JPWO2016104541A1 - 内胚葉系細胞の製造方法、肝臓細胞の製造方法、膵臓細胞の製造方法、内胚葉系細胞の誘導促進剤、肝臓細胞の誘導促進キット、膵臓細胞の誘導促進キット、およびマイクロ流体デバイス - Google Patents

内胚葉系細胞の製造方法、肝臓細胞の製造方法、膵臓細胞の製造方法、内胚葉系細胞の誘導促進剤、肝臓細胞の誘導促進キット、膵臓細胞の誘導促進キット、およびマイクロ流体デバイス Download PDF

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謙一郎 亀井
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Abstract

分散された多能性細胞からも内胚葉系細胞を誘導でき、且つ内胚葉系細胞の作製効率が向上した内胚葉系細胞の製造方法を提供する。本発明の内胚葉系細胞の製造方法は、多能性細胞から内胚葉系細胞を誘導することにより前記内胚葉系細胞を製造する方法であって、内胚葉系細胞誘導因子の存在下、前記多能性細胞を前記内胚葉系細胞へ誘導する誘導工程を含み、また、前記誘導工程において、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度が、０．５×１０４〜２×１０４細胞／ｃｍ２であることが好ましい。

Description

本発明は、内胚葉系細胞の製造方法、肝臓細胞の製造方法、膵臓細胞の製造方法、内胚葉系細胞の誘導促進剤、肝臓細胞の誘導促進キット、膵臓細胞の誘導促進キット、およびマイクロ流体デバイスに関する。
薬剤の機能評価等を行うために、ＥＳ細胞（胚性幹細胞、embryonic stem cells）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells、ｉＰＳ細胞）等の多能性細胞から肝臓様細胞（以下、「肝臓細胞」ともいう。）を分化させることが試みられている。前記多能性細胞から前記肝臓細胞を誘導する方法として、肝臓細胞分化に関与する遺伝子を前記多能性細胞に導入する方法が知られている。また、非特許文献１には、細胞塊を形成した前記多能性細胞から前記肝臓細胞を誘導する方法が開示されている。
しかしながら、遺伝子導入では、例えば、導入後の細胞のがん化等の可能性が懸念される。また、前記非特許文献１の方法では、分化の初期段階で大半の細胞が死ぬという問題や、前記肝臓細胞の誘導に適した均一な細胞塊を作製するのが困難という問題があった。
Hannan, N.R.F. et.al, "Production of hepatocyte like cells from human pluripotent stem cells", Nature Protocols, volume 8, number 2, pages 430-437
そこで、本発明は、分散された多能性細胞からも内胚葉系細胞を誘導でき、且つ内胚葉系細胞の作製効率が向上した内胚葉系細胞の製造方法の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明の内胚葉系細胞の製造方法は、多能性細胞から内胚葉系細胞を誘導することにより前記内胚葉系細胞を製造する方法であって、
内胚葉系細胞誘導因子の存在下、前記多能性細胞を前記内胚葉系細胞へ誘導する誘導工程を含み、
前記誘導工程において、ＲＯＣＫタンパク質の活性を抑制することを特徴とする。
本発明の肝臓細胞の製造方法は、肝臓細胞分化因子の存在下、内胚葉系細胞を肝臓細胞へ分化させる分化工程を含み、
前記内胚葉系細胞が、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法により得られた内胚葉系細胞であることを特徴とする。
本発明の膵臓細胞の製造方法は、膵臓細胞分化因子の存在下、内胚葉系細胞を膵臓細胞へ分化させる分化工程を含み、
前記内胚葉系細胞が、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法により得られた内胚葉系細胞であることを特徴とする。
本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤は、ＲＯＣＫタンパク質の活性抑制物質を含むことを特徴とする。
本発明の肝臓細胞の誘導促進キットは、前記本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤を含むことを特徴とする。
本発明の膵臓細胞の誘導促進キットは、前記本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤を含むことを特徴とする。
本発明のマイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの開口部と細胞培養チャンバーとを含み、
前記開口部は、前記細胞培養チャンバーと接続され、
前記細胞培養チャンバー内に肝臓細胞と足場とを導入して培養したときに、少なくとも１つの前記開口部から前記細胞培養チャンバーへの肝臓細胞成熟因子の供給を前記細胞培養チャンバー内で濃度勾配を形成しながら行うことができ、
前記本発明の肝臓細胞の製造方法に使用することを特徴とする。
本発明の内胚葉系細胞の製造方法によれば、分散された多能性細胞からも内胚葉系細胞を誘導でき、且つ内胚葉系細胞の作製効率を向上できる。
図１（Ａ）は、実施形態のデバイスの構成を示す斜視図であり、（Ｂ）は、図１（Ａ）のＩ−Ｉ’方向からみた模式断面図である。 図２は、実施例１におけるＣＸＣＲ４の発現量を示すヒストグラムである。 図３は、実施例２におけるＣＸＣＲ４の発現量を示すヒストグラムである。 図４は、実施例２における細胞数を示すグラフである。 図５は、実施例２におけるＳＯＸ１７遺伝子の発現量を示すグラフである。 図６は、実施例３におけるＡＦＰ遺伝子、ＨＮＦ４α遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を示す写真である。 図７は、実施例４におけるＡ１ＡＴの発現を示す写真である。 図８は、実施例４におけるＡ１ＡＴの発現量を示すヒストグラムである。 図９は、実施例５におけるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の取り込みおよび排出を示す写真である。 図１０は、実施例６におけるＣＹＰ１Ａ１遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子、ＭＲＰ２遺伝子、ＭＤＲ／ＴＡＰ遺伝子、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子、Ａ１ＡＴ遺伝子、ＴＤＯ２遺伝子、ＨＮＦ４α遺伝子、およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を示す写真である。 図１１は、実施例７におけるＡ１ＡＴの発現を示す写真である。 図１２は、実施例７におけるＩＣＧの取り込みおよび排出を示す写真である。 図１３は、実施例９におけるＡＬＢ遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子、Ａ１ＡＴ遺伝子、ＭＤＲ／ＴＡＰ遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を示す写真である。 図１４は、実施例１０におけるＮＫＸ６．１およびインスリンの発現を示す写真である。 図１５は、実施例１０におけるＰＴＦ１α遺伝子、ＮＫＸ６．１遺伝子、ＰＤＸ１遺伝子、およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を示す写真である。
本発明の内胚葉系細胞の製造方法は、前記誘導工程において、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度が、０．５×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２であることが好ましい。
本発明の内胚葉系細胞の製造方法は、前記多能性細胞が、分散された多能性細胞であることが好ましい。
本発明の内胚葉系細胞の製造方法は、例えば、前記内胚葉系細胞誘導因子が、ＴＧＦ−βファミリータンパク質、ｂＦＧＦ、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性抑制物質、ＧＳＫ−３βタンパク質の活性抑制物質、およびｍＴＯＲタンパク質の活性抑制物質からなる群から選択された少なくとも１つを含む。前記ＴＧＦ−βファミリータンパク質は、アクチビン、ＢＭＰ−４、およびＮＯＤＡＬからなる群から選択された少なくとも１つを含むことが好ましい。
本発明の内胚葉系細胞の製造方法は、例えば、前記誘導工程が、前記内胚葉系細胞誘導因子を含む多能性細胞用の培養液の存在下、前記多能性細胞を前記内胚葉系細胞へ誘導する誘導工程である。また、前記培養液が、ＴＧＦ−βファミリータンパク質およびｂＦＧＦを含む培養液であることが好ましく、ＴＧＦ−βファミリータンパク質、ｂＦＧＦ、およびインスリンを含む培養液であることがより好ましい。
本発明の内胚葉系細胞の製造方法は、例えば、前記誘導工程において、前記ＲＯＣＫタンパク質の活性抑制化合物により前記ＲＯＣＫタンパク質の活性を抑制することが好ましい。
本発明の肝臓細胞の製造方法は、例えば、前記肝臓細胞分化因子が、ＴＧＦ−βファミリータンパク質、ＦＧＦ１０、およびＷＮＴからなる群から選択された少なくとも１つを含む。前記ＴＧＦ−βファミリータンパク質は、アクチビン、ＢＭＰ−４、およびＮＯＤＡＬからなる群から選択された少なくとも１つを含むことが好ましい。
本発明の肝臓細胞の製造方法は、例えば、さらに、肝臓細胞成熟因子の存在下、前記肝臓細胞を成熟させる成熟工程を含む。
本発明の肝臓細胞の製造方法は、前記成熟工程において、足場上で前記肝臓細胞を成熟させることが好ましい。また、前記足場が、細胞外基質タンパク質、血液成分および組み換えタンパク質を含むコーティングからなる群から選択された少なくとも１つであることがより好ましく、前記細胞外基質タンパク質であることがさらに好ましい。
本発明の肝臓細胞の製造方法は、例えば、前記肝臓細胞成熟因子が、ＯＳＭ、ＨＧＦ、デキサメタゾン、ニコチンアミド、ジメチルスルホキシド、および酪酸ナトリウムからなる群から選択された少なくとも１つを含む。
本発明の肝臓細胞の製造方法は、前記成熟工程において、前記肝臓細胞をマイクロ流体デバイス（以下、「デバイス」ともいう、）内で成熟させ、
前記マイクロ流体デバイスが、少なくとも２つの開口部と細胞培養チャンバーとを含み、
前記開口部は、前記細胞培養チャンバーと接続され、
前記細胞培養チャンバー内に前記肝臓細胞と足場とを導入して培養したときに、少なくとも１つの前記開口部から前記細胞培養チャンバーへの前記肝臓細胞成熟因子の供給を前記細胞培養チャンバー内で濃度勾配を形成しながら行うことができるマイクロ流体デバイスであることが好ましい。また、前記成熟工程において、前記成熟開始時の前記肝臓細胞の細胞密度が、１×１０４〜５×１０４細胞／ｃｍ２であることがより好ましい。
本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤は、例えば、前記ＲＯＣＫタンパク質の活性抑制物質が、前記ＲＯＣＫタンパク質の活性抑制化合物である。
本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤は、例えば、さらに、内胚葉系細胞誘導因子を含む。前記内胚葉系細胞誘導因子が、ＴＧＦ−βファミリータンパク質、ｂＦＧＦ、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性抑制物質、ＧＳＫ−３βタンパク質の活性抑制物質、およびｍＴＯＲタンパク質の活性抑制物質からなる群から選択された少なくとも１つを含む。前記ＴＧＦ−βファミリータンパク質は、アクチビン、ＢＭＰ−４、およびＮＯＤＡＬからなる群から選択された少なくとも１つを含むことが好ましい。
本発明の肝臓細胞の誘導促進キットは、例えば、さらに、肝臓細胞分化因子を含む。前記肝臓細胞分化因子が、ＴＧＦ−βファミリータンパク質、ＦＧＦ１０、およびＷＮＴからなる群から選択された少なくとも１つを含む。前記ＴＧＦ−βファミリータンパク質は、アクチビン、ＢＭＰ−４、およびＮＯＤＡＬからなる群から選択された少なくとも１つを含むことが好ましい。
本発明の肝臓細胞の誘導促進キットは、例えば、さらに、肝臓細胞成熟因子を含む。前記肝臓細胞成熟因子が、ＯＳＭ、ＨＧＦ、デキサメタゾン、ニコチンアミド、ジメチルスルホキシド、および酪酸ナトリウムからなる群から選択された少なくとも１つを含む。
本発明の肝臓細胞の誘導促進キットは、さらに、マイクロ流体デバイスを含み、
前記マイクロ流体デバイスが、少なくとも２つの開口部と細胞培養チャンバーとを含み、
前記開口部は、前記細胞培養チャンバーと接続され、
前記細胞培養チャンバー内に前記肝臓細胞と足場とを導入して培養したときに、少なくとも１つの前記開口部から前記細胞培養チャンバーへの前記肝臓細胞成熟因子の供給を前記細胞培養チャンバー内で濃度勾配を形成しながら行うことができるマイクロ流体デバイスであることが好ましい。
本発明の膵臓細胞の製造方法および膵臓細胞の誘導促進キットは、例えば、前記膵臓細胞分化因子が、ＫＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ヘッジホッグシグナル阻害剤、レチノイン酸受容体の活性化物質、Ｎｏｇｇｉｎ、およびＡＬＫ阻害剤からなる群から選択された少なくとも１つである。
本発明において「ＲＯＣＫタンパク質」は、Ｒｈｏ結合キナーゼ（Rho-associated coiled-coil forming kinase）を意味する。
本発明において、「多能性」は、例えば、内胚葉、中胚葉および外胚葉を含む三胚葉への分化能を有することを意味する。また、本発明において、「多能性」は、例えば、全ての細胞への分化能、すなわち全能性を有することも含む。
本発明において、「タンパク質の活性抑制」は、例えば、タンパク質の活性を抑制することを意味する。前記抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、前記タンパク質の活性自体の抑制でもよいし、前記タンパク質の発現抑制でもよい。後者の場合、前記発現抑制は、例えば、ダウンレギュレーションでもよいし、サイレンシングでもよい。前記タンパク質の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。
＜内胚葉系細胞の製造方法＞
本発明の内胚葉系細胞の製造方法は、前述のように、多能性細胞から内胚葉系細胞を誘導することにより前記内胚葉系細胞を製造する方法であって、内胚葉系細胞誘導因子の存在下、前記多能性細胞を前記内胚葉系細胞へ誘導する誘導工程を含み、前記誘導工程において、ＲＯＣＫタンパク質（以下、「ＲＯＣＫ」ともいう。）の活性を抑制することを特徴とする。本発明の内胚葉系細胞の製造方法は、前記誘導工程において、ＲＯＣＫタンパク質の活性を抑制することを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。
本発明者らは、鋭意研究の結果、前記多能性細胞から前記内胚葉系細胞の誘導において、前記ＲＯＣＫの活性を抑制することにより、例えば、誘導中の細胞死を抑制でき、且つ細胞増殖を促進できることを見出した。このため、本発明の内胚葉系細胞の製造方法によれば、内胚葉系細胞の作製効率が向上できる。前記多能性細胞から他の細胞を誘導する際に前記ＲＯＣＫの活性を抑制するということは、例えば、前記先行技術文献の方法等では行われていない方法であり、本発明者らが初めて実施した新規な方法である。また、本発明者らは、鋭意研究の結果、前記ＲＯＣＫの活性を抑制することにより、分散された前記多能性細胞から前記内胚葉系細胞を誘導できることを確認し、本発明を確立するに至った。このため、本発明では、前記分散された多能性細胞からも前記内胚葉系細胞を誘導できるため、前記先行技術文献のように、細胞塊を形成した前記多能性細胞から前記内胚葉系細胞を誘導する必要がない。このため、本発明によれば、例えば、均一な多能性細胞の細胞塊を作製する必要が無いため、より簡便な操作で、前記内胚葉系細胞を誘導できる。さらに、本発明者らは、メカニズムは不明であるが、本発明の内胚葉系細胞の製造方法により得られた内胚葉系細胞を使用することにより、例えば、前記先行技術文献の方法に対して、肝臓細胞および膵臓細胞の誘導および成熟に要する日数を短縮できることを見出した。このため、本発明の内胚葉系細胞の製造方法によれば、例えば、より短い期間で成熟肝臓細胞および膵臓細胞を分化可能な内胚葉系細胞を誘導できる。
前記多能性細胞は、特に制限されず、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、生殖性幹細胞、体性幹細胞、胚性腫瘍細胞等があげられる。前記多能性細胞の由来は、特に制限されず、例えば、ヒトおよびヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、サル、ゴリラ、チンパンジー、マーモセット等の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ウマ、モルモット等があげられる。
前記内胚葉系細胞誘導因子は、例えば、ＴＧＦ−βファミリータンパク質、ｂＦＧＦ（Basic fibroblast growth factor）、ＰＩ３Ｋタンパク質（以下、「ＰＩ３Ｋ」ともいう。）の活性抑制物質、ＧＳＫ−３βタンパク質（以下、「ＧＳＫ−３β」ともいう。）の活性抑制物質、ｍＴＯＲタンパク質（以下、「ｍＴＯＲ」ともいう。）の活性抑制物質等があげられる。前記ＴＧＦ−βファミリータンパク質は、特に制限されず、例えば、アクチビンＡ、ＢＭＰ−４（bone morphogenetic protein 4）、ＮＯＤＡＬ等があげられる。前記ＰＩ３Ｋの活性抑制物質は、特に制限されず、例えば、前記ＰＩ３Ｋの活性を抑制する化合物、核酸等があげられる。前者の場合、前記ＰＩ３Ｋの活性抑制化合物は、例えば、公知のＰＩ３Ｋの活性抑制化合物が使用でき、例えば、ＬＹ２９４００２、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＰＩ８２８、ＴＧ１００７１３、ＰＦ０５２１２３８４等があげられる。後者の場合、前記ＰＩ３Ｋの活性抑制核酸は、例えば、前記ＰＩ３ＫをコードするｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の発現抑制核酸等があげられる。前記ＧＳＫ−３βの活性抑制物質は、特に制限されず、例えば、前記ＧＳＫ−３βの活性を抑制する化合物、核酸等があげられる。前者の場合、前記ＧＳＫ−３βの活性抑制化合物は、例えば、公知のＧＳＫ−３βの活性抑制化合物が使用でき、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、ＭｅＢＩＯ、ＳＢ２１６７６３、ＴＷＳ１１９、３Ｆ８、ＴＣ−Ｇ２４等があげられる。後者の場合、前記ＧＳＫ−３βの活性抑制核酸は、例えば、前記ＧＳＫ−３βをコードするｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の発現抑制核酸等があげられる。前記ｍＴＯＲの活性抑制物質は、特に制限されず、例えば、前記ｍＴＯＲの活性を抑制する化合物、核酸等があげられる。前者の場合、前記ｍＴＯＲの活性抑制化合物は、例えば、公知のｍＴＯＲの活性抑制化合物が使用でき、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ、ＫＵ００６３７９４、ＰＰ２４２、Ｔｏｒｉｎ１、Ｔｏｒｉｎ２、ＷＹＥ６８７ dihydrochloride、ＸＬ３８８等があげられる。後者の場合、前記ｍＴＯＲの活性抑制核酸は、例えば、前記ｍＴＯＲをコードするｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の発現抑制核酸等があげられる。前記内胚葉系細胞誘導因子がタンパク質である場合、前記内胚葉系細胞誘導因子の由来は、前記多能性細胞の由来と同じでもよいし、異なってもよい。前記内胚葉系細胞誘導因子は、例えば、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。後者の場合、前記内胚葉系細胞誘導因子の組合せは、特に制限されず、例えば、アクチビンＡ、ＢＭＰ−４および前記ＰＩ３Ｋの活性抑制物質の組合せ、アクチビンＡ、ＢＭＰ−４、前記ＰＩ３Ｋの活性抑制物質およびＧＳＫ−３βの活性抑制物質の組合せ、アクチビンＡおよびＧＳＫ−３βの活性抑制物質の組合せ等があげられる。前記内胚葉系細胞誘導因子は、前記多能性細胞から前記内胚葉細胞への誘導において、全期間にわたり同じ前記内胚葉系細胞誘導因子を使用してもよいし、所定期間毎に異なる前記内胚葉系細胞誘導因子を使用してもよい。前記所定期間は、例えば、後述する実施例等を参照できる。
前記内胚葉系細胞は、特に制限されず、前記内胚葉由来の細胞に分化できる細胞があげられる。前記内胚葉由来の細胞は、例えば、消化器官系の細胞、肝臓細胞、膵臓細胞等があげられる。前記内胚葉系細胞は、例えば、１種類の前記内胚葉由来の細胞に分化可能でもよいし、２種類以上の前記内胚葉由来の細胞に分化可能でもよい。前記内胚葉系細胞は、例えば、内胚葉系細胞マーカーの発現により確認することができる。前記内胚葉系細胞マーカーは、例えば、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＨＮＦ−３β（ＦｏｘＡ２、hepatocyte nuclear factors-3β）、ＧＳＣ（goosecoid）等があげられる。ヒト由来ＳＯＸ１７は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２２４５４で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＣＸＣＲ４は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００３４６７で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＨＮＦ−３βは、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２１７８４またはＮＭ＿１５３６７５で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＧＳＣは、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１７３８４９で登録されている塩基配列があげられる。本発明の内胚葉系細胞の製造方法において、例えば、１種類の前記内胚葉系細胞マーカーが発現している細胞を前記内胚葉系細胞としてもよいし、２種類以上の前記内胚葉系細胞マーカーが発現している細胞を前記内胚葉系細胞としてもよく、より生体の内胚葉系細胞と性質が近いことから、全ての前記内胚葉系細胞マーカーが発現している細胞を前記内胚葉系細胞とすることが好ましい。
前記誘導工程において、前記多能性細胞から前記内胚葉系細胞への誘導は、例えば、培養液（以下、「誘導用培養液」ともいう。）の存在下で培養することにより行うことができる。前記誘導用培養液の存在下で前記多能性細胞の誘導を行う場合、前記誘導用培養液が、例えば、前記内胚葉系細胞誘導因子を含む。前記誘導用培養液は、特に制限されず、例えば、多能性細胞用の培養液、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｉｓｃｏｖｅ（ＩＭＥＭ）、αＭＥＭ等があげられる。前記多能性細胞用の培養液は、例えば、ｍＴｅＳＲ−１（STEMCELL Technologies社製）、ＴｅＳＲ−Ｅ８（STEMCELL Technologies社製）、ＣＤＭ−ＰＶＡ、ＳｔｅｍＰＲＯ ｈＥＳＣ ＳＦＭ（Life Technologies社製）、Ｅ８（Life Technologies社製）等があげられ、好ましくは、ｍＴｅＳＲ−１、ＴｅＳＲ−Ｅ８、Ｅ８である。前記ＣＤＭ−ＰＶＡの組成は、例えば、前記非特許文献１を参照できる。前記誘導用培養液は、例えば、前記内胚葉系細胞への分化効率がより向上することから、ＴＧＦ−βファミリータンパク質およびｂＦＧＦを含む培養液であることが好ましく、ＴＧＦ−βファミリータンパク質、ｂＦＧＦ、およびインスリンを含む培養液であることがより好ましい。具体例として、これら２または３種類の因子を含む誘導用培養液は、例えば、ｍＴｅＳＲ−１、Ｅ８等があげられる。前記誘導用培養液は、前記多能性細胞から前記内胚葉細胞への誘導において、全期間にわたり同じ誘導用培養液を使用してもよいし、所定期間毎に異なる前記誘導用培養液を使用してもよい。前記所定期間は、例えば、後述する実施例等を参照できる。
前記誘導用培養液は、その他の成分を含んでもよい。前記その他の成分は、特に制限されず、培養補助剤、血清、抗生物質等があげられる。前記培養補助剤は、例えば、GlutaMAX（商標）サプリメント（GIBCO社製）、B-27（登録商標）サプリメント、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）サプリメント等があげられる。前記抗生物質は、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等があげられる。
前記誘導工程において、前記多能性細胞から前記内胚葉系細胞への誘導は、例えば、フィーダー細胞を使用して行ってもよいし、フィーダー細胞を使用せずに行ってもよい。前記フィーダー細胞は、例えば、マウス胚繊維芽細胞等の公知のフィーダー細胞が使用できる。前記フィーダー細胞を使用しない場合、足場上で前記多能性細胞を成熟させることが好ましい。前記足場は、特に制限されず、例えば、細胞外基質タンパク質を含むコーティング、血液成分を含むコーティング、コーティング剤を含むコーティング、組み換えタンパク質を含むコーティング等があげられ、好ましくは、細胞外基質タンパク質を含むコーティングである。前記細胞外基質タンパク質は、例えば、ラミニン１１１等のラミニン、コラーゲンＩ、コラーゲンIV等のコラーゲン、エンタクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等があげられる。前記細胞外基質タンパク質を含むコーティングは、１種類の前記細胞外基質タンパク質を含んでもよいし、２種類以上の前記細胞外基質タンパク質を含んでもよい。前記細胞外基質タンパク質を含むコーティングは、例えば、マトリゲル（商標）（BD Biosciences社製）、コラーゲン、ラミニン等によるコーティング等があげられる。前記血液成分を含むコーティングは、特に制限されず、例えば、全血、血清、血漿等の血液試料、フィブロネクチン等の血液タンパク質によるコーティングがあげられる。前記コーティング剤は、例えば、Synthemax（登録商標）（Corning社製）等があげられる。前記組み換えタンパク質は、例えば、前述の細胞外基質タンパク質の改変タンパク質および融合タンパク質等があげられる。前記足場は、例えば、前記血清、前記細胞外基質タンパク質等を前記培養容器上でインキュベートすることで作製できる。前記足場は、例えば、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。
前記誘導工程において、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度は、例えば、前記多能性細胞を前記培養容器に播種した際の密度と対応するため、前記多能性細胞の播種密度ということもできる。前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度は、特に制限されず、例えば、０．５×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２であり、前記内胚葉系細胞の分化効率がより向上することから、好ましくは、１×１０４〜７×１０４細胞／ｃｍ２であり、より好ましくは、２×１０４〜６×１０４細胞／ｃｍ２である。また、前記誘導開始時の前記多能性細胞は、例えば、分散された多能性細胞でもよいし、細胞塊を形成した多能性細胞でもよく、前記内胚葉系細胞の分化効率がより向上することから、好ましくは、分散された多能性細胞である。前記分散された多能性細胞は、例えば、前記細胞塊を形成した多能性細胞をプロテアーゼ処理することにより取得できる。前記プロテアーゼ処理の条件は、特に制限されず、例えば、細胞を分離する一般的な条件があげられる。前記プロテアーゼは、特に制限されず、例えば、細胞培養等に使用されている公知のプロテアーゼがあげられ、具体的には、トリプシン、TrypLE（商標）express（Life Technologies社製）等のトリプシン誘導体、アキュターゼ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ等があげられる。前記プロテアーゼ処理は、例えば、ＥＤＴＡ等の公知のカルシウムキレート剤存在下で行ってもよい。前記細胞塊を形成した多能性細胞を使用する場合、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度は、例えば、１×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２であり、前記内胚葉系細胞の分化効率がより向上することから、好ましくは、２．５×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２であり、より好ましくは、５×１０４〜１×１０５細胞／ｃｍ２である。また、前記分散された多能性細胞を使用する場合、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度は、例えば、０．５×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２であり、前記内胚葉系細胞の分化効率がより向上することから、好ましくは、１×１０４〜７×１０４細胞／ｃｍ２であり、より好ましくは、２×１０４〜６×１０４細胞／ｃｍ２である。前記細胞密度は、例えば、前記誘導時に使用する培養容器の培養可能な面積と細胞数とから算出できる。
前記誘導工程において、前記多能性細胞から前記内胚葉細胞への誘導を行う日数（以下、「誘導期間」ともいう。）は、特に制限されず、例えば、３〜８日であり、好ましくは、４〜５日である。
前記誘導工程において、前記ＲＯＣＫの活性を抑制する方法は、特に制限されず、例えば、前記ＲＯＣＫの活性抑制物質を使用する方法等があげられる。前記ＲＯＣＫの活性抑制物質を使用する場合、前記多能性細胞から前記内胚葉系細胞への誘導は、例えば、前記ＲＯＣＫの活性抑制物質存在下で培養することにより行うことができる。前記ＲＯＣＫの活性抑制物質は、特に制限されず、例えば、前記ＲＯＣＫの活性を抑制する化合物、核酸等があげられる。前者の場合、前記ＲＯＣＫ活性抑制化合物は、例えば、公知のＲＯＣＫ活性抑制化合物が使用でき、Ｙ２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）等があげられる。後者の場合、前記ＲＯＣＫの活性抑制核酸は、例えば、前記ＲＯＣＫをコードするｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の発現抑制核酸等があげられる。前記ＲＯＣＫの活性抑制物質は、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。前記ＲＯＣＫの活性抑制物質を使用する場合、前記ＲＯＣＫの活性抑制物質の濃度は、特に制限されず、例えば、１×１０−６〜１×１０−４ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、２×１０−６〜２×１０−５ｍｏｌ／Ｌである。前記ＲＯＣＫの活性抑制物質の濃度は、例えば、１種類の前記ＲＯＣＫの活性抑制物質の濃度でもよいし、２種類以上の前記ＲＯＣＫの活性抑制物質の濃度の合計の濃度でもよい（以下、同様）。前記ＲＯＣＫ活性抑制化合物は、例えば、前記ＲＯＣＫにより重合および脱重合が制御されているミオシンの活性を制御してもよいし、前記ＲＯＣＫを活性化するタンパク質の活性を制御してもよい。前者の場合、前記ＲＯＣＫ活性抑制化合物は、例えば、ミオシンの脱重合剤があげられる。前記ミオシンの脱重合剤は、例えば、公知のミオシンの脱重合剤が使用でき、Blebbistatin等があげられる。
前記誘導工程において、前記ＲＯＣＫの活性を抑制する日数は、特に制限されず、例えば、前述の誘導期間の全期間でもよいし、一部の期間でもよい。後者の場合、前記誘導期間における前記ＲＯＣＫの活性の抑制の開始日と終了日とは、特に制限されない。前記誘導工程において、例えば、前記内胚葉系細胞の誘導の初期に前記ＲＯＣＫの活性を抑制することで、前記内胚葉系細胞の分化効率をより向上できることから、前記開始日は、前記誘導期間の開始日が好ましい。前記終了日は、特に制限されず、例えば、前記誘導中の前記多能性細胞が、培養容器への接着性を獲得する日があげられる。前記誘導期間において、前記ＲＯＣＫの活性を抑制する日数は、特に制限されず、例えば、前記ＲＯＣＫの活性を抑制する日数（Ｓ）と前記誘導期間の日数（Ｉ）との比（Ｓ：Ｉ）が、１：２〜７、１：２〜６、１：３〜４である。具体的に、前記ＲＯＣＫの活性を抑制する日数は、例えば、１〜７日、２〜６日、３〜４日である。
前記誘導工程において、前記内胚葉系細胞誘導因子の濃度は、特に制限されず、例えば、１×１０−１２〜１×１０−６ｍｏｌ／Ｌがあげられる。前記内胚葉系細胞誘導因子の濃度は、例えば、１種類の前記内胚葉系細胞誘導因子の濃度でもよいし、２種類以上の前記内胚葉系細胞誘導因子の濃度の合計の濃度でもよい（以下、同様）。前記内胚葉系細胞誘導因子がＴＧＦ−βファミリータンパク質を含む場合、前記ＴＧＦ−βファミリータンパク質の濃度は、例えば、１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−９〜５×１０−９ｍｏｌ／Ｌである。前記内胚葉系細胞誘導因子がアクチビンＡを含む場合、前記アクチビンＡの濃度は、例えば、１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−９〜５×１０−９ｍｏｌ／Ｌである。前記内胚葉系細胞誘導因子がＢＭＰ−４を含む場合、前記ＢＭＰ−４の濃度は、例えば、１×１０−１１〜１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−１０〜５×１０−１０ｍｏｌ／Ｌである。前記内胚葉系細胞誘導因子がｂＦＧＦを含む場合、前記ｂＦＧＦの濃度は、例えば、１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌで、１×１０−９〜５×１０−９ｍｏｌ／Ｌである。前記内胚葉系細胞誘導因子がＰＩ３Ｋの活性抑制物質を含む場合、前記ＰＩ３Ｋの活性抑制物質の濃度は、例えば、１×１０−６〜１×１０−４ｍｏｌ／Ｌ、５×１０−６〜２×１０−５ｍｏｌ／Ｌである。前記内胚葉系細胞誘導因子がＧＳＫ−３βの活性抑制物質を含む場合、前記ＧＳＫ−３βの活性抑制物質の濃度は、例えば、１×１０−６〜１×１０−４ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−６〜５×１０−６ｍｏｌ／Ｌである。
前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度、前記ＲＯＣＫの活性抑制物質の濃度および前記内胚葉系細胞誘導因子の濃度の組合せは、特に制限されず、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度が０．５×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２である場合、例えば、前記ＲＯＣＫの活性抑制物質の濃度は、１×１０−６〜１×１０−４ｍｏｌ／Ｌであり、前記内胚葉系細胞誘導因子の濃度は、１×１０−１２〜１×１０−６ｍｏｌ／Ｌである。なお、３者の組合せについて、例示したが、前記３者のうち、２者を組合せて使用してもよい。
前記誘導工程において、培養条件は、特に制限されず、例えば、前記多能性細胞を培養する一般的な培養条件を使用できる。前記誘導工程において、Ｏ２分圧は、例えば、１〜２１％であり、ＣＯ２分圧は、例えば、５〜６％である。培養温度は、例えば、３６〜３７℃である。
以下に、前記誘導工程について、前記内胚葉系細胞誘導因子が、アクチビンＡ、ＢＭＰ−４、ｂＦＧＦ、ＰＩ３Ｋの活性抑制化合物、およびＧＳＫ−３βの活性抑制化合物であり、前記ＲＯＣＫの活性を、ＲＯＣＫ活性抑制化合物により抑制する例について、説明する。これらは一例であり、本発明を制限するものではない。
まず、第１培養液に懸濁した多能性細胞を培養容器に播種する。前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度は、例えば、０．５×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２である。前記第１培養液は、例えば、１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ アクチビンＡおよび１×１０−６〜１×１０−４ｍｏｌ／Ｌ 前記ＲＯＣＫ活性抑制化合物を含む誘導用培養液である。培養条件は、特に制限されず、Ｏ２分圧は、例えば、１〜２１％であり、ＣＯ２分圧は、例えば、５〜６％である。培養温度は、例えば、３６〜３７℃である。そして、前記培養条件下で、例えば、１２〜４８時間培養する。
つぎに、前記第１培養液を除去し、第２培養液を添加する。前記第２培養液は、例えば、１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ アクチビンＡ、１×１０−１１〜１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ ＢＭＰ−４、１×１０−６〜１×１０−４ｍｏｌ／Ｌ ＰＩ３Ｋの活性抑制化合物、１×１０−６〜１×１０−４ｍｏｌ／Ｌ ＧＳＫ−３βの活性抑制化合物、および１×１０−６〜１×１０−４ｍｏｌ／Ｌ 前記ＲＯＣＫ活性抑制化合物を含む誘導用培養液である。そして、前記培養条件で、例えば、１２〜３６時間培養する。
つぎに、前記第２培養液を除去し、第３培養液を添加する。前記第３培養液は、例えば、１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ アクチビンＡ、１×１０−１１〜１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ ＢＭＰ−４、１×１０−６〜１×１０−４ｍｏｌ／Ｌ ＰＩ３Ｋの活性抑制化合物、および１×１０−６〜１×１０−４ｍｏｌ／Ｌ 前記ＲＯＣＫ活性抑制化合物を含む誘導用培養液である。そして、前記培養条件で、例えば、１２〜３６時間培養する。
そして、前記培養後の細胞を回収することで、前記内胚葉系細胞を取得できる。前記誘導工程は、さらに、下記の第４培養液を用いた培養を含んでもよい。
前記誘導工程が前記第４培養液を用いた培養を含む場合、つぎに、前記第３培養液を除去し、前記第４培養液を添加する。前記第４培養液は、例えば、１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ アクチビンＡおよび１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ ｂＦＧＦを含む誘導用培養液である。そして、前記培養条件で、例えば、１２〜３６時間培養する。
そして、前記培養後の細胞を回収することで、前記内胚葉系細胞を取得できる。
＜肝臓細胞の製造方法＞
本発明の肝臓細胞の製造方法は、前述のように、肝臓細胞分化因子の存在下、内胚葉系細胞を肝臓細胞へ分化させる分化工程を含み、前記内胚葉系細胞が、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法により得られた内胚葉系細胞であることを特徴とする。本発明の肝臓細胞の製造方法は、前記内胚葉系細胞が、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法により得られた内胚葉系細胞であることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の肝臓細胞の製造方法によれば、分散された前記多能性細胞からも前記肝臓細胞を誘導でき、且つ肝臓細胞の作製効率を向上できる。本発明の肝臓細胞の製造方法は、例えば、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法の説明を援用できる。
本発明の肝臓細胞の製造方法は、前記分化工程に先立ち、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法により、前記内胚葉系細胞を誘導する誘導工程を含んでもよい。前記誘導工程は、例えば、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法における誘導工程と同様に実施できる。
前記肝臓細胞分化因子は、例えば、ＴＧＦ−βファミリータンパク質、ＦＧＦ１０（fibroblast growth factor 10）、ＷＮＴ等があげられる。前記ＴＧＦ−βファミリータンパク質は、特に制限されず、例えば、アクチビンＡ、ＢＭＰ−４、ＮＯＤＡＬ等があげられる。前記肝臓細胞分化因子がタンパク質である場合、前記肝臓細胞分化因子の由来は、前記内胚葉系細胞の由来、すなわち前述の多能性細胞の由来と同じでもよいし、異なってもよい。前記肝臓細胞分化因子は、例えば、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。後者の場合、前記肝臓細胞分化因子の組合せは、特に制限されず、例えば、ＢＭＰ−４およびＦＧＦ１０の組合せ、ＢＭＰ−４およびＷＮＴの組合せ等があげられる。前記肝臓細胞分化因子は、前記内胚葉系細胞から前記肝臓細胞への分化において、全期間にわたり同じ前記肝臓細胞分化因子を使用してもよいし、所定期間毎に異なる前記肝臓細胞分化因子を使用してもよい。前記所定期間は、例えば、後述する実施例等を参照できる。
前記肝臓細胞は、例えば、肝臓細胞マーカーの発現により確認することができる。前記肝臓細胞マーカーは、例えば、ＡＦＰ（α−fetoprotein）、ＨＮＦ４α（hepatocyte nuclear factor 4 alpha）、ＴＡＴ(tyrosine aminotransferase)、ＴＴＲ（transthyretin）、ＡｐｏＦ（apolipoprotein F）、ＣＡＲ（constitutive androstane receptor）、ＴＤＯ２（tryptophan 2,3-dioxygenase、ＴＯ）等があげられる。ヒト由来ＡＦＰは、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１１３４で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＨＮＦ４αは、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００４５７で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＴＡＴは、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００３５３で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＴＴＲは、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００３７１で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＡｐｏＦは、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１６３８で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＣＡＲは、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１０７７４６９で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＴＤＯ２は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５６５１で登録されている塩基配列があげられる。本発明の肝臓細胞の製造方法において、例えば、１種類の前記肝臓細胞マーカーが発現している細胞を前記肝臓細胞としてもよいし、２種類以上の前記肝臓細胞マーカーが発現している細胞を前記肝臓細胞としてもよく、より生体の肝臓細胞と性質が近いことから、全ての前記肝臓細胞マーカーが発現している細胞を前記肝臓細胞とすることが好ましい。
前記分化工程において、前記内胚葉系細胞から前記肝臓細胞への分化は、例えば、培養液（以下、「分化用培養液」ともいう。）の存在下で培養することにより行うことができる。前記分化用培養液の存在下で前記肝臓細胞の分化を行う場合、前記分化用培養液が、例えば、前記肝臓細胞分化因子を含む。前記分化用培養液は、特に制限されず、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｉｓｃｏｖｅ（ＩＭＥＭ）、αＭＥＭ等があげられる。前記分化用培養液は、前記内胚葉系細胞から前記肝臓細胞への分化において、全期間にわたり同じ分化用培養液を使用してもよいし、所定期間毎に異なる前記分化用培養液を使用してもよい。前記所定期間は、例えば、後述する実施例等を参照できる。
前記分化用培養液は、その他の成分を含んでもよい。前記その他の成分は、例えば、前述の説明を援用できる。
前記分化工程において、前記内胚葉系細胞から前記肝臓細胞への分化は、例えば、フィーダー細胞を使用して行ってもよいし、フィーダー細胞を使用せずに行ってもよい。前記フィーダー細胞は、例えば、前述の説明を援用できる。また、前記フィーダー細胞を使用しない場合、足場上で前記内胚葉系細胞を成熟させることが好ましい。前記足場は、例えば、前述の説明を援用できる。
前記分化工程において、前記内胚葉系細胞は、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法で得られた内胚葉系細胞であればよい。本発明の肝臓細胞の製造方法が前記誘導工程を含む場合、前記内胚葉系細胞は、例えば、前記誘導工程において得られた前記内胚葉系細胞をそのまま使用してもよいし、前記誘導工程において得られた前記内胚葉系細胞を回収し、回収した前記内胚葉系細胞を播種して使用してもよい。前記内胚葉系細胞を播種する場合、前記分化開始時の前記内胚葉系細胞の細胞密度は、特に制限されず、例えば、１×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２であり、前記肝臓細胞の分化効率がより向上することから、好ましくは、２．５×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２であり、より好ましくは、５×１０４〜１×１０５細胞／ｃｍ２である。前記細胞密度は、例えば、前記分化時に使用する培養容器の培養可能な面積と細胞数とから算出できる。
前記分化工程において、前記内胚葉系細胞から前記肝臓細胞への分化を行う日数（以下、「分化期間」ともいう。）は、特に制限されず、例えば、３〜１４日であり、好ましくは、５〜８日である。
前記分化工程において、前記肝臓細胞分化因子の濃度は、特に制限されず、例えば、１×１０−１２〜１×１０−６ｍｏｌ／Ｌがあげられる。前記肝臓細胞分化因子の濃度は、例えば、１種類の前記肝臓細胞分化因子の濃度でもよいし、２種類以上の前記肝臓細胞分化因子の濃度の合計の濃度でもよい（以下、同様）。前記肝臓細胞分化因子がＴＧＦ−βファミリータンパク質を含む場合、前記ＴＧＦ−βファミリータンパク質の濃度は、例えば、１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−９〜５×１０−９ｍｏｌ／Ｌである。前記肝臓細胞分化因子がアクチビンＡを含む場合、前記アクチビンＡの濃度は、例えば、１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−９〜５×１０−９ｍｏｌ／Ｌである。前記肝臓細胞分化因子がＢＭＰ−４を含む場合、前記ＢＭＰ−４の濃度は、例えば、１×１０−１１〜１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−１０〜５×１０−１０ｍｏｌ／Ｌである。前記肝臓細胞分化因子がＦＧＦ１０を含む場合、前記ＦＧＦ１０の濃度は、例えば、１×１０−１３〜１×１０−１１ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−１２〜１×１０−１１ｍｏｌ／Ｌである。前記肝臓細胞分化因子がＷＮＴを含む場合、前記ＷＮＴの濃度は、例えば、１×１０−１４〜１×１０−１１ｍｏｌ／Ｌ、２×１０−１３〜１×１０−１２ｍｏｌ／Ｌである。
前記誘導工程を含む場合、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度および前記肝臓細胞分化因子の濃度の組合せは、特に制限されず、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度が０．５×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２である場合、例えば、前記肝臓細胞分化因子の濃度は、１×１０−１２〜１×１０−６ｍｏｌ／Ｌである。
前記分化開始時の前記内胚葉系細胞の細胞密度および前記肝臓細胞分化因子の濃度の組合せは、特に制限されず、前記分化開始時の前記内胚葉系細胞の細胞密度が１×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２である場合、例えば、前記肝臓細胞分化因子の濃度は、１０−１２〜１×１０−６ｍｏｌ／Ｌである。
前記分化工程において、培養条件は、特に制限されず、例えば、前述の誘導工程における培養条件の説明を援用できる。
本発明の肝臓細胞の製造方法は、さらに、肝臓細胞成熟因子の存在下、前記肝臓細胞を成熟させる成熟工程を含んでもよい。
前記肝臓細胞成熟因子は、例えば、ＯＳＭ（oncostatin M）、ＨＧＦ（hepatocyte growth factor/scatter factor）、デキサメタゾン、ニコチンアミド、ジメチルスルホキシド、および酪酸ナトリウム等があげられる。前記肝臓細胞成熟因子がタンパク質である場合、前記肝臓細胞成熟因子の由来は、前記肝臓細胞の由来、すなわち前述の多能性細胞の由来と同じでもよいし、異なってもよい。前記肝臓細胞成熟因子は、例えば、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。後者の場合、前記肝臓細胞成熟因子の組合せは、特に制限されず、例えば、ＯＳＭおよびＨＧＦの組合せ、ＯＳＭおよびデキサメタゾンの組合せ等があげられる。前記肝臓細胞成熟因子は、前記肝臓細胞の成熟において、全期間にわたり同じ前記肝臓細胞成熟因子を使用してもよいし、所定期間毎に異なる前記肝臓細胞成熟因子を使用してもよい。前記所定期間は、例えば、後述する実施例を参照できる。
成熟した前記肝臓細胞（以下、「成熟肝臓細胞」ともいう。）は、例えば、薬剤代謝マーカー、トランスポーターマーカー、成熟肝臓細胞マーカー等の成熟肝臓細胞マーカーの発現により確認することができる。前記薬剤代謝マーカーは、例えば、ＣＹＰ１Ａ１（cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1）、ＣＹＰ２Ｃ９（cytochrome P450 2C9）、ＣＹＰ２Ｃ１９（cytochrome P450 2C19）、ＣＹＰ３Ａ４（cytochrome P450 3A4）等があげられる。ヒト由来ＣＹＰ１Ａ１は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００４９９で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＣＹＰ２Ｃ９は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００７７１で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＣＹＰ２Ｃ１９は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００７６９で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＣＹＰ３Ａ４は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２０２８５５で登録されている塩基配列があげられる。前記トランスポーターマーカーは、例えば、ＭＲＰ２（multidrug resistance-associated protein 2）、ＭＤＲ／ＴＡＰ（ABCB1、ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1）、ＵＧＴ１Ａ１（UDP-glucuronosyltransferase 1-1）等があげられる。ヒト由来ＭＲＰ２は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００３９２で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＭＤＲ／ＴＡＰは、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００９２７で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＵＧＴ１Ａ１は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００４６３で登録されている塩基配列があげられる。前記成熟肝臓細胞マーカーは、例えば、Ａ１ＡＴ（alpha-1 Antitrypsin）、ＴＤＯ２（tryptophan 2,3-dioxygenase、ＴＯ）、ＡＬＢ（albumin）等があげられる。ヒト由来Ａ１ＡＴ１は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１１２７７０７、ＮＭ＿００１１２７７０６、ＮＭ＿００１１２７７０５、ＮＭ＿００１１２７７０４、ＮＭ＿００１１２７７０３、ＮＭ＿００１１２７７０２、ＮＭ＿００１１２７７０１、ＮＭ＿００１１２７７００、ＮＭ＿００１００２２３６、ＮＭ＿００１００２２３５、ＮＭ＿０００２９５等で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＡＬＢは、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００４７７で登録されている塩基配列があげられる。本発明の肝臓細胞の製造方法において、例えば、１種類の前記成熟肝臓細胞マーカーが発現している細胞を前記成熟肝臓細胞としてもよいし、２種類以上の前記成熟肝臓細胞マーカーが発現している細胞を前記成熟肝臓細胞としてもよく、より生体の成熟肝臓細胞と性質が近いことから、全ての前記成熟肝臓細胞マーカーが発現している細胞を前記成熟肝臓細胞とすることが好ましい。また、前記成熟肝臓細胞マーカーとして、ＴＤＯ２を使用する場合、他の成熟肝臓細胞マーカーと併用することが好ましい。
前記成熟工程において、前記肝臓細胞の成熟は、例えば、培養液（以下、「成熟用培養液」ともいう。）の存在下で培養することにより行うことができる。前記成熟用培養液の存在下で前記肝臓細胞の成熟を行う場合、前記成熟用培養液が、例えば、前記肝臓細胞成熟因子を含む。前記成熟用培養液は、特に制限されず、例えば、前記肝臓細胞用の培養液、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｉｓｃｏｖｅ（ＩＭＥＭ）、αＭＥＭ等があげられる。前記肝臓細胞用培養液は、例えば、Hepatocyte basal medium BulletKit（LONZA社製）等があげられる。前記成熟用培養液は、前記肝臓細胞の成熟において、全期間にわたり同じ成熟用培養液を使用してもよいし、所定期間毎に異なる前記成熟用培養液を使用してもよい。
前記成熟用培養液は、その他の成分を含んでもよい。前記その他の成分は、例えば、前述の説明を援用できる。
前記成熟工程において、前記肝臓細胞の成熟は、例えば、フィーダー細胞を使用して行ってもよいし、フィーダー細胞を使用せずに行ってもよい。前記フィーダー細胞は、例えば、前述の説明を援用できる。また、前記フィーダー細胞を使用しない場合、前記成熟工程において、より生体の成熟肝臓細胞に近い性質となることから、足場上で前記肝臓細胞を成熟させることが好ましい。前記足場は、例えば、前述の説明を援用できる。前記成熟工程において、生体の成熟肝臓細胞により近い性質の成熟肝臓細胞を得られることから、前記肝臓細胞の成熟は、前記細胞外基質タンパク質を含むコーティング上で行うことが好ましい。
前記成熟工程において、前記肝臓細胞は、例えば、前記分化工程において得られた前記肝臓細胞をそのまま使用してもよいし、前記分化工程において得られた前記肝臓細胞を回収し、回収した前記肝臓細胞を播種してもよい。前記肝臓細胞を播種する場合、前記成熟開始時の前記肝臓細胞の細胞密度は、特に制限されず、例えば、１×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２であり、好ましくは、２．５×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２であり、より好ましくは、５×１０４〜１×１０５細胞／ｃｍ２である。前記細胞密度は、例えば、前記成熟時に使用する培養容器の培養可能な面積と細胞数とから算出できる。
前記成熟工程において、前記肝臓細胞の成熟を行う日数（以下、「成熟期間」ともいう。）は、特に制限されず、例えば、５〜３０日であり、好ましくは、７〜１８日である。
前記成熟工程において、前記肝臓細胞成熟因子の濃度は、特に制限されず、例えば、１×１０−１１〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌがあげられる。前記肝臓細胞成熟因子の濃度は、例えば、１種類の前記肝臓細胞成熟因子の濃度でもよいし、２種類以上の前記肝臓細胞成熟因子の濃度の合計の濃度でもよい（以下、同様）。前記肝臓細胞成熟因子がＯＳＭを含む場合、前記ＯＳＭの濃度は、例えば、５×１０−１０〜１×１０−８ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−９〜５×１０−９ｍｏｌ／Ｌである。前記肝臓細胞成熟因子がＨＧＦを含む場合、前記ＨＧＦの濃度は、例えば、５×１０−１０〜１×１０−８ｍｏｌ／Ｌ、２×１０−９〜１×１０−８ｍｏｌ／Ｌである。前記肝臓細胞成熟因子がデキサメタゾンを含む場合、前記デキサメタゾンの濃度は、例えば、５×１０−９〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−８〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌである。前記肝臓細胞成熟因子がニコチンアミドを含む場合、前記ニコチンアミドの濃度は、例えば、１×１０−４〜１×１０−２ｍｏｌ／Ｌ、５×１０−３〜２×１０−２ｍｏｌ／Ｌである。前記肝臓細胞成熟因子がジメチルスルホキシドを含む場合、前記ジメチルスルホキシドの濃度は、例えば、０．００１〜１％（ｖ/ｖ）、０．０１〜０．１％（ｖ/ｖ）である。
前記誘導工程を含む場合、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度および前記肝臓細胞成熟因子の濃度の組合せは、特に制限されず、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度が０．５×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２である場合、例えば、前記肝臓細胞成熟因子の濃度は、１×１０−１１〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌである。
前記分化開始時の前記内胚葉系細胞の細胞密度および前記肝臓細胞分化因子の濃度の組合せは、特に制限されず、前記分化開始時の前記内胚葉系細胞の細胞密度が１×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２である場合、例えば、前記肝臓細胞分化因子の濃度は、１×１０−１１〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌである。
前記成熟開始時の前記肝臓細胞の細胞密度および前記肝臓細胞成熟因子の濃度の組合せは、特に制限されず、前記成熟開始時の前記肝臓細胞の細胞密度が１×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２である場合、例えば、前記肝臓細胞成熟因子の濃度は、１×１０−１１〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌである。
前記成熟工程において、培養条件は、特に制限されず、例えば、前述の誘導工程における培養条件の説明を援用できる。
前記成熟工程において、前記肝臓細胞をマイクロ流体デバイス内で成熟させ、前記マイクロ流体デバイスが、少なくとも２つの開口部と細胞培養チャンバーとを含み、前記開口部は、前記細胞培養チャンバーと接続され、前記細胞培養チャンバー内に前記肝臓細胞と足場とを導入し、培養したときに、少なくとも１つの前記開口部から前記細胞培養チャンバーへの前記肝臓細胞成熟因子の供給を前記細胞培養チャンバー内で濃度勾配を形成しながら行うことができるマイクロ流体デバイスであることが好ましい。
前記デバイスは、例えば、３Ｄプリンタ等を用いて鋳型を形成した後、原料を鋳型に流し込み、重合等により固化させることで得ることができる。前記原料は、特に制限されず、例えば、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）、ジフェニルシロキサン等のポリシロキサン系ポリマー、シリコーン樹脂／シリコーンゴム、天然ゴム、合成ゴム、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリメチルアクリレート（ＰＭＡ）、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリウレタン、ポリスチレン、フッ素化ポリマー（ＰＴＦＥ、ＰＶｄＦ等）、ポリ塩化ビニル、ポリメチルハイドロゲンシロキサン、ジメチルシロキサンとメチルハイドロジェンシロキサン単位のコポリマー等のホモポリマーもしくはコポリマー、およびこれらの混合物があげられ、好ましくは、ポリシロキサン系ポリマーであり、より好ましくは、ＰＤＭＳである。三次元細胞培養の評価を行いやすいことから、前記デバイスは、透明性は高いことが好ましい。また、前記デバイスは、酸素、二酸化炭素等の気体透過性に優れていることが好ましい。
図１に、前記デバイスの一例を示す。図１（Ａ）は、本実施形態のデバイス１００の構成を示す斜視図であり、（Ｂ）は、図１（Ａ）のＩ−Ｉ’方向からみた模式断面図である。図１に示すように、本実施形態のデバイス１００は、２つの細胞培養チャンバー１および、４つの開口部２を含む。デバイス１００における細胞培養チャンバー１の個数は、これに限定されず、１個でもよいし、２個以上でもよい。前記デバイスをハイスループット用デバイスとする場合、前記細胞培養チャンバーの個数は、例えば、１０〜４００個、より具体的には、１６個、４８個、９６個、３８４個等があげられる。
細胞培養チャンバー１の大きさは、特に制限されず、その一方の開口部から他方の開口部への方向（長さ方向）の長さが、例えば、１０００〜１００００μｍであり、その幅が、例えば、１００〜１０００μｍであり、その高さが、例えば、１００〜１０００μｍである。細胞培養チャンバー１の容積は、特に制限されず、例えば、１００〜２０００μＬである。
本実施形態のデバイス１００において、細胞培養チャンバー１は、例えば、細胞や培養液等を供給可能な２つの開口部２と接続している。これにより、細胞培養チャンバー１において前記肝臓細胞の培養を行いながら、例えば、前記培養液の交換、前記肝臓細胞成熟因子の濃度勾配を有する供給を行うことができる。具体的には、細胞培養チャンバー１の一方の開口部から新しい培養液を供給すれば細胞培養チャンバー１を経由して他方の開口部から古い培養液が排出され、それにより培養液の交換が可能である。本実施形態において、デバイス１００は、１つの細胞培養チャンバー１に対して、２つの開口部２を有しているが、デバイス１００は、これに限定されず、１つの細胞培養チャンバー１に対して、３つ以上の開口部２を有していてもよい。
デバイス１００において、開口部２の形状は、円筒形状であるが、デバイス１００は、これに限定されず、任意の形状とできる。開口部２が円筒形状の場合、開口部２の大きさは、特に制限されず、その径が、例えば、１００〜３０００μｍであり、その高さが、例えば、２０００〜１００００μｍである。
前記デバイスは、上部に蓋を重ね合わせて培養液の蒸発を防止することが好ましい。
開口部２に導入された前記肝臓細胞成熟因子は、例えば、前記足場中を拡散することにより濃度勾配を形成する。前記拡散は、例えば、前記肝臓細胞成熟因子の分子量により変化する。
前記デバイスは、例えば、前記肝臓細胞成熟因子の濃度勾配の形成の効率が向上することから、前記細胞培養チャンバー内に狭小部を含むことが好ましい。前記狭小部の形状は、特に制限されず、任意の形状とでき、例えば、円筒形状等があげられる。前記狭小部が円筒状の場合、前記狭小部の大きさは、特に制限されず、その径が、例えば、１００〜１０００μｍであり、その長さが、例えば、１０００〜１００００μｍである。前記狭小部の径は、例えば、前記肝臓細胞成熟因子の濃度勾配の形成の効率が向上することから、前記開口部の径より小さいことが好ましい。前記細胞培養チャンバー内における前記狭小部の位置は、特に制限されず、例えば、前記細胞培養チャンバーの中央部でもよいし、前記細胞培養チャンバーと前記開口部との接続部でもよいし、その他の位置でもよい。
前記デバイスが３つ以上の開口部を有する場合、２つ以上の前記開口部が、例えば、前記狭小部と接続してもよい。２つ以上の前記開口部が前記狭小部と接続することにより、例えば、複数の前記肝臓細胞成熟因子を任意のタイミングで三次元培養細胞に供給することができる。
前記肝臓細胞を前記マイクロ流体デバイス内で成熟させる場合、前記成熟開始時の前記肝臓細胞の細胞密度が、１×１０１〜５×１０６細胞／ｃｍ２であり、前記成熟工程後に成熟肝臓細胞が３次元構造体を形成することから、好ましくは、１×１０３〜１×１０５細胞／ｃｍ２であり、より好ましくは、１×１０４〜５×１０４細胞／ｃｍ２である。前記細胞密度は、例えば、前記細胞培養用チャンバーの底面の面積と細胞数とから算出できる。
以下に、前記分化工程および前記成熟工程について、前記肝臓細胞分化因子が、アクチビンＡ、ＢＭＰ−４、およびｂＦＧＦであり、前記肝臓細胞成熟因子が、ＯＳＭおよびＨＧＦである例について、説明する。これらは一例であり、本発明を制限するものではない。
まず、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法により、前記内胚葉系細胞を取得する。つぎに、第５培養液に懸濁した前記内胚葉系細胞を前記培養容器に播種する。前記分化開始時の前記内胚葉系細胞の細胞密度は、例えば、１×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２である。前記第５培養液は、例えば、１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ アクチビンＡを含む分化用培養液である。培養条件は、特に制限されず、Ｏ２分圧は、例えば、１〜２１％であり、ＣＯ２分圧は、例えば、５〜６％である。培養温度は、例えば、３６〜３７℃である。そして、前記培養条件下で、例えば、１〜５日培養する。
つぎに、前記第５培養液を除去し、第６培養液を添加する。前記第６培養液は、例えば、１×１０−１１〜１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ ＢＭＰ−４および１×１０−１３〜１×１０−１１ｍｏｌ／Ｌ ＦＧＦ１０を含む分化用培養液である。そして、前記培養条件で、例えば、２〜５日培養する。
つぎに、前記第６培養液を除去し、第７培養液を添加する。前記第７培養液は、例えば、５×１０−１０〜１×１０−８ｍｏｌ／Ｌ ＯＳＭおよび５×１０−１０〜１×１０−８ｍｏｌ／Ｌ ＨＧＦを含む成熟用培養液である。そして、前記培養条件で、例えば、２〜２５日培養する。
そして、前記培養後の細胞を回収することで、前記成熟肝臓細胞を取得できる。なお、前記肝臓細胞を取得する場合、前記第６培養液での培養後に、前記培養後の細胞を回収することで取得できる。
＜膵臓細胞の製造方法＞
本発明の膵臓細胞の製造方法は、前述のように、膵臓細胞分化因子の存在下、内胚葉系細胞を膵臓細胞へ分化させる分化工程（膵臓分化工程）を含み、前記内胚葉系細胞が、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法により得られた内胚葉系細胞であることを特徴とする。本発明の膵臓細胞の製造方法は、前記内胚葉系細胞が、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法により得られた内胚葉系細胞であることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の膵臓細胞の製造方法によれば、分散された前記多能性細胞からも前記膵臓細胞を誘導でき、且つ膵臓細胞の作製効率を向上できる。本発明の膵臓細胞の製造方法は、例えば、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法の説明を援用できる。
本発明の膵臓細胞の製造方法は、前記膵臓分化工程に先立ち、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法により、前記内胚葉系細胞を誘導する誘導工程を含んでもよい。前記誘導工程は、例えば、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法における誘導工程と同様に実施できる。
前記膵臓細胞分化因子は、例えば、ＫＧＦ（keratinocyte growth factor）、ＥＧＦ（Epidermal Growth Factor）、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ヘッジホッグシグナル阻害剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）の活性化物質、Ｎｏｇｇｉｎ、ＡＬＫ阻害剤等があげられる。前記ＲＡＲの活性化物質は、特に制限されず、例えば、ＲＡＲの活性化させる化合物等があげられる。前記ＲＡＲの活性化化合物は、例えば、レチノイド、ＴＴＮＰＢ（4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl] benzoic acid）、Tazarotene、Isotretinoin、Adapalene、AM 580、EC 23等があげられる。前記ＲＡＲの活性化物質は、例えば、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、およびＲＡＲγのいずれか１つを活性化してもよいし、２つ以上を活性化してもよいし、全てを活性化してもよい。前記ヘッジホッグシグナル阻害剤は、特に制限されず、例えば、シクロパミンまたはその誘導体、AY 9944 dihydrochloride、AZ 12080282 dihydrochloride、GANT 58、GANT 61、HPI 1等があげられる。前記シクロパミン誘導体は、例えば、ＫＡＡＤ−ＣＹＣ（3-Keto-N-aminoethyl-N’-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine）等があげられる。前記ＡＬＫ（anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase）阻害剤は、特に制限されず、例えば、ＳＢ４３２５４１等があげられる。前記膵臓細胞分化因子がタンパク質である場合、前記膵臓細胞分化因子の由来は、前記内胚葉系細胞の由来、すなわち前述の多能性細胞の由来と同じでもよいし、異なってもよい。前記膵臓細胞分化因子は、例えば、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。後者の場合、前記膵臓細胞分化因子の組合せは、特に制限されず、例えば、前記ヘッジホッグシグナル阻害剤、前記ＲＡＲの活性化物質、およびＮｏｇｇｉｎの組合せ、ＫＧＦ、Ｎｏｇｇｉｎ、およびＥＧＦの組合せ等があげられる。前記膵臓細胞分化因子は、前記内胚葉系細胞から前記膵臓細胞への分化において、全期間にわたり同じ前記膵臓細胞分化因子を使用してもよいし、所定期間毎に異なる前記膵臓細胞分化因子を使用してもよい。前記所定期間は、例えば、後述する実施例等を参照できる。
前記膵臓細胞は、例えば、膵臓細胞マーカーの発現により確認することができる。前記膵臓細胞マーカーは、例えば、インスリン、ＰＴＦ１α（Pancreas Specific Transcription Factor 1a）、ＮＫＸ６．１（Homeobox protein Nkx-6.1）、ＰＤＸ１（Pancreatic and duodenal homeobox 1）、ＭＡＦＡ（Musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family A）、ＭＡＦＢ（Musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family Ｂ）、ＧＬＵＴ２（Glucose transporter 2）、ＳＬＣ２Ａ２（Ｓolute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 2 ）、ＳＬＣ３０Ａ８（Solute carrier family 30 (zinc transporter), member 8）等があげられる。ヒト由来インスリンは、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００２０７で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＰＴＦ１αは、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１７８１６１で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＮＫＸ６．１は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００６１６８で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＰＤＸ１は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００２０９で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＭＡＦＡは、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿２０１５８９．３で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＭＡＦＢは、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５４６１．４で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＧＬＵＴ２は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００３４０で登録されている塩基配列があげられる。ヒト由来ＳＬＣ３０Ａ８は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１１７２８１１で登録されている塩基配列があげられる。本発明の膵臓細胞の製造方法において、例えば、１種類の前記膵臓細胞マーカーが発現している細胞を前記膵臓細胞としてもよいし、２種類以上の前記膵臓細胞マーカーが発現している細胞を前記膵臓細胞としてもよく、より生体の膵臓細胞と性質が近いことから、全ての前記膵臓細胞マーカーが発現している細胞を前記膵臓細胞とすることが好ましい。
前記膵臓分化工程において、前記内胚葉系細胞から前記膵臓細胞への分化は、例えば、培養液（以下、「膵臓分化用培養液」ともいう。）の存在下で培養することにより行うことができる。前記膵臓分化用培養液の存在下で前記膵臓細胞の分化を行う場合、前記膵臓分化用培養液が、例えば、前記膵臓細胞分化因子を含む。前記膵臓分化用培養液は、特に制限されず、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｉｓｃｏｖｅ（ＩＭＥＭ）、αＭＥＭ等があげられる。前記膵臓分化用培養液は、前記内胚葉系細胞から前記膵臓細胞への分化において、全期間にわたり同じ膵臓分化用培養液を使用してもよいし、所定期間毎に異なる前記膵臓分化用培養液を使用してもよい。前記所定期間は、例えば、後述する実施例等を参照できる。
前記膵臓分化用培養液は、その他の成分を含んでもよい。前記その他の成分は、例えば、前述の説明を援用できる。
前記膵臓分化工程において、前記内胚葉系細胞から前記膵臓細胞への分化は、例えば、フィーダー細胞を使用して行ってもよいし、フィーダー細胞を使用せずに行ってもよい。前記フィーダー細胞は、例えば、前述の説明を援用できる。また、前記フィーダー細胞を使用しない場合、足場上で前記内胚葉系細胞を成熟させることが好ましい。前記足場は、例えば、前述の説明を援用できる。
前記膵臓分化工程において、前記内胚葉系細胞は、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法で得られた内胚葉系細胞であればよい。本発明の膵臓細胞の製造方法が前記誘導工程を含む場合、前記内胚葉系細胞は、例えば、前記誘導工程において得られた前記内胚葉系細胞をそのまま使用してもよいし、前記誘導工程において得られた前記内胚葉系細胞を回収し、回収した前記内胚葉系細胞を播種して使用してもよい。前記内胚葉系細胞を播種する場合、前記分化開始時の前記内胚葉系細胞の細胞密度は、特に制限されず、例えば、１×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２、２．５×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２、５×１０４〜１×１０５細胞／ｃｍ２である。前記細胞密度は、例えば、前記分化時に使用する培養容器の培養可能な面積と細胞数とから算出できる。
前記膵臓分化工程において、前記内胚葉系細胞から前記膵臓細胞への分化を行う日数（以下、「膵臓分化期間」ともいう。）は、特に制限されず、例えば、７〜２１日であり、好ましくは、９〜１４日である。
前記膵臓分化工程において、前記膵臓細胞分化因子の濃度は、特に制限されず、例えば、１×１０−４〜５×１０−５ｍｏｌ／Ｌがあげられる。前記膵臓細胞分化因子の濃度は、例えば、１種類の前記膵臓細胞分化因子の濃度でもよいし、２種類以上の前記膵臓細胞分化因子の濃度の合計の濃度でもよい（以下、同様）。前記膵臓細胞分化因子がＫＧＦを含む場合、前記ＫＧＦの濃度は、例えば、１×１０−１０〜５×１０−７ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−９〜５×１０−８ｍｏｌ／Ｌである。前記膵臓細胞分化因子がＥＧＦを含む場合、前記ＥＧＦの濃度は、例えば、１×１０−８〜５×１０−４ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−７〜５×１０−５ｍｏｌ／Ｌである。前記膵臓細胞分化因子がヘッジホッグシグナル阻害物質を含む場合、前記ヘッジホッグシグナル阻害物質の濃度は、例えば、１×１０−１１〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−１０〜１×１０−８ｍｏｌ／Ｌである。前記膵臓細胞分化因子がＲＡＲの活性化物質を含む場合、前記ＲＡＲの活性化物質の濃度は、例えば、１×１０−７〜１×１０−４ｍｏｌ／Ｌ、５×１０−７〜１×１０−５ｍｏｌ／Ｌである。前記膵臓細胞分化因子がＮｏｇｇｉｎを含む場合、前記Ｎｏｇｇｉｎの濃度は、例えば、１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ、１×１０−９〜１×１０−８ｍｏｌ／Ｌである。
前記誘導工程を含む場合、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度および前記膵臓細胞分化因子の濃度の組合せは、特に制限されず、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度が０．５×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２である場合、例えば、前記膵臓細胞分化因子の濃度は、１×１０−４〜５×１０−５ｍｏｌ／Ｌである。
前記膵臓分化開始時の前記内胚葉系細胞の細胞密度および前記膵臓細胞分化因子の濃度の組合せは、特に制限されず、前記分化開始時の前記内胚葉系細胞の細胞密度が１×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２である場合、例えば、前記膵臓細胞分化因子の濃度は１×１０−４〜５×１０−５ｍｏｌ／Ｌである。
前記膵臓分化工程において、培養条件は、特に制限されず、例えば、前述の誘導工程における培養条件の説明を援用できる。
以下に、前記膵臓分化工程について、前記膵臓細胞分化因子が、ＫＧＦ、ヘッジホッグシグナル阻害物質、ＲＡＲの活性化物質、Ｎｏｇｇｉｎ、およびＥＧＦである例について、説明する。これらは一例であり、本発明を制限するものではない。
まず、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法により、前記内胚葉系細胞を取得する。つぎに、第８培養液に懸濁した前記内胚葉系細胞を前記培養容器に播種する。前記分化開始時の前記内胚葉系細胞の細胞密度は、例えば、１×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２である。前記第７培養液は、例えば、１×１０−１０〜５×１０−７ｍｏｌ／Ｌ ＫＧＦを含む膵臓分化用培養液である。培養条件は、特に制限されず、Ｏ２分圧は、例えば、１〜２１％であり、ＣＯ２分圧は、例えば、５〜６％である。培養温度は、例えば、３６〜３７℃である。そして、前記培養条件下で、例えば、２〜５日培養する。
つぎに、前記第８培養液を除去し、第９培養液を添加する。前記第９培養液は、例えば、１×１０−１１〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ ヘッジホッグシグナル阻害物質、１×１０−７〜１×１０−４ｍｏｌ／Ｌ ＲＡＲの活性化物質、および１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ Ｎｏｇｇｉｎを含む膵臓分化用培養液である。そして、前記培養条件で、例えば、３〜９日培養する。
つぎに、前記第９培養液を除去し、第１０培養液を添加する。前記第１０培養液は、例えば、１×１０−１０〜５×１０−７ｍｏｌ／Ｌ ＫＧＦ、１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ Ｎｏｇｇｉｎ、および１×１０−８〜５×１０−４ｍｏｌ／Ｌ ＥＧＦを含む膵臓分化用培養液である。そして、前記培養条件で、例えば、３〜９日培養する。
そして、前記培養後の細胞を回収することで、前記膵臓細胞を取得できる。なお、前記第９培養液での培養後、前記培養容器から分化中の前記内胚葉系細胞を回収し、別の培養容器に再播種してもよい。前記再播種時の内胚葉系細胞の細胞密度は、例えば、６×１０４〜４．８×１０５細胞／ｃｍ２である。また、この場合、前記第１０培養液による培養において、前記ＲＯＣＫの活性を抑制することが好ましく、具体的には、前記第１０培養液が、例えば、前記ＲＯＣＫ活性抑制物質を含む。前記第１０培養液における前記ＲＯＣＫ活性抑制物質の濃度は、例えば、１×１０−６〜１×１０−４ｍｏｌ／Ｌである。
＜製造方法により得られる細胞＞
本発明の内胚葉系細胞は、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法により得られることを特徴とする。本発明の肝臓細胞は、前記本発明の肝臓細胞の製造方法により得られることを特徴とする。本発明の膵臓細胞は、本発明の膵臓細胞の製造方法により得られることを特徴する。本発明の内胚葉系細胞、肝臓細胞、および膵臓細胞の説明は、それぞれ、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法、肝臓細胞の製造方法、および肝臓細胞の製造方法の説明を援用できる。
＜内胚葉系細胞の誘導促進剤＞
本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤は、前述のように、ＲＯＣＫタンパク質の活性抑制物質を含むことを特徴とする。本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤は、前記ＲＯＣＫの活性抑制物質を含むことを特徴とし、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤によれば、分散された多能性細胞からも内胚葉系細胞を誘導でき、且つ内胚葉系細胞の作製効率を向上できる。本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤は、例えば、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法等の説明を援用できる。
本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤は、さらに、前述の内胚葉系細胞誘導因子を含んでもよい。
本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤は、各構成要素がそれぞれ別個の容器に収容されてもよいし、同一の容器に混合または未混同で収容されてもよい。前記各構成要素が別個の容器に収納されている場合、本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤は、内胚葉系細胞の誘導促進キットということもできる。
本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤は、前記ＲＯＣＫの活性抑制物質の他に、その他の構成を含んでもよい。前記構成は、例えば、培養容器、使用説明書等があげられる。前記培養容器は、特に制限されず、例えば、公知の細胞培養用の容器等があげられる。
＜肝臓細胞の誘導促進キット＞
本発明の肝臓細胞の誘導促進キットは、前述のように、前記本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤を含むことを特徴とする。本発明の肝臓細胞の誘導促進キットは、前記本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の肝臓細胞の誘導促進キットによれば、分散された多能性細胞からも肝臓細胞を誘導でき、且つ肝臓細胞の作製効率を向上できる。本発明の肝臓細胞の誘導促進キットは、例えば、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法、肝臓細胞の製造方法、および内胚葉系細胞の誘導促進剤等の説明を援用できる。
本発明の肝臓細胞の誘導促進キットは、さらに、前述の肝臓細胞分化因子を含んでもよい。本発明の肝臓細胞の誘導促進キットは、さらに、前述の肝臓細胞成熟因子を含んでもよい。
本発明の肝臓細胞の誘導促進キットは、各構成要素がそれぞれ別個の容器に収容されてもよいし、同一の容器に混合または未混同で収容されてもよい。前記各構成要素が同一の容器に混合または未混同で収納されている場合、本発明の肝臓細胞の誘導促進キットは、肝臓細胞の誘導促進剤ということもできる。
本発明の肝臓細胞の誘導促進キットは、前記本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤の他に、その他の構成を含んでもよい。前記構成は、例えば、前記培養容器、前述のマイクロ流体デバイス、使用説明書等があげられる。
＜膵臓細胞の誘導促進キット＞
本発明の膵臓細胞の誘導促進キットは、前述のように、前記本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤を含むことを特徴とする。本発明の膵臓細胞の誘導促進キットは、前記本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の膵臓細胞の誘導促進キットによれば、分散された多能性細胞からも膵臓細胞を誘導でき、且つ膵臓細胞の作製効率を向上できる。本発明の膵臓細胞の誘導促進キットは、例えば、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法、膵臓細胞の製造方法、内胚葉系細胞の誘導促進剤、および肝臓細胞の誘導促進キット等の説明を援用できる。
本発明の膵臓細胞の誘導促進キットは、さらに、前述の膵臓細胞分化因子を含んでもよい。
本発明の膵臓細胞の誘導促進キットは、各構成要素がそれぞれ別個の容器に収容されてもよいし、同一の容器に混合または未混同で収容されてもよい。前記各構成要素が同一の容器に混合または未混同で収納されている場合、本発明の膵臓細胞の誘導促進キットは、膵臓細胞の誘導促進剤ということもできる。
本発明の膵臓細胞の誘導促進キットは、前記本発明の内胚葉系細胞の誘導促進剤の他に、その他の構成を含んでもよい。前記構成は、例えば、培養容器、使用説明書等があげられる。前記培養容器は、特に制限されず、例えば、公知の細胞培養用の容器等があげられる。
＜マイクロ流体デバイス＞
本発明のマイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの開口部と細胞培養チャンバーとを含み、前記開口部は、前記細胞培養チャンバーと接続され、前記細胞培養チャンバー内に肝臓細胞と足場とを導入して培養したときに、少なくとも１つの前記開口部から前記細胞培養チャンバーへの肝臓細胞成熟因子の供給を前記細胞培養チャンバー内で濃度勾配を形成しながら行うことができ、前記本発明の肝臓細胞の製造方法に使用することを特徴とする。本発明のマイクロ流体デバイスは、前記本発明の肝臓の製造方法に使用することが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明のマイクロ流体デバイスは、例えば、前記本発明の内胚葉系細胞の製造方法等の説明を援用できる。本発明のマイクロ流体デバイスによれば、例えば、三次元構造を有する肝臓細胞が製造できる。
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
［実施例１］
異なる培養液を使用し、ＲＯＣＫの活性を抑制することで、分散された多能性細胞および細胞塊を形成した多能性細胞から、内胚葉系細胞が作製できること、および高い分化効率で前記内胚葉系細胞を作製できることを確認した。
（１）内胚葉系細胞の作製
（培養１日目）
２４ウェルディッシュ（培養可能な面積：１．９ｃｍ２／ｗｅｌｌ、BD Falcon（商標）社製）に、ヒトＥＳ細胞であるＨ９細胞株（WiCellから入手）を、分散状態で、１×１０５細胞／ｗｅｌｌとなるように播種し、２４時間培養した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。また、培養液は、１０μｍｏｌ／Ｌ Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ活性抑制化合物、Ｗａｋｏ社製）、および１００ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡ（R&D Systems社製）を含むｍＴｅＳＲ−１（STEMCELL社製）を使用した。ｍＴｅＳＲ−１には、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンおよび１００Ｕ／ｍＬ ストレプトマイシンとなるように、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｗａｋｏ社製）を予め添加したものを使用した。
（培養２日目）
前記培養後、培養１日目の前記培養液を除去し、さらに、同じ組成の前記培養液を各ウェルに添加し、さらに、前記培養条件で１日培養した。
（培養３日目）
培養２日目の前記培養液を除去し、１０μｍｏｌ／Ｌ Ｙ２７６３２、１００ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡ、１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ−４（R&D Systems社製）、１０μｍｏｌ／Ｌ ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋの活性抑制化合物、CAYMAN CHEMICAL COMPANY社製）、および３μｍｏｌ／Ｌ ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ−３βの活性抑制化合物、STEMGENT社製）を含むｍＴｅＳＲ−１を添加した。そして、前記培養条件で２４時間培養した。
（培養４日目）
培養３日目の前記培養液を除去し、１０μｍｏｌ／Ｌ Ｙ２７６３２、１００ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡ、１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ−４および１０μｍｏｌ／Ｌ ＬＹ２９４００２を含むｍＴｅＳＲ−１を添加した。そして、前記培養条件で２４時間培養した。
（培養５日目）
培養４日目の前記培養液を除去し、１００ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡ、および１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ−４を含むＲＰＭＩ／Ｂ−２７培養液を添加した。そして、前記培養条件で２４時間培養した。前記ＲＰＭＩ／Ｂ−２７培養液は、下記表１の組成の培養液を使用した。
（２）ＣＸＣＲ４の発現
前記５日目の培養後、各ウェルから細胞を回収した。そして、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＸＣＲ４抗体（クローン名：１２Ｇ５、BD Pharmigen社製）を用いて、染色した。前記染色後の細胞を、フローサイトメトリー（BD FACSCanto（商標）II、BD Biosciences社製）を用いて、ＣＸＣＲ４の発現を測定した。また、前記培養１〜４日目において、ｍＴｅＳＲ−１に代えて、ＴｅＳＲ−Ｅ８またはＣＤＭ−ＰＶＡを用いた以外は同様にして、ＣＸＣＲ４の発現を測定した。さらに、前記培養１日目において、分散状態のＨ９細胞株に代えて、細胞塊を形成しているＨ９細胞株を播種した以外は同様にして、ＣＸＣＲ４の発現を測定した。コントロールは、前記抗ヒトＣＸＣＲ４抗体に代えて、ＡＰＣ標識コントロール抗体（クローン名：Ｇ１５５−１７８、BD Pharmigen社製）を用いた以外は同様にして、ＣＸＣＲ４の発現を測定した。
この結果を図２に示す。図２は、ＣＸＣＲ４の発現量を示すヒストグラムである。図２において、横軸は、ＣＸＣＲ４の発現量を示し、縦軸は、細胞数の相対値を示し、各ヒストグラム中の数字は、内胚葉系細胞の割合を示す。また、図２において、上段のヒストグラムは、前記分散された多能性細胞から誘導した結果を示し、下段のヒストグラムは、前記細胞塊を形成した多能性細胞から誘導した結果を示し、網掛けのヒストグラムは、実施例の結果を示し、白抜きのヒストグラムは、コントロールの結果を示す。図２において、各ヒストグラムは、左から、ｍＴｅＳＲ−１、ＴｅＳＲ−Ｅ８およびＣＤＭ−ＰＶＡを、それぞれ使用した結果を示す。図２に示すように、いずれの条件においても、内胚葉細胞マーカーであるＣＸＣＲ４陽性の細胞の割合が８０．５％以上であった。また、各培養液を比較した場合、ＣＸＣＲ４強陽性の内胚葉系細胞の割合が、ｍＴｅＳＲ−１、ＴｅｓＲ−Ｅ８およびＣＤＭ−ＰＶＡの順に高かった。これらの結果から、前記ＲＯＣＫの活性を抑制することで、分散された多能性細胞および細胞塊を形成した多能性細胞から、高い分化効率で前記内胚葉系細胞を作製できることがわかった。また、本発明の内胚葉系細胞の製造方法によれば、前記分散された多能性細胞からも前記内胚葉細胞を誘導できることがわかった。さらに、ｍＴｅＳＲ−１およびＴｅＳＲ−Ｅ８が、ＣＤＭ−ＰＶＡに対して高い分化効率を示したことから、ＴＧＦ−βファミリータンパク質およびｂＦＧＦを含む培地を使用することで、前記内胚葉系細胞の作製効率をより向上できることがわかった。
［実施例２］
前記誘導開始時に、異なる細胞密度の多能性細胞を播種し、高い分化効率で前記内胚葉系細胞を作製できること、および誘導された細胞において、内胚葉系細胞マーカーであるＳＯＸ１７が発現していることを確認した。
（１）内胚葉系細胞の作製
前記Ｈ９細胞株を、５×１０４細胞／ｗｅｌｌ、１×１０５細胞／ｗｅｌｌ、または２×１０５細胞／ｗｅｌｌとなるように播種した以外は、前記実施例１と同様にして内胚葉系細胞の誘導を行った。また、分散状態のＨ９細胞株に代えて、細胞塊を形成しているＨ９細胞株を播種した以外は同様にして、内胚葉系細胞の誘導を行った。そして、前記誘導後の内胚葉系細胞を回収した。
（２）ＣＸＣＲ４の発現
得られた前記内胚葉系細胞について、前記実施例１（２）と同様にして、ＣＸＣＲ４の発現を測定した。コントロールは、前記抗ヒトＣＸＣＲ４抗体に代えて、前記ＡＰＣ標識コントロール抗体を用いた以外は同様にして、ＣＸＣＲ４の発現を測定した。
この結果を図３に示す。図３は、ＣＸＣＲ４の発現量を示すヒストグラムである。図３において、横軸は、ＣＸＣＲ４の発現量を示し、縦軸は、細胞数の相対値を示し、各ヒストグラム中の数字は、内胚葉系細胞の割合を示す。また、図３において、上段のヒストグラムは、前記分散された多能性細胞から誘導した結果を示し、下段のヒストグラムは、前記細胞塊を形成した多能性細胞から誘導した結果を示し、網掛けのヒストグラムは、実施例の結果を示し、白抜きのヒストグラムは、コントロールの結果を示す。図３において、各ヒストグラムは、左から、５×１０４細胞／ｗｅｌｌ、１×１０５細胞／ｗｅｌｌ、および２×１０５細胞／ｗｅｌｌの前記Ｈ９細胞株を、それぞれ播種した結果を示す。図３に示すように、いずれの条件においても、内胚葉細胞マーカーであるＣＸＣＲ４陽性の細胞の割合が８３．７％以上であった。また、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度を比較した場合、５×１０４細胞／ｗｅｌｌの細胞密度および１×１０５細胞／ｗｅｌｌの細胞密度は、２×１０５細胞／ｗｅｌｌの細胞密度と比較して、ＣＸＣＲ４陽性の内胚葉系細胞の割合が高かった。さらに、ＣＸＣＲ４強陽性の内胚葉系細胞の割合は、５×１０４細胞／ｗｅｌｌ、１×１０５細胞／ｗｅｌｌ、および２×１０５細胞／ｗｅｌｌの細胞密度の順に高かった。これらの結果から、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度を低くすること、具体的には、１×１０４〜７×１０４細胞／ｃｍ２、より好ましくは、２×１０４〜６×１０４細胞／ｃｍ２とすることで、前記内胚葉系細胞の作製効率をより向上できることがわかった。
（３）作製後の細胞数
前記（１）で得られた内胚葉系細胞について、細胞数のカウントを行った。
この結果を図４に示す。図４は、細胞数を示すグラフである。図４において、横軸は、前記誘導開始時の前記Ｈ９細胞株の細胞数を示し、縦軸は、前記誘導後の内胚葉系細胞の細胞数を示す。また、図４において、菱形（◇）は、前記分散された多能性細胞から誘導した結果を示し、四角（□）は、前記細胞塊を形成した多能性細胞から誘導した結果を示す。図４に示すように、いずれの条件においても、前記誘導後の前記内胚葉系細胞の細胞数が、前記誘導開始時の前記Ｈ９細胞株の細胞数に対して、６倍以上の細胞数となった。また、前記誘導開始時の分散状態で比較した場合、前記分散された多能性細胞は、前記細胞塊を形成した多能性細胞に対して、前記誘導後の前記内胚葉系細胞の細胞数が多かった。これらの結果から、本発明の内胚葉系細胞の製造方法によれば、前記誘導開始時の分散状態によらず、高い作製効率で前記内胚葉系細胞を作製できることがわかった。また、分散された多能性細胞を播種することで、前記内胚葉系細胞の作製効率をより向上できることがわかった。
（４）ＳＯＸ１７遺伝子の発現
前記（１）で得られた内胚葉系細胞から、常法により、ＲＮＡを抽出した。そして、逆転写酵素およびランダムプライマーを用い、常法により、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。得られた前記ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ試薬（TaKaRa Taq（商標）（Mg2+free Buffer添付）、Takara Bio社製）、リアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ試薬（Power SYBR（登録商標） Green PCR Master Mix、ABI社製）およびApplied Biosystems（登録商標）7500リアルタイムPCRシステム（Life Technologies社製）を用い、添付のプロトコルに従って定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、前記ＲＮＡ中のＳＯＸ１７遺伝子のｍＲＮＡ発現量および内部標準であるＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。ＳＯＸ１７遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現量に対する比として算出した。前記ｑＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＳＯＸ１７遺伝子および前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅には、それぞれ以下のプライマーセットを使用した。
ＳＯＸ１７遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号１）5’-CGCACGGAATTTGAACAGTA-3’
（配列番号２）5’-GGATCAGGGACCTGTCACAC-3’
ＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号３）5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’
（配列番号４）5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’
この結果を図５に示す。図５は、ＳＯＸ１７遺伝子の発現量を示すグラフである。図５において、横軸は、前記誘導開始時の多能性細胞の細胞密度および分散状態の条件を示し、縦軸は、ＳＯＸ１７遺伝子の発現量を示す。図５に示すように、いずれの条件においても、ＳＯＸ１７遺伝子の発現が確認された。また、前記誘導開始時の分散状態で比較した場合、前記細胞塊を形成した多能性細胞は、前記分散された多能性細胞に対して、ＳＯＸ１７遺伝子の発現量が高かった。これらの結果から、本発明の内胚葉系細胞の製造方法によれば、前記内胚葉細胞を誘導できることがわかった。
［実施例３］
ＲＯＣＫの活性を抑制することで、分散された多能性細胞および細胞塊を形成した多能性細胞から、肝臓細胞が作製できることを確認した。
（１）内胚葉系細胞の作製
前記Ｈ９細胞株を、５×１０４細胞／ｗｅｌｌ、１×１０５細胞／ｗｅｌｌ、または２×１０５細胞／ｗｅｌｌとなるように播種した以外は、前記実施例１と同様にして内胚葉系細胞の誘導を行った。また、分散されたＨ９細胞株に代えて、細胞塊を形成しているＨ９細胞株を播種した以外は同様にして、内胚葉系細胞の誘導を行った。
（２）肝臓細胞の作製
（培養６〜８日目）
培養５日目の前記培養液を除去し、５０ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡを含むＲＰＭＩ／Ｂ−２７培養液を添加した。そして、前記培養条件で３日培養した。前記３日の培養中、毎日、前記ウェルの前記培養液を除去し、同じ組成の培養液を添加し、培養した。
（培養９〜１２日目）
培養８日目の前記培養液を除去し、２０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ−４、および１０ｎｇ／ｍＬ ヒトＦＧＦ１０（R&D Systems社製）を含むＲＰＭＩ／Ｂ−２７培養液を添加した。そして、前記培養条件で、４日培養した。前記４日の培養中、毎日、前記ウェルの前記培養液を除去し、同じ組成の培養液を添加し、培養した。
（３）肝臓細胞マーカーの発現
前記１２日目の培養後、各ウェルから細胞を回収した。つぎに、前記内胚葉系細胞に代えて、回収した前記細胞を用いた以外は、前記実施例２（４）と同様にして、ｃＤＮＡを合成した。そして、得られた前記ｃＤＮＡを鋳型として、前記ＰＣＲ試薬、およびサーマルサイクラー（Mastercycler（登録商標） pro、Eppendorf AG社製）を用い、添付のプロトコルに従ってＰＣＲを行い、前記ＲＮＡ中のＡＦＰ遺伝子、ＨＮＦ４α遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅した。そして、増幅後のＰＣＲ液について、１．８％アガロースゲルで泳動した。前記泳動後、前記ゲルは、Ｇｅｌ Ｒｅｄ（商標）（Biotium社製）により染色し、ＡＦＰ遺伝子、ＨＮＦ４α遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を確認した。前記ＰＣＲにおいて、ＡＦＰ遺伝子およびＨＮＦ４α遺伝子の増幅には、それぞれ以下のプライマーセットを使用した。ポジティブコントロールは、前記回収した細胞に代えて、ＡＦＰ遺伝子およびＨＮＦ４α遺伝子を発現しているヒト肝臓がん由来の細胞株であるＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣより入手）を用いた以外は、ネガティブコントロールは、前記ｃＤＮＡを添加しなかった以外は同様にして、ＡＦＰ遺伝子、ＨＮＦ４α遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を確認した。
ＡＦＰ遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号５）5’-AAATGCGTTTCTCGTTGCTT-3’
（配列番号６）5’-GCCACAGGCCAATAGTTTGT-3’
ＨＮＦ４α遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号７）5’-CCACGGGCAAACACTACGG-3’
（配列番号８）5’-GGCAGGCTGCTGTCCTCAT-3’
この結果を図６に示す。図６は、ＡＦＰ遺伝子、ＨＮＦ４α遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を示す写真である。図６において、写真の上は、サンプルの種類を示し、写真の左は、遺伝子の種類を示し、各レーンは、左から、分散されたＨ９細胞株を５×１０４細胞／ｗｅｌｌ、１×１０５細胞／ｗｅｌｌ、または２×１０５細胞／ｗｅｌｌ播種した場合、細胞塊のＨ９細胞株を１×１０５細胞／ｗｅｌｌ、または２×１０５細胞／ｗｅｌｌ播種した場合、ポジティブコントロール、およびネガティブコントロールの結果を示す。図６に示すように、ポジティブコントロールは、ＡＦＰ遺伝子およびＨＮＦ４α遺伝子を発現しており、ネガティブコントロールは、ＡＦＰ遺伝子およびＨＮＦ４α遺伝子を発現していなかった。また、実施例のサンプルはいずれも、ＡＦＰ遺伝子およびＨＮＦ４α遺伝子を発現していた。これらの結果から、前記ＲＯＣＫの活性を抑制することで、分散された多能性細胞および細胞塊を形成した多能性細胞から、高い分化効率で前記肝臓細胞を作製できることがわかった。
［実施例４］
ＲＯＣＫの活性を抑制し、多能性細胞から成熟肝臓細胞が作製できること、および細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートを使用することで、より生体の成熟肝臓細胞と性質が近い成熟肝臓細胞を誘導できることを確認した。
（１）足場コートプレートの作製
血液成分を含むコーティング処理をしたプレートは、以下の手順で作製した。まず、前記２４ウェルプレートに、０．１％（体積％）ゼラチン溶液を添加し、３７℃で３０分間静置した。前記ゼラチン溶液を除去し、血清含有培養液を添加し、３７℃で２４時間以上インキュベートした。前記血清含有培養液は、下記表２の組成とした。また、細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートは、以下の手順で作製した。まず、８０μＬのマトリゲル（商標）（BD Biosciences社製）と、６ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２（SIGMA-Ardrich社製）とを混合し、マトリゲル液を作製した。前記２４ウェルプレートに、前記マトリゲル液を添加し、４℃で２４時間以上インキュベートした。
（２）肝臓細胞の作製
前記２４ウェルプレートに代えて、前記血液成分を含むコーティング処理をしたプレートおよび前記胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートを用いた以外は、前記実施例１（１）および前記実施例３（２）と同様にして、肝臓細胞を分化させた。
（３）成熟肝臓細胞の作製
（培養１３日目〜）
培養１２日目の前記培養液を除去し、３０ｎｇ／ｍＬ ＯＳＭ（R&D Systems社製）および５０ｎｇ／ｍＬ ヒトＨＧＦ（PEPROTECH社製）を含む肝臓細胞用培養液（肝臓細胞成熟用培養液、hepatocyte basal medium、LONZA社製）を添加した。そして、前記培養条件で２１日培養した。前記２１日の培養中、２日毎に、前記ウェルの前記培養液を除去し、同じ組成の培養液を添加し、培養した。
（４）成熟肝臓細胞マーカーの発現
培養３３日目の培養液を除去後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で前記ウェルを洗浄した。つぎに、４％ホルムアルデヒドを添加し、２４℃で５分間固定した。再度、ＰＢＳで前記ウェルを洗浄し、細胞透過液を添加し、細胞膜透過処理を４℃で２４時間以上行った。前記細胞透過液は、０．５％（体積％）Triton X-100（Sigma-Aldrich社製）含有ＰＢＳを使用した。前記細胞透過処理後、ウサギ抗ヒトＡ１ＡＴポリクローナル抗体（DAKO社製）と反応させた。さらに、Alexa Fluor（登録商標）488標識抗ウサギＩｇＧ抗体を添加し、染色した。そして、ＤＡＰＩ（Life Technologies社製）で核染色を行った。前記染色後のウェルについて、蛍光顕微鏡（Nikon Eclipse Ti-E、ニコン社製）を用いて観察した。
この結果を図７に示す。図７は、Ａ１ＡＴの発現を示す写真である。図７において、上段は、前記血液成分を含むコーティング処理をしたプレートを使用した結果を示し、下段は、前記細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートを使用した結果を示す。また、図７において、写真は、左から、位相差像、ＤＡＰＩ染色像、Ａ１ＡＴ染色像を示す。図７の位相差像に示すように、いずれの足場でコーティング処理したプレートを使用した場合も、細胞が大型化し、またコロニーも盛り上がるようになり、成熟肝臓細胞であることがわかった。また、いずれの足場でコーティング処理したプレートを使用した場合も、Ａ１ＡＴが強く発現していた。これらの結果から、ＲＯＣＫの活性を抑制し、多能性細胞から成熟肝臓細胞が作製できることがわかった。
（５）成熟肝臓細胞マーカーの発現
図７のＡ１ＡＴ染色像について、ソフトウェア（CellProfiler、Broad Institute製）を使用し、Ａ１ＡＴの染色強度を測定した。
この結果を図８に示す。図８は、Ａ１ＡＴの発現量を示すヒストグラムである。図８において、横軸は、Ａ１ＡＴの発現量を示し、縦軸は、細胞数を示す。また、図８において、斜線のバーは、前記血液成分を含むコーティング処理をしたプレートを使用した結果を示し、白色のバーは、前記細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートを使用した結果を示す。図８に示すように、前記細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートは、前記血液成分を含むコーティング処理をしたプレートに対して、Ａ１ＡＴの発現量が高かった。これらの結果から、前記細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートを使用することで、より生体の成熟肝臓細胞と性質が近い成熟肝臓細胞を誘導できることがわかった。
［実施例５］
ＲＯＣＫの活性を抑制し、多能性細胞から作製した成熟肝臓細胞が成熟肝臓細胞の機能を有することを確認した。
（１）成熟肝臓細胞の作製
前記実施例４（３）において、２８日培養した以外は、前記実施例４（１）〜（３）と同様にして、成熟肝臓細胞を作製した。また、前記血液成分を含むコーティング処理をしたプレートに加えて、前記細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートを用いた以外は同様にして、成熟肝臓細胞を作製した。
（２）成熟肝臓細胞機能の確認
前記ウェルに、１ｍｇ／ｍＬとなるようにインドシアニングリーン（ＩＣＧ）溶液（Sigma-Aldrich社製）を添加した。そして、前記培養条件下で１時間培養し、前記ＩＣＧを作製した前記成熟肝臓細胞に取り込ませた。つぎに、前記１２日目の培養液で洗浄後、前記培養液を添加した。そして、前記培養条件下で１２時間培養することで、ＩＣＧを排出させた。
この結果を図９に示す。図９は、ＩＣＧの取り込みおよび排出を示す写真である。図９において、上段は、ＩＣＧ取り込み後の結果を示し、下段は、ＩＣＧ排出後の結果を示す。また、図９において、左側の写真が、前記血液成分を含むコーティング処理をしたプレートを使用した結果を示し、右側の写真が、前記細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートを使用した結果を示す。図９の上段において矢印Ｘで示すように、いずれの足場でコーティング処理したプレートを使用した場合も、ＩＣＧの取り込みが観察された。また、図９の下段に示すように、いずれの足場でコーティング処理したプレートを使用した場合も、ＩＣＧの排出が観察された。また、前記細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートは、前記血液成分を含むコーティング処理をしたプレートに対して、ＩＣＧの取り込み効率が高かった。これらの結果から、ＲＯＣＫの活性を抑制し、多能性細胞から作製した成熟肝臓細胞が成熟肝臓細胞の機能を有することがわかった。また、前記細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートを使用することで、より生体の成熟肝臓細胞と性質が近い成熟肝臓細胞を誘導できることがわかった。
［実施例６］
ＲＯＣＫの活性を抑制することで、多能性細胞から成熟肝臓細胞が作製できることを確認した。
（１）成熟肝臓細胞の作製
前記実施例４（３）において、２０日培養した以外は、前記実施例４（１）〜（３）と同様にして、成熟肝臓細胞を作製した。
（２）成熟肝臓細胞マーカーの発現
３２日目の培養後、各ウェルから細胞を回収した。つぎに、前記内胚葉系細胞に代えて、回収した前記細胞を用いた以外は、前記実施例２（４）と同様にして、ｃＤＮＡを合成した。そして、前記実施例３（２）と同様にして、ＰＣＲを行い、前記ＲＮＡ中のＣＹＰ１Ａ１遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子、ＭＲＰ２遺伝子、ＭＤＲ／ＴＡＰ遺伝子、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子、Ａ１ＡＴ遺伝子、ＴＤＯ２遺伝子、ＨＮＦ４α遺伝子、およびＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅した。そして、増幅後のＰＣＲ液について、１．８％アガロースゲルで泳動した。前記泳動後、前記ゲルは、Ｇｅｌ Ｒｅｄ（商標）により染色し、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子、ＭＲＰ２遺伝子、ＭＤＲ／ＴＡＰ遺伝子、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子、Ａ１ＡＴ遺伝子、ＴＤＯ２遺伝子、ＨＮＦ４α遺伝子、およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を確認した。前記ＰＣＲにおいて、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子、ＭＲＰ２遺伝子、ＭＤＲ／ＴＡＰ遺伝子、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子、Ａ１ＡＴ遺伝子、およびＴＤＯ２遺伝子の増幅には、それぞれ以下のプライマーセットを使用し、ＨＮＦ４α遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅には、それぞれ、前記実施例３（３）および２（４）のプライマーセットを使用した。ポジティブコントロールは、前記回収した細胞に代えて、ヒト肝臓粉砕液（Clontechより入手）を用いた以外は、ネガティブコントロールは、前記ｃＤＮＡを添加しなかった以外は、コントロール１は、前記回収した細胞に代えて、Ｈ９細胞株を用いた以外は、コントロール２は、前記回収した細胞に代えて、ＨｅｐＧ２細胞を用いた以外は、同様にして、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子、ＭＲＰ２遺伝子、ＭＤＲ／ＴＡＰ遺伝子、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子、Ａ１ＡＴ遺伝子、ＴＤＯ２遺伝子、ＨＮＦ４α遺伝子、およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を確認した。
ＣＹＰ１Ａ１遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号９）5’-ACCTGAATGAGAAGTTCTACAGC-3’
（配列番号１０）5’-CTGGGGTTCATCACCAAATACA-3’
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号１１）5’-CCCTGGATCCAGATCTGCAA-3’
（配列番号１２）5’-TGCTTGTCGTCTCTGTCCCA-3’
ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号１３）5’-GGTGCTGCATGGATATGAAGTG-3’
（配列番号１４）5’-TGGATCCAGGGGGTGCTTAC-3’
ＭＲＰ２遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号１５）5’-ACCTCCAACAGGTGGCTTGCA-3’
（配列番号１６）5’-ACACCAATCTTCTCCATGCTACC-3’
ＭＤＲ／ＴＡＰ遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号１７）5’-GTGCTGAGTAAGATTCAGCATGGG-3’
（配列番号１８）5’-AGCATGTCATCTTCAGTTGCATCCT-3’
ＵＧＴ１Ａ１遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号１９）5’-GTGCCTTTATCACCCATGCT-3’
（配列番号２０）5’-TCTTGGATTTGTGGGCTTTC-3’
Ａ１ＡＴ遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号２１）5’-ACATTTACCCAAACTGTCCATT-3’
（配列番号２２）5’-GCTTCAGTCCCTTTCTCGTC-3’
ＴＤＯ２遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号２３）5’-GACGGCTGTCATACAGAGCA-3’
（配列番号２４）5’-CGCAGGTAGTGATAGCCTGA-3’
この結果を図１０に示す。図１０は、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子、ＭＲＰ２遺伝子、ＭＤＲ／ＴＡＰ遺伝子、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子、Ａ１ＡＴ遺伝子、ＴＤＯ２遺伝子、ＨＮＦ４α遺伝子、およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を示す写真である。図１０において、写真の上は、レーン番号を示し、写真の左は、遺伝子の種類を示し、各レーンは、左から、作製した成熟肝臓細胞、コントロール１、コントロール２、ポジティブコントロール、ネガティブコントロールの結果を示す。図１０に示すように、ポジティブコントロールは、全ての遺伝子を発現しており、ネガティブコントロールは、全ての遺伝子を発現していなかった。また、作製した成熟肝臓細胞はいずれも、全ての遺伝子を発現していた。これらの結果から、前記ＲＯＣＫの活性を抑制することで、生体の成熟肝臓細胞と性質が近い成熟肝臓細胞を誘導できることがわかった。
［実施例７］
マイクロ流体デバイス内で、ＲＯＣＫの活性を抑制し、多能性細胞から作製した肝臓細胞を成熟させることで成熟肝臓細胞が得られること、および得られた前記成熟肝臓細胞が、成熟肝臓細胞の機能を有することを確認した。
（１）デバイスの作製
３次元画像描画ソフトウェア（３Ｄ−ＣＡＤ、AutoCAD、Blender）により、図１のマイクロ流路デバイスの構造の型となる鋳型デザインを有するマスクを作製した。前記デバイスの細胞培養チャンバーの長さは、９０００μｍ、幅は、１５００μｍ、高さは２００μｍとした。また、前記デバイスの開口部の径は、１０００μｍ、高さは、５０００μｍとした。前記デバイスは、使用するまでデシケーター内で保存した。つぎに、鋳型デザインをstlファイルに変換し、変換後のstlファイルを３Ｄプリンタ（AGILISTA、Keyence社製）に転送し、鋳型を印刷した。
Silicone Elastomer BaseとCuring agent（SYLGARD（登録商標）184 Silicone Elastomer kit （base, curing agent）、Dow corning社製）とを１０：１の重量比で撹拌ミキサーを用いて混合し、ＰＤＭＳ混合液を作製した。前記ＰＤＭＳ混合液を、前記鋳型に流し込んだ後、前記鋳型をデシケーター内で３０分間脱気した。前記脱気後、６５℃のオーブンでオーバーナイト加熱した。そして、前記鋳型内で形成されたＰＤＭＳを回収した。
オムニトレイ（Nuncオムニトレイ、Thermo scientific社製）またはガラスボトムディッシュ（岩城硝子社製）を、コロナフィットＣＦＧ−５００（信光電気計装株式会社製）を用いてコロナ処理した。また、前記ＰＤＭＳについても同様に表面をコロナ処理した。つぎに、コロナ処理後の前記オムニトレイまたは前記ガラスボトムディッシュと前記ＰＤＭＳとを貼り合わせた。そして、６５℃のオーブンでオーバーナイト加熱し、図１のデバイスを作製した。
（２）肝臓細胞の作製
前記Ｈ９細胞株を、１×１０５細胞／ｗｅｌｌとなるように播種した以外は、前記実施例３（１）および（２）と同様にして、肝臓細胞を調製した。得られた前記肝臓細胞は、TrypLE（商標）express含有ＰＢＳを使用し、回収した。
（３）成熟肝臓細胞の作製
前記デバイスに、１０μＬの前記血清含有培養液または前記マトリゲル液を導入し、４℃で２４時間以上インキュベートした。つぎに、前記デバイスに、前記肝臓細胞成熟用培養液を導入し、前記デバイスの流路を洗浄した。さらに、前記デバイスに、回収した前記肝臓細胞を５×１０４細胞／デバイス、または１×１０５細胞／デバイスとなるように導入後、３時間培養し、導入した前記肝臓細胞を接着させた。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。また、培養液は、前記肝臓細胞成熟用培養液を使用した。前記培養後、前記肝臓細胞成熟用培養液を導入し、接着していない前記肝臓細胞を除去した。そして、前記肝臓細胞成熟用培養液を毎日交換した以外は、前記実施例４（３）と同様にして、成熟肝臓細胞を作製した。
（４）成熟肝臓細胞マーカーの発現
培養３３日目の培養液を除去後、前記実施例４（４）と同様にして、成熟肝臓細胞マーカーの発現を、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
この結果を図１１に示す。図１１は、Ａ１ＡＴの発現を示す写真である。図１１において、１段目は、前記血液成分を含むコーティング処理をしたプレートを使用し、前記肝臓細胞を５×１０４細胞／デバイスで播種した結果を示し、２段目は、前記血液成分を含むコーティング処理をしたプレートを使用し、前記肝臓細胞を１×１０５細胞／デバイスで播種した結果を示し、３段目は、前記細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートを使用し、前記肝臓細胞を５×１０４細胞／デバイスで播種した結果を示し、４段目は、前記細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートを使用し、前記肝臓細胞を１×１０５細胞／デバイスで播種した結果を示す。また、図１１において、写真は、左から、位相差像、ＤＡＰＩ染色像、Ａ１ＡＴ染色像を示す。図１１の位相差像に示すように、いずれの足場でコーティング処理したプレートを使用した場合も、細胞が大型化し、またコロニーも盛り上がるようになり、成熟肝臓細胞であることがわかった。また、図１１の４段目に示すように、前記細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートを使用し、前記肝臓細胞を１×１０５細胞／デバイスで播種した場合、成熟肝臓細胞が３次元構造を形成していることがわかった。これらの結果から、前記マイクロ流体デバイス内で、ＲＯＣＫの活性を抑制し、多能性細胞から作製した肝臓細胞を成熟させることで成熟肝臓細胞が得られることがわかった。また、前記マイクロ流体デバイスを使用し、前記成熟開始時の前記肝臓細胞の細胞密度を高くすること、具体的には、１×１０３〜１×１０５細胞／ｃｍ２、より好ましくは、１×１０４〜５×１０４細胞／ｃｍ２とすることで、３次元構造を有する成熟肝臓細胞が得られることがわかった。
（５）成熟肝臓細胞機能の確認
前記実施例７（４）の前記細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートを使用し、前記肝臓細胞を１×１０５細胞／デバイスで播種した以外は、前記実施例７（１）〜（３）と同様にして、成熟肝臓細胞を作製した。つぎに、前記デバイスに、１ｍｇ／ｍＬとなるように前記ＩＣＧ溶液を添加した。そして、前記培養条件下で１時間培養し、前記ＩＣＧを作製した前記成熟肝臓細胞に取り込ませた。さらに、前記肝臓細胞成熟用培養液で洗浄後、前記肝臓細胞成熟用培養液を再度添加した。そして、前記培養条件下で１２時間培養することで、ＩＣＧを排出させた。
この結果を図１２に示す。図１２は、ＩＣＧの取り込みおよび排出を示す写真である。図１２において、左側の写真は、ＩＣＧ取り込み後の結果を示し、右側の写真は、ＩＣＧ排出後の結果を示す。図１２の左側の写真において矢印Ｘで示すように、ＩＣＧの取り込みが観察された。また、図１２の右側の写真に示すように、ＩＣＧの排出が観察された。これらの結果から、マイクロ流体デバイス内で成熟させた成熟肝臓細胞が成熟肝臓細胞の機能を有することがわかった。
［実施例８］
ＲＯＣＫの活性を抑制することで、多能性細胞から極めた優れた分化効率で前記内胚葉系細胞を作製できることを確認した。
全２０回、前記実施例１（１）と同様にして、内胚葉系細胞の誘導を行った。そして、５日目において、内胚葉系細胞が誘導されているか否かを確認した。コントロールは、全２５回、前記ＲＯＣＫ活性抑制化合物を添加しなかった以外は同様にして、内胚葉系細胞の誘導を行った。そして、５日目において、内胚葉系細胞が誘導されているか否かを確認した。
この結果を表３に示す。前記表３に示すように、実施例の内胚葉系細胞の誘導確率は、１００％であった。これに対して、コントロールの内胚葉系細胞の誘導確率は、８％であった。これらの結果から、ＲＯＣＫの活性を抑制することで、多能性細胞から極めた優れた分化効率で前記内胚葉系細胞を作製できることがわかった。
［実施例９］
ＲＯＣＫの活性を抑制することで、多能性細胞から、より短い期間で成熟肝臓細胞を作製できることを確認した。
（１）肝臓細胞および成熟肝臓細胞の作製
前記細胞外基質タンパク質を含むコーティング処理をしたプレートを用いた以外は、前記実施例４（１）〜（３）と同様にして、肝臓細胞および成熟肝臓細胞を作製した。そして、培養２０、２５、３０、および３５日目の細胞を回収した。そして、前記内胚葉系細胞に代えて、回収した前記細胞を用いた以外は、前記実施例２（４）と同様にして、ｃＤＮＡを合成した。そして、得られた前記ｃＤＮＡを鋳型として、前記ＰＣＲ試薬、およびサーマルサイクラーを用い、添付のプロトコルに従ってＰＣＲを行い、前記ＲＮＡ中のＡＬＢ遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子、Ａ１ＡＴ遺伝子、ＭＤＲ／ＴＡＰ遺伝子、およびＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅した。そして、増幅後のＰＣＲ液について、１．８％アガロースゲルで泳動した。前記泳動後、前記ゲルは、Ｇｅｌ Ｒｅｄ（商標）により染色し、ＡＬＢ遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子、Ａ１ＡＴ遺伝子、ＭＤＲ／ＴＡＰ遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を確認した。前記ＰＣＲにおいて、ＡＬＢ遺伝子の増幅には、以下のプライマーセットを使用し、ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅には、前記実施例２（４）のプライマーセットを使用し、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子、Ａ１ＡＴ遺伝子、およびＭＤＲ／ＴＡＰ遺伝子の増幅には、前記実施例６（２）のプライマーセットを使用した。ポジティブコントロールは、前記回収した細胞に代えて、前記ヒト肝臓粉砕液を用いた以外は、ネガティブコントロールは、前記ｃＤＮＡを添加しなかった以外は、コントロール１は、前記回収した細胞に代えて、Ｈ９細胞株を用いた以外は、コントロール２は、前記回収した細胞に代えて、ＨｅｐＧ２細胞を用いた以外は、同様にして、ＡＬＢ遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子、Ａ１ＡＴ遺伝子、ＭＤＲ／ＴＡＰ遺伝子、およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を確認した。
ＡＬＢ遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号２５）5’-TTGGCACAATGAAGTGGGTA-3’
（配列番号２６）5’-AAAGGCAATCAACACCAAGG-3’
この結果を図１３に示す。図１３は、ＡＬＢ遺伝子、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子、Ａ１ＡＴ遺伝子、ＭＤＲ／ＴＡＰ遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を示す写真である。図１３において、写真の上は、サンプルの種類を示し、写真の左は、遺伝子の種類を示し、各レーンは、左から、コントロール１、コントロール２、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、培養２０日目のサンプル、培養２５日目のサンプル、培養３０日目のサンプル、培養３５日目のサンプルの結果を示す。図１３に示すように、ポジティブコントロールは、全ての遺伝子を発現しており、ネガティブコントロールは、全ての遺伝子を発現していなかった。また、培養２０〜３５日目のサンプルは、全ての遺伝子を発現していた。これらの結果から、前記ＲＯＣＫの活性を抑制することで、培養２０日目においても、生体の成熟肝臓細胞と性質が近い成熟肝臓細胞を誘導できることがわかった。すなわち、本発明の内胚葉系細胞の製造方法によれば、３５日の培養期間を要する非特許文献１の方法に対して、より短い期間で成熟肝臓細胞を分化可能な内胚葉系細胞を誘導できることがわかった。
［実施例１０］
ＲＯＣＫの活性を抑制することで、分散された多能性細胞から、膵臓細胞が作製できることを確認した。
（１）内胚葉系細胞の作製
前記２４ウェルディッシュに代えて、Nunc（商標）４ウェルディッシュ（Thermo Scientific社製）を用い、前記Ｈ９細胞株に代えて、人工多能性幹細胞（253G1 hiPSCs、京都大学iPS細胞研究所山中研究室より分与）を用いた以外は、前記実施例１（１）の培養１〜４日目と同様にして、内胚葉系細胞を作製した。なお、前記４ウェルディッシュは、１０（ｖ／ｖ）％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液を添加し、３７℃で２４時間以上静置することにより、コーティング処理を行ったディッシュを用いた。
（２）膵臓細胞の作製
（培養５〜７日目）
前記４日目の培養液を除去し、１００μｇ／ｍＬ ＫＧＦ（R&D systems社製）を含むｉＭＥＭ／Ｂ−２７培養液を添加した。そして、前記培養条件で３日培養した。前記ｉＭＥＭ／Ｂ−２７培養液は、下記表４の組成の培養液を使用した。前記３日の培養中、毎日、前記ウェルの前記培養液を除去し、同じ組成の培養液を添加し、培養した。
（培養８〜１０日目）
前記７日目の培養液を除去し、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＡＡＤ−ＣＹＣ（Toronto Research Chemicals Inc.社製）、１０μｍｏｌ／Ｌ ＴＴＮＰＢ（Tocris社製）および１００μｇ／ｍＬ Ｎｏｇｇｉｎを含むｉＭＥＭ／Ｂ−２７培養液を添加した。そして、前記培養条件で３日培養した。前記３日の培養中、毎日、前記ウェルの前記培養液を除去し、同じ組成の培養液を添加し、培養した。
（培養１１〜１６日目）
前記１０日目の培養液を除去後、０．２５％ トリプシンおよび０．４８ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを添加し、３分間処理した。前記処理後、細胞を回収し、遠心後上清を除去した。さらに、１０μｍｏｌ／Ｌ Ｙ２７６３２、１００μｇ／ｍＬ ＫＧＦ、１００μｇ／ｍＬ Ｎｏｇｇｉｎおよび５００μｇ／ｍＬ ＥＧＦ（R&D systems社製）を含むｉＭＥＭ／Ｂ−２７培養液を添加し、細胞を懸濁後、前記４ウェルディッシュに、２×１０５細胞／ｗｅｌｌとなるように播種し、前記培養条件で６日培養した。前記６日の培養中、毎日、前記ウェルの前記培養液を除去し、同じ組成の培養液を添加し、培養した。
（３）膵臓細胞マーカータンパク質の発現
培養１６日目の培養液を除去後、ＰＢＳで前記ウェルを洗浄した。つぎに、４％ホルムアルデヒドを添加し、２４℃で５分間固定した。再度、ＰＢＳで前記ウェルを洗浄し、細胞透過液を添加し、細胞膜透過処理を４℃で２４時間以上行った。前記細胞透過液は、０．５％（体積％）Triton X-100含有ＰＢＳを使用した。前記細胞透過処理後、ウサギ抗ヒトＮＫＸ６．１ポリクローナル抗体（R&D systems社製）またはウサギ抗ヒトインスリンポリクローナル抗体（Abcam社製）と反応させた。さらに、Alexa Fluor（登録商標）488標識抗ウサギＩｇＧ抗体を添加し、染色した。そして、ＤＡＰＩで核染色を行った。前記染色後のウェルについて、前記蛍光顕微鏡を用いて観察した。
この結果を図１４に示す。図１４において、（Ａ）は、ＮＫＸ６．１の発現を示す写真であり、（Ｂ）は、インスリンの発現を示す写真である。図１４（Ａ）において、写真は、左から、位相差像、ＤＡＰＩ染色像、ＮＫＸ６．１染色像を示し、（Ｂ）において、写真は、左から、位相差像、ＤＡＰＩ染色像、インスリン染色像を示す。図１４（Ａ）および（Ｂ）に示すように、培養１６日目の膵臓細胞は、膵臓細胞マーカーであるＮＫＸ６．１およびインスリンを発現していた。これらの結果から、前記ＲＯＣＫの活性を抑制することで、分散された多能性細胞から前記膵臓細胞を作製できることがわかった。
（４）膵臓細胞マーカー遺伝子の発現
前記１６日目の培養後、各ウェルから細胞を回収した。つぎに、前記内胚葉系細胞に代えて、回収した前記細胞を用いた以外は、前記実施例２（４）と同様にして、ｃＤＮＡを合成した。そして、ＰＴＦ１α遺伝子、ＮＫＸ６．１遺伝子、およびＰＤＸ１遺伝子のプライマーセットとして、以下のプライマーセットを用いた以外は、前記実施例３（３）と同様にして、ＰＴＦ１α遺伝子、ＮＫＸ６．１遺伝子、ＰＤＸ１遺伝子、およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を確認した。
ＰＴＦ１α遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号２７）5’-CCCCAGCGACCCTGATTA-3’
（配列番号２８）5’-GGACACAAACTCAAATGGTGG-3’
ＮＫＸ６．１遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号２９）5’-ATTCGTTGGGGATGACAGAG-3’
（配列番号３０）5’-TGGGATCCAGAGGCTTATTG-3’
ＰＤＸ１遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号３１）5’-AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT-3’
（配列番号３２）5’-CACAGCCTCTACCTCGGAAC-3’
この結果を図１５に示す。図１５は、ＰＴＦ１α遺伝子、ＮＫＸ６．１遺伝子、ＰＤＸ１遺伝子、およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を示す写真である。図１５において、写真の左は、遺伝子の種類を示す。図１５に示すように、培養１６日目の膵臓細胞は、膵臓細胞マーカーであるＰＴＦ１α遺伝子、ＮＫＸ６．１遺伝子、およびＰＤＸ１遺伝子を発現していた。これらの結果から、前記ＲＯＣＫの活性を抑制することで、分散された多能性細胞から前記膵臓細胞を作製できることがわかった。
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
この出願は、２０１４年１２月２４日に出願された日本出願特願２０１４−２６１０８８を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
以上のように、本発明の内胚葉系細胞の製造方法によれば、分散された多能性細胞からも内胚葉系細胞を誘導でき、且つ内胚葉系細胞の作製効率を向上できる。このため、本発明は、再生医療等の臨床分野、医療分野、生命科学分野等において極めて有用である。
１ 細胞培養チャンバー
２ 開口部
１００ デバイス

Claims (32)

  1. 多能性細胞から内胚葉系細胞を誘導することにより前記内胚葉系細胞を製造する方法であって、
    内胚葉系細胞誘導因子の存在下、前記多能性細胞を前記内胚葉系細胞へ誘導する誘導工程を含み、
    前記誘導工程において、ＲＯＣＫタンパク質の活性を抑制することを特徴とする、内胚葉系細胞の製造方法。
  2. 前記誘導工程において、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度が、０．５×１０４〜２×１０５細胞／ｃｍ２である、請求項１記載の内胚葉系細胞の製造方法。
  3. 前記多能性細胞が、分散された多能性細胞である、請求項１または２記載の内胚葉系細胞の製造方法。
  4. 前記内胚葉系細胞誘導因子が、ＴＧＦ−βファミリータンパク質、ｂＦＧＦ、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性抑制物質、ＧＳＫ−３βタンパク質の活性抑制物質、およびｍＴＯＲタンパク質の活性抑制物質からなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞の製造方法。
  5. 前記ＴＧＦ−βファミリータンパク質が、アクチビン、ＢＭＰ−４、およびＮＯＤＡＬからなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項４記載の内胚葉系細胞の製造方法。
  6. 前記誘導工程が、前記内胚葉系細胞誘導因子を含む多能性細胞用の培養液の存在下、前記多能性細胞を前記内胚葉系細胞へ誘導する誘導工程である、請求項１から５のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞の製造方法。
  7. 前記培養液が、ＴＧＦ−βファミリータンパク質、ｂＦＧＦ、およびインスリンを含む培養液である、請求項６記載の内胚葉系細胞の製造方法。
  8. 前記誘導工程において、前記ＲＯＣＫタンパク質の活性抑制化合物により前記ＲＯＣＫタンパク質の活性を抑制する、請求項１から７のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞の製造方法。
  9. 肝臓細胞分化因子の存在下、内胚葉系細胞を肝臓細胞へ分化させる分化工程を含み、
    前記内胚葉系細胞が、請求項１から８のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞の製造方法により得られた内胚葉系細胞であることを特徴とする、肝臓細胞の製造方法。
  10. 前記肝臓細胞分化因子が、ＴＧＦ−βファミリータンパク質、ＦＧＦ１０、およびＷＮＴからなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項９記載の肝臓細胞の製造方法。
  11. 前記ＴＧＦ−βファミリータンパク質が、アクチビン、ＢＭＰ−４、およびＮＯＤＡＬからなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項１０記載の肝臓細胞の製造方法。
  12. さらに、肝臓細胞成熟因子の存在下、前記肝臓細胞を成熟させる成熟工程を含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の肝臓細胞の製造方法。
  13. 前記成熟工程において、足場上で前記肝臓細胞を成熟させる、請求項１２記載の肝臓細胞の製造方法。
  14. 前記足場が、細胞外基質タンパク質を含むコーティングである、請求項１３記載の肝臓細胞の製造方法。
  15. 前記足場が、血液成分を含むコーティングである、請求項１３記載の肝臓細胞の製造方法。
  16. 前記足場が、組み換えタンパク質を含むコーティングである、請求項１３記載の肝臓細胞の製造方法。
  17. 前記肝臓細胞成熟因子が、ＯＳＭ、ＨＧＦ、デキサメタゾン、ニコチンアミド、ジメチルスルホキシド、および酪酸ナトリウムからなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の肝臓細胞の製造方法。
  18. 膵臓細胞分化因子の存在下、内胚葉系細胞を膵臓細胞へ分化させる分化工程を含み、
    前記内胚葉系細胞が、請求項１から８のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞の製造方法により得られた内胚葉系細胞であることを特徴とする、膵臓細胞の製造方法。
  19. 多能性細胞から内胚葉系細胞の誘導に用いる誘導促進剤であって、
    ＲＯＣＫタンパク質の活性抑制物質を含むことを特徴とする、内胚葉系細胞の誘導促進剤。
  20. 前記ＲＯＣＫタンパク質の活性抑制物質が、前記ＲＯＣＫタンパク質の活性抑制化合物である、請求項１９記載の内胚葉系細胞の誘導促進剤。
  21. さらに、内胚葉系細胞誘導因子を含む、請求項１９または２０記載の内胚葉系細胞の誘導促進剤。
  22. 前記内胚葉系細胞誘導因子が、ＴＧＦ−βファミリータンパク質、ｂＦＧＦ、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性抑制物質、ＧＳＫ−３βタンパク質の活性抑制物質、およびｍＴＯＲタンパク質の活性抑制物質からなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項２１記載の内胚葉系細胞の誘導促進剤。
  23. 前記ＴＧＦ−βファミリータンパク質が、アクチビン、ＢＭＰ−４、およびＮＯＤＡＬからなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項２２記載の内胚葉系細胞の誘導促進剤。
  24. 請求項１９から２３のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞の誘導促進剤を含むことを特徴とする、肝臓細胞の誘導促進キット。
  25. さらに、肝臓細胞分化因子を含む、請求項２４記載の肝臓細胞の誘導促進キット。
  26. 前記肝臓細胞分化因子が、ＴＧＦ−βファミリータンパク質、ＦＧＦ１０、およびＷＮＴからなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項２５記載の肝臓細胞の誘導促進キット。
  27. 前記ＴＧＦ−βファミリータンパク質が、アクチビン、ＢＭＰ−４、およびＮＯＤＡＬからなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項２６記載の肝臓細胞の誘導促進キット。
  28. さらに、肝臓細胞成熟因子を含む、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の肝臓細胞の誘導促進キット。
  29. 前記肝臓細胞成熟因子が、ＯＳＭ、ＨＧＦ、デキサメタゾン、ニコチンアミド、ジメチルスルホキシド、および酪酸ナトリウムからなる群から選択された少なくとも１つを含む、請求項２８記載の肝臓細胞の誘導促進キット。
  30. さらに、マイクロ流体デバイスを含み、
    前記マイクロ流体デバイスが、少なくとも２つの開口部と細胞培養チャンバーとを含み、
    前記開口部は、前記細胞培養チャンバーと接続され、
    前記細胞培養チャンバー内に前記肝臓細胞と足場とを導入して培養したときに、少なくとも１つの前記開口部から前記細胞培養チャンバーへの前記肝臓細胞成熟因子の供給を前記細胞培養チャンバー内で濃度勾配を形成しながら行うことができるマイクロ流体デバイスである、請求項２８または２９記載の肝臓細胞の誘導促進キット。
  31. 請求項１９から２３のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞の誘導促進剤を含むことを特徴とする、膵臓細胞の誘導促進キット。
  32. 少なくとも２つの開口部と細胞培養チャンバーとを含み、
    前記開口部は、前記細胞培養チャンバーと接続され、
    前記細胞培養チャンバー内に肝臓細胞と足場とを導入して培養したときに、少なくとも１つの前記開口部から前記細胞培養チャンバーへの肝臓細胞成熟因子の供給を前記細胞培養チャンバー内で濃度勾配を形成しながら行うことができ、
    請求項９から１７の肝臓細胞の製造方法に使用することを特徴とする、マイクロ流体デバイス。
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