸塩基が解析される場合、固相に捕捉された標的ＤＮＡをエンドヌクレアーゼまたは／およびエキソヌクレアーゼにより分解して、ＤＮＡ断片がモノマー塩基（ヌクレオチド）に分解された溶液を回収した後、この溶液をこのような技術に付すことで、修飾核酸塩基を解析できる。また、ナノポア分析により修飾核酸塩基が解析される場合、固相に捕捉された標的ＤＮＡをアルカリ性水溶液による処理、または加熱処理により固相上から解離して、ＤＮＡ断片を含む溶液を得た後、この溶液をナノポア分析に付すことで、修飾核酸塩基を解析できる。本発明では、用いたゲノムＤＮＡ量又は標的ＤＮＡ量を考慮して、修飾核酸塩基による標的ＤＮＡの修飾頻度を評価してもよい。
以下、実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１：制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後の未切断率の評価（１）
（１−１）ゲノムＤＮＡの切断
１．８μｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）と３ｕｎｉｔｓの制限酵素ＸｓｐＩ（タカラバイオ社製）を、反応Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＫＣｌ）２０μＬ中に溶解させ、３７℃で０分、又は２０分、４０分、６０分反応させることで、制限酵素ＸｓｐＩにより切断されたゲノムＤＮＡを得た。
（１−２）ゲノムＤＮＡの未切断率の評価
上記で得られた制限酵素切断ゲノムＤＮＡを、制限酵素ＸｓｐＩの切断部位を挟む領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセットを使用したリアルタイムＰＣＲ増幅により、制限酵素によって切断された割合を測定した。
リアルタイムＰＣＲ増幅を以下に示す。
Ｐｒｅｍｉｘ ＰＣＲ試薬（ＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ：ＴＯＹＯＢＯ社製）：１２．５μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：０．５μＬ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：０．５μＬ
５０ｘ ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ：０．０５μＬ
２５倍希釈した制限酵素切断ゲノムＤＮＡ：２μＬ
Ｔｏｔａｌ：２５μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’−ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＣＣ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＣＧ−３’（配列番号１）、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’−ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＡＣ ＴＣＧ ＡＧＧ ＣＴＧ−３’（配列番号２）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
上記組成の反応溶液を、以下のプロトコールに従って、増幅反応を行った。
（１）９８℃、２分
（２）９８℃、１０秒
（３）６８℃、１分
反応ステップ（１）を行ってから、反応ステップ（２）〜（３）を５０サイクル繰り返した。結果を表１に示す。
Figure 2017135348
その結果、ヒトゲノムＤＮＡを制限酵素ＸｓｐＩでの切断処理をしても、反応時間６０分では完全に切断できないことが確認できた（表１、図２）。
参考例２：制限酵素によるゲノムＤＮＡ切断反応後の未切断率の評価（２）
（２−１）ゲノムＤＮＡの切断
１．８μｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）と３ｕｎｉｔｓの制限酵素ＸｓｐＩ（タカラバイオ社製）を、反応Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＫＣｌ）２０μＬ中に溶解させ、３７℃で２０分反応させることで、制限酵素ＸｓｐＩにより切断されたゲノムＤＮＡを得た。
（２−２）標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブにより捕捉されたＤＮＡの未切断率の評価
標的ＤＮＡを捕捉するためのプローブ核酸（標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ）のヌクレオチド配列は、５’−ＵＧＣ ＡＧＧ ＡＣＣ ＡＣＵ ＣＧＡ ＧＧＣ ＵＧＣ ＣＡＣ−３’（配列番号３；核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
上記で得た制限酵素ＸｓｐＩにより切断されたゲノムＤＮＡの１０μＬを、標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ（１ｐｍｏｌ）を含む緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍイミダゾール、５０ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ）９０μＬに溶解させた。９５℃で５分間反応させた後、３７℃で１時間反応させることで、ゲノムＤＮＡ内の標的ＤＮＡと標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブのハイブリッドを形成させた。ハイブリダイゼーション反応後の溶液に、３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（ＪＳＲ社製Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、磁性粒子上に核酸のハイブリッドを固定化した。この磁性粒子を、２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで２回洗浄し、２０μＬの蒸留水を加えて懸濁させた後、制限酵素ＸｓｐＩの切断部位を挟む領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセット及び切断部位を挟まない領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセットを使用したリアルタイムＰＣＲ増幅により、磁性粒子に捕捉されたＤＮＡ量及び制限酵素ＸｓｐＩにより未切断のＤＮＡ量を測定した。
リアルタイムＰＣＲ増幅を以下に示す。
Ｐｒｅｍｉｘ ＰＣＲ試薬（ＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ：ＴＯＹＯＢＯ社製）：１２．５μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：０．５μＬ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：０．５μＬ
５０ｘ ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ：０．０５μＬ
磁性粒子に捕捉したＤＮＡサンプル：２μＬ
Ｔｏｔａｌ：２５μＬ
制限酵素ＸｓｐＩの切断部位を挟む領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセットは、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’−ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＣＣ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＣＧ−３’（配列番号１）、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’−ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＡＣ ＴＣＧ ＡＧＧ ＣＴＧ−３’（配列番号２）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
切断部位を挟まない領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセットは、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’−ＴＡＧ ＡＡＣ ＧＣＴ ＴＴＧ ＣＧＴ ＣＣＣ ＧＡＣ−３’（配列番号４）、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’−ＧＡＧ ＡＧＣ ＴＣＣ ＧＣＡ ＣＴＣ ＴＴＣ Ｃ−３’（配列番号５）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
上記組成の反応溶液を以下のプロトコールに従って、増幅反応を行った。
（１）９８℃、２分
（２）９８℃、１０秒
（３）６８℃、１分
反応ステップ（１）を行ってから、反応ステップ（２）〜（３）を５０サイクル繰り返した。結果を表２に示す。
Figure 2017135348
その結果、制限酵素ＸｓｐＩにより切断されていないＤＮＡが、磁性粒子に捕捉された標的ＤＮＡのうち３．９％を占めることが確認された（表２、図３）。
参考例３：非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いた、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去効率の評価
（３−１）ゲノムＤＮＡの切断
１．８μｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）と３ｕｎｉｔｓの制限酵素ＸｓｐＩ（タカラバイオ社製）を、反応Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭ ＫＣｌ）２０μＬ中に溶解させ、３７℃で２０分反応させることで、制限酵素ＸｓｐＩにより処理したゲノムＤＮＡを得た。
（３−２）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去
標的ＤＮＡを捕捉するためのプローブ核酸（標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ）のヌクレオチド配列は５’−ＵＧＣ ＡＧＧ ＡＣＣ ＡＣＵ ＣＧＡ ＧＧＣ ＵＧＣ ＣＡＣ−３’（配列番号３；核酸の主鎖は２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。制限酵素により未切断の標的ＤＮＡを捕捉するためのプローブ核酸（ポリアデニンを有する、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ）のヌクレオチド配列は５’−ＧＴＧ ＧＧＧ ＣＧＧ ＧＧＴ ＣＴＡ ＧＡＧ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ−３’（配列番号６）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
上記で得た制限酵素ＸｓｐＩにより処理したゲノムＤＮＡの１０μＬを、標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ（１ｐｍｏｌ）、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ（１ｐｍｏｌ）、３７．５μｇのポリチミンでコートされた磁性粒子（インビトロジェン社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５；粒子１）を含む緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１．５Ｍ イミダゾール、５０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）９０μＬに溶解させた。
また、粒子１の代わりに、３７．５μｇのポリチミンでコートされた磁性粒子（サーモフィッシャー社製Ｓｅｒａ−Ｍａｇ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ） Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；粒子２）を使用した以外は、上記と同じ組成の溶液を調製した。
さらに、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ、及びポリチミンでコートされた磁性粒子を添加してない溶液を調製した。
これらの溶液を、９５℃で５分間反応させた後、３７℃で１時間反応させることで、ゲノムＤＮＡ内の標的ＤＮＡと標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブのハイブリッドを形成させた。同時に標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片と、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブ、ポリチミンでコートされた磁性粒子の３者のハイブリットも形成させた。ハイブリダイゼーション反応後の溶液を磁石上で３分間集磁操作を行って、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片を溶液中で沈殿させ、分離した。
（３−３）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片の除去効率の評価
上記で得られた溶液の上清（標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片が除去）に３７５μｇ／ｍＬのストレプトアビジンでコートされた磁性粒子（ＪＳＲ社製Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を５０μＬ加え、３７℃で３０分反応させることで、磁性粒子上に核酸のハイブリッドを固定化した。この磁性粒子を、２５０μＬのＴＢＳ−Ｔで２回洗浄し、２０μＬの蒸留水を加えて懸濁させた後、制限酵素ＸｓｐＩの切断部位を挟む領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセット及び切断部位を挟まない領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセットを使用したリアルタイムＰＣＲ増幅により、磁性粒子に捕捉されたＤＮＡ量及び制限酵素ＸｓｐＩにより未切断のＤＮＡ量を測定した。
リアルタイムＰＣＲ増幅を以下に示す。
Ｐｒｅｍｉｘ ＰＣＲ試薬（ＫＯＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ：ＴＯＹＯＢＯ社製）：１２．５μＬ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：０．５μＬ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）：０．５μＬ
５０ｘ ＲＯＸ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ：０．０５μＬ
磁性粒子に捕捉したＤＮＡサンプル：２μＬ
Ｔｏｔａｌ：２５μＬ
制限酵素ＸｓｐＩの切断部位を挟む領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセットは、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’−ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＣＣ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＣＧ−３’（配列番号１）、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’−ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＡＣ ＴＣＧ ＡＧＧ ＣＴＧ−３’（配列番号２）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
切断部位を挟まない領域に設計されたＰｒｉｍｅｒセットは、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’−ＴＡＧ ＡＡＣ ＧＣＴ ＴＴＧ ＣＧＴ ＣＣＣ ＧＡＣ−３’（配列番号４）、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ配列は５’−ＧＡＧ ＡＧＣ ＴＣＣ ＧＣＡ ＣＴＣ ＴＴＣ Ｃ−３’（配列番号５）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたものを使用した。
上記組成の反応溶液を以下のプロトコールに従って、増幅反応を行った。
（１）９８℃、２分
（２）９８℃、１０秒
（３）６８℃、１分
反応ステップ（１）を行ってから、反応ステップ（２）〜（３）を５０サイクル繰り返した。結果を表３に示す。
Figure 2017135348
その結果、非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いることにより、標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片が効率良く除去できることが明らかとなった（表３、図４）。よって、本方法論により、標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片を特異的に捕捉することができると考えられる。
実施例１：イムノアッセイによる標的ＤＮＡ中のメチルシトシンの解析
（１）ゲノムＤＮＡの切断
溶液中においてゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して、以下のＤＮＡ断片を含有する混合液を得る（例、図１を参照）。
（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片
（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片
（ｃ）標的ＤＮＡを含まない種々のＤＮＡ断片
（２）上記（ｂ）のＤＮＡ断片の除去
（２−１）非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブとして５’隣接ＤＮＡプローブ及び／又は３’隣接ＤＮＡプローブ（磁性粒子に固定）、標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブとして２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡプローブ（５’末端はビオチン標識）を混合液に添加する。
（２−２）混合液をインキュベートして、ハイブリダイゼーション複合体を形成する。
（２−３）混合液中の磁性粒子を集磁した後、混合液の上清（磁性粒子を含まない）を回収する。本上清を、上記（ｂ）のＤＮＡ断片の量が低減された、上記（ａ）及び（ｃ）のＤＮＡ断片を含む溶液として用いる。本溶液中では、上記（ａ）のＤＮＡ断片は、２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡプローブとハイブリダイゼーション複合体を形成している。
（３）標的ＤＮＡの解析
（３−１）上記（２）で得られた溶液を、ビオチンと親和性を有するストレプトアビジンが固定されたマルチウェルプレートに移す。そうすると、上記（ａ）のＤＮＡ断片及び２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡプローブを含むハイブリダイゼーション複合体がマルチウェルプレートに固定されるので、標的ＤＮＡを固相に捕捉することができる。
（３−２）固相に捕捉された標的ＤＮＡ中のメチルシトシンを、イムノアッセイ（例、国際公開第２０１５／０２５８６２号；国際公開第２０１５／０２５８６３号；国際公開第２０１５／０２５８６４号；国際公開第２０１５／１０８１７７号；ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３，３７−４２（２００６））により解析する。
実施例２：質量分析、電気化学分析、または高速液体クロマトグラフィー分析による標的ＤＮＡ中のメチルシトシンの解析
（１）ゲノムＤＮＡの切断
実施例１（１）と同様の方法により行う。
（２）上記（ｂ）のＤＮＡ断片の除去
実施例１（２）と同様の方法により行う。
（３）標的ＤＮＡの解析
（３−１）実施例１（３−１）と同様の方法により行う。
（３−２）固相に捕捉された標的ＤＮＡをエンドヌクレアーゼまたは／およびエキソヌクレアーゼにより分解する。そうすると、上記（ａ）のＤＮＡ断片がモノマー塩基（ヌクレオチド）に分解された溶液を回収することができる。
（３−３）モノマー塩基に分解された標的ＤＮＡ中に含まれるメチルシトシンを、質量分析（例、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７７（２），５０４−５１０（２００５））、電気化学分析（例、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８３，７５９５−７５９９（２０１１））、または高速液体クロマトグラフィー分析（例、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４（８），ｅ６１（２００６））により解析する。
実施例３：ナノポア分析による標的ＤＮＡ中のメチルシトシンの解析
（１）ゲノムＤＮＡの切断
実施例１（１）と同様の方法により行う。
（２）上記（ｂ）のＤＮＡ断片の除去
実施例１（２）と同様の方法により行う。
（３）標的ＤＮＡの解析
（３−１）実施例１（３−１）と同様の方法により行う。
（３−２）固相に捕捉された標的ＤＮＡをアルカリ性水溶液（例、５０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液）による処理、または加熱処理（例、９５℃、２分間）により固相上から解離することで、上記（ａ）のＤＮＡ断片を含む溶液を得ることができる。
（３−３）固相上から解離された標的ＤＮＡ中に含まれるメチルシトシンを、ナノポア分析（例、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５０１（２），ｓｒｅｐ００５０１（２０１２））により解析する。
本発明の方法は、標的ＤＮＡの測定に有用である。

Claims (7)

  1. 以下を含む、標的ＤＮＡの測定方法：
    （１）溶液中においてゲノムＤＮＡを制限酵素で切断して、（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片、（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片、及び（ｃ）標的ＤＮＡを含まないＤＮＡ断片を含有する混合液を得ること；
    （２）（ｂ）標的ＤＮＡを含む不完全切断ＤＮＡ断片を前記混合液から除去して、（ａ）標的ＤＮＡからなる完全切断ＤＮＡ断片、及び（ｃ）標的ＤＮＡを含まないＤＮＡ断片を含有する溶液を得ること；並びに
    （３）前記（２）で得られた溶液において標的ＤＮＡを解析すること。
  2. 前記除去が非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いて行われる、請求項１記載の方法。
  3. 非標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブが以下の核酸プローブである、請求項２記載の方法：
    （１）５’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ；
    （２）３’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ；又は
    （３）５’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブ、及び３’隣接ＤＮＡに特異的な核酸プローブの組み合わせ。
  4. 前記解析が標的ＤＮＡに特異的な核酸プローブを用いて行われる、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
  5. 標的ＤＮＡ中の修飾核酸塩基が解析される、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
  6. 修飾核酸塩基がメチルシトシンである、請求項５記載の方法。
  7. 前記解析が、イムノアッセイ、質量分析、電気化学分析、高速液体クロマトグラフィー分析、又はナノポア分析により行われる、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006055028A (ja) * 2004-08-18 2006-03-02 Canon Inc 核酸調製方法、並びに、それを用いた核酸増幅方法、核酸標識方法及び核酸検出方法
JP2012517231A (ja) * 2009-02-13 2012-08-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 標的ゲノム配列の富化のための方法およびシステム
WO2014046198A1 (ja) * 2012-09-19 2014-03-27 シスメックス株式会社 肝細胞癌に関する情報の取得方法、ならびに肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9365897B2 (en) * 2011-02-08 2016-06-14 Illumina, Inc. Selective enrichment of nucleic acids
EP3312295A1 (en) * 2013-03-19 2018-04-25 Directed Genomics, LLC Enrichment of target sequences

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006055028A (ja) * 2004-08-18 2006-03-02 Canon Inc 核酸調製方法、並びに、それを用いた核酸増幅方法、核酸標識方法及び核酸検出方法
JP2012517231A (ja) * 2009-02-13 2012-08-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 標的ゲノム配列の富化のための方法およびシステム
WO2014046198A1 (ja) * 2012-09-19 2014-03-27 シスメックス株式会社 肝細胞癌に関する情報の取得方法、ならびに肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLARKE, J., ET AL.: "Continuous base identification for single-molecule nanopore DNA sequencing", NAT. NANOTECHNOL., vol. vol.4, issue 4, JPN6017014351, 2009, pages 265 - 270, ISSN: 0004446171 *
PROLL, J., ET AL.: "Ultra-sensitive immunodetection of 5'methyl cytosine for DNA methylation analysis on oligonucleotide", DNA RES., vol. vol.13, issue 1, JPN7017001356, 2006, pages 37 - 42, ISSN: 0004446170 *

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