JPWO2017014196A1 - 目的生体物質の解析方法および解析システム - Google Patents

Abstract

本発明の課題は、免疫染色剤ごとに蛍光輝点数を正確に解析する目的生体物質の解析システムを提供することである。当該目的生体物質の解析システム１は、組織標本３０を、互いに異なる蛍光ナノ粒子を含む複数種類の免疫染色剤で染色し、これを蛍光顕微鏡１０を用いて解析するシステムである。解析システム１では、前記免疫染色剤で染色された組織標本３０を撮像する蛍光顕微鏡１０と、蛍光顕微鏡１０を制御する制御装置６０とを備える。制御装置６０は、前記免疫染色剤それぞれのフィルターセット５０ごとの輝度比率を記憶する記憶部６４と、蛍光顕微鏡１０の撮像結果から、組織標本３０のフィルターセット５０ごとの蛍光輝点数を計測し、前記輝度比率に基づき、前記免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する制御部６２とを有する。

Description

本発明は目的生体物質の解析方法および解析システムに関する。

従来の免疫染色では、組織切片上で、観察対象となる抗原を、抗体修飾した蛍光体（免疫染色剤）に結合させることで標識し、蛍光顕微鏡で観察することが行われている。
免疫染色を用いたがん関連の病理検査において、同一の組織切片上に複数種類の抗原が存在するような場合、抗原ごとに陽性か陰性かを見ることで、抗がん剤治療の予後不良などを診断することができる。
本出願人はかかる病理検査において、抗原ごとに蛍光輝点数や蛍光強度を解析してその発現レベルを計測しうる生体物質の検出方法や免疫染色剤を提供している（特許文献１、実施例３参照）。

国際公開第２０１２／０２９３４２号

ところで、蛍光顕微鏡による観察では、免疫染色剤の種類（蛍光体の励起波長および発光波長）に応じたフィルターセットが鏡筒の所定位置にセットされ観察が行われる。
しかしながら、上記のとおり、複数種類の免疫染色剤を使用し蛍光顕微鏡で観察する場合、１つのフィルターセットで蛍光観察を行ったとき、他の免疫染色剤からの蛍光が映り込んでしまい、免疫染色剤ごとに蛍光輝点数または蛍光輝点から算出される蛍光体粒子数を正確に解析（算出）しえないことがわかってきた。
したがって本発明の主な目的は、複数種類の免疫染色剤を用いた多重免疫染色でも、免疫染色剤ごとに蛍光輝点数を正確に解析することができる目的生体物質の解析方法および解析システムを提供することにある。

上記課題を解決するため、本発明の一態様によれば、
組織標本を、互いに異なる蛍光ナノ粒子を含む複数種類の免疫染色剤で染色し、これを蛍光顕微鏡を用いて解析する目的生体物質の解析方法において、
前記免疫染色剤それぞれの輝度比率をフィルターセットごとに算出する工程と、
前記組織標本の蛍光輝点数を前記フィルターセットごとに計測し、前記輝度比率に基づき、前記免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する工程と、
を備えることを特徴とする目的生体物質の解析方法が提供される。

本発明の他の態様によれば、
組織標本を、互いに異なる蛍光ナノ粒子を含む複数種類の免疫染色剤で染色し、これを蛍光顕微鏡を用いて解析する目的生体物質の解析システムにおいて、
前記免疫染色剤で染色された前記組織標本を撮像する蛍光顕微鏡と、
前記蛍光顕微鏡を制御する制御装置であって、前記免疫染色剤それぞれのフィルターセットごとの輝度比率を記憶する記憶部と、前記蛍光顕微鏡の撮像結果から、前記組織標本の前記フィルターセットごとの蛍光輝点数を計測し、前記輝度比率に基づき、前記免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する算出部とを有する前記制御装置と、
を備えることを特徴とする目的生体物質の解析システムが提供される。

本発明によれば免疫染色剤ごとに蛍光輝点数を正確に解析することができる。

目的生体物質の解析システムの概略的な構成を示す図である。 目的生体物質の解析方法を経時的に示すフローチャートである。 輝度比率の算出工程の処理を概略的に説明する図である。 輝度比率の具体的な算出方法の一例を説明するグラフである。 蛍光輝点数の算出工程の処理を概略的に説明する図である。 フィルターセットの励起フィルターと蛍光フィルターとの関係を概略的に示す図である。 フィルターセットの蛍光フィルター同士の関係を概略的に示す図である。 蛍光ナノ粒子の発光波長のスペクトルの重複を概略的に説明する図である。

以下、図面を参照しながら本発明の好ましい実施形態について説明する。
下記では、数値範囲を示す「〜」の前後に記載される上限値および下限値はその数値範囲に含まれるものとする。

［目的生体物質の解析システム］
図１に示すとおり、目的生体物質の解析システム１は蛍光顕微鏡１０、制御装置６０および表示装置７０を備えている。
蛍光顕微鏡１０はステージ１２、対物レンズ１４、鏡筒１６、接眼レンズ１８および撮像素子２０を備えている。ステージ１２には免疫染色後の組織標本３０が設置される。鏡筒１６にはランプ４０およびフィルターセット５０が内蔵されている。フィルターセット５０は励起フィルター５２、ビームスプリッター５４および蛍光フィルター５６を備えている。
ランプ４０は励起光を出射するランプである。励起フィルター５２は励起光だけを透過するフィルターである。ビームスプリッター５４は所定波長の光を境界として反射または透過する光学部品であって、ここでは励起光を反射し蛍光を透過するものである。蛍光フィルター５６は励起光を遮断し蛍光だけを透過するフィルターである。
蛍光顕微鏡１０では、ランプ４０が点灯すると、励起光が励起フィルター５２を透過しビームスプリッター５４で反射され、対物レンズ１４を通過し組織標本３０に照射される。その結果組織標本３０で蛍光が発光され、蛍光は対物レンズ１４で集光されビームスプリッター５４および蛍光フィルター５６を透過する。その後、蛍光は蛍光像として接眼レンズ１８を介して観察されるとともに、撮像素子２０に撮像される。

蛍光顕微鏡１０にはこれらを制御する制御装置６０が接続されている。
制御装置６０は制御部６２および記憶部６４を備えている。
制御部６２はステージ１２と接続され、ステージ１２の昇降を制御し焦点位置（高さ位置）を制御しうる。制御部６２は撮像素子２０と接続され、撮像素子２０を制御し蛍光像を撮像させ、その蛍光像を受け蛍光画像を生成しうる。制御部６２はランプ４０と接続され、ランプ４０の点灯および消灯を制御しうる。記憶部６４には図２の蛍光輝点数算出処理を実行するための目的生体物質の解析プログラムが記憶されている。
制御装置６０には表示装置７０が接続され、表示装置７０には制御装置６０による算出結果などが表示される。

［組織標本］
続いて、組織標本３０について説明する。
組織標本３０は目的生体物質を含む組織切片であって免疫染色剤で染色され、染色後の組織標本３０が蛍光顕微鏡１０のステージ１２に設置される。

（１）目的生体物質
目的生体物質とは、主に病理診断の観点からの検出または定量のために、蛍光標識体を用いた免疫染色の対象とするものをいい、組織切片に発現している生体物質、特にタンパク質（抗原）である。
典型的な目的生体物質としては、各種の癌組織の細胞膜で発現しており、バイオマーカーとして利用することができる生体物質が挙げられる。

（２）免疫染色剤（抗体−蛍光ナノ粒子の結合体）
免疫染色剤としては、蛍光標識の効率を向上させて蛍光の劣化につながる時間経過をなるべく抑えるために、一次抗体および蛍光ナノ粒子が間接的に、つまり抗原抗体反応などを利用した、共有結合以外の結合によって連結される複合体を用いることが好ましい。染色操作を簡便にするため、免疫染色剤として、一次抗体または二次抗体に蛍光ナノ粒子が直結している複合体を用いることもできる。

免疫染色剤の一例として、［目的生体物質に対する一次抗体］…［一次抗体に対する抗体（二次抗体）］〜［蛍光ナノ粒子（以下、「蛍光色素内包樹脂粒子」ともいう。）］が挙げられる。
“…”は抗原抗体反応により結合していることを表し、“〜”が示す結合の態様としては特に限定されず、たとえば、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、抗原抗体結合、ビオチンアビジン反応、物理吸着、化学吸着などが挙げられ、必要に応じてリンカー分子を介していてもよい。
また、一次抗体および蛍光ナノ粒子が間接的に、つまり抗原抗体反応で連結される形態以外の、目的生体物質に対する免疫染色剤の形態としては、結合能力の高いハプテン分子を用いた［ハプテン標識一次抗体］…［ハプテンに対する抗体（抗ハプテン抗体）］〜［蛍光ナノ粒子］が挙げられるし、同様に結合能力の高い［ビオチン標識一次抗体］…［アビジン］〜［蛍光ナノ粒子］が挙げられる。具体的には、ハプテン、抗ハプテン抗体(ジニトロフェノール、抗ジニトロフェノール抗体、ジゴキシゲニン、抗ジゴキシゲニン抗体、フルオレセイン、抗フルオレセイン抗体など)、ビオチン、アビジンおよびその改変体（ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）が、間接反応に関与する化合物として挙げられる。あるいは、ＦＩＳＨにおいては、ハプテンを結合させた核酸分子（プローブ）と、ハプテン親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子とを含む複合体を形成させる実施形態において用いられる。

親和性分子を間接的に結合する場合の態様としては、両末端に官能基を有する高分子を用いて、それらの官能基を樹脂が有する官能基と親和性分子が有する官能基のそれぞれと反応させることにより、蛍光色素内包樹脂粒子と親和性分子とをその高分子由来のスペーサー（リンカー）を介して結合させる態様が挙げられる。特にこのような実施形態において、蛍光色素内包樹脂粒子表面の単位面積当たりに結合する親和性分子の量が変動しやすいため、本発明を適用することの有効性が高い。例えば、アミンとカルボン酸の反応によるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、エポキシとアミンの反応によるアミノ化等を利用して、第１親和性分子と（必要に応じてスペーサーと）蛍光色素内包樹脂粒子とを共有結合させることができる。第１親和性分子、必要に応じて用いられるスペーサーの両端、蛍光色素内包樹脂粒子の表面のそれぞれに、上述した反応に関与する官能基を導入しておき、所定の条件下で反応させることで、共有結合によって連結することができる。なお、第１親和性分子とは、このように、蛍光色素内包樹脂粒子の表面に結合している親和性分子をいう。

スペーサーのなかでは、非特異的吸着を抑制できることなどの観点から親水性高分子が好ましく、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、オキシエチレン単位の数により鎖長を設定しやすい観点から好ましい。ＰＥＧを用いる場合は、例えばサーモサイエンティフィック社等の市販のものを購入したり、化学構造の繰り返しの単位の数を設定して、試薬メーカー等に製造を依頼したりすることで任意の長さのものを入手することができる。

スペーサーの長さは、結合する蛍光色素内包樹脂粒子の粒径に応じて、適切な範囲で調整すればよい。単一の長さをもつスペーサーを用いてもよいし、それぞれ異なった２種類以上の長さをもつスペーサーを併用してもよい。単一のスペーサーを用いる場合、スペーサーの長さは１〜１００ｎｍが好ましい。２種類以上の長さを有するスペーサーを用いる場合、そのうちの少なくとも１種類のスペーサーの長さが１〜１００ｎｍであり、他のスペーサーの長さが０．１〜１０ｎｍであることが好ましい。

ここで、免疫染色反応の良しあしを決定する重要な要因として生体親和性の性能が挙げられる。この生体親和性の性能は、次のような方法により評価することができる。すなわち、表面に第１親和性分子(代表的にはアビジン)を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子を一定濃度で含む一定量の溶液を、該親和性分子と特異的に結合可能な分子（以下、このような分子を「第２親和性分子」ともいい、例えばアビジンに対するビオチンが例として挙げられるがこれに限定されない。）を一定密度で固定化したプレートと反応させた際に、計測される信号値（Ｓ）が下記式を満たすものを選択する工程を含む、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産・評価方法である。
０．５×Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ） ≦ Ｓ ≦ １．２×Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）
Ａ：第１親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数と同数の蛍光色素単体を、前記プレートと反応させた際に計測される信号値
Ｂ：前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第１親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で割った、蛍光色素内包樹脂粒子１つあたりに結合される第１親和性分子の数
Ｃ：前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度
Ｄ：前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度

このような粒子の生産・評価方法により、十分な染色性能を持った蛍光色素内包樹脂粒子溶液を選択し、さらに所定の方法で得られた信号値に基づいて蛍光色素内包樹脂粒子の濃度を調整することにより、一定の染色性能を持つ蛍光色素内包樹脂粒子溶液を得ることができる。例えば第２親和性分子がビオチンであり、ビオチン化プレートを用いて、ＳＡで修飾された表面修飾後の蛍光色素内包樹脂粒子を用いた場合、プレートから得られた信号値とその粒子を用いて実際に免疫染色を行なった輝度の強さとの相関関係が高いことから、実際に染色をおこなわずとも粒子の染色性能を判断することがでる。さらに、蛍光色素内包樹脂粒子の表面積の総和（Ｔ）に対する、ビオチン化プレートに蛍光色素内包樹脂粒子溶液を散布した際に計測される信号値（Ｓ）の比の値（Ｓ／Ｔ）が所定の値となるように溶液を希釈することによって、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の濃度を同等の染色性能を持つように調整することが可能となる。従って、異なったロットの蛍光色素内包樹脂粒子溶液を用いて病理染色を行なった場合でも、ばらつきのない染色結果を得ることが可能となる。上記Ａの規定に含まれている、蛍光色素の「第１親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数」（ａ）は、次のようにして計算することが可能である。すなわち、一定濃度（例えば０．０１ｎＭ、すなわち６．０２×１０⁹粒子／ｍＬ）の一定量の蛍光色素内包樹脂粒子溶液（蛍光色素内包樹脂粒子標準液）と、それと同じ一定濃度（例えば０．０１ｎＭ、すなわち６．０２×１０⁹分子／ｍＬ）の蛍光色素溶液（蛍光色素標準液）を調製し、それぞれの溶液の発光ピーク波長における蛍光強度を測定する。ここで、蛍光色素内包樹脂粒子内には蛍光色素同士が高濃度で集積しているので、濃度消光と呼ばれる現象により、蛍光色素内包樹脂粒子内が発する蛍光が弱められている可能性がある。そのため、「蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度」に「蛍光色素単体での量子収率／蛍光色素内包樹脂粒子の量子収率」を乗ずることにより、濃度消光の影響が補正された蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度を算出することができる。この「補正後の蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度」を「蛍光色素標準液の蛍光強度」で割れば、言い換えれば「蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度／蛍光色素標準液の蛍光強度」×「蛍光色素単体での量子収率／蛍光色素内包樹脂粒子の量子収率」を算出することにより、「第１親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数」が求まる。なお、量子収率は公知の手段で、例えば「Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−ＱＹ」（絶対ＰＬ量子収率測定装置、浜松ホトニクス株式会社）を用いて、計測することができる。

上記ａの値が算出できれば、その数の蛍光色素を含有する溶液を調製し、第２親和性分子が固定化されたプレートに塗布するなどして反応させることにより、その結果発せられる蛍光強度（信号値）（Ａ）を計測することができる。

上記Ｂの規定に含まれている「一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第１親和性分子の全数」（ｂ１）は、その全表面に結合している第１親和性分子の総重量を、第１親和性分子の分子量で除することにより算出することができる。ストレプトアビジンに代表される第１親和性分子がタンパク質であるのに対し、蛍光色素内包樹脂粒子の母体は樹脂であるので、ＢＣＡ法等のタンパク質の定量方法に基づいて、一定量の蛍光色素内包樹脂粒子溶液中のタンパク質（その全てが蛍光色素内包樹脂粒子の表面に結合しているものとする）の濃度を測定することができる。その測定された濃度に「一定量の溶液」の体積を掛ければ、前記タンパク質の総重量を算出することができ、その総重量を前記タンパク質の分子量（例えばストレプトアビジンの分子量は５２０００）で除すれば、Ｂの規定に用いられる前記タンパク質（前記第１親和性分子）の全数を算出することができる。
また、同じく上記Ｂの規定に含まれている、前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる「蛍光色素内包樹脂粒子数」（ｂ２）は、粒子カウンター（例えばリオン社製「Liquid Particle Counter」）で計測することが可能である。前項にある第１親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で除することにより、蛍光色素内包樹脂粒子一つに結合している第１親和性分子の数を計算することが可能である。
上記ｂ１およびｂ２の値が算出できれば、ｂ１／ｂ２により、蛍光色素内包樹脂粒子１つあたりに結合している第１親和性分子の数（平均値）（Ｂ）が求まる。

上記Ｃの「前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度」は、次のようにして計算することが可能である。すなわち、粒子カウンターを利用して、一定濃度（例えば０．０１ｎＭ、すなわち６．０２×１０⁹粒子／ｍＬ）の一定量の蛍光色素内包樹脂粒子溶液（蛍光色素内包樹脂粒子標準液）を調製し、発光ピーク波長における蛍光強度を測定する。蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度を、当該標準液中に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子の数で除することにより、蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度が求まる。

上記Ｄの「前記蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度」は、次のようにして計算することが可能である。すなわち、一定濃度（例えば０．０１ｎＭ、すなわち６．０２×１０⁹分子／ｍＬ、蛍光色素の分子量をＷとすればＷ×１０^-14ｇ／ｍＬ）の一定量の蛍光色素溶液（蛍光色素標準液）を調製し、その溶液の発光ピーク波長における蛍光強度を測定する。蛍光色素標準液の蛍光強度に、「蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている蛍光色素の分子数（ないしその重量）／蛍光色素標準液中の蛍光色素の分子数（ないしその重量）」を乗じ、さらに、前述したような濃度消光の影響を補正するため、「蛍光色素単体での量子収率／蛍光色素内包樹脂粒子の量子収率」を乗ずることにより、蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数（ないし同等の重量）あたりの蛍光色素単体の蛍光強度が求まる。

なお、上記ＣおよびＤで規定する発光強度の測定方法は特に限定されるものではなく、一般的な蛍光光度計を用いて、適切な測定条件において測定すればよい。
信号値が上記式を満たす蛍光色素内包樹脂粒子溶液、換言すれば、相対値化された信号値：Ｓ／｛Ａ×Ｂ×（Ｃ／Ｄ）｝が０．５〜１．２の範囲にある蛍光色素内包樹脂粒子溶液は、染色液として十分な染色性能があると考えられる。たとえば、ＳＡ結合蛍光標識液の評価は、次の通り実施できる。
まず、ＳＡ結合蛍光標識体の保存液を採取し、パーティクルカウンター「Ｌｉｑｕｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ」（リオン社製）で粒子数を測定した後、濃度を０．０５ｎＭに調整する。市販のビオチン化プレート「Ｗｅｌｌ−Ｃｏａｔｅｄ Ｂｉｏｔｉｎ， ９６−ｗｅｌｌ， Ｂｌａｃｋ」（Ｇ−ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社製）をＰＢＳで５回洗浄した後、当該プレート上に、上記の濃度を調整した溶液を、１ウェルにつき１００μＬずつ添加し、４℃で一昼夜反応させる。反応後のプレートをＰＢＳで洗浄した後、マイクロプレートリーダー「プレートカメレオンＶ」（Ｈｉｄｅｘ社製）を用いて、蛍光強度の信号値（Ｓ）を測定する。ここで、例えば、後述の実施例３で得られる「免疫染色剤Ｄ」について、信号値（Ｓ）を、蛍光色素単体での信号値（Ａ）×蛍光色素内包樹脂粒子１つあたりに結合している親和性分子の数（Ｂ）×｛蛍光色素内包樹脂粒子１粒子あたりの発光強度（Ｃ）／（蛍光色素内包樹脂粒子１粒子に内包されている数の蛍光色素単体での発光強度（Ｄ）｝で割ると、相対値化した値は０．８となるため、良好な染色性能が得られることがわかる。一方、後述の実施例１でニカラック（メラミン樹脂）を用いて作製した蛍光色素集積ナノ粒子に代えて、スチレン樹脂を用いて作製した蛍光色素集積ナノ粒子により染色した場合には良好な染色性能が得られず、その粒子の相対値は０．４である。総じて０．５以上出れば良好な染色性能が得られる。
本発明によれば、良好な染色性能が得られない粒子を用いた多重染色においても、輝点数算出精度を向上させることが出来る。

（３）抗体（抗原に対して親和性の高い分子）
一次抗体には、目的生体物質としてのタンパク質を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。たとえば、ＨＥＲ２を目的生体物質とする場合は抗ＨＥＲ２抗体を、ＨＥＲ３を目的生体物質とする場合は抗ＨＥＲ３抗体を、それぞれ用いることができる。
二次抗体には、一次抗体を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。
一次抗体および二次抗体はいずれも、ポリクローナル抗体であってもよいが、定量の安定性の観点から、モノクローナル抗体が好ましい。抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよい。

（４）蛍光ナノ粒子
蛍光ナノ粒子とは、励起光の照射を受けて蛍光発光するナノサイズの粒子であって、目的生体物質を１分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発光しうる粒子である。
蛍光ナノ粒子として、好ましくは量子ドット（半導体ナノ粒子）、蛍光物質集積ナノ粒子が使用される。
蛍光ナノ粒子として、好ましくは発光波長が蛍光顕微鏡１０の撮像素子２０の感度域内に存在するナノ粒子であって、詳しくは発光波長が４００〜７００ｎｍのナノ粒子が使用される。

（４．１）量子ドット
量子ドットとしては、ＩＩ−ＶＩ族化合物、ＩＩＩ−Ｖ族化合物またはＩＶ族元素を含有する半導体ナノ粒子が使用される。たとえば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅなどが挙げられる。

（４．２）蛍光物質集積ナノ粒子
蛍光物質集積ナノ粒子は、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光物質（たとえば、上記量子ドット、蛍光色素など）がその中に内包されているおよび／またはその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。
蛍光物質集積ナノ粒子としては、母体と蛍光物質とが、互いに反対の電荷を有する置換基または部位を有し、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
蛍光物質集積ナノ粒子としては、量子ドット集積ナノ粒子、蛍光色素集積ナノ粒子などが使用される。

（４．２．１）母体
母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル−スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル−スチレン−アクリル酸メチル共重合体）など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができる。
母体のうち、無機物としては、シリカ、ガラスなどを例示することができる。

（４．２．２）量子ドット集積ナノ粒子
量子ドット集積ナノ粒子とは、上記量子ドットが、上記母体の中に内包されている、および／またはその表面に吸着している構造を有する。
量子ドットが母体に内包されている場合、量子ドットは母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。

（４．２．３）蛍光色素集積ナノ粒子
蛍光色素集積ナノ粒子とは、蛍光色素が、上記母体の中に内包されている、および／またはその表面に吸着している構造を有する。
蛍光色素としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。
蛍光色素としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子、ＣＦ（登録商標、Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）系色素分子、ＤＹ（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）系色素分子、ＣＡＬ（登録商標、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）系色素分子などを用いることができる。
なお、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。

（５）組織切片の染色方法
染色方法の一例について説明する。
この染色方法が適用できる組織切片（単に「切片」ともいい、病理切片などの切片も含まれる。）の作製法は特に限定されず、公知の手順により作製されたものを用いることができる。

（５．１）標本作製工程
（５．１．１）脱パラフィン処理
キシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。

次いでエタノールを入れた容器に切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。

水を入れた容器に、切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。

（５．１．２）賦活化処理
公知の方法に倣い、目的生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。
ｐＨ条件は用いる組織切片に応じてｐＨ２．０〜１３．０の範囲から、シグナルが出て、組織の荒れがシグナルを評価できる程度となる条件で行う。通常はｐＨ６．０〜８．０で行うが、特殊な組織切片ではたとえばｐＨ３．０でも行う。
加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０〜１３０℃、時間は５〜３０分で行うことができる。

次いでＰＢＳを入れた容器に、賦活処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。

（５．２）免疫染色工程
免疫染色工程では、目的生体物質を染色するために、目的生体物質に直接的または間接的に結合しうる部位を有する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤の溶液を、切片に乗せ、目的生体物質との反応を行う。免疫染色工程に用いる免疫染色剤の溶液については、この工程の前にあらかじめ調製しておけばよい。

免疫染色工程を行う上での条件、すなわち免疫染色剤の溶液に組織標本を浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
上述したような処理を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど公知のブロッキング剤やＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を滴下することが好ましい。

（５．３）標本後処理工程
免疫染色工程を終えた組織標本は、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。

固定化・脱水処理は、組織標本を固定処理液（ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノールなどの架橋剤）に浸漬すればよい。透徹処理は、固定化・脱水処理を終えた組織標本を透徹液（キシレンなど）に浸漬すればよい。封入処理は、透徹処理を終えた組織標本を封入液に浸漬すればよい。
これらの処理を行う上での条件、たとえば組織標本を所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。

（５．４）形態観察染色工程
免疫染色工程とは別に、明視野において細胞、組織、臓器などの形態を観察することができるようにするための、形態観察染色を行ってもよい。
形態観察染色工程は、常法に従って行うことができる。
組織標本の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）として知られている）。
形態観察染色工程を含める場合は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。

［目的生体物質の解析方法］
続いて、目的生体物質の解析方法について説明する。
かかる方法は、組織標本を、互いに異なる蛍光ナノ粒子を含む複数種類の免疫染色剤で染色し、これを目的生体物質の解析システム１で解析する方法である。

図２に示すとおり、目的生体物質の解析方法では主に、
（Ｓ１）免疫染色剤それぞれの輝度比率をフィルターセット５０ごとに算出する工程Ｓ１（以下、「輝度比率算出工程Ｓ１」ともいう。）と、
（Ｓ２）組織標本３０の蛍光輝点数をフィルターセット５０ごとに計測し、前記輝度比率に基づき、免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する工程Ｓ２（以下、「蛍光輝点数算出工程Ｓ２」ともいう。）と、
を備えている。

（１）輝度比率算出工程Ｓ１
輝度比率算出工程Ｓ１では、輝度比率を算出するための目的生体物質の種類数に対応する複数種類の免疫染色剤散布サンプルおよびフィルターセット５０を、準備する。
「免疫染色剤散布サンプル」とは、免疫染色剤をガラス基板上に塗布したものである。「複数種類の免疫染色剤」は、組織標本サンプルの目的生体物質の種類数に対応する、互いに異なる蛍光ナノ粒子を含み、「複数種類のフィルターセット５０」も、組織標本サンプルの目的生体物質の種類数に対応する、互いに異なる励起フィルター５２、ビームスプリッター５４および蛍光フィルター５６を備える。

その後、免疫染色剤散布サンプルをステージ１２に設置する。
その後、フィルターセット５０を切り替えながら、フィルターセット５０を切り替えるごとに、制御部６２が、ランプ４０を点灯させ、組織標本サンプルの蛍光像を撮像素子２０に撮像させ、組織標本サンプルの蛍光輝点数をフィルターセット５０ごとに計測する。
蛍光輝点数の計測では、たとえば「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）が使用され、かかる画像処理ソフトウエアを利用することにより、蛍光像から所定波長（色）の蛍光輝点を抽出し蛍光輝点を計測する処理を、半自動的に迅速に行いうる。
その後、制御部６２が、フィルターセット５０ごとの蛍光輝点数の計測結果に基づき、免疫染色剤それぞれの輝度比率をフィルターセット５０ごとに算出し、これを記憶部６４に記憶させる。

たとえば、図３に示すとおり、緑色、赤色、近赤外線の蛍光を発光する蛍光ナノ粒子を含む３種類の免疫染色剤Ａ〜Ｃを、それぞれ緑色用、赤色用、近赤外線用の３種類のフィルターセット５０を切り替えながら、フィルターセット５０を切り替えるごとに、組織標本サンプルの蛍光像の蛍光輝点数を計測し、免疫染色剤それぞれの輝度比率をフィルターセット５０ごとに算出する。
図３では、緑色発光する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤Ａが、緑色用、赤色用、近赤外線用のフィルターセット５０で蛍光輝点数が計測された場合は、輝度比率が１：０．０８：０．０１と算出された例を示している。
赤色発光する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤Ｂが、緑色用、赤色用、近赤外線用のフィルターセット５０で蛍光輝点数が計測された場合は、輝度比率が０．１２：１：０．０８と算出されている。
近赤外線を発光する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤が、緑色用、赤色用、近赤外線用のフィルターセット５０で蛍光輝点数が計測された場合は、輝度比率が０：０．１：１と算出されている。
この輝度比率の具体的な算出方法としては、次の二つを挙げることが出来る。まず一つ目の方法（第１の算出方法）は、撮影画像全体で計測された輝点の合計輝度値を用いる方法であり、合計輝度値の比として輝度比率が導かれる。この方法は、画像全体を平均化して導かれる簡易な方法であり、特に、一つ一つの粒子が固有の輝度比率を持たず、その固有値に偏りがない場合に有効に使用できる。

第１の算出方法の具体例としては、輝度比率Ｒ（１〜ｎ，１〜Ｎ）を、下記一般式（１）から算出する方法が挙げられる。

一般式（１）：輝度比率Ｒ（ｍ，ｋ）＝ＦＬ（ｍ，ｋ）／ＦＬ（ｍ，ｐ）
[上記一般式（１）において、ＦＬ（ｍ，ｋ）は、免疫染色剤（ｍ）をフィルターセット（ｋ）を使用し撮影した画像全体で観察された輝点の合計輝度値である。ＦＬ（ｍ，ｐ）は、免疫染色剤（ｍ）をフィルターセット（ｐ）を使用し撮影した画像全体で観察された輝点の合計輝度値である。ｋは、１〜Ｎの範囲内の整数である。ｐは、１〜Ｎの範囲内の整数である。ｎ、Ｎ及びｍは、それぞれ正の整数であり、１≦ｍ≦ｎである。]

なお、上記一般式（１）において、ｍ、ｋ、ｐの組み合わせは、ＦＬ（ｍ，ｋ）≦ＦＬ（ｍ，ｐ）を満たす組み合わせであることが、輝度比率Ｒ（ｍ，ｋ）の上限が１となり、計算上好ましい。すなわち、フィルターセット（ｐ）はフィルターセット（１〜Ｎ）のうち、免疫染色剤（ｍ）を撮影した画像全体で観察された輝点の合計輝度値が最大となるフィルターセットであることが好ましい。

一方、二つ目の方法（第２の算出方法）としては、一輝点あたりの輝度値を、フィルターセット５０ごとに測定し、フィルターセット間での輝度値に基づいて、輝度比率を算出する方法が挙げられる。具体的には、例えば、緑色用、赤色用、近赤外用のフィルターセット５０ごとに輝度値を測定し、緑色発光する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤Ａの輝度比率を求める場合、緑色用のフィルターセット５０で測定された輝度値を縦軸、赤色（もしくは近赤外用）のフィルターセット５０で測定された輝度値を横軸としたグラフを作成する(図４参照。)。そして、このグラフから得られる近似曲線y=ａxのａを緑色用のフィルターセット５０での測定値に対する赤色もしくは近赤外用のフィルターセット５０の輝度比率とする。

すなわち、第２の算出方法とは、まず、輝度比率Ｒ（１〜ｎ，１〜Ｎ）を、同一輝点の輝度値を前記フィルターセット（１〜Ｎ）ごとに測定し、フィルターセット（ｐ）を使用したときに得られる輝度値Ｘと、フィルターセット（ｋ）を使用したときに得られる輝度値Ｙとの関係を示す近似直線である下記一般式（２）の傾きａを輝度比率Ｒ（ｍ，ｋ）として算出する方法である。なお、この第２の算出方法において、ｋは、１〜Ｎの範囲内の整数であり、ｐは、１〜Ｎの範囲内の整数であり、ｎ、Ｎ及びｍは、それぞれ正の整数であり、１≦ｍ≦ｎである。

一般式（２）：Ｙ＝ａＸ

なお、上記一般式（２）において、フィルターセット（ｐ）はフィルターセット（１〜Ｎ）のうち、免疫染色剤（ｍ）を撮影した画像全体で観察された輝点の合計輝度値が最大となるフィルターセットであることが、ａの最大値が１となり、計算上好ましい。

この二つ目の方法は、一つ一つの粒子が固有の輝度比率を持っていて、その固有値に偏りがある場合であっても、真の輝度比率へ近づけることができる。

（２）蛍光輝点数算出工程Ｓ２
蛍光輝点数算出工程Ｓ２では、組織標本３０を、上記と同様の複数種類の免疫染色剤で染色し、免疫染色後の組織標本３０をステージ１２に設置する。
その後、フィルターセット５０を切り替えながら、フィルターセット５０を切り替えるごとに、制御部６２が、ランプ４０を点灯させ、組織標本３０の蛍光像を撮像素子２０に撮像させ、組織標本３０の蛍光輝点数をフィルターセット５０ごとに計測する。

その後、制御部６２が、輝度比率算出工程Ｓ１で算出し記憶部６４に記憶させた輝度比率を記憶部６４から読み出し、その輝度比率に基づき、免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する。
かかる場合、免疫染色剤（１〜ｎ）それぞれのフィルターセット５０（１〜Ｎ）ごとの輝度比率をＲ（１〜ｎ，１〜Ｎ）と、フィルターセット５０（１〜Ｎ）ごとに計測した組織標本３０の蛍光輝点数をＴＢ（１〜Ｎ）と、免疫染色剤（１〜ｎ）ごとの蛍光輝点数をＬ（１〜ｎ）として下記の連立方程式を作り、その連立方程式の解から、免疫染色剤（ｍ）の蛍光輝点数Ｌ（ｍ）を算出する。
ＴＢ（１）＝Ｌ（１）＋Ｒ（１，２）×Ｌ（２）＋Ｒ（１，３）×Ｌ（３）＋…
ＴＢ（２）＝Ｒ（２，１）×Ｌ（１）＋Ｌ（２）＋Ｒ（２，３）×Ｌ（３）＋…
ＴＢ（３）＝Ｒ（３，１）×Ｌ（１）＋Ｒ（３，２）×Ｌ（２）＋Ｌ（３）＋…
……………
ただし、ｎ、Ｎ、ｍは正の整数であり、１≦ｍ≦ｎである。

たとえば、図５に示すとおり、組織標本３０に３種類の目的生体物質が含まれ、これを緑色、赤色、近赤外線の蛍光を発光する蛍光ナノ粒子を含む３種類の免疫染色剤Ａ〜Ｃで染色した場合、緑色用、赤色用、近赤外線用の３種類のフィルターセット５０を切り替えながら、フィルターセット５０を切り替えるごとに、組織標本３０の蛍光像の蛍光輝点数を計測する。
かかる場合、緑色用のフィルターセット５０で５７２個、赤色用のフィルターセット５０で６８０個、近赤外線用のフィルターセット５０で４５３個の蛍光輝点数を計測したときは、下記の連立方程式を作ることができる。
５７２＝Ｌ（１）＋０．１２Ｌ（２）＋０Ｌ（３）
６８０＝０．０８Ｌ（１）＋Ｌ（２）＋０．１Ｌ（３）
４５３＝０．０１Ｌ（１）＋０．０８Ｌ（２）＋Ｌ（３）
かかる連立方程式を解くと、Ｌ（１）＝５００、Ｌ（２）＝６００、Ｌ（３）＝４００という解が得られ、緑色の蛍光輝点数を５００と、赤色の蛍光輝点数を６００と、近赤外線の蛍光輝点数を４００と算出することができ、結果的に免疫染色剤Ａ〜Ｃごとの蛍光輝点数を算出することができる。

輝度比率算出工程Ｓ１、蛍光輝点数算出工程Ｓ２では、フィルターセット５０として、図６に示すとおり、励起フィルター５２の波長幅５２ａが２０〜３０ｎｍで、蛍光フィルター５６の波長幅５６ａが３０〜５０ｎｍのフィルターセットを使用するのがよい。
かかる場合、図７に示すとおり、蛍光フィルター５６同士の波長重複幅５６ｂが１０ｎｍ以下のフィルターセット５０を使用するのがよい。

免疫染色剤の蛍光ナノ粒子としても、発光波長の重複が３０％以下のナノ粒子を使用するのがよい。
「発光波長の重複」とは、図８に示すとおり、一方の蛍光ナノ粒子Ａの蛍光スペクトルに対する、他方の蛍光ナノ粒子Ｂの蛍光スペクトルの重複であって、蛍光ナノ粒子Ａに対応する蛍光フィルター５６の波長幅５６ａでの蛍光ナノ粒子Ａの強度の積分値（グレー部参照）に対する、波長幅５６ａの範囲での蛍光ナノ粒子Ｂの強度の積分値（斜線部参照）である。図８の例では、グレー部の面積に対する、斜線部の面積が３０％以下である蛍光ナノ粒子Ｂを使用するのがよい。

以上の本実施形態によれば、免疫染色剤それぞれの輝度比率をフィルターセット５０ごとに事前に算出しておき、その後に組織標本３０の蛍光輝点数（総数）をフィルターセット５０ごとに計測し、算出済みの輝度比率に基づき、免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出している。
かかる場合、１つのフィルターセット５０で蛍光観察を行っているときに、他の免疫染色剤からの蛍光が映り込んでしまっても、すでに算出済みの輝度比率に基づき、その蛍光観察時の免疫染色剤の蛍光輝点数が算出されうる。そのため、複数種類の免疫染色剤を用いた多重免疫染色でも、免疫染色剤ごとに蛍光輝点数を正確に解析することができる。

〔実施例１〕
（１）免疫染色剤の作製
（１．１）蛍光色素集積ナノ粒子の合成
蛍光色素として緑色発光色素であるPyrromethene556色素１４．４ｍｇを水２２ｍＬに加えて溶解させた。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ−０３５（日本カーバイド工業社製）を０．６５ｇ加えた。
さらに、この溶液に反応開始剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。
得られた色素樹脂粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素などの不純物を除くため、純水による洗浄を行った。具体的には、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。
以上の処理により、緑色蛍光色素集積ナノ粒子（励起波長490nm、発光波長520nm）を作製した。

かかる緑色蛍光色素集積ナノ粒子の作製において、Pyrromethene556色素に代えてSulforhodamine101（Texas Red）色素を使用し、赤色蛍光色素集積ナノ粒子（励起波長590nm、発光波長620nm）も作製した。
さらにかかる緑色蛍光色素集積ナノ粒子の作製において、Pyrromethene556色素に代えてCy5色素を使用し、近赤外線蛍光色素集積ナノ粒子（励起波長643nm、発光波長647nm）も作製した。

（１．２）蛍光色素集積ナノ粒子の修飾
緑色蛍光色素集積ナノ粒子の末端にＮＨＳ−ＰＥＧ（polyethylene glycol）−マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗ＨＥＲ２抗体を結合させ、これを「免疫染色剤Ａ」とした。
これと同様に、赤色蛍光色素集積ナノ粒子の末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗Ｋｉ６７抗体を結合させ、これを「免疫染色剤Ｂ」とした。
近赤外線蛍光色素集積ナノ粒子の末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４抗体を結合させ、これを「免疫染色剤Ｃ」とした。

（２）免疫染色剤散布サンプルの作製および輝度比率の測定
（２．１）免疫染色剤Ａ〜Ｃをそれぞれガラススライドに塗布することで、免疫染色剤散布スライドを作製した。なお、ヒト***組織標本サンプルとして、ＨＥＲ２、Ｋｉ６７、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４の３種類の抗原を含み、かつ、抗原同士の発現の割合があらかじめ認識されているものを使用することとしてもよい。

（２．２）蛍光顕微鏡観察
蛍光顕微鏡としてCarl Zeiss社製蛍光顕微鏡を、フィルターセットとしてSemrock製フィルターセットを使用した。フィルターセットは免疫染色剤Ａ〜Ｃ（緑色用、赤色用、近赤外線用）に対応する下記３種類のものを使用した。

（３）蛍光顕微鏡観察
免疫染色剤散布サンプルをステージに設置し、緑色用、赤色用、近赤外線用の３種類のフィルターセットを切り替えながら、フィルターセットを切り替えるごとに、免疫染色剤散布サンプルの蛍光像の画面全体の蛍光輝点から算出された合計輝度値の輝度比率(第１の算出方法)又は、一輝点ごとの輝度値を計測し、免疫染色剤Ａ〜Ｃそれぞれの輝度比率をフィルターセットごとに輝度比率を算出した(第２の算出方法)。第１の算出方法及び第２の算出方法どちらを用いた場合も、同じ輝度比率が得られた。

（４）組織標本の免疫染色
ヒト***組織標本の免疫染色を行った。
下記工程（４−１）〜（４−１５）の方法により、免疫染色剤Ａ〜Ｃを用いてヒト***組織標本の免疫染色（ＩＨＣ法）を行った。
工程（４−１）：キシレンを入れた容器に組織標本を１５分浸漬させた。途中２回キシレンを交換した。
工程（４−２）：エタノールを入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。途中２回エタノールを交換した。
工程（４−３）：水を入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。
工程（４−４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に組織標本を浸漬させた。
工程（４−５）：１２１度で５分オートクレーブ処理を行った。
工程（４−６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を１５分浸漬させた。途中３回ＰＢＳを交換した。
工程（４−７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織標本に載せて、１時間放置した。
工程（４−８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２抗体が結合された免疫染色剤Ａを、組織標本に載せて一晩放置した。
工程（４−９）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本を１５分浸漬させた。
工程（４−１０）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに希釈した抗Ｋｉ６７抗体が結合された免疫染色剤Ｂを、組織標本に載せて一晩放置した。
工程（４−１１）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本を１５分浸漬させた。
工程（４−１２）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに希釈した抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４抗体が結合された免疫染色剤Ｃを、組織標本に載せて一晩放置した。
工程（４−１３）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本を３０分浸漬させた。
なお、工程（４−８）〜工程（４−１３）では、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで最終濃度を０．１ｎＭに調整した免疫染色剤Ａ、Ｂ、Ｃを、組織標本に載せて一晩放置し、その後に、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本を１５分浸漬させてもよい。
工程（４−１４）：組織標本を４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ＨＥ染色を行った。
工程（４−１５）：Merck社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ、組織標本を封入した。

（５）顕微鏡観察
免疫染色後の組織標本をステージに設置し、緑色用、赤色用、近赤外線用の３種類のフィルターセットを切り替えながら、フィルターセットを切り替えるごとに、組織標本の蛍光像の蛍光輝点数を計測した。

蛍光輝点数の計測結果から、下記の連立方程式が作られた。
１６５６＝Ｌ（１）＋０．１２Ｌ（２）＋０Ｌ（３）
１５４５＝０．０８Ｌ（１）＋Ｌ（２）＋０．１Ｌ（３）
１３６９＝０．０１Ｌ（１）＋０．０８Ｌ（２）＋Ｌ（３）
かかる連立方程式を解くと、Ｌ（１）＝１５００、Ｌ（２）＝１３００、Ｌ（３）＝１２５０という解が得られ、緑色の蛍光輝点数を１５００と、赤色の蛍光輝点数を１３００と、近赤外線の蛍光輝点数を１２５０と算出され、結果的に免疫染色剤Ａ〜Ｃごとの蛍光輝点数を算出することができた。
すなわち、以上の結果から、検査対象の組織標本では、ＨＥＲ２：Ｋｉ６７：Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４＝１５００：１３００：１２５０の割合で発現していることが確認された。

〔実施例２〕
（１）免疫染色剤の作製
（１．１）蛍光色素集積ナノ粒子の合成
実施例１の「（１．１）蛍光色素集積ナノ粒子の合成」と同様にして、緑色蛍光色素集積ナノ粒子（励起波長490nm、発光波長520nm）を作製した。

かかる緑色蛍光色素集積ナノ粒子の作製において、Pyrromethene556色素に代えてSulforhodamine101（Texas Red）色素を使用し、赤色蛍光色素集積ナノ粒子（励起波長590nm、発光波長620nm）も作製した。

(１．２)蛍光色素集積ナノ粒子の修飾
緑色蛍光色素集積ナノ粒子の末端にＮＨＳ−ＰＥＧ（polyethylene glycol）−マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ＤＩＧ）抗体を結合させ、これを「免疫染色剤D」とした。
これと同様に、赤色蛍光色素集積ナノ粒子の末端にマレイミドを導入し、これにチオール化した抗Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）抗体を結合させ、これを「免疫染色剤E」とした。

（１．３）二次抗体の修飾
ラット由来抗マウス抗体ＳＢ７７ｅのアミノ基にＮＨＳ―ＤＩＧを結合させ、これを「二次抗体Ａ」とした。
これと同様に、ラット由来抗ラビット抗体ＬＯＲＧ１にＮＨＳ−ＦＩＴＣを結合させ、これを「二次抗体Ｂ」とした。

（２）免疫染色剤散布サンプルの作製および輝度比率の測定
免疫染色剤Ｄ，Ｅをそれぞれガラススライドに塗布することで、免疫染色剤散布スライドを作製した。

（３）蛍光顕微鏡観察
免疫染色剤散布サンプルをステージに設置し、緑色用、赤色用の２種類のフィルターセットを切り替えながら、フィルターセットを切り替えるごとに、組織標本サンプルの蛍光像の画面全体の蛍光輝点から算出された合計輝度値もしくは一輝点ごとの輝度値を計測し、免疫染色剤Ｄ，Ｅそれぞれの輝度比率をフィルターセットごとに算出した。

（４）組織標本の免疫染色
下記工程（４−１）〜（４−１５）の方法により、免疫染色剤Ｄ,Ｅを用いてヒト肺組織標本の免疫染色（ＩＨＣ法）を行った。

工程（４−１）：キシレンを入れた容器に組織標本を１５分浸漬させた。途中２回キシレンを交換した。
工程（４−２）：エタノールを入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。途中２回エタノールを交換した。
工程（４−３）：水を入れた容器に組織標本を１０分浸漬させた。
工程（４−４）：１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に組織標本を浸漬させた。
工程（４−５）：１２１度で５分オートクレーブ処理を行った。
工程（４−６）：ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織標本を１５分浸漬させた。途中３回ＰＢＳを交換した。
工程（４−７）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを組織標本に載せて、１時間放置した。
工程（４−８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３μｇ／ｍＬに希釈した抗ＰＤ−Ｌ１抗体・抗ＥＧＦＲ抗体混合溶液を、組織標本に載せて一晩放置した。
工程（４−８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したＤＩＧが結合した二次抗体ＡおよびＦＩＴCが結合した二次抗体Ｂの混合溶液を、組織標本に載せて一晩放置した。
工程（４−８）：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで０．１ｎＭに希釈した抗ＤＩＧ抗体が結合された免疫染色剤Ｄおよび抗ＦＩＴＣ抗体が結合された免疫染色剤Ｅを、組織標本に載せて一晩放置した。
工程（４−１３）：ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織標本を３０分浸漬させた。
工程（４−１４）：組織標本を４％中性パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定処理した後、ＨＥ染色を行った。
工程（４−１５）：Merck社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ、組織標本を封入した。

（５）蛍光顕微鏡観察
蛍光顕微鏡としてCarl Zeiss社製蛍光顕微鏡を、フィルターセットとしてSemrock製フィルターセットを使用した。フィルターセットは免疫染色剤Ｄ、Ｅ（緑色用、赤色用）に対応する２種類のものを使用した。顕微鏡観察及び蛍光輝点数解析は、実施例１の「（５）顕微鏡観察」と同様にして行った。
次に、画面全体の蛍光輝点から算出した合計輝度値から輝度比率(第１の算出方法)を求めた。また、一輝点ごとの輝度値を計測し、免疫染色剤Ａ〜Ｃそれぞれの輝度比率をフィルターセットごとに算出した(第２の算出方法)。第１の算出方法又は第２の算出方法どちらを用いた場合も、同じ輝度比率（表４）であり、また、ＰＤ−Ｌ１：ＥＧＦＲ＝２００：１４００の割合で発現していることが確認された（表５）。

〔実施例３（組織標本が動物モデルから搾取され、標本化されたものである例）〕
検査対象の組織標本としてPDXマウス(Patient-derived xenograft)から搾取された組織の標本を用いたこと以外は、実施例２と同様にしてＰＤ−Ｌ１およびＥＧＦＲに由来する輝点を検出した。
ＰＤＸとは、Patient-derived tumor xenograft（患者由来腫瘍異種移植）の略称であり、患者（ヒト）由来の組織をマウスまたはその他の実験動物に移植し、一定期間、マウス等の体内で成長させることをいう。たとえば、ヒト癌の組織が移植されたマウスを1か月近く飼育するとヒト癌組織が増大し、これを患者検体の代替えとして利用する有用性が、近年論じられている。さらに、増大した癌組織を別のマウスに移植することを「継代」と呼んでおり、患者検体を継代によってずっと増やしていくことも可能となっている。

本実施例で使用する組織標本は、次の手順で準備した。
（１）検体入手： 移植する大きさ１ｃｍ^３の肺がん患者検体は、臨床検体供給元企業であるソフィアバイオ社(Sofia Bio LLC)から購入した。
（２）ＰＤＸマウスの作製: 入手した癌組織検体を、３匹のNOD-SCIDマウスの皮下へそれぞれ３ｍｍ^３角移植した。無菌施設内でマウスを約１か月間飼育し、癌組織が１ｃｍ^３まで増大したらそれを搾取する。搾取した癌組織の一部は１０％ホルマリンで２４時間固定した後、パラフィンでブロック形態として保管した。
（３）パラフィン切片スライドの染色

得られたパラフィンブロックを４μｍの厚さに切り出して、ガラススライド上に張り付け、実施例２と同様に免疫染色および染色画像の解析を実施した。その際、実施例２における「(１．２)蛍光色素集積ナノ粒子の修飾」については下記のように変更した。
緑色蛍光色素集積ナノ粒子の末端にＮＨＳ−ＰＥＧ（polyethylene glycol）−マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、末端にマレイミド基が付いた蛍光物質内包メラミンナノ粒子を得た。一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をN-succinimidyl S-acetylthioacetate（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光物質内包メラミンナノ粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。上記の蛍光物質内包メラミンナノ粒子とストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、室温で１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合蛍光物質内包メラミンナノ粒子を作製し、これを「免疫染色剤D」とした。
一方、同様に赤色蛍光色素集積ナノ粒子の末端にマレイミドを導入した粒子に対しては、これにチオール化した抗ＥＧＦＲ抗体を結合させ、これを「免疫染色剤E」とした。

さらに、実施例２における「（１．３）二次抗体の修飾」については、次の通り、ビオチン修飾することに変更した。
（ビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体の作製）
５０ｍＭＴｒｉｓ溶液に、２次抗体として用いる抗ウサギＩｇＧ抗体５０μｇを溶解した。この溶液に、最終濃度３ｍＭとなるようにＤＴＴ（ジチオトレイトール）溶液を添加、混合し、３７℃で３０分間反応させた。その後、反応溶液を脱塩カラム「Zeba Desalt Spin Columns」（サーモサイエンティフィック社、Cat.#89882）に通して、ＤＴＴで還元化した２次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち２００μＬを５０ｍＭＴｒｉｓ溶液に溶解して抗体溶液を調製した。その一方で、リンカー試薬「Maleimide-PEG2-Biotin」（サーモサイエンティフィック社、製品番号21901）を、ＤＭＳＯを用いて０．４ｍＭとなるように調整した。このリンカー試薬溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加、混合し、３７℃で３０分間反応させることにより、抗ウサギＩｇＧ抗体にＰＥＧ鎖を介してビオチンを結合させた。この反応溶液を脱塩カラムに通して精製した。脱塩した反応溶液について、波長３００ｎｍにおける吸光度を分光高度計（日立製「Ｆ−７０００」）を用いて測定することにより、反応溶液中のタンパク質（ビオチン修飾２次抗体）の濃度を算出した。５０ｍＭＴｒｉｓ溶液を用いて、ビオチン修飾２次抗体の濃度を２５０μｇ／ｍＬに調整した溶液を、ビオチン修飾２次抗体の溶液とした。「免疫染色剤D」による染色は次のように実施した。すなわち、抗ＰＤ−Ｌ１ウサギモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ「ＳＰ１４２」Spring Bioscience（SBS）社）０．０５ｎＭの濃度で１次反応処理し、次に作製したビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体のPBS溶液６μｇ／ｍＬで２次反応処理した。

その結果、第１の方法で導かれた蛍光輝点数はＰＤ−Ｌ１：ＥＧＦＲ＝２００：１４００であり、第２の方法で導かれた蛍光輝点数はＰＤ−Ｌ１：ＥＧＦＲ＝１００：１４００であった。このような差が生じる要因について不明であるが、ここで用意した患者由来マウス検体スライドの状態に、オリジナル患者検体スライドの状態に比較して何らかの変化が生じている可能性が示唆される。今後、マウス検体スライドの状態をチェックするために、本手法が有効な手段になりえると考察された。

以上のように、本発明は、複数種類の免疫染色剤を用いた多重免疫染色でも、免疫染色剤ごとに蛍光輝点数を正確に解析することができる目的生体物質の解析方法および解析システムを提供することに適している。

１ 目的生体物質の解析システム
１０ 蛍光顕微鏡
１２ ステージ
１４ 対物レンズ
１６ 鏡筒
１８ 接眼レンズ
２０ 撮像素子
３０ 組織標本
４０ ランプ
５０ フィルターセット
５２ 励起フィルター
５２ａ 波長幅
５４ ビームスプリッター
５６ 蛍光フィルター
５６ａ 波長幅
５６ｂ 波長重複幅
６０ 制御装置
６２ 制御部
６４ 記憶部
７０ 表示装置

Claims (11)

1. 組織標本を、互いに異なる蛍光ナノ粒子を含む複数種類の免疫染色剤で染色し、これを蛍光顕微鏡を用いて解析する目的生体物質の解析方法において、
   前記免疫染色剤それぞれの輝度比率をフィルターセットごとに算出する工程と、
   前記組織標本の蛍光輝点数を前記フィルターセットごとに計測し、前記輝度比率に基づき、前記免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する工程と、
   を備えることを特徴とする目的生体物質の解析方法。
2. 請求項１に記載の目的生体物質の解析方法において、
   前記免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する工程では、
   免疫染色剤（１〜ｎ）それぞれのフィルターセット（１〜Ｎ）ごとの輝度比率をＲ（１〜ｎ，１〜Ｎ）と、フィルターセット（１〜Ｎ）ごとに計測した組織標本の蛍光輝点数をＴＢ（１〜Ｎ）と、免疫染色剤（１〜ｎ）ごとの蛍光輝点数をＬ（１〜ｎ）として下記の連立方程式を作り、その連立方程式の解から、免疫染色剤（ｍ）の蛍光輝点数Ｌ（ｍ）を算出することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
   ＴＢ（１）＝Ｌ（１）＋Ｒ（１，２）×Ｌ（２）＋Ｒ（１，３）×Ｌ（３）＋…
   ＴＢ（２）＝Ｒ（２，１）×Ｌ（１）＋Ｌ（２）＋Ｒ（２，３）×Ｌ（３）＋…
   ＴＢ（３）＝Ｒ（３，１）×Ｌ（１）＋Ｒ（３，２）×Ｌ（２）＋Ｌ（３）＋…
   ……………
   （ただし、ｎ、Ｎ、ｍは正の整数であり、１≦ｍ≦ｎである。）
3. 請求項２に記載の目的生体物質の解析方法において、
   前記輝度比率Ｒ（１〜ｎ，１〜Ｎ）を、下記一般式（１）から算出することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
   一般式（１）：輝度比率Ｒ（ｍ，ｋ）＝ＦＬ（ｍ，ｋ）／ＦＬ（ｍ，ｐ）
   [上記一般式（１）において、ＦＬ（ｍ，ｋ）は、免疫染色剤（ｍ）をフィルターセット（ｋ）を使用し撮影した画像全体で観察された輝点の合計輝度値である。ＦＬ（ｍ，ｐ）は、免疫染色剤（ｍ）をフィルターセット（ｐ）を使用し撮影した画像全体で観察された輝点の合計輝度値である。ｋは、１〜Ｎの範囲内の整数である。ｐは、１〜Ｎの範囲内の整数である。ｎ、Ｎ及びｍは、それぞれ正の整数であり、１≦ｍ≦ｎである。]
4. 請求項２に記載の目的生体物質の解析方法において、
   前記輝度比率Ｒ（１〜ｎ，１〜Ｎ）を、
   同一輝点の輝度値を前記フィルターセット（１〜Ｎ）ごとに測定し、フィルターセット（ｐ）を使用したときに得られる輝度値Ｘと、フィルターセット（ｋ）を使用したときに得られる輝度値Ｙとの関係を示す近似直線である下記一般式（２）の傾きａを輝度比率Ｒ（ｍ，ｋ）として算出することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
   一般式（２）：Ｙ＝ａＸ
   [ただし、ｋは、１〜Ｎの範囲内の整数である。ｐは、１〜Ｎの範囲内の整数である。ｎ、Ｎ及びｍは、それぞれ正の整数であり、１≦ｍ≦ｎである。]
5. 請求項１〜４に記載の目的生体物質の解析方法において、
   前記フィルターセットとして、励起フィルターの波長幅が２０〜３０ｎｍで、蛍光フィルターの波長幅が３０〜５０ｎｍのフィルターセットを使用することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
6. 請求項５に記載の目的生体物質の解析方法において、
   前記フィルターセットとして、蛍光フィルター同士の波長重複幅が１０ｎｍ以下のフィルターセットを使用することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の目的生体物質の解析方法において、
   前記蛍光ナノ粒子として半導体ナノ粒子または蛍光物質集積ナノ粒子を使用することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
8. 請求項７に記載の目的生体物質の解析方法において、
   前記蛍光ナノ粒子として発光波長が４００〜７００ｎｍのナノ粒子を使用することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
9. 請求項８に記載の目的生体物質の解析方法において、
   前記蛍光ナノ粒子として、発光波長の重複が３０％以下のナノ粒子であって、一方の蛍光ナノ粒子に対応する前記フィルターセットの蛍光フィルターの波長幅での当該一方の蛍光ナノ粒子の強度の積分値に対し、その波長幅での他方の蛍光ナノ粒子の強度の積分値が３０％以下であるナノ粒子を使用することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
10. 請求項１〜９に記載の目的生体物質の解析方法において、組織標本が動物モデルから搾取され、標本化されたものを使用することを特徴とする目的生体物質の解析方法。
11. 組織標本を、互いに異なる蛍光ナノ粒子を含む複数種類の免疫染色剤で染色し、これを蛍光顕微鏡を用いて解析する目的生体物質の解析システムにおいて、
    前記免疫染色剤で染色された前記組織標本を撮像する蛍光顕微鏡と、
    前記蛍光顕微鏡を制御する制御装置であって、前記免疫染色剤それぞれのフィルターセットごとの輝度比率を記憶する記憶部と、前記蛍光顕微鏡の撮像結果から、前記組織標本の前記フィルターセットごとの蛍光輝点数を計測し、前記輝度比率に基づき、前記免疫染色剤ごとの蛍光輝点数を算出する算出部とを有する前記制御装置と、
    を備えることを特徴とする目的生体物質の解析システム。

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