JPWO2015087945A1 - C型肝炎ウイルスのns5aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法、及びc型肝炎ウイルスのns5aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キット - Google Patents
C型肝炎ウイルスのns5aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法、及びc型肝炎ウイルスのns5aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キット Download PDFInfo
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Abstract
Description
前記直接作用型抗ウイルス剤としては、例えば、ダクラタスビルがある。ダクラタスビルは、HCVのNS5A(non−structural 5A)タンパク質の阻害剤である。これまでに、HCVのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸(野生型は、チロシン)に変異が起こっているとダクラタスビルに対して耐性を示すことが知られている(例えば、非特許文献1参照)。そのため、ダクラタスビルを患者に投与する前に、HCVのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸に変異が起こっているか否かを、低コストで、簡便かつ迅速に確認できることが求められている。
しかしながら、ダイレクトシーケンスは、安価に実施可能だが、定量性はなく、野生型や変異型の定量や変異率を測定するのは不可能であるという問題がある。また、次世代シークエンサーは、定量性はあるものの、1ラン当たりの費用が莫大であり、臨床分野で少数のゲノムサイズが比較的小さいHCVなどに使用することは事実上不可能であるという問題がある。
<1> 検体中のC型肝炎ウイルスのRNAを鋳型としてcDNAを合成するcDNA合成工程と、
前記cDNAを鋳型とし、サイクリングプローブ法を用いてリアルタイムPCRを行うリアルタイムPCR工程とを含み、
前記リアルタイムPCRに用いるプライマーセットが、C型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであり、
前記リアルタイムPCRに用いるプローブが、
下記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含むことを特徴とするC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法である。
aacgcat[a]ca(配列番号:1)
aacgcac[a]ca(配列番号:2)
acgcac[a]ca(配列番号:18)
配列番号:1、2、及び18中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。
<2> 下記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含むことを特徴とするC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キットである。
aacgcat[a]ca(配列番号:1)
aacgcac[a]ca(配列番号:2)
acgcac[a]ca(配列番号:18)
配列番号:1、2、及び18中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。
本発明のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異(以下、「HCV NS5A Y93変異」と称することがある)の検出方法は、cDNA合成工程と、リアルタイムPCR工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記cDNA合成工程は、検体中のC型肝炎ウイルスのRNAを鋳型としてcDNAを合成する工程である。
前記検体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、HCV感染を検査される患者(以下、「被検者」と称することがある)の血液、組織などが挙げられる。
前記被検者から血液、組織などを採取する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記C型肝炎ウイルスのRNAの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、QIAamp MinElute Virus Spin Kit(キアゲン社製)を用いて調製する方法などが挙げられる。
前記cDNAの合成方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)(タカラバイオ株式会社製)、cDNA Synthesis Kit(M−MLV Version)(タカラバイオ株式会社製)を用いて合成する方法などが挙げられる。
前記リアルタイムPCR工程は、前記cDNAを鋳型とし、サイクリングプローブ法を用いてリアルタイムPCRを行う工程である。
前記サイクリングプローブ法を用いたリアルタイムPCRは、RNAとDNAとからなるキメラプローブと、RNase Hとの組合せにより、試料における塩基配列及びその量を測定する方法である。
前記プローブは、一方の末端が蛍光物質で修飾されており、他方の末端がクエンチャー物質で修飾されている。そのため、増幅産物の相補的な配列と、プローブとがハイブリッドを形成した後にRNase HによりRNA部分が切断されることにより、強い蛍光が生じる。前記蛍光強度を測定することで、増幅産物量を定量することができる。
前記蛍光物質としては、特に制限はなく、公知の蛍光物質を適宜選択することができ、例えば、FAM、HEX、ROXなどが挙げられる。
前記クエンチャー物質としては、特に制限はなく、公知のクエンチャー物質を適宜選択することができ、例えば、Eclipse Dark Quencher(Epoch Biosciences社製)、BHQ1 Dark Quencher(BIOSERCH TECHNOLOGIES社製)、BHQ2 Dark Quencher(BIOSERCH TECHNOLOGIES社製)などが挙げられる。
前記プローブは、下記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを少なくとも含み、必要に応じて更にその他のプローブを含む。
5’−aa(y)gc(n)ya(y)−3’(配列番号:13)
配列番号:13は、NS5Aタンパク質の91番目から93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であり、下線部は、93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する。また、配列番号:13中、「y」は、チミン又はシトシンを示し、「n」は、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンを示す。
後述する製造例1に示すように、NS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異は、主に277番目の塩基がtからcになることにより生じる。また、273番目、276番目、279番目の塩基(前記配列番号:13において、( )を付した塩基)では、HCV間にバリエーションが存在する。そのため、NS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の有無を、低コストで、簡便かつ迅速に、定量的に測定するためには、プローブの設計が非常に重要である。
前記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Ycacタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−aacgcat[a]ca−3’(配列番号:1)
前記配列番号:1中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がチロシンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列である。
前記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異を引き起こす277番目の塩基をRNAとするのではなく、その隣の278番目の塩基をRNAとすることにより、前記Ycacタイプの配列に加え、Ycgcタイプの配列(前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcgcである配列)、Ycccタイプの配列(前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcccである配列)、及びYctcタイプの配列(前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にctcである配列)をも検出することができる。即ち、前記配列番号:13で表される塩基配列における「n」のバリエーションの影響を受けずにNS5Aの93番目がチロシンであるか否か及びその量を測定することができる。
前記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、1種単独で使用してもよいし、2種を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
前記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Hcacタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−aacgcac[a]ca−3’(配列番号:2)
前記配列番号:2中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号:13において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列である。
前記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異を引き起こす277番目の塩基をRNAとするのではなく、その隣の278番目の塩基をRNAとすることにより、前記Hcacタイプの配列に加え、Hcgcタイプの配列(前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcgcである配列)、Hcccタイプの配列(前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcccである配列)、及びHctcタイプの配列(前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にctcである配列)をも検出することができる。即ち、前記配列番号:13で表される塩基配列における「n」のバリエーションの影響を受けずにNS5Aの93番目がヒスチジンであるか否か及びその量を測定することができる。
前記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Hcacタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−acgcac[a]ca−3’(配列番号:18)
前記配列番号:18中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号:13において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列である。
前記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異を引き起こす277番目の塩基をRNAとするのではなく、その隣の278番目の塩基をRNAとすることにより、前記Hcacタイプの配列に加え、Hcgcタイプの配列(前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcgcである配列)、Hcccタイプの配列(前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcccである配列)、及びHctcタイプの配列(前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にctcである配列)をも検出することができる。即ち、前記配列番号:13で表される塩基配列における「n」のバリエーションの影響を受けずにNS5Aの93番目がヒスチジンであるか否か及びその量を測定することができる。
前記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記その他のプローブとしては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他のプローブとしては、下記配列番号:9で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号:10で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:22で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む態様が、C型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の有無をより高い精度で検出することができる点で、好ましい。
前記配列番号:9で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Ycgcタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−aacgcgt[a]ca−3’(配列番号:9)
前記配列番号:9中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:9で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がチロシンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcgcである配列である。
前記配列番号:9で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号:9で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、1種単独で使用してもよいし、2種を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号:9で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
前記配列番号:10で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Hcgcタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−aacgcgc[a]ca−3’(配列番号:10)
前記配列番号:10中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:10で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcgcである配列である。
前記配列番号:10で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号:22で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Hcgcタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−acgcgc[a]ca−3’(配列番号:22)
前記配列番号:22中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:22で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号:13において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcgcである配列である。
前記配列番号:22で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記その他のプローブを用いることにより、更に多くの検体におけるC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異を検出することができる。
前記配列番号:3で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Ycatタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−aacgcat[a]ta−3’(配列番号:3)
前記配列番号:3中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:3で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がチロシンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcatである配列である。
前記配列番号:3で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号:3で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、1種単独で使用してもよいし、2種を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号:3で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
前記配列番号:4で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Hcatタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−aacgcac[a]ta−3’(配列番号:4)
前記配列番号:4中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:4で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcatである配列である。
前記配列番号:4で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号:19で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Hcatタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−acgcac[a]ta−3’(配列番号:19)
前記配列番号:19中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:19で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcatである配列である。
前記配列番号:19で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号:5で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Ytacタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−aatgcat[a]ca−3’(配列番号:5)
前記配列番号:5中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:5で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がチロシンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にtacである配列である。
前記配列番号:5で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号:5で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、1種単独で使用してもよいし、2種を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号:5で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
前記配列番号:6で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Htacタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−aatgcac[a]ca−3’(配列番号:6)
前記配列番号:6中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:6で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にtacである配列である。
前記配列番号:6で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号:20で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Htacタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−atgcac[a]ca−3’(配列番号:20)
前記配列番号:20中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:20で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にtacである配列である。
前記配列番号:20で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号:7で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Ytatタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−aatgcat[a]ta−3’(配列番号:7)
前記配列番号:7中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:7で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がチロシンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にtatである配列である。
前記配列番号:7で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号:7で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、1種単独で使用してもよいし、2種を併用してもよい。これらの中でも、前記配列番号:7で表される塩基配列からなるプローブが好ましい。
前記配列番号:8で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Htatタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−aatgcac[a]ta−3’(配列番号:8)
前記配列番号:8中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:8で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にtatである配列である。
前記配列番号:8で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
前記配列番号:21で表される塩基配列からなるプローブ(以下、「Htatタイプ」と称することがある)の配列は、以下のとおりである。
5’−atgcac[a]ta−3’(配列番号:21)
前記配列番号:21中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記配列番号:21で表される塩基配列からなるプローブは、NS5Aの93番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にtatである配列である。
前記配列番号:21で表される塩基配列からなるプローブは、その相補的な塩基配列からなるプローブとしてもよい。
(1) 前記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、前記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとの組合せ
(2) 前記配列番号:9で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、前記配列番号:10で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号:22で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとの組合せ
(3) 前記配列番号:3で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、前記配列番号:4で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号:19で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとの組合せ
(4) 前記配列番号:5で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、前記配列番号:6で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号:20で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとの組合せ
(5) 前記配列番号:7で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、前記配列番号:8で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号:21で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとの組合せ
前記プライマーセットとしては、C型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、検体中における様々なHCVのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能である点で、下記配列番号:11で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号:12で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び下記配列番号:11に相補的な塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号:12に相補的な塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットのいずれかであることが好ましい。
前記配列番号:11で表される塩基配列からなるプライマーは、NS5Aタンパク質をコードする塩基配列の208番目から226番目に対応するものであり、その配列は、以下のとおりである。
5’−ggttccatgaggatcgttg−3’(配列番号:11)
前記配列番号:11で表される塩基配列からなるプライマーは、その相補的な塩基配列からなるプライマーであってもよいが、前記配列番号:11で表される塩基配列からなるプライマーが好ましい。
前記配列番号:12で表される塩基配列からなるプライマーは、NS5Aタンパク質をコードする塩基配列の376番目から394番目に対応するものであり、その配列は、以下のとおりである。
5’−ccgtcacgtagtggaaatc−3’(配列番号:12)
前記配列番号:12で表される塩基配列からなるプライマーは、その相補的な塩基配列からなるプライマーであってもよいが、前記配列番号:12で表される塩基配列からなるプライマーが好ましい。
前記組合せのプローブを同一の反応容器に入れて行う場合には、それぞれのプローブを修飾する前記蛍光物質を異なるものとすればよい。前記それぞれのプローブを異なる反応容器に入れて行う場合は、同一の蛍光物質を用いてもよいし、それぞれ異なる蛍光物質を用いてもよい。
前記リアルタイムPCRは、例えば、Cycleave(登録商標)PCR Reaction Mix(タカラバイオ株式会社製)を用いて行うことができる。
前記リアルタイムPCRの反応条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記リアルタイムPCRにより、検体中におけるHCVのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の有無を定量的に測定することができ、HCVのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異を検出することができる。
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記被検者から血液、組織などを採取する採取工程などが挙げられる。
本発明のHCV NS5A Y93変異の検出用キットは、前記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、前記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、前記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び前記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの以外のプローブ(以下、「その他のプローブ」と称することがある)、プライマーセット、PCRに用いる試薬などが挙げられる。
前記HCV NS5A Y93変異の検出用キットにおけるその他のプローブとしては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記その他のプローブとしては、下記配列番号:9で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号:10で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:22で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む態様が、C型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の有無をより高い精度で検出することができる点で、好ましい。
前記配列番号:9で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:9で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記配列番号:10で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:10で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記配列番号:22で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:22で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記その他のプローブを用いることにより、更に多くの検体におけるC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異を検出することができる。
前記配列番号:3で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:3で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記配列番号:4で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:4で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記配列番号:19で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:19で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記配列番号:5で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:5で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記配列番号:6で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:6で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記配列番号:20で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:20で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記配列番号:7で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:7で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記配列番号:8で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:8で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記配列番号:21で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:21で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記プライマーセットとしては、C型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、検体中における様々なHCVのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能である点で、下記配列番号:11で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号:12で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び前記配列番号:11に相補的な塩基配列からなるプライマーと、前記配列番号:12に相補的な塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットのいずれかであることが好ましい。
前記配列番号:11で表される塩基配列からなるプライマー若しくはその相補的な塩基配列からなるプライマーは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:11で表される塩基配列からなるプライマー若しくはその相補的な塩基配列からなるプライマー」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記配列番号:12で表される塩基配列からなるプライマー若しくはその相補的な塩基配列からなるプライマーは、上記した本発明のHCV NS5A Y93変異の検出方法の「配列番号:12で表される塩基配列からなるプライマー若しくはその相補的な塩基配列からなるプライマー」の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
<プローブの設計>
公開されているDNAデータベースに登録されている647例のHCVの塩基配列を調査した。NS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸(野生型は、チロシン)をコードする塩基配列近傍の塩基配列の調査結果を表1示す。なお、NS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする塩基配列近傍の配列は、下記配列番号:13で表されるとおりである。
5’−aa(y)gc(n)ya(y)−3’(配列番号:13)
配列番号:13は、NS5Aタンパク質の91番目から93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であり、下線部は、93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する。また、配列番号:13中、「y」は、チミン又はシトシンを示し、「n」は、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンを示す。
サイクリングプローブ法では、変異箇所をプローブのRNA部分とすることが一般的である。そのため、277番目の位置の塩基をRNAとしたプローブを設計することが考えられた。しかしながら、後述する試験例5に示すように、277番目の位置の塩基をRNAとした場合、276番目の位置の塩基のバリエーションの影響を受けてしまい、様々なバリエーションのHCVを検出するためには、それぞれのバリエーションに応じたプローブを用意しなければならないことがわかった。
−プローブセット−
・ Ycacタイプ−1:
5’−aacgcat[a]ca−3’(配列番号:1)
配列番号:1中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記Ycacタイプ−1は、NS5Aの93番目のアミノ酸がチロシンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列である。
前記Ycacタイプ−1のプローブは、5’末端が蛍光物質(FAM)で修飾されており、3’末端がクエンチャー物質(Eclipse Dark Quencher(Epoch Biosciences社製))で修飾されている。
・ Hcacタイプ−1:
5’−aacgcac[a]ca−3’(配列番号:2)
配列番号:2中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記Hcacタイプ−1は、NS5Aの93番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列である。
前記Hcacタイプ−1のプローブは、5’末端が蛍光物質(FAM)で修飾されており、3’末端がクエンチャー物質(Eclipse Dark Quencher(Epoch Biosciences社製))で修飾されている。
C型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットとして、以下の配列番号:11及び12で表される塩基配列からなるプライマーセットを調製した。前記プライマーセットは、公開されているDNAデータベースに登録されている約600例のHCV塩基配列をもとに、リアルタイムPCRに用いることができる、相同性の高い領域を見出し、設計した。
・ HCV_Y93−1L:
5’−ggttccatgaggatcgttg−3’(配列番号:11)
前記配列番号:11で表される塩基配列は、NS5Aタンパク質をコードする塩基配列の208番目から226番目に対応する。
・ HCV_Y93−1R:
5’−ccgtcacgtagtggaaatc−3’(配列番号:12)
前記配列番号:12で表される塩基配列は、NS5Aタンパク質をコードする塩基配列の376番目から394番目に対応する。
前記製造例1で設計したプローブ、又は後述する製造例3で設計したプローブと、前記製造例2で設計したプライマーとを用い、リアルタイムPCRを行うことにより、C型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異を検出することができるか否かを確認するための人工合成遺伝子として、以下の人工合成遺伝子を調製した。なお、前記人工合成遺伝子は、遺伝子型が1b型であるC型肝炎ウイルスのゲノムRNAの配列を参考に調製した。
・ 人工合成遺伝子−1(野生型):
NS5Aタンパク質をコードする塩基配列の198番目から404番目に対応する塩基配列であって、91番目から93番目のアミノ酸をコードする塩基配列が、「aacgcatac」であるもの(配列番号:14)と、その相補鎖からなる二本鎖DNA。前記人工合成遺伝子−1は、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列である。
・ 人工合成遺伝子−2(変異型):
前記配列番号:14において、NS5Aタンパク質の91番目から93番目のアミノ酸をコードする塩基配列が、「aacgcacac」であるもの(配列番号:15)と、その相補鎖からなる二本鎖DNA。前記人工合成遺伝子−2は、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列である。
・ 人工合成遺伝子−3(変異型):
前記配列番号:14において、NS5Aタンパク質の91番目から93番目のアミノ酸をコードする塩基配列が、「aacgcgcac」であるもの(配列番号:16)と、その相補鎖からなる二本鎖DNA。前記人工合成遺伝子−3は、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcgcである配列である。
・ 人工合成遺伝子−4(野生型):
NS5Aタンパク質をコードする塩基配列の198番目から404番目に対応する塩基配列であって、91番目から93番目のアミノ酸をコードする塩基配列が、「aacgcgtac」であるもの(配列番号:23)と、その相補鎖からなる二本鎖DNA。前記人工合成遺伝子−4は、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcgcである配列である。
<人工合成遺伝子サンプルの調製>
前記調製例1で調製した人工合成遺伝子−1(野生型:Y93)と、人工合成遺伝子−2(変異型:Y93H)とを表2のように混合し、人工合成遺伝子サンプルを調製した。
前記サンプルA−1からH−1のそれぞれについて、プローブを前記製造例1で設計した各プローブとし、プライマーセットを前記製造例2で設計したプライマーセットとし、Cycleave(登録商標)PCR Reaction Mix(タカラバイオ株式会社製)を用いて、以下の反応液の組成(表3参照)、及び反応条件で、リアルタイムPCR(反応装置:LightCycler 480)を行った。
なお、前記リアルタイムPCRでは、Ycacタイプのプローブ(配列番号:1)と、Hcacタイプのプローブ(配列番号:2)とを、それぞれ別のウェルに入れ、反応を行った。
−反応条件−
−−ホールド(初期変性)−−
サイクル数:1
条件:95℃、30秒間
−−3ステップPCR−−
サイクル数:45
条件:95℃、5秒間、次いで、55℃、10秒間、その後、72℃、25秒間
前記サンプルA−1からH−1のそれぞれについて、シークエンサーとして、3730xl DNA Analyzer(アプライドバイオシステムズ社製)を用い、試薬として、BigDye Terminator v3.1(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて、サンガーデオキシ法によるダイレクトシークエンスを行った。結果を図1に示す。
<リアルタイムPCR>
遺伝子として、前記調製例1で調製した人工合成遺伝子−3(変異型:Y93H)を用いた以外は、前記試験例1のリアルタイムPCRと同様に、前記製造例1で設計した各プローブ、及び前記製造例2で設計したプライマーを用いてリアルタイムPCRを行った。結果を表5に示す。
したがって、前記製造例1で設計したプローブセットを用いると、HCVの変異やバリエーションによる影響を抑え、検体中における様々なHCVのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の有無を、低コストで、簡便かつ迅速に、定量的に測定することができることが示された。
<検体>
検体として、HCV(遺伝子型:1b型)に感染している患者の血清(SPI研究会から入手)を14検体用意した。
前記各検体について、QIAamp MinElute Virus Spin Kit(キアゲン社製)を用い、ウイルスRNAを抽出し、精製した。
前記ウイルスRNAを鋳型とし、cDNA Synthesis Kit(M−MLV Version)(タカラバイオ株式会社製)を用いて、二本鎖のcDNAを合成した。
鋳型を前記cDNA合成工程で得られた二本鎖のcDNAとした以外は、前記試験例1のリアルタイムPCRと同様にして、前記製造例1で設計した各プローブ、及び前記製造例2で設計したプライマーセットを用い、リアルタイムPCRを行った。結果を表6に示す。
前記cDNA合成工程で得られた二本鎖のcDNAを用いた以外は、前記試験例1と同様にして、ダイレクトシークエンスを行った。結果を表6に示す。
前記ダイレクトシークエンスによれば、変異の有無を定性的に確認することはできるものの、変異の程度を定量的に確認することができず、また、検体からウイルスRNAを調製するところから、シークエンスの結果を得るまでに12時間程度の時間を要した。一方、本発明のサイクリングプローブ法によるリアルタイムPCRによれば、変異の有無のみならず、変異の量を定量的に確認することができ、また、検体からウイルスRNAを調製するところから、リアルタイムPCRの結果を得るまでの時間が5時間程度であり、非常に迅速に結果が得られた。
また、前記試験例2の結果と同様に、検体12の結果から、前記製造例1で設計したプローブを用いると、Hcacタイプの配列(前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列)に加え、予想外にも、Hcgcタイプの配列(前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcgcである配列)をも検出可能であることが示された。
したがって、前記製造例1で設計したプローブセットを用いると、HCVの変異やバリエーションによる影響を抑え、検体中における様々なHCVのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の有無を、低コストで、簡便かつ迅速に、定量的に測定することができることが示された。
<検体>
検体として、HCV(遺伝子型:1a型)に感染している患者の血清、HCV(遺伝子型:2a型)に感染している患者の血清、及びHCV(遺伝子型:2b型)に感染している患者の血清(いずれもSPI研究会から入手)を、それぞれ1検体用意した。
前記各検体について、QIAamp MinElute Virus Spin Kit(キアゲン社製)を用い、ウイルスRNAを抽出し、精製した。
前記ウイルスRNAを鋳型とし、cDNA Synthesis Kit(M−MLV Version)(タカラバイオ株式会社製)を用いて、二本鎖のcDNAを合成した。
鋳型を前記cDNA合成工程で得られた二本鎖のcDNAとした以外は、前記試験例1のリアルタイムPCRと同様にして、前記製造例1で設計した各プローブ、及び前記製造例2で設計したプライマーセットを用い、リアルタイムPCRを行った。結果を表8に示す。
前記cDNA合成工程で得られた二本鎖のcDNAを用いた以外は、前記試験例1と同様にして、ダイレクトシークエンスを行った。結果を表8に示す。
NS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異に寄与する277番目の塩基をプローブのRNA部分とした以外は、配列番号:2と同様とした下記プローブを設計した。
−プローブ−
・ Hcacタイプ−2:
5’−aacgca[c]aca−3’(配列番号:17)
配列番号:17中、[ ]内のcは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。前記Hcacタイプ−2は、NS5Aの93番目のアミノ酸がヒスチジンであり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列である。
前記Hcacタイプ−2のプローブは、5’末端が蛍光物質(FAM)で修飾されており、3’末端がクエンチャー物質(Eclipse Dark Quencher(Epoch Biosciences社製))で修飾されている。
以下の組合せとした以外は、前記試験例1と同様にしてリアルタイムPCRを行った。なお、リアルタイムPCRに用いた人工合成遺伝子量(分子数)は、2.00×106とした。結果を表9に示す。
<試験例5−1>
・ 人工合成遺伝子 : 人工合成遺伝子−3(配列番号:16、変異型であり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcgcである配列である。)
・ プローブ : Hcacタイプ−2(配列番号:17、RNAは277番目の塩基、変異型であり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列である。)
・ プライマー : 製造例2のプライマーセット
<試験例5−2>
・ 人工合成遺伝子 : 人工合成遺伝子−3(配列番号:16、変異型であり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcgcである配列である。)
・ プローブ : Hcacタイプ−1(配列番号:2、RNAは278番目の塩基、変異型であり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列である。)
・ プライマー : 製造例2のプライマーセット
<試験例5−3>
・ 人工合成遺伝子 : 人工合成遺伝子−2(配列番号:15、変異型であり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列である。)
・ プローブ : Hcacタイプ−2(配列番号:17、RNAは277番目の塩基、変異型であり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列である。)
・ プライマー : 製造例2のプライマーセット
<試験例5−4>
・ 人工合成遺伝子 : 人工合成遺伝子−2(配列番号:15、変異型であり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列である。)
・ プローブ : Hcacタイプ−1(配列番号:2、RNAは278番目の塩基、変異型であり、前記配列番号:13で表される塩基配列において( )を付した位置の塩基が5’側から順にcacである配列である。)
・ プライマー : 製造例2のプライマーセット
C型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出率をより向上させるために、以下のプローブセットを設計した。
・ 野生株検出用プローブ:
(1)5’−aacgcat[a]ca−3’(配列番号:1)
(2)5’−aacgcgt[a]ca−3’(配列番号:9)
配列番号:1、及び9中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。
前記配列番号:1、及び9で表される野生型検出用プローブは、5’末端が蛍光物質(FAM)で修飾されており、3’末端がクエンチャー物質(Eclipse Dark Quencher(Epoch Biosciences社製))で修飾されている。
前記野生株検出用プローブにおける、配列番号:1で表されるプローブと、配列番号:9で表されるプローブとの分子数の比は、1:1である。
5’−acgcac[a]ca−3’(配列番号:18)
5’−acgcgc[a]ca−3’(配列番号:22)
配列番号:18、及び22中、[ ]内のaは、RNAであることを示し、下線部はNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする部分に対応する配列であることを示す。
前記配列番号:18、及び22で表される変異株検出用プローブは、5’末端が蛍光物質(ROX)で修飾されており、3’末端がクエンチャー物質(Eclipse Dark Quencher(Epoch Biosciences社製))で修飾されている。
前記変異株検出用プローブにおける、配列番号:18で表されるプローブと、配列番号:22で表されるプローブとの分子数の比は、1:1である。
<人工合成遺伝子サンプルの調製>
前記調製例1で調製した人工合成遺伝子−4(野生型:Y93)と、人工合成遺伝子−3(変異型:Y93H)とを表10のように混合し、人工合成遺伝子サンプルを調製した。
前記サンプルA−2からH−2のそれぞれについて、プローブを前記製造例3で設計した各プローブとし、プライマーセットを前記製造例2で設計したプライマーセットとし、Cycleave(登録商標)PCR Reaction Mix(タカラバイオ株式会社製)を用いて、以下の反応液の組成(表11参照)、及び反応条件で、リアルタイムPCR(反応装置:LightCycler 480)を行った。
なお、前記リアルタイムPCRでは、野生株検出用プローブ(サイクリングプローブY)と、変異株検出用プローブ(サイクリングプローブH)とを同じウェルに入れ、反応を行った。
−反応条件−
−−ホールド(初期変性)−−
サイクル数:1
条件:95℃、30秒間
−−3ステップPCR−−
サイクル数:45
条件:95℃、5秒間、次いで、55℃、10秒間、その後、72℃、25秒間
遺伝子として、前記調製例1で調製した人工合成遺伝子−2(変異型:Y93H)を用いた以外は、前記試験例6のリアルタイムPCRと同様に、前記製造例3で設計した各プローブ、及び前記製造例2で設計したプライマーを用いてリアルタイムPCRを行った。結果を表13に示す。
したがって、前記製造例3で設計したプローブセットを用いると、HCVの変異やバリエーションによる影響を抑え、検体中における様々なHCVのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の有無を、より高い精度で測定することができることが示された。
<1> 検体中のC型肝炎ウイルスのRNAを鋳型としてcDNAを合成するcDNA合成工程と、
前記cDNAを鋳型とし、サイクリングプローブ法を用いてリアルタイムPCRを行うリアルタイムPCR工程とを含み、
前記リアルタイムPCRに用いるプライマーセットが、C型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであり、
前記リアルタイムPCRに用いるプローブが、
下記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含むことを特徴とするC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法である。
aacgcat[a]ca(配列番号:1)
aacgcac[a]ca(配列番号:2)
acgcac[a]ca(配列番号:18)
配列番号:1、2、及び18中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。
<2> リアルタイムPCRに用いるプローブが、
下記配列番号:9で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号:10で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:22で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む前記<1>に記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法である。
aacgcgt[a]ca(配列番号:9)
aacgcgc[a]ca(配列番号:10)
acgcgc[a]ca(配列番号:22)
配列番号:9、10、及び22中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。
<3> リアルタイムPCRに用いるプローブが、
下記配列番号:3で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号:4で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:19で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む前記<1>から<2>のいずれかに記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法である。
aacgcat[a]ta(配列番号:3)
aacgcac[a]ta(配列番号:4)
acgcac[a]ta(配列番号:19)
配列番号:3、4、及び19中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。
<4> リアルタイムPCRに用いるプローブが、
(1)下記配列番号:5で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号:6で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:20で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せ、及び
(2)下記配列番号:7で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号:8で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:21で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せの少なくともいずれかを含む前記<1>から<3>のいずれかに記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法である。
aatgcat[a]ca(配列番号:5)
aatgcac[a]ca(配列番号:6)
atgcac[a]ca(配列番号:20)
aatgcat[a]ta(配列番号:7)
aatgcac[a]ta(配列番号:8)
atgcac[a]ta(配列番号:21)
配列番号:5、6、7、8、20、及び21中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。
<5> リアルタイムPCRに用いるプライマーセットが、
(1)下記配列番号:11で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号:12で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び
(2)下記配列番号:11で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号:12で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットのいずれかである前記<1>から<4>のいずれかに記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法である。
ggttccatgaggatcgttg(配列番号:11)
ccgtcacgtagtggaaatc(配列番号:12)
<6> C型肝炎ウイルスの遺伝子型が、1a型、1b型、2a型、及び2b型のいずれかである前記<1>から<5>のいずれかに記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法である。
<7> 下記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含むことを特徴とするC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キットである。
aacgcat[a]ca(配列番号:1)
aacgcac[a]ca(配列番号:2)
acgcac[a]ca(配列番号:18)
配列番号:1、2、及び18中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。
<8> 下記配列番号:9で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号:10で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:22で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む前記<7>に記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キットである。
aacgcgt[a]ca(配列番号:9)
aacgcgc[a]ca(配列番号:10)
acgcgc[a]ca(配列番号:22)
配列番号:9、10、及び22中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。
<9> 下記配列番号:3で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号:4で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:19で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む前記<7>から<8>のいずれかに記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キットである。
aacgcat[a]ta(配列番号:3)
aacgcac[a]ta(配列番号:4)
acgcac[a]ta(配列番号:19)
配列番号:3、4、及び19中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。
<10> (1)下記配列番号:5で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号:6で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:20で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せ、及び
(2)下記配列番号:7で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号:8で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:21で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せの少なくともいずれかを含む前記<7>から<9>のいずれかに記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キットである。
aatgcat[a]ca(配列番号:5)
aatgcac[a]ca(配列番号:6)
atgcac[a]ca(配列番号:20)
aatgcat[a]ta(配列番号:7)
aatgcac[a]ta(配列番号:8)
atgcac[a]ta(配列番号:21)
配列番号:5、6、7、8、20、及び21中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。
<11> (1)下記配列番号:11で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号:12で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び
(2)下記配列番号:11で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号:12で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットの少なくともいずれかを含む前記<7>から<10>のいずれかに記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キットである。
ggttccatgaggatcgttg(配列番号:11)
ccgtcacgtagtggaaatc(配列番号:12)
<12> C型肝炎ウイルスの遺伝子型が、1a型、1b型、2a型、及び2b型のいずれかである前記<7>から<11>のいずれかに記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キットである。
本発明のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キットは、本発明のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法などに好適に利用可能である。
Claims (10)
- 検体中のC型肝炎ウイルスのRNAを鋳型としてcDNAを合成するcDNA合成工程と、
前記cDNAを鋳型とし、サイクリングプローブ法を用いてリアルタイムPCRを行うリアルタイムPCR工程とを含み、
前記リアルタイムPCRに用いるプライマーセットが、C型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであり、
前記リアルタイムPCRに用いるプローブが、
下記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含むことを特徴とするC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法。
aacgcat[a]ca(配列番号:1)
aacgcac[a]ca(配列番号:2)
acgcac[a]ca(配列番号:18)
配列番号:1、2、及び18中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。 - リアルタイムPCRに用いるプローブが、
下記配列番号:9で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号:10で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:22で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む請求項1に記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法。
aacgcgt[a]ca(配列番号:9)
aacgcgc[a]ca(配列番号:10)
acgcgc[a]ca(配列番号:22)
配列番号:9、10、及び22中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。 - リアルタイムPCRに用いるプローブが、
下記配列番号:3で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号:4で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:19で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む請求項1から2のいずれかに記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法。
aacgcat[a]ta(配列番号:3)
aacgcac[a]ta(配列番号:4)
acgcac[a]ta(配列番号:19)
配列番号:3、4、及び19中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。 - リアルタイムPCRに用いるプローブが、
(1)下記配列番号:5で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号:6で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:20で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せ、及び
(2)下記配列番号:7で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号:8で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:21で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せの少なくともいずれかを含む請求項1から3のいずれかに記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法。
aatgcat[a]ca(配列番号:5)
aatgcac[a]ca(配列番号:6)
atgcac[a]ca(配列番号:20)
aatgcat[a]ta(配列番号:7)
aatgcac[a]ta(配列番号:8)
atgcac[a]ta(配列番号:21)
配列番号:5、6、7、8、20、及び21中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。 - リアルタイムPCRに用いるプライマーセットが、
(1)下記配列番号:11で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号:12で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び
(2)下記配列番号:11で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号:12で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットのいずれかである請求項1から4のいずれかに記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出方法。
ggttccatgaggatcgttg(配列番号:11)
ccgtcacgtagtggaaatc(配列番号:12) - 下記配列番号:1で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号:2で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:18で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含むことを特徴とするC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
aacgcat[a]ca(配列番号:1)
aacgcac[a]ca(配列番号:2)
acgcac[a]ca(配列番号:18)
配列番号:1、2、及び18中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。 - 下記配列番号:9で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号:10で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:22で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む請求項6に記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
aacgcgt[a]ca(配列番号:9)
aacgcgc[a]ca(配列番号:10)
acgcgc[a]ca(配列番号:22)
配列番号:9、10、及び22中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。 - 下記配列番号:3で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、
下記配列番号:4で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:19で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとを含む請求項6から7のいずれかに記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
aacgcat[a]ta(配列番号:3)
aacgcac[a]ta(配列番号:4)
acgcac[a]ta(配列番号:19)
配列番号:3、4、及び19中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。 - (1)下記配列番号:5で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号:6で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:20で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せ、及び
(2)下記配列番号:7で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブと、下記配列番号:8で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブ、及び下記配列番号:21で表される塩基配列からなるプローブ若しくはその相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかとからなる組合せの少なくともいずれかを含む請求項6から8のいずれかに記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
aatgcat[a]ca(配列番号:5)
aatgcac[a]ca(配列番号:6)
atgcac[a]ca(配列番号:20)
aatgcat[a]ta(配列番号:7)
aatgcac[a]ta(配列番号:8)
atgcac[a]ta(配列番号:21)
配列番号:5、6、7、8、20、及び21中、[ ]内の塩基は、RNAであることを示す。 - (1)下記配列番号:11で表される塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号:12で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、及び
(2)下記配列番号:11で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーと、下記配列番号:12で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットの少なくともいずれかを含む請求項6から9のいずれかに記載のC型肝炎ウイルスのNS5Aタンパク質の93番目のアミノ酸の変異の検出用キット。
ggttccatgaggatcgttg(配列番号:11)
ccgtcacgtagtggaaatc(配列番号:12)
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