JPWO2015194663A1 - Sensor chip for surface plasmon resonance excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS), SPFS measurement method, and kit for SPFS - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＳＰＦＳにおいてセンサー部に補足された測定対象物質を標識する蛍光物質の褪色を防止し、好ましくはさらにセンサー部に固定された捕捉物質の劣化を防止する手段を提供することを課題とする。本発明に係る測定法は、誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に形成された、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域とを有するセンサーチップを使用した表面プラズモン共鳴励起増強分光に基づく測定法であって、前記捕捉物質に捕捉された測定対象物質に結合した蛍光標識剤の近傍に、褪色防止剤を存在する状態で励起光を照射して蛍光を測定する工程を含む。It is an object of the present invention to provide a means for preventing fading of a fluorescent substance that labels a measurement target substance captured in a sensor unit in SPFS, and preferably further preventing deterioration of a capture substance fixed to the sensor unit. To do. The measurement method according to the present invention specifically captures a dielectric member, a metal thin film formed on the main surface of the dielectric member, and a substance to be measured formed on a part of the metal thin film. A measurement method based on surface plasmon resonance excitation enhanced spectroscopy using a sensor chip having a region to which a capture substance is fixed, and in the vicinity of a fluorescent labeling agent bound to the measurement target substance captured by the capture substance, Irradiating excitation light in the presence of the inhibitor to measure fluorescence.
Description
本発明は、表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）に係るセンサーチップおよび測定方法に関する。更に詳しくは、本発明は、測定対象物質を標識する蛍光物質の褪色防止や、センサーチップの表面に固定化されている捕捉物質の劣化防止を目的とする、ＳＰＦＳに係るセンサーチップおよび測定方法に関する。 The present invention relates to a sensor chip and a measurement method according to surface plasmon resonance excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS). More specifically, the present invention relates to a sensor chip and a measuring method according to SPFS for the purpose of preventing fading of a fluorescent substance that labels a measurement target substance and preventing deterioration of a capture substance immobilized on the surface of the sensor chip. .
ヒトや動物の血液、尿、その他の生体試料中に含まれる腫瘍マーカー、特定のタンパク質や核酸、その他の生体関連物質を検出、定量することは、今日の医療分野における診断や生物、生化学の分野における研究において広く行われている。そして、生体試料中に含まれる微量の生体関連物質を高感度に測定する方法として、表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光（ＳＰＦＳ：Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）に基づく測定法（以下、「ＳＰＦＳ測定法」と称する。）が知られている。 Detecting and quantifying tumor markers, specific proteins and nucleic acids, and other biological substances in human and animal blood, urine, and other biological samples is a diagnostic, biological, and biochemical approach in today's medical field. Widely used in research in the field. As a method for measuring a very small amount of a biological substance contained in a biological sample with high sensitivity, a measurement method based on surface plasmon resonance enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) (hereinafter referred to as “SPFS measurement”). Known as “the law”).
ＳＰＦＳ測定法では、光源より照射したレーザー光等の励起光が、金属薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ；attenuated total reflectance）する条件において、金属薄膜表面に表面プラズモン（粗密波）を発生させる。その結果、光源より照射した励起光が有するフォトン量が数十倍〜数百倍に増加され、表面プラズモン光の電場増強効果が得られる。そして、ＳＰＦＳ測定法では、金属薄膜の表面近傍に捕捉した測定対象化合物と結合した蛍光物質を、この電場増強効果により効率良く励起させ、発生する蛍光発光を観察することによって、極めて微量の測定対象化合物も測定可能となる。 In the SPFS measurement method, surface plasmons (dense waves) are generated on the surface of the metal thin film under conditions where excitation light such as laser light emitted from a light source is attenuated by total reflection (ATR) on the surface of the metal thin film. As a result, the amount of photons contained in the excitation light irradiated from the light source is increased to several tens to several hundred times, and the electric field enhancement effect of the surface plasmon light is obtained. In the SPFS measurement method, a fluorescent substance bonded to a measurement target compound captured in the vicinity of the surface of the metal thin film is efficiently excited by this electric field enhancement effect, and the generated fluorescent emission is observed, whereby a very small amount of measurement target is measured. Compounds can also be measured.
表面プラズモン共鳴励起増強蛍光測定法を実施するための装置（以下、「ＳＰＦＳ装置」と称する。）の概略構成の一例を図１に示す。ＳＰＦＳ装置１００は、センサーチップ装填部１１１を備えており、このセンサーチップ装填部１１１に、センサーチップ１１０が装填されるように構成されている。
An example of a schematic configuration of an apparatus (hereinafter, referred to as “SPFS apparatus”) for carrying out a surface plasmon resonance excitation enhanced fluorescence measurement method is shown in FIG. The
図１の例では、センサーチップ１１０は、誘電体部材１１２と、誘電体部材１１２の主面１１２ａ上に形成された金属薄膜１１３と、金属薄膜１１３上の微細流路１１７の所定位置に形成されたセンサー部１１６を有している。センサー部１１６は、測定対象物質を捕捉する物質（以下、捕捉物質ともいう）が固定化された領域である。微細流路１１７は、薄層部材１１４と蓋部材１１５によって、誘電体部材１１２の主面１１２ａに金属薄膜１１３を介して形成されている。
In the example of FIG. 1, the
ＳＰＦＳ装置１００のセンサーチップ装填部１１１に装填されたセンサーチップ１１０の誘電体部材１１２側には、誘電体部材１１２の入射面１１２ｉから入射され、金属薄膜１１３において全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる所定の入射角θでセンサー部１１６に向かう励起光１２１を照射する光源１２０を備えるとともに、さらに光源１２０から照射された励起光１２１が金属薄膜１１３で反射した反射光１２２を受光する受光手段１２３が備えられている。また、センサーチップ１１０の上方には、センサー部１１６に捕捉された測定対象物質を標識する蛍光物質が発する蛍光１３１を受光する光検出手段１３０が設けられている。
The
センサーチップ１１０と光検出手段１３０との間には、蛍光１３１を効率良く集光するための集光部材１２６と、蛍光１３１以外の光を除去して蛍光１３１のみを選択的に透過する波長選択機能部材１３３が設けられている。
Between the
このようなＳＰＦＳ装置１００は、使用例は次の通りである。
Such an
先ず、センサー部１１６に微細流路１１７を通して測定対象物質を含有する検体液（測定試料）を流入させ、測定対象物質をセンサー部１１６に固定された捕捉物質に捕捉する。次いで、測定対象物質を蛍光標識する物質（例えば、蛍光標識化２次抗体）（以下、蛍光標識物質ともいう）を、同様に微細流路１１７を通して流入させることで、センサー部１１６に蛍光物質で標識された測定対象物質が捕捉された状態とする。
First, a sample liquid (measurement sample) containing a measurement target substance is caused to flow into the
そして、この状態で光源１２０より誘電体部材１１２を介して、金属薄膜１１３において全反射減衰が生じる所定の入射角θで励起光１２１を照射することで、エバネッセント波と金属薄膜１１３からの表面プラズモンとの共鳴によって増強された電場が発生し、それによりセンサー部１１６に捕捉された測定対象物質を標識する蛍光物質による蛍光１３１を効率良く励起させる。この励起された蛍光１３１を光検出手段１３０で検出することで、極めて微量の測定対象物質でも検出・定量が可能である。
In this state, the evanescent wave and the surface plasmon from the metal
このようにして実施されるＳＰＦＳ測定法においては、極めて強い励起光が蛍光物質に照射されることになるが、高強度の励起光を照射すると蛍光物質は劣化する。そのため、励起光の照射を開始してから蛍光の測定を行うまでの比較的短い時間の間にも、蛍光物質の劣化が進行し、蛍光物質で標識された測定対象物質の定量結果に影響を与えるおそれがある。 In the SPFS measurement method performed in this way, extremely strong excitation light is irradiated to the fluorescent material, but the fluorescent material deteriorates when irradiated with high-intensity excitation light. For this reason, even during the relatively short time from the start of excitation light irradiation to the measurement of fluorescence, the deterioration of the fluorescent material progresses, affecting the quantitative results of the measurement target substance labeled with the fluorescent material. There is a risk of giving.
ＳＰＦＳ測定法とは異なる系に関して、たとえば特許文献１（国際公開ＷＯ２０１３／１４７０８１）には、病理切片を免疫染色してその蛍光染色像を観察する際に、染色された病理切片を永久標本にするための封入剤に褪色防止剤を配合することにより、蛍光物質の耐光性能を向上させて褪色を防止する方法が開示されている。しかしながら特許文献１には、センサーチップの表面において捕捉物質の固定、測定対象物質の捕捉、蛍光標識化２次抗体の結合などの処理が行われる、ＳＰＦＳ測定系における蛍光物質の褪色防止方法については記載されていない。
Regarding a system different from the SPFS measurement method, for example, in Patent Document 1 (International Publication WO2013 / 147081), when a pathological section is immunostained and a fluorescent stained image is observed, the stained pathological section is used as a permanent specimen. A method for preventing fading by improving the light resistance of a fluorescent material by blending an anti-fading agent into the encapsulant for the purpose is disclosed. However,
一方、ＳＰＦＳ測定法に関しては、たとえば特許文献２（国際公開ＷＯ２０１１／１１１７６４）には、捕捉物質（抗体等）が固定化されたセンサーチップの表面をブロッキング剤（ＢＳＡ等の非特異的吸着タンパク質）とともに糖類を含有する溶液で処理することにより、その捕捉物質の保存性を高める方法が記載されており、特許文献３（特開２０１２−１６８１６５号公報）には、カルボキシメチルデキストラン等の親水性高分子層に捕捉物質を担持させたセンサーチップの表面を、尿素等の保湿剤を含有する溶液で処理することにより、捕捉物質と測定対象物質の相互作用（抗原抗体反応）を促進し、測定感度（Ｓ／Ｎ比）を向上させる方法が記載されている。また特許文献４（国際公開ＷＯ２０１３／０４２６０３）には、カルボキシメチルデキストランを含有する溶液で検体を希釈することにより、検体中の夾雑物による非特異的吸着を抑制し、ＳＰＦＳ測定法により測定される蛍光に対するノイズを抑制する方法が記載されている。しかしながら、褪色防止を目的としたＳＰＦＳ用センサーチップの表面処理方法や褪色防止も行えるＳＰＦＳ測定法はこれまで提案されていなかった。 On the other hand, with respect to the SPFS measurement method, for example, in Patent Document 2 (International Publication WO2011 / 111176), a blocking agent (nonspecific adsorption protein such as BSA) is applied to the surface of a sensor chip on which a capture substance (antibody or the like) is immobilized. In addition, a method for improving the preservability of the trapping substance by treating with a solution containing a saccharide is described. Patent Document 3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2012-168165) describes a highly hydrophilic substance such as carboxymethyldextran. By treating the surface of the sensor chip with a capture substance in the molecular layer with a solution containing a moisturizing agent such as urea, the interaction between the capture substance and the measurement target substance (antigen-antibody reaction) is promoted, and the measurement sensitivity A method for improving (S / N ratio) is described. In Patent Document 4 (International Publication WO2013 / 042603), the specimen is diluted with a solution containing carboxymethyldextran to suppress non-specific adsorption by contaminants in the specimen, and is measured by the SPFS measurement method. A method for suppressing noise relative to fluorescence is described. However, the surface treatment method of the SPFS sensor chip for the purpose of preventing discoloration and the SPFS measurement method capable of preventing discoloration have not been proposed so far.
実際の測定対象物質のシグナル測定においては、蛍光物質に励起光を照射し、蛍光物質で標識された測定対象物質のシグナルを測定する前に、センサー部に向かって励起光を照射し、センサーチップ上の金属薄膜において全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる所定の入射角を調べてから、シグナル測定を行っている。つまり、１回の測定において、複数回（少なくとも２回）励起光を照射しており、複数回励起光の照射を行うことで、蛍光物質の劣化が進行し、蛍光物質で標識された測定対象物質のシグナルに影響を与える恐れがあった。 In the actual signal measurement of the target substance, the excitation light is irradiated to the fluorescent substance, and the sensor chip is irradiated with the excitation light before measuring the signal of the target substance labeled with the fluorescent substance. The signal is measured after checking a predetermined incident angle at which total reflection attenuation (ATR) occurs in the upper metal thin film. In other words, in one measurement, the excitation light is irradiated a plurality of times (at least twice), and the irradiation of the excitation light a plurality of times causes the deterioration of the fluorescent material, and the measurement target labeled with the fluorescent material. There was a risk of affecting the signal of the substance.
一方、臨床検査などにおいて、検体中のタンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出する際には、測定対象物質が存在しないにもかかわらず、検出値が陽性を示すことがある。これは検体中に含まれる測定対象物質以外の物質が、センサーチップに非特異的に吸着され、シグナルとして検出されるためであった。一般的に、測定対象物質との特異的結合による解離速度の大きさは、測定対象物質以外の物質との非特異的吸着による解離速度の大きさとは異なり、時間経過によって後者の解離が速く進むことが知られている。そこで、測定対象物質と蛍光物質を反応させてから、初めにＳＰＦＳの測定で得られたシグナルを第１シグナル、ある程度の時間が経過した後に再度測定を行い、得られたシグナルを第２シグナルとし、シグナルの減少率を比較することで、検出された第１シグナル（測定対象物質）を高感度かつ定量的に検出する方法が考えられる。このような場合にも、複数回励起光の照射を行う必要があるので、蛍光物質の劣化が進行しやすく、測定対象物質のシグナルに影響を与える恐れがあった。 On the other hand, when detecting a small amount of a substance to be detected such as protein or DNA in a sample with high sensitivity in a clinical test or the like, the detection value is positive even though the measurement target substance does not exist. Sometimes. This is because substances other than the measurement target substance contained in the specimen are adsorbed nonspecifically on the sensor chip and detected as signals. In general, the dissociation rate due to specific binding to the measurement target substance is different from the dissociation rate due to non-specific adsorption with substances other than the measurement target substance, and the latter dissociation progresses with time. It is known. Therefore, after reacting the substance to be measured and the fluorescent substance, the signal obtained by the SPFS measurement is first measured as the first signal, the measurement is performed again after a certain amount of time has passed, and the obtained signal is designated as the second signal. A method of detecting the detected first signal (measurement target substance) highly sensitively and quantitatively by comparing the signal decrease rates is conceivable. Even in such a case, since it is necessary to irradiate the excitation light a plurality of times, the deterioration of the fluorescent material is likely to proceed, which may affect the signal of the measurement target material.
本発明は、上記のように励起光を複数回照射するといった過酷な状況下においても、ＳＰＦＳ測定法においてセンサー部に補足された測定対象物質を標識する蛍光物質の褪色を防止することができ、好ましくはさらにセンサー部に固定された捕捉物質の劣化を防止する手段を提供することを課題とする。 The present invention can prevent the fading of the fluorescent substance that labels the measurement target substance captured by the sensor unit in the SPFS measurement method even under a severe situation in which the excitation light is irradiated a plurality of times as described above. Preferably, another object is to provide means for preventing deterioration of the trapping substance fixed to the sensor unit.
本発明者らは、ＳＰＦＳ用のセンサーチップの製造時、またはセンサーチップを用いたＳＰＦＳの測定時に、蛍光物質の褪色防止剤を含有する溶液を利用することにより、蛍光強度の測定時に蛍光物質の褪色を防止して測定値を安定化できることを見出した。特に、センサーチップの製造時に褪色防止剤として抗酸化剤を用いた場合、蛍光物質の褪色を防止できるのみならず、センサーチップの表面に固定されている捕捉物質の劣化も防止して、測定対象物質との反応性を向上させることもできることも見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors use a solution containing an anti-fading agent for a fluorescent substance at the time of manufacturing a sensor chip for SPFS or measuring SPFS using the sensor chip. It was found that the measured value can be stabilized by preventing fading. In particular, when an antioxidant is used as an anti-fading agent during the manufacture of a sensor chip, not only can the fluorescent material be prevented from fading, but also the degradation of the captured substance fixed on the surface of the sensor chip can be prevented. It has also been found that the reactivity with a substance can be improved, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は一つの側面において、誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に形成された、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域とを有する、表面プラズモン共鳴励起増強分光に基づく測定法のためのセンサーチップであって、前記捕捉物質が固定された領域に対して、褪色防止剤を含有する溶液を接触させることによる褪色防止処理が行われている、ＳＰＦＳ用センサーチップを提供する。 That is, according to one aspect of the present invention, a dielectric member, a metal thin film formed on a main surface of the dielectric member, and a substance to be measured formed on a part of the metal thin film are specifically specified. A sensor chip for a measurement method based on surface plasmon resonance excitation enhanced spectroscopy, which has a region where a capture substance to be captured is fixed, and contains an anti-fading agent for the region where the capture substance is fixed Provided is a sensor chip for SPFS which is subjected to anti-fading treatment by bringing a solution into contact therewith.
また、本発明はもう一つの側面において、誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に形成された、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域とを有するセンサーチップを使用した表面プラズモン共鳴励起増強分光に基づく測定法であって、前記捕捉物質に捕捉された測定対象物質に結合した蛍光標識剤の近傍に、褪色防止剤を存在する状態で励起光を照射して蛍光を測定する工程を含む、ＳＰＦＳ測定法を提供する。 According to another aspect of the present invention, a dielectric member, a metal thin film formed on a main surface of the dielectric member, and a substance to be measured formed on a part of the metal thin film are specified. A measurement method based on surface plasmon resonance excitation enhanced spectroscopy using a sensor chip having a region to which a capture substance to be captured is fixed, in the vicinity of a fluorescent labeling agent bound to the measurement target substance captured by the capture substance And an SPFS measurement method including a step of measuring fluorescence by irradiating excitation light in the presence of an antifading agent.
本発明はさらなる側面において、誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に形成された、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域とを有する、表面プラズモン共鳴励起増強分光に基づく測定法のためのセンサーチップであって、前記捕捉物質が固定された領域に対して、褪色防止剤を含有する溶液を接触させることによる褪色防止処理が行われているものを少なくとも含むキットを提供する。さらに、誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に形成された、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域とを有する、表面プラズモン共鳴励起増強分光に基づく測定法のためのセンサーチップ、ならびに褪色防止処理液またはそれを調製するための褪色防止剤および溶媒を少なくとも含むキットを提供する。 In a further aspect, the present invention provides a dielectric member, a metal thin film formed on a main surface of the dielectric member, and a capture specifically capturing a measurement target substance formed on a part of the metal thin film. A sensor chip for a measurement method based on surface plasmon resonance excitation enhanced spectroscopy, having a region to which a substance is fixed, and contacting a solution containing an anti-fading agent to the region to which the capture substance is fixed Provided is a kit including at least one that has undergone fading prevention treatment. Furthermore, the dielectric member, the metal thin film formed on the main surface of the dielectric member, and the capture substance that specifically captures the measurement target substance formed on a part of the metal thin film are fixed. And a sensor chip for a measurement method based on surface plasmon resonance excitation enhanced spectroscopy, and a kit containing at least an anti-fading solution or an anti-fading agent and a solvent for preparing the same.
本発明のセンサーチップ、測定法およびキットを使用することにより、蛍光物質の褪色を防止して蛍光強度の測定値を安定化し、好ましくはセンサー部に固定された捕捉物質の劣化を防止して測定対象物質との結合性を保持することができ、測定対象物質の定量性に対する信頼性を高めることができる。また、そのようなセンサーチップの作製方法や、同等の作用効果が奏されるＳＰＦＳの測定方法は、従来のセンサーチップの作製やＳＰＦＳの測定と同様のシステムを用いて、効率的に実施することができる。特に、本発明による褪色防止の効果は優れているので、複数回励起光を照射しても、また励起光の出力が高くても、蛍光物質の褪色が生じにくく、蛍光強度の測定値を安定化し、測定対象物質の定量性に対する信頼性を高めることができる。 By using the sensor chip, measurement method and kit of the present invention, the fluorescent substance is prevented from fading and the fluorescence intensity measurement value is stabilized, and preferably the measurement is performed by preventing the capture substance fixed on the sensor part from being deteriorated. The binding property with the target substance can be maintained, and the reliability with respect to the quantitativeness of the measurement target substance can be increased. In addition, such a sensor chip fabrication method and an SPFS measurement method with the same effects can be efficiently performed using the same system as the conventional sensor chip fabrication and SPFS measurement. Can do. In particular, the anti-fading effect of the present invention is excellent, so that even if the excitation light is irradiated multiple times or the output of the excitation light is high, the fluorescent material is not easily faded and the measured value of the fluorescence intensity is stable. It is possible to improve the reliability with respect to the quantitativeness of the measurement target substance.
− センサーチップ −
本発明のＳＰＦＳ用センサーチップは、誘電体部材と、前記誘電体部材の主面上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上の一部に形成された、測定対象物質を特異的に捕捉する捕捉物質が固定された領域（以下「センサー部」と称する。）とを有する、表面プラズモン共鳴励起増強分光測定に基づく測定法（ＳＰＦＳ測定法）のためのセンサーチップであって、前記捕捉物質が固定された領域を含む領域に褪色防止剤を含有する溶液（以下「褪色防止処理液」と称する。）を接触させることによる褪色防止処理が行われているものである。以下、そのような本発明のセンサーチップについて、本発明の実施形態を例示する図２〜４を参照しながら詳細に説明する。− Sensor chip −
The SPFS sensor chip of the present invention specifically captures a dielectric member, a metal thin film formed on the main surface of the dielectric member, and a substance to be measured formed on a part of the metal thin film. A sensor chip for a measurement method (SPFS measurement method) based on surface plasmon resonance excitation enhanced spectroscopy measurement, having a region (hereinafter referred to as “sensor portion”) to which the capture material to be immobilized is fixed. The anti-fading treatment is carried out by bringing a solution containing the anti-fading agent (hereinafter referred to as “fading prevention treatment liquid”) into contact with the region including the region where is fixed. Hereinafter, such a sensor chip of the present invention will be described in detail with reference to FIGS. 2 to 4 illustrating an embodiment of the present invention.
図２は、センサー部を１個有するセンサーチップの例である。図３は、図２に示したようなセンサー部を１個有するセンサーチップを用いて、その上部に流路を形成した場合の例である。図４は、センサー部を３個有するセンサーチップの例である。なお、図４に示したようなセンサー部を複数有するセンサーチップを用いる場合も、図３と同様に、上部に流路を形成することができる。 FIG. 2 is an example of a sensor chip having one sensor unit. FIG. 3 shows an example of using a sensor chip having one sensor unit as shown in FIG. FIG. 4 is an example of a sensor chip having three sensor portions. In the case where a sensor chip having a plurality of sensor portions as shown in FIG. 4 is used, a channel can be formed in the upper portion as in FIG.
図２及び図４に示すように、センサーチップ２００は、誘電体部材２０１と、誘電体部材２０１の主面２０１ａ上に形成された金属薄膜２０２と、金属薄膜２０２上に設けられたセンサー部２０３とを有する。金属薄膜２０２上の全ての領域をセンサー部にする必要はなく、金属薄膜２０２上の一部の領域に一個または複数個のセンサー部を形成すればよい。センサー部２０３を含む領域に対して褪色防止処理液による褪色防止処理が施されていればよく、金属薄膜２０２上の全ての領域に対して褪色防止処理を行う必要はない。
As shown in FIG. 2 and FIG. 4, the
また、図３に示すように、センサー部２０３が形成されている金属薄膜２０２上に薄層部材２０４を設置し、薄層部材２０４上に蓋部材２０５を設置することにより、測定試料等が流れる流路２０６を形成することができる。測定試料等は、ピペット等を用いて、流入・排出口２０７から流路２０６に導入し、導入された測定試料は液溜部２０８に溜るようになっている。薄層部材２０４の材質は、例えばアクリル性粘着シートであり、その厚さは目的の流路の高さに応じて決めればよく、例えば２０〜１０００μｍである。蓋部材２０５の材質は、例えば後述する誘電体部材と同様の樹脂材料である。流入・排出口２０７及び液溜部２０８の形状は、流入・排出口２０７でピペット等により測定試料を数回繰り返し吸引、注入することにより、液溜部２０８に溜った測定試料が撹拌されやすいように、適宜設定することができる。
In addition, as shown in FIG. 3, a measurement sample or the like flows by installing a
なお、センサーチップ２００の使用形態は、上記のように薄層部材２０４と蓋部材２０５と組み合わせて、流入・排出口２０７および液溜部２０８と連通する流路を形成し、その流路の底面にセンサー部２０３を位置させることに限定されるものではない。例えば、貫通孔を有するプレートと組み合わせて、上端以外に開口のないウェルを形成し、そのウェルの底面にセンサー部２０３を位置させた上で、そのウェル内に測定試料等を注入し、反応後に吸引するといった使用形態であってもよい。
The
褪色防止処理（後述する褪色防止処理の第１実施形態および第２実施形態を包含する。）が施されたセンサー部において、褪色防止剤はセンサー部の表面ないし内部に保持されている。たとえば金属薄膜の表面にＳＡＭが結合し、そのＳＡＭに捕捉物質が結合しているセンサー部が形成されている場合、褪色防止剤はＳＡＭなどとの相互作用により固定化されているものと考えられる。 In the sensor part that has been subjected to the anti-fading process (including first and second embodiments of the anti-fading process described later), the anti-fading agent is held on the surface or inside of the sensor part. For example, when a SAM is bonded to the surface of a metal thin film and a sensor unit is formed in which a capture substance is bonded to the SAM, the anti-fading agent is considered to be immobilized by interaction with the SAM. .
褪色防止処理が施されたＳＰＦＳ用センサーチップにおいて、センサー部に存在する褪色防止剤の量は特に限定されるものではなく、褪色防止効果を考慮しながら適宜調節することができる。このような範囲の量の褪色防止剤は、後述する褪色防止処理の第１実施形態または第２実施形態における褪色防止剤の使用量や処理時間を適用することで、センサー部に保持させることが可能である。 In the SPFS sensor chip that has been subjected to the anti-fading treatment, the amount of the anti-fading agent present in the sensor portion is not particularly limited and can be appropriately adjusted in consideration of the anti-fading effect. The amount of anti-fading agent in such a range can be held in the sensor unit by applying the amount of anti-fading agent used or the processing time in the first or second embodiment of anti-fading processing described later. Is possible.
センサーチップ２００は、ＳＰＦＳ装置に装填して使用する。測定に際しては、測定試料等を流入・排出口２０７から注入する。まず、流入・排出口２０７からピペット等により測定試料を注入し、所定時間反応させることで、測定対象物質はセンサー部２０３に固定された捕捉物質に捕捉される。その後、測定試料を流入・排出口２０７からピペット等により排出する。続いて、洗浄液（例えば界面活性剤が溶解したＰＢＳ）を流入・排出口２０７から注入し、流路２０６に残存する測定試料や非特異的に吸着した測定対象物質を洗い流した後、それらが溶け込んだ洗浄液を流入・排出口２０７から吸引する。次に、センサー部２０３に捕捉された測定対象物質を蛍光物質で標識するため、蛍光物質の溶液を流入・排出口２０７から注入し、測定試料のときと同様、所定時間反応させた後、流入・排出口２０７から吸引する。再び、洗浄液を流入・排出口２０７から注入し、流路２０６に残存する蛍光物質の溶液や非特異的に吸着した蛍光物質を洗い流した後、それらが溶け込んだ洗浄液を流入・排出口２０７から吸引する。最後に、測定液（例えばＰＢＳ）を流入・排出口２０７から注入し、流路２０６を測定液で満たした状態にしてから、センサー部に励起光を照射し、表面プラズモン励起増強蛍光分光法による蛍光物質の励起された蛍光を測定する。
The
なお、本発明における測定対象物質は、ＳＰＦＳによって検出または定量される、センサーチップ（センサー部）の表面に固定された捕捉物質と特異的に結合する物質を指し、典型的には、タンパク質、脂質、糖、核酸、細胞、その他の生体関連物質である。また、本発明における測定試料は、測定対象物質を定量するＳＰＦＳ測定のために本発明のセンサーチップに供される液状の試料を指す。測定試料は、典型的には生体試料、すなわち、ヒトや動物から採取された検体、および生体試料に由来する物質を含んだ試料であるが、そのような生体試料のモデルとして調製された、測定対象物質を含有する溶液も包含される。 The substance to be measured in the present invention refers to a substance that specifically binds to a capture substance immobilized on the surface of a sensor chip (sensor part), which is detected or quantified by SPFS. Sugars, nucleic acids, cells, and other biological materials. In addition, the measurement sample in the present invention refers to a liquid sample that is provided to the sensor chip of the present invention for SPFS measurement for quantifying the measurement target substance. The measurement sample is typically a biological sample, that is, a sample collected from a human or animal and a sample containing a substance derived from the biological sample, but the measurement prepared as a model of such a biological sample. A solution containing the target substance is also included.
・誘電体部材
図２に示す実施形態のセンサーチップ２００では、誘電体部材２０１は、断面が台形状をなした六面体形状に形成されている。その上側の面が主面２０１ａであり、この六面体の側面の一面が、励起光の入射面である入射面２０１ｉである。Dielectric member In the
しかしながら、誘電体部材２０１の形状は、上記のような六面体形状に限定されない。少なくともセンサー部２０３が形成される主面２０１ａと、励起光が入射する面である入射面２０１ｉを有し、入射面２０１ｉから入射した励起光が、誘電体部材２０１の内部を通過し、全反射条件となる所定の入射角θでセンサー部２０３を照射するように構成されていればよく、その形状は、例えば円錐形状や、三角錐や四角錐などの角錐形状、或いはかまぼこ状であってもよい。また、誘電体部材２０１に二面以上の入射面２０１ｉを形成することも可能である。
However, the shape of the
誘電体部材の材質は、少なくとも励起光に関して光学的に透明な材料から形成されていればその材質は特に限定されないが、安価で取り扱い性に優れるセンサーチップを提供する上では、例えば樹脂材料から形成されていることが好ましい。誘電体部材を樹脂材料から形成する場合は、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレートなどのポリエステル類、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）などのポリオレフィン類、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのポリ環状オレフィン類、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなどのビニル系樹脂、ポリスチレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリサルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、ポリイミド、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）等のアクリル樹脂、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）などを用いることができる。 The material of the dielectric member is not particularly limited as long as it is formed of a material that is optically transparent at least with respect to excitation light. However, in order to provide a sensor chip that is inexpensive and excellent in handleability, it is formed of, for example, a resin material. It is preferable that When the dielectric member is formed from a resin material, for example, polyesters such as polyethylene terephthalate (PET) and polyethylene naphthalate, polyolefins such as polyethylene (PE) and polypropylene (PP), cyclic olefin copolymer (COC), cyclic Polycyclic olefins such as olefin polymer (COP), vinyl resins such as polyvinyl chloride and polyvinylidene chloride, polystyrene, polyether ether ketone (PEEK), polysulfone (PSF), polyether sulfone (PES), polycarbonate ( PC), polyamide, polyimide, acrylic resin such as polymethyl methacrylate resin (PMMA), triacetyl cellulose (TAC), or the like can be used.
誘電体部材の形成方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記のような樹脂材料を用いる場合には、射出成形によって形成することができる。 The method for forming the dielectric member is not particularly limited. For example, when the resin material as described above is used, the dielectric member can be formed by injection molding.
・金属薄膜
金属薄膜２０２は、一般的なＳＰＦＳ装置に用いられるセンサーチップを構成する金属薄膜と同様の金属を用いることができる。すなわち、金属薄膜は、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、その中でも金からなることがより好ましい。これらの金属については、その合金の形態であってもよく、金属を積層したものであってもよい。-Metal thin film The metal
金属薄膜を誘電体部材の主面上に形成する方法としては、通常行われている方法を用いればよく、例えば、電子ビーム加熱真空蒸着法、抵抗加熱真空蒸着法、マグネトロンスパッタ法、プラズマ支援スパッタ法、イオンアシスト蒸着法、イオンプレーティング法等の真空成膜法によって、誘電体部材の主面上に金属薄膜を成膜することができる。 As a method for forming the metal thin film on the main surface of the dielectric member, a conventional method may be used. For example, an electron beam heating vacuum deposition method, a resistance heating vacuum deposition method, a magnetron sputtering method, a plasma assisted sputtering method may be used. A metal thin film can be formed on the main surface of the dielectric member by a vacuum film formation method such as an ion assisted deposition method or an ion plating method.
金属薄膜の厚さとしては、金は５〜５００ｎｍ、銀は５〜５００ｎｍ、アルミニウムは５〜５００ｎｍ、銅は５〜５００ｎｍ、白金は５〜５００ｎｍ、これらの合金は５〜５００ｎｍが好ましい。電場増強効果の観点からは、金は２０〜７０ｎｍ、銀は２０〜７０ｎｍ、アルミニウムは１０〜５０ｎｍ、銅は２０〜７０ｎｍ、白金は２０〜７０ｎｍ、これらの合金は１０〜７０ｎｍがより好ましい。金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。 The thickness of the metal thin film is preferably 5 to 500 nm for gold, 5 to 500 nm for silver, 5 to 500 nm for aluminum, 5 to 500 nm for copper, 5 to 500 nm for platinum, and 5 to 500 nm for these alloys. From the viewpoint of the electric field enhancement effect, gold is preferably 20 to 70 nm, silver is 20 to 70 nm, aluminum is 10 to 50 nm, copper is 20 to 70 nm, platinum is 20 to 70 nm, and these alloys are more preferably 10 to 70 nm. When the thickness of the metal thin film is within the above range, surface plasmons are easily generated, which is preferable.
・センサー部
センサー部２０３は、金属薄膜２０２上の一部の領域に設けられており、この領域に捕捉物質が固定されている。この場合、センサー部は複数個設けられていてもよく、それぞれのセンサー部には異なる捕捉物質が固定されていてもよい（図４参照）。-Sensor part The
捕捉物質は、測定対象物質（タンパク質、脂質、糖、核酸、その他の物質）を特異的に捕捉する物質である。捕捉物質としては、例えば、抗原に対する抗体、基質・補酵素に対する酵素、ホルモンに対するレセプタ、抗体に対するプロテインＡ・プロテインＧ、ビオチンに対するアビジン類、カルシウムに対するカルモジュリン、糖に対するレクチン、等が挙げられる。また、測定対象物質が核酸である場合、それと特異的に結合する配列を有する核酸も捕捉物質として使用可能である。 The capture substance is a substance that specifically captures a measurement target substance (protein, lipid, sugar, nucleic acid, or other substance). Examples of the capture substance include an antibody against an antigen, an enzyme against a substrate / coenzyme, a receptor against a hormone, protein A / protein G against an antibody, avidin against biotin, calmodulin against calcium, a lectin against a sugar, and the like. Moreover, when the substance to be measured is a nucleic acid, a nucleic acid having a sequence that specifically binds to it can also be used as a capture substance.
捕捉物質を金属薄膜上に固定する方法としては、通常行われている方法を用いればよく、例えば、金属薄膜の表面に特定の結合を生じる修飾基を導入し、捕捉物質にこの修飾基に対応した反応基を導入し、これらの修飾基と反応基を結合させることにより、捕捉物質を金属薄膜上に固定することができる。 As a method for immobilizing the capture substance on the metal thin film, a conventional method may be used. For example, a modification group that generates a specific bond is introduced on the surface of the metal thin film, and this capture group is supported by this modification group. The trapping substance can be fixed on the metal thin film by introducing the reactive group and bonding the modifying group and the reactive group.
具体的には、例えば、必要に応じて金属薄膜上に誘電体層を形成させた後、金属薄膜の表面を、末端にアミノ基を有するシランカップリング剤で処理してアミノ基で修飾し、続いてＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）−ＰＥＧ４−ビオチンで処理して上記アミノ基にビオチンを結合させ、このビオチンにアビジンを反応させた後に、ビオチン化した捕捉物質（例えば抗体）を反応させることにより、金属薄膜上に捕捉物質を固定することができる。あるいは金属薄膜の表面を、末端にカルボキシル基を有するシランカップリング剤で処理してカルボキシル基で修飾し、続いてＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride）およびＮＨＳで処理してそのカルボキシル基を活性エステル化した後に、アミノ基を有する捕捉物質（例えば抗体）を反応させることによっても、金属薄膜上に捕捉物質を固定することができる。 Specifically, for example, if necessary, after forming a dielectric layer on the metal thin film, the surface of the metal thin film is treated with a silane coupling agent having an amino group at the terminal and modified with an amino group, Subsequently, it is treated with NHS (N-hydroxysuccinimide) -PEG4-biotin, biotin is bound to the amino group, avidin is reacted with biotin, and then a biotinylated capture substance (for example, antibody) is reacted. As a result, the trapping substance can be fixed on the metal thin film. Alternatively, the surface of the metal thin film is treated with a silane coupling agent having a carboxyl group at the end and modified with a carboxyl group, followed by treatment with EDC (1-Ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) and NHS. The capture substance can also be immobilized on the metal thin film by reacting a capture substance (for example, an antibody) having an amino group after the carboxyl group has been converted into an active ester.
また、必要に応じて、ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）を、金属薄膜の表面に形成させ、捕捉物質を金属薄膜上に固定してもよい。ＳＡＭは、捕捉物質を金属薄膜上に固定する際の土台としての役割を有する。 Further, if necessary, a SAM (Self-Assembled Monolayer) may be formed on the surface of the metal thin film, and the trapping substance may be fixed on the metal thin film. The SAM serves as a foundation for fixing the trapping substance on the metal thin film.
このＳＡＭが含む単分子としては、例えば、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ アルドリッチ ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは１０−カルボキシ−１−デカンチオールが用いられる。炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。 As a single molecule contained in this SAM, for example, a carboxyalkanethiol having about 4 to 20 carbon atoms (for example, available from Dojindo Laboratories Co., Ltd., Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.), particularly preferably 10- Carboxy-1-decanethiol is used. Carboxyalkanethiol having 4 to 20 carbon atoms has properties such as little optical influence of SAM formed using it, that is, high transparency, low refractive index, and thin film thickness. Therefore, it is preferable.
ＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属薄膜を、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。１０−カルボキシ−１−デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭを形成する。形成したＳＡＭ上へ捕捉物質を固定する方法も、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができ、例えば、上記のＥＤＣ及びＮＨＳで処理する方法を用いることができる。 The method for forming the SAM is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. Specific examples include a method of immersing a metal thin film in an ethanol solution containing 10-carboxy-1-decanethiol (manufactured by Dojindo Laboratories). The thiol group of 10-carboxy-1-decanethiol binds to the metal and is immobilized, and self-assembles on the surface of the gold thin film to form a SAM. The method for immobilizing the capture substance on the formed SAM is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. For example, the above-described method of treating with EDC and NHS can be used.
金属薄膜上に捕捉物質が固定された領域、すなわちセンサー部、の形状及び面積は、特に限定されるものではないが、入射した励起光が照射される照射領域の面積以上であることが好ましい。特に、センサー部で励起された蛍光測定時のＳ／Ｎを向上させるためには、センサー部の形状は、励起光が照射される領域と同じ形状であることが好ましい。この場合、金属薄膜上の一部の領域のみに捕捉物質を固定するためには、捕捉物質を固定する領域の形状に応じて、例えば後述する溶液貯留部材のような部材を金属薄膜上の所定の位置に設置して、この部材の中へ上記の捕捉物質を金属薄膜上に固定する方法で用いる試薬等を添加すればよい。 The shape and area of the region where the trapping substance is fixed on the metal thin film, that is, the sensor portion is not particularly limited, but is preferably equal to or larger than the area of the irradiation region irradiated with the incident excitation light. In particular, in order to improve the S / N at the time of fluorescence measurement excited by the sensor unit, the shape of the sensor unit is preferably the same as the region irradiated with the excitation light. In this case, in order to fix the capture substance only to a part of the region on the metal thin film, a member such as a solution storage member described later is provided on the metal thin film according to the shape of the region to fix the capture substance. The reagent used in the method for fixing the capture substance on the metal thin film may be added to this member.
＜褪色防止処理＞
本発明では、センサー部２０３を含む領域に対して、蛍光標識物質、特に蛍光物質分子の褪色を防止するための褪色防止処理を行う。<Anti-fading treatment>
In the present invention, the region including the
・褪色防止剤（抗酸化剤およびその他の物質）
褪色防止処理に用いる褪色防止剤は、ＳＰＦＳ測定系で用いられる蛍光標識物質の褪色を防止する作用効果を有する物質であれば特に限定されるものではないが、褪色の原因となる活性酸素による蛍光標識物質の酸化を効果的に防止することができる抗酸化剤（酸化防止剤）が好適である。抗酸化剤はさらに、センサー部２０３に固定化された捕捉物質、例えば抗体、レクチン等のタンパク質またはその他の生体関連物質に対する、保存時または血液等の検体との接触時における酸化を防止することができる点でも好適である。捕捉物質の酸化の防止により、測定対象物質との反応性を維持してＳＰＦＳの測定結果の安定性を高めることが可能であり、抗酸化剤は捕捉物質に対する保護剤としても機能するといえる。また、センサー部２０３に固定されている捕捉物質の機能に障害を与えないよう、センサー部２０３に接触させる褪色防止処理液は水または緩衝液を溶媒として調製することが好ましいため、抗酸化剤は水溶性のものであることが好ましい。・ Anti-fading agent (antioxidant and other substances)
The anti-fading agent used for the anti-fading treatment is not particularly limited as long as it is a substance having an effect of preventing the fading of the fluorescent labeling substance used in the SPFS measurement system. An antioxidant (antioxidant) that can effectively prevent the oxidation of the labeling substance is suitable. Further, the antioxidant may prevent oxidation of a capture substance immobilized on the
水溶性の抗酸化剤は、本発明の属する技術分野およびその他の技術分野において用いられる各種の抗酸化剤の中から選択することができる。典型的な抗酸化剤として、フェノール系抗酸化剤、アミン系抗酸化剤、リン系抗酸化剤、硫黄系抗酸化剤および不飽和炭化水素系の抗酸化剤が挙げられる。 The water-soluble antioxidant can be selected from various antioxidants used in the technical field to which the present invention belongs and other technical fields. Typical antioxidants include phenolic antioxidants, amine antioxidants, phosphorus antioxidants, sulfur antioxidants and unsaturated hydrocarbon antioxidants.
フェノール系抗酸化剤としては、天然物由来のフェノール類およびヒンダードフェノール類が挙げられる。 Examples of phenolic antioxidants include natural products-derived phenols and hindered phenols.
このうち、天然物由来のフェノール類の好適な例として、フェノール性水酸基を有する各種フラボノイド類、具体的には、クエルセチン、ルチン、ミリセチン、ミリシトリン、フィセチン、モリンなど、フェノール性水酸基を有する、フラボノール類及びその配糖体；ヘスペレチン、ヘスペリジン、メチルヘスペリジン、ナリンゲニン、ナリンギンなど、フェノール性水酸基を有する、フラバノン類及びその配糖体；アピゲニン、ルテオリンなど、フェノール性水酸基を有するフラボン類；タキシフォリンなど、フェノール性水酸基を有するフラバノノール類；カテキン、ガロカテキン、没食子酸ガロカテキン、没食子酸エピガロカテキンなどのカテキン類；ゲニステイン、ダイゼイン（４'，７−ジヒドロキシイソフラボン）などのイソフラボン類；並びに、シアニジン、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジンなど、フェノール性水酸基を有するアントシアニジン類などが挙げられる。 Among these, as preferred examples of phenols derived from natural products, various flavonoids having a phenolic hydroxyl group, specifically, flavonols having a phenolic hydroxyl group such as quercetin, rutin, myricetin, myricitrin, fisetin, and morin. And glycosides thereof: hesperetin, hesperidin, methyl hesperidin, naringenin, naringin, etc., flavanones having a phenolic hydroxyl group and glycosides thereof; flavones having a phenolic hydroxyl group, such as apigenin, luteolin; phenols such as taxifolin, etc. Flavonanols having a functional hydroxyl group; catechins such as catechin, gallocatechin, gallocatechin gallate, epigallocatechin gallate; isofuranes such as genistein and daidzein (4 ′, 7-dihydroxyisoflavone) And anthocyanidins having a phenolic hydroxyl group such as cyanidin, delphinidin, malvidin, pelargonidin, and peonidin.
また、天然物由来のフェノール類の別の好適な例として、没食子酸、並びに、没食子酸プロピルなどの没食子酸エステル等のポリフェノール類も挙げられる。タンニン、トコフェロール、トコトリエノールなども、フェノール系抗酸化剤として用いることができる。 Moreover, polyphenols, such as gallic acid and gallic acid ester, such as propyl gallate, are mentioned as another suitable example of phenols derived from a natural product. Tannin, tocopherol, tocotrienol and the like can also be used as a phenolic antioxidant.
ヒンダードフェノール類としては、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール、ｐ−フェニルアゾフェノール、４−ニトロアニリン、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシメチルフェノール、Ｎ,Ｎ'−ジサリチルアル−１，２−プロパンジアミン、トリエチレングリコール-ビス[３−(３−ｔｅｒｔ−ブチル−５−メチル−４−ヒドロキシフェニル)プロピオネート]、１，６−ヘキサンジオール-ビス[３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル)プロピオネート]、２，４−ビス−(ｎ−オクチルチオ)−６−(４−ヒドロキシ−３,５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルアニリノ)−１,３,５−トリアジン、ペンタエリスリチル・テトラキス[３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル)プロピオネート]、２, ２−チオ-ジエチレンビス[３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル)プロピオネート]、オクタデシル−３−(３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル)プロピオネート、Ｎ,Ｎ'−ヘキサメチレンビス(３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ-ヒドロシンナマミド)、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシベンジルフォスフォネート-ジエチルエステル、１，３，５−トリメチル−２,４,６−トリス(３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシベンジル)ベンゼン、トリス−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシベンジル)-イソシアヌレイト、オクチル化ジフェニルアミン、２，４−ビス[(オクチルチオ)メチル]−Ｏ−クレゾール、イソオクチル−３−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル)プロピオネート、１，３，５−トリス（４−ｔｅｒｔ−ブチル−３−ヒドロキシ−２，６−ジメチルベンジル）イソシアヌル酸などが挙げられる。 Examples of hindered phenols include 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol, p-phenylazophenol, 4-nitroaniline, 2,6-di-tert-butyl-4-hydroxymethylphenol, N , N′-disalicylical-1,2-propanediamine, triethylene glycol-bis [3- (3-tert-butyl-5-methyl-4-hydroxyphenyl) propionate], 1,6-hexanediol-bis [3 -(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl) propionate], 2,4-bis- (n-octylthio) -6- (4-hydroxy-3,5-di-tert-butylanilino)- 1,3,5-triazine, pentaerythrityl tetrakis [3- (3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl) propione G] 2,2-thio-diethylenebis [3- (3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl) propionate], octadecyl-3- (3,5-di-tert-butyl-4- Hydroxyphenyl) propionate, N, N′-hexamethylenebis (3,5-di-tert-butyl-4-hydroxy-hydrocinnamamide), 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzyl phosphate Nate-diethyl ester, 1,3,5-trimethyl-2,4,6-tris (3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzyl) benzene, tris- (3,5-di-tert-butyl -4-hydroxybenzyl) -isocyanurate, octylated diphenylamine, 2,4-bis [(octylthio) methyl] -O-cresol, isooctyl-3- (3,5-di tert- butyl-4-hydroxyphenyl) propionate, etc. 1,3,5-tris (4-tert- butyl-3-hydroxy-2,6-dimethylbenzyl) isocyanuric acid.
アミン系抗酸化剤としては、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ：登録商標、Air Products & Chemicals, Inc.）等の３級アミン；フェノチアジン、フェニル−α−ナフチルアミン、ｐ，ｐ'−ジオクチルジフェニルアミン、ｐ−フェニレンジアミンなどの芳香族アミン；セバシン酸ビス（２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジル）、２，２，６，６−テトラメチルピペリジンなどのヒンダードアミン；並びに、カフェインなどのアルカロイドが挙げられる。本発明においては、好適なアミン系抗酸化剤として芳香族アミンが挙げられ、その中でも特に好適なアミン系抗酸化剤としてフェノチアジンが挙げられる。 Examples of amine-based antioxidants include tertiary amines such as 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane (DABCO: registered trademark, Air Products & Chemicals, Inc.); phenothiazine, phenyl-α-naphthylamine, p. , P'-dioctyldiphenylamine, aromatic amines such as p-phenylenediamine; bis (2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidyl) sebacate, 2,2,6,6-tetramethylpiperidine, etc. Hindered amines; and alkaloids such as caffeine. In the present invention, an aromatic amine is mentioned as a suitable amine-based antioxidant, and among them, phenothiazine is mentioned as a particularly suitable amine-based antioxidant.
リン系抗酸化剤としては、２−メルカプトベンゾイミダゾール、亜リン酸トリフェニル、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ ＨＣｌ）、ジイソデシルペンタエリスリトールジホスファイト、９，１０−ジヒドロ−９−オキサ−１０−ホスファフェナントレン−１０−オキシド等が挙げられる。 Examples of phosphorus antioxidants include 2-mercaptobenzimidazole, triphenyl phosphite, tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP HCl), diisodecylpentaerythritol diphosphite, 9,10-dihydro-9- And oxa-10-phosphaphenanthrene-10-oxide.
硫黄系抗酸化剤としては、３，３−チオジプロピオン酸ジドデシル、２，２'−チオジエタノール等のスルフィドや、ジベンジルジスルフィド、ＤＬ−αリポ酸（チオクト酸）、３，６−ジチア−１,８−オクタンジオール等のジスルフィド、ジチオスレイトールやオクタンジオール等のチオールが挙げられる。
Examples of the sulfur-based antioxidant include sulfides such as
不飽和炭化水素系抗酸化剤としては、ルテイン、リコピン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、ミキソキサントフィル、ゼアキサンチン、カロテン、レチノイン酸等のカロテン類やカロテノイド類、キサントフィル類、アスコルビン酸（Ｌ−アスコルビン酸、イソアスコルビン酸（エリソルビン酸）またはそのＮａ等の塩を含む）、トコトリエノール、不飽和脂肪酸類等が挙げられる。 Examples of unsaturated hydrocarbon-based antioxidants include carotenes such as lutein, lycopene, astaxanthin, canthaxanthin, capsanthin, myxoxanthophyll, zeaxanthin, carotene, retinoic acid, carotenoids, xanthophylls, ascorbic acid (L-ascorbic acid , Isoascorbic acid (erythorbic acid) or salts thereof such as Na), tocotrienol, unsaturated fatty acids and the like.
上記の抗酸化剤のうち、蛍光物質の褪色防止の効果が大きいことから、フェノール系抗酸化剤およびアミン系抗酸化剤、たとえばアミン系抗酸化剤である１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、ｐ−フェニレンジアミンなどが好ましい。また、上記不飽和炭化水素系抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸などもまた好適な抗酸化剤である。ここで、アスコルビン酸は、天然物(自然産物)であるため、測定値に与える(及ぼす)影響が低く、安価であるので、好適である。なお、フェノール系抗酸化剤によっては、フェノール性水酸基に加えてアルコール性水酸基が含まれることもあるが、この場合、フェノール性水酸基とアルコール性水酸基とを合わせて２個以上有することが好ましい。 Among the above-mentioned antioxidants, since the effect of preventing the fading of the fluorescent substance is great, phenol-based antioxidants and amine-based antioxidants such as 1,4-diazabicyclo [2.2. 2] Octane (DABCO), p-phenylenediamine and the like are preferable. The unsaturated hydrocarbon antioxidants such as ascorbic acid are also suitable antioxidants. Here, since ascorbic acid is a natural product (natural product), it has a low influence (influence) on measurement values and is inexpensive, and thus is preferable. Some phenolic antioxidants may contain an alcoholic hydroxyl group in addition to the phenolic hydroxyl group. In this case, it is preferable to have two or more phenolic hydroxyl groups and alcoholic hydroxyl groups.
抗酸化剤は、いずれか一種を単独で用いても、複数種を混合して用いてもよい。また、センサー部を複数個有するセンサーチップを用いる場合は、必要に応じて、センサー部ごとに用いる抗酸化剤を変えてもよい。 Any one kind of antioxidant may be used alone, or a plurality of kinds may be mixed and used. Further, when a sensor chip having a plurality of sensor parts is used, the antioxidant used for each sensor part may be changed as necessary.
抗酸化剤は、蛍光標識物質が発する蛍光強度の測定値に悪影響が無いよう、吸収波長４５０〜６００ｎｍで吸収が無いことが好ましく、発光波長５００〜７００ｎｍで発光が無いことが好ましい。吸収があると蛍光強度の測定値の低下につながる場合がある。また、発光があると蛍光強度の測定時にノイズが増加する場合がある。抗酸化剤の吸収が無いとは、抗酸化剤の１ｍｇ／ｍＬ濃度のキシレン溶液を調整し、１０ｍｍセルに入れて吸光度測定を行なった際に、４５０ｎｍおよび６００ｎｍにおける吸光度がともに０．５以下であることをいう。 The antioxidant preferably has no absorption at an absorption wavelength of 450 to 600 nm, and preferably has no emission at an emission wavelength of 500 to 700 nm, so as not to adversely affect the measurement value of the fluorescence intensity emitted by the fluorescent labeling substance. Absorption may lead to a decrease in measured fluorescence intensity. In addition, if there is light emission, noise may increase when measuring the fluorescence intensity. The absence of antioxidant absorption means that when the xylene solution of 1 mg / mL concentration of antioxidant is prepared and the absorbance is measured in a 10 mm cell, the absorbance at 450 nm and 600 nm is both 0.5 or less. Say something.
上記の抗酸化剤以外に褪色防止剤として用いることのできる物質としては、たとえば、褪色防止用封入剤として知られている「Slow Fade」（登録商標、サーモフィッシャーサイエンティフィック）、「Perma Fluor」(商標、サーモフィッシャーサイエンティフィック)などの製品が挙げられる。 Examples of substances that can be used as anti-fading agents other than the above antioxidants include, for example, “Slow Fade” (registered trademark, Thermo Fisher Scientific), “Perma Fluor”, which is known as an anti-fading encapsulant. (Trademark, Thermo Fisher Scientific) and other products.
・褪色防止処理方法
上述したような褪色防止剤を用いた褪色防止処理は、褪色防止剤が溶解している褪色防止処理液を調製し、その処理液を金属薄膜のセンサー部を含む領域に接触させ、所定の時間保持することにより行うことができる。そのような褪色防止処理の実施形態としては、たとえば下記のような実施形態が挙げられる。-Anti-fading treatment method The anti-fading treatment using the anti-fading agent described above is to prepare an anti-fading treatment solution in which the anti-fading agent is dissolved, and the treatment solution is brought into contact with the region including the sensor part of the metal thin film. And by holding for a predetermined time. Examples of such fading prevention processing include the following embodiments.
・褪色防止処理の第１実施形態
本発明の褪色防止処理の第１実施形態は、センサーチップを製造する際の、金属薄膜上の一部に捕捉物質が固定された領域を形成するための処理に付随して行われるものである。このような実施形態は、たとえば図５に示すように、センサーチップの製造段階で（つまりセンサーチップをＳＰＦＳ装置に装填する前に）所定の器具を用いて行うことができ、センサー部のみに対して効率的に褪色防止処理をする上で好適である。First Embodiment of Anti-fading Process The first embodiment of the anti-fading process of the present invention is a process for forming a region where a trapping substance is fixed on a part of a metal thin film when manufacturing a sensor chip. It is performed in conjunction with. For example, as shown in FIG. 5, such an embodiment can be performed using a predetermined instrument in the manufacturing stage of the sensor chip (that is, before loading the sensor chip into the SPFS device), and only for the sensor unit. Therefore, it is suitable for efficient fading prevention treatment.
図５に示す実施形態では、円形のセンサー部３０３と同じ寸法の内径を有する円筒形の溶液貯留部材３０４を、その内周がセンサー部３０３の円周と重なるように、金属薄膜３０２の上に設置する。溶液貯留部材３０４の材質は、ブロッキング剤溶液を貯留できるものであれば特に制限はなく、例えば、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）などの樹脂等である。次に、溶液貯留部材３０４で囲まれた領域内へ、ピペット等により、センサー部３０３全体が覆われるように褪色防止処理液３０５を加え、所定の温度および時間、例えば室温で１時間保持する。
In the embodiment shown in FIG. 5, a cylindrical
このような実施形態においては、溶液貯留部材３０４内に入れた褪色防止処理液３０５が溶液貯留部材３０４と金属薄膜３０２との隙間から漏れ出さないように、溶液貯留部材３０４と金属薄膜３０２との間をシールしておくことが適切である。このシールは、例えば、溶液貯留部材３０４の下部に巻いたシール部材３０６より行われる。シール部材３０６の材質は、例えばゴムである。シール部材３０６の効果をより十分にするために、例えば溶液貯留部材３０４と誘電体部材３０１を適当な板部材（図示せず）で挟んで力を加える等の方法によって、溶液貯留部材３０４の上から力を加えてシール部材３０６を金属薄膜３０２の表面に密着させることが好ましい。この板部材に貫通孔を設けておけば、そこから溶液貯留部材３０４で囲まれた領域内に褪色防止処理液３０５を加えることができる。
In such an embodiment, the
上記の工程の後、ピペット等により、溶液貯留部材３０４から褪色防止処理液を取り除き、溶液貯留部材３０４を取り外してから、恒温槽にセンサーチップ３００を入れて乾燥させる。乾燥させたセンサーチップ３００は、好ましくは密封された状態で、ＳＰＦＳ測定に供されるまで保管される。
After the above steps, the anti-fading treatment liquid is removed from the
なお、センサー部の形状は円形に限るものではないことは前述の通りであり、円形以外の形状のセンサー部の場合は、その形状に応じた溶液貯留部材を設置すればよい。また、例えば図４のような複数のセンサー部を有するセンサーチップの場合は、上述したような褪色防止処理を複数のセンサー部のそれぞれに対して行えばよい。 As described above, the shape of the sensor portion is not limited to a circle. In the case of a sensor portion having a shape other than a circle, a solution storage member corresponding to the shape may be installed. For example, in the case of a sensor chip having a plurality of sensor units as shown in FIG. 4, the above-described fading prevention process may be performed on each of the plurality of sensor units.
上述したような褪色防止処理の第１実施形態は、センサーチップの製造時に、金属薄膜上の一部に捕捉物質が固定された領域（つまりセンサー部３０３）を形成するための処理に付随させて行うことができる。例えば、金属薄膜３０２の表面にカルボキシル基を末端に有するＳＡＭを形成し、続いてＥＤＣおよびＮＨＳで処理して前記カルボキシル基を活性エステル基に変換した後、捕捉物質としての抗体を反応させることで、その抗体のアミノ基を介してセンサー部３０５に固定することができる。このような工程の最後では通常、抗体が結合しなかった未反応の活性エステル基を、Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液を用いて不活性化する処理が行われる。この不活性化処理の際に用いられるＴｒｉｓ緩衝液に褪色防止剤を溶解させておくことで、不活性化処理と同時に褪色防止処理を行うことができる。
The first embodiment of the anti-fading process as described above is accompanied by a process for forming a region (that is, the sensor unit 303) in which the trapping substance is fixed on a part of the metal thin film when the sensor chip is manufactured. It can be carried out. For example, by forming a SAM having a carboxyl group at the terminal on the surface of the metal
あるいは、褪色防止剤を含有しないＴｒｉｓ緩衝液を用いた不活性化処理を行った後に、センサー部３０３を含む領域に褪色防止処理液を塗布するというように、捕捉物質の固定化のための工程とは別の工程として褪色防止のための工程を行ってもよい。
Alternatively, a process for immobilizing the trapping substance, such as applying an anti-fading treatment solution to an area including the
褪色防止処理液中の褪色防止剤の濃度は特に限定されるものではなく、褪色防止効果を考慮しながら適宜調節することができるが、一般的に濃度が高いほど褪色防止効果は発揮されやすいので、用いる褪色防止剤に応じた十分に高い濃度とすることが適切である。また、褪色防止処理の時間も特に限定されるものではなく、褪色防止効果を考慮しながら適宜調節することができるが、一般的に処理時間が長いほど褪色防止効果は発揮されやすいので、用いる褪色防止剤に応じた十分に長い時間とすることが適切である。 The concentration of the anti-fading agent in the anti-fading treatment solution is not particularly limited and can be adjusted as appropriate in consideration of the anti-fading effect. Generally, the higher the concentration, the more easily the anti-fading effect is exhibited. It is appropriate to make the concentration sufficiently high according to the anti-fading agent used. Also, the time for the anti-fading treatment is not particularly limited and can be appropriately adjusted in consideration of the anti-fading effect. Generally, the longer the processing time, the more easily the anti-fading effect is exhibited. It is appropriate to make the time sufficiently long according to the inhibitor.
・褪色防止処理の第２実施形態
本発明の褪色防止処理の第２実施形態は、センサーチップを使用してＳＰＦＳ測定法を実施する際に、捕捉物質が固定された領域に所定の溶液を供給する工程に付随して行われるものである。このような実施形態は、たとえば、センサーチップに薄層部材および蓋部材を組み合わせて流路を形成した状態、あるいはプレートと組み合わせてウェルを形成した状態で、ＳＰＦＳ装置に装填した後に、ＳＰＦＳ測定のための工程と一体的にないし連続的な工程として行うことができ、効率的に褪色防止処理をすることができるため好適である。Second embodiment of anti-fading treatment The second embodiment of the anti-fading treatment of the present invention supplies a predetermined solution to an area where a capture substance is fixed when performing a SPFS measurement method using a sensor chip. This is performed in association with the process. In such an embodiment, for example, after a thin film member and a lid member are combined with a sensor chip to form a flow path, or a well is formed with a plate in combination with a plate, the SPFS measurement is performed after loading the SPFS device. Therefore, the process can be carried out as an integral or continuous process, and the anti-fading treatment can be efficiently performed.
第２実施形態では、従来のＳＰＦＳにおいて用いられている所定の溶液、すなわち測定試料（検体希釈液）、蛍光標識溶液、洗浄液、蛍光測定液などの溶液に褪色防止剤を添加して溶解させておく。たとえば、測定試料（検体希釈液）に褪色防止剤を添加した場合、ＳＰＦＳの最初の工程で、センサー部に固定された捕捉物質と測定試料中の測定対象物質とを反応させるために、流路に測定試料を所定の時間導入する際、センサー部に対する褪色防止処理が同時に行われることになる。蛍光標識溶液、洗浄液または蛍光測定液に褪色防止剤を添加した場合も同様であり、それぞれ蛍光標識工程、洗浄工程または蛍光測定工程においてセンサー部に対する褪色防止処理が同時に行われることになる。アッセイシグナルを測定する蛍光測定工程と同様に、ベースラインシグナル測定工程において退色防止処理を行ってもよい。蛍光測定工程において退色防止処理を行うことは、その後にさらなる送液は行われず、固定化された褪色防止剤が流下してしまうおそれが最も低いため好ましい。 In the second embodiment, an anti-fading agent is added to and dissolved in a predetermined solution used in the conventional SPFS, that is, a solution such as a measurement sample (specimen dilution solution), a fluorescent labeling solution, a cleaning solution, or a fluorescent measurement solution. deep. For example, when an anti-fading agent is added to a measurement sample (specimen diluent), a flow path is used to react the capture substance fixed to the sensor unit with the measurement target substance in the measurement sample in the first step of SPFS. When the measurement sample is introduced into the sensor for a predetermined time, the anti-fading process is simultaneously performed on the sensor unit. The same applies to the case where an anti-fading agent is added to the fluorescent labeling solution, the cleaning solution, or the fluorescent measuring solution, and the anti-fading process is simultaneously performed on the sensor unit in the fluorescent labeling step, the cleaning step, or the fluorescent measuring step, respectively. Similar to the fluorescence measurement step for measuring the assay signal, the fading prevention treatment may be performed in the baseline signal measurement step. It is preferable to perform the fading prevention treatment in the fluorescence measurement step, since no further liquid feeding is performed after that, and the possibility that the immobilized antifading agent will flow down is the lowest.
測定試料（検体希釈液）、蛍光標識溶液または洗浄液に対する褪色防止剤の添加量は特に限定されるものではなく、褪色防止効果を考慮しながら適宜調節することができるが、一般的に濃度が高いほど褪色防止効果は発揮されやすいので、用いる褪色防止剤に応じた十分に高い濃度とすることが適切である。また、測定試料反応工程、蛍光標識工程または洗浄工程（すなわち褪色防止処理）の時間も特に限定されるものではなく、通常の測定試料反応工程、蛍光標識工程または洗浄工程の時間と同程度、あるいは必要に応じて褪色防止効果を考慮しながら適宜調節することができるが、一般的に処理時間が長いほど褪色防止効果は発揮されやすいので、用いる褪色防止剤に応じた十分に長い時間とすることが適切である。 The amount of anti-fading agent added to the measurement sample (specimen diluent), fluorescent labeling solution, or washing solution is not particularly limited and can be adjusted as appropriate in consideration of the anti-fading effect, but the concentration is generally high. Since the anti-fading effect is more likely to be exhibited, it is appropriate to set the concentration sufficiently high according to the anti-fading agent used. In addition, the time of the measurement sample reaction process, the fluorescent labeling process or the washing process (that is, the fading prevention process) is not particularly limited, and is approximately the same as the time of the normal measurement sample reaction process, the fluorescent labeling process or the washing process, or Although it can be adjusted as appropriate considering the anti-fading effect as necessary, generally the longer the processing time, the more easily the anti-fading effect is exhibited, so the time should be sufficiently long according to the anti-fading agent used. Is appropriate.
＜ブロッキング処理および安定化処理＞
センサー部２０３を含む領域に対しては、必要に応じて、測定試料中の夾雑物（測定対象物質以外のタンパク質、脂質、糖、その他）や蛍光標識物質がセンサー部に非特異的に吸着又は結合することを防止するためのブロッキング処理を行ってもよい。<Blocking treatment and stabilization treatment>
For the region including the
ブロッキング処理に用いるブロッキング剤は特に限定されるものではなく、通常のものを使用すればよい。ブロッキング剤としては、例えば、スキムミルク、フィッシュゼラチン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、界面活性剤、カゼイン、プロタミン、ポリエチレングリコール、トレハロース、デキストラン等が知られており、測定試料、測定対象物質に応じて適切なものを選べばよい。このうち、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルクがより一般的によく使用される。ブロッキング剤は、いずれか一種を単独で用いても、複数種を混合して用いてもよい。 The blocking agent used for the blocking treatment is not particularly limited, and a normal one may be used. As blocking agents, for example, skim milk, fish gelatin, bovine serum albumin (BSA), surfactants, casein, protamine, polyethylene glycol, trehalose, dextran, etc. are known, and are appropriate according to the measurement sample and the substance to be measured. Choose the right one. Of these, bovine serum albumin, casein, gelatin, and skim milk are more commonly used. Any one type of blocking agent may be used alone, or a plurality of types may be used in combination.
また、ブロッキング処理の際に、糖類のような安定化剤による安定化処理をあわせて行ってもよい。安定化処理は、捕捉物質、特に抗体のようなタンパク質の捕捉物質、の構造を安定に保護し、時間経過による測定対象物質が有する捕捉効果の減少を防ぐ効果があるため、特にセンサーチップの製造時に行われる褪色防止処理の第１実施形態と組み合わせることが好ましい。安定化剤として用いることのできる糖類は、単糖（例えば、グルコース、フルクトース等）、二糖（スクロース、マルトース等）、及び３〜１０個の単糖から構成されるオリゴ糖（ラフィノース、パノース等）からなる群から選択される少なくとも１種の糖であることが好ましい。 Further, in the blocking treatment, a stabilization treatment with a stabilizer such as a saccharide may be performed together. Since the stabilization treatment has the effect of stably protecting the structure of the capture substance, particularly a protein capture substance such as an antibody, and preventing the capture effect of the measurement target substance from decreasing over time. It is preferably combined with the first embodiment of the anti-fading process that is sometimes performed. Saccharides that can be used as a stabilizer include monosaccharides (eg, glucose, fructose, etc.), disaccharides (sucrose, maltose, etc.), and oligosaccharides composed of 3 to 10 monosaccharides (raffinose, panose, etc.). And at least one sugar selected from the group consisting of:
ブロッキング処理および安定化処理は、ブロッキング剤の溶液に安定化剤を添加することにより同時に行うことができる。ブロッキング剤溶液に対する糖類の添加量は、１〜２０重量％であることが好ましく、５〜１２重量％であることがより好ましい。 The blocking treatment and the stabilization treatment can be performed simultaneously by adding a stabilizer to the blocking agent solution. The amount of saccharide added to the blocking agent solution is preferably 1 to 20% by weight, and more preferably 5 to 12% by weight.
上述したようなブロッキング処理は、ブロッキング剤溶液を調製して金属薄膜のセンサー部を含む領域に接触させ、所定の時間保持するようにして行えばよい。たとえば、褪色防止処理工程の前または後に、前述したような褪色防止処理の第１実施形態と同様の溶液貯留部材を用いて、ブロッキング剤および必要に応じて安定化剤（糖類）を含有するブロッキング処理液を、センサー部を含む領域に接触させることができる。 The blocking treatment as described above may be performed by preparing a blocking agent solution and bringing it into contact with the region containing the sensor part of the metal thin film and holding it for a predetermined time. For example, before or after the anti-fading treatment step, using the same solution storage member as that of the first embodiment of the anti-fading treatment described above, blocking containing a blocking agent and, if necessary, a stabilizer (saccharide). The treatment liquid can be brought into contact with the region including the sensor unit.
− ＳＰＦＳに基づく測定法 −
本発明のＳＰＦＳ測定法は、捕捉物質に捕捉された測定対象物質に結合した蛍光標識剤の近傍に、褪色防止剤を存在する状態で励起光を照射して蛍光を測定する工程を含む測定法である。ここで「近傍」とは、褪色防止剤が蛍光標識剤に含まれる蛍光体の褪色を防止する作用効果が奏される距離であればよく、特に限定されるものではないが、たとえば、センサー部が形成される金属薄膜の表面から蛍光体までの距離、すなわち表面プラズモン共鳴により増強されたエバネッセント波が到達する数百ナノメートル程度の距離に収まる距離が好ましい。そのようなＳＰＦＳ測定法の実施形態としては、たとえば下記のような実施形態が挙げられる。-Measurement method based on SPFS-
The SPFS measurement method of the present invention includes a step of measuring fluorescence by irradiating excitation light in the presence of an anti-fading agent in the vicinity of a fluorescent labeling agent bound to a measurement target substance captured by a capture substance. It is. The “near” here is not particularly limited as long as it is a distance at which the anti-fading agent has an effect of preventing the fading of the phosphor contained in the fluorescent labeling agent. For example, the sensor unit The distance from the surface of the metal thin film on which the sapphire is formed to the phosphor, that is, a distance within a range of about several hundred nanometers where the evanescent wave enhanced by the surface plasmon resonance reaches is preferable. Examples of such an SPFS measurement method include the following embodiments.
・ＳＰＦＳ測定法の第１実施形態
本発明のＳＰＦＳ測定法の第１実施形態は、捕捉物質が固定された領域（センサー部）に褪色防止剤が存在する状態で励起光を照射して蛍光を測定するものである。First Embodiment of SPFS Measurement Method In the first embodiment of the SPFS measurement method of the present invention, fluorescence is emitted by irradiating excitation light in a state where an anti-fading agent is present in a region (sensor part) where a capture substance is fixed. Measure.
このようなＳＰＦＳ測定法の第１実施形態は、下記（Ａ）および（Ｂ）の両方の場合を包含する：
（Ａ）前述した褪色防止処理の第１実施形態に対応して、褪色防止処理が施されたセンサー部を備えたセンサーチップを使用することにより、捕捉物質が固定された領域に褪色防止剤を存在させるようにする場合；
（Ｂ）前述した褪色防止処理の第２実施形態に対応して、センサー部に褪色防止処理が施されていないセンサーチップを使用してＳＰＦＳ測定法を開始した後、励起光を照射して蛍光を測定する工程よりも前の所定の工程において、褪色防止剤を添加した測定試料（検体希釈液）、洗浄液、蛍光標識溶液などをセンサー部に供給することにより、捕捉物質が固定された領域に褪色防止剤を存在させるようにする場合。The first embodiment of such an SPFS measurement method includes both cases (A) and (B) below:
(A) Corresponding to the first embodiment of the anti-fading process described above, the anti-fading agent is applied to the region where the trapping substance is fixed by using a sensor chip including a sensor part that has been subjected to the anti-fading process. To make it exist;
(B) Corresponding to the above-described second embodiment of the anti-fading process, the SPFS measurement method is started using a sensor chip that is not subjected to the anti-fading process on the sensor unit, and then irradiated with excitation light to fluoresce. In a predetermined step prior to the step of measuring the sample, a measurement sample (specimen diluent) to which an anti-fading agent is added, a cleaning solution, a fluorescent labeling solution, and the like are supplied to the sensor unit, so that the capture substance is fixed in the region. To make anti-fading agent present.
（Ａ）の場合、前記捕捉物質が固定された領域に存在する褪色防止剤は、センサーチップがＳＰＦＳ測定法のために使用される前にあらかじめ、捕捉物質が固定された領域を含む領域に対して行われていた、褪色防止処理のための溶液に含有されていたものである。 In the case of (A), the anti-fading agent present in the region where the capture substance is immobilized is compared with the region including the region where the capture substance is immobilized before the sensor chip is used for the SPFS measurement method. And contained in a solution for anti-fading treatment.
（Ｂ）の場合、捕捉物質が固定された領域に存在する褪色防止剤は、ＳＰＦＳ測定法で用いられる試料溶液、洗浄液または蛍光標識溶液に添加されていたものであり、ＳＰＦＳ測定法の第１実施形態は、励起光を照射して蛍光を測定する工程の前に、褪色防止剤が添加された測定試料、洗浄液、蛍光標識溶液などを、捕捉物質が固定された領域に供給する工程を含むことになる。そのような測定試料反応工程、洗浄工程、蛍光標識工程についてはさらに後述する。 In the case of (B), the anti-fading agent present in the region where the capture substance is fixed is added to the sample solution, washing solution or fluorescent labeling solution used in the SPFS measurement method. The embodiment includes a step of supplying a measurement sample, a washing solution, a fluorescent labeling solution, etc., to which an antifading agent is added, to a region where a capture substance is fixed, before the step of measuring fluorescence by irradiating excitation light. It will be. Such measurement sample reaction step, washing step, and fluorescent labeling step will be further described later.
・ＳＰＦＳ測定法の第２実施形態
本発明のＳＰＦＳ測定法の第２実施形態は、褪色防止剤が、ＳＰＦＳ測定法で用いられる蛍光測定液中に存在するものであり、励起光を照射して蛍光を測定する工程において、褪色防止剤が添加された蛍光測定液を捕捉物質に固定された領域に供給するものである。つまり、蛍光標識剤の周囲を満たす蛍光測定液中に褪色防止剤が存在する状態で、励起光を照射して蛍光を測定するようにする。そのような蛍光測定工程についてはさらに後述する。Second Embodiment of SPFS Measurement Method In the second embodiment of the SPFS measurement method of the present invention, the anti-fading agent is present in a fluorescence measurement liquid used in the SPFS measurement method, and is irradiated with excitation light. In the step of measuring fluorescence, a fluorescence measuring solution to which an anti-fading agent is added is supplied to the region fixed to the capture substance. That is, the fluorescence is measured by irradiating the excitation light in the state where the anti-fading agent is present in the fluorescence measuring solution filling the periphery of the fluorescent labeling agent. Such a fluorescence measurement process will be further described later.
・ＳＰＦＳ測定法に含まれる工程
ＳＰＦＳ測定法を開始する際、センサーチップは、通常は薄層部材および枠部材と組み合わせて流路を形成した状態で、あるいはプレートと組み合わせてウェルを形成した状態で、ＳＰＦＳ装置に装填される。ＳＰＦＳ装置は従来公知のものを利用することができる。Steps included in the SPFS measurement method When starting the SPFS measurement method, the sensor chip is usually in a state where a flow path is formed in combination with a thin layer member and a frame member, or in a state where a well is formed in combination with a plate. , Loaded into the SPFS device. A conventionally known SPFS apparatus can be used.
本発明のＳＰＦＳ測定法は、褪色防止に関する事項以外は、基本的には従来公知の測定法と同様であり、たとえば以下のような工程に従って実施することができる：
（１）測定試料反応工程：流路またはウェルに測定試料を供給し、それらの底面に当たる金属薄膜上の一部に形成されているセンサー部に測定試料を接触させることで、捕捉物質と測定対象物質とを反応させる工程；
（２）蛍光標識工程：測定試料接触工程を経たセンサー部に、蛍光標識剤を含有する溶液を接触させることで、捕捉物質に捕捉された測定対象物質と蛍光標識剤とを反応させる工程；
（３）蛍光測定工程：流路またはウェルを蛍光測定液で満たした後、蛍光標識工程を経たセンサー部に、蛍光標識剤に含まれる蛍光体に対応した励起光を照射し、ＳＰＦＳに基づき生じた蛍光の強度（アッセイシグナル）を測定する工程。The SPFS measurement method of the present invention is basically the same as a conventionally known measurement method except for matters relating to anti-fading, and can be carried out, for example, according to the following steps:
(1) Measurement sample reaction process: supply a measurement sample to a flow path or a well, and bring the measurement sample into contact with a sensor part formed on a part of a metal thin film that hits the bottom surface of the measurement substance, so that the captured substance and the measurement target are contacted. Reacting with a substance;
(2) Fluorescent labeling step: a step of reacting the measurement target substance captured by the capture substance with the fluorescent labeling agent by bringing the solution containing the fluorescent labeling agent into contact with the sensor part that has undergone the measurement sample contacting step;
(3) Fluorescence measurement step: After filling the flow path or well with a fluorescence measurement solution, the sensor unit that has passed through the fluorescence labeling step is irradiated with excitation light corresponding to the phosphor contained in the fluorescence labeling agent, and is generated based on SPFS. Measuring the intensity of the fluorescence (assay signal).
なお、蛍光測定工程において測定されるアッセイシグナルとの対比のため、測定試料の代わりにブランク（たとえば緩衝液のみ）を用いること以外は上記と同様にして蛍光の強度（ブランクシグナル）を測定する工程や、測定試料反応工程の後、蛍光標識工程の前に、蛍光測定工程と同様にして蛍光の強度（ベースラインシグナル）を測定する工程を、さらに行ってもよい。 In order to contrast with the assay signal measured in the fluorescence measurement step, the fluorescence intensity (blank signal) is measured in the same manner as above except that a blank (for example, only a buffer solution) is used instead of the measurement sample. Alternatively, after the measurement sample reaction step and before the fluorescence labeling step, a step of measuring the intensity of fluorescence (baseline signal) in the same manner as the fluorescence measurement step may be further performed.
また、測定試料反応工程と蛍光標識工程の間、および蛍光標識工程と蛍光測定工程の間には、必要に応じて、前の工程で用いて後に残存している溶液等を洗い流すための洗浄工程を設けてもよい。 In addition, between the measurement sample reaction step and the fluorescence labeling step, and between the fluorescence labeling step and the fluorescence measurement step, a washing step for washing away the remaining solution used in the previous step, if necessary, May be provided.
測定試料反応工程、蛍光標識工程、蛍光測定工程、および洗浄工程では、それぞれ測定試料、蛍光標識溶液、蛍光測定液、および洗浄液で流路またはウェルを満たし、各工程を終える際に除去するようにする。なお、蛍光測定液は、蛍光標識剤や洗浄剤などを含まない水、緩衝液その他の溶媒であり、たとえば蛍光標溶液や洗浄液の調製に用いられる緩衝液そのものを蛍光測定液として用いることができる。また、測定試料の調製の際に必要に応じて用いられる検体希釈液としても、同様の緩衝液を用いることができる。 In the measurement sample reaction step, fluorescence labeling step, fluorescence measurement step, and washing step, fill the flow path or well with the measurement sample, fluorescence labeling solution, fluorescence measurement solution, and washing solution, respectively, and remove them when finishing each step To do. The fluorescence measurement solution is water that does not contain a fluorescent labeling agent or a cleaning agent, a buffer solution, or other solvent. For example, the buffer solution itself used for the preparation of a fluorescent standard solution or a cleaning solution can be used as the fluorescence measurement solution. . Moreover, the same buffer solution can also be used as the specimen diluent used as necessary when preparing the measurement sample.
ＳＰＦＳ測定法の第１実施形態においては、測定試料反応工程、蛍光標識工程または洗浄工程で用いる測定試料（検体希釈液）、蛍光標識溶液または洗浄液に褪色防止剤を添加することにより、蛍光測定工程より前に褪色防止処理が施されたセンサー部を形成し、捕捉物質が固定された領域に褪色防止剤を存在させた状態で励起光を照射して蛍光を測定することができる。測定試料（検体希釈液）、蛍光標識溶液または洗浄液に対する褪色防止剤の添加量や、測定試料反応工程、蛍光標識工程または洗浄工程（すなわち褪色防止処理）の時間は、褪色防止処理の第２実施形態との関係で前述したことと同様である。 In the first embodiment of the SPFS measurement method, a fluorescence measurement step is performed by adding an anti-fading agent to a measurement sample (specimen diluent), a fluorescence labeling solution or a washing solution used in a measurement sample reaction step, a fluorescence labeling step or a washing step. It is possible to measure fluorescence by forming a sensor part that has been subjected to anti-fading treatment earlier and irradiating excitation light in a state where the anti-fading agent is present in the region where the capture substance is fixed. The amount of anti-fading agent added to the measurement sample (specimen diluent), fluorescent labeling solution or washing solution, and the time of the measurement sample reaction step, fluorescent labeling step or washing step (ie anti-fading treatment) are the second implementation of the anti-fading treatment. This is the same as described above in relation to the form.
一方、ＳＰＦＳ測定法の第２実施形態においては、蛍光測定液に褪色防止剤を添加することにより、捕捉物質に捕捉された測定対象物質に結合した蛍光標識剤の周囲の溶液（つまり蛍光測定液）中に褪色防止剤を存在させた状態で、励起光を照射して蛍光を測定することができる。蛍光測定液（緩衝液等）に対する褪色防止剤の添加量も特に限定されるものではなく、前述したように、褪色防止効果を考慮しながら適宜調節することができる。 On the other hand, in the second embodiment of the SPFS measurement method, by adding an anti-fading agent to the fluorescence measurement solution, a solution around the fluorescent labeling agent bound to the measurement target substance captured by the capture substance (that is, the fluorescence measurement solution) ) And fluorescence can be measured by irradiating with excitation light in the presence of an anti-fading agent. The addition amount of the anti-fading agent with respect to the fluorescence measurement solution (buffer solution or the like) is not particularly limited, and can be appropriately adjusted in consideration of the anti-fading effect as described above.
・測定試料
測定試料は、前述の通り、典型的にはヒトや動物から採取された検体であり、その代表例としては血液（血清、血漿を含む）及び尿が挙げられる。細胞を測定対象物質とする場合も、所定の方法に従って採取または培養された細胞を用いて調製された懸濁液を測定試料とすることもできる。また、採取された検体は、必要に応じて、抗凝固処理、遠心分離、抽出、その他の必要な処理を行い、希釈液（緩衝液等）で適当な濃度に希釈した上で、測定試料としてもよい。Measurement sample As described above, the measurement sample is typically a specimen collected from a human or an animal, and typical examples thereof include blood (including serum and plasma) and urine. In the case of using cells as a substance to be measured, a suspension prepared using cells collected or cultured according to a predetermined method can also be used as a measurement sample. The collected specimen is subjected to anticoagulation, centrifugation, extraction, and other necessary treatments as necessary, diluted to an appropriate concentration with a diluent (buffer solution, etc.), and used as a measurement sample. Also good.
・測定対象物質
測定対象物質は、前述の通り、測定試料から検出又は定量するタンパク質、脂質、糖、核酸、その他の生体関連物質である。測定試料が血液の場合の測定対象物質の例として、心筋マーカーであるトロポニンＩ、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ、Ｄ−Ｄｉｍｅｒ等のタンパク質が挙げられる。-Substance to be measured As described above, the substance to be measured is a protein, lipid, sugar, nucleic acid, or other biological substance to be detected or quantified from a measurement sample. Examples of substances to be measured when the measurement sample is blood include myocardial markers such as troponin I, NT-ProBNP, and D-Dimer.
・蛍光標識剤
蛍光標識剤は、測定対象物質と特異的に結合する物質と、所定の励起光を照射することで蛍光を発することのできる蛍光体とを含む複合体である。たとえば、測定対象物質が抗原（タンパク質）である場合は、それと特異的に結合する抗体と蛍光体との複合体（蛍光標識化二次抗体）を蛍光標識剤として用いることができる。このような蛍光標識剤は、公知の手法によって作製することができ、特定の測定対象物質に対する蛍光標識剤は市販もされている。-Fluorescent labeling agent A fluorescent labeling agent is a complex containing a substance that specifically binds to a substance to be measured and a fluorescent substance that can emit fluorescence when irradiated with predetermined excitation light. For example, when the substance to be measured is an antigen (protein), a complex of an antibody that specifically binds to the substance and a fluorescent substance (fluorescently labeled secondary antibody) can be used as the fluorescent labeling agent. Such a fluorescent labeling agent can be prepared by a known technique, and a fluorescent labeling agent for a specific measurement target substance is also commercially available.
本発明のＳＰＦＳ測定法における蛍光標識剤に用いられる蛍光体は、公知のＳＰＦＳ測定法における蛍光標識剤と同様のものであればよく、公知の各種の蛍光体を用いることができるが、代表的な蛍光体としては蛍光物質が挙げられる。 The phosphor used for the fluorescent labeling agent in the SPFS measurement method of the present invention may be the same as the fluorescent labeling agent in the known SPFS measurement method, and various known phosphors can be used. Examples of such phosphors include fluorescent materials.
蛍光物質としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。あるいは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子などを用いることができる。なお、このような色素分子の総称は、化合物中の主要な構造（骨格）または登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光物質の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できる。 Examples of the fluorescent substance include rhodamine dye molecules, squarylium dye molecules, cyanine dye molecules, aromatic ring dye molecules, oxazine dye molecules, carbopyronine dye molecules, and pyromesene dye molecules. Alternatively, Alexa Fluor (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dye molecule, BODIPY (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dye molecule, Cy (registered trademark, manufactured by GE Healthcare) dye molecule, DY dye molecule (registered) Trademark, manufactured by DYOMICS), HiLyte (registered trademark, manufactured by Anaspec), dye molecule, DyLight (registered trademark, manufactured by Thermo Scientific), dye molecule, ATTO (registered trademark, manufactured by ATTO-TEC) Molecules, MFP (registered trademark, manufactured by Mobitec) -based dye molecules, and the like can be used. In addition, the generic name of such a dye molecule is named based on the main structure (skeleton) in the compound or a registered trademark, and the range of the fluorescent substance belonging to each of them must be excessively trial and error by those skilled in the art. Can be grasped appropriately.
− キット −
本発明のキットは、前述したような本発明のセンサーチップを作製するため、または前述したような本発明のＳＰＦＳ測定法を実施するために使用されるものである。そのようなキットの実施形態としては、たとえば下記のような実施形態が挙げられる。− Kit −
The kit of the present invention is used for producing the sensor chip of the present invention as described above or for carrying out the SPFS measurement method of the present invention as described above. Examples of such kit embodiments include the following embodiments.
・キットの第１実施形態
本発明のキットの第１実施形態は、前述した褪色防止処理の第１実施形態およびＳＰＦＳ測定法の第１実施形態の（Ａ）に対応しており、少なくとも、捕捉物質が固定された領域に対して、褪色防止剤を含有する溶液を接触させることによる褪色防止処理が行われているＳＰＦＳ用センサーチップを含む。また、このキットは、上記のＳＰＦＳ用センサーチップを使用して行われるＳＰＦＳ測定法に適合した試薬類や器具類、たとえば検体希釈液、洗浄液（またはそれを調製するための洗浄剤および溶媒ならびに調製器具）、蛍光標識液（またはそれを調製するための二次抗体、蛍光体、反応試薬および溶媒ならびに調製器具）、蛍光測定液、あるいはこれらの溶液を予め収容して密封された、ＳＰＦＳ装置に装填して使用することのできる試薬収容器を含んでいてもよい。このキットはさらに、褪色防止処理の第１実施形態またはＳＰＦＳ測定法の第１実施形態の（Ｂ）の説明書を含んでいてもよい。First Embodiment of Kit The first embodiment of the kit of the present invention corresponds to (A) of the first embodiment of the fading prevention treatment and the first embodiment of the SPFS measurement method described above, and at least captures It includes an SPFS sensor chip that has been subjected to anti-fading treatment by bringing a solution containing the anti-fading agent into contact with the region where the substance is fixed. This kit also includes reagents and instruments suitable for the SPFS measurement method performed using the above-mentioned SPFS sensor chip, such as a sample diluent, a cleaning liquid (or a cleaning agent and a solvent for preparing the same, and a preparation). Instrument), fluorescent labeling solution (or secondary antibody, phosphor, reaction reagent and solvent and preparation instrument for preparing the same), fluorescence measuring solution, or SPFS device that contains and seals these solutions in advance and sealed A reagent container that can be loaded and used may be included. The kit may further include instructions for (B) of the first embodiment of the anti-fading treatment or the first embodiment of the SPFS measurement method.
・キットの第２実施形態
本発明のキットの第２実施形態は、前述した褪色防止処理の第２実施形態およびＳＰＦＳ測定法の第１実施形態の（Ｂ）に対応しており、少なくとも、ＳＰＦＳ用センサーチップ（捕捉物質が固定された領域に対して、褪色防止剤を含有する溶液を接触させることによる褪色防止処理は行われていないもの）と、褪色防止処理液（またはそれを調製するための褪色防止剤および溶媒）を含む。褪色防止処理液は、試料溶液、洗浄液、蛍光標識溶液、または蛍光測定工程の前に行われる工程で用いられるその他の溶液に褪色防止剤を添加したものとして調製される。たとえば、褪色防止剤を添加した試料溶液を褪色防止処理液として利用する場合、褪色防止剤の溶液と検体希釈液を個別に２個のパックにしておくか、あるいは最初から検体希釈液に褪色防止剤を溶解させて１個のパックにしておき、ＳＰＦＳ測定法を実施する際に、そのようなパックの内容物を検体またはその処理物と混合して試料溶液を調製するようにしてもよい。褪色防止剤を添加した洗浄液または褪色防止剤を添加した蛍光標識溶液を褪色防止処理液として利用する場合も同様である。また、このキットは、上記のＳＰＦＳ用センサーチップを使用して行われるＳＰＦＳ測定法に適合した試薬類や器具類、たとえば検体希釈液、洗浄液（ないしそれを調製するための洗浄剤および溶媒ならびに調製器具）、蛍光標識液（ないしそれを調製するための二次抗体、蛍光体、反応試薬および溶媒ならびに調製器具）、蛍光測定液、あるいは上記の褪色防止処理液を含めた各種の溶液を予め収容して密封された、ＳＰＦＳ装置に装填して使用することのできる試薬収容器を含んでいてもよい。このキットはさらに、褪色防止処理の第２実施形態またはＳＰＦＳ測定法の第１実施形態の（Ｂ）の説明書を含んでいてもよい。Second Embodiment of Kit The second embodiment of the kit of the present invention corresponds to (B) of the second embodiment of the anti-fading process and the first embodiment of the SPFS measurement method described above, and at least SPFS. Sensor chip (not subjected to anti-fading treatment by bringing a solution containing an anti-fading agent into contact with the area where the capture substance is fixed) and anti-fading treatment liquid (or to prepare it) Antifading agents and solvents). The anti-fading treatment solution is prepared by adding an anti-fading agent to a sample solution, a cleaning solution, a fluorescent labeling solution, or other solution used in a step performed before the fluorescence measurement step. For example, when using a sample solution with an anti-fading agent as an anti-fading solution, either keep the anti-fading agent solution and the sample diluent in two packs separately, or prevent the sample diluent from fading from the beginning. The agent may be dissolved to form one pack, and when performing the SPFS measurement method, the contents of such a pack may be mixed with the specimen or the processed product to prepare a sample solution. The same applies to the case where a cleaning solution with an anti-fading agent or a fluorescent labeling solution with an anti-fading agent is used as the anti-fading treatment solution. This kit also includes reagents and instruments suitable for the SPFS measurement method performed using the above-mentioned SPFS sensor chip, such as a sample diluent, a cleaning solution (or a cleaning agent and a solvent for preparing the same, and a preparation). Instruments), fluorescent labeling solutions (or secondary antibodies, phosphors, reaction reagents and solvents and preparation instruments for preparing them), fluorescence measurement solutions, or various solutions including the above-described anti-fading treatment solution In addition, a reagent container that can be loaded into the SPFS device and used can be included. The kit may further include instructions for (B) of the second embodiment of the anti-fading treatment or the first embodiment of the SPFS measurement method.
・キットの第３実施形態
本発明のキットの第３実施形態は、前述したＳＰＦＳ測定法の第２実施形態に対応しており、少なくとも、ＳＰＦＳ用センサーチップ（捕捉物質が固定された領域に対して、褪色防止剤を含有する溶液を接触させることによる褪色防止処理は行われていないもの）と、褪色防止処理液（またはそれを調製するための褪色防止剤および溶媒）を含む。ここで、上記のＳＰＦＳ用センサーチップは、捕捉物質が固定された領域に対して、褪色防止剤を含有する溶液を接触させることによる褪色防止処理が行われていないものであってもよいし、ＳＰＦＳ測定法の第１実施形態と組み合わせる場合は、そのような褪色防止処理が行われているものであってもよい。褪色防止処理液は、蛍光測定液に褪色防止剤を添加したものとして調製される。たとえば、褪色防止剤の溶液と蛍光測定液を個別に２個のパックにしておいてもよいし、最初から蛍光測定液に褪色防止剤を溶解させて１個のパックにしておいてもよい。また、このキットは、上記のＳＰＦＳ用センサーチップを使用して行われるＳＰＦＳ測定法に適合した試薬類や器具類、たとえば検体希釈液、洗浄液（ないしそれを調製するための洗浄剤および溶媒ならびに調製器具）、蛍光標識液（ないしそれを調製するための二次抗体、蛍光体、反応試薬および溶媒ならびに調製器具）、あるいは上記の褪色防止処理液を含めた各種の溶液を予め収容して密封された、ＳＰＦＳ装置に装填して使用することのできる試薬収容器を含んでいてもよい。このキットはさらに、ＳＰＦＳ測定法の第２実施形態の説明書を含んでいてもよい。Third Embodiment of Kit The third embodiment of the kit of the present invention corresponds to the second embodiment of the SPFS measurement method described above, and at least the sensor chip for SPFS (with respect to the region where the capture substance is fixed) And an anti-fading treatment solution by contact with a solution containing the anti-fading agent) and an anti-fading treatment liquid (or an anti-fading agent and a solvent for preparing the anti-fading treatment solution). Here, the SPFS sensor chip may not be subjected to the anti-fading treatment by bringing a solution containing the anti-fading agent into contact with the region where the trapping substance is fixed. When combined with the first embodiment of the SPFS measurement method, such fading prevention processing may be performed. The anti-fading treatment solution is prepared by adding an anti-fading agent to the fluorescence measurement solution. For example, the anti-fading agent solution and the fluorescence measuring solution may be separately made into two packs, or the anti-fading agent may be dissolved in the fluorescent measuring solution from the beginning to make one pack. This kit also includes reagents and instruments suitable for the SPFS measurement method performed using the above-mentioned SPFS sensor chip, such as a sample diluent, a cleaning solution (or a cleaning agent and a solvent for preparing the same, and a preparation). Instruments), fluorescent labeling solutions (or secondary antibodies, phosphors, reaction reagents and solvents and preparation instruments for preparing them), or various solutions including the above-described anti-fading treatment solution, and sealed in advance. In addition, a reagent container that can be used by being loaded into the SPFS apparatus may be included. The kit may further include instructions for the second embodiment of the SPFS measurement method.
［実施例１］
（１）センサーチップの作製
工程（ａ）：誘電体部材の材料としてシクロオレフィンポリマー樹脂（日本ゼオン株式会社）、ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）用いて作成した略台形の断面形状を持つプリズム部材の主面に、まずクロム薄膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金薄膜をスパッタリング法により形成した。このクロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。[Example 1]
(1) Manufacture of sensor chip Step (a): Main surface of a prism member having a substantially trapezoidal cross-sectional shape created by using cycloolefin polymer resin (ZEON Corporation) and ZEONEX (registered trademark) as a material of a dielectric member. First, a chromium thin film was formed by sputtering, and further a gold thin film was formed on the surface by sputtering. The chromium thin film had a thickness of 1 to 3 nm, and the gold thin film had a thickness of 44 to 52 nm.
工程（ｂ）：得られた成膜済みプリズムを、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭ（自己組織化単分子膜）を形成した。プリズムを該溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。 Step (b): The obtained film-formed prism is immersed in an ethanol solution containing 1 mM 10-carboxy-1-decanethiol for 24 hours or more to form a SAM (self-assembled monolayer) on one side of the gold thin film. did. The prism was removed from the solution, washed with ethanol and isopropanol, and then dried with an air gun.
工程（ｃ）：ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）製の外径７ｍｍ、内径５ｍｍ、長さ１５ｍｍの円筒部材の一方の端に、深さ０．５ｍｍ、幅１ｍｍの溝を形成し、フッ素ゴム製の太さ１ｍｍ、内径６ｍｍのＯリング（株式会社ミスミ）を設置した溶液貯留部材を、該工程（ｂ）で得られたプリズムの金属薄膜上に設置した。溶液貯留部材からの漏出を防ぐため、ステンレス製の板材２枚を用いて溶液貯留部材及びプリズムを上下から挟み込み、ビスで固定した（上側のステンレス製の板材には、溶液貯留部材へ試薬等を出し入れするための開口部が設けられている）。 Step (c): A groove having a depth of 0.5 mm and a width of 1 mm is formed on one end of a cylindrical member made of polymethyl methacrylate resin (PMMA) having an outer diameter of 7 mm, an inner diameter of 5 mm, and a length of 15 mm. A solution storage member provided with an O-ring (Misumi Co., Ltd.) having a thickness of 1 mm and an inner diameter of 6 mm was set on the metal thin film of the prism obtained in the step (b). In order to prevent leakage from the solution storage member, the solution storage member and the prism were sandwiched from above and below using two stainless steel plates and fixed with screws (the upper stainless steel plate was loaded with a reagent or the like on the solution storage member) An opening for taking in and out is provided).
工程（ｄ）：Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を２５ｍｇ／ｍＬと、水溶性カルボジイミド〔ＥＤＣ〕を２５ｍｇ／ｍＬとを含むＭＥＳ〔2-morpholinoethanesulfonic acid〕緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）を０．２ｍＬ導入し、２０分間反応させた後、反応液を抜き取り、抗トロポニンＩ〔ＴｎＩ〕モノクローナル抗体を含むＡｃｅｔａｔｅ溶液（ｐＨ６．０）０．２ｍＬを導入し、３０分間反応させることで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した。 Step (d): MES [2-morpholinoethanesulfonic acid] buffered saline (pH 6.0) containing 25 mg / mL N-hydroxysuccinimide [NHS] and 25 mg / mL water-soluble carbodiimide [EDC] After introducing 0.2 mL and reacting for 20 minutes, the reaction solution was taken out, 0.2 mL of an Acetate solution (pH 6.0) containing anti-troponin I [TnI] monoclonal antibody was introduced, and the mixture was reacted for 30 minutes. The primary antibody was immobilized on the top.
工程（ｅ）：まず、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）０．２ｍＬに褪色防止剤としてＬ−アスコルビン酸Ｎａを０．１重量％添加した溶液を流路に導入し、１５分間反応させることで、未反応の活性化エステル基の不活性化と同時にセンサー部の褪色防止処理を行った。 Step (e): First, a solution obtained by adding 0.1% by weight of L-ascorbic acid Na as an anti-fading agent to 0.2 mL of 50 mM Tris (pH 7.4) is introduced into the flow path and reacted for 15 minutes. At the same time as the inactivation of the unreacted activated ester group, the anti-fading treatment of the sensor part was performed.
工程（ｆ）：溶液貯留部材を除去し、流路を形成するための貫通孔（７ｍｍ×３０ｍｍ）を形成したＰＥＴ基材両面テープＮｏ．５６１０（日東電工株式会社）（薄層部材２０４）を用いて、流入・排出口２０７および液溜部２０８を有する、厚さ１０ｍｍのポリメチルメタクリレート製プレート（蓋部材）を接着し、流路２０６を形成し、センサーチップとした。
Step (f): PET base double-sided tape No. 1 having a through hole (7 mm × 30 mm) for removing the solution storage member and forming a flow path. Using 5610 (Nitto Denko Corporation) (thin layer member 204), a 10 mm thick polymethylmethacrylate plate (lid member) having an inlet /
（２）センサーチップを用いた測定
測定試料反応工程：（１）によって作製したセンサーチップに、抗原となるトロポニンＩを０．１ｎｇ／ｍＬと１重量％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を注入し、固相化された１次抗体と抗原を３０分間反応させた。抗原を含む溶液を吸引除去し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含むＴＢＳを注入・吸引除去する操作を数回繰り返し、洗浄操作を行った。(2) Measurement using sensor chip Measurement sample reaction step: PBS buffered physiology containing 0.1 ng / mL of troponin I as an antigen and 1 wt% bovine serum albumin [BSA] in the sensor chip prepared in (1) Saline was injected, and the immobilized primary antibody and antigen were reacted for 30 minutes. The solution containing the antigen was removed by suction, and the operation of injecting and removing TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 was repeated several times to perform the washing operation.
ベースラインシグナル測定工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含むＴＢＳで流路を満たした状態で、ブランクとして扱う蛍光（ベースラインシグナル）を、光源としてレーザー光源を用いて、出力１ｍＷ以下（０．２〜０．８ｍＷ）、波長６３５ｎｍのレーザー光を、光学フィルター（シグマ光機（株））によりフォトン量を調節し、センサーチップの金属薄膜に照射し、カットフィルターとして蛍光成分以外の波長をカットするカットフィルター、対物レンズ（２０倍）を用いてＣＣＤイメージセンサー（テキサスインスツルメント（株）製）により検出した。 Baseline signal measurement step: Fluorescence (baseline signal) treated as a blank with a flow path filled with TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 using a laser light source as a light source and an output of 1 mW or less (0.2 ~ 0.8mW), 635nm wavelength laser light is controlled by optical filter (Sigma Kogyo Co., Ltd.), irradiates the metal thin film of the sensor chip, and cuts wavelengths other than fluorescent components as a cut filter Detection was performed with a CCD image sensor (manufactured by Texas Instruments Co., Ltd.) using a cut filter and an objective lens (20 ×).
蛍光標識工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含むＴＢＳを吸引除去し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標名）６４７タンパク質ラベリングキット（インビトロゲン社）を用いて蛍光標識化した抗トロポニンＩ〔ＴｎＩ〕モノクローナル抗体（一次抗体とは異なるクローン）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を流路に注入し、１５分間反応させ、免疫複合体を形成させた。蛍光標識抗体を含む溶液であるＰＢＳ緩衝生理食塩水を吸引除去した後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含むＴＢＳを注入・吸引除去する操作を数回繰り返し、洗浄操作を行った。 Fluorescence labeling step: anti-troponin I [TnI] monoclonal antibody (primary primary) obtained by aspirating and removing TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 and fluorescence-labeling using Alexa Fluor ™ 647 protein labeling kit (Invitrogen) PBS buffered saline containing a clone different from the antibody) was injected into the channel and allowed to react for 15 minutes to form an immune complex. The PBS buffered saline, which is a solution containing the fluorescently labeled antibody, was removed by suction, and then the operation of injecting and removing TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 was repeated several times to perform the washing operation.
アッセイシグナル測定工程：Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含むＴＢＳに褪色防止剤としてＬ−アスコルビン酸Ｎａを０．１重量％加え、褪色防止剤が添加された蛍光測定液とした。この蛍光測定液で流路を満たした状態で、ベースラインシグナル測定と同様に蛍光を測定し、免疫複合体に由来する蛍光シグナルを測定した。レーザー光は、アッセイシグナル測定工程の開始から少なくとも１０分間継続して照射し、その間の蛍光シグナルを測定した。 Assay signal measurement step: A TBS containing 0.05% by weight of Tween 20 was added 0.1% by weight of L-ascorbic acid Na as an anti-fading agent to obtain a fluorescence measuring solution to which the anti-fading agent was added. In a state where the flow path was filled with this fluorescence measurement solution, fluorescence was measured in the same manner as the baseline signal measurement, and the fluorescence signal derived from the immune complex was measured. Laser light was continuously emitted for at least 10 minutes from the start of the assay signal measurement step, and the fluorescence signal was measured during that time.
ブランクシグナル測定工程：標識化抗体の非特異的な吸着に由来するブランクシグナルの測定は、上記測定試料反応工程において、抗原となるトロポニンＩを含まない１重量％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水を注入すること以外は同様の工程により、別のセンサーチップを用いて行った。 Blank signal measurement step: The measurement of the blank signal derived from non-specific adsorption of the labeled antibody is performed by using PBS containing 1 wt% bovine serum albumin [BSA] that does not contain troponin I as an antigen in the measurement sample reaction step. A similar sensor chip was used in the same process except injecting buffered saline.
Ｓ／Ｎの算出：上記測定で得られた、ノイズ成分（ベースラインシグナル、ブランクシグナル）と抗原を含む溶液を用いて得られたシグナルから、下記式によりＳ／Ｎを算出した。
Ｓ／Ｎ
＝｜（アッセイシグナル）｜／｜（ベースラインシグナル＋ブランクシグナル）｜Calculation of S / N: S / N was calculated from the signal obtained by using the solution containing the noise component (baseline signal, blank signal) and the antigen obtained in the above measurement according to the following formula.
S / N
= | (Assay signal) | / | (baseline signal + blank signal) |
［実施例２］
（１）センサーチップの作製
実施例１と同様にして、褪色防止処理を施したセンサーチップを作製した。[Example 2]
(1) Production of sensor chip In the same manner as in Example 1, a sensor chip subjected to the fading prevention treatment was produced.
（２）センサーチップを用いた測定
アッセイシグナル測定工程において、褪色防止剤が添加された蛍光測定液の代わりに、褪色防止剤が添加されていないＴｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含むＴＢＳ自体を蛍光測定液として用いたこと、つまりアッセイシグナル測定工程において褪色防止処理を行わなかったこと以外は実施例１と同様にして、ベースラインシグナル、アッセイシグナルおよびブランクシグナルを測定した。(2) Measurement using sensor chip In the assay signal measurement step, instead of the fluorescence measurement solution to which the anti-fading agent is added, TBS itself containing 0.05% by weight of Tween 20 to which no anti-fading agent is added is measured by fluorescence. Baseline signals, assay signals, and blank signals were measured in the same manner as in Example 1 except that they were used as solutions, that is, the anti-fading treatment was not performed in the assay signal measurement step.
［実施例３］
（１）センサーチップの作製
工程（ｅ）において、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）０．２ｍＬに褪色防止剤を添加せず、センサー部の褪色防止処理を行わなかった（未反応の活性化エステル基の不活性化のみ行った）こと以外は実施例１と同様にして、センサーチップを作製した。[Example 3]
(1) Preparation of sensor chip In step (e), no anti-fading agent was added to 0.2 mL of 50 mM Tris (pH 7.4), and no anti-fading treatment was performed on the sensor part (unreacted activated ester). A sensor chip was produced in the same manner as in Example 1 except that only the group was inactivated.
（２）センサーチップを用いた測定
実施例１と同様にして、ベースラインシグナル、アッセイシグナルおよびブランクシグナルを測定した。(2) Measurement using sensor chip In the same manner as in Example 1, a baseline signal, an assay signal, and a blank signal were measured.
［実施例４］
（１）センサーチップの作製
工程（ｅ）において、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）０．２ｍＬに褪色防止剤を添加せず、センサー部の褪色防止処理を行わなかった（未反応の活性化エステル基の不活性化のみ行った）こと以外は実施例１と同様にして、センサーチップを作製した。[Example 4]
(1) Preparation of sensor chip In step (e), no anti-fading agent was added to 0.2 mL of 50 mM Tris (pH 7.4), and no anti-fading treatment was performed on the sensor part (unreacted activated ester). A sensor chip was produced in the same manner as in Example 1 except that only the group was inactivated.
（２）センサーチップを用いた測定
アッセイシグナル測定工程において、褪色防止剤が添加された蛍光測定液の代わりに、褪色防止剤が添加されていないＴｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含むＴＢＳ自体を蛍光測定液として用いたこと、逆にベースラインシグナル工程において、上記の褪色防止剤が添加された蛍光測定液を用いたこと、つまりアッセイシグナル測定工程で褪色防止処理を行わないかわりにベースラインシグナル測定工程で褪色防止処理をおこなうようにしたこと以外は実施例１と同様にして、ベースラインシグナル、アッセイシグナルおよびブランクシグナルを測定した。(2) Measurement using sensor chip In the assay signal measurement step, instead of the fluorescence measurement solution to which the anti-fading agent is added, TBS itself containing 0.05% by weight of Tween 20 to which no anti-fading agent is added is measured by fluorescence. In contrast, in the baseline signal process, the fluorescence measurement liquid to which the anti-fading agent is added is used, that is, the baseline signal measurement process is performed instead of performing the anti-fading process in the assay signal measurement process. The baseline signal, the assay signal, and the blank signal were measured in the same manner as in Example 1 except that the anti-fading treatment was performed.
［実施例５］
（１）センサーチップの作製
工程（ｅ）において、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）０．２ｍＬに褪色防止剤を添加せず、センサー部の褪色防止処理を行わなかった（未反応の活性化エステル基の不活性化のみ行った）こと以外は実施例１と同様にして、センサーチップを作製した。[Example 5]
(1) Preparation of sensor chip In step (e), no anti-fading agent was added to 0.2 mL of 50 mM Tris (pH 7.4), and no anti-fading treatment was performed on the sensor part (unreacted activated ester). A sensor chip was produced in the same manner as in Example 1 except that only the group was inactivated.
（２）センサーチップを用いた測定
アッセイシグナル測定工程において、（i）Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含むＴＢＳに褪色防止剤としてイソアスコルビン酸Ｎａを０．１重量％加え、褪色防止剤が添加された蛍光測定液として用い、ブランクシグナル測定工程において、上記のイソアスコルビン酸Ｎａの褪色防止剤が添加された蛍光測定液を用いる、つまりアッセイシグナル測定工程およびブランクシグナル測定工程で褪色防止剤として、アスコルビン酸Ｎａのかわりにイソアスコルビン酸Ｎａを使用して褪色防止処理を行い、また（ii）レーザー光の照射を、出力３０ｍＷ、波長６６０ｎｍのレーザー光源を用いて、１回あたり数秒間程度の照射を５回繰り返すようにし、それ以外は実施例４と同様にして、ベースラインシグナル、アッセイシグナルおよびブランクシグナルを測定した。(2) Measurement using sensor chip In the assay signal measurement step, (i) 0.1 wt% of isoascorbic acid Na was added to TBS containing 0.05 wt% of Tween 20 as an antifading agent, and an antifading agent was added. In the blank signal measurement step, the fluorescence measurement solution to which the anti-fading agent of isoascorbic acid is added is used. That is, ascorbine is used as the anti-fading agent in the assay signal measurement step and the blank signal measurement step. Performs anti-fading treatment using isoascorbic acid Na instead of acid Na. (Ii) Laser light is irradiated for about several seconds per time using a laser light source with an output of 30 mW and a wavelength of 660 nm. Repeated 5 times, otherwise the same as in Example 4, baseline signal, Assay signal and blank signal were measured.
［比較例１］
（１）センサーチップの作製
工程（ｅ）において、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）０．２ｍＬに褪色防止剤を添加せず、センサー部の褪色防止処理を行わなかった（未反応の活性化エステル基の不活性化のみ行った）こと以外は実施例１と同様にして、センサーチップを作製した。[Comparative Example 1]
(1) Preparation of sensor chip In step (e), no anti-fading agent was added to 0.2 mL of 50 mM Tris (pH 7.4), and no anti-fading treatment was performed on the sensor part (unreacted activated ester). A sensor chip was produced in the same manner as in Example 1 except that only the group was inactivated.
（２）センサーチップを用いた測定
実施例１の（１）で作成した、センサー部が褪色防止処理されたセンサーチップの代わりに、比較例の（１）で作製した、センサー部が褪色防止処理されていないセンサーチップを使用したこと以外は実施例１と同様にして、ベースラインシグナル、アッセイシグナルおよびブランクシグナルを測定した。(2) Measurement using sensor chip Instead of the sensor chip created in (1) of Example 1 in which the sensor part was subjected to anti-fading treatment, the sensor part produced in (1) of the comparative example was subjected to anti-fading treatment. Baseline signals, assay signals, and blank signals were measured in the same manner as in Example 1 except that a sensor chip that was not used was used.
［比較例２］
（１）センサーチップの作製
工程（ｅ）において、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）０．２ｍＬに褪色防止剤を添加せず、センサー部の褪色防止処理を行わなかった（未反応の活性化エステル基の不活性化のみ行った）こと以外は実施例１と同様にして、センサーチップを作製した。[Comparative Example 2]
(1) Preparation of sensor chip In step (e), no anti-fading agent was added to 0.2 mL of 50 mM Tris (pH 7.4), and no anti-fading treatment was performed on the sensor part (unreacted activated ester). A sensor chip was produced in the same manner as in Example 1 except that only the group was inactivated.
（２）センサーチップを用いた測定
（i）実施例１の（１）で作製した、センサー部が褪色防止処理されたセンサーチップの代わりに、比較例の（１）で作製した、センサー部が褪色防止処理されていないセンサーチップを使用し、また（ii）アッセイシグナル測定工程において、出力３０ｍＷ、波長６６０ｎｍのレーザー光源を用いて、１回あたり数秒間程度の照射を５回繰り返すようにし、それ以外は実施例１と同様にして、ベースラインシグナル、アッセイシグナルおよびブランクシグナルを測定した。(2) Measurement using sensor chip (i) Instead of the sensor chip manufactured in (1) of Example 1 in which the sensor part was subjected to anti-fading treatment, the sensor part manufactured in (1) of Comparative Example was Using a sensor chip that has not been subjected to anti-fading treatment, and (ii) in the assay signal measurement step, using a laser light source with an output of 30 mW and a wavelength of 660 nm, irradiation for about several seconds per time is repeated five times. The baseline signal, assay signal, and blank signal were measured in the same manner as Example 1 except for the above.
＜結果＞
実施例１〜４および比較例１の結果を表１および図６に示す。Ｓ／Ｎ比の数値は、それぞれアッセイシグナル測定工程における励起光の照射時間が０分（照射直後）の値を１としたときの、各照射時間（２，４，６，８または１０分）の値の割合である。センサーチップ作製段階と測定段階の少なくとも一方で褪色防止処理を行っている実施例１〜４はいずれも、褪色防止処理を行っていない比較例１より、照射時間によるＳ／Ｎ比の低下が緩やかであり、褪色防止効果が示されている。特にセンサーチップ作製段階と測定段階（アッセイシグナル測定工程）の両方で褪色防止処理を行った実施例１が、照射時間によるＳ／Ｎ比の低下が最も緩やかで、最も褪色防止効果に優れている。<Result>
The results of Examples 1 to 4 and Comparative Example 1 are shown in Table 1 and FIG. The numerical value of the S / N ratio represents each irradiation time (2, 4, 6, 8 or 10 minutes) when the value of the excitation light irradiation time in the assay signal measurement step is 0 minutes (immediately after irradiation) is 1. Is the ratio of the values of. In each of Examples 1 to 4 in which the anti-fading treatment is performed at least in one of the sensor chip manufacturing stage and the measurement stage, the S / N ratio decreases more slowly with the irradiation time than in Comparative Example 1 in which the anti-fading treatment is not performed. The anti-fading effect is shown. In particular, Example 1 in which the anti-fading treatment was performed both in the sensor chip production stage and in the measurement stage (assay signal measurement process) showed the slowest S / N ratio decrease with irradiation time and the most excellent anti-fading effect. .
また、実施例５および比較例２の結果を表２に示す。Ｓ／Ｎ比の数値は、実施例５のアッセイシグナル測定工程において、励起光の照射回数が１回のときの値を１としたときの、各照射回数（１〜５回）の値の割合である。測定段階（アッセイシグナル測定工程およびブランクシグナル測定工程）で褪色防止処理を行っている実施例５は、褪色防止処理を行っていない比較例２より、照射回数によるＳ／Ｎ比の低下が緩やかであり、褪色防止効果が示されている。特に、実施例５および比較例２の測定条件において、蛍光物質に照射した励起光の出力は３０ｍＷであり、これは実施例１〜４および比較例１で照射した励起光の出力１ｍＷ以下（０．２〜０．８ｍＷ）に比べ、蛍光物質に照射されただけで、褪色を生じる。実施例５は、実施例１と比較して、より優れた褪色防止効果を持つといえる。 The results of Example 5 and Comparative Example 2 are shown in Table 2. The numerical value of the S / N ratio is the ratio of the number of times of irradiation (1 to 5 times) when the value when the number of times of excitation light irradiation is 1 is 1 in the assay signal measurement step of Example 5 It is. In Example 5 where the anti-fading treatment is performed in the measurement stage (assay signal measurement step and blank signal measurement step), the S / N ratio decreases more slowly with the number of times of irradiation than in Comparative Example 2 where the anti-fading treatment is not performed. There is an anti-fading effect. In particular, in the measurement conditions of Example 5 and Comparative Example 2, the output of the excitation light irradiated to the fluorescent material is 30 mW, which is less than 1 mW (0) of the excitation light irradiated in Examples 1 to 4 and Comparative Example 1 .2 to 0.8 mW), it causes a fading just by being irradiated to the fluorescent material. It can be said that Example 5 has a more excellent anti-fading effect as compared to Example 1.
１００ ＳＰＦＳ装置
１１０ センサーチップ
１１１ センサーチップ装填部
１１２ 誘電体部材
１１２ａ 誘電体部材の主面
１１２ｉ 誘電体部材の入射面
１１３ 金属薄膜
１１４ 薄層部材
１１５ 蓋部材
１１６ センサー部
１１７ 微細流路
１２０ 光源
１２１ 励起光
１２２ 反射光
１２３ 受光手段
１３０ 光検出手段
１３１ 蛍光
１３２ 集光部材
１３３ 波長選択機能部材
θ 入射角
２００ センサーチップ
２０１ 誘電体部材
２０１ａ 誘電体部材の主面
２０１ｉ 誘電体部材の入射面
２０２ 金属薄膜
２０３ センサー部
２０４ 薄層部材
２０５ 蓋部材
２０６ 流路
２０７ 流入・排出口
２０８ 液溜部
３００ センサーチップ
３０１ 誘電体部材
３０１ａ 誘電体部材の主面
３０１ｉ 誘電体部材の入射面
３０２ 金属薄膜
３０３ センサー部
３０４ 溶液貯留部材
３０５ ブロッキング剤溶液
３０６ シール部材DESCRIPTION OF
Claims (20)
前記捕捉物質が固定された領域に対して、褪色防止剤を含有する溶液を接触させることによる褪色防止処理が行われている、センサーチップ。A dielectric member, a metal thin film formed on a main surface of the dielectric member, and a region formed on a part of the metal thin film, to which a capture substance that specifically captures a measurement target substance is fixed A sensor chip for a measurement method based on surface plasmon resonance excitation enhanced spectroscopy, comprising:
A sensor chip in which an anti-fading treatment is performed by bringing a solution containing an anti-fading agent into contact with an area where the capture substance is fixed.
前記捕捉物質に捕捉された測定対象物質に結合した蛍光標識剤の近傍に、褪色防止剤が存在する状態で励起光を照射して蛍光を測定する工程を含む、測定法。A dielectric member, a metal thin film formed on a main surface of the dielectric member, and a region formed on a part of the metal thin film, to which a capture substance that specifically captures a measurement target substance is fixed A measurement method based on surface plasmon resonance excitation enhanced spectroscopy using a sensor chip having
A measurement method comprising a step of irradiating excitation light in the vicinity of a fluorescent labeling agent bound to a measurement target substance captured by the capture substance and irradiating excitation light in the presence of an antifading agent.
を少なくとも含むキット。A dielectric member, a metal thin film formed on a main surface of the dielectric member, and a region formed on a part of the metal thin film, to which a capture substance that specifically captures a measurement target substance is fixed A sensor chip for a measurement method based on surface plasmon resonance excitation enhanced spectroscopy, wherein an anti-fading treatment is performed by bringing a solution containing an anti-fading agent into contact with the region where the capture substance is fixed. A kit containing at least what is being done.
褪色防止処理液またはそれを調製するための褪色防止剤および溶媒
を少なくとも含むキット。A dielectric member, a metal thin film formed on a main surface of the dielectric member, and a region formed on a part of the metal thin film, to which a capture substance that specifically captures a measurement target substance is fixed A kit comprising at least a sensor chip for a measurement method based on surface plasmon resonance excitation enhanced spectroscopy, and an anti-fading treatment solution or an anti-fading agent and a solvent for preparing the same.
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