JPWO2015190439A1 - Screening method for low molecular weight compounds that bind to antibodies - Google Patents
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Abstract
本発明は、抗体への結合能を有する低分子化合物をin silicoで簡便にスクリーニングするための方法を提供することを目的とする。本発明に係る抗体に結合する低分子化合物のスクリーニングする方法は上記抗体の軽鎖の可変領域において、アミノ酸配列1を有するフレームワーク領域に含まれる第1の結合標的部位と、上記抗体の重鎖の可変領域において、アミノ酸配列2を有するフレームワーク領域に含まれる第2の結合標的部位の両方に対して、ドッキングシミュレーションにおいて低ドッキングスコアを示す化合物を選択する工程を含むことを特徴とする。An object of the present invention is to provide a method for simply screening in silico a low molecular weight compound capable of binding to an antibody. The method for screening for a low molecular weight compound that binds to an antibody according to the present invention comprises the step of: combining the first binding target site contained in the framework region having amino acid sequence 1 in the variable region of the light chain of the antibody; The step of selecting a compound exhibiting a low docking score in the docking simulation for both of the second binding target sites contained in the framework region having amino acid sequence 2 in the variable region.
Description
本発明は、抗体への結合能を有する低分子化合物をin silicoで簡便にスクリーニングするための方法に関するものである。 The present invention relates to a method for simply screening in silico a low molecular weight compound capable of binding to an antibody.
近年、開発が盛んに行われている医療用タンパク質の一つに抗体医薬がある。抗体医薬とは、抗体を有効成分とし、抗体の有する機能を利用した医薬品であり、標的分子に対して特異的に働くために従来の医薬品が有していた副作用が軽減されており、且つ、高い治療効果が期待できる。抗体医薬は、実際に様々な病態の改善に寄与している。その一方で、生体に大量に投与されることから、他の医療用タンパク質と比べた場合に純度が品質に与える影響が大きいといわれている。 In recent years, antibody drugs are one of medical proteins that have been actively developed. An antibody drug is a drug that uses an antibody as an active ingredient and uses the function of an antibody, and has reduced side effects that a conventional drug has because it works specifically with a target molecule, and High therapeutic effect can be expected. Antibody drugs actually contribute to the improvement of various pathological conditions. On the other hand, since it is administered in a large amount to a living body, it is said that purity has a great influence on quality when compared with other medical proteins.
これまでの抗体医薬品には、主に免疫グロブリンG(IgG)の分子形が用いられてきた。しかし近年、低コストで生産可能な次世代抗体としてFc領域をなくした低分子抗体の研究が積極的に進められている。その理由の一つとしては、低分子抗体はIgG抗体に比べて製造コストを低減できることが挙げられる。詳しくは、抗体のFc領域には一般的に糖鎖が結合しているため、IgG抗体の製造にはチャイニーズハムスターの卵巣細胞(CHO細胞)を用いる必要があった。しかしCHO細胞を使って製造してもIgG抗体の糖鎖は不均一であり、ヒト抗体の糖鎖と異なるものが混入してヒト体内で抗原抗体反応を引き起こすことがあったため、厳密な精製が必要であった。それに対して低分子抗体は、Fc領域に付加される糖鎖を考慮する必要もないことから、大腸菌や酵母などを使った安価な生産が可能である。 Conventionally, the molecular form of immunoglobulin G (IgG) has been mainly used for antibody drugs. However, in recent years, research has been actively conducted on low molecular weight antibodies that eliminate the Fc region as next-generation antibodies that can be produced at low cost. One reason for this is that low-molecular-weight antibodies can reduce production costs compared to IgG antibodies. Specifically, since a sugar chain is generally bound to the Fc region of an antibody, it was necessary to use Chinese hamster ovary cells (CHO cells) for the production of IgG antibodies. However, even when manufactured using CHO cells, the sugar chain of IgG antibody is heterogeneous, and it may cause an antigen-antibody reaction in the human body due to contamination with something different from the sugar chain of human antibody. It was necessary. On the other hand, low-molecular-weight antibodies do not need to consider the sugar chain added to the Fc region, and therefore can be produced inexpensively using Escherichia coli or yeast.
しかし低分子抗体にはIgG抗体に存在するFc領域がないため、その精製の際に、IgG抗体精製時によく使われるプロテインAをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーを使うことはできない。そこで、低分子抗体の精製のため、抗体のFab領域やFv領域への結合性を有する低分子化合物を固定化した担体を使ったアフィニティークロマトグラフィーカラムが開発されている(特許文献1,プロメティック・バイオサイエンス社製の「Fabsorbent(商標)」)。これらの低分子化合物は、抗体の軽鎖と重鎖との間に存在するヌクレオチド結合部位や、抗体の2つの軽鎖ドメインの間にある窪み(ポケット)を結合標的部位としている(特許文献1,非特許文献1)。 However, since low molecular weight antibodies do not have the Fc region present in IgG antibodies, affinity chromatography using protein A as a ligand often used for IgG antibody purification cannot be used for purification. Therefore, affinity chromatography columns using a carrier on which a low molecular weight compound having binding properties to the Fab region or Fv region of the antibody is immobilized have been developed for the purification of low molecular weight antibodies (Patent Document 1, Prometic). -"Fabsorbent (trademark)" manufactured by Bioscience. These low molecular weight compounds have a nucleotide binding site existing between the light chain and heavy chain of an antibody and a depression (pocket) between two light chain domains of an antibody as a binding target site (Patent Document 1). Non-patent document 1).
このように、近年、Fc領域を有さない抗体医薬品と、それに対応したアフィニティークロマトグラフィーが盛んに開発されている。しかし抗体医薬品の分子形には、これら以外に抗体の軽鎖の可変領域(VL)や重鎖の可変領域(VH)のみを用いたもの(domain antibody)や、ラクダの重鎖の可変領域を用いたもの(nanobody)など様々な分子形があり、これらを標的部位とするアフィニティークロマトグラフィーの開発はまだ不十分である。Thus, in recent years, antibody pharmaceuticals that do not have an Fc region and affinity chromatography corresponding thereto have been actively developed. However, in addition to these, the molecular forms of antibody drugs include those using only the variable region of the light chain of the antibody (V L ) or the variable region of the heavy chain (V H ), or the variable of the heavy chain of a camel. There are various molecular forms such as those using regions (nanobody), and the development of affinity chromatography using these as target sites is still insufficient.
上述したように、現在までに開発されている低分子抗体精製用のアフィニティークロマトグラフィーに使われる低分子化合物は、抗体の軽鎖と重鎖の間に存在するヌクレオチド結合や抗体の2つの軽鎖ドメイン間にある窪みを結合標的部位とするものである。しかし、様々な抗体医薬が開発されており、各抗体を簡便に精製するために、精製用アフィニティークロマトグラフィーに用いる担体に結合させる化合物であって、抗体に高い親和性を有するものを簡便にスクリーニングするための方法が求められている。 As described above, the low molecular weight compounds that have been developed so far for affinity chromatography for purifying low molecular weight antibodies include nucleotide bonds existing between the light chain and heavy chain of the antibody and the two light chains of the antibody. A depression between domains is used as a binding target site. However, various antibody drugs have been developed, and in order to easily purify each antibody, a compound that binds to a carrier used in affinity chromatography for purification and that has a high affinity for the antibody can be easily screened. There is a need for a way to do this.
そこで本発明は、抗体への結合能を有する低分子化合物をin silicoで簡便にスクリーニングするための方法を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for simply screening in silico a low molecular weight compound capable of binding to an antibody.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、抗体の可変領域の中でも比較的変異の少ないフレームワーク領域の特定アミノ酸配列が抗体間で共通して保存されており、当該配列を用いれば様々な抗体に親和性の高い低分子化合物をin silicoで簡便にスクリーニングできることを見出して、本発明を完成した。 The inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above problems. As a result, the specific amino acid sequence of the framework region with relatively few mutations in the variable region of the antibody is conserved in common among the antibodies. By using this sequence, low molecular weight compounds having high affinity for various antibodies can be obtained. The present invention was completed by finding that it can be easily screened in silico.
以下、本発明を示す。 Hereinafter, the present invention will be described.
[1] 抗体に結合する低分子化合物をスクリーニングする方法であって、
上記抗体の軽鎖の可変領域において、下記アミノ酸配列1を有するフレームワーク領域に含まれる第1の結合標的部位と、上記抗体の重鎖の可変領域において、下記アミノ酸配列2を有するフレームワーク領域に含まれる第2の結合標的部位の両方に対して、ドッキングシミュレーションにおいて低ドッキングスコアを示す化合物を選択する工程を含むことを特徴とする方法。
アミノ酸配列1: 配列番号1に示されるアミノ酸配列において、第9位のXaaがセリン、フェニルアラニン、ロイシン、グリシン、アラニンまたはアスパラギン酸であり、第15位のXaaがプロリン、バリン、トレオニンまたはロイシンであり、第24〜31位のXaaが任意のアミノ酸または欠失であり、第39位のXaaがグルタミン、リシン、ロイシンまたはグルタミン酸であり、第79位および第80位のXaaが任意のアミノ酸または欠失であるアミノ酸配列
アミノ酸配列2: 配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第9位のXaaがグリシン、アラニン、プロリンまたはセリンであり、第14位のXaaが任意のアミノ酸または欠失であり、第17位のXaaがグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニンまたはアスパラギン酸であり、第41〜43位のXaaが任意のアミノ酸または欠失であり、第47位のXaaがバリン、メチオニン、イソロイシンまたはロイシンであり、第50位のXaaがバリン、ロイシン、フェニルアラニンまたはイソロイシンであり、第56位のXaaがトレオニン、アルギニン、メチオニン、グルタミン酸、リシン、アスパラギンまたはアスパラギン酸であり、第61位のXaaがロイシン、アラニン、バリンまたはフェニルアラニンであり、第65位のXaaがロイシン、メチオニン、トリプトファンまたはイソロイシンであり、第66位のXaaがセリン、アルギニン、トレオニン、アスパラギン、グリシンまたはシステインであるアミノ酸配列[1] A method for screening a low molecular weight compound that binds to an antibody,
In the variable region of the light chain of the antibody, the first binding target site contained in the framework region having the following amino acid sequence 1, and in the variable region of the heavy chain of the antibody, in the framework region having the amino acid sequence 2 Selecting a compound that exhibits a low docking score in a docking simulation for both of the included second binding target sites.
Amino acid sequence 1: In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, Xaa at the 9th position is serine, phenylalanine, leucine, glycine, alanine or aspartic acid, and Xaa at the 15th position is proline, valine, threonine or leucine Xaa at positions 24 to 31 is any amino acid or deletion, Xaa at position 39 is glutamine, lysine, leucine or glutamic acid, and Xaa at positions 79 and 80 is any amino acid or deletion In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, Xaa at the 9th position is glycine, alanine, proline or serine, Xaa at the 14th position is any amino acid or deletion, Xaa at position 17 is glycine, alanine, serine, threonine, glutami , Glutamic acid, arginine or aspartic acid, Xaa at positions 41 to 43 is any amino acid or deletion, Xaa at position 47 is valine, methionine, isoleucine or leucine, and Xaa at position 50 is valine. , Leucine, phenylalanine or isoleucine, Xaa at position 56 is threonine, arginine, methionine, glutamic acid, lysine, asparagine or aspartic acid, Xaa at position 61 is leucine, alanine, valine or phenylalanine, Amino acid sequence wherein Xaa at position is leucine, methionine, tryptophan or isoleucine, and Xaa at position 66 is serine, arginine, threonine, asparagine, glycine or cysteine
[2] 上記第1の結合標的部位が、下記アミノ酸配列3およびアミノ酸配列4を含む上記[1]に記載の方法。
アミノ酸配列3: 配列番号3に示されるアミノ酸配列において、第4位のXaaがグリタミン、リシン、ロイシンまたはグルタミン酸であるアミノ酸配列
アミノ酸配列4: 配列番号4に示されるアミノ酸配列[2] The method according to [1] above, wherein the first binding target site comprises the following amino acid sequence 3 and amino acid sequence 4.
Amino acid sequence 3: In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence in which the fourth position Xaa is glutamine, lysine, leucine or glutamic acid. Amino acid sequence 4: Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4
[3] 上記第2の結合標的部位が、下記アミノ酸配列5およびアミノ酸配列6を含む上記[1]または[2]に記載の方法。
アミノ酸配列5: 配列番号5に示されるアミノ酸配列において、第6位のXaaが任意のアミノ酸または欠失であるアミノ酸配列
アミノ酸配列6: 配列番号6に示されるアミノ酸配列[3] The method according to [1] or [2] above, wherein the second binding target site comprises the following amino acid sequence 5 and amino acid sequence 6.
Amino acid sequence 5: In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, the amino acid sequence in which Xaa at position 6 is an arbitrary amino acid or a deletion. Amino acid sequence 6: Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
本発明に係るスクリーニング方法は、様々な抗体、例えばFc領域を有さない低分子抗体の精製に用いられるアフィニティークロマトグラフィーの担体にリガンドとして結合させる低分子化合物を、in silicoで簡便にスクリーニングすることができる。また、本発明方法によりスクリーニングされた低分子化合物は、様々な抗体に対して親和性を示す汎用的で多様性のあるものであるので、低分子抗体のみならず免疫グロブリンの工業的な製造に活用することもできる。当該低分子化合物は、抗体の精製の他にも、抗体の特徴付け、同定、定量などにも利用できる。さらに、従来、Fc領域を含む免疫グロブリンの精製の際には、軽鎖と重鎖との間に存在するヌクレオチド結合部位を結合標的部位とした低分子化合物(結合標的部位の数:2)や、軽鎖ドメイン間を標的部位とした低分子化合物(結合標的部位の数:2)が利用されていた。つまり、従来の当該低分子化合物の抗体に対する結合標的部位の数は2である。それに対して本発明方法によりスクリーニングされた低分子化合物は、抗体を構成する重鎖と軽鎖にそれぞれ存在し、抗体1分子当たり合計で4つ存在する結合標的部位において抗体と結合することができる。よって、本発明に係る低分子化合物は、抗体とより高い親和性で結合することができるため、抗体の精製などに非常に適しているといえる。 The screening method according to the present invention involves simple screening in silico of low molecular weight compounds that bind to a carrier of affinity chromatography used for purification of various antibodies, for example, low molecular weight antibodies that do not have an Fc region. Can do. In addition, the low molecular weight compounds screened by the method of the present invention are general-purpose and diverse ones showing affinity for various antibodies, so that they can be used not only for low molecular weight antibodies but also for the industrial production of immunoglobulins. It can also be used. The low molecular weight compound can be used for antibody characterization, identification, quantification and the like in addition to antibody purification. Furthermore, conventionally, when purifying an immunoglobulin containing an Fc region, a low molecular weight compound (number of binding target sites: 2) having a nucleotide binding site existing between a light chain and a heavy chain as a binding target site, A low molecular weight compound (number of binding target sites: 2) having a light chain domain as a target site has been used. That is, the number of binding target sites for the antibody of the conventional low molecular weight compound is 2. On the other hand, the low molecular weight compounds screened by the method of the present invention are present in the heavy chain and light chain constituting the antibody, respectively, and can bind to the antibody at a total of four binding target sites per antibody molecule. . Therefore, it can be said that the low molecular weight compound according to the present invention is very suitable for antibody purification and the like because it can bind to an antibody with higher affinity.
本発明に係る抗体に結合する低分子化合物のスクリーニング方法は、当該抗体の軽鎖の可変領域において、アミノ酸配列1を有するフレームワーク領域に含まれる第1の結合標的部位と、当該抗体の重鎖の可変領域において、アミノ酸配列2を有するフレームワーク領域に含まれる第2の結合標的部位の両方に対して、ドッキングシミュレーションにおいて低ドッキングスコアを示す化合物を選択する工程を含むことを特徴とする。 A screening method for a low molecular weight compound that binds to an antibody according to the present invention includes a first binding target site contained in a framework region having amino acid sequence 1 in a variable region of a light chain of the antibody, and a heavy chain of the antibody The step of selecting a compound exhibiting a low docking score in the docking simulation for both of the second binding target sites contained in the framework region having amino acid sequence 2 in the variable region.
本発明方法では、抗体、特にヒト抗体に対する低分子化合物の結合能を評価すべき結合標的部位として、フレームワーク領域に含まれる窪み(ポケット)を用いる。フレームワーク領域は、抗体のFab領域の先端部分である可変領域(V領域)において、抗原と直接接触する相補性決定領域(CDR:Complementarity−Determining Region)以外の比較的変異の少ない領域をいう。フレームワーク領域は、可変領域の中でもアミノ酸配列の変異が比較的少なく、抗体間でも立体構造がよく似ているといわれている。本発明方法では、フレームワーク領域の特定アミノ酸配列との親和性が高い化合物を選択する。よって、当該化合物は、様々な抗体に対して共通して比較的高い親和性を示す。 In the method of the present invention, a depression (pocket) contained in the framework region is used as a binding target site for which the binding ability of a low molecular compound to an antibody, particularly a human antibody, should be evaluated. The framework region refers to a region with relatively few mutations other than the complementarity determining region (CDR) in direct contact with the antigen in the variable region (V region) which is the tip of the Fab region of the antibody. It is said that the framework region has relatively few amino acid sequence variations among the variable regions, and that the three-dimensional structure is similar between antibodies. In the method of the present invention, a compound having a high affinity for a specific amino acid sequence in the framework region is selected. Therefore, the compound exhibits a relatively high affinity for various antibodies in common.
また、本発明方法では、軽鎖と重鎖の両方において、フレームワーク領域にそれぞれ含まれる特定のアミノ酸配列を有する結合標的部位に親和性を示す化合物を選択する。 In the method of the present invention, a compound having an affinity for a binding target site having a specific amino acid sequence contained in each framework region in both the light chain and the heavy chain is selected.
本発明方法で用いる特定のアミノ酸配列は、ヒト抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列をアラインメントし、相同性が比較的高く且つ低分子化合物が侵入可能なような窪み(ポケット)を形成するものである。 The specific amino acid sequence used in the method of the present invention aligns the amino acid sequences of the framework regions of human antibodies, and forms a recess (pocket) that is relatively high in homology and into which a low molecular compound can enter. .
本発明において「アラインメント」という用語は、ペアワイズアラインメントおよびマルチプルアラインメントを指し、タンパク質のアミノ酸配列について、2つまたは3つ以上の配列間で対応する部分が並ぶように整列させることをいう。ここで、「ペアワイズアラインメント」とは、比較すべきアミノ酸配列とデータベースに保存されたアミノ酸配列を1対1で総当り比較を行う配列比較をいい、「マルチプルアラインメント」とは、1対3以上の多数で行う多重配列比較をいう。また、2以上のアミノ酸配列などにおける配列相同性は、アラインメントのためのソフトウエアにより容易に算出される。 In the present invention, the term “alignment” refers to pairwise alignment and multiple alignment, and refers to aligning the amino acid sequences of proteins so that corresponding portions are aligned between two or more sequences. Here, “pair-wise alignment” refers to a sequence comparison in which the amino acid sequence to be compared and the amino acid sequence stored in the database are compared one-to-one, and “multiple alignment” is a one-to-three or more sequence comparison. A multiple sequence comparison performed in large numbers. In addition, sequence homology in two or more amino acid sequences and the like is easily calculated by software for alignment.
本発明方法で用いるアミノ酸配列において、「任意のアミノ酸または欠失」は、進化の過程におけるアミノ酸の挿入・欠失に対応した所謂「ギャップ」を表す。「任意のアミノ酸」としては、タンパク質を構成する20種のアミノ酸が好ましい。また、「欠失」は、タンパク質の化学構造上、その前後のアミノ酸の間の単結合を示す。 In the amino acid sequence used in the method of the present invention, “any amino acid or deletion” represents a so-called “gap” corresponding to insertion / deletion of an amino acid in the course of evolution. As “any amino acid”, 20 kinds of amino acids constituting a protein are preferable. Further, “deletion” indicates a single bond between amino acids before and after the chemical structure of the protein.
「タンパク質」という用語は、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、断片化されたポリペプチド鎖や、ペプチド結合によって連結された2以上のポリペプチド鎖も含む。従って、本明細書において、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は同じ意味で使用される。また、「ドメイン」とはタンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。 The term “protein” includes any molecule having a polypeptide structure, and also includes fragmented polypeptide chains and two or more polypeptide chains linked by peptide bonds. Accordingly, in the present specification, “peptide”, “polypeptide” and “protein” are used interchangeably. A “domain” is a unit of a protein's higher order structure, consisting of a sequence of tens to hundreds of amino acid residues, and sufficient for expressing any physicochemical or biochemical function. A unit.
アラインメントした結果、一致しているアミノ酸の数をアラインメントさせたアミノ酸の総数で割った比率を「配列相同性」という。配列相同性が高いほど変異が少なく、立体構造が似ていることが期待される。一般的には、あるアミノ酸配列に対して、1個または複数個のアミノ酸の欠失、付加および/または置換により50%以上の配列相同性があれば立体構造が似ていることが期待され、40%以上であれば低分子化合物のドッキングシミュレーション用の構造の鋳型として利用可能であるといわれている(D.Baker & A.Sali,Science,294,pp.93−96(2001))。抗体の場合、軽鎖のフレームワーク領域同士、重鎖のフレームワーク領域同士のアミノ酸配列をそれぞれアラインメントすると配列相同性が50%以上と高く、立体構造がよく似ている。一方、軽鎖と重鎖のフレームワーク領域のアミノ酸配列をアラインメントすると配列相同性が30%未満と低く、一般的には立体構造は似ていない。しかし本発明において特定したヒト抗体の軽鎖と重鎖のフレームワーク領域における結合標的部位のアミノ酸配列の配列相同性は42%と高く、その立体構造が似ている可能性が高い。従って、これらの結合標的部位に対して同一の低分子化合物によるスクリーニングが実施可能となる。 As a result of the alignment, the ratio of the number of matching amino acids divided by the total number of aligned amino acids is called “sequence homology”. It is expected that the higher the sequence homology, the less the mutation and the similar three-dimensional structure. In general, if there is a sequence homology of 50% or more by deletion, addition and / or substitution of one or more amino acids with respect to a certain amino acid sequence, it is expected that the three-dimensional structure is similar. If it is 40% or more, it is said that it can be used as a template of a structure for docking simulation of a low molecular compound (D. Baker & A. Sali, Science, 294, pp. 93-96 (2001)). In the case of antibodies, when the amino acid sequences of the light chain framework regions and heavy chain framework regions are aligned, the sequence homology is as high as 50% or more, and the three-dimensional structures are very similar. On the other hand, when the amino acid sequences of the framework regions of the light chain and heavy chain are aligned, the sequence homology is as low as less than 30%, and generally the three-dimensional structure is not similar. However, the sequence homology between the amino acid sequences of the binding target sites in the light chain and heavy chain framework regions of the human antibody specified in the present invention is as high as 42%, and the three-dimensional structure is likely to be similar. Accordingly, screening with the same low molecular weight compound can be performed on these binding target sites.
本発明における結合標的部位が有するアミノ酸配列としては、軽鎖においては配列番号3および配列番号4、重鎖においては配列番号5および配列番号6に示した配列が好ましく、両者間の配列相同性は40%以上であることが好ましく、さらに45%以上であることがより好ましく、さらに50%以上であることがより好ましい。結合標的部位の配列番号に示したアミノ酸配列は、軽鎖に関してヒト抗体として報告されているκ鎖、λ鎖、2種類あるうちのκ鎖のアミノ酸配列であるが、λ鎖の場合でも、重鎖の結合標的部位のアミノ酸配列と配列相同性が40%以上と高いアミノ酸配列を持つ結合標的部位を指定すれば、同一の低分子化合物が結合することが期待されるので、その場合のスクリーニング方法も本発明に含まれることは明らかであるといえる。また同様に、ヒト由来の抗体でなくても、軽鎖、重鎖間でアミノ酸配列の配列相同性が高くなるような結合標的部位を指定した場合のスクリーニング方法も本発明に含まれる。 The amino acid sequence of the binding target site in the present invention is preferably the sequences shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 for the light chain and SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for the heavy chain. It is preferably 40% or more, more preferably 45% or more, and even more preferably 50% or more. The amino acid sequence shown in the SEQ ID NO of the binding target site is the amino acid sequence of κ chain, λ chain, and two types of κ chain reported as human antibodies for the light chain. Since the same low molecular weight compound is expected to bind if a binding target site having an amino acid sequence having a high sequence homology of 40% or more with the amino acid sequence of the binding target site of the chain is expected, the screening method in that case It is obvious that the present invention is also included in the present invention. Similarly, the present invention includes a screening method in which a binding target site is specified that increases the sequence homology of the amino acid sequence between the light and heavy chains, even if it is not a human-derived antibody.
本発明においては、特定のアミノ酸配列を有する2つの結合標的部位の両方に対して、ドッキングシュミレーションにおいて低ドッキングスコアを示す化合物を選択する。 In the present invention, a compound is selected that exhibits a low docking score in a docking simulation for both two binding target sites having a specific amino acid sequence.
低分子化合物をスクリーニングするためのドッキングシミュレーションを行うためのコンピューターソフトフェアは、特に制限されないが、例えば、in silico創薬で一般的によく使われるソフトウエアsievgene(http://www.jbic.or.jp/activity/st_pr_pj/mypresto/index_mypr.html)を挙げることができる。 The computer software for performing the docking simulation for screening the low molecular weight compound is not particularly limited, but, for example, software commonly used in in silico drug discovery (http: //www.jbic.or). .Jp / activity / st_pr_pj / mypresto / index_mypr.html).
本発明方法では、ドッキングシミュレーションによって化合物のドッキングスコアを得て化合物の順位付けを行い、低ドッキングスコアを示す化合物を選択する。本発明において「ドッキングスコア」とは、化合物と本発明に係る結合標的部位の結合エネルギーに対応する値で、値が小さいほど当該結合標的部位に対する化合物の親和性が高いといえる。 In the method of the present invention, a compound docking score is obtained by docking simulation, the compounds are ranked, and a compound showing a low docking score is selected. In the present invention, the “docking score” is a value corresponding to the binding energy between the compound and the binding target site according to the present invention. The smaller the value, the higher the affinity of the compound for the binding target site.
具体的には、上記ソフトウエアsievgeneを用いたドッキングシュミレーションにおいて、第1結合標的部位と第2結合標的部位の両方に対するドッキングスコアが−2.0未満の化合物を選択することが好ましい。当該ドッキングスコアとしては、−3.0未満がより好ましい。一方、当該ドッキングスコアが低過ぎるとドッキングシミュレーションに用いた抗体に過剰適合し、他の抗体との親和性が下がることが予想されるので、当該ドッキングスコアとしては−5.5以上が好ましい。 Specifically, in the docking simulation using the above software sievgene, it is preferable to select a compound having a docking score of less than −2.0 for both the first binding target site and the second binding target site. The docking score is more preferably less than −3.0. On the other hand, if the docking score is too low, it is expected that the antibody used in the docking simulation will be overfitted and the affinity with other antibodies will decrease, so that the docking score is preferably −5.5 or more.
本発明に係るスクリーニング方法はコンピューターを用いる簡便なものであるが、無制限の化合物を評価するとすれば効率は当然に悪い。よって、評価すべき化合物は、事前にある程度選別しておくことが好ましい。例えば、一般的な試薬メーカーから販売されている化合物から、可溶性などを基準として選択することができる。 The screening method according to the present invention is a simple method using a computer, but if an unlimited compound is evaluated, the efficiency is naturally poor. Therefore, it is preferable to select the compounds to be evaluated to some extent in advance. For example, it can be selected from compounds sold by general reagent manufacturers based on solubility and the like.
本発明方法により選択された化合物は、例えば、水不溶性の基材からなる担体に固定化し、アフィニティーリガンドとして利用することができる。ここで「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に結合する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、低分子抗体および免疫グロブリンに対して特異的に結合する低分子化合物を指す。 The compound selected by the method of the present invention can be immobilized, for example, on a carrier comprising a water-insoluble substrate and used as an affinity ligand. Here, the term “affinity ligand” is a term that refers to a substance or functional group that selectively binds a target molecule from a set of molecules based on the affinity between specific molecules represented by the binding between an antigen and an antibody. In the present invention, it refers to a small molecule compound that specifically binds to a small molecule antibody and an immunoglobulin.
本発明において「低分子抗体」という用語は、免疫グロブリンからプロテアーゼ分解あるいは遺伝子工学的に作製した部分断片のみの抗体を指す。代表的な低分子抗体としては、Fab、一本鎖抗体(single chain antibody:scFv)、Diabodyなどが挙げられる。Fabは軽鎖と重鎖がジスルフィド結合した分子で,分子量約60kDa、scFvは軽鎖と重鎖の可変領域のみを短いリンカーで連結させたもので、分子量は約30kDa、Diabodyは、scFvのリンカーの長さを調節することにより2分子のscFvが共有結合により会合した分子であり,2つの抗原結合部位を持つ。 In the present invention, the term “small molecule antibody” refers to an antibody consisting only of a partial fragment produced from an immunoglobulin by protease degradation or genetic engineering. Typical low molecular weight antibodies include Fab, single chain antibody (scFv), Diabody, and the like. Fab is a molecule in which a light chain and a heavy chain are disulfide-bonded. Molecular weight is about 60 kDa, scFv is a light chain and heavy chain variable region linked by a short linker, molecular weight is about 30 kDa, Diabody is a scFv linker. Is a molecule in which two molecules of scFv are covalently associated by adjusting the length of the protein, and has two antigen-binding sites.
本発明におけるアフィニティーリガンドが標的とする分子は、標的分子結合ドメインが結合可能な全ての分子であるが、例えば、抗体の軽鎖の可変領域(VL)、重鎖の可変領域(VH)のみを用いたもの(domain antibody)やラクダの重鎖の可変領域を用いたもの(nanobody)など、様々な分子形を持つ断片化した低分子抗体、低分子抗体誘導体、免疫グロブリンG(IgG)および抗体誘導体が挙げられる。ここで「低分子抗体誘導体」としては、例えば、ヒトIgGのFv領域とFc領域とを融合させた人工抗体が挙げられ、「抗体誘導体」としては、例えば、ヒトIgGの一部のドメインを他生物種のIgG抗体のドメインに置き換えて融合させたキメラ抗体や、ヒトIgGのCDR(Complementarity−Determining Regions;相補性決定領域)を他生物種抗体のCDRに置き換えて融合させたヒト化抗体が挙げられる。The molecules targeted by the affinity ligand in the present invention are all molecules to which the target molecule-binding domain can bind. For example, the light chain variable region (V L ) and heavy chain variable region (V H ) of an antibody. Fragmented low-molecular-weight antibodies, low-molecular-weight antibody derivatives, immunoglobulin G (IgG) with various molecular forms, such as those that use only the domain (domain antibody) and those that use the variable region of the heavy chain of a camel (nanobody) And antibody derivatives. Here, examples of the “small molecule antibody derivative” include an artificial antibody obtained by fusing the Fv region and the Fc region of human IgG, and examples of the “antibody derivative” include a part of the domain of human IgG. Examples include chimeric antibodies that are fused by substituting the domain of an IgG antibody of a biological species, and humanized antibodies that are fused by substituting CDRs of other IgG species (Complementarity-Determining Regions) with the CDRs of an antibody of another species. It is done.
様々な分子形をした低分子抗体および免疫グロブリンに対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたBiacoreシステム(GEヘルスケア社)などのバイオセンサーや、結合によって生じる発熱・吸熱変化を検出する等温滴定型カロリメータ(ITC)などの、生体分子間相互作用検出・解析装置によって評価できる。 The affinity for low molecular weight antibodies and immunoglobulins with various molecular forms detects biosensors such as the Biacore system (GE Healthcare) using the surface plasmon resonance principle, and exothermic / endothermic changes caused by binding. It can be evaluated by a biomolecule interaction detection / analysis apparatus such as an isothermal titration calorimeter (ITC).
本発明に用いる水不溶性担体は、アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて表面積が大きいものが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状(中空糸を含む)などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。リガンドの固定化方法としては、例えば、担体に反応性基を導入し、リンカー基を介して公知のカップリング法により低分子化合物を結合させる方法を挙げることができる。 The water-insoluble carrier used in the present invention preferably has a large surface area in view of the purpose and method of use of the affinity separation matrix, and is preferably a porous material having a large number of pores of an appropriate size. The form of the carrier can be any of beads, monoliths, fibers, membranes (including hollow fibers), and any form can be selected. Examples of the method for immobilizing a ligand include a method in which a reactive group is introduced into a carrier and a low molecular compound is bound by a known coupling method via a linker group.
上記反応性基は、例えば、アミノ基、カルボキシ基、エーテル基、チオエーテル基などを挙げることができる。反応性基の導入は、「スペーサー」と呼ばれる化合物の導入により行ってもよい。カップリング法としては、例えば、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性基を導入し、リガンドとして固定化する低分子化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、または、担体とリガンドとして固定化する低分子化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、もしくは、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法などが挙げられる。 Examples of the reactive group include an amino group, a carboxy group, an ether group, and a thioether group. The reactive group may be introduced by introducing a compound called “spacer”. As a coupling method, for example, the carrier is reacted with cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine, sodium periodate, etc., or the carrier is activated. A method in which a reactive group is introduced on the surface and a low molecular compound to be immobilized as a ligand is coupled and immobilized, or a system in which a low molecular compound to be immobilized as a carrier and a ligand exists is a condensation such as carbodiimide. Examples of the immobilization method include adding a reagent or a reagent having a plurality of functional groups in the molecule such as glutaraldehyde, followed by condensation and crosslinking.
リガンドとして用いられる本発明の低分子化合物に対しては、担体を化学修飾して固定化してもよいし、固定化に有用なスペーサー分子を導入してもよい。本発明の本質は、低分子化合物をリガンドとして固定化したマトリックスにおいても低分子化合物の機能が同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように低分子化合物を修飾・改変しようが、本発明の範囲に含まれる。 The low molecular compound of the present invention used as a ligand may be immobilized by chemically modifying the carrier, or a spacer molecule useful for immobilization may be introduced. The essence of the present invention is that the function of the low molecular weight compound is similarly imparted to the matrix in which the low molecular weight compound is immobilized as a ligand, and how the low molecular weight compound is modified / modified for immobilization. And within the scope of the present invention.
本発明により見出された低分子化合物を水不溶性担体に固定化した上記アフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリン、抗体誘導体、低分子抗体および低分子抗体誘導体をアフィニティークロマトグラフィー精製法により分離・精製・特徴付けすることが可能となる。 Separation and separation of immunoglobulins, antibody derivatives, low molecular antibodies and low molecular antibody derivatives by affinity chromatography using the above affinity separation matrix in which the low molecular weight compound found by the present invention is immobilized on a water-insoluble carrier. It becomes possible to refine and characterize.
これらの抗体、抗体誘導体、低分子抗体、および、低分子抗体誘導体の精製法は、すでに市販品として存在するプロテインAカラムを用いたアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法などに準じる手順により達成することができる(Roque A.C.A.ら,Journal of Chromatography A,1160号,44−55頁(2007年))。即ち、抗体、抗体誘導体、低分子抗体および低分子抗体誘導体を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、抗体、抗体誘導体、低分子抗体および低分子抗体誘導体を吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の抗体、抗体誘導体、低分子抗体および低分子抗体誘導体はカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。次いで、適切なpHに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望の抗体、抗体誘導体、低分子抗体および低分子抗体誘導体を溶出することにより、高純度な精製が達成される。溶出に使われる酸性緩衝液には、マトリックスからの所望の抗体などの解離を促進するための物質を添加してもよい。同様の手法にて、本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着する抗体、抗体誘導体、低分子抗体および低分子抗体誘導体は、該結合標的部位を有するとの特徴づけが可能となる。 Purification methods for these antibodies, antibody derivatives, low-molecular-weight antibodies, and low-molecular-weight antibody derivatives can be achieved by procedures according to affinity column / chromatography purification methods using protein A columns that are already available as commercial products. (Roque ACA et al., Journal of Chromatography A, 1160, 44-55 (2007)). That is, an antibody, an antibody derivative, a low molecular antibody, and a buffer containing a low molecular antibody derivative are adjusted to be neutral, and then the solution is passed through an affinity column packed with the affinity separation matrix of the present invention. Adsorbing antibody derivatives, low molecular weight antibodies and low molecular weight antibody derivatives. Next, an appropriate amount of pure buffer is passed through the affinity column, and the inside of the column is washed. At this point, the desired antibody, antibody derivative, low molecular antibody and low molecular antibody derivative are adsorbed to the affinity separation matrix of the present invention in the column. Then, an acidic buffer adjusted to an appropriate pH is passed through the column to elute the desired antibody, antibody derivative, low molecular antibody and low molecular antibody derivative, thereby achieving high purity purification. A substance for promoting dissociation of the desired antibody from the matrix may be added to the acidic buffer used for elution. In the same manner, the antibody, antibody derivative, low molecular antibody and low molecular antibody derivative adsorbed on the affinity separation matrix of the present invention can be characterized as having the binding target site.
本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンドである低分子化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。当該緩衝液には、適当な変性剤や有機溶剤を添加してもよい。本発明の低分子化合物をリガンドとして利用した場合、タンパク質、例えばプロテインAをリガンドとして利用するよりもリガンドの化学的安定性が高まることが予想される。ここで化学的安定性とは、低分子化合物の機能を保持する性質を意味する。本発明において「低分子化合物の機能を保持する」とは、免疫グロブリンの軽鎖、重鎖の可変領域のフレームワーク領域に存在する結合標的部位(ポケット)への親和性を保持することを指す。即ち、リガンドの「化学的安定性」が高い程、種々の化学的処理を行っても標的部位への親和性が低下する度合いが小さい。 The affinity separation matrix of the present invention should be washed by passing it through a pure buffer having a suitable strong acidity or strong alkalinity to such an extent that the low molecular weight compound as a ligand and the substrate of the carrier do not completely impair the function. Can be reused. An appropriate denaturant or organic solvent may be added to the buffer solution. When the low molecular weight compound of the present invention is used as a ligand, the chemical stability of the ligand is expected to be higher than when a protein such as protein A is used as a ligand. Here, chemical stability means the property of retaining the function of a low molecular compound. In the present invention, “retaining the function of a low molecular weight compound” refers to retaining affinity for a binding target site (pocket) existing in the framework region of the variable region of an immunoglobulin light chain or heavy chain. . That is, the higher the “chemical stability” of the ligand, the less the affinity to the target site decreases even when various chemical treatments are performed.
本願は、2014年6月9日に出願された日本国特許出願第2014−118466号に基づく優先権の利益を主張するものである。2014年6月9日に出願された日本国特許出願第2014−118466号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。 This application claims the benefit of priority based on Japanese Patent Application No. 2014-118466 filed on June 9, 2014. The entire content of the specification of Japanese Patent Application No. 2014-118466 filed on June 9, 2014 is incorporated herein by reference.
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited by the following examples, but may be appropriately modified within a range that can meet the purpose described above and below. Of course, it is possible to implement them, and they are all included in the technical scope of the present invention.
実施例1
公知のヒト抗体の軽鎖(κ鎖)と重鎖の代表的なアミノ酸配列をアラインメントした結果(http://www2.mrc−lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php;図1および図2)を用いて、各鎖で配列相同性の高いアミノ酸配列を抽出し、共通アミノ酸配列とした。得られた軽鎖、重鎖の各共通アミノ酸配列のフレームワーク領域のアミノ酸配列のアラインメントを実施し、軽鎖で共通する配列として配列番号1の配列と、重鎖で共通する配列として配列番号2を導き出した。さらに、これら配列番号1と配列番号2の配列それぞれにおいて、抗体の立体構造上、表面に露出しており、且つ、配列相同性が比較的高い配列を抽出した。軽鎖における当該配列を配列番号3と配列番号4に、重鎖における当該配列を配列番号5と配列番号6に示す。なお、配列番号3と配列番号4とを合わせた配列全体と、配列番号5と配列番号6とを合わせた配列全体との配列相同性は42%であった。Example 1
Results of alignment of representative amino acid sequences of known human antibody light chain (κ chain) and heavy chain (http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php; FIG. 1 and 2), amino acid sequences having high sequence homology in each chain were extracted and used as common amino acid sequences. Alignment of the amino acid sequences of the framework regions of the common amino acid sequences of the obtained light and heavy chains was performed, and the sequence of SEQ ID NO: 1 as the sequence common to the light chain and SEQ ID NO: 2 as the sequence common to the heavy chain Derived. Furthermore, in each of the sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, sequences that are exposed on the surface due to the three-dimensional structure of the antibody and that have a relatively high sequence homology were extracted. The sequences in the light chain are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and the sequences in the heavy chain are shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6. The sequence homology between the entire sequence including SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 and the entire sequence including SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 was 42%.
立体構造が明らかにされている公知のヒト抗体のデータベースであるPDB(Protein Data Bank,http://pdbj.org)に登録されているデータの中から、上記共通アミノ酸配列(配列番号1と配列番号2)との配列相同性が50%以上のアミノ酸配列をフレームワーク領域中に有するものを検索し、抽出されたものの中からヒト抗体(PDBコード:2xa8)の立体構造をダウンロードした。当該ヒト抗体2xa8の軽鎖のフレームワーク領域のアミノ酸配列と配列番号1との配列相同性は94%、重鎖のフレームワーク領域のアミノ酸配列と配列番号2との配列相同性は82%であった。軽鎖と重鎖のフレームワーク領域の立体構造を見て、低分子化合物が結合可能な窪み(ポケット)を探索し、軽鎖と重鎖のフレームワーク領域の共通アミノ酸配列のアラインメントにおいて配列相同性が42%と高いアミノ酸配列(軽鎖:配列番号3と配列番号4,重鎖:配列番号5と配列番号6)に対応するアミノ酸配列を含む窪みを結合標的部位として選択した。このとき、選択したヒト抗体2xa8の軽鎖のフレームワーク領域の結合標的部位のアミノ酸配列と、軽鎖のフレームワーク領域の結合標的部位における共通アミノ酸配列(配列番号3,4)との配列相同性は92%、重鎖のフレームワーク領域の結合標的部位のアミノ酸配列と、重鎖のフレームワーク領域の結合標的部位における共通アミノ酸配列(配列番号5,6)との配列相同性は100%であった。また、ヒト抗体2xa8における軽鎖、重鎖の結合標的部位のアミノ酸配列間の配列相同性は50%であった。 From the data registered in PDB (Protein Data Bank, http://pdbj.org), which is a database of known human antibodies whose steric structure has been clarified, the above common amino acid sequence (SEQ ID NO: 1 and sequence) Those having an amino acid sequence having a sequence homology of 50% or more with No. 2) in the framework region were searched, and the three-dimensional structure of a human antibody (PDB code: 2xa8) was downloaded from the extracted one. The sequence homology between the amino acid sequence of the light chain framework region of the human antibody 2xa8 and SEQ ID NO: 1 was 94%, and the sequence homology between the amino acid sequence of the heavy chain framework region and SEQ ID NO: 2 was 82%. It was. Look at the three-dimensional structure of the framework region of the light and heavy chains, search for cavities (pockets) to which low molecular weight compounds can bind, and sequence homology in alignment of common amino acid sequences of the framework regions of the light and heavy chains Was selected as a binding target site, which contains an amino acid sequence corresponding to an amino acid sequence as high as 42% (light chain: SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, heavy chain: SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6). At this time, the sequence homology between the amino acid sequence of the binding target site in the framework region of the light chain of the selected human antibody 2xa8 and the common amino acid sequence (SEQ ID NOs: 3 and 4) in the binding target site of the framework region of the light chain The sequence homology between the amino acid sequence of the binding target site in the heavy chain framework region and the common amino acid sequence (SEQ ID NOs: 5 and 6) in the binding target site of the heavy chain framework region was 100%. It was. In addition, the sequence homology between the amino acid sequences of the light chain and heavy chain binding target sites in human antibody 2xa8 was 50%.
ヒト抗体2xa8の2つの結合標的部位それぞれに対して、ドッキングシミュレーションソフトsievgene(http://www.jbic.or.jp/activity/st_pr_pj/mypresto/index_mypr.html)を利用して、ドッキングシミュレーションを実施した。化合物ライブラリーとしてナミキ商事社の在庫化合物(http://www.namiki−s.co.jp/service/screening)を利用し、化合物数を限定するために、選定条件として以下の5つの条件を定めた。
1. 入手しやすいENAMINE社製化合物
2. 分子量が250以上
3. 水素結合ドナー数が5以下、水素結合アクセプター数が10以下
4. 水溶性(clogP5未満)
5. 反応性の高い構造を除くDocking simulation is performed for each of the two binding target sites of human antibody 2xa8 using docking simulation software sievgene (http://www.jbic.or.jp/activity/st_pr_pj/mypresto/index_mypr.html) did. In order to limit the number of compounds by using a stock library (http://www.namiki-s.co.jp/service/screening) of Namiki Shoji Co., Ltd. as a compound library, the following five conditions were selected as selection conditions. Determined.
1. 1. An easily available compound made by ENAMINE 2. Molecular weight is 250 or more. 3. The number of hydrogen bond donors is 5 or less and the number of hydrogen bond acceptors is 10 or less. Water soluble (less than clogP5)
5). Excluding highly reactive structures
選定した124万個の化合物を使ってドッキングシミュレーションを実施した。得られたドッキングスコアによって化合物の順位付けを行い、それぞれの結合標的部位に対してドッキングスコア上位10000個の化合物を選定した。軽鎖と重鎖それぞれの標的部位に対するドッキングスコアと化合物数の分布を表1に示す。表1中、ドッキングスコアは化合物と上記結合標的部位との結合エネルギーに対応し、値が小さいほど上記結合標的部位との親和性が高いことを示す。 A docking simulation was conducted using 1.24 million selected compounds. The compounds were ranked according to the obtained docking scores, and the top 10,000 docking scores were selected for each binding target site. Table 1 shows the docking scores and compound number distributions for the light chain and heavy chain target sites. In Table 1, the docking score corresponds to the binding energy between the compound and the binding target site, and the smaller the value, the higher the affinity with the binding target site.
軽鎖または重鎖の結合標的部位に対するドッキングスコアの値が小さい、のべ20000個の化合物の中から、軽鎖および重鎖の両方の結合標的部位に対するドッキングスコアの平均が上位10%以内に含まれるもの5つを候補化合物として選定した。それらの化学構造を以下に示す。 The average docking score for both light chain and heavy chain binding target sites is within the top 10% out of a total of 20000 compounds with low docking score values for light or heavy chain binding target sites Were selected as candidate compounds. Their chemical structures are shown below.
実施例2
立体構造が明らかにされている公知のヒト抗体のデータベースであるPDB(http://pdbj.org)に登録されているデータの中から、上記実施例1と同様にして、上記共通アミノ酸配列(配列番号1と配列番号2)との配列相同性が50%以上のアミノ酸配列をフレームワーク領域中に有するものを検索し、抽出されたものの中からヒト抗体(PDBコード:2hwz)の立体構造をダウンロードした。当該ヒト抗体2hwzの軽鎖のフレームワーク領域のアミノ酸配列と配列番号1との配列相同性は91%、重鎖のフレームワーク領域のアミノ酸配列と配列番号2との配列相同性は57%であった。当該ヒト抗体2hwzにおいて、上記実施例1で選択した結合標的部位に対応する窪み(ポケット)を結合標的部位として選択した。このとき、選択したヒト抗体2hwzの軽鎖のフレームワーク領域の結合標的部位のアミノ酸配列と、軽鎖のフレームワーク領域の結合標的部位における共通アミノ酸配列(配列番号3,4)との配列相同性は83%、重鎖のフレームワーク領域の結合標的部位のアミノ酸配列と、重鎖のフレームワーク領域の結合標的部位における共通アミノ酸配列(配列番号5,6)との配列相同性は58%であった。また、ヒト抗体2hwzにおける軽鎖、重鎖の結合標的部位のアミノ酸配列間の配列相同性は58%であった。Example 2
From the data registered in PDB (http://pdbj.org), which is a database of known human antibodies whose steric structure has been clarified, the above common amino acid sequence ( Search for those having 50% or more of amino acid sequence in the framework region between SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2), and extract the three-dimensional structure of the human antibody (PDB code: 2hwz) from the extracted one downloaded. The sequence homology between the amino acid sequence of the light chain framework region of the human antibody 2hwz and SEQ ID NO: 1 was 91%, and the sequence homology between the amino acid sequence of the heavy chain framework region and SEQ ID NO: 2 was 57%. It was. In the human antibody 2hwz, a depression (pocket) corresponding to the binding target site selected in Example 1 was selected as the binding target site. At this time, the sequence homology between the amino acid sequence of the binding target site in the framework region of the light chain of the selected human antibody 2hwz and the common amino acid sequence (SEQ ID NOs: 3 and 4) in the binding target site of the framework region of the light chain 83%, the sequence homology between the amino acid sequence of the binding target site in the framework region of the heavy chain and the common amino acid sequence (SEQ ID NO: 5 and 6) in the binding target site of the framework region of the heavy chain was 58%. It was. In addition, the sequence homology between the amino acid sequences of the light chain and heavy chain binding target sites in human antibody 2hwz was 58%.
ヒト抗体2hwzの2つの結合標的部位それぞれに対して、上記実施例1において、ヒト抗体2xa8の2つの結合標的部位それぞれに対するドッキングスコア上位の10000個の化合物を使って、ドッキングシミュレーションを実施した。軽鎖と重鎖それぞれの結合標的部位に対するドッキングスコアと化合物数の分布を表2に示す。 For each of the two binding target sites of human antibody 2hwz, docking simulations were performed using 10,000 compounds with the highest docking score for each of the two binding target sites of human antibody 2xa8 in Example 1 above. Table 2 shows the distribution of the docking score and the number of compounds with respect to the binding target site of each of the light and heavy chains.
上記実施例1で最終的に選定された5つの化合物の、ヒト抗体2hwzの軽鎖、重鎖それぞれの結合標的部位に対するドッキングスコアを調べた。結果を表3に示す。なお、表3中、「NS−」から始まる化合物名はナミキ商事社が各化合物に付したコードナンバーであり、「p1_2xa8」、「p2_2xa8」、「p1_2hwz」および「p2_2hwz」はそれぞれヒト抗体2xa8および2hwzの軽鎖および重鎖の各結合標的部位に対する各化合物のドッキングスコアを示し、「avg_2xa8」および「avg_2hwz」はそれぞれヒト抗体2xa8および2hwzの上記各結合標的部位に対する各化合物のドッキングスコアの平均値を示す。 The docking scores of the five compounds finally selected in Example 1 above to the binding target sites of the light chain and heavy chain of human antibody 2hwz were examined. The results are shown in Table 3. In Table 3, compound names beginning with “NS-” are code numbers assigned to each compound by Namiki Shoji Co., Ltd., and “p1_2xa8”, “p2_2xa8”, “p1_2hwz” and “p2_2hwz” are human antibody 2xa8 and 2 hwz shows the docking score of each compound for each binding target site of light chain and heavy chain, “avg — 2xa8” and “avg — 2hwz” mean the docking score of each compound for each binding target site of human antibodies 2xa8 and 2 hwz, respectively Indicates.
表3に示す結果により、2xa8の結合標的部位に対するドッキングスコアの平均が上位10%に入る5つの上記化合物は、2hwzの結合標的部位に対するドッキングスコアの平均も上位10%に入ることを確認した。この結果は、ヒト抗体間において、本発明に係る上記結合標的部位の構造が軽鎖においても重鎖においても類似していることに起因していると考えられる。 The results shown in Table 3 confirmed that the five compounds with an average docking score for the 2xa8 binding target site were in the top 10% also had an average docking score for the 2 hwz binding target site in the top 10%. This result is considered to result from the fact that the structure of the binding target site according to the present invention is similar between the light chain and the heavy chain among human antibodies.
比較例1
軽鎖と重鎖の2つの結合標的部位のうちどちらか一方だけに低いドッキングスコアを与える化合物の一例を表4に示す。表4中、「N/A」は、軽鎖、重鎖それぞれの結合標的部位に対するドッキングスコアが上位10000個の中に入っていなかったため、スコアの値が無いことを示す。Comparative Example 1
An example of a compound that gives a low docking score to only one of the two binding target sites of the light and heavy chains is shown in Table 4. In Table 4, “N / A” indicates that there is no score value because the docking scores for the binding target sites of the light and heavy chains were not included in the top 10,000.
表4に示す結果のとおり、NS−01599272のIDを持つ化合物は軽鎖の結合標的部位に対して良いスコアを与えたが、重鎖の標的部位には良いスコアを与えなかった。一方、NS−02992114のIDを持つ化合物は、重鎖の結合標的部位に対して良いスコアを与えたが、軽鎖の標的部位には良いスコアを与えなかった。よって、これら化合物は、上記実施例1,2で選定された化合物に比較して、ヒト抗体への親和性が低いと考えられる。 As shown in Table 4, the compound having an ID of NS-01599272 gave a good score for the light chain binding target site, but did not give a good score for the heavy chain target site. On the other hand, the compound with ID NS-02992114 gave a good score for the binding target site of the heavy chain, but did not give a good score for the light chain target site. Therefore, these compounds are considered to have a lower affinity for human antibodies than the compounds selected in Examples 1 and 2 above.
Claims (3)
上記抗体の軽鎖の可変領域において、下記アミノ酸配列1を有するフレームワーク領域に含まれる第1の結合標的部位と、上記抗体の重鎖の可変領域において、下記アミノ酸配列2を有するフレームワーク領域に含まれる第2の結合標的部位の両方に対して、ドッキングシミュレーションにおいて低ドッキングスコアを示す化合物を選択する工程を含むことを特徴とする方法。
アミノ酸配列1: 配列番号1に示されるアミノ酸配列において、第9位のXaaがセリン、フェニルアラニン、ロイシン、グリシン、アラニンまたはアスパラギン酸であり、第15位のXaaがプロリン、バリン、トレオニンまたはロイシンであり、第24〜31位のXaaが任意のアミノ酸または欠失であり、第39位のXaaがグルタミン、リシン、ロイシンまたはグルタミン酸であり、第79位および第80位のXaaが任意のアミノ酸または欠失であるアミノ酸配列
アミノ酸配列2: 配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第9位のXaaがグリシン、アラニン、プロリンまたはセリンであり、第14位のXaaが任意のアミノ酸または欠失であり、第17位のXaaがグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニンまたはアスパラギン酸であり、第41〜43位のXaaが任意のアミノ酸または欠失であり、第47位のXaaがバリン、メチオニン、イソロイシンまたはロイシンであり、第50位のXaaがバリン、ロイシン、フェニルアラニンまたはイソロイシンであり、第56位のXaaがトレオニン、アルギニン、メチオニン、グルタミン酸、リシン、アスパラギンまたはアスパラギン酸であり、第61位のXaaがロイシン、アラニン、バリンまたはフェニルアラニンであり、第65位のXaaがロイシン、メチオニン、トリプトファンまたはイソロイシンであり、第66位のXaaがセリン、アルギニン、トレオニン、アスパラギン、グリシンまたはシステインであるアミノ酸配列A method of screening for low molecular weight compounds that bind to an antibody,
In the variable region of the light chain of the antibody, the first binding target site contained in the framework region having the following amino acid sequence 1, and in the variable region of the heavy chain of the antibody, in the framework region having the amino acid sequence 2 Selecting a compound that exhibits a low docking score in a docking simulation for both of the included second binding target sites.
Amino acid sequence 1: In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, Xaa at the 9th position is serine, phenylalanine, leucine, glycine, alanine or aspartic acid, and Xaa at the 15th position is proline, valine, threonine or leucine Xaa at positions 24 to 31 is any amino acid or deletion, Xaa at position 39 is glutamine, lysine, leucine or glutamic acid, and Xaa at positions 79 and 80 is any amino acid or deletion In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, Xaa at the 9th position is glycine, alanine, proline or serine, Xaa at the 14th position is any amino acid or deletion, Xaa at position 17 is glycine, alanine, serine, threonine, glutami , Glutamic acid, arginine or aspartic acid, Xaa at positions 41 to 43 is any amino acid or deletion, Xaa at position 47 is valine, methionine, isoleucine or leucine, and Xaa at position 50 is valine. , Leucine, phenylalanine or isoleucine, Xaa at position 56 is threonine, arginine, methionine, glutamic acid, lysine, asparagine or aspartic acid, Xaa at position 61 is leucine, alanine, valine or phenylalanine, Amino acid sequence wherein Xaa at position is leucine, methionine, tryptophan or isoleucine, and Xaa at position 66 is serine, arginine, threonine, asparagine, glycine or cysteine
アミノ酸配列3: 配列番号3に示されるアミノ酸配列において、第4位のXaaがグルタミン、リシン、ロイシンまたはグルタミン酸であるアミノ酸配列
アミノ酸配列4: 配列番号4に示されるアミノ酸配列The method according to claim 1, wherein the first binding target site comprises the following amino acid sequence 3 and amino acid sequence 4.
Amino acid sequence 3: In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence in which the fourth position Xaa is glutamine, lysine, leucine or glutamic acid. Amino acid sequence 4: Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4
アミノ酸配列5: 配列番号5に示されるアミノ酸配列において、第6位のXaaが任意のアミノ酸または欠失であるアミノ酸配列
アミノ酸配列6: 配列番号6に示されるアミノ酸配列The method according to claim 1 or 2, wherein the second binding target site comprises the following amino acid sequence 5 and amino acid sequence 6.
Amino acid sequence 5: In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, the amino acid sequence in which Xaa at position 6 is an arbitrary amino acid or a deletion. Amino acid sequence 6: Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
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