JPWO2016032003A1 - Lung cancer patient therapeutic agent and method for predicting the effectiveness of lung cancer patient treatment - Google Patents
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Abstract
肺癌患者、特に、EGFR-TKIに耐性を有するNSCLC患者の治療の肺癌治療剤及び肺癌患者治療の有効性の予測検査方法を提供する。HDAC阻害剤とEGFR-TKIの最適な組み合わせの肺癌患者用治療剤を鋭意検討した結果、「EGFR-TKIに耐性を有するNSCLC患者由来のサンプル中のBIMが非野生型である場合には、EGFR-TKI単独投与は治療の有効性が低いが、JNJ-26481585とEGFR-TKIを組み合わせた肺癌患者用治療剤又はCUDC-101とEGFR-TKIを組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与の治療の有効性が高いこと」を見出し、本発明を完成した。Provided are a lung cancer therapeutic agent for treating a lung cancer patient, in particular, an NSCLC patient having resistance to EGFR-TKI, and a predictive test method for the effectiveness of the lung cancer patient treatment. As a result of earnest examination of therapeutic agents for lung cancer patients with an optimal combination of HDAC inhibitor and EGFR-TKI, `` If BIM in the sample derived from NSCLC patients resistant to EGFR-TKI is non-wild type, EGFR -TKI monotherapy is less effective, but it is effective for treatment of lung cancer patients combined with JNJ-26481585 and EGFR-TKI or lung cancer patients combined with CUDC-101 and EGFR-TKI The present invention has been completed.
Description
本発明は、肺癌患者用治療剤及び肺癌患者治療の有効性の予測検査方法に関する。特に、BIM非野生型を有する肺癌患者、より詳しくは、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性を有する非小細胞肺癌患者の治療剤及び治療の有効性の予測検査方法に関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願2014-176674号優先権を請求する。The present invention relates to a therapeutic agent for lung cancer patients and a method for predicting the effectiveness of treatment for lung cancer patients. In particular, the present invention relates to a therapeutic agent for a lung cancer patient having a non-wild type BIM, more specifically, a non-small cell lung cancer patient having resistance to a tyrosine kinase inhibitor of an epidermal growth factor receptor and a method for predicting the effectiveness of the treatment.
This application claims the priority of Japanese application No. 2014-176674, which is incorporated herein by reference.
（肺癌）
日本では、毎年約6万人以上が肺癌で死亡しており、その中で非小細胞肺癌（NSCLC）は、約75％以上であると言われている。このような肺癌患者の治療方法として、一般的に上皮成長因子受容体（EGFR）のチロシンキナーゼ阻害剤（TKI）の投与がある。(lung cancer)
In Japan, more than 60,000 people die from lung cancer every year, and non-small cell lung cancer (NSCLC) is said to be about 75% or more. As a method for treating such lung cancer patients, there is generally administration of an epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor (TKI).
（上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤）
上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤（EGFR-TKI）であるゲフィチニブ及びエルロチニブは、エクソン19欠失やL858R点突然変異等のEGFR活性化突然変異を有するNSCLCに対して顕著な治療効果を示すことが知られている（非特許文献１、２）。
しかし、約20〜30%の患者では、EGFR-TKIに対する内因性耐性が現れる。また、初期にEGFR-TKI投与による効果を示す患者でも、治療期間中にEGFR-TKIへの耐性が発現していることが報告されている（非特許文献３）。
さらに、EGFR-TKIの薬剤性間質性肺炎等の副作用が問題になっている。
以上により、EGFR-TKIに対する感度又は感受性が低い（耐性がある）患者に対して、投与前に効果を予測できる方法、さらにEGFR-TKI耐性の患者に対する最適な治療方法の確立が強く望まれている。(Tyrosine kinase inhibitor of epidermal growth factor receptor)
The epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors (EGFR-TKI) gefitinib and erlotinib have significant therapeutic effects on NSCLC with EGFR-activating mutations such as exon 19 deletion and L858R point mutation (Non-Patent Documents 1 and 2).
However, about 20-30% of patients develop intrinsic resistance to EGFR-TKI. In addition, it has been reported that even patients who initially show the effects of EGFR-TKI administration have developed resistance to EGFR-TKI during the treatment period (Non-patent Document 3).
Furthermore, side effects such as drug-induced interstitial pneumonia of EGFR-TKI have become a problem.
Based on the above, for patients with low sensitivity or sensitivity to EGFR-TKI (resistant), it is strongly desired to establish a method that can predict the effect before administration and to establish an optimal treatment method for EGFR-TKI resistant patients. Yes.
本発明は、前記要望に対して、肺癌患者、特に、EGFR-TKIに耐性を有するNSCLC患者の肺癌治療剤及び肺癌患者治療の有効性の予測検査方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a lung cancer therapeutic agent for lung cancer patients, particularly NSCLC patients having resistance to EGFR-TKI, and a method for predicting the effectiveness of treatment for lung cancer patients.
本発明者等は、上記課題を解決すべく、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（HDAC阻害剤）とEGFR-TKIの最適な組み合わせの肺癌患者用治療剤を鋭意検討した結果、「EGFR-TKIに耐性を有するNSCLC患者由来のサンプル中のBIMが非野生型である場合には、EGFR-TKI単独投与は治療の有効性が低いが、JNJ-26481585とEGFR-TKIを組み合わせた肺癌患者用治療剤又はCUDC-101とEGFR-TKIを組み合わせた肺癌患者用治療剤の有効性が高いこと」を見出し、本発明を完成した。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have intensively studied a therapeutic agent for lung cancer patients with an optimal combination of a histone deacetylase inhibitor (HDAC inhibitor) and EGFR-TKI. When BIM in a sample derived from a patient with NSCLC who is resistant is non-wild type, treatment with EGFR-TKI alone is less effective, but a treatment for lung cancer patients combining JNJ-26481585 and EGFR-TKI Or the effectiveness of the therapeutic agent for lung cancer patients which combined CUDC-101 and EGFR-TKI is high, "and found the present invention.
すなわち、本発明は以下からなる。
１．有効成分であるJNJ-26481585、CUDC-101、ボリノスタット及び／又はベリノスタットを、有効成分である上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせたことを特徴とする肺癌患者用治療剤。
２．前記肺癌患者は、BIMの非野生型を有する前項１に記載の肺癌患者用治療剤。
３．前記肺癌患者は、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性を有する非小細胞肺癌患者である前項１又は２に記載の肺癌患者用治療剤。
４．JNJ-26481585を上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブと組み合わせた前項１〜３のいずれか１に記載の肺癌患者用治療剤。
５．CUDC-101を上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブと組み合わせた前項１〜３のいずれか１に記載の肺癌患者用治療剤。
６．ベリノスタットを上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤であるAZD9291と組み合わせた前項１〜３のいずれか１に記載の肺癌患者用治療剤。
７．ボリノスタットを上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤であるAZD9291と組み合わせた前項１〜３のいずれか１に記載の肺癌患者用治療剤。
８．ベリノスタットを上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブと組み合わせた前項１〜３のいずれか１に記載の肺癌患者用治療剤。
９．ベリノスタットを上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤であるアファチニブと組み合わせた前項１〜３のいずれか１に記載の肺癌患者用治療剤。
１０．ボリノスタットを上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤であるアファチニブと組み合わせた前項１〜３のいずれか１に記載の肺癌患者用治療剤。
１１．前記非野生型であることは、以下のいずれか１を有することである前項２〜１０のいずれか１に記載の肺癌患者用治療剤。
（１）BIM遺伝子の第2イントロンの部分欠失
（２）BIM-γ
（３）mRNA転写産物のエクソン3対エクソン4比が1以上
１２．以下の工程を有する肺癌患者治療の有効性の予測検査方法。
（１）肺癌患者から取得したサンプル中のBIMが野生型であるか非野生型であるかを判定する工程
（２）非野生型の場合には、JNJ-26481585、CUDC-101、ボリノスタット及び／又はベリノスタットを上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせた併用投与が有効であると判定する工程
１３．前記非野生型であることは、以下のいずれか１を検出することを含む前項１２に記載の予測検査方法。
（１）BIM遺伝子の第2イントロンの部分欠失
（２）BIM-γ
（３）mRNA転写産物のエクソン3対エクソン4比が1以上
１４．前記肺癌患者は、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性を有する非小細胞肺癌患者である前項１２又は１３に記載の予測検査方法。
１５．前記上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤はゲフィチニブである前項１２〜１４のいずれか１に記載の予測検査方法。
１６．前記上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤はAZD9291である前項１２〜１４のいずれか１に記載の予測検査方法。
１７．前記上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤はアファチニブである前項１２〜１４のいずれか１に記載の予測検査方法。That is, this invention consists of the following.
1. A therapeutic agent for lung cancer patients, wherein an active ingredient JNJ-26481585, CUDC-101, vorinostat and / or belinostat is combined with an active ingredient epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor.
2. 2. The therapeutic agent for lung cancer patients according to 1 above, wherein the lung cancer patient has a non-wild type of BIM.
3. 3. The therapeutic agent for a lung cancer patient according to item 1 or 2, wherein the lung cancer patient is a non-small cell lung cancer patient having resistance to a tyrosine kinase inhibitor of an epidermal growth factor receptor.
4). 4. The therapeutic agent for lung cancer patients according to any one of 1 to 3 above, wherein JNJ-26481585 is combined with gefitinib which is a tyrosine kinase inhibitor of epidermal growth factor receptor.
5. 4. The therapeutic agent for lung cancer patients according to any one of the preceding items 1 to 3, wherein CUDC-101 is combined with gefitinib which is a tyrosine kinase inhibitor of an epidermal growth factor receptor.
6). 4. The therapeutic agent for lung cancer patients according to any one of the preceding items 1 to 3, wherein berinostat is combined with AZD9291 which is a tyrosine kinase inhibitor of epidermal growth factor receptor.
7). 4. The therapeutic agent for lung cancer patients according to any one of 1 to 3 above, wherein vorinostat is combined with AZD9291 which is a tyrosine kinase inhibitor of epidermal growth factor receptor.
8). 4. The therapeutic agent for lung cancer patients according to any one of the preceding items 1 to 3, wherein berinostat is combined with gefitinib which is a tyrosine kinase inhibitor of an epidermal growth factor receptor.
9. 4. The therapeutic agent for lung cancer patients according to any one of 1 to 3 above, wherein belinostat is combined with afatinib which is a tyrosine kinase inhibitor of epidermal growth factor receptor.
10. 4. The therapeutic agent for lung cancer patients according to any one of 1 to 3 above, wherein vorinostat is combined with afatinib which is a tyrosine kinase inhibitor of epidermal growth factor receptor.
11. 11. The therapeutic agent for a lung cancer patient according to any one of 2 to 10 above, wherein the non-wild type is any one of the following.
(1) Partial deletion of the second intron of the BIM gene (2) BIM-γ
(3) Exon 3 to exon 4 ratio of mRNA transcript is 1 or more. A method for predicting the effectiveness of treatment for lung cancer patients comprising the following steps.
(1) Step of determining whether BIM in a sample obtained from a lung cancer patient is wild type or non-wild type (2) In the case of non-wild type, JNJ-26481585, CUDC-101, vorinostat and / or Alternatively, the step of determining that the combined administration in which belinostat is combined with a tyrosine kinase inhibitor of epidermal growth factor receptor is effective 13. Said non-wild type is the prediction test | inspection method of previous clause 12 including detecting any one of the following.
(1) Partial deletion of the second intron of the BIM gene (2) BIM-γ
(3) Exon 3 to exon 4 ratio of mRNA transcript is 1 or more 14. The predictive test method according to item 12 or 13, wherein the lung cancer patient is a non-small cell lung cancer patient having resistance to a tyrosine kinase inhibitor of an epidermal growth factor receptor.
15. 15. The predictive test method according to any one of items 12 to 14, wherein the tyrosine kinase inhibitor of the epidermal growth factor receptor is gefitinib.
16. 15. The predictive test method according to any one of 12 to 14 above, wherein the tyrosine kinase inhibitor of the epidermal growth factor receptor is AZD9291.
17. 15. The predictive test method according to any one of 12 to 14 above, wherein the tyrosine kinase inhibitor of the epidermal growth factor receptor is afatinib.
本発明は、肺癌患者、特に、EGFR-TKIに耐性を有するNSCLC患者の肺癌治療剤を提供することができる。
さらに、本発明は、肺癌患者、特にEGFR変異NSCLC患者に見られるBIM多型を検出して、肺癌患者治療の有効性の予測検査方法を提供することができる。
これにより、EGFR-TKIの治療効果を投与前に予測することが可能になり、EGFR-TKI投与の効果が期待される患者には早期からEGFR-TKIを投与することにより、治療効果を高めることができる。さらに、EGFR-TKI単独投与の治療の有効性が期待できない患者には、JNJ-26481585とEGFR-TKIを組み合わせた肺癌患者用治療剤又はCUDC-101とEGFR-TKIを組み合わせた肺癌患者用治療剤を患者に投与することができる。The present invention can provide a therapeutic agent for lung cancer in lung cancer patients, particularly NSCLC patients having resistance to EGFR-TKI.
Furthermore, the present invention can provide a predictive test method for the effectiveness of treating lung cancer patients by detecting BIM polymorphisms found in lung cancer patients, particularly EGFR mutant NSCLC patients.
This makes it possible to predict the therapeutic effect of EGFR-TKI before administration, and to enhance the therapeutic effect by administering EGFR-TKI from an early stage to patients who are expected to have the effect of EGFR-TKI administration Can do. Furthermore, for patients who cannot expect the effectiveness of treatment with EGFR-TKI single administration, treatment for lung cancer patients combining JNJ-26481585 and EGFR-TKI or treatment for lung cancer patients combining CUDC-101 and EGFR-TKI Can be administered to a patient.
本発明は、「有効成分であるJNJ-26481585、CUDC-101、ボリノスタット及び／又はベリノスタットを、有効成分であるEGFR-TKIと組み合わせたことを特徴とする肺癌患者用治療剤」並びに「肺癌患者から取得したサンプル中のBIMが野生型であるか非野生型であるかを判定し、非野生型の場合には、JNJ-26481585、CUDC-101、ボリノスタット及び／又はベリノスタットを、EGFR-TKIと組み合わせた併用投与が有効であると判定することを特徴とする肺癌患者治療の有効性の予測検査方法」である。 The present invention relates to "a therapeutic agent for lung cancer patients characterized by combining JNJ-26481585, CUDC-101, vorinostat and / or belinostat as active ingredients with EGFR-TKI as an active ingredient" and "from lung cancer patients". Determine whether the BIM in the obtained sample is wild-type or non-wild-type. If it is non-wild-type, combine JNJ-26481585, CUDC-101, vorinostat and / or verinostat with EGFR-TKI. A method for predicting the effectiveness of treatment for patients with lung cancer, characterized in that it is determined that the combined administration is effective.
（肺癌患者治療の有効性の予測検査方法）
本発明の肺癌患者治療の有効性の予測検査方法は、以下の工程を含む。
（１）肺癌患者から取得したサンプル中のBIMが野生型であるか非野生型であるかを判定する工程
（２）非野生型の場合には、JNJ-26481585、CUDC-101、ボリノスタット及び／又はベリノスタットをEGFR-TKIと組み合わせた併用投与が有効であると判定する工程(Test method for predicting the effectiveness of treatment for lung cancer patients)
The predictive test method for the effectiveness of treatment of lung cancer patients according to the present invention includes the following steps.
(1) Step of determining whether BIM in a sample obtained from a lung cancer patient is wild type or non-wild type (2) In the case of non-wild type, JNJ-26481585, CUDC-101, vorinostat and / or Or the step of determining that the combined administration of velinostat and EGFR-TKI is effective
（肺癌患者用治療剤）
本発明の肺癌患者用治療剤は、有効成分であるJNJ-26481585及び／又はCUDC-101を有効成分であるEGFR-TKIと組み合わせたことを特徴とする肺癌患者用治療剤である。
特に、好ましい、EGFR-TKIは、ゲフィチニブ、AZD9291及びアファチニブである。(Therapeutic agent for lung cancer patients)
The therapeutic agent for lung cancer patients of the present invention is a therapeutic agent for lung cancer patients characterized by combining JNJ-26481585 and / or CUDC-101 as active ingredients with EGFR-TKI as active ingredients.
Particularly preferred EGFR-TKIs are gefitinib, AZD9291 and afatinib.
（肺癌患者）
本発明の肺癌患者治療の有効性の予測検査方法又は肺癌患者用治療剤における、肺癌患者は、好ましくはEGFR変異肺癌患者であり、より好ましくはEGFR変異NSCLC患者であり、最も好ましくは進行性のEGFR変異NSCLC患者である。また、肺癌患者は、BIM の非野生型（BIM欠失多型）を有していても良い。
加えて、BIM欠失多型は、比較的東アジア人に多いので、黄色人種、好ましくは東アジア人種、より好ましくは日本人の肺癌患者に有効である。(Lung cancer patients)
The lung cancer patient in the predictive test method for the effectiveness of the treatment of lung cancer patient treatment or the therapeutic agent for lung cancer patient of the present invention is preferably an EGFR mutant lung cancer patient, more preferably an EGFR mutant NSCLC patient, most preferably progressive. EGFR mutant NSCLC patients. The lung cancer patient may have a non-wild type of BIM (BIM deletion polymorphism).
In addition, since the BIM deletion polymorphism is relatively common in East Asians, it is effective in patients with lung cancer in yellow, preferably East Asian, more preferably Japanese.
（サンプル）
本発明のサンプルは、下記実施例５の結果を示すように、由来は特に限定されないが、例えば血液（末梢単核球）、血清、肺癌細胞、リンパ液、***、尿、唾液（含：口内粘膜細胞）、その他の体液、及び生体組織（肺癌組織）等が挙げられ、特に、末梢単核球、血清等が採取等の取り扱いが容易で、侵襲性が低いという点で最も好ましい。被検者からサンプルを取得する方法は、特に限定されず、自体公知の方法によることができる。(sample)
The origin of the sample of the present invention is not particularly limited, as shown in the results of Example 5 below. For example, blood (peripheral mononuclear cells), serum, lung cancer cells, lymph fluid, semen, urine, saliva (including: oral mucosa) Cells), other body fluids, and biological tissues (lung cancer tissues), and particularly, peripheral mononuclear cells, serum and the like are most preferable in terms of easy handling such as collection and low invasiveness. The method for obtaining the sample from the subject is not particularly limited, and can be a method known per se.
（サンプルの処理方法）
上記肺癌患者から取得したサンプルは、免疫染色法、RT-PCR法等の自体公知の方法でBIMの多型を検出できる。
また、取得したサンプルは、予め処理することができる。サンプルからのDNA又はmRNAの抽出方法は、特に限定されず、自体公知の方法によることができる。例えばDNAを抽出する場合は、塩析、PCI（フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール抽出）法、市販のDNA抽出キット等を用いる方法、その他公知の方法によることができる。例えば、mRNAを抽出する場合は、PCI法において溶液を酸性にして水層から抽出する方法、オリゴdTカラム等を利用する方法、市販のRNA抽出キットを用いる方法、その他の公知の方法によることができる。(Sample processing method)
A sample obtained from the above lung cancer patient can detect a polymorphism of BIM by a method known per se such as immunostaining and RT-PCR.
Also, the acquired sample can be processed in advance. The method for extracting DNA or mRNA from the sample is not particularly limited, and can be a method known per se. For example, when DNA is extracted, salting out, PCI (phenol / chloroform / isoamyl alcohol extraction) method, a method using a commercially available DNA extraction kit or the like, or other known methods can be used. For example, when extracting mRNA, it is possible to use a method in which the solution is acidified in the PCI method and extracted from the aqueous layer, a method using an oligo dT column or the like, a method using a commercially available RNA extraction kit, or other known methods. it can.
サンプルから得られたDNA又はmRNA等のポリヌクレオチドの量が少ない場合には、必要に応じて、公知の方法によってこれらを増幅することができる。ポリヌクレオチドの増幅方法は、特に限定されず自体公知の方法を採用することができ、増幅の対象がDNAの場合は、例えばPCR法やLAMP法を利用することができ、増幅の標的となる対象がmRNAの場合には、RT-PCR法やRT-LAMP法等を利用することができる。 When the amount of polynucleotide such as DNA or mRNA obtained from the sample is small, these can be amplified by a known method, if necessary. The method for amplifying the polynucleotide is not particularly limited, and a method known per se can be adopted. When the amplification target is DNA, for example, the PCR method or the LAMP method can be used, and the amplification target When is mRNA, RT-PCR method, RT-LAMP method or the like can be used.
上記サンプルから得られたDNA又はmRNAから、BIMを含む領域を増幅することができる。増幅されたヌクレオチド断片は、測定可能なサイズのものであればよい。
上記BIMを含む領域を増幅するためのプライマーは、BIMを含む領域のポリヌクレオチドのアンチセンス鎖及びセンス鎖の3'末端と、それぞれ特異的にハイブリダイズする、フォワード（センス）プライマーとリバース（アンチセンス）プライマーが含まれる。これらのプライマーは、BIMを含む領域の塩基配列に合わせて、適宜デザインすることができる。A region containing BIM can be amplified from DNA or mRNA obtained from the sample. The amplified nucleotide fragment may be of a measurable size.
Primers for amplifying the region containing BIM are forward (sense) primer and reverse (anti-antigen) that specifically hybridize with the antisense strand and 3 ′ end of the sense strand of the polynucleotide in the region containing BIM, respectively. Sense) primer. These primers can be appropriately designed according to the base sequence of the region containing BIM.
（BIM多型の決定方法）
本発明の肺癌患者治療の有効性の予測検査方法又は肺癌患者用治療剤で使用するBIM多型の決定方法（検出方法）は、サンプルから得られたDNA又はmRNA等のポリヌクレオチド、又は上記増幅により得られたポリヌクレオチド断片により、BIMの多型を決定する工程を含む。BIMの多型を決定する方法は、自体公知の方法を用いることができ、例えば、シークエンサー等を用いて直接塩基配列を決定するdirect sequence法（ジデオキシ法）の他、RELP（制限酵素断片長多型性）を利用するPCR-RELP法、TaqMan法、DigiTag2法、シングルヌクレオチドプライマー伸長法、SnaPshot法（ABI）、ASP-PCR法、PCR-SSO（sequence specific oligonucleotide）法、PCR-SSP（sequence specific primer）法、PCR-SSCP（single-stranded conformational polymorphism analysis）法、電気泳動等による核酸の長さの確認、及びDNAチップ等の遺伝子多型検査用器具等を用いる方法等が挙げられる。(BIM polymorphism determination method)
The method for predicting the effectiveness of treatment for lung cancer patients according to the present invention or the method for determining BIM polymorphism (detection method) used in a therapeutic agent for lung cancer patients is a polynucleotide such as DNA or mRNA obtained from a sample, or the amplification described above. The step of determining a polymorphism of BIM using the polynucleotide fragment obtained by the above step is included. As a method for determining a polymorphism of BIM, a method known per se can be used. For example, in addition to the direct sequence method (dideoxy method) for directly determining a base sequence using a sequencer or the like, RELP (restriction of fragment length of restriction enzyme) PCR-RELP method, TaqMan method, DigiTag2 method, single nucleotide primer extension method, SnaPshot method (ABI), ASP-PCR method, PCR-SSO (sequence specific oligonucleotide) method, PCR-SSP (sequence specific) primer) method, PCR-SSCP (single-stranded conformational polymorphism analysis) method, confirmation of the length of the nucleic acid by electrophoresis, and a method using a genetic polymorphism testing instrument such as a DNA chip.
（BIM）
BCL2L11とも称されるBIMは、プロアポトーシスタンパク質であり、Bcl-2ファミリーのメンバーである。アポトーシス誘導に不可欠なBH3ドメインを有する遺伝子産物（BIMEL、BIML及びBIMS等）は、抗アポトーシスタンパク質（Bcl-2、Bcl-XL及びMcl-1等）に拮抗し、プロアポトーシスタンパク質（BAX及びBAK等）を活性化し、アポトーシスを誘導する。BAX及びBAKを活性化すると、細胞質内にシトクロームＣが放出され、カスパーゼのカスケードが活性化される。
BIM欠失多型は、比較的東アジア人に多く（12.9%）、0.5%がこの欠失に対してホモ接合性である。BIM欠失多型は、イントロン2内で2903 bp断片の欠失を含み、これによってエクソン4よりもエクソン3が優先的にスプライスされ、BH3ドメインを欠失したBIMイソ型が生成される（参照：Nat Med 2012;18:521-8）。
また、BIMELは、E1、E2A、E2B、E2C、E4（BH3ドメインを含む）及びE5を含む転写産物であり、BIMLは、E1、E2A、E2C、E4及びE5を含む転写産物であり、BIMSは、E1、E2A、E4及びE5を含む転写産物であり、BIM-γは、E1、E2A、E2C及びE3を含む転写産物である。(BIM)
BIM, also referred to as BCL2L11, is a pro-apoptotic protein and a member of the Bcl-2 family. Gene products having a BH3 domain essential for apoptosis induction (BIM EL, BIM L and BIM S, etc.), and antagonize the anti-apoptotic proteins (Bcl-2, Bcl-XL and McI-1, etc.), pro-apoptotic proteins (BAX And BAK and the like) and induce apoptosis. When BAX and BAK are activated, cytochrome C is released into the cytoplasm and the caspase cascade is activated.
BIM deletion polymorphisms are relatively common in East Asians (12.9%) and 0.5% are homozygous for this deletion. The BIM deletion polymorphism includes a deletion of a 2903 bp fragment within intron 2, which preferentially splices exon 3 over exon 4 to produce a BIM isoform lacking the BH3 domain (see : Nat Med 2012; 18: 521-8).
BIM EL is a transcript containing E1, E2A, E2B, E2C, E4 (including the BH3 domain) and E5, and BIM L is a transcript containing E1, E2A, E2C, E4 and E5, BIM S is a transcript containing E1, E2A, E4 and E5, and BIM-γ is a transcript containing E1, E2A, E2C and E3.
（BIMが野生型であるか非野生型であるかの判定）
本発明の肺癌患者治療の有効性の予測検査方法又は肺癌患者用治療剤において、BIMが野生型であるか非野生型であるかを判定する基準として、BIM多型を検出する。下記のBIM多型を検出することができれば、非野生型と判定する。さらに、本実施例２では、下記のBIM多型がEGFR-TKI抵抗性を有することを確認している。
（１）BIM遺伝子の第2イントロンの部分欠失
（２）BIM-γ
（３）mRNA転写産物のエクソン3対エクソン4比が1以上
加えて、下記実施例２〜４及び参考例１〜２の結果により、BIM多型（H3ドメインを含んでいるBIM多型）では、JNJ-26481585、CUDC-101、ボリノスタット及び／又はベリノスタットをEGFR-TKIと組み合わせた肺癌患者用治療剤が、特に有効であることを確認している。(Determining whether BIM is wild type or non-wild type)
In the predictive test method for the effectiveness of treatment of lung cancer patients or the therapeutic agent for lung cancer patients of the present invention, a BIM polymorphism is detected as a reference for determining whether the BIM is a wild type or a non-wild type. If the following BIM polymorphism can be detected, it is determined as a non-wild type. Furthermore, in this Example 2, it has confirmed that the following BIM polymorphism has EGFR-TKI resistance.
(1) Partial deletion of the second intron of the BIM gene (2) BIM-γ
(3) The ratio of exon 3 to exon 4 of the mRNA transcript is 1 or more, and according to the results of Examples 2 to 4 and Reference Examples 1 and 2 below, BIM polymorphism (BIM polymorphism containing H3 domain) , JNJ-26481585, CUDC-101, vorinostat and / or verinostat in combination with EGFR-TKI has been confirmed to be particularly effective.
（EGFR-TKI）
EGFR-TKIは、EGFRのチロシンキナーゼの活性を阻害する抗癌剤である。EGFR-TKIは、特に制限されないが、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブAZD9291及びアファチニブ等が例示される。(EGFR-TKI)
EGFR-TKI is an anticancer agent that inhibits the activity of EGFR tyrosine kinase. EGFR-TKI is not particularly limited, and examples thereof include gefitinib, erlotinib AZD9291, and afatinib.
ゲフィチニブ（参照：下記式）は、他の治療法で効果がなかった進行性NSCLCの治療に使用されている分子標的抗癌剤であり、アストラゼネカ社により商品名「イレッサ」として市販されている。 Gefitinib (see: formula below) is a molecularly targeted anticancer agent used in the treatment of advanced NSCLC that was ineffective with other therapies and is marketed by AstraZeneca under the trade name “Iressa”.
アファチニブ（Afatinib：参照：下記式）は、ゲフィチニブより新しい、進行性NSCLCの治療に使用されている分子標的抗癌剤であり、日本ベーリンガーインゲルハイム社より商品名「ジオトリフ」として市販されている。 Afatinib (refer to the following formula) is a molecular target anticancer agent that is newer than gefitinib and is used for the treatment of advanced NSCLC, and is marketed by Nippon Boehringer Ingelheim under the trade name “Geotrif”.
AZD9291（参照：下記式）は、アファチニブより新しい、進行性NSCLCの治療に有望な分子標的抗癌剤であり、アストラゼネカ社により臨床試験されている。
上記AZD9291は、変異型EGFR選択的TKIに分類される薬剤で、活性型遺伝子変異のみならずT790M二次的遺伝子変異を有するEGFRを選択的に阻害する（参照：WO2013/014448、Cancer Discov 2014;4:1046-61）。また高血糖の可能性を回避するためインスリン受容体及びインスリン様成長因子受容体に対する作用を低減するよう設計されている。AZD9291 (reference: formula below) is a new molecular target anticancer drug that is newer than afatinib and is promising for the treatment of advanced NSCLC, and is being clinically tested by AstraZeneca.
The AZD9291 is a drug classified as a mutant EGFR-selective TKI and selectively inhibits EGFR having a T790M secondary gene mutation as well as an active gene mutation (see: WO2013 / 014448, Cancer Discov 2014; 4: 1046-61). It is also designed to reduce the action on insulin receptors and insulin-like growth factor receptors to avoid the possibility of hyperglycemia.
（ドセタキセル）
ドセタキセルは、タキサン系の抗癌剤であり、細胞の***に必要な微小管の働きを阻害し、がん細胞の***を防ぐ作用があり、商品名「タキソテール」あるいは「ワンタキソテール」として市販されている。(Docetaxel)
Docetaxel is a taxane anticancer drug that inhibits the action of microtubules necessary for cell division and prevents cancer cell division, and is marketed under the trade name "Taxotere" or "One Taxotere". .
（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤：HDAC阻害剤）
ヒストン脱アセチル化酵素は、クロマチンリモデリングを調節し、様々な遺伝子の後成的調節に極めて重要な酵素である。HDAC阻害剤の例として、ボリノスタット、JNJ-26481585、CUDC-101、PCI-24781、Droxinostat、Entinostat（エンチノスタット）がある。
本発明の肺癌患者用治療剤で使用するHDAC阻害剤は、下記の実施例３、４、参考例１及び参考例２の結果より、JNJ-26481585、CUDC-101、ボリノスタット及び／又はベリノスタットである。(Histone deacetylase inhibitor: HDAC inhibitor)
Histone deacetylase regulates chromatin remodeling and is a critical enzyme for epigenetic regulation of various genes. Examples of HDAC inhibitors include vorinostat, JNJ-26481585, CUDC-101, PCI-24781, Droxinostat, Entinostat (entinostat).
The HDAC inhibitor used in the therapeutic agent for lung cancer patients of the present invention is JNJ-26481585, CUDC-101, vorinostat and / or verinostat based on the results of the following Examples 3 and 4, Reference Example 1 and Reference Example 2. .
ボリノスタット（参照：下記式）は、商品名「ゾリンザ」として市販されており、皮膚T細胞性リンパ腫の患者を治療するために、米国食品医薬品局（FDA）に認可されている。 Vorinostat (see: Formula below) is marketed under the trade name “Zolinza” and is approved by the US Food and Drug Administration (FDA) to treat patients with cutaneous T-cell lymphoma.
ベリノスタット（Belinostat：下記式）は、末梢T細胞リンパ腫の患者を治療するために、FDAに認可されている。 Belinostat (below formula) is approved by the FDA to treat patients with peripheral T-cell lymphoma.
Droxinostatは、HDAC3、HDAC6及びHDAC8の阻害剤であり、市販されている。
Entinostatは、HDAC1及びHDAC3の阻害剤であり、市販されている。Droxinostat is an inhibitor of HDAC3, HDAC6 and HDAC8 and is commercially available.
Entinostat is an inhibitor of HDAC1 and HDAC3 and is commercially available.
（CUDC-101）
CUDC-101（参照：下記式）は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害作用だけでなく、上皮成長因子受容体阻害作用も有し、市販されている。(CUDC-101)
CUDC-101 (refer to the following formula) has not only a histone deacetylase inhibitory action but also an epidermal growth factor receptor inhibitory action, and is commercially available.
（JNJ-26481585）
JNJ-26481585（参照：下記式）は、広範囲のヒストン脱アセチル化酵素（HDAC1、HDAC2、HDAC4、HDAC10及び HDAC11）の阻害剤であり、市販されている。(JNJ-26481585)
JNJ-26481585 (see: formula below) is an inhibitor of a wide range of histone deacetylases (HDAC1, HDAC2, HDAC4, HDAC10 and HDAC11) and is commercially available.
（肺癌患者用治療剤の使用方法）
本発明の肺癌患者用治療剤の好ましい使用方法は、下記の通りであるが特に限定されない。
肺癌患者から得られたサンプルのBIMが非野生型の場合には、実施例３、実施例４、参考例１及び参考例２の結果よりJNJ-26481585、CUDC-101、ボリノスタット及び／又はベリノスタットをEGFR-TKIと組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与が有効であると判定し、さらに、該治療剤を該肺癌患者に投与する。なお、好ましい、EGFR-TKIは、ゲフィチニブ、アファチニブ及びAZD9291である。
さらに、肺癌患者から得られたサンプルのBIMが野生型の場合には、実施例２の結果より、EGFR-TKI単独投与でも有効であると判定し、治療期間中において、必要に応じて、JNJ-26481585、CUDC-101、ボリノスタット及び／又はベリノスタットをEGFR-TKIと組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与を行う。なお、好ましい、EGFR-TKIは、ゲフィチニブ、アファチニブ及びAZD9291である。(Usage of therapeutic agents for lung cancer patients)
Although the preferable usage method of the therapeutic agent for lung cancer patients of this invention is as follows, it is not specifically limited.
In the case where the BIM of the sample obtained from the lung cancer patient is non-wild type, JNJ-26481585, CUDC-101, vorinostat and / or verinostat are obtained from the results of Example 3, Example 4, Reference Example 1 and Reference Example 2. It is determined that administration of a therapeutic agent for lung cancer patients in combination with EGFR-TKI is effective, and the therapeutic agent is further administered to the lung cancer patient. Preferred EGFR-TKIs are gefitinib, afatinib and AZD9291.
Further, when the BIM of the sample obtained from the lung cancer patient is wild type, it is determined that EGFR-TKI alone is effective from the results of Example 2, and during the treatment period, JNJ -26481585, CUDC-101, vorinostat and / or belinostat is combined with EGFR-TKI for the treatment of lung cancer patients. Preferred EGFR-TKIs are gefitinib, afatinib and AZD9291.
（CUDC-101及びゲフィチニブを組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与方法）
本発明の有効成分であるCUDC-101及びゲフィチニブを組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与方法は、以下を例示することができるが特に限定されない。
（１）１回の投与量
ゲフィチニブ：２５０ｍｇ
CUDC-101：７５ｍｇ/ｍ２〜３００ｍｇ/ｍ２、好ましくは１５０ｍｇ/ｍ２〜２７５ｍｇ/ｍ２、最も好ましくは約２７５ｍｇ/ｍ２
（２）投与間隔
ゲフィチニブ：１週間１〜７回投与、好ましくは２日１〜２回投与、最も好ましくは１日１回投与
CUDC-101：２週間１〜５回投与、好ましくは２週間３〜５回投与、最も好ましくは２週間５回投与
（３）併用投与：CUDC-101とゲフィチニブは同時投与、数時間の間隔を空けての投与、１日の間隔を空けての投与、数日の間隔を空けての投与のいずれでも良い。
また、CUDC-101とゲフィチニブを、生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤等などと混合し、医薬組成物にした後に、該組成物を患者に投与してもよい。さらに、CUDC-101とゲフィチニブを別々に製剤化した場合において、別々に製剤化したものを使用時に希釈剤などを用いて混合して混合物にして後に、該混合物を患者に投与してもよい。(Method of administering therapeutic agent for lung cancer patients combining CUDC-101 and gefitinib)
The method for administering a therapeutic agent for lung cancer patients in which CUDC-101, which is an active ingredient of the present invention, and gefitinib are combined can be exemplified as follows, but is not particularly limited.
(1) Single dose gefitinib: 250 mg
CUDC-101: 75mg / m 2 ~300mg / m 2, preferably 150mg / m 2 ~275mg / m 2 , and most preferably about 275 mg / m 2
(2) Dosing interval Gefitinib: 1-7 times a week, preferably 1-2 times a day, most preferably once a day
CUDC-101: administered 1-5 times for 2 weeks, preferably administered 3-5 times for 2 weeks, most preferably administered 5 times for 2 weeks (3) Combined administration: CUDC-101 and gefitinib are administered simultaneously, with an interval of several hours Any of administration at intervals, administration at intervals of 1 day, administration at intervals of several days may be used.
Alternatively, CUDC-101 and gefitinib may be mixed with physiologically acceptable carriers, excipients, binders and the like to form a pharmaceutical composition, and then the composition may be administered to a patient. Furthermore, when CUDC-101 and gefitinib are separately formulated, the separately formulated products may be mixed with a diluent at the time of use to form a mixture, and then the mixture may be administered to the patient.
（JNJ-26481585及びゲフィチニブを組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与方法）
本発明の有効成分であるJNJ-26481585及びゲフィチニブを組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与方法は、以下を例示することができるが特に限定されない。
（１）１回の投与量
ゲフィチニブ：２５０ｍｇ
JNJ-26481585：２ｍｇ〜１９ｍｇ、好ましくは８ｍｇ〜１２ｍｇ、最も好ましくは約１２ｍｇ
（２）投与間隔
ゲフィチニブ：１週間１〜７回投与、好ましくは２日１〜２回投与、最も好ましくは１日１回投与
JNJ-26481585：１週間２〜４回投与、好ましくは１週間２〜３回投与、最も好ましくは１週間３回投与
（３）併用方法：JNJ-26481585とゲフィチニブは同時投与、数時間の間隔を空けての投与、数日間の間隔を空けての投与、数週間の間隔を空けての投与のいずれでも良い。
また、JNJ-26481585とゲフィチニブを、生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤等などと混合し、医薬組成物にした後に、該組成物を患者に投与してもよい。さらに、JNJ-26481585とゲフィチニブを別々に製剤化した場合において、別々に製剤化したものを使用時に希釈剤などを用いて混合して混合物にして後に、該混合物を患者に投与してもよい。(Method of administering a therapeutic agent for lung cancer patients combining JNJ-26481585 and gefitinib)
Examples of the method for administering a therapeutic agent for lung cancer patients in which JNJ-26481585 and gefitinib, which are the active ingredients of the present invention, are combined are not particularly limited.
(1) Single dose gefitinib: 250 mg
JNJ-26481585: 2 mg to 19 mg, preferably 8 mg to 12 mg, most preferably about 12 mg
(2) Dosing interval Gefitinib: 1-7 times a week, preferably 1-2 times a day, most preferably once a day
JNJ-26481585: administered 2-4 times a week, preferably administered 2-3 times a week, most preferably administered 3 times a week (3) Combination method: JNJ-26481585 and gefitinib are administered simultaneously, with an interval of several hours Any of administration after an interval, administration after an interval of several days, administration after an interval of several weeks may be used.
Further, JNJ-26481585 and gefitinib may be mixed with physiologically acceptable carriers, excipients, binders and the like to form a pharmaceutical composition, and then the composition may be administered to a patient. Further, when JNJ-26481585 and gefitinib are separately formulated, the separately formulated products may be mixed using a diluent or the like at the time of use to form a mixture, and then the mixture may be administered to the patient.
（ベリノスタット及びAZD9291を組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与方法）
本発明の有効成分であるベリノスタット及びAZD9291を組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与方法は、以下を例示することができるが特に限定されない。
（１）１回の投与量
AZD9291：８０ｍｇ
ベリノスタット：１００/ｍｇ２〜２０００/ｍｇ２、好ましくは５００/ｍｇ２〜１２００/ｍｇ２、最も好ましくは約１０００/ｍｇ２
（２）投与間隔
AZD9291：１週間１〜７回投与、好ましくは２日１〜２回投与、最も好ましくは１日１回投与
ベリノスタット：３週間１〜１０回投与、好ましくは３週間１〜５回投与、最も好ましくは３週間５回投与
（３）併用方法：ベリノスタットとAZD9291は同時投与、数時間の間隔を空けての投与、数日間の間隔を空けての投与、数週間の間隔を空けての投与のいずれでも良い。
また、ベリノスタットとAZD9291を、生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤等などと混合し、医薬組成物にした後に、該組成物を患者に投与してもよい。さらに、ベリノスタットとAZD9291を別々に製剤化した場合において、別々に製剤化したものを使用時に希釈剤などを用いて混合して混合物にして後に、該混合物を患者に投与してもよい。(Method of administering a therapeutic agent for lung cancer patients combining Verinostat and AZD9291)
Examples of the method for administering a therapeutic agent for lung cancer patients in combination with belinostat and AZD9291 which are the active ingredients of the present invention can be exemplified below, but are not particularly limited.
(1) One dose
AZD9291: 80mg
Berinostat: 100 / mg 2 to 2000 / mg 2 , preferably 500 / mg 2 to 1200 / mg 2 , most preferably about 1000 / mg 2
(2) Dosing interval
AZD9291: administered 1-7 times per week, preferably administered 1-2 times per day, most preferably administered once per day Berinostat: administered 1-10 times per 3 weeks, preferably 1-5 times per 3 weeks, most preferred Is administered 5 times a week for 3 weeks (3) Combined method: belinostat and AZD9291 administered simultaneously, administered at intervals of several hours, administered at intervals of several days, or administered at intervals of several weeks But it ’s okay.
In addition, verinostat and AZD9291 may be mixed with physiologically acceptable carriers, excipients, binders and the like to form a pharmaceutical composition, and then the composition may be administered to a patient. Furthermore, in the case where belinostat and AZD9291 are separately formulated, the separately formulated products may be mixed with a diluent or the like at the time of use to form a mixture, and then the mixture may be administered to the patient.
（ボリノスタット及びAZD9291を組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与方法）
本発明の有効成分であるボリノスタット及びAZD9291を組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与方法は、以下を例示することができるが特に限定されない。
（１）１回の投与量
AZD9291：８０ｍｇ
ボリノスタット：１００ｍｇ〜４００ｍｇ、好ましくは２００ｍｇ〜４００ｍｇ、最も好ましくは約４００ｍｇ
（２）投与間隔
AZD9291：１週間１〜７回投与、好ましくは２日１〜２回投与、最も好ましくは１日１回投与
ボリノスタット：１週間１〜７回投与、好ましくは１週間３〜７回投与、最も好ましくは１週間７回投与
（３）併用方法：ボリノスタットとAZD9291は同時投与、数時間の間隔を空けての投与、数日間の間隔を空けての投与、数週間の間隔を空けての投与のいずれでも良い。
また、ボリノスタットとAZD9291を、生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤等などと混合し、医薬組成物にした後に、該組成物を患者に投与してもよい。さらに、ボリノスタットとAZD9291を別々に製剤化した場合において、別々に製剤化したものを使用時に希釈剤などを用いて混合して混合物にして後に、該混合物を患者に投与してもよい。(Method of administering a therapeutic agent for lung cancer patients combining vorinostat and AZD9291)
The method for administering a therapeutic agent for lung cancer patients in which vorinostat and AZD9291 which are the active ingredients of the present invention are combined can be exemplified as follows, but is not particularly limited.
(1) One dose
AZD9291: 80mg
Vorinostat: 100 mg to 400 mg, preferably 200 mg to 400 mg, most preferably about 400 mg
(2) Dosing interval
AZD9291: 1-7 times a week, preferably 1-2 times a day, most preferably once a day Vorinostat: 1-7 times a week, preferably 3-7 times a week, most preferably Is administered 7 times a week (3) Combination method: Vorinostat and AZD9291 can be administered simultaneously, administered several hours apart, administered several days apart, or separated several weeks apart But it ’s okay.
In addition, vorinostat and AZD9291 may be mixed with physiologically acceptable carriers, excipients, binders and the like to form a pharmaceutical composition, and then the composition may be administered to a patient. Furthermore, when vorinostat and AZD9291 are separately formulated, the separately formulated products may be mixed with a diluent at the time of use to form a mixture, and then the mixture may be administered to the patient.
（ベリノスタット及びゲフィチニブを組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与方法）
本発明の有効成分であるベリノスタット及びゲフィチニブを組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与方法は、以下を例示することができるが特に限定されない。
（１）１回の投与量
ゲフィチニブ：２５０ｍｇ
ベリノスタット：１００/ｍｇ２〜２０００/ｍｇ２、好ましくは５００/ｍｇ２〜１２００/ｍｇ２、最も好ましくは約１０００/ｍｇ２
（２）投与間隔
ゲフィチニブ：１週間１〜７回投与、好ましくは２日１〜２回投与、最も好ましくは１日１回投与
ベリノスタット：３週間１〜１０回投与、好ましくは３週間１〜５回投与、最も好ましくは３週間５回投与
（３）併用方法：ベリノスタットとゲフィチニブは同時投与、数時間の間隔を空けての投与、数日間の間隔を空けての投与、数週間の間隔を空けての投与のいずれでも良い。
また、ベリノスタットとゲフィチニブを、生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤等などと混合し、医薬組成物にした後に、該組成物を患者に投与してもよい。さらに、ベリノスタットとゲフィチニブを別々に製剤化した場合において、別々に製剤化したものを使用時に希釈剤などを用いて混合して混合物にして後に、該混合物を患者に投与してもよい。(Method of administering a therapeutic agent for lung cancer patients combining berinostat and gefitinib)
Although the following can be illustrated as an administration method of the therapeutic agent for lung cancer patients which combined belinostat and gefitinib which are the active ingredients of this invention, it is not specifically limited.
(1) Single dose gefitinib: 250 mg
Berinostat: 100 / mg 2 to 2000 / mg 2 , preferably 500 / mg 2 to 1200 / mg 2 , most preferably about 1000 / mg 2
(2) Administration interval Gefitinib: 1-7 administrations per week, preferably 1-2 administrations 2 days, most preferably 1 administration per day Berinostat: 1-10 administrations for 3 weeks, preferably 1-5 administrations for 3 weeks Multiple doses, most preferably 3 times 5 weeks (3) Combination method: belinostat and gefitinib administered simultaneously, administered several hours apart, separated several days apart, spaced several weeks apart Any of these administrations may be used.
In addition, verinostat and gefitinib may be mixed with physiologically acceptable carriers, excipients, binders and the like to form a pharmaceutical composition, and then the composition may be administered to a patient. Further, in the case where belinostat and gefitinib are separately formulated, the separately formulated products may be mixed with a diluent at the time of use to form a mixture, and then the mixture may be administered to the patient.
（ベリノスタット及びアファチニブを組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与方法）
本発明の有効成分であるベリノスタット及びアファチニブを組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与方法は、以下を例示することができるが特に限定されない。
（１）１回の投与量
アファチニブ：４０ｍｇ
ベリノスタット：１００/ｍｇ２〜２０００/ｍｇ２、好ましくは５００/ｍｇ２〜１２００/ｍｇ２、最も好ましくは約１０００/ｍｇ２
（２）投与間隔
アファチニブ：１週間１〜７回投与、好ましくは２日１〜２回投与、最も好ましくは１日１回投与
ベリノスタット：３週間１〜１０回投与、好ましくは３週間１〜５回投与、最も好ましくは３週間５回投与
（３）併用方法：ベリノスタットとアファチニブは同時投与、数時間の間隔を空けての投与、数日間の間隔を空けての投与、数週間の間隔を空けての投与のいずれでも良い。
また、ベリノスタットとアファチニブを、生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤等などと混合し、医薬組成物にした後に、該組成物を患者に投与してもよい。さらに、ベリノスタットとアファチニブを別々に製剤化した場合において、別々に製剤化したものを使用時に希釈剤などを用いて混合して混合物にして後に、該混合物を患者に投与してもよい。(Method of administering a therapeutic agent for lung cancer patients combining berinostat and afatinib)
Although the following can be illustrated as an administration method of the therapeutic agent for lung cancer patients which combined belinostat and afatinib which are the active ingredients of this invention, it is not specifically limited.
(1) Single dose afatinib: 40 mg
Berinostat: 100 / mg 2 to 2000 / mg 2 , preferably 500 / mg 2 to 1200 / mg 2 , most preferably about 1000 / mg 2
(2) Administration interval Afatinib: 1 to 7 times a week, preferably 1 to 2 times a day, most preferably 1 time a day Berinostat: 1 to 10 times for 3 weeks, preferably 1 to 3 times for 3 weeks Multiple doses, most preferably 3 times 5 weeks (3) Combination method: belinostat and afatinib administered simultaneously, administered several hours apart, administered several days apart, spaced several weeks apart Any of all administration may be sufficient.
In addition, verinostat and afatinib may be mixed with physiologically acceptable carriers, excipients, binders and the like to form a pharmaceutical composition, and then the composition may be administered to a patient. Further, in the case where belinostat and afatinib are separately formulated, the separately formulated products may be mixed with a diluent at the time of use to form a mixture, and then the mixture may be administered to the patient.
（ボリノスタット及びアファチニブを組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与方法）
本発明の有効成分であるボリノスタット及びアファチニブを組み合わせた肺癌患者用治療剤の投与方法は、以下を例示することができるが特に限定されない。
（１）１回の投与量
アファチニブ：４０ｍｇ
ボリノスタット：１００ｍｇ〜４００ｍｇ、好ましくは２００ｍｇ〜４００ｍｇ、最も好ましくは約４００ｍｇ
（２）投与間隔
アファチニブ：１週間１〜７回投与、好ましくは２日１〜２回投与、最も好ましくは１日１回投与
ボリノスタット：１週間１〜７回投与、好ましくは１週間３〜７回投与、最も好ましくは１週間７回投与
（３）併用方法：ボリノスタットとアファチニブは同時投与、数時間の間隔を空けての投与、数日間の間隔を空けての投与、数週間の間隔を空けての投与のいずれでも良い。
また、ボリノスタットとアファチニブを、生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤等などと混合し、医薬組成物にした後に、該組成物を患者に投与してもよい。さらに、ボリノスタットとアファチニブを別々に製剤化した場合において、別々に製剤化したものを使用時に希釈剤などを用いて混合して混合物にして後に、該混合物を患者に投与してもよい。(Method of administering therapeutic agent for lung cancer patients combining vorinostat and afatinib)
Although the following can be illustrated as an administration method of the therapeutic agent for lung cancer patients which combined the active ingredient of this invention vorinostat and afatinib, it is not specifically limited.
(1) Single dose afatinib: 40 mg
Vorinostat: 100 mg to 400 mg, preferably 200 mg to 400 mg, most preferably about 400 mg
(2) Administration interval Afatinib: 1-7 times a week, preferably 1-2 times a day, most preferably once a day Vorinostat: 1-7 times a week, preferably 3-7 times a week Single dose, most preferably 7 times a week (3) Combined method: Vorinostat and afatinib administered simultaneously, several hours apart, several days apart, weeks apart Any of these administrations may be used.
In addition, vorinostat and afatinib may be mixed with physiologically acceptable carriers, excipients, binders and the like to form a pharmaceutical composition, and then the composition may be administered to a patient. Furthermore, when vorinostat and afatinib are separately formulated, the separately formulated products may be mixed with a diluent at the time of use to form a mixture, and then the mixture may be administered to the patient.
以下に示す実施例及び参考例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。さらに、すべての動物実験は、金沢大学学際科学実験センター及び実験動物研究施設（承認番号AP-081088）のガイドラインにしたがった。 The present invention will be specifically described with reference to the following examples and reference examples, but the present invention is not limited thereto. Furthermore, all animal experiments were in accordance with the guidelines of the Kanazawa University Interdisciplinary Science Experiment Center and the Laboratory Animal Research Facility (approval number AP-081088).
（材料及び方法）
実施例及び参考例で使用した材料及び方法は、以下の通りである。(Materials and methods)
Materials and methods used in Examples and Reference Examples are as follows.
（細胞株と試薬）
EGFR変異のあるNSCLC細胞株PC-9、HCC827及びHCC2279を、それぞれ、Immuno-Biological Laboratories Co.,ltd.（日本国、群馬県、藤岡市）、ATCC（バージニア州、Manassas）及びDr. John Minna（テキサス大学南西医療センター、テキサス州、Dallas）から入手した。
NSCLCである日本人女性患者から樹立したPC-3細胞（EGFRエクソン19欠失あり）をヒューマンサイエンス研究資源バンク（JCRB0077: http://cellbank.nibio.go.jp/~cellbank/en/search_res_det.cgiμDB_NUM=1&ID=252）（日本国、大阪府）から購入した。なお、該細胞は、前立腺癌細胞株PC-3（ATCC CRL1435）とは異なる。
PC-3及び他の３種の細胞株は、それぞれ、10%ウシ胎仔血清（FBS）及び抗生物質を添加したD-MEM及び10%ウシ胎仔血清及び抗生物質を添加したRPMI1640培地で保持した。
すべての細胞を３か月まで継代維持し、その後、凍結させた初期継代ストックから再生させた。
細胞を、MycoAlert Mycoplasma Detectionキット（Lonza社、メーン州、Rockland）を使用して、定期的にマイコプラズマスクリーニングをした。
ボリノスタットは、Selleck Chemicals（テキサス州、Houston）から入手した。
ベリノスタットは、Selleck Chemicalsから入手した。
ゲフィチニブは、AstraZeneca（英国、London）から入手した。
アファチニブは、Selleck Chemicalsから入手した。
AZD9291は、Selleck Chemicalsから入手した。
CUDC-101は、Selleck Chemicals入手した。
JNJ-26481585は、Selleck Chemicalsから入手した。
Droxinostatは、Selleck Chemicalsから入手した。
Entinostatは、Selleck Chemicalsから入手した。(Cell lines and reagents)
NSCLC cell lines PC-9, HCC827, and HCC2279 with EGFR mutation were obtained from Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. (Japan, Gunma Prefecture, Fujioka City), ATCC (Manassas, Virginia) and Dr. John Minna, respectively. (From University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas).
PC-3 cells (with EGFR exon 19 deletion) established from a Japanese female patient with NSCLC were transferred to the Human Science Research Resource Bank (JCRB0077: http://cellbank.nibio.go.jp/~cellbank/en/search_res_det. cgiμDB_NUM = 1 & ID = 252) (Osaka, Japan). The cells are different from prostate cancer cell line PC-3 (ATCC CRL1435).
PC-3 and three other cell lines were maintained in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics and D-MEM and 10% fetal bovine serum and antibiotics, respectively.
All cells were passaged for up to 3 months and then regenerated from frozen initial passage stock.
Cells were periodically screened for mycoplasma using the MycoAlert Mycoplasma Detection kit (Lonza, Rockland, Maine).
Vorinostat was obtained from Selleck Chemicals (Houston, Texas).
Verinostat was obtained from Selleck Chemicals.
Gefitinib was obtained from AstraZeneca (London, UK).
Afatinib was obtained from Selleck Chemicals.
AZD9291 was obtained from Selleck Chemicals.
CUDC-101 was obtained from Selleck Chemicals.
JNJ-26481585 was obtained from Selleck Chemicals.
Droxinostat was obtained from Selleck Chemicals.
Entinostat was obtained from Selleck Chemicals.
（BIMの遺伝子型及び発現解析）
DNeasy Blood & Tissueキット（Qiagen社、ドイツ、Hilden）を使用し、メーカーのプロトコールにしたがってゲノムDNAを細胞から抽出した。RNeasy PLUS Miniキット（Qiagen社）を使用し、全RNAを細胞から抽出した。PCR法によって、試料中のBIM欠失多型及びBIMイソ型の発現レベルを検出した（参照文献：Nat Med 2012;18:521-8）。(BIM genotype and expression analysis)
Genomic DNA was extracted from cells using the DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer's protocol. Total RNA was extracted from the cells using the RNeasy PLUS Mini kit (Qiagen). The expression level of BIM deletion polymorphism and BIM isoform in the sample was detected by PCR method (reference document: Nat Med 2012; 18: 521-8).
（細胞アポトーシス）
細胞（3x103）を96ウェルの白色壁プレートの各ウェルに播種し、一晩培養し、被験化合物又はビヒクル（DMSO）で48時間処理した。
メーカーの説明書に従い、細胞アポトーシスを、Caspase-Glo 3/7アッセイキット（Promega社、ウィスコンシン州、Madison）で測定し、カスパーゼ-3/7活性を、PE-Annexin V Apoptosis Detection Kit（BD Biosciences社、カリフォルニア州、San Jose）で評価した。
MTTアッセイは、公知のキット及び該キットの添付の説明書に従い行った。(Cell apoptosis)
Cells (3 × 10 3 ) were seeded in each well of a 96-well white wall plate, cultured overnight, and treated with test compound or vehicle (DMSO) for 48 hours.
Cell apoptosis was measured with the Caspase-Glo 3/7 assay kit (Promega, Madison, Wis.) According to the manufacturer's instructions, and caspase-3 / 7 activity was measured using the PE-Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences). , San Jose, California).
The MTT assay was performed according to a known kit and instructions attached to the kit.
（RNA干渉）
本発明者らが著者である文献「Cancer Res 2008;68:9479-87」の記載に従い、BIMに対してのDiplexed Stealth RNAi（Invitrogen、カリフォルニア州、Carlsbad）、及びStealth RNAi-negative control low GC Duplex #3（Invitrogen）を使用して、RNA干渉（RNAi）分析を行った。
使用したsiRNA標的配列は、以下の通りである。
BIM #1
5'-CAUGAGUUGUGACAAAUCAACACAA-3'（配列番号１）
5'-UUGUGUUGAUUUGUCACAACUCAUG-3'（配列番号２）
BIM #2
5'-UGAGUGUGACCGAGAAGGUAGACAA-3'（配列番号３）
5'-UUGUCUACCUUCUCGGUCACACUCA-3'（配列番号４）(RNA interference)
Diplexed Stealth RNAi against BIM (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) And Stealth RNAi-negative control low GC Duplex according to the description of the document “Cancer Res 2008; 68: 9479-87” authored by the inventors. RNA interference (RNAi) analysis was performed using # 3 (Invitrogen).
The siRNA target sequences used are as follows.
BIM # 1
5'-CAUGAGUUGUGACAAAUCAACACAA-3 '(SEQ ID NO: 1)
5'-UUGUGUUGAUUUGUCACAACUCAUG-3 '(SEQ ID NO: 2)
BIM # 2
5'-UGAGUGUGACCGAGAAGGUAGACAA-3 '(SEQ ID NO: 3)
5'-UUGUCUACCUUCUCGGUCACACUCA-3 '(SEQ ID NO: 4)
（ウエスタンブロット分析）
ホスホEGFR（Tyr1068）、ヒストンH3、アセチル化ヒストンH3（Lys27）、BIM（Cell Signaling Technology、マサチューセッツ州、Beverly）及びEGFR（R&D Systems、ミネソタ州、Minneapolis）に対する抗体でウエスタンブロッティングを行った。
次に、ブロットを、マウス又はウサギIgGに特異的なHRP共役二次抗体と共に培養し、化学発光の増強（Pierce Biotechnology）によってシグナルを検出した。(Western blot analysis)
Western blotting was performed with antibodies against phospho-EGFR (Tyr1068), histone H3, acetylated histone H3 (Lys27), BIM (Cell Signaling Technology, Beverly, Mass.) And EGFR (R & D Systems, Minneapolis, MN).
The blot was then incubated with an HRP-conjugated secondary antibody specific for mouse or rabbit IgG and the signal was detected by enhanced chemiluminescence (Pierce Biotechnology).
（BIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株はゲフィチニブ誘導型アポトーシスに対して感受性が低いかどうかの確認）
本実施例では、EGFR-TKIの投与がBIM非野生型（BIM欠失多型）を有するEGFR変異NSCLC細胞株に対して有効であるかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。(Check if EGFR mutant NSCLC cell line with BIM deletion polymorphism is less sensitive to gefitinib-induced apoptosis)
In this example, it was confirmed whether EGFR-TKI administration was effective against EGFR mutant NSCLC cell lines having BIM non-wild type (BIM deletion polymorphism). Details are as follows.
PCRによって、EGFR変異NSCLC細胞株のBIM欠失多型を検出した。PC-9及びHCC827は、PCR生成物のサイズが4.2kbである野生型アレルを有していた。HCC2279細胞は、PCR生成物のサイズが4.2kb（野生型）及び1.3 kb（2.9 kb欠失多型）のサイズのBIM欠失多型であるヘテロ接合性であった。EGFR変異を有する7つの他の細胞株（参照：下記表１）において、PC-3はBIM欠失多型であるヘテロ接合性であった（図１Ａ）。
ウエスタンブロット分析は、「プロアポトーシスBIMタンパク質の発現はPC-9及びHCC827細胞内よりもPC-3及びHCC2279細胞内で顕著に低いこと」を明らかにした。
BIMイソ型転写産物の分析は、「BIM多型を有する細胞は、エクソン4含有転写産物よりもエクソン3含有転写産物を多く発現すること」を明らかにした（図２）。
EGFR-TKIであるゲフィチニブ単独投与は、PC-9及びHCC827細胞のカスパーゼ-3/7及びアポトーシスが顕著に活性化した。しかし、ゲフィチニブ単独投与は、PC-3及びHCC2279細胞のカスパーゼ-3/7及びアポトーシスを活性化しなかった（図１Ｂ、図３）。
さらに、ゲフィチニブは、BIM siRNAで処置したPC-9及びHCC827細胞内のカスパーゼ-3/7を増加させなかった（図１Ｃ）。この非増加は、「BIMがEGFR-TKIで処置したEGFR変異NSCLC細胞内のアポトーシス誘導において極めて重要な役割を担っていること」を示すものであった。
以上により、BIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞は、アポトーシス誘導から明らかなように、野生型BIMを有する細胞と比較して、EGFR-TKIであるゲフィチニブ感受性が極めて低いことを確認した。
すなわち、EGFR-TKIの単独投与はBIM非野生型（BIM欠失多型）を有するEGFR変異NSCLC細胞に対して有効でないことを確認した。A BIM deletion polymorphism in the EGFR mutant NSCLC cell line was detected by PCR. PC-9 and HCC827 had a wild type allele with a PCR product size of 4.2 kb. HCC2279 cells were heterozygous with BIM deletion polymorphisms with PCR product sizes of 4.2 kb (wild type) and 1.3 kb (2.9 kb deletion polymorphism). In 7 other cell lines with EGFR mutations (see: Table 1 below), PC-3 was heterozygous, a BIM deletion polymorphism (FIG. 1A).
Western blot analysis revealed that “pro-apoptotic BIM protein expression was significantly lower in PC-3 and HCC2279 cells than in PC-9 and HCC827 cells”.
Analysis of BIM isoform transcripts revealed that “cells with BIM polymorphism express more exon 3 containing transcripts than exon 4 containing transcripts” (FIG. 2).
Administration of EGFR-TKI gefitinib alone significantly activated caspase-3 / 7 and apoptosis of PC-9 and HCC827 cells. However, administration of gefitinib alone did not activate caspase-3 / 7 and apoptosis of PC-3 and HCC2279 cells (FIG. 1B, FIG. 3).
Furthermore, gefitinib did not increase caspase-3 / 7 in PC-9 and HCC827 cells treated with BIM siRNA (FIG. 1C). This non-increase indicated that “BIM plays a very important role in inducing apoptosis in EGFR mutant NSCLC cells treated with EGFR-TKI”.
As described above, it was confirmed that the EGFR mutant NSCLC cells having the BIM deletion polymorphism have extremely low sensitivity to gefitinib, which is EGFR-TKI, as is clear from the induction of apoptosis.
That is, it was confirmed that single administration of EGFR-TKI was not effective against EGFR mutant NSCLC cells having BIM non-wild type (BIM deletion polymorphism).
（HDAC阻害剤がBIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株のBIM発現を促進するかどうかの確認）
本実施例では、各HDAC阻害剤がBIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株（PC-3細胞株）のBIM発現を促進するかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。(Confirmation of whether HDAC inhibitor promotes BIM expression in EGFR mutant NSCLC cell line with BIM deletion polymorphism)
In this example, it was confirmed whether each HDAC inhibitor promotes BIM expression in an EGFR mutant NSCLC cell line (PC-3 cell line) having a BIM deletion polymorphism. Details are as follows.
ボリノスタットに関し、1μMからヒストンのアセチル化及びBIM発現の上昇を確認した（図４ａ）。
CUDC-101に関し、低濃度である0.1μMからヒストンのアセチル化及びBIM発現の上昇を確認した（図４ｂ）。
Droxinostatに関し、いずれの濃度でもヒストンのアセチル化及びBIM発現は誘導できなかった（図４ｃ）。
Entinostatに関し、1μM程度からヒストンのアセチル化及びBIM発現の上昇を確認できた（図４ｄ）。
以上により、CUDC-101は、ボリノスタットと比較して、BIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株のBIM発現を強く誘導することを確認した。Regarding vorinostat, the histone acetylation and the increase in BIM expression were confirmed from 1 μM (FIG. 4 a).
Regarding CUDC-101, histone acetylation and increased BIM expression were confirmed from a low concentration of 0.1 μM (FIG. 4 b).
Regarding Droxinostat, histone acetylation and BIM expression could not be induced at any concentration (FIG. 4c).
Regarding Entinostat, it was confirmed that histone acetylation and BIM expression increased from about 1 μM (FIG. 4d).
From the above, it was confirmed that CUDC-101 strongly induced BIM expression in the EGFR mutant NSCLC cell line having the BIM deletion polymorphism as compared with vorinostat.
（HDAC阻害剤とゲフィチニブの併用投与がBIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株のアポトーシスを誘導するかどうかの確認）
本実施例では、各HDAC阻害剤とゲフィチニブの併用投与がBIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株（PC-3細胞株、HCC2279細胞株）のアポトーシスを誘導するかどうかをcleaved Caspase 3及びcleaved PARPの発現量を基にして確認した。詳細は、以下の通りである。(Confirm whether combined administration of HDAC inhibitor and gefitinib induces apoptosis of EGFR mutant NSCLC cell line with BIM deletion polymorphism)
In this example, whether or not combined administration of each HDAC inhibitor and gefitinib induces apoptosis of EGFR mutant NSCLC cell lines (PC-3 cell line, HCC2279 cell line) having a BIM deletion polymorphism cleaved Caspase 3 and This was confirmed based on the expression level of cleaved PARP. Details are as follows.
各HDAC阻害剤及びゲフィチニブの併用投与がPC-3細胞のアポトーシスを誘導するかどうかの確認結果を図５に示す。
図５（ａ）の結果から明らかなように、JNJ-26481585及びゲフィチニブの併用投与は、ボリノスタット及びゲフィチニブの併用投与と比較して、低濃度（ボリノスタット投与量3μMとJNJ-26481585投与量0.03μM〜0.1μMが同程度）でBIM蛋白質発現を回復させ、さらにBIM遺伝子多型陽性PC-3細胞株のアポトーシス（cleaved PARP及びcleaved caspase-3発現）を誘導した。
図５（ｂ）の結果から明らかなように、EGFRとHDACの両者を阻害するCUDC-101単独投与は、ボリノスタット及びゲフィチニブの併用投与と同程度のアポトーシス（cleaved PARP発現）を誘導した。さらに、CUDC-101及びゲフィチニブの併用投与もアポトーシス（cleaved PARP発現）を誘導していることを確認した。FIG. 5 shows the results of confirming whether combined administration of each HDAC inhibitor and gefitinib induces apoptosis of PC-3 cells.
As is clear from the results of FIG. 5 (a), the combined administration of JNJ-26481585 and gefitinib is lower in concentration than the combined administration of vorinostat and gefitinib (the vorinostat dosage 3 μM and the JNJ-26481585 dosage 0.03 μM to BIM protein expression was recovered at the same level of 0.1 μM, and apoptosis (cleaved PARP and cleaved caspase-3 expression) of the BIM gene polymorphism positive PC-3 cell line was induced.
As is clear from the results of FIG. 5 (b), CUDC-101 alone, which inhibits both EGFR and HDAC, induced apoptosis (cleaved PARP expression) to the same extent as the combined administration of vorinostat and gefitinib. Furthermore, it was confirmed that combined administration of CUDC-101 and gefitinib also induced apoptosis (cleaved PARP expression).
（HDAC阻害剤とゲフィチニブの併用投与がBIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株のアポトーシスを誘導するかどうかの確認）
本実施例では、各HDAC阻害剤とゲフィチニブの併用投与がBIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株（PC-3細胞株、HCC2279細胞株）のアポトーシスを誘導するかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。(Confirm whether combined administration of HDAC inhibitor and gefitinib induces apoptosis of EGFR mutant NSCLC cell line with BIM deletion polymorphism)
In this example, it was confirmed whether combined administration of each HDAC inhibitor and gefitinib induces apoptosis of EGFR mutant NSCLC cell lines (PC-3 cell line, HCC2279 cell line) having a BIM deletion polymorphism. Details are as follows.
各HDAC阻害剤及びゲフィチニブの併用投与がPC-3細胞のアポトーシスを誘導するかどうかの確認結果を図６に示す。
ボリノスタット及びゲフィチニブの併用投与に関し、ボリノスタット投与量3μMで細胞生存率を約０％まで低下させた（図６ａ）。
CUDC-101及びゲフィチニブの併用投与に関し、低濃度であるCUDC-101投与量1μMで細胞生存率を約０％まで低下させた（図６ｂ）。
Droxinostat及びゲフィチニブの併用投与に関し、細胞生存率の変化がなかった（図６ｃ）。
Entinostat及びゲフィチニブの併用投与に関し、わずかに細胞生存率の低下があった（図６ｄ）。
JNJ-26481585及びゲフィチニブの併用投与に関し、低濃度であるJNJ-26481585投与量0.03μMで細胞生存率を約０％まで低下させた（図６ｅ）。FIG. 6 shows the results of confirming whether combined administration of each HDAC inhibitor and gefitinib induces apoptosis of PC-3 cells.
Regarding the combined administration of vorinostat and gefitinib, cell viability was reduced to about 0% at a vorinostat dose of 3 μM (FIG. 6a).
Regarding the combined administration of CUDC-101 and gefitinib, the cell viability was reduced to about 0% at a low concentration of 1 μM CUDC-101 (FIG. 6b).
There was no change in cell viability for the combined administration of Droxinostat and gefitinib (FIG. 6c).
There was a slight decrease in cell viability for the combined administration of Entinostat and gefitinib (FIG. 6d).
Regarding the combined administration of JNJ-26481585 and gefitinib, the cell viability was reduced to about 0% at a low concentration of 0.03 μM JNJ-26481585 (FIG. 6e).
各HDAC阻害剤及びゲフィチニブの併用投与がHCC2279細胞のアポトーシスを誘導するかどうかの確認結果を図７に示す。
ボリノスタット及びゲフィチニブの併用投与に関し、ボリノスタット投与量3μMで細胞生存率を約３０％まで低下させた（図７ａ）。
CUDC-101及びゲフィチニブの併用投与に関し、低濃度であるCUDC-101投与量3μMで細胞生存率を約１０％以下まで低下させた（図７ｂ）。
Droxinostat及びゲフィチニブの併用投与に関し、細胞生存率の変化がなかった（図７ｃ）。
Entinostat及びゲフィチニブの併用投与に関し、わずかに細胞生存率の低下があった（図７ｄ）。
JNJ-26481585及びゲフィチニブの併用投与に関し、低濃度であるJNJ-26481585投与量0.3μMで細胞生存率を約０％まで低下させた（図７ｅ）。FIG. 7 shows the results of confirming whether combined administration of each HDAC inhibitor and gefitinib induces apoptosis of HCC2279 cells.
Regarding the combined administration of vorinostat and gefitinib, cell viability was reduced to about 30% at a vorinostat dose of 3 μM (FIG. 7a).
Regarding the combined administration of CUDC-101 and gefitinib, the cell viability was reduced to about 10% or less at a low concentration of 3 μM of CUDC-101 (FIG. 7b).
There was no change in cell viability for the combined administration of Droxinostat and gefitinib (FIG. 7c).
There was a slight decrease in cell viability for the combined administration of Entinostat and gefitinib (FIG. 7d).
Regarding the combined administration of JNJ-26481585 and gefitinib, the cell viability was reduced to about 0% at a low concentration of 0.3 μM JNJ-26481585 (FIG. 7e).
上記PC-3細胞及びHCC2279細胞のアポトーシス誘導結果より、JNJ-26481585及びゲフィチニブの併用投与並びにCUDC-101及びゲフィチニブの併用投与は、ボリノスタット及びゲフィチニブの併用投与と比較して、アポトーシス誘導作用が強いことを確認した。
特に、JNJ-26481585及びゲフィチニブの併用投与は、CUDC-101及びゲフィチニブの併用投与と比較して、低濃度でアポトーシスを誘導した。
さらに、各HDAC阻害剤のBIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株のBIM発現促進結果は、各HDAC阻害剤とゲフィチニブの併用投与によるBIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株のアポトーシス誘導結果と一致した。
以上により、JNJ-26481585及びゲフィチニブの併用投与並びにCUDC-101及びゲフィチニブの併用投与は、ボリノスタット及びゲフィチニブの併用投与と比較して、BIM多型を有するEGFR変異NSCLC患者の有効な治療方法になることを確認した。すなわち、有効成分であるJNJ-26481585又はCUDC-101を有効成分であるEGFR-TKIと組み合わせた肺癌患者用治療剤は、BIM多型を有するEGFR変異NSCLC患者の優れた肺癌治療剤となる。From the results of apoptosis induction of PC-3 cells and HCC2279 cells, the combined administration of JNJ-26481585 and gefitinib and the combined administration of CUDC-101 and gefitinib have a stronger apoptosis-inducing effect than the combined administration of vorinostat and gefitinib It was confirmed.
In particular, combined administration of JNJ-26481585 and gefitinib induced apoptosis at a lower concentration compared to combined administration of CUDC-101 and gefitinib.
Furthermore, the results of promoting the BIM expression of EGFR mutant NSCLC cell lines with BIM deletion polymorphism of each HDAC inhibitor are the results of apoptosis of EGFR mutant NSCLC cell lines with BIM deletion polymorphism by combined administration of each HDAC inhibitor and gefitinib. Consistent with the induction results.
Based on the above, combined administration of JNJ-26481585 and gefitinib and combined administration of CUDC-101 and gefitinib should be an effective treatment method for EGFR-mutated NSCLC patients with BIM polymorphism compared to combined administration of vorinostat and gefitinib It was confirmed. That is, a therapeutic agent for lung cancer patients in which JNJ-26481585 or CUDC-101 as an active ingredient is combined with EGFR-TKI as an active ingredient is an excellent lung cancer therapeutic agent for EGFR mutant NSCLC patients having the BIM polymorphism.
（BIM非野生型の検出）
BIM非野生型であるBIM多型は、末梢血を使用して検出可能であるかどうかを確認した。(BIM non-wild type detection)
BIM non-wild type BIM polymorphisms were confirmed to be detectable using peripheral blood.
BIM欠失部に隣接するプライマーを使用し、5人の健常ボランティアのPBMC由来DNAをPCR増幅した。増幅して得られたBIMサイズが4.2 kb及び1.3 kbのPCR生成物は、それぞれ、欠失のないアレイ及び欠失のあるアレイに相当した（図８Ａ）。
また、5人の健常ボランティアにおける血清DNAのPCR生成物である362 bp及び284 bpは、それぞれ、野生型（W）及び欠失多型（D）に相当した（図８Ｂ）。
加えて、PBMCの結果と血清の結果は一致したことを確認した。
以上により、本実施例では、利便性があり簡単に利用できるPCRスクリーニング法を適用し、血清中のDNAでBIM多型を容易に検出できることを確認した（図８Ａ、Ｂ）。さらに、BIM多型は生殖細胞系列の変質であることから、どの時点の血清でも検出が可能である。Using primers adjacent to the BIM deletion site, PBMC-derived DNA of 5 healthy volunteers was PCR amplified. PCR products with BIM sizes of 4.2 kb and 1.3 kb obtained by amplification corresponded to an array without deletion and an array with deletion, respectively (FIG. 8A).
In addition, 362 bp and 284 bp, which are PCR products of serum DNA in 5 healthy volunteers, corresponded to the wild type (W) and deletion polymorphism (D), respectively (FIG. 8B).
In addition, it was confirmed that the results of PBMC and serum were consistent.
As described above, in this example, it was confirmed that a convenient and easy-to-use PCR screening method was applied to easily detect BIM polymorphism in DNA in serum (FIGS. 8A and 8B). Furthermore, since BIM polymorphism is a germline alteration, it can be detected in serum at any time.
（ボリノスタット又はベリノスタットと各EGER-TKIの併用投与がBIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株のアポトーシスを誘導するかどうかの確認）
本参考例では、ボリノスタット又はベリノスタットと各EGER-TKIの併用投与がBIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株（PC-3細胞株）のアポトーシスを誘導するかどうかをcleaved Caspase 3及びcleaved PARPの発現量を基にして確認した。詳細は、以下の通りである。(Confirmation whether vorinostat or berinostat and each EGER-TKI administration induces apoptosis of EGFR mutant NSCLC cell line with BIM deletion polymorphism)
In this reference example, cleaved Caspase 3 and cleaved PARP were used to determine whether vorinostat or velinostat combined with each EGER-TKI induces apoptosis in EGFR mutant NSCLC cell line (PC-3 cell line) with BIM deletion polymorphism. This was confirmed based on the expression level. Details are as follows.
PC-9及びPC-3細胞における各EGER-TKIによるアポトーシスの誘導率を図９（Ａ）に示した。
図９（Ａ）から明らかなように、EGER-TKIであるゲフィチニブ、アファチニブおよびAZD9291は、投与量１μＭで、実施例２において野生型アレルを示したPC-9細胞のアポトーシスの誘導を顕著に増加した。対して、実施例２においてBIM欠失多型であるヘテロ接合性を示したPC-3については、いずれのEGER-TKIによってもアポトーシスの誘導を増加しなかった。
ボリノスタット又はベリノスタット並びに各EGER-TKIの併用投与がPC-3細胞のアポトーシスを誘導するかどうかの確認結果を図９（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。
図９（Ｂ）の結果から明らかなように、ゲフィチニブ、アファチニブ又はAZD9291並びにボリノスタットの併用投与は、BIM遺伝子多型陽性PC-3細胞株のアポトーシス（cleaved PARP及びcleaved caspase-3発現）を誘導した。
同様に、図９（Ｃ）の結果から明らかなように、ゲフィチニブ、アファチニブ又はAZD9291並びにベリノスタットの併用投与は、PC-3細胞株のアポトーシスを誘導した。The induction rate of apoptosis by each EGER-TKI in PC-9 and PC-3 cells is shown in FIG.
As is clear from FIG. 9 (A), the EGER-TKIs gefitinib, afatinib and AZD9291 markedly increased the induction of apoptosis in PC-9 cells, which showed a wild type allele in Example 2, at a dose of 1 μM. did. On the other hand, in PC-2 which showed heterozygosity which is a BIM deletion polymorphism in Example 2, the induction of apoptosis was not increased by any EGER-TKI.
The results of confirming whether vorinostat or belinostat and combined administration of each EGER-TKI induce apoptosis of PC-3 cells are shown in FIGS. 9 (B) and (C).
As is clear from the results in FIG. 9B, combined administration of gefitinib, afatinib or AZD9291 and vorinostat induced apoptosis (cleaved PARP and cleaved caspase-3 expression) of the BIM gene polymorphism positive PC-3 cell line. .
Similarly, as is clear from the results in FIG. 9C, gefitinib, afatinib or AZD9291 and velinostat combined administration induced apoptosis of the PC-3 cell line.
（ボリノスタット又はベリノスタットとゲフィチニブ、アファチニブ又はAZD9291の併用投与がBIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株のアポトーシスを誘導するかどうかの確認）
本参考例では、実施例５と同様な方法により、ボリノスタット又はベリノスタットとゲフィチニブ、アファチニブ又はAZD9291の併用投与がBIM欠失多型を有するEGFR変異NSCLC細胞株（PC-3細胞株）のアポトーシスを誘導するかどうかを確認した（参照：図１０）。(Confirm whether vorinostat or belinostat and gefitinib, afatinib or AZD9291 combined administration induces apoptosis in EGFR mutant NSCLC cell lines with BIM deletion polymorphism)
In this reference example, the administration of vorinostat or belinostat and gefitinib, afatinib, or AZD9291 in the same manner as in Example 5 induces apoptosis of EGFR mutant NSCLC cell line (PC-3 cell line) having BIM deletion polymorphism It was confirmed whether or not (see: FIG. 10).
ベリノスタットとAZD9291の併用投与、ボリノスタットとAZD9291の併用投与、ベリノスタットとアファチニブの併用投与、並びにボリノスタットとアファチニブの併用投与は、細胞生存率を顕著に低下させた。 Combined administration of belinostat and AZD9291, vorinostat and AZD9291, concomitant administration of belinostat and afatinib, and concomitant administration of vorinostat and afatinib significantly reduced cell viability.
（総論）
実施例２では、上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤（EGFR-TKI）の単独投与治療方法はBIM非野生型（BIM欠失多型）を有するEGFR変異NSCLC患者に対して有効でないことを確認した。
実施例３−５では、JNJ-26481585及びゲフィチニブを併用した治療方法並びにCUDC-101及びゲフィチニブを併用した治療方法が、BIMタンパク質の発現を修復し、アポトーシスを誘導し、ゲフィチニブ耐性を解消することができた。
実施例６では、BIM多型は、サンプルの由来に影響しないことを確認した。
参考例１−２では、ベリノスタット及びAZD9291を併用した治療方法、ボリノスタット及びAZD9291を併用した治療方法、ベリノスタット及びゲフィチニブを併用した治療方法、ベリノスタット及びアファチニブを併用した治療方法並びにボリノスタット及びアファチニブを併用した治療方法が、BIMタンパク質の発現を修復し、アポトーシスを誘導し、ゲフィチニブ耐性、アファチニブ耐性又はAZD9291耐性を解消することができた。
以上により、すべての実施例及び参考例の結果として、EGFR変異NSCLC患者の最適な治療剤及び肺癌患者治療の有効性の予測検査方法を提供することができる。(General)
In Example 2, the single-dose treatment method of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) is not effective for EGFR mutant NSCLC patients with BIM non-wild type (BIM deletion polymorphism) confirmed.
In Example 3-5, the therapeutic method using JNJ-26481585 and gefitinib in combination and the therapeutic method using CUDC-101 and gefitinib together can restore the expression of BIM protein, induce apoptosis, and eliminate gefitinib resistance. did it.
In Example 6, it was confirmed that the BIM polymorphism does not affect the origin of the sample.
In Reference Example 1-2, a treatment method using velinostat and AZD9291, a treatment method using vorinostat and AZD9291, a treatment method using velinostat and gefitinib, a treatment method using velinostat and afatinib, and a treatment using vorinostat and afatinib The method was able to repair BIM protein expression, induce apoptosis, and resolve gefitinib resistance, afatinib resistance or AZD9291 resistance.
As described above, as a result of all Examples and Reference Examples, it is possible to provide an optimal therapeutic agent for EGFR mutant NSCLC patients and a method for predicting the effectiveness of treatment for lung cancer patients.
肺癌患者、特にEGFR変異NSCLC患者の最適な治療剤及び肺癌患者治療の有効性の予測検査方法を提供することができる。 It is possible to provide an optimal therapeutic agent for lung cancer patients, particularly EGFR-mutated NSCLC patients, and a method for predicting the effectiveness of treatment for lung cancer patients.
Claims (10)
A therapeutic agent for lung cancer patients, comprising combining JNJ-26481585 and / or CUDC-101 as an active ingredient with a tyrosine kinase inhibitor of an epidermal growth factor receptor as an active ingredient.
The therapeutic agent for lung cancer patients according to claim 1, wherein the lung cancer patient has a non-wild type of BIM.
The therapeutic agent for lung cancer patients according to claim 1 or 2, wherein the lung cancer patient is a non-small cell lung cancer patient having resistance to a tyrosine kinase inhibitor of an epidermal growth factor receptor.
The therapeutic agent for lung cancer patients according to any one of claims 1 to 3, wherein JNJ-26481585 is combined with gefitinib which is a tyrosine kinase inhibitor of an epidermal growth factor receptor.
The therapeutic agent for lung cancer patients according to any one of claims 1 to 3, wherein CUDC-101 is combined with gefitinib which is a tyrosine kinase inhibitor of an epidermal growth factor receptor.
（１）BIM遺伝子の第2イントロンの部分欠失
（２）BIM-γ
（３）mRNA転写産物のエクソン3対エクソン4比が1以上
The therapeutic agent for lung cancer patients according to any one of claims 2 to 5, wherein the non-wild type is any one of the following.
(1) Partial deletion of the second intron of the BIM gene (2) BIM-γ
(3) Exon 3 to exon 4 ratio of mRNA transcript is 1 or more
（１）肺癌患者から取得したサンプル中のBIMが野生型であるか非野生型であるかを判定する工程
（２）非野生型の場合には、JNJ-26481585及び／又はCUDC-101を上皮成長因子受容体のチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせた併用投与が有効であると判定する工程
A method for predicting the effectiveness of treatment for lung cancer patients, comprising the following steps.
(1) A step of determining whether BIM in a sample obtained from a lung cancer patient is a wild type or a non-wild type (2) In the case of a non-wild type, JNJ-26481585 and / or CUDC-101 is epithelial A step of determining that a combined administration in combination with a tyrosine kinase inhibitor of a growth factor receptor is effective
（１）BIM遺伝子の第2イントロンの部分欠失
（２）BIM-γ
（３）mRNA転写産物のエクソン3対エクソン4比が1以上
The prediction test method according to claim 7, wherein the non-wild type includes detecting any one of the following.
(1) Partial deletion of the second intron of the BIM gene (2) BIM-γ
(3) Exon 3 to exon 4 ratio of mRNA transcript is 1 or more
The predictive test method according to claim 7 or 8, wherein the lung cancer patient is a non-small cell lung cancer patient having resistance to a tyrosine kinase inhibitor of an epidermal growth factor receptor.
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