JPWO2015022953A1 - Blood brain barrier disorder improving agent - Google Patents

Abstract

【課題】従来公知のプロサイモシンα又はそのペプチドよりも製造・加工が容易であり，それらと同等又はそれ以上の活性を有するペプチド提供すること。【解決手段】本発明は，配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはこれと実質的に同等の機能を有するペプチドを有効成分として含有してなる，血液臓器関門障害改善剤，血液臓器関門障害を伴う疾患又は虚血性疾患の治療剤，神経細胞死抑制剤を提供する。【選択図】 図１ＡThe present invention provides a peptide that is easier to produce and process than conventionally known prothymosin α or its peptide, and has an activity equal to or higher than that. [MEANS FOR SOLVING PROBLEMS] The present invention improves a blood organ barrier disorder, comprising as an active ingredient a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a peptide having a function substantially equivalent thereto. The present invention provides an agent, a therapeutic agent for a disease associated with a blood organ barrier disorder or an ischemic disease, and a neuronal cell death inhibitor. [Selection] Figure 1A

Description

本発明は，プロサイモシンα由来のペプチド，及びそのペプチドを有効成分として含む血液臓器関門障害改善剤などに関する。   The present invention relates to a peptide derived from prothymosin α, a blood organ barrier disorder ameliorating agent containing the peptide as an active ingredient, and the like.

脳卒中は日本人の死亡率第４位，寝たきりの病因で第１位の重要疾患であり，脳虚血が原因で生じる疾患である。脳卒中をはじめとする脳虚血性の疾患に対しては，予後を改善する意味で，急性期治療が重要であるといわれている。現在注目されている主な治療方法はプラスミノーゲンアクチベータ（以下，「ｔＰＡ」と記載する）をはじめとした血栓溶解剤であるが，その使用は４．５時間以内に限られ，その恩恵をうけることができる患者は十数パーセント程度にすぎない（非特許文献１参照）。この一因として，脳虚血後の時間経過と共に血液脳関門が脆弱になること，ｔＰＡなどの血栓溶解剤の使用により出血性脳卒中の危険性が増すことが挙げられる。   Stroke is the fourth most common mortality in Japan, the number one most important cause of bedridden disease, and is caused by cerebral ischemia. It is said that acute treatment is important to improve prognosis for cerebral ischemic diseases such as stroke. The main therapeutic methods currently attracting attention are thrombolytic agents including plasminogen activator (hereinafter referred to as “tPA”), but its use is limited to within 4.5 hours, and its benefits are Only about a dozen percent of patients can be received (see Non-Patent Document 1). One reason for this is that the blood-brain barrier becomes weaker over time after cerebral ischemia, and the risk of hemorrhagic stroke is increased by the use of thrombolytic agents such as tPA.

発明者は近年，プロサイモシンαが神経細胞死保護作用を有する物質であり，この神経細胞死抑制効果によって脳卒中障害を軽減することができることを初めて見出した（特許文献１参照）。また発明者らはプロサイモシンαがマウス，ラットにおいて脳卒中および虚血性緑内障を抑制する効果を有することも見出した（非特許文献２〜４参照）。さらに発明者は，プロサイモシンαが，血液脳関門の脆弱化から血液脳関門を保護する作用を有することを見出すとともに，ラットプロサイモシンα中の３０アミノ酸からなる活性本体と，活性発現に重要な当該配列中の９アミノ酸とを明らかにした（特許文献２参照）。   The inventor recently found for the first time that prothymosin α is a substance having a neuronal cell death-protecting action, and that this neuronal cell death inhibitory effect can reduce stroke disorders (see Patent Document 1). The inventors have also found that prothymosin α has an effect of suppressing stroke and ischemic glaucoma in mice and rats (see Non-Patent Documents 2 to 4). Furthermore, the inventor has found that prothymosin α has an action of protecting the blood brain barrier from the weakening of the blood brain barrier, and also has an active body consisting of 30 amino acids in rat prothymosin α and is important for the expression of the activity. Nine amino acids in the sequence were clarified (see Patent Document 2).

国際公開２００４／０６４８６１号パンフレットInternational Publication No. 2004/064861 Pamphlet 国際公開２０１１／０１９０２３号パンフレットInternational publication 2011/019023 pamphlet

最新医療：医療：医療と介護：読売新聞オンライン ２００５年１０月２５日付記事，「脳梗塞に新薬 ｔＰＡ」，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｏｍｉｕｒｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｉｒｙｏｕ／ｍｅｄｉ／ｓａｉｓｉｎ／２００５１０２５ｉｋ１４．ｈｔｍLatest medical care: Medical care: Medical care and long-term care: Yomiuri Shimbun Online Article dated 25 October 2005, “New drug for cerebral infarction tPA”, http: // www. yomiuri. co. jp / iryou / medi / saisin / 200501025ik14. htm Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７），１７６，８５３−８６２Journal of Cell Biology (2007), 176, 853-862 Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００７），１４，１８３９−１８４２Cell Death and Differentiation (2007), 14, 1839-1842 Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００９），１６，３４９−３５８Cell Death and Differentiation (2009), 16, 349-358.

虚血により生じうる血液臓器関門の脆弱化を抑制し，血液臓器関門を保護することができる物質であって，薬剤等への適用を見据えて，現在公知のペプチドよりも取扱いの容易な物質が望まれている。特に，製造の容易さ及び市場での採算性を考慮すると，長さを１０アミノ酸以下にすることが望ましい。   A substance that can suppress the weakening of the blood organ barrier that can be caused by ischemia and protect the blood organ barrier, and is easier to handle than currently known peptides in view of its application to drugs. It is desired. In particular, considering the ease of production and profitability in the market, it is desirable to make the length 10 amino acids or less.

本発明者は，上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果，プロサイモシンαの５０番目から５７番目の８アミノ酸からなるペプチドを改変したペプチド（Ｐ８改変ペプチド：配列番号２など）及びこのペプチドを環状したペプチド（環状Ｐ８改変ペプチド：配列番号３）が，血液脳関門障害改善活性などの特性を有することを見出した。本発明者はさらに鋭意検討し，本発明を完成するに至った。   As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor has obtained a peptide (P8 modified peptide: SEQ ID NO: 2, etc.) obtained by modifying a peptide consisting of eight amino acids from 50th to 57th of prothymosin α and this peptide. It was found that a cyclic peptide (cyclic P8 modified peptide: SEQ ID NO: 3) has properties such as blood-brain barrier amelioration activity. The present inventor has further intensively studied and has completed the present invention.

上記の発明は，基本的には以下の知見に基づく。本発明者は，国際公開２０１１／０１９０２３号パンフレット（特許文献２）に開示されたＰｒｏＴα９と表記されるラットプロサイモシンαの５２番目のアミノ酸から６０番目のアミノ酸からなるポリペプチドにおいてアミノ酸配列からＮ末端及びＣ末端の残基を１〜数個移動させて得られる部分ペプチド（配列番号１，４又は６で示されるペプチド）及びこれらのペプチドの１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなる改変ペプチド又はその塩ペプチド（配列番号２，３又は５で示される改変ペプチド）の網膜虚血障害保護作用を検討し，改変ペプチドがより高い作用を示すことを見出した。   The above invention is basically based on the following knowledge. The present inventor has determined from the amino acid sequence N in the polypeptide consisting of the 52nd amino acid to the 60th amino acid of rat prothymosin α expressed as ProTα9 disclosed in International Publication No. 2011/019023 (Patent Document 2). Modification consisting of partial peptides (peptides represented by SEQ ID NO: 1, 4 or 6) obtained by moving one or several residues at the terminal and C-terminal and amino acid sequences in which one amino acid of these peptides is substituted The peptide or its salt peptide (modified peptide represented by SEQ ID NO: 2, 3 or 5) was examined for its protective effect on retinal ischemic injury, and it was found that the modified peptide exhibits a higher effect.

P+2N／−4C : DNEVDEE（配列番号４）
P+2N／−4C改変 : DNEVDQE（配列番号５）
P+2N／−3C : DNEVDEEE（配列番号１）
P+2N／−3C改変 : DNEVDQEE（配列番号２）
P+2N／−3C改変 : *DNEVDQEE*（配列番号３） ＊のアミノ酸を結合して環状化
P+2N／−2C : DNEVDEEEE（配列番号６）
P+2N／−2C改変 : DNEVDQEEE（配列番号７）P + 2N / -4C: DNEVDEE (SEQ ID NO: 4)
P + 2N / -4C modification: DNEVDQE (SEQ ID NO: 5)
P + 2N / -3C: DNEVDEEE (SEQ ID NO: 1)
P + 2N / -3C modification: DNEVDQEE (SEQ ID NO: 2)
P + 2N / -3C modification: * DNEVDQEE * (SEQ ID NO: 3)
P + 2N / -2C: DNEVDEEEE (SEQ ID NO: 6)
P + 2N / -2C modification: DNEVDQEEE (SEQ ID NO: 7)

また，本発明者は，先に説明した環状Ｐ８改変ペプチドが上記ペプチドの中でも最も高い網膜虚血障害保護作用を有することを見出した。   The present inventor has also found that the cyclic P8 modified peptide described above has the highest protective effect on retinal ischemic injury among the above peptides.

Ｐ８改変ペプチド及び環状Ｐ８改変ペプチドは，ｔＰＡによって誘発される脳梗塞時の出血作用抑制作用が認められた。   P8 modified peptide and cyclic P8 modified peptide were confirmed to have an inhibitory effect on hemorrhage during cerebral infarction induced by tPA.

Ｐ８改変ペプチド及び環状Ｐ８改変ペプチドは，ｔＰＡによって誘発される脳梗塞時の血管脆弱化に対する保護作用が認められた。   P8 modified peptide and cyclic P8 modified peptide were observed to have a protective effect against vascular weakening during cerebral infarction induced by tPA.

Ｐ８改変ペプチド及び環状Ｐ８改変ペプチドは，ｔＰＡ併用時の運動障害改善作用が認められた。   The P8 modified peptide and the cyclic P8 modified peptide were found to have a movement disorder improving effect when tPA was used in combination.

本発明者は，環状Ｐ８改変ペプチドが，ＰＩＴモデルにおける運動障害改善において高活性を示すことを見出した。   The inventor has found that cyclic P8-modified peptides exhibit high activity in improving movement disorders in the PIT model.

本発明の第１の側面は，配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩に関する。この塩は薬学的に許容される塩である。この側面は，配列（配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列）に含まれる２つのアミノ酸残基が結合したものが好ましい。   The first aspect of the present invention relates to a peptide comprising an amino acid sequence in which one amino acid is substituted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof. This salt is a pharmaceutically acceptable salt. This aspect is preferably a combination of two amino acid residues contained in a sequence (an amino acid sequence in which one amino acid is substituted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1).

この側面のペプチドまたはその塩の好ましいものは，配列番号２又は配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である。そして，この側面のペプチド又はその塩の特に好ましいものは，配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である。配列番号３は，末端のＮ（アスパラギン酸部分）とＥ（グルタミン酸）との間で結合が形成されたペプチドである。   A preferred peptide of this aspect or a salt thereof is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a salt thereof. A particularly preferred peptide of this aspect or a salt thereof is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a salt thereof. SEQ ID NO: 3 is a peptide in which a bond is formed between terminal N (aspartic acid moiety) and E (glutamic acid).

本発明の第２の側面は，上記したいずれかのペプチドまたはその塩を有効成分として含む血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤に関する。このように，本発明のペプチドまたはその塩を有効成分として含む治療剤を，本発明の治療剤ともよぶ。この治療剤は，上記したいずれかのペプチドまたはその塩をその機能を発揮できる程度の有効量含むものである。具体的に説明すると，この治療剤は，血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤といえる。さらに具体的に説明すると，この治療剤は，アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害，一過性血流障害，高血圧性脳障害，頭蓋内外の動脈の塞栓症，血栓症に起因する梗塞，動脈瘤，動静脈奇形，脳動脈狭窄性病変，硬膜動静脈瘻，血管外傷，血管性腫瘍，ウィルス感染性脳炎，脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫，又は脳梗塞後の脆弱性血管新生による出血疾患の治療剤である。また，本発明の治療剤の好ましい態様は，虚血性疾患の治療剤である。さらに，本発明の治療剤の好ましい態様は，脳梗塞の治療剤である。本発明の治療剤の好ましい態様は，血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血の治療剤又は予防剤である。本発明の治療剤の好ましい態様は，神経細胞死抑制剤である。   The second aspect of the present invention relates to a therapeutic agent for a disease associated with a blood organ barrier disorder comprising any of the above-described peptides or salts thereof as an active ingredient. Thus, the therapeutic agent containing the peptide of the present invention or a salt thereof as an active ingredient is also referred to as the therapeutic agent of the present invention. This therapeutic agent contains one of the above-described peptides or a salt thereof in an effective amount that can exert its function. Specifically, this therapeutic agent can be said to be a therapeutic agent for diseases associated with blood-brain barrier disorders. More specifically, this treatment is caused by secondary vascular disorders due to atherosclerosis or hypertension, transient blood flow disorders, hypertensive encephalopathy, intracranial and arterial embolism, and thrombosis. Infarction, aneurysm, arteriovenous malformation, cerebral artery stenosis, dural arteriovenous fistula, vascular trauma, vascular tumor, viral infectious encephalitis, edema due to fragile angiogenesis after cerebral infarction, or after cerebral infarction It is a therapeutic agent for bleeding disorders caused by fragile angiogenesis. A preferred embodiment of the therapeutic agent of the present invention is an ischemic disease therapeutic agent. Furthermore, a preferred embodiment of the therapeutic agent of the present invention is a therapeutic agent for cerebral infarction. A preferred embodiment of the therapeutic agent of the present invention is a therapeutic or preventive agent for movement disorders or cerebral hemorrhage caused by a thrombolytic agent. A preferred embodiment of the therapeutic agent of the present invention is a neuronal cell death inhibitor.

本発明の第３の側面は，本発明のペプチドまたはその塩，及び血栓溶解剤を有効成分として含む，脳虚血性疾患用治療剤である。本発明のペプチドまたはその塩は，血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血を治療又は予防できるので，血栓溶解剤との併用が有効である。この側面において，好ましい血栓溶解剤は，プラスミノーゲンアクチベータである。さらに，この側面において，好ましい適応症は脳梗塞である。この側面において，本発明のペプチドまたはその塩と血栓溶解剤とは，対象となる患者に同時に投与されても良い。また，本発明のペプチドまたはその塩を血栓溶解剤投与の１時間前に前投与することにより，脳梗塞後６時間における血栓溶解剤による治療効果を高めることが期待される。また，同時投与することにより脳梗塞４時間後に投与した血栓溶解剤による出血作用を抑制するなどの重要な副作用を軽減できるという特性も期待できる。血栓溶解剤は，様々な副作用を惹起する場合がある。例えば，脳梗塞の疑いがある患者に対し，本発明のペプチドまたはその塩を投与することで，血栓溶解剤を投与する時間的余裕を多くすることができる。このため，精密検査を行って脳梗塞であると判明した後に，血栓溶解剤を投与できることとなる。   The third aspect of the present invention is a therapeutic agent for cerebral ischemic disease comprising the peptide of the present invention or a salt thereof and a thrombolytic agent as active ingredients. Since the peptide of the present invention or a salt thereof can treat or prevent a movement disorder or cerebral hemorrhage caused by a thrombolytic agent, a combination with a thrombolytic agent is effective. In this aspect, the preferred thrombolytic agent is a plasminogen activator. Furthermore, in this aspect, the preferred indication is cerebral infarction. In this aspect, the peptide of the present invention or a salt thereof and the thrombolytic agent may be simultaneously administered to the subject patient. Moreover, it is expected that the therapeutic effect of the thrombolytic agent at 6 hours after cerebral infarction is enhanced by pre-administering the peptide of the present invention or a salt thereof 1 hour before the administration of the thrombolytic agent. Moreover, the characteristic that the side effect which suppresses the bleeding effect by the thrombolytic agent administered 4 hours after cerebral infarction, etc. can be reduced by coadministering can also be expected. Thrombolytic agents can cause various side effects. For example, by administering the peptide of the present invention or a salt thereof to a patient suspected of having cerebral infarction, the time margin for administering the thrombolytic agent can be increased. Therefore, thrombolytic agents can be administered after a close examination reveals a cerebral infarction.

本発明の血液臓器関門障害改善剤は，虚血により生じうる血液臓器関門の脆弱化を抑制し，血液臓器関門障害を改善することができる。特に脳虚血（脳卒中など）により生じうる血液脳関門の脆弱化の抑制や，網膜虚血により生じうる血液網膜関門障害の改善に有用である。よって本発明の剤は血液臓器関門障害に起因する疾患の治療剤となり得る。
あるいは，各臓器の虚血により血液臓器関門が脆弱化した場合であって，血栓溶解剤の適用対象外と判断されるような場合であっても，従来公知の血栓溶解剤と本発明の剤とを併用することによって，血栓溶解剤による血液臓器関門からの出血といった副作用を心配することなく虚血性疾患を治療することができる。
本発明の血液臓器関門障害改善剤の有効成分は，プロサイモシンαの５０番目から５７番目の８アミノ酸からなるペプチド（本明細書中，「ＰｒｏＴα８」や「Ｐ８」と記載する場合がある；配列番号１）を改変したペプチド（配列番号２及び３）等である。この有効成分は，従来知られているプロサイモシンα全長やプロサイモシンα由来のペプチドに比べて，製造・加工が容易であって，かつ同等以上の虚血改善効果を有している。したがって当該ペプチドは，血液臓器関門障害の改善剤や，血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤，また虚血性疾患の治療剤等の有効成分として，より有用である。The blood organ barrier disorder-improving agent of the present invention can suppress the weakening of the blood organ barrier that may be caused by ischemia and can improve the blood organ barrier disorder. In particular, it is useful for suppressing the weakening of the blood-brain barrier that can be caused by cerebral ischemia (stroke, etc.) and for improving the blood-retinal barrier disorder that can be caused by retinal ischemia. Therefore, the agent of the present invention can be a therapeutic agent for diseases caused by blood organ barrier disorders.
Alternatively, even when the blood organ barrier is weakened by ischemia of each organ and it is judged that the thrombolytic agent is not applicable, the conventionally known thrombolytic agent and the agent of the present invention Can be used to treat ischemic diseases without worrying about side effects such as bleeding from the blood organ barrier caused by thrombolytic agents.
The active ingredient of the blood organ barrier disorder-improving agent of the present invention is a peptide consisting of eight amino acids from the 50th to the 57th amino acids of prothymosin α (in this specification, it may be referred to as “ProTα8” or “P8”; SEQ ID NO: 1) modified peptides (SEQ ID NOs: 2 and 3) and the like. This active ingredient is easier to manufacture and process than the conventionally known full-length prothymosin α and peptides derived from prothymosin α, and has an equal or better effect on improving ischemia. Therefore, the peptide is more useful as an active ingredient such as an agent for improving blood organ barrier disorders, a therapeutic agent for diseases associated with blood organ barrier disorders, and a therapeutic agent for ischemic diseases.

図１Ａは，網膜虚血モデルにおいてペプチドを投与した場合のERGにおけるａ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。FIG. 1A is a graph showing the value of retinal potential using a-wave in ERG when a peptide is administered in a retinal ischemia model. 図１Ｂは，網膜虚血モデルにおいてペプチドを投与した場合のERGにおけるｂ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。FIG. 1B is a graph showing retinal potential values using b-waves in ERG when a peptide is administered in a retinal ischemia model. 図２は，ペプチドの網膜虚血障害保護効果を示すための染色された網膜を示す図面に替わる写真である。FIG. 2 is a photograph replacing a drawing showing a stained retina for showing the protective effect of peptide on retinal ischemic injury. 図３は，ＰＩＴモデルにおいてペプチドを静脈内投与した場合のアクセレイテッドロータロッドテスト（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｒｏｔａ ｒｏｄ ｔｅｓｔ）の結果を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the results of an accelerated rotarod test when the peptide is intravenously administered in the PIT model. 図４Ａは，ｔＭＣＡＯモデルにおける評価工程及び臨床スコアの基準を示す。FIG. 4A shows the evaluation process and clinical score criteria in the tMCAO model. 図４Ｂは，ペプチドを静脈内投与した場合のｔＭＣＡＯモデルでの運動障害評価スコアの変遷を示す。FIG. 4B shows the transition of the movement disorder evaluation score in the tMCAO model when the peptide is administered intravenously. 図５Ａは，ｔＭＣＡＯモデルにおける評価工程を示す。FIG. 5A shows an evaluation process in the tMCAO model. 図５Ｂは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にペプチドとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血作用を示す写真である。FIG. 5B is a photograph showing the bleeding action in the cerebral cortex and striatum at the time of combined use of peptide and tPA 4 hours after tMCAO ischemia. 図５Ｃは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にペプチドとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血領域を定量的解析したグラフである。FIG. 5C is a graph obtained by quantitative analysis of bleeding regions in the cerebral cortex and striatum at the time of combined use of peptide and tPA 4 hours after tMCAO ischemia. 図６Ａは，ｔＭＣＡＯモデルにおける評価工程を示す。FIG. 6A shows an evaluation process in the tMCAO model. 図６Ｂは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にペプチドとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における血液脳関門破綻に誘導されるエバンスブルー漏出を示す写真である。FIG. 6B is a photograph showing Evans blue leakage induced by blood-brain barrier breakdown in the cerebral cortex and striatum during the combined use of peptide and tPA 4 hours after tMCAO ischemia. 図６Ｃは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にペプチドとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における血液脳関門破綻に誘導されるエバンスブルー漏出領域を定量的解析したものである。FIG. 6C is a quantitative analysis of the Evans blue leakage area induced by the blood-brain barrier breakdown in the cerebral cortex and striatum during the combined use of peptide and tPA 4 hours after tMCAO ischemia.

以下，本発明を詳細に説明する。
プロサイモシンα（以下，「ＰｒｏＴα」と記載する場合がある）とは，神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能を有し，また「脳虚血性の血液脳関門脆弱化を顕著に抑制し，血液脳関門障害を改善する機能」をも有することが知られている公知のタンパク質である。The present invention will be described in detail below.
Prothymosin α (hereinafter sometimes referred to as “ProTα”) has a function of protecting against neuronal cell death and a function of suppressing neuronal cell death, and “remarkably suppresses blood-brain barrier weakening due to cerebral ischemia” It is a known protein that is also known to have a function of improving the blood-brain barrier disorder.

上記の発明は，基本的には以下の知見に基づく。国際公開２０１１／０１９０２３号パンフレット（特許文献２）に開示されたＰｒｏＴα９と表記されるラットプロサイモシンαの５２番目のアミノ酸から６０番目のアミノ酸からなるポリペプチドにおいてＮ末端及びＣ末端の残基を１〜数個移動させて得られる部分ペプチド（配列番号１，４又は６で示されるペプチド）及びこれらのペプチドの１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなる改変ペプチド又はその塩ペプチド（配列番号２，３，５又は７で示される改変ペプチド）の網膜虚血障害保護作用を検討し，改変ペプチドがより高い作用を示すことを見出した。   The above invention is basically based on the following knowledge. N-terminal and C-terminal residues in a polypeptide consisting of the 52nd amino acid to the 60th amino acid of rat prothymosin α expressed as ProTα9 disclosed in WO 2011/019023 (Patent Document 2) A partial peptide (peptide represented by SEQ ID NO: 1, 4 or 6) obtained by shifting one to several amino acids, and a modified peptide or a salt peptide thereof (SEQ ID NO: 1) consisting of an amino acid sequence in which one amino acid of these peptides is substituted The protective effect of the modified peptide represented by 2, 3, 5 or 7) was examined, and it was found that the modified peptide exhibited a higher effect.

P+2N／−4C : DNEVDEE（配列番号４）
P+2N／−4C改変 : DNEVDQE（配列番号５）
P+2N／−3C : DNEVDEEE（配列番号１）
P+2N／−3C改変 : DNEVDQEE（配列番号２）
P+2N／−3C改変 : *DNEVDQEE*（配列番号３） ＊のアミノ酸を結合して環状化
P+2N／−2C : DNEVDEEEE（配列番号６）
P+2N／−2C改変 : DNEVDQEEE（配列番号７）P + 2N / -4C: DNEVDEE (SEQ ID NO: 4)
P + 2N / -4C modification: DNEVDQE (SEQ ID NO: 5)
P + 2N / -3C: DNEVDEEE (SEQ ID NO: 1)
P + 2N / -3C modification: DNEVDQEE (SEQ ID NO: 2)
P + 2N / -3C modification: * DNEVDQEE * (SEQ ID NO: 3)
P + 2N / -2C: DNEVDEEEE (SEQ ID NO: 6)
P + 2N / -2C modification: DNEVDQEEE (SEQ ID NO: 7)

また，先に説明した環状Ｐ８改変ペプチドが上記ペプチドの中でも最も高い網膜虚血障害保護作用を有することを見出した。   Moreover, it discovered that the cyclic | annular P8 modified peptide demonstrated previously had the highest protective effect of retinal ischemic injury among the said peptides.

Ｐ８改変ペプチド及び環状Ｐ８改変ペプチド（配列番号３で示されるペプチド）は，ｔＰＡによって誘発される脳梗塞時の出血作用抑制作用が認められた。   The P8 modified peptide and the cyclic P8 modified peptide (peptide represented by SEQ ID NO: 3) were found to have an inhibitory effect on bleeding action during cerebral infarction induced by tPA.

Ｐ８改変ペプチド及び環状Ｐ８改変ペプチドは，ｔＰＡによって誘発される脳梗塞時の出血領域の縮小作用が認められた。   The P8 modified peptide and the cyclic P8 modified peptide were confirmed to reduce the bleeding region during cerebral infarction induced by tPA.

Ｐ８改変ペプチド及び環状Ｐ８改変ペプチドは，ｔＰＡ併用時の運動障害改善作用が認められた。   The P8 modified peptide and the cyclic P8 modified peptide were found to have a movement disorder improving effect when tPA was used in combination.

環状Ｐ８改変ペプチドは，ＰＩＴモデルにおける運動障害改善において高活性を示すことを見出した。   Cyclic P8 modified peptides were found to show high activity in improving movement disorders in the PIT model.

本発明のペプチドまたはその塩（単に本発明のペプチドとよぶ場合がある）は，配列番号１で表わされるアミノ酸配列の一部を置換したアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩であり，配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと同様又はそれ以上の活性を有するものである。配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドの活性は，後述する実施例で評価された活性のうちいずれか１つであればよい。また，このように本発明のペプチドまたはその塩は，単離されたペプチドであるか，又は単離及び精製されたペプチドである。   The peptide of the present invention or a salt thereof (sometimes simply referred to as the peptide of the present invention) is a peptide or salt thereof containing an amino acid sequence obtained by substituting a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, It has the same or more activity as the peptide having the amino acid sequence represented by The activity of the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be any one of the activities evaluated in Examples described later. In addition, the peptide of the present invention or a salt thereof is thus an isolated peptide, or an isolated and purified peptide.

本発明のペプチドは，ヒトや哺乳動物（例えば，モルモット，ラット，マウス，ウサギ，ブタ，ヒツジ，ウシ又はサル）の細胞に由来するペプチドであってもよい。また，本発明のペプチドは，プロサイモシンα又はそれに由来するペプチドの部分ペプチドであってもよい。さらに，本発明のペプチドは，合成ペプチドであってもよい。   The peptide of the present invention may be a peptide derived from a human or mammal (eg, guinea pig, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, cow or monkey). The peptide of the present invention may be prothymosin α or a partial peptide derived therefrom. Furthermore, the peptide of the present invention may be a synthetic peptide.

本発明のペプチドの例は，配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である。本発明のペプチドは，たとえば，ペプチド内のアミノ酸同士が結合し，環状構造を有していてもよく，また環状構造を有していることが好ましい。   An example of the peptide of the present invention is a peptide consisting of an amino acid sequence in which one amino acid is substituted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof. The peptide of the present invention may have, for example, a cyclic structure in which amino acids in the peptide are bonded to each other, and preferably has a cyclic structure.

なお，本発明のペプチドには，たとえばアミノ酸残基や，末端が修飾されているものも含まれる。そのような置換の例は，アミノ酸残基又はペプチド末端が，アセチル化又はアミド化されているものである。   The peptides of the present invention include, for example, amino acid residues and those modified at the ends. Examples of such substitutions are those in which the amino acid residue or peptide end is acetylated or amidated.

本発明のペプチドの好ましい例は，配列番号２又は配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である。これらの中でも，本発明のペプチドの好ましい例は配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である。   A preferred example of the peptide of the present invention is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a salt thereof. Among these, a preferred example of the peptide of the present invention is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a salt thereof.

本明細書におけるペプチドは，ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）であり，右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のペプチドは，Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ），カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻），アミド（−ＣＯＮＨ_２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。エステルにおけるＲの例は，Ｃ_１−６アルキル基，Ｃ_３−８シクロアルキル基，Ｃ_６−１２アリール基，Ｃ_７−１４アラルキル基，及びピバロイルオキシメチル基である。Ｃ_１−６アルキル基の例は，メチル基，エチル基，ｎ−プロピル基，イソプロピル基，ｎ−ブチル基，ｓ−ブチル基及びｔ−ブチル基である。Ｃ_３−８シクロアルキル基の例は，シクロペンチル基及びシクロヘキシル基である。Ｃ_６−１２アリール基の例は，フェニル基及びα−ナフチル基である。のＣ_７−１４アラルキル基の例は,ベンジル基及びフェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基；及びα−ナフチルメチル基などのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基である。The peptide in the present specification has the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide designation. In the peptide of the present invention, the C-terminus may be any of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO ⁻ ), an amide (—CONH ₂ ), or an ester (—COOR). Examples of R in the ester are a C _1-6 alkyl group, a C _3-8 cycloalkyl group, a C _6-12 aryl group, a C _7-14 aralkyl group, and a pivaloyloxymethyl group. Examples of C _1-6 alkyl groups are methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, s-butyl and t-butyl. Examples of C _3-8 cycloalkyl groups are a cyclopentyl group and a cyclohexyl group. Examples of C _6-12 aryl groups are phenyl and α-naphthyl groups. Examples of C _7-14 aralkyl groups are phenyl-C _1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl; and α-naphthyl-C _1-2 alkyl groups such as α-naphthylmethyl group.

本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合，カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。この場合のエステルの例は，上記したＣ末端のエステルである。   When the peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, the peptide of the present invention includes those in which the carboxyl group is amidated or esterified. An example of the ester in this case is the above-mentioned C-terminal ester.

本発明のペプチドには，上記したペプチドにおいて，Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの，Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの，分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの，あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド・糖タンパク質などの複合ペプチド・複合タンパク質なども含まれる。Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基の保護基の例は，Ｃ_１−６アシル基であり，Ｃ_１−６アシル基の例は，ホルミル基，アセチル基などのＣ_２−６アルカノイル基である。分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基の例は，−ＯＨ，−ＳＨ，アミノ基，イミダゾール基，インドール基，及びグアニジノ基である。分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基の保護基の例は，Ｃ_１−６アシル基であり，Ｃ_１−６アシル基の例は，ホルミル基，アセチル基などのＣ_２−６アルカノイル基である。In the peptide of the present invention, in the above peptide, the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group, the N-terminal side is cleaved in vivo and the glutamyl group produced by pyroglutamine oxidation, Also included are those in which substituents on the side chains of amino acids in the molecule are protected with appropriate protecting groups, or so-called glycopeptides / glycoproteins such as glycopeptides / glycoproteins to which sugar chains are bound. Examples of protecting groups for the amino group of the N-terminal methionine residue is a C _1-6 acyl group, examples of C _1-6 acyl group is a formyl group, C _2-6 alkanoyl group such as acetyl group . Examples of substituents on the side chains of amino acids in the molecule are —OH, —SH, amino groups, imidazole groups, indole groups, and guanidino groups. Examples of protecting groups for the substituent on the side chain of an amino acid in the molecule is a C _1-6 acyl group, examples of C _1-6 acyl groups are formyl, C _2-6 alkanoyl group such as acetyl group It is.

本発明のペプチドの塩は，生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩の例は，無機酸（例えば，塩酸，リン酸，臭化水素酸，及び硫酸）との塩及び有機酸（例えば，酢酸，ギ酸，プロピオン酸，フマル酸，マレイン酸，コハク酸，酒石酸，クエン酸，リンゴ酸，蓚酸，安息香酸，メタンスルホン酸，及びベンゼンスルホン酸）との塩である。   The salt of the peptide of the present invention is preferably a physiologically acceptable acid addition salt. Examples of such salts are salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid and sulfuric acid) and organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). , Tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid).

本発明のペプチドの塩は，実質的に本発明のペプチドと同様の作用を有する。このため，本明細書の実施例においてもペプチドの塩が用いられている場合や，ペプチドの塩が含まれている場合が存在する。そのような場合であっても，簡便のためペプチドのみを用いたように表記する。   The salt of the peptide of the present invention has substantially the same action as the peptide of the present invention. For this reason, even in the examples of the present specification, there are cases where a salt of a peptide is used or a case where a peptide salt is included. Even in such a case, it is described as using only a peptide for convenience.

本発明のペプチドは，特許文献１又は２に開示されたプロサイモシンα又はプロサイモシンα由来のポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断すること，又は公知の合成方法によって製造することができる。また，ペプチドの環状化は，例えば高度希釈法など従来公知の方法により分子内でカルボキシ基とアミノ基を縮合させる方法等により行うことができる（特表２０１０−５１４７２８号公報，特表２００２−５３３２９９号公報，再表２００８／１１７８３３号公報参照）。   The peptide of the present invention can be produced by cleaving prothymosin α or a polypeptide derived from prothymosin α disclosed in Patent Document 1 or 2 with an appropriate peptidase, or by a known synthesis method. In addition, the peptide can be cyclized by a method of condensing a carboxy group and an amino group in the molecule by a conventionally known method such as a high dilution method (Japanese Patent Publication No. 2010-514728, Japanese Patent Publication No. 2002-533299). No., re-table 2008/117833).

本発明のペプチドが関与する各種疾病の治療剤
本発明の血液脳関門障害改善剤は，本発明のペプチドを有効成分として含有する。このため本発明の血液脳関門障害改善剤は，脳虚血により生じる血液脳関門の脆弱性を保護し，血液脳関門障害を改善することができる。従って本発明の血液脳関門障害改善剤は，それが有する神経保護作用によって血液脳関門を保護すると共に，脳血管障害により脆弱化した血液脳関門をも改善することができるので，脳虚血性の疾患全般，特に血液脳関門障害を伴う疾患の予防または治療に有用である。 Therapeutic Agent for Various Diseases Involving the Peptide of the Present Invention The blood-brain barrier disorder improving agent of the present invention contains the peptide of the present invention as an active ingredient. Therefore, the blood brain barrier disorder-improving agent of the present invention can protect the blood brain barrier vulnerability caused by cerebral ischemia, and can improve the blood brain barrier disorder. Therefore, the agent for improving blood-brain barrier disorder according to the present invention protects the blood-brain barrier by its neuroprotective action and can also improve the blood-brain barrier weakened by cerebrovascular disorder. It is useful for the prevention or treatment of all diseases, particularly those with blood-brain barrier disorders.

本発明における「血液脳関門障害を伴う疾患」とは，血液脳関門に異常を生ずることが知られている疾患全般（例えば血液脳関門のタイトジャンクション構造が物理的に脆弱になる疾患，血液脳関門における物質輸送が異常を来す疾患など）や，血液脳関門に異常を生ずることに起因する疾患などが挙げられる。このような疾患は，多くが脳虚血を伴う疾患であり，具体的には，アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害，一過性血流障害，高血圧性脳障害，頭蓋内外の動脈の塞栓症，血栓症に起因する梗塞，動脈瘤，動静脈奇形，脳動脈狭窄性病変，硬膜動静脈瘻，血管外傷，血管性腫瘍，ウィルス感染性脳炎，あるいは脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫または出血疾患などのほか，脳卒中，外傷性脳障害，緑内障，糖尿病性網膜症又は網膜剥離治療時の圧迫性障害などが挙げられる。なお，ここでいう「治療」には，疾患を完治させる場合のみならず，病状を軽減させる場合や病状の悪化を阻止する場合なども含まれる。   The term “disease associated with blood-brain barrier disorder” in the present invention refers to all diseases known to cause abnormalities in the blood-brain barrier (for example, diseases in which the tight junction structure of the blood-brain barrier becomes physically weak, blood-brain Diseases that cause abnormalities in the transport of substances at the barrier), and diseases caused by abnormalities in the blood-brain barrier. Most of these diseases involve cerebral ischemia. Specifically, secondary vascular disorders due to atherosclerosis or hypertension, transient blood flow disorders, hypertensive brain disorders, intracranial and external Arterial embolism, infarction due to thrombosis, aneurysm, arteriovenous malformation, stenosis of cerebral artery, dural arteriovenous fistula, vascular trauma, vascular tumor, viral infectious encephalitis, or vulnerability after cerebral infarction In addition to edema or hemorrhagic disease due to idiopathic neovascularization, stroke, traumatic encephalopathy, glaucoma, diabetic retinopathy, or compression disorder during retinal detachment treatment. The term “treatment” here includes not only the case where the disease is completely cured, but also the case where the disease state is reduced or the deterioration of the disease state is prevented.

本発明の「血液脳関門障害改善剤」および「血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤」は，本発明のペプチドを，公知の方法に従い薬学的に許容される担体あるいは希釈剤と混合することにより製剤化される。適切な薬学的に許容される担体あるいは希釈剤としては特に限定されず公知の担体又は希釈剤を適用することが可能であるが，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等に記載されたものが挙げられる。   The “blood-brain barrier ameliorating agent” and “therapeutic agent for diseases associated with blood-brain barrier disorders” of the present invention comprise mixing the peptide of the present invention with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent according to a known method. Is formulated. Suitable pharmaceutically acceptable carriers or diluents are not particularly limited, and known carriers or diluents can be applied, and examples include those described in Remington's Pharmaceutical Sciences and the like.

本明細書中「血液臓器関門」とは，血管内の血液と臓器の組織液との間の物質交換を制御する機構のことをいう。血液臓器関門による物質交換の制御機構は，アミノ酸やグルコースをはじめとする神経活動のエネルギー源となる必須内因性物質を臓器内に取り込むメカニズムと，臓器内の毒物や不要な異物などを血中に排出するメカニズムに支えられている。これらのメカニズムは，各臓器の毛細血管内皮細胞に発現している多くのトランスポーター輸送系によってコントロールされ得る。
代表的な血液臓器関門である血液脳関門を解剖学的に見ると，血液脳関門を構成する脳毛細血管内皮細胞がタイトジャンクションを形成し，細胞間隙への物質透過性を制限していることが理解できる。つまり血液脳関門の存在により，脳組織をはじめとする中枢神経系へ血管内の成分が流れ込まなくなるため，中枢神経系の生化学的恒常性が高度に維持されている。血液脳関門に異常を生じた場合，脳血管内と脳内の選択的な物質透過性に異常が生じ，これらの異常が結果的に中枢神経系に影響を及ぼすこととなる。In the present specification, the “blood organ barrier” refers to a mechanism for controlling material exchange between blood in a blood vessel and tissue fluid of the organ. The control mechanism of substance exchange by the blood organ barrier includes the mechanism of taking essential endogenous substances such as amino acids and glucose into the organ, which are energy sources of nerve activity, and toxic and unnecessary foreign substances in the organ. Supported by a discharging mechanism. These mechanisms can be controlled by many transporter transport systems expressed in the capillary endothelial cells of each organ.
The anatomical view of the blood-brain barrier, which is a representative blood organ barrier, shows that the brain capillary endothelial cells that make up the blood-brain barrier form tight junctions that limit substance permeability to the cell gap. Can understand. In other words, the presence of the blood-brain barrier prevents components in the blood vessels from flowing into the central nervous system, including brain tissue, so that the biochemical homeostasis of the central nervous system is highly maintained. When abnormalities occur in the blood-brain barrier, abnormalities occur in selective substance permeability in the cerebral blood vessels and in the brain, and these abnormalities eventually affect the central nervous system.

血液臓器関門として具体的には，血液脳関門，血液網膜関門，血液脳脊髄液関門，血液胆汁関門，血液胸腺関門，血液精巣関門などが挙げられる。好ましくは，血液脳関門，血液網膜関門などの脳神経系の臓器における血液臓器関門である。   Specific examples of blood organ barriers include the blood brain barrier, blood retinal barrier, blood cerebrospinal fluid barrier, blood bile barrier, blood thymus barrier, and blood testis barrier. Preferably, it is a blood organ barrier in a cranial nervous system organ such as a blood brain barrier and a blood retina barrier.

血管梗塞時には，梗塞部位だけでなく血液臓器関門にも虚血症状が生じる。虚血症状が生じた部分の血管は急激に弱くなるので，血流が再開された場合，血液臓器関門から出血する可能性が高い。特に脳梗塞などの脳虚血の場合は，血液脳関門の血管壁が急激に弱くなり，血流再開に伴い出血するリスクが非常に高い。
したがって血管梗塞治療に適用するか否か検討されるべきｔＰＡなどの血栓溶解剤は，例えば脳梗塞の場合，梗塞後４．５時間（好ましくは３時間）以内にその病態が確認できた場合でしか使用できないために，ほとんどが適用外となってしまう。
それに対しＰｒｏＴαは，脳梗塞のような血栓の排除に急を要する一方で必ず出血を避けなければならないような疾患に対する治療に用いることができる。すなわち，梗塞部位周囲の神経細胞死を抑制して臓器の恒常性を維持し，梗塞部位の障害を改善することが可能であるだけでなく，後述するように，ｔＰＡなどの血栓溶解剤を併用することができるよう，血液脳関門などの血液臓器関門の脆弱性を改善する目的でも用いることが可能なものである。During vascular infarction, ischemic symptoms occur not only at the infarct site but also at the blood organ barrier. The blood vessels in the area where the ischemic symptoms occur suddenly weaken, so if blood flow is resumed, there is a high possibility of bleeding from the blood organ barrier. In particular, in the case of cerebral ischemia such as cerebral infarction, the blood vessel wall of the blood-brain barrier weakens rapidly, and the risk of bleeding due to resumption of blood flow is very high.
Therefore, thrombolytic agents such as tPA to be examined for application to vascular infarction are, for example, in the case of cerebral infarction, when the pathological condition can be confirmed within 4.5 hours (preferably 3 hours) after infarction. Most of them are not applicable because they can only be used.
On the other hand, ProTα can be used for the treatment of diseases such as cerebral infarction that require urgent elimination of blood clots but must avoid bleeding. That is, not only is it possible to suppress neuronal cell death around the infarcted region to maintain organ homeostasis and improve the infarcted site, but also use a thrombolytic agent such as tPA in combination as described later. It can also be used to improve the vulnerability of blood organ barriers such as the blood brain barrier.

本発明における「血液臓器関門障害」とは，血液臓器関門に何らかの異常を生ずることをいう。このような異常としては，血液臓器関門における物質の選択的透過性の異常，毛細血管内皮細胞のタイトジャンクションの崩壊（細胞間隙の広がり），毛細血管内皮細胞の減少が挙げられ，さらに血液臓器関門の機能低下に起因する障害，例えば浮腫や黄疸などが挙げられる。   “Blood organ barrier disorder” in the present invention means that some abnormality occurs in the blood organ barrier. Such abnormalities include abnormal permeation of substances at the blood organ barrier, collapse of tight junctions of capillary endothelial cells (expansion of cell gaps), reduction of capillary endothelial cells, and blood organ barriers. Disorders caused by reduced function, such as edema and jaundice.

本発明における「血液臓器関門障害」として具体的には，上記した血液臓器関門障害で一般的に生じる症状だけでなく，例えば血液脳関門障害に伴って生ずる，脳毛細血管内皮細胞の減少およびそれに伴う発熱，脳浮腫などの脳炎症状，記憶・学習，食欲，睡眠障害や情動性疼痛などのありとあらゆる高次脳機能障害，血圧，呼吸，消化器症状を伴う自律神経疾患，頭蓋内圧亢進症状に伴う頭痛，嘔吐，脳ヘルニアなども含まれる。また臓器が網膜の場合は，例えば中心性漿液性網脈絡膜症が挙げられる。
本発明の血液臓器関門障害改善剤は，このような血液臓器関門障害を改善し，血液臓器関門を保護するものである。Specifically, the “blood organ barrier disorder” in the present invention includes not only the symptoms generally caused by the blood organ barrier disorder described above, but also the reduction of brain capillary endothelial cells caused by the blood brain barrier disorder and the like. Accompanying fever, cerebral inflammatory symptoms such as cerebral edema, memory / learning, appetite, all sorts of higher brain dysfunction such as sleep disorders and emotional pain, autonomic neuropathy with blood pressure, breathing, digestive symptoms, and increased intracranial pressure This includes headache, vomiting, and brain hernia. Moreover, when the organ is the retina, for example, central serous chorioretinopathy can be mentioned.
The agent for improving a blood organ barrier disorder of the present invention improves such a blood organ barrier disorder and protects the blood organ barrier.

血液臓器関門の異常は，血液臓器関門周辺の毛細血管の数量や長さを確認することで発見することが可能である。
例えば血液脳関門の異常を確認する場合，大脳皮質知覚領域における毛細血管の数量や長さを通常の状態と比較する。すなわち大脳皮質知覚領域における毛細血管が少なければ，脳梗塞に伴い血液脳関門の異常が発生していると判断することができるし，大脳皮質知覚領域における毛細血管が適量であれば，血液脳関門の異常は無いものと判断することができる。毛細血管の長さや量は自体公知の方法によって判別することができるが，そのような方法としては，「生体の科学；５５（３）巻，２６６−２７２頁（森川俊一，江崎太一著），２００４年」に記載のレクチン（例，トマトレクチン）による血管内皮細胞の染色が挙げられる。Abnormalities in the blood organ barrier can be detected by checking the quantity and length of capillaries around the blood organ barrier.
For example, when confirming abnormalities in the blood-brain barrier, the number and length of capillaries in the cerebral cortex sensory area are compared with normal conditions. In other words, if there are few capillaries in the cerebral cortex perception area, it can be judged that an abnormality of the blood brain barrier has occurred due to cerebral infarction, and if there are adequate capillaries in the cerebral cortex perception area, the blood brain barrier It can be determined that there is no abnormality. The length and amount of capillaries can be discriminated by a method known per se. Examples of such methods include “Science of Living Body; 55 (3), 266-272 (Shunichi Morikawa, Taichi Ezaki), And staining of vascular endothelial cells with a lectin described in “2004” (eg, tomato lectin).

例えば，配列番号２で表されるアミノ酸配列（ＤＮＥＶＤＱＥＥ）からなるペプチド及びこのペプチドのアミノ酸配列中の２個のアミノ酸が結合してなるペプチド（配列番号３）は，本発明の血液臓器関門障害改善剤，血液臓器関門障害を伴う疾患又は虚血性疾患の治療剤，神経細胞死抑制剤などの有効成分として利用することができる。配列番号３のペプチドは，１番目のＤと８番目のＥとの間に結合が形成されたものである。なお，配列番号５の１番目のＤと７番目のＥとの間に結合が形成されたものも本発明の好ましいペプチドである。   For example, the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (DNEVDQEE) and the peptide formed by binding two amino acids in the amino acid sequence of this peptide (SEQ ID NO: 3) improve the blood organ barrier disorder of the present invention. It can be used as an active ingredient such as an agent, a therapeutic agent for a disorder involving blood organ barrier or ischemic disease, and a neuronal cell death inhibitor. In the peptide of SEQ ID NO: 3, a bond is formed between the first D and the eighth E. A peptide in which a bond is formed between the first D and the seventh E of SEQ ID NO: 5 is also a preferred peptide of the present invention.

配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは，ラットプロサイモシンαの５０番目から５７番目の８アミノ酸からなるペプチド（ＰｒｏＴα８と呼ぶ）である。当該ペプチドは，ラット由来のプロサイモシンαだけでなく，ヒト由来のプロサイモシンαにおける対応するペプチド，マウス由来のプロサイモシンαにおける対応するペプチドなど，いずれの動物種のものも同じ配列である。   The peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a peptide consisting of the 50th to 57th 8 amino acids of rat prothymosin α (referred to as ProTα8). The peptide has the same sequence as that of any animal species, including not only rat-derived prothymosin α but also a corresponding peptide in human-derived prothymosin α and a corresponding peptide in mouse-derived prothymosin α.

配列番号２及び３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは，プロサイモシンαが有する機能，例えば血液臓器関門障害を保護，改善する機能（例，ＧＬＵＴ４の細胞膜表在化促進作用など），神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例，神経細胞のネクローシス抑制機能，神経細胞のアポトーシス促進機能，神経細胞の間接的アポトーシス抑制機能など）などを有するペプチドである。そして当該ペプチドは，創薬シーズへの適応をより容易にする目的で，その機能を維持しつつ，従来公知のプロサイモシンα由来のペプチドよりもさらに短小化されたペプチドである。   The peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 2 and 3 is a function of prothymosin α, for example, a function to protect and improve blood organ barrier disorder (eg, GLUT4 promotes cell membrane superficialization), neuronal cell death Is a peptide having a function of protecting cells, a function of suppressing death of nerve cells (eg, a function of suppressing necrosis of neurons, a function of promoting apoptosis of neurons, a function of suppressing indirect apoptosis of neurons), and the like. The peptide is a peptide that is further shortened than a conventionally known peptide derived from prothymosin α while maintaining its function for the purpose of facilitating adaptation to drug seeds.

先に説明したとおり，本発明では，配列番号１で表されるアミノ酸配列から１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩であって，配列番号２または３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと「実質的に同等の機能を有するペプチド」を使用することもできる。ここで「実質的に同等の機能を有するペプチド」とは，上記「配列番号２又は３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」と同様の機能（ここでいう「同等の機能」とは，機能が質的に同等であることをいい，その活性／作用の強弱について述べているわけではない），例えば血液臓器関門障害を保護，改善する機能（例，ＧＬＵＴ４の細胞膜表在化促進作用など），神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例，神経細胞のネクローシス抑制機能，神経細胞のアポトーシス促進機能，神経細胞の間接的アポトーシス抑制機能など）などを有し，かつ「配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」のアミノ酸配列における１個のアミノ酸が置換されたペプチドが挙げられる。どのようなアミノ酸を置換させることができるかについては，当業者であれば所望の機能や後述するペプチド修飾との兼ね合いにより適宜決定することが可能である。   As described above, in the present invention, a peptide consisting of an amino acid sequence in which one amino acid is substituted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, and the amino acid represented by SEQ ID NO: 2 or 3 A “peptide having substantially the same function” as a peptide consisting of a sequence can also be used. Here, “a peptide having substantially the same function” means the same function as the above “peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3” (here, “an equivalent function” means a function) Are not qualitatively equivalent, and do not describe the strength or weakness of their activity / action), for example, the function of protecting and improving blood organ barrier disorders (eg, the promotion of GLUT4 cell membrane superficialization) , Having a function of protecting against neuronal cell death and a function of inhibiting neuronal cell death (eg, a function of inhibiting necrosis of neuronal cells, a function of promoting apoptosis of neurons, an indirect function of inhibiting apoptosis of neurons, etc.) And a peptide in which one amino acid in the amino acid sequence of the “peptide consisting of the amino acid sequence represented by 1” is substituted. A person skilled in the art can appropriately determine what amino acid can be substituted depending on the desired function and the peptide modification described later.

ただし，本発明者は，ラットプロサイモシンαの５０番目〜５６番目のアミノ酸からなる７アミノ酸のペプチド及び５１番目〜５７番目のアミノ酸からなる７アミノ酸のペプチドも，配列番号２又は３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと同等の活性を有するが，５１番目〜５５番目のアミノ酸からなる５アミノ酸のペプチド及び４９番目〜５６番目のアミノ酸からなる８アミノ酸のペプチドでは，活性が低下することを見出している（データ示さず）。   However, the present inventor also expressed a 7-amino acid peptide consisting of the 50th to 56th amino acids and a 7-amino acid peptide consisting of the 51st to 57th amino acids of rat prothymosin α by SEQ ID NO: 2 or 3. It has the same activity as that of the peptide consisting of the amino acid sequence, but the activity is decreased in the 5-amino acid peptide consisting of the 51st to 55th amino acids and the 8-amino acid peptide consisting of the 49th to 56th amino acids. (Data not shown).

これらのペプチドは，天然由来のペプチドでなくてもよく，自体公知のペプチド合成法によって製造することが可能である。またアミノ酸の欠失，付加，置換若しくは転位についても，自体公知の方法により行うことが可能である。   These peptides do not have to be naturally derived peptides, and can be produced by a peptide synthesis method known per se. Amino acid deletion, addition, substitution or rearrangement can also be carried out by a method known per se.

本発明のペプチドは，プロサイモシンαが有する機能，例えば血液臓器関門障害を保護，改善する機能（例，ＧＬＵＴ４の細胞膜表在化促進作用など），神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例，ネクローシス抑制機能，アポトーシス促進機能，間接的アポトーシス抑制機能など）などを有する限りにおいて，ペプチド修飾されていてもよい。   The peptide of the present invention has a function of prothymosin α, for example, a function to protect and improve a blood organ barrier disorder (eg, promoting action of GLUT4 on cell membrane superficialization), a function to protect against nerve cell death, and a function to suppress nerve cell death As long as it has a function (eg, necrosis inhibitory function, apoptosis promoting function, indirect apoptosis inhibitory function, etc.), the peptide may be modified.

ペプチドの修飾としては，蛍光標識（例，ＦＩＴＣ化，Ｄｎｓ化，Ｎｍａ化など），その他の標識（例，ビオチン標識など），脂肪酸による修飾（例，ＤＨＡ修飾など），リン酸化，スルホン化，水酸化，メチル化，アセチル化，プレニル化，パルミトイル化，カルボキシル化，アミノ基の修飾（例，アセチル化，ホルミル化，ピログルタミン酸化，アミド化，スクシニル化，ビオチニル化，Ｚ化，Ｄｎｐ化，Ｄｎｓ化，ミリストイル化など），チオール基の修飾（例，ファルネシル化，ゲラニル化など），糖による修飾（例，Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）含有ペプチドなど），グリコシルホスファチジルイノシトール付加，ユビキチン化，ペプチド結合の修飾（例，還元型，スタチン型など）などが挙げられる。所望の機能を調整すべく，当業者であればこのましい修飾態様を適宜選択することが可能である。   Peptide modifications include fluorescent labels (eg, FITC, Dns, Nma), other labels (eg, biotin), fatty acid modifications (eg, DHA), phosphorylation, sulfonation, Hydroxylation, methylation, acetylation, prenylation, palmitoylation, carboxylation, amino group modification (eg, acetylation, formylation, pyroglutamine oxidation, amidation, succinylation, biotinylation, Zation, Dnpation, Dns, myristoylation, etc.), thiol group modification (eg, farnesylation, geranylation, etc.), sugar modification (eg, Asn (GlcNAc) -containing peptide), glycosylphosphatidylinositol addition, ubiquitination, peptide bond modification (Eg, reduced type, statin type, etc.). In order to adjust a desired function, those skilled in the art can appropriately select this modification mode.

本発明のペプチドが修飾される場合，ペプチドにおける修飾位置は特に限定されないが，ペプチド末端で修飾されることが好ましい。
ペプチド末端の修飾方法としては，上述した本発明のペプチドが有する機能を阻害しないものであれば特に限定されないが，当該機能を向上させる，あるいは本発明のペプチドの体内での分解を抑制するといった観点から，アセチル化またはアミド化であることが望ましい。本発明のペプチドをペプチド末端でアセチル化またはアミド化することによって，本発明のペプチドの機能を向上させ，あるいは体内での分解を抑制することができる。
ペプチド末端におけるアセチル化またはアミド化は，当業者であれば適切な手法を適宜選択して行うことが可能である。例えば，本発明のペプチドは，Ｎ末端がアセチル化され，かつ／又はＣ末端がアミド化されたペプチドである。When the peptide of the present invention is modified, the modification position in the peptide is not particularly limited, but is preferably modified at the end of the peptide.
The method for modifying the terminal of the peptide is not particularly limited as long as it does not inhibit the function of the peptide of the present invention described above, but the viewpoint of improving the function or suppressing degradation of the peptide of the present invention in the body. Therefore, acetylation or amidation is desirable. By acetylating or amidating the peptide of the present invention at the terminal of the peptide, the function of the peptide of the present invention can be improved, or degradation in the body can be suppressed.
A person skilled in the art can perform acetylation or amidation at the terminal of the peptide by appropriately selecting an appropriate method. For example, the peptide of the present invention is a peptide in which the N-terminus is acetylated and / or the C-terminus is amidated.

本発明の「血液脳関門障害改善剤」は，本発明のペプチドを有効成分として含有してなるので，梗塞部位周囲の神経細胞死を抑制して臓器の恒常性を維持し，梗塞部位の障害を改善するだけでなく，さらに虚血により生じる血液臓器関門の脆弱化を改善し，血液臓器関門を保護することができる。
すなわち本発明の血液臓器関門障害改善剤は，本発明のペプチドが有する細胞保護作用によって，血液臓器関門周囲の神経組織を保護すると共に，血管障害により脆弱化した血液臓器関門をも改善し，血液臓器関門を保護することができる。したがって虚血性の疾患全般，血液臓器関門障害を伴う疾患，特に脳神経系組織における虚血性疾患，脳神経系臓器における血液臓器関門障害を伴う疾患の予防または治療に有用である。Since the “blood-brain barrier ameliorating agent” of the present invention contains the peptide of the present invention as an active ingredient, it suppresses neuronal cell death around the infarcted region, maintains organ homeostasis, and As well as improving the weakness of the blood organ barrier caused by ischemia, the blood organ barrier can be protected.
That is, the blood organ barrier disorder-improving agent of the present invention protects the nerve tissue around the blood organ barrier by the cytoprotective action of the peptide of the present invention, and also improves the blood organ barrier weakened by vascular disorder. It can protect the organ barrier. Therefore, it is useful for the prevention or treatment of ischemic diseases in general, diseases associated with blood organ barrier disorders, particularly ischemic diseases in cranial nervous system tissues, and diseases associated with blood organ barrier disorders in cranial nervous system organs.

本発明における「血液臓器関門障害を伴う疾患」とは，血液臓器関門に異常を生ずることが知られている疾患全般や，血液臓器関門に異常を生ずることに起因する疾患などが挙げられる。このような疾患としては，血液臓器関門のタイトジャンクション構造が物理的に脆弱になることに起因する疾患や，血液臓器関門における物質輸送が異常を来すことに起因する疾患などが挙げられる。
臓器としては，脳神経系の臓器であることが好ましい。本発明の「血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤」に含まれる「本発明のペプチド」は，特に脳神経系の血液臓器関門の障害に対し有効に機能するので，当該剤は，脳神経系の血液臓器関門障害を伴う疾患の治療に有用である。Examples of the “diseases associated with blood organ barrier disorders” in the present invention include all diseases known to cause abnormalities in the blood organ barrier and diseases caused by abnormalities in the blood organ barrier. Examples of such diseases include diseases caused by physical weakness of the tight junction structure of the blood organ barrier and diseases caused by abnormal substance transport at the blood organ barrier.
The organ is preferably a cranial nervous system organ. The “peptide of the present invention” included in the “therapeutic agent for diseases associated with blood organ barrier disorders” of the present invention functions effectively particularly for disorders of the blood organ barrier of the cranial nervous system. It is useful for the treatment of diseases associated with blood organ barrier disorders.

血液臓器関門障害が，血液脳関門障害である場合，血液脳関門障害を伴う疾患の多くは脳虚血を伴う疾患であって，このような疾患として具体的には，アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害，一過性血流障害，高血圧性脳障害，頭蓋内外の動脈の塞栓症，血栓症に起因する梗塞，動脈瘤，動静脈奇形，脳動脈狭窄性病変，硬膜動静脈瘻，血管外傷，血管性腫瘍，ウィルス感染性脳炎，あるいは脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫，黄疸または出血性疾患などのほか，脳卒中，外傷性脳障害などが挙げられる。
また血液臓器関門障害が，血液網膜関門障害である場合，血液網膜関門障害を伴う疾患として具体的には，緑内障，糖尿病性網膜症又は網膜剥離治療時の圧迫性障害などが挙げられる。
なおここでいう疾患の「治療」には，疾患を完治させる場合のみならず，病状を軽減させる場合や病状の悪化を阻止する場合なども含まれる。When the blood organ barrier disorder is a blood brain barrier disorder, many of the diseases associated with the blood brain barrier disorder are those associated with cerebral ischemia, such as atherosclerosis or hypertension. Secondary vascular disorder, transient blood flow disorder, hypertensive cerebral disorder, intracranial and arterial embolism, infarction due to thrombosis, aneurysm, arteriovenous malformation, cerebral artery stenotic lesion, dura mater Arteriovenous fistulas, vascular trauma, vascular tumors, viral infectious encephalitis, edema due to fragile angiogenesis after cerebral infarction, jaundice or hemorrhagic disease, stroke, traumatic encephalopathy, etc.
In addition, when the blood organ barrier disorder is a blood-retinal barrier disorder, specific examples of the disease associated with the blood-retinal barrier disorder include glaucoma, diabetic retinopathy, or pressure disorder during retinal detachment treatment.
The “treatment” of the disease mentioned here includes not only the case where the disease is completely cured, but also the case where the disease state is reduced or the deterioration of the disease state is prevented.

本発明における「虚血性疾患」とは，虚血によって生じる様々な疾患のことをいう。虚血は血栓による動脈の梗塞や，動脈自体の狭窄など様々な原因によって生ずる。
虚血性疾患としては，脳神経系組織の虚血により生じる虚血性疾患（脳卒中，脳梗塞，脳血栓，一過性脳虚血発作など），心臓組織の虚血により生じる虚血性疾患（虚血性心疾患；例えば心筋梗塞，狭心症など），腸組織の虚血により生じる虚血性腸疾患（虚血性腸疾患；例えば急性腸間膜動脈閉塞症，虚血性大腸炎，腹部アンギナなど）が挙げられるが，好ましくは，脳神経系組織の虚血により生じる虚血性疾患である。The “ischemic disease” in the present invention refers to various diseases caused by ischemia. Ischemia is caused by various causes such as infarction of an artery due to a thrombus and stenosis of the artery itself.
Ischemic diseases include ischemic diseases caused by ischemia of cranial nervous system tissues (stroke, cerebral infarction, cerebral thrombus, transient ischemic attack, etc.), ischemic diseases caused by ischemia of heart tissue (ischemic heart disease) ; For example, myocardial infarction, angina pectoris), ischemic bowel disease caused by ischemia of intestinal tissue (ischemic bowel disease; for example, acute mesenteric artery occlusion, ischemic colitis, abdominal angina, etc.) Preferably, it is an ischemic disease caused by ischemia of the cranial nervous system tissue.

一方，本発明の「虚血性疾患の治療剤」は，血栓溶解剤と併用することで，血栓溶解剤の適用範囲を広げることができる。特に本発明の「虚血性疾患の治療剤」を血栓溶解剤と併用することで，血管梗塞に起因する虚血性疾患をより効果的に治療することが可能である。   On the other hand, the “therapeutic agent for ischemic disease” of the present invention can be used in combination with a thrombolytic agent to expand the application range of the thrombolytic agent. In particular, by using the “therapeutic agent for ischemic disease” of the present invention in combination with a thrombolytic agent, it is possible to more effectively treat the ischemic disease caused by vascular infarction.

一般に血栓溶解剤は，血管梗塞急性期であって，従来の血管構造が保たれている期間内（例えば脳梗塞の場合は，発症後４．５時間以内）の患者にしか使用することができず，そのため，ＣＴやＭＲＩなどで出血がない事を確認した上で用いることが求められている。これは，血液臓器関門が虚血により脆弱化するので，発症初期の血液臓器関門の構造が比較的維持されている状態でないと血栓溶解剤の効果により出血などの副作用が生じる危険性が高まるためである。したがって特に脳梗塞を始めとする脳血管障害の場合は，頭蓋内から出血がない，あるいは出血する危険性が無い状態で使用することが望まれるため，多くの脳血管障害に直面した医師は，出血の危険性を恐れて，本来使用したい血栓溶解剤を使用しない場合が多い。
しかしながら，本発明の「虚血性疾患の治療剤」に含まれる本発明のペプチドは，梗塞部位周囲の神経細胞死を抑制して臓器の恒常性を維持し，梗塞部位の障害を改善するだけでなく，さらに虚血により生じる血液臓器関門の脆弱化を改善し，血液臓器関門を保護することができる。本発明のペプチドは出血を引き起こさないので，虚血性疾患等の治療において，出血の有無を確認することなく早期に投与することが可能である。したがって，本発明のペプチド，あるいは本発明の「虚血性疾患の治療剤」を用いることにより，血液臓器関門の構造が維持され，血栓溶解剤の副作用として考えられる脆弱血管から出血するリスクが極めて低くなる。In general, thrombolytic agents can only be used in patients with acute vascular infarction and within the period when conventional vasculature is maintained (for example, within 4.5 hours after onset in the case of cerebral infarction). Therefore, it is required to use after confirming that there is no bleeding by CT or MRI. This is because the blood organ barrier is weakened by ischemia, and the risk of side effects such as bleeding increases due to the effect of the thrombolytic agent unless the structure of the blood organ barrier is maintained relatively early. It is. Therefore, especially in the case of cerebral vascular disorders such as cerebral infarction, it is desirable to use in a state where there is no bleeding or no risk of bleeding from the cranium. Because of the risk of bleeding, thrombolytic agents that are intended to be used are often not used.
However, the peptide of the present invention contained in the “therapeutic agent for ischemic disease” of the present invention only suppresses neuronal cell death around the infarcted region, maintains organ homeostasis, and improves the infarcted site disorder. Furthermore, the weakening of the blood organ barrier caused by ischemia can be improved and the blood organ barrier can be protected. Since the peptide of the present invention does not cause bleeding, it can be administered early in the treatment of ischemic diseases and the like without confirming the presence or absence of bleeding. Therefore, by using the peptide of the present invention or the “therapeutic agent for ischemic disease” of the present invention, the structure of the blood organ barrier is maintained, and the risk of bleeding from vulnerable blood vessels considered as a side effect of the thrombolytic agent is extremely low. Become.

したがって，血栓溶解剤の使用に際し本発明の「虚血性疾患の治療剤」を併用することにより，血管梗塞の発症時期に左右されること無く血栓溶解剤を用いることができる。これにより効果的に種々の虚血性疾患を治療できるようになる。特に脳虚血性疾患（例えば，脳梗塞，脳卒中など）では発症後４．５時間しか血栓溶解剤を用いることができなかったが，本発明の虚血性疾患治療剤との併用により，４．５時間が経過したとしても血栓溶解剤を使用することが可能になり，急性期における脳虚血性疾患の治療ルートの選択範囲が飛躍的に拡大する。   Therefore, when the thrombolytic agent is used in combination with the “therapeutic agent for ischemic disease” of the present invention, the thrombolytic agent can be used regardless of the onset time of vascular infarction. This makes it possible to effectively treat various ischemic diseases. In particular, in the case of cerebral ischemic diseases (for example, cerebral infarction, stroke, etc.), the thrombolytic agent can be used only for 4.5 hours after the onset, but in combination with the ischemic disease therapeutic agent of the present invention, Thrombolytic agents can be used over time, and the range of treatment routes for cerebral ischemic disease in the acute phase will be dramatically expanded.

従って，本発明は本発明のペプチドを有効成分として含有する，虚血性疾患治療剤を提供すると共に，該虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分との組み合わせも提供する。なお，当該血栓溶解成分は，本発明の虚血性疾患治療剤の中に含まれていてもよいし，虚血性疾患治療剤とは別の血栓溶解剤として用いてもよい。   Therefore, the present invention provides a therapeutic agent for ischemic disease containing the peptide of the present invention as an active ingredient, and also provides a combination of the therapeutic agent for ischemic disease and a thrombolytic component. The thrombolytic component may be contained in the ischemic disease therapeutic agent of the present invention, or may be used as a thrombolytic agent different from the ischemic disease therapeutic agent.

本発明の虚血性疾患治療剤と併用され得る血栓溶解剤（血栓溶解成分）としては，具体的にはｔＰＡ，ウロキナーゼ，ストレプトキナーゼ，ナットウキナーゼ，プロウロキナーゼ，スタフィロキナーゼ，デスモテプラーゼ，ＡＰＳＡＣなど，あるいはこれらの血栓溶解成分に由来するペプチドが挙げられるが，これらに限定されない。好ましくはｔＰＡである。ここで「これらの血栓溶解成分に由来するペプチド」とは，上記血栓溶解成分が有する活性をそれぞれ有し，かつ各血栓由来成分（蛋白質）全長のアミノ酸配列の一部または全部と同一のアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。
ｔＰＡは，市販されているものを用いてもよいし，また公知の方法で合成したものを用いてもよい。Specific examples of thrombolytic agents (thrombolytic components) that can be used in combination with the therapeutic agent for ischemic disease of the present invention include tPA, urokinase, streptokinase, nattokinase, prourokinase, staphylokinase, desmoteplase, APSAC, and the like. Peptides derived from thrombolytic components are not limited to these. TPA is preferred. Here, “the peptide derived from these thrombolytic components” means the amino acid sequence that has the activity of each of the above thrombolytic components and is identical to a part or all of the amino acid sequence of the full length of each thrombolytic component (protein). Means a peptide having
As tPA, a commercially available one may be used, or one synthesized by a known method may be used.

さらに本発明の虚血性疾患治療剤は，他の公知の血管障害治療剤（血管障害治療成分）と併用して用いることができる。他の公知の血管障害治療剤としては特に限定されないが，上記血栓溶解剤の他に，例えばラジカルスカベンジャー（エダラボン）が挙げられる。   Furthermore, the therapeutic agent for ischemic disease of the present invention can be used in combination with other known vascular disorder therapeutic agents (vascular disorder therapeutic components). Although it does not specifically limit as another known vascular disorder therapeutic agent, For example, a radical scavenger (edaravone) other than the said thrombolytic agent is mentioned.

本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解剤（血栓溶解成分）との組み合わせは，（１）本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分とを一緒に製剤化し，単剤（配合剤）として投与する方法，（２）本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分とを別々に製剤化し，同時に投与する方法，（３）本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分とを別々に製剤化し，時間差で投与する方法（例，本発明の虚血性疾患治療剤を先に投与し，次いで血栓溶解成分を投与する），などが挙げられるがこれらに限定されない投与方法によって，投与することができる。
併用される他の公知の血管障害治療剤の投与量は，用途や投与対象の年齢，体重，性別，疾患の程度等の要件によって適宜変更可能であるが，例えば，ｔＰＡの場合，虚血性疾患の治療に一般に使用される量を用いることができ，通常げっ歯類では約１０ｍｇ／ｋｇ，ヒトでは約０．６ｍｇ／ｋｇである。The combination of the therapeutic agent for ischemic disease and the thrombolytic agent (thrombolytic component) of the present invention comprises the following steps: (1) Formulating the therapeutic agent for ischemic disease and thrombolytic component of the present invention together to form a single agent (compound) (2) A method of separately preparing the ischemic disease therapeutic agent of the present invention and a thrombolytic component and simultaneously administering it, (3) A method of separately administering the ischemic disease therapeutic agent and the thrombolytic component of the present invention And administration by time lag (eg, administering the therapeutic agent for ischemic disease of the present invention first and then administering the thrombolytic component), etc. be able to.
The dose of other known vascular disorder therapeutic agents used in combination can be appropriately changed depending on the purpose of use, age, weight, sex, degree of disease, etc. of the administration target. A commonly used amount for the treatment of canine can be used, usually about 10 mg / kg for rodents and about 0.6 mg / kg for humans.

本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分との組み合わせでは，血栓溶解成分を使用できる期間を延長することが可能となる。かかる効果を奏するには，ヒトの場合，ｔＰＡ約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ，好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約０．９ｍｇ／ｋｇ，最も好ましくは約０．６ｍｇ／ｋｇに対し，本発明のペプチドを約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ，好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇ，最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇの量で投与できる。マウスでは，ｔＰＡ約１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ，好ましくは約３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ，最も好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇに対し，本発明のペプチドを約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ，好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇ，最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇの量で投与できる。   In the combination of the therapeutic agent for ischemic disease and the thrombolytic component of the present invention, the period during which the thrombolytic component can be used can be extended. To achieve this effect, in humans, tPA is about 0.1 mg / kg to 1.0 mg / kg, preferably about 0.3 mg / kg to about 0.9 mg / kg, most preferably about 0.6 mg / kg. In contrast, the peptides of the present invention can be administered in an amount of about 0.1 mg / kg to 10 mg / kg, preferably about 0.3 mg / kg to 3.0 mg / kg, most preferably about 1 mg / kg. In mice, about 0.1 mg / kg to 30 mg / kg of tPA, preferably about 3 mg / kg to about 20 mg / kg, most preferably about 10 mg / kg, while the peptide of the present invention is about 0.1 mg / kg to 10 mg / kg. , Preferably about 0.3 mg / kg to 3.0 mg / kg, most preferably about 1 mg / kg.

前述のとおり本発明のペプチドは，神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例，神経細胞のネクローシス抑制機能，神経細胞のアポトーシス促進機能，神経細胞の間接的アポトーシス抑制機能など）を有するペプチドであるため，本発明のペプチドを含む剤は，神経細胞死抑制剤として用いることが可能である。
よって本発明は，本発明のペプチドを有効成分として含有する，神経細胞死抑制剤を提供する。As described above, the peptide of the present invention has a function of protecting against neuronal cell death and a function of inhibiting neuronal cell death (eg, a function of inhibiting necrosis of neurons, a function of promoting apoptosis of neurons, and a function of inhibiting indirect apoptosis of neurons). Therefore, the agent containing the peptide of the present invention can be used as a neuronal cell death inhibitor.
Therefore, the present invention provides a neuronal cell death inhibitor containing the peptide of the present invention as an active ingredient.

本発明の「血液臓器関門障害改善剤」，「血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤」，「虚血性疾患の治療剤」および「神経細胞死抑制剤」（以下，これらをまとめて「本発明の剤」と記載する場合がある）は，本発明のペプチドを公知の方法に従って薬学的に許容される担体あるいは希釈剤，さらに必要に応じて上記併用成分と混合することにより，製剤化される。
適切な薬学的に許容される担体あるいは希釈剤としては特に限定されず，自体公知の担体あるいは希釈剤を適用することが可能であるが，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等に記載されたものが挙げられる。The “blood organ barrier disorder improving agent”, “therapeutic agent for diseases associated with blood organ barrier disorder”, “therapeutic agent for ischemic disease” and “nerve cell death inhibitor” (hereinafter collectively referred to as “the present invention”) May be described as “the agent of the invention”) by mixing the peptide of the present invention with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent and, if necessary, the above-mentioned combination component according to a known method. The
A suitable pharmaceutically acceptable carrier or diluent is not particularly limited, and a carrier or diluent known per se can be applied, for example, those described in Remington's Pharmaceutical Sciences etc. It is done.

本発明の剤の剤型は特に限定されることなく，自体公知の投与剤型を適用可能である。しかしながら公知の臓器血管障害の治療用医薬と同様に，血管投与用の注射剤として調製されることが好ましく，特に血液脳関門障害に対する剤の場合は，脳室内投与用の注射剤として調製されることが好ましい。
より具体的には，本発明のペプチドを，水，生理食塩水，等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで注射剤とする。その際，ポリエチレングリコール，グルコース，各種アミノ酸，コラーゲン，アルブミン等を保護剤として添加して調製することが可能である。また，リボソーム等の封入体にペプチドを包埋させて投与することも可能である。The dosage form of the agent of the present invention is not particularly limited, and a dosage form known per se can be applied. However, it is preferable to be prepared as an injection for blood vessel administration, as in the case of known drugs for treating organ vascular disorders, and in particular in the case of an agent for blood-brain barrier disorders, it is prepared as an injection for intraventricular administration. It is preferable.
More specifically, the peptide of the present invention is made into an injection by dissolving it in an appropriate solvent such as water, physiological saline or isotonic buffer. In that case, it is possible to prepare by adding polyethylene glycol, glucose, various amino acids, collagen, albumin and the like as a protective agent. It is also possible to administer the peptide by embedding it in an inclusion body such as ribosome.

本発明のペプチドを上述した疾患の治療に用いるとき，有効成分としての本発明のペプチドの用量は特に限定されず，対象の年齢，体重，病状，および投与経路，その他の要素により異なるが，投薬する医師などが容易に適宜決定することができる。   When the peptide of the present invention is used for the treatment of the above-mentioned diseases, the dose of the peptide of the present invention as an active ingredient is not particularly limited and varies depending on the subject's age, body weight, medical condition, administration route, and other factors. A doctor or the like can easily determine appropriately.

本発明のペプチド，あるいは本発明の剤の投与方法は特に限定されず，現在実際に行われている様々な投与方法を採用することができる。このような投与方法の一例として，大槽内投与を挙げることができる。大槽内投与は，脳実質を傷つけないという点で有利である。また非経口投与（例えば，血管内投与（例，静脈内投与），脳室内投与など），経口投与などにより投与してもよい。   The administration method of the peptide of the present invention or the agent of the present invention is not particularly limited, and various administration methods currently practiced can be employed. An example of such an administration method is intracisternal administration. Intracisternal administration is advantageous in that it does not harm the brain parenchyma. Further, parenteral administration (for example, intravascular administration (eg, intravenous administration), intraventricular administration, etc.), oral administration, and the like may be used.

本発明のペプチドを全身投与，例えば静脈内投与する場合，１日の投与量は，例えば，約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ，好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇ，最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇである。また，本発明のペプチドを局所投与，例えば硝子体内投与する場合，１回の投与量が約０．１ｐｍｏｌ〜２０ｐｍｏｌ，好ましくは約１ｐｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌとなるように投与する。   When the peptide of the present invention is administered systemically, for example, intravenously, the daily dose is, for example, about 0.1 mg / kg to 10 mg / kg, preferably about 0.3 mg / kg to 3.0 mg / kg, Most preferably about 1 mg / kg. In addition, when the peptide of the present invention is administered locally, for example, intravitreally, it is administered so that a single dose is about 0.1 pmol to 20 pmol, preferably about 1 pmol to 10 pmol.

本発明の治療剤の好ましい態様は，血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血の治療剤又は予防剤である。実施例により実証されたとおり，本発明のペプチド又はその塩は，血栓溶解剤により惹起される運動障害や脳出血を防止できる。このため，たとえば，本発明のペプチドまたはその塩と，血栓溶解剤とを併用することで，血栓溶解剤により惹起される運動障害や脳出血を防止できる。   A preferred embodiment of the therapeutic agent of the present invention is a therapeutic or preventive agent for movement disorders or cerebral hemorrhage caused by a thrombolytic agent. As demonstrated by the examples, the peptide of the present invention or a salt thereof can prevent movement disorder and cerebral hemorrhage caused by a thrombolytic agent. Therefore, for example, by using the peptide of the present invention or a salt thereof in combination with the thrombolytic agent, it is possible to prevent movement disorders and cerebral hemorrhage caused by the thrombolytic agent.

本発明の治療剤の好ましい態様は，本発明のペプチドまたはその塩，及び血栓溶解剤を有効成分として含む，脳虚血性疾患用治療剤である。本発明のペプチドまたはその塩は，血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血を治療又は予防できるので，血栓溶解剤との併用が有効である。この側面において，好ましい血栓溶解剤は，プラスミノーゲンアクチベータである。さらに，この側面において，好ましい適応症は脳梗塞である。この側面において，本発明のペプチドまたはその塩と血栓溶解剤とは，対象となる患者に同時に投与されても良い。また，本発明のペプチドまたはその塩が対象に投与された後，３０分から５時間以内（又は１時間から３時間以内）に血栓溶解剤が投与されるものであってもよい。血栓溶解剤は，様々な副作用を惹起する場合がある。例えば，脳梗塞の疑いがある患者に対し，本発明のペプチドまたはその塩を投与することで，血栓溶解剤を投与する時間的余裕を多くすることができる。このため，精密検査を行って脳梗塞であると判明した後に，血栓溶解剤を投与できることとなる。   A preferred embodiment of the therapeutic agent of the present invention is a therapeutic agent for cerebral ischemic disease comprising the peptide of the present invention or a salt thereof and a thrombolytic agent as active ingredients. Since the peptide of the present invention or a salt thereof can treat or prevent a movement disorder or cerebral hemorrhage caused by a thrombolytic agent, a combination with a thrombolytic agent is effective. In this aspect, the preferred thrombolytic agent is a plasminogen activator. Furthermore, in this aspect, the preferred indication is cerebral infarction. In this aspect, the peptide of the present invention or a salt thereof and the thrombolytic agent may be simultaneously administered to the subject patient. In addition, the thrombolytic agent may be administered within 30 minutes to 5 hours (or within 1 hour to 3 hours) after the peptide of the present invention or a salt thereof is administered to the subject. Thrombolytic agents can cause various side effects. For example, by administering the peptide of the present invention or a salt thereof to a patient suspected of having cerebral infarction, the time margin for administering the thrombolytic agent can be increased. Therefore, thrombolytic agents can be administered after a close examination reveals a cerebral infarction.

本発明は，対象（例えばヒト）に，本発明のペプチドを，血液脳関門障害を伴う疾患を治療するために有効な量投与する工程を含む，血液脳関門障害を伴う疾患の治療方法をも提供する。   The present invention also includes a method for treating a disease associated with a blood brain barrier disorder, comprising the step of administering to a subject (eg, a human) an effective amount of the peptide of the present invention for treating the disease associated with the blood brain barrier disorder. provide.

血液脳関門障害を伴う疾患の例は，アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害，一過性血流障害，高血圧性脳障害，頭蓋内外の動脈の塞栓症，血栓症に起因する梗塞，動脈瘤，動静脈奇形，脳動脈狭窄性病変，硬膜動静脈瘻，血管外傷，血管性腫瘍，ウィルス感染性脳炎，脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫，及び脳梗塞後の脆弱性血管新生による出血疾患である。   Examples of diseases with blood-brain barrier disorders are due to secondary vascular disorders due to atherosclerosis or hypertension, transient blood flow disorders, hypertensive brain disorders, intracranial and external arterial emboli, thrombosis Infarction, aneurysm, arteriovenous malformation, cerebral artery stenotic lesion, dural arteriovenous fistula, vascular trauma, vascular tumor, viral infectious encephalitis, edema due to fragile angiogenesis after cerebral infarction, and fragility after cerebral infarction It is a bleeding disorder caused by sexual angiogenesis.

本発明は，対象（例えばヒト）に，本発明のペプチドを脳梗塞の治療に有効な量投与する工程を含む，脳梗塞の治療方法をも提供する。   The present invention also provides a method for treating cerebral infarction comprising the step of administering to a subject (eg, human) an effective amount of the peptide of the present invention for the treatment of cerebral infarction.

本発明は，対象（例えばヒト）に，本発明のペプチド及び血栓溶解剤を脳虚血性疾患の治療に有効な量投与する工程を含む，脳虚血性疾患の治療方法をも提供する。血栓溶解剤の例は，プラスミノーゲンアクチベータである。この方法は，特に脳梗塞の治療に有効である。すなわち，血栓溶解剤と本発明のペプチドを併用することで，血栓溶解剤の治療可能時間を延長することができ，さらに血栓溶解剤による運動機能低下を防止できる。本発明のペプチド及び血栓溶解剤は，対象に同時に投与されてもよい。一方，たとえば，脳卒中の疑いがある場合に，本発明のペプチドを取り急ぎ投与し，その後３０分から５時間以内（又は１時間から３時間以内）に，検査結果に基づいて血栓溶解剤を対象に投与してもよい。   The present invention also provides a method for treating cerebral ischemic disease, comprising the step of administering to a subject (eg, human) an effective amount of the peptide of the present invention and a thrombolytic agent for the treatment of cerebral ischemic disease. An example of a thrombolytic agent is plasminogen activator. This method is particularly effective for the treatment of cerebral infarction. That is, by using the thrombolytic agent and the peptide of the present invention in combination, the treatment time of the thrombolytic agent can be extended, and further, the motor function can be prevented from being lowered by the thrombolytic agent. The peptide of the present invention and the thrombolytic agent may be administered to the subject simultaneously. On the other hand, for example, when there is a suspicion of stroke, the peptide of the present invention is administered immediately, and within 30 minutes to 5 hours (or within 1 hour to 3 hours), a thrombolytic agent is administered to the subject based on the test results. May be.

以下，実施例により本発明を更に詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.

［試験方法］
試薬等
ｔＰＡは，協和発酵キリン株式会社（東京，日本）より購入した。[Test method]
Reagents, etc. tPA was purchased from Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. (Tokyo, Japan).

実験動物
本実験で使用したＣ５７／ＢＬ６Ｊ系雄性マウス６〜９週齢（１９〜２８ｇ）は，恒温（２２±２℃）の部屋で１２時間毎の昼夜自然管理下において飼育し，水道水及び一般動物用固形飼料（ＭＦ，オリエンタル酵母，東京，日本）を自由に摂取させた。以下に示す全ての実験は，長崎大学動物実験指針で定める方法に準じて行った。 Experimental animals C57 / BL6J male mice 6-9 weeks old (19-28 g) used in this experiment were bred under natural control every 12 hours in a constant temperature (22 ± 2 ° C.) room, with tap water and General animal chow (MF, Oriental yeast, Tokyo, Japan) was freely ingested. All the experiments shown below were conducted according to the method defined in the Nagasaki University Animal Experiment Guidelines.

網膜虚血モデル
ペントバルビタール７５ｍｇ／ｋｇをマウス腹腔内に投与し麻酔をかけた。37℃の恒温台の上にマウスを置き，体温を維持する。硝子体を１％の硫酸アトロピンで散瞳させ，無菌眼内潅流溶液（ＢＳＳ ＰＬＵＳ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ; Ａｌｃｏｎ, Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ, ＴＸ, ＵＳＡ）の容器を予め水面がマウスの眼より１３５．５ ｃｍ（１００ ｍｍＨｇ）の高さになるようにつり上げておき，灌流溶液を小児用輸液セットに接続した３３Ｇの注射針を針先から少し垂らしながら前眼房に刺入し固定した。前房に針を刺入した後，灌流系を解放することにより前眼房内に圧力（１００ ｍｍＨｇ）を４５分間負荷した（マウス正常眼圧は１５ ｍｍＨｇ程度）。これらの操作は実体顕微鏡下で行い，眼圧の上昇により網膜虚血が惹起されていることを網膜内血流の遮断を指標に目視にて確認した。虚血負荷終了後に注射針を抜き，眼圧を低下させることにより網膜を再灌流させた。モデルは虚血−再灌流法を用いた一般的緑内障モデルであり，既存の緑内障治療薬であるアンジオテンシン変換酵素阻害薬の全身投与により神経保護効果を示すこと等が知られている。Retinal ischemia model Pentobarbital 75 mg / kg was administered intraperitoneally to mice and anesthetized. Place the mouse on a 37 ° C thermostat to maintain body temperature. The vitreous body was mydriated with 1% atropine sulfate, and a container of sterile intraocular perfusion solution (BSS PLUS dilution buffer; Alcon, Fort Worth, TX, USA) was previously placed at a water surface of 135.5 cm (100 mmHg) from the mouse eye. The 33G injection needle connected with the perfusion solution to the pediatric infusion set was slightly suspended from the tip of the needle and inserted into the anterior chamber for fixation. After the needle was inserted into the anterior chamber, pressure (100 mmHg) was applied to the anterior chamber for 45 minutes by releasing the perfusion system (normal intraocular pressure of the mouse was about 15 mmHg). These operations were performed under a stereomicroscope, and it was visually confirmed that retinal ischemia was caused by an increase in intraocular pressure with the blockage of blood flow in the retina as an index. After completion of the ischemic load, the retina was reperfused by removing the injection needle and reducing the intraocular pressure. The model is a general glaucoma model using an ischemia-reperfusion method, and it is known that a systemic administration of an angiotensin converting enzyme inhibitor, which is an existing therapeutic agent for glaucoma, exhibits a neuroprotective effect.

ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色による組織障害評価
標本作製：ペントバルビタール５０ ｍｇ/ｋｇをマウス腹腔内に投与し麻酔をかけた。心臓から Ｋ+ ｆｒｅｅ ＰＢＳ ４０ ｍｌを灌流して脱血し，４％ ＰＦＡ ３０ ｍｌを灌流して固定した。マウスから眼球を取り出し，室温で３時間，４％ ＰＦＡで浸漬固定した。２５%スクロースに置換し，８時間以上組織が沈むまで４℃でインキュベーションした。その後，組織表面の水分を拭き取った後，ＯＣＴコンパウンドで包埋した。凍結ミクロトーム ＣＭ１９００で１０μｍ厚切り切片を作成し，シランコーティングしたスライドガラスに張り付けた。ヒーターの中で一晩乾燥させた。Evaluation of tissue damage by staining with hematoxylin and eosin (HE) Preparation of specimen: Pentobarbital 50 mg / kg was intraperitoneally administered to mice and anesthetized. From the heart, 40 ml of K + free PBS was perfused to remove blood, and 30 ml of 4% PFA was perfused and fixed. The eyeball was removed from the mouse and fixed by immersion in 4% PFA at room temperature for 3 hours. The tissue was replaced with 25% sucrose and incubated at 4 ° C. until the tissue subsided for 8 hours or more. Then, after wiping off the water | moisture content of the structure | tissue surface, it embedded with the OCT compound. A 10 μm-thick section was prepared with a frozen microtome CM1900 and attached to a silane-coated slide glass. Dry overnight in heater.

ＨＥ染色：検体の細胞核をギルヘマトキシリン液にて染色し，洗浄後０．２％ 塩酸・７０％エタノールにて分別を行う。分別液を洗浄し，９５％エタノールにて検体を親和させる。組織をエオジン・フロキシン液にて対比染色する。エタノールにて分別・脱水を行った後，キシレンにて透徹した。検体は封入した後，ＢＩＯＺＥＲＯ顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ，大阪，日本）にて観察を行った。   HE staining: The cell nuclei of the specimen are stained with gilhematoxylin solution, and after washing, fractionated with 0.2% hydrochloric acid / 70% ethanol. Wash the aliquot and allow the sample to affinity with 95% ethanol. The tissue is counterstained with eosin-phloxin solution. After separation and dehydration with ethanol, it was clarified with xylene. After enclosing the specimen, the specimen was observed with a BIOZERO microscope (KEYENCE, Osaka, Japan).

網膜電位図（Ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍ: ＥＲＧ）による網膜機能の評価
マウスを暗室にて3時間暗順応させた後，ペントバルビタール５０ ｍｇ/ｋｇをマウス腹腔内に投与し麻酔をかけた。１％ アトロピン点眼にて瞳孔を開かせた後，コンタクト電極（ＫＥ-Ｓ; Ｋｙｏｔｏ ｃｏｎｔａｃｔ ｌｅｎｓｅｓ，京都，日本）を角膜先端に設置し，鉄電極を眼近傍に設置した。皮下プラチナ針電極は，腹部に設置した。ＥＲＧはＳＬＳ−３１００（日本光電，東京，日本）にて２０ Ｊの閃光にて誘発させ，ＭＥＢ-９１０４（日本光電）にて２分ごとに３０分間計測した。バックグラウンド補正は，通常時の明時における反応を２分ごとに２０分間計測したものを使用した。計測されるａ波，ｂ波の増幅は，Ｎｅｕｒｏｐａｃｋ（日本光電）にて定量した。Evaluation of retinal function by electroretinogram (ERG) After the mouse was dark-adapted in a dark room for 3 hours, pentobarbital 50 mg / kg was intraperitoneally administered to the mouse and anesthetized. After opening the pupil with 1% atropine instillation, a contact electrode (KE-S; Kyoto contact lenses, Kyoto, Japan) was placed at the tip of the cornea, and an iron electrode was placed near the eye. A subcutaneous platinum needle electrode was placed in the abdomen. ERG was induced with 20 J flash in SLS-3100 (Nihon Kohden, Tokyo, Japan) and measured every 2 minutes for 30 minutes with MEB-9104 (Nihon Kohden). The background correction used was a measurement of the response at normal light during 20 minutes every 2 minutes. The amplification of the measured a wave and b wave was quantified with Neuropack (Nihon Kohden).

一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）モデル
マウスを３％ イソフルラン（エスカイン（登録商標），マイラン製薬株式会社，東京，日本）で麻酔をかけた（Ｓｍａｌｌ ａｎｉｍａｌ ａｎｅｓｔｈｅｔｉｚｅｒ ＭＫ-Ａ１００，室町機械株式会社，東京，日本）。摂氏３７度の恒温台（池本理化学株式会社，東京，日本）の上で咽頭部位の皮膚を鋏で ２ ｃｍほど縦に切る。硬質絹糸（硬質8号，夏目製作所）で皮を右側に引っ張り，視野を確保した。実体顕微鏡を使い，結合組織，神経などを剥離しながら気管左に位置する左総頸動脈を硬質絹糸で確保する。総頸動脈を上方へ辿ると内頸動脈と外頸動脈に分かれるので，左手前側の外頸動脈を二か所，軟質絹糸で硬く結び，間を切る。内頸動脈から上部に伸びる細い血管を軟質絹糸で確保する。軟質絹糸と硬質絹糸を強く引っ張り血流を止めて，内頸動脈に鋏で切りこみを入れる。そこから塞栓子を１から１．５ ｃｍ挿入し，中大脳動脈を閉塞する。内頸動脈を塞栓子ごと軟質絹糸で結び，塞栓子を固定した。引っ張っている硬質絹糸の下に軟質絹糸を通し，硬質絹糸の手前で総頸動脈を結んでから硬質絹糸を外す。軟質絹糸で胸を２か所縫合する。本課題の一過性中大脳動脈閉塞モデル（ｔＭＣＡＯ）の場合，１時間，または４時間後に再び摂氏３７度の恒温台の上でマウスに３％イソフルランで麻酔をかけ，胸を縫合した軟質絹糸をほどき，胸を開ける。内頸動脈を結んでいた軟質絹糸を緩め，塞栓子を抜去し，すぐに再び内頸動脈を結んだ。Transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) model mice were anesthetized with 3% isoflurane (Escaine (registered trademark), Mylan Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan) (Small animal anestheticizer MK-A100, Muromachi Kikai Co., Ltd.) Tokyo Japan). Cut the skin at the pharyngeal site on a constant temperature table (Ikemoto RIKEN Co., Tokyo, Japan) at 37 degrees Celsius with a scissors about 2 cm. The skin was pulled to the right with hard silk thread (Hard No. 8, Natsume Seisakusho) to secure a field of view. Using a stereomicroscope, secure the left common carotid artery located on the left side of the trachea with hard silk while peeling connective tissue and nerves. When the common carotid artery is traced upward, it is divided into an internal carotid artery and an external carotid artery, so the external carotid artery on the left front side is tied tightly with soft silk thread and cut between them. Secure thin blood vessels extending upward from the internal carotid artery with soft silk thread. Pull soft silk and hard silk tightly to stop blood flow, and scissor the internal carotid artery with scissors. From there, an embolus is inserted 1 to 1.5 cm to occlude the middle cerebral artery. The internal carotid artery was tied together with the embolus with soft silk thread, and the embolus was fixed. Pass the soft silk thread under the pulling hard silk thread, tie the common carotid artery before the hard silk thread, and then remove the hard silk thread. Suture the chest with two soft silks. In the case of the transient middle cerebral artery occlusion model (tMCAO), a soft silk thread that was anesthetized with 3% isoflurane on a constant temperature table at 37 degrees Celsius after 1 or 4 hours and the chest was sutured Unwind and open your chest. The soft silk thread that tied the internal carotid artery was loosened, the embolus was removed, and the internal carotid artery was immediately reconnected.

血栓性脳梗塞（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ-ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ: ＰＩＴ）モデル
マウスを３％イソフルラン（エスカイン（登録商標），マイラン製薬株式会社，東京，日本）で麻酔をかけた（Ｓｍａｌｌ ａｎｉｍａｌ ａｎｅｓｔｈｅｔｉｚｅｒ ＭＫ-Ａ１００，室町機械株式会社，東京，日本）。術中は，２．５％イソフルランで麻酔効果の維持を行った。摂氏３７度の恒温台（池本理化学株式会社，東京，日本）の上で左耳と左眼の間の皮膚を５〜６ｍｍ切開した。側頭筋縁に沿って眼科用ハサミを入れ，頭蓋骨と側頭筋の付着部を切開し，側頭筋下の中大脳動脈領域の頭蓋骨を露出した。軟質絹糸で四方向に皮膚および側頭筋を引っ張ることで視野を確保した後，実体顕微鏡下にて中大脳動脈領域の頭蓋骨にドリルで約１．５ｍｍ径の小孔を開けた。ローズベンガル（Ｗａｋｏ）３０ ｍｇ/ｋｇを尾静脈内投与し，直後にＵＶスポット光源（Ｌ-４８８７-１３；浜松ホトニクス，静岡，日本）に接続したライトガイド（Ａ４８８８；浜松ホトニクス，静岡，日本）の先端部を，硬膜下に確認される遠位中大脳動脈に垂直に充て緑色光を１０分間照射した。その後，中大脳動脈が変化（細くなる又は血赤色が薄くなる）していることを確認した後，側頭筋を戻し，皮膚を軟質絹糸にて縫合した。A thrombotic cerebral infarction (Photochemically induced thrombosis: PIT) model mouse was anesthetized with 3% isoflurane (Escaine (registered trademark), Mylan Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan) (Small animal anesthetizer MK-A100, Muromachi Machine Stock Company, Tokyo, Japan). During the operation, the anesthetic effect was maintained with 2.5% isoflurane. A 5-6 mm incision was made on the skin between the left ear and the left eye on a constant temperature table (Ikemoto RIKEN, Tokyo, Japan) at 37 degrees Celsius. Ophthalmic scissors were inserted along the margin of the temporal muscle, the incision was made between the skull and the temporal muscle, and the skull in the middle cerebral artery region under the temporal muscle was exposed. After visual field was secured by pulling the skin and temporal muscles in four directions with soft silk thread, a small hole with a diameter of about 1.5 mm was drilled in the skull in the middle cerebral artery region under a stereomicroscope. Light guide (A4888; Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japan) administered with 30 mg / kg of Rose Bengal (Wako) via the tail vein and immediately connected to a UV spot light source (L-4877-1; Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japan) The distal end of each was filled vertically with the distal middle cerebral artery confirmed under the dura mater and irradiated with green light for 10 minutes. Thereafter, after confirming that the middle cerebral artery had changed (thinned or blood reddish), the temporal muscle was returned and the skin was sutured with soft silk.

神経学的スコアリング
脳虚血に伴う運動機能障害の程度を評価するため，以下の定義による神経学的スコア（Clinical Scores）を用いた。また，1〜4の各数値は 2段階評価とした（スコア1と2を示すなら，1.5とした）。
1：右前肢の運動機能障害，2：一方向性の行動をとる，3：体勢を保てず傾く，4：自発運動の消失，5：死亡Neurological scoring To assess the degree of motor dysfunction associated with cerebral ischemia, we used the following neurological scores (Clinical Scores). In addition, each number from 1 to 4 was rated on a two-point scale (1.5 if score 1 and 2 are shown).
1: Motor dysfunction of the right forelimb, 2: Take unidirectional behavior, 3: Lean without maintaining posture, 4: Loss of spontaneous movement, 5: Death

統計処理
独立した2群間については，Ｆ-ｔｅｓｔによる分散分析後にＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ-ｔｅｓｔを用いて有意差検定を行った。多群間解析については，Ｏｎｅ-ｆａｃｔｏｒ ＡＮＯＶＡ，ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅ ＡＮＯＶＡによる分散分析後にＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔを用いて有意差検定を行った。Statistical processing For two independent groups, significant difference test was performed using Student's t-test after analysis of variance by F-test. For multi-group analysis, significant difference test was performed using Dunnett's test after analysis of variance with One-factor ANOVA and repeated measurement ANOVA.

［実施例１］
網膜虚血誘発網膜機能障害に対するプロサイモシンα由来ペプチド及びそれらの改変ペプチドの抑制効果
特許文献２で既に特定したペプチド９（＝ＰｒｏＴα９）の誘導化を目指し，アミノ酸配列を前後させる，あるいはＮ末端およびＣ末端を欠損するなどした，下記表１に示す７種類のペプチドの効果を網膜虚血モデルで評価した。なお，網膜虚血モデルにおける硝子体内投与処置における評価は，眼内という閉鎖系であることから網膜の厚みを測定する組織化学的解析，網膜電位図 (ERG)による機能解析は，高い再現性と高感度性を有する。[Example 1]
Inhibitory effect of prothymosin α-derived peptides and their modified peptides on retinal ischemia-induced retinal dysfunction Aiming at derivatization of peptide 9 (= ProTα9) already specified in Patent Document 2, the amino acid sequence is changed back and forth, or N-terminal and C The effects of the seven types of peptides shown in Table 1 below, such as deletion of the terminal, were evaluated in a retinal ischemia model. The evaluation of intravitreal administration in the retinal ischemia model is based on a closed system called the intraocular system. Therefore, histochemical analysis to measure the thickness of the retina and functional analysis by retinal electrogram (ERG) have high reproducibility. High sensitivity.

表１は，本発明と関連するペプチドを示す表である。Ｐｅｐ−３５は，全長ラットプロサイモンシンαにおいて５０番目から５６番目のアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号４）である。Ｐｅｐ−３６は，Ｐｅｐ−３５において，全長ラットプロサイモンシンαにおける５５番目のグルタミン酸をグルタミンに置換したペプチド（配列番号５）である。Ｐｅｐ−３７は，全長ラットプロサイモンシンαにおいて５０番目から５７番目のアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号１）である。Ｐｅｐ−３８は，Ｐｅｐ−３７において，全長ラットプロサイモンシンαにおける５５番目のグルタミン酸をグルタミンに置換したペプチド（配列番号２）である。Ｐｅｐ−３９は，全長ラットプロサイモンシンαにおいて５０番目から５８番目のアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号６）である。Ｐｅｐ−４０は，Ｐｅｐ−３９において，全長ラットプロサイモンシンαにおける５５番目のグルタミン酸をグルタミンに置換したペプチド（配列番号７）である。Ｐｅｐ−４１は，Ｐｅｐ−３８において，Ｎ末端のアスパラギン酸とＣ末端のグルタミン酸とを結合させたペプチド（配列番号３）である。   Table 1 is a table showing peptides related to the present invention. Pep-35 is a peptide (SEQ ID NO: 4) having an amino acid sequence from the 50th to the 56th amino acid in full-length rat prothymosin α. Pep-36 is a peptide (SEQ ID NO: 5) obtained by substituting glutamine for 55th glutamic acid in full-length rat prosimonsin α in Pep-35. Pep-37 is a peptide having the amino acid sequence from the 50th to the 57th amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) in full-length rat prosimonsin α. Pep-38 is a peptide (SEQ ID NO: 2) obtained by substituting glutamine for 55th glutamic acid in full-length rat prosimonsin α in Pep-37. Pep-39 is a peptide having the amino acid sequence from the 50th to the 58th amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) in full-length rat prosimonsin α. Pep-40 is a peptide (SEQ ID NO: 7) obtained by substituting glutamine for 55th glutamic acid in full-length rat prosimonsin α in Pep-39. Pep-41 is a peptide obtained by binding N-terminal aspartic acid and C-terminal glutamic acid in Pep-38 (SEQ ID NO: 3).

ＥＲＧでは，光照射から視神経（神経節細胞）に至る活動を評価することができる。角膜の後極に対する電位差は＋２〜１７ｍＶであるが（網膜の静止電位），光刺激後，１５ｍｓｅｃの潜時で内向きの電圧変化ａ−ｗａｖｅ（ａ波）が生じ，その後外向きの電圧変化ｂ−ｗａｖｅ（ｂ波）が生じる。ａ波は外顆粒層（視細胞）の働きを反映し，ｂ波は内顆粒層から神経節細胞層までの機能を反映している。ａ波及びｂ波は，虚血処理の１週間後の時点ではほぼ完全に消失し，電位は平坦なものになる。ａ波及びｂ波の消失は，網膜虚血障害により網膜機能が低下したことを示す。神経保護タンパク質であるプロサイモシンα １ｐｍｏｌ（ＰＢＳ溶液中）を虚血の２４時間後に硝子体内に注入すると，その内向き，外向きの電流がほぼ完全に回復することが知られている（非特許文献４参照）。
虚血処理は，マウス前眼房に１３０ｍｍＨｇの水圧を４５分間適用することにより行った。網膜電位の測定は，虚血処理の１週間後に行った。虚血処理の１週間後，マウスを３時間暗順応させた。その後光を短時間照射し，角膜に装置した電極を用いて静止電位の変化を測定した。
本実施例では，前記ペプチド０．１ ｐｍｏｌを，虚血の24時間後に硝子体内に投与した。In ERG, the activity from light irradiation to the optic nerve (ganglion cell) can be evaluated. The potential difference with respect to the posterior pole of the cornea is +2 to 17 mV (resting potential of the retina). After light stimulation, an inward voltage change a-wave (a wave) occurs at a latency of 15 msec, and then the outward voltage change. b-wave (b wave) is generated. The a wave reflects the function of the outer granule layer (photocell), and the b wave reflects the function from the inner granule layer to the ganglion cell layer. The a wave and the b wave disappear almost completely at one week after the ischemic treatment, and the potential becomes flat. The disappearance of a-wave and b-wave indicates that retinal function has been reduced due to retinal ischemic injury. It is known that the inward and outward currents are almost completely recovered when 1 pmol of prothymosin α (in PBS solution), a neuroprotective protein, is injected into the vitreous 24 hours after ischemia (non-patent document) 4).
The ischemic treatment was performed by applying a water pressure of 130 mmHg to the anterior chamber of the mouse for 45 minutes. Retinal potential was measured one week after ischemia treatment. One week after the ischemic treatment, the mice were dark adapted for 3 hours. After that, light was irradiated for a short time, and the change in static potential was measured using an electrode attached to the cornea.
In this example, 0.1 pmol of the peptide was administered intravitreally 24 hours after ischemia.

結果を図１Ａ及びＢに示す。図１Ａ及びＢは，上記ペプチドを用いた場合の網膜電位の値を示すグラフである。図１Ａは，ａ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図１Ｂは，ｂ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。なお，図中の縦軸は電圧の変化分を示す。また，図１Ａ及びＢから求めた網膜電位の値の回復率を，表２に示す。   The results are shown in FIGS. 1A and B. 1A and 1B are graphs showing values of retinal potential when the peptide is used. FIG. 1A is a graph showing values of retinal potential using a-waves. FIG. 1B is a graph showing the value of retinal potential using b-wave. The vertical axis in the figure indicates the change in voltage. Table 2 shows the recovery rate of the value of the retinal potential obtained from FIGS. 1A and 1B.

図１Ａ及びＢ，並びに表２から明らかなように，改変ペプチドであるＰｅｐ−３６，３８，４０及び４１は，それぞれ，改変していないＰｅｐ−３５，３７，及び３９に比べて高い網膜虚血障害保護作用を有していた。
また，上記改変ペプチドの中でも，環状ペプチドであるＰｅｐ−４１はａ−ｗａｖｅ回復率６６．０％，ｂ−ｗａｖｅ回復率７７．３％と最も高い活性を示した。
なお，０．１ ｐｍｏｌという投与量での保護効果としてはプロサイモシンαに比べて相当高いと考えられる。As is apparent from FIGS. 1A and B and Table 2, the modified peptides Pep-36, 38, 40 and 41 have higher retinal ischemia compared to unmodified Pep-35, 37 and 39, respectively. It had a protective effect on obstacles.
Among the above modified peptides, Pep-41, which is a cyclic peptide, showed the highest activity with an a-wave recovery rate of 66.0% and a b-wave recovery rate of 77.3%.
The protective effect at a dose of 0.1 pmol is considered to be considerably higher than that of prothymosin α.

［実施例２］
網膜虚血に対するプロサイモシンα由来ペプチド及びそれらの改変ペプチドの形態学的改善効果
実施例１において各ペプチドによる網膜虚血の組織障害抑制効果を調べるため，網膜組織のＨＥ染色を行った。図２は，染色された網膜を示す図面に替わる写真である。また，図２の組織障害抑制効果の評価を表３に示す。[Example 2]
Morphological improvement effect of prothymosin α-derived peptides and their modified peptides against retinal ischemia In Example 1, retinal tissue was stained with HE in order to examine the inhibitory effect of each peptide on retinal ischemia. FIG. 2 is a photograph replacing a drawing showing the stained retina. In addition, Table 3 shows the evaluation of the tissue disorder suppressing effect of FIG.

図２及び表３から，例えば，Ｐｅｐ−３６，３９，４０及び４１は網膜虚血モデルにおいて組織障害を抑制し，特にＰｅｐ−４０及び４１には高い組織保護作用があることがわかった。   2 and Table 3, for example, Pep-36, 39, 40, and 41 suppressed tissue damage in a retinal ischemia model, and in particular, Pep-40 and 41 were found to have a high tissue protective action.

［実施例３］
ＰＩＴモデルにおけるＰ８改変ペプチドの運動障害回復効果
アクセレイテッドロータロッドテスト（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｒｏｔａ ｒｏｄ ｔｅｓｔ）は，運動協調性（ｍｏｔｏｒ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）および運動学習機能の解析に特化した手法である。運動協調性は，主に線条体領域に存在する神経細胞の機能障害によって低下することが知られている。また，運動学習は主に小脳で制御されており，小脳神経細胞の機能障害によって運動学習機能は低下する。[Example 3]
Recovery Effect of P8 Modified Peptide in PIT Model Accelerated Rota rod test is a method specialized in the analysis of motor coordination and motor learning function. It is known that motor coordination is reduced mainly by dysfunction of neurons existing in the striatum region. In addition, motor learning is mainly controlled by the cerebellum, and motor learning functions decline due to dysfunction of cerebellar neurons.

脳梗塞動物モデルであるＰＩＴモデルは，尾静脈投与により光感受性色素であるローズベンガルを投与することで，緑色光を照射した場所特異的に活性酸素種を発生させることが可能な方法である。産生された活性酸素種は，血管内皮細胞を傷害し，血栓を形成させることで血管閉塞を引き起こす。中大脳動脈における緑色光の照射により，その血流支配下にある大脳皮質，線条体で虚血傷害を引き起こすことが可能である。そのため，ＰＩＴモデルで見られる運動機能障害は，運動協調性を制御する線条体が主な病態責任領域であると考えられる。   The PIT model, which is a cerebral infarction animal model, is a method capable of generating reactive oxygen species specific to a site irradiated with green light by administering rose bengal, which is a photosensitive pigment, by tail vein administration. The produced reactive oxygen species damages vascular endothelial cells and causes vascular occlusion by forming a thrombus. Irradiation with green light in the middle cerebral artery can cause ischemic injury in the cerebral cortex and striatum under blood flow control. Therefore, the motor dysfunction seen in the PIT model is considered to be the main pathological responsibility area of the striatum that controls motor coordination.

神経保護ペプチドとして見出された本発明のペプチドが，PITモデルにおける運動機能回復に寄与することができるか，運動協調性の観点から検討することを目的とし，アクセレイテッドロータロッドテストを実施した。   An accelerated rotarod test was conducted to investigate whether the peptide of the present invention found as a neuroprotective peptide can contribute to motor function recovery in the PIT model from the viewpoint of motor coordination. .

アクセレイテッドロータロッドテストはＲＯＴＡ-ＲＯＤ ＴＲＥＡＤＭＩＬＬ ＦＯＲ ＲＡＴＳ ＆ ＭＩＣＥ（ＭＫ-６１０Ａ，室町機械）を用いて行った。この実験では，ロッドの回転は5分間で４．５ ｒｐｍから４５ ｒｐｍまで加速する条件とした。体重20〜25ｇの雄性マウス（C57BL／J6）をロッドに乗せ，ロッド上からマウスが落下するまでの時間（落下潜時）を測定することにより行った。本試行は1日4試行，1試行につき1時間の間隔をあけて3日連続で実施し「Training」（トレイニング）とした。   The accelerated rotarod test was performed using ROTA-ROD TREADMILL FOR RATS & MICE (MK-610A, Muromachi Kikai). In this experiment, the rod rotation was accelerated from 4.5 rpm to 45 rpm in 5 minutes. A male mouse (C57BL / J6) weighing 20 to 25 g was placed on the rod, and the time until the mouse dropped from the rod (falling latency) was measured. This trial was conducted for 4 consecutive days, 3 consecutive days with 1 hour interval per trial, and was designated as “Training”.

その後PIT手術を行い，1週間後に運動機能障害を4試行／日することで評価し，「Test」値とした。ただし，回転するRota rodからマウスが落下せず，ロッドにしがみついたまま一緒に回転する場合は，連続して2回回転した時点で歩行不可と判定し，測定を終了，落下時間として判定した。   Thereafter, PIT surgery was performed, and after 1 week, motor dysfunction was evaluated by performing 4 trials / day, and the value was set to “Test”. However, when the mouse did not fall from the rotating Rota rod and rotated together while clinging to the rod, it was determined that walking was impossible at the time of two consecutive rotations, the measurement was terminated, and the fall time was determined.

改変ペプチドによる効果の判定試験では，PIT虚血終了５時間後に各ペプチドを３ｍｇ／ｋｇ尾静脈投与(ｉ.ｖ.)し，投与した。効果検定は１週間後に行った。なお，ローズベンガルをｉ.ｖ.投与し緑色光を照射しない群をｓｈａｍ群とし，ローズベンガルのｉ.ｖ.投与および緑色光照射を行い，5時間後に溶媒ＰＢＳ（１００μＬ／１０グラム, ｉ.ｖ.）処置したものをＰＩＴ処置群とした。また，5時間後にＰｅｐ−３５，３８又は４１（それぞれ３ ｍｇ／ｋｇ, ｉ.ｖ.）で処置したものを，それぞれＰＩＴ+Ｐｅｐ−３５処置群，ＰＩＴ+Ｐｅｐ−３８処置群及びＰＩＴ+Ｐｅｐ−４１処置群とした。   In the test for determining the effect of the modified peptide, each peptide was administered at 3 mg / kg tail vein (iv) 5 hours after the end of PIT ischemia. The effect test was performed one week later. In addition, rose bengal was administered iv and the group not irradiated with green light was designated as sham group, rose bengal was administered iv and irradiated with green light, and solvent PBS (100 μL / 10 gram, i. v.) The treated group was designated as a PIT-treated group. In addition, those treated with Pep-35, 38 or 41 (3 mg / kg, iv, respectively) after 5 hours were treated with the PIT + Pep-35 treatment group, the PIT + Pep-38 treatment group and the PIT + Pep, respectively. -41 treated group.

参考文献：Ｊｕｎｇ-Ｋｉｌ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ。 Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６７ (２００７) ６２０〜６２５   Reference: Jung-Kil Lee et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surgical Neurology 67 (2007) 620-625

図３は，７日後におけるアクセレイテッドロータロッドテスト（Accelerated Rota rod test）の結果を示す，走行不可能となるまでの時間の平均値を示す棒グラフである。   FIG. 3 is a bar graph showing the average value of the time until it becomes impossible to run, showing the result of the accelerated rotor rod test after 7 days.

図３から，PIT処置を行った場合には運動能力の低下が見られるが，PIT処置後に改変ペプチドを３ｍｇ／ｋｇ投与した系では，運動能力が回復する傾向にあることがわかった。特にＰｅｐ−４１には高い回復効果があることがわかった。   From FIG. 3, it was found that when PIT treatment was performed, motor ability decreased, but in the system in which the modified peptide was administered at 3 mg / kg after PIT treatment, the motor ability tended to recover. In particular, Pep-41 was found to have a high recovery effect.

［実施例４］
ｔＭＣＡＯ（一過性中大脳動脈閉塞）虚血モデルにおけるP8改変ペプチドの評価
ｔＭＣＡＯモデル（60分間虚血）において超急性期に相当する虚血1時間後静脈内投与で運動障害に対し保護効果を有するかを評価した。
C57BL／J6マウスの左中大脳動脈を梗塞して作成した脳虚血モデルマウスを１時間維持し，次いで再灌流した。再灌流の１時間後にPep−35（3mg／kg），Pep−38（3mg／kg）又はPep−41（3mg／kg又は10mg／kg）を尾静脈内投与し，その後24時間毎にマウスの経過を観察して運動機能及び生存を評価した。[Example 4]
Evaluation of P8-modified peptides in tMCAO (transient middle cerebral artery occlusion) ischemia model In tMCAO model (60 minutes ischemia), intravenous administration 1 hour after ischemia corresponding to the hyperacute phase protects against movement disorders It was evaluated whether it has.
Cerebral ischemia model mice prepared by infarction of the left middle cerebral artery of C57BL / J6 mice were maintained for 1 hour and then reperfused. One hour after reperfusion, Pep-35 (3 mg / kg), Pep-38 (3 mg / kg), or Pep-41 (3 mg / kg or 10 mg / kg) was administered via the tail vein, and every 24 hours thereafter The progress was observed to evaluate motor function and survival.

図４Ａは，ｔＭＣＡＯモデルにおける評価工程及び運動障害を表す臨床スコアを示す。
図４Ｂは，60分間のｔＭＣＡＯを行った後１〜７日間の運動障害を評価したスコアの変遷を示す。なお，図４Ｂ中，黒丸で示したデータは，60分間のｔＭＣＡＯの１時間後に，ＰＢＳ中0.1%のDMSO（Vehicle）を尾静脈に3mg／kg投与した時の値を示し，マウスを７日間毎日評価したところ，７日後にほぼ最大の臨床スコアの悪化を示し，ほぼ全てのマウスが死亡した（ｎ＝９）。FIG. 4A shows the clinical score representing the evaluation process and movement disorders in the tMCAO model.
FIG. 4B shows the change of the score which evaluated the movement disorder for 1 to 7 days after 60 minutes of tMCAO. In FIG. 4B, the data indicated by black circles indicate the values when 3 mg / kg of 0.1% DMSO (Vehicle) in PBS was administered to the tail vein 1 hour after 60 minutes of tMCAO. When evaluated daily, almost all mice died after 7 days and almost all mice died (n = 9).

図４Ｂから明らかなように，Pep−35（3mg／kg）投与では，有意な改善効果が観察され，臨床スコアは平均１程度に低下した。また，Pep−38及びPep−41は，3mg／kgでは臨床スコアの低下傾向が見られ，10mg／kgでは臨床スコアが平均２程度に低下し，有意な改善効果を有することがわかった。   As is clear from FIG. 4B, when Pep-35 (3 mg / kg) was administered, a significant improvement effect was observed, and the clinical score decreased to about 1 on average. In addition, Pep-38 and Pep-41 showed a tendency of decreasing clinical score at 3 mg / kg, and the clinical score decreased to an average of about 2 at 10 mg / kg.

［実施例５］
ｔＰＡ誘発性出血に対するP8改変ペプチドの抑制効果（その１）
次に，P8改変ペプチドの血管系に対する効果について着目した。脳梗塞治療薬として使用される血栓溶解剤ｔＰＡは，急性期における処置では梗塞自体を消失させることから有用である。しかし，副作用として脳出血を惹起することから，ｔＰＡを投与する際に画像診断が必要であり，更に虚血後4.5時間以内に投与する必要がある。そこで，P8改変ペプチドのｔＰＡ誘発性の副作用抑制効果の有無について解析を行った。ｔＰＡによる脳出血を有意に誘発させることを目的として，ｔＭＣＡＯモデルで虚血4時間処置後に10 mg／kg ｔＰＡを処置し，再還流を行う系を用いた。[Example 5]
Inhibitory effect of P8-modified peptide on tPA-induced bleeding (Part 1)
Next, we focused on the effects of P8-modified peptides on the vasculature. The thrombolytic agent tPA used as a therapeutic agent for cerebral infarction is useful because the infarction itself disappears during treatment in the acute phase. However, since cerebral hemorrhage is caused as a side effect, imaging diagnosis is necessary when administering tPA, and it is necessary to administer it within 4.5 hours after ischemia. Therefore, the presence or absence of the tPA-induced side effect suppression effect of the P8 modified peptide was analyzed. For the purpose of significantly inducing cerebral hemorrhage due to tPA, a system in which 10 mg / kg tPA was treated after 4 hours of ischemia treatment in the tMCAO model and reperfusion was used was used.

4時間のｔＭＣＡＯを行い，１日後にPBSを用いた還流により血液を序去し，灌流により除去できなかった脳組織内の血液を脳血管の破綻による出血とし，脳出血評価を実施した（図５）。ｔＰＡ 10mg／kg＋PBS，ｔＰＡ 10mg／kg＋ペプチド3mg／kgは再灌流直前に尾静脈投与した。齧歯類に対する４時間のｔＭＣＡＯは広域に渡り脳内出血を引き起こすことから，ヒトでｔＰＡ誘発性脳出血のリスクが高まる4.5時間以降に相当する。   After 4 days of tMCAO, blood was removed by refluxing with PBS one day later, and blood in the brain tissue that could not be removed by perfusion was regarded as bleeding due to cerebrovascular failure, and cerebral hemorrhage evaluation was performed (FIG. 5). ). tPA 10 mg / kg + PBS and tPA 10 mg / kg + peptide 3 mg / kg were administered via the tail vein immediately before reperfusion. Since 4 hours of tMCAO for rodents causes intracerebral hemorrhage over a wide area, it corresponds to after 4.5 hours when the risk of tPA-induced cerebral hemorrhage is increased in humans.

図５Ａは，ｔＭＣＡＯモデルにおける評価工程を示す。
図５Ｂは，ｔＭＣＡＯ虚血4時間後にｔＰＡとペプチドを併用した場合の大脳皮質および線条体における出血作用を示す写真である。図５Ｂには，対照（PBS）又はPep−35〜41を3mg／kg投与した際の写真が示されている。
図５Ｃは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にｔＰＡとペプチドを併用した場合の大脳皮質および線条体における出血作用を出血面積により定量的に解析したものである。FIG. 5A shows an evaluation process in the tMCAO model.
FIG. 5B is a photograph showing the bleeding action in the cerebral cortex and striatum when tPA and peptide are used together 4 hours after tMCAO ischemia. FIG. 5B shows a photograph when 3 mg / kg of control (PBS) or Pep-35 to 41 was administered.
FIG. 5C is a quantitative analysis of bleeding effects in the cerebral cortex and striatum when tPA and peptide are used together 4 hours after tMCAO ischemia based on the bleeding area.

図５Ｂ及びＣから，Pep−38及び41は，Pep−36，37及び40と比べて有意な出血抑制効果が見られた。したがって，P8改変ペプチドをｔＰＡと併用することにより，ｔＰＡの副作用である脳出血を抑制することが分かった。   From FIG. 5B and C, Pep-38 and 41 showed the significant bleeding suppression effect compared with Pep-36, 37, and 40. FIG. Therefore, it was found that cerebral hemorrhage, which is a side effect of tPA, is suppressed by using the P8 modified peptide together with tPA.

［実施例６］
ｔＰＡ誘発性出血に対するP8改変ペプチドの抑制効果（その２）
実施例５におけるP8改変ペプチドの効果を詳細に検証するため，ｔＭＣＡＯを行った１日後にエバンスブルー染色をした以外は実施例５と同様にして脳出血の評価を行った。血管が脆弱化している部分ではエバンスブルーが漏出するため染色される。[Example 6]
Inhibitory effect of P8-modified peptide on tPA-induced bleeding (Part 2)
In order to verify the effect of the P8 modified peptide in Example 5 in detail, cerebral hemorrhage was evaluated in the same manner as in Example 5 except that Evans blue staining was performed one day after tMCAO was performed. Evans blue leaks out in areas where blood vessels are weakened.

図６Ａは，ｔＭＣＡＯモデルにおける評価工程を示す。
図６Ｂは，ｔＭＣＡＯ虚血4時間後にｔＰＡとペプチドを併用した場合の大脳皮質および線条体における出血作用を示す写真である。図６Ｂには，対照（Vehicle），Pep−35，38，又は41を3mg／kg投与した際の写真が示されている。
図６Ｃは，ｔＭＣＡＯ虚血4時間後にペプチドとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血領域を定量的解析したものである。FIG. 6A shows an evaluation process in the tMCAO model.
FIG. 6B is a photograph showing bleeding action in the cerebral cortex and striatum when tPA and peptide are used together 4 hours after tMCAO ischemia. FIG. 6B shows a photograph when 3 mg / kg of vehicle (Vehicle), Pep-35, 38, or 41 was administered.
FIG. 6C is a quantitative analysis of bleeding regions in the cerebral cortex and striatum at the time of combined use of peptide and tPA 4 hours after tMCAO ischemia.

図６Ｂ及びＣから，P8改変ペプチドであるPep−38及び41は，ｔＰＡ誘発性の副作用である血管脆弱化及び出血を有意に抑制することが分かった。   6B and C, Pep-38 and 41, which are P8-modified peptides, were found to significantly suppress vascular weakening and bleeding, which are tPA-induced side effects.

本明細書中で述べられた全ての刊行物に記載された内容は，ここに引用されたことによって，その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。   The contents of all publications mentioned in this specification are hereby incorporated by reference herein to the same extent as if all were made explicit.

本発明の血液脳関門障害改善剤は，脳虚血により生じうる血液脳関門の脆弱化を改善することができる。従って，本発明の剤は血液脳関門障害に起因する疾患の治療薬となり得る。   The blood-brain barrier ameliorating agent of the present invention can improve the weakening of the blood-brain barrier that may occur due to cerebral ischemia. Therefore, the agent of the present invention can be a therapeutic agent for diseases caused by blood-brain barrier disorders.

配列番号１：ＰｒｏＴα８（Ｐ８，P+2N／−3C，Ｐｅｐ−３７）
配列番号２：Ｐ８改変ペプチド（P+2N／−3C改変，Ｐｅｐ−３８）
配列番号３：環状Ｐ８改変ペプチド（環状P+2N／−3C改変，Ｐｅｐ−４１）
配列番号４：P+2N／−4C（Ｐｅｐ−３５）
配列番号５：P+2N／−4C改変（Ｐｅｐ−３６）
配列番号６：P+2N／−2C（Ｐｅｐ−３９）
配列番号７：P+2N／−2C改変（Ｐｅｐ−４０）SEQ ID NO: 1 ProTα8 (P8, P + 2N / −3C, Pep-37)
SEQ ID NO: 2: P8 modified peptide (P + 2N / -3C modified, Pep-38)
SEQ ID NO: 3: Cyclic P8 modified peptide (Cyclic P + 2N / -3C modified, Pep-41)
Sequence number 4: P + 2N / -4C (Pep-35)
Sequence number 5: P + 2N / -4C modification (Pep-36)
Sequence number 6: P + 2N / -2C (Pep-39)
SEQ ID NO: 7: P + 2N / -2C modification (Pep-40)

Claims (13)

配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩ペプチド。   A peptide consisting of an amino acid sequence in which one amino acid is substituted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt peptide thereof. 請求項１に記載のペプチドまたはその塩であって，
前記「配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列」中の２個のアミノ酸が結合してなるペプチドまたはその塩。The peptide according to claim 1 or a salt thereof,
A peptide obtained by binding two amino acids in the “amino acid sequence in which one amino acid is substituted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1” or a salt thereof. 請求項１に記載のペプチドまたはその塩であって，
前記「配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるペプチド」が，
配列番号２または配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなる，ペプチドまたはその塩。The peptide according to claim 1 or a salt thereof,
The above-mentioned “peptide consisting of an amino acid sequence in which one amino acid is substituted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1”
A peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or a salt thereof. 請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤。   The therapeutic agent of the disease accompanying the blood organ barrier disorder which contains the peptide of Claim 1 or its salt as an active ingredient. 請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤。   The therapeutic agent of the disease accompanying the blood-brain barrier disorder which contains the peptide of Claim 1 or its salt as an active ingredient. 請求項５に記載の血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤であって，
前記血液脳関門障害を伴う疾患が，アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害，一過性血流障害，高血圧性脳障害，頭蓋内外の動脈の塞栓症，血栓症に起因する梗塞，動脈瘤，動静脈奇形，脳動脈狭窄性病変，硬膜動静脈瘻，血管外傷，血管性腫瘍，ウィルス感染性脳炎，脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫，又は脳梗塞後の脆弱性血管新生による出血疾患である，
血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤。A therapeutic agent for a disease associated with blood-brain barrier disorder according to claim 5,
Infarction caused by atherosclerosis or hypertension secondary vascular disorder, transient blood flow disorder, hypertensive cerebral disorder, intracranial or external artery embolism, thrombosis , Aneurysm, arteriovenous malformation, cerebral artery stenotic lesion, dural arteriovenous fistula, vascular trauma, vascular tumor, viral infectious encephalitis, edema due to vascularization after cerebral infarction, or vulnerability after cerebral infarction A bleeding disorder caused by angiogenesis,
A therapeutic agent for diseases associated with blood-brain barrier disorders. 請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む虚血性疾患の治療剤。   A therapeutic agent for ischemic disease comprising the peptide according to claim 1 or a salt thereof as an active ingredient. 請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む脳梗塞の治療剤。   A therapeutic agent for cerebral infarction comprising the peptide according to claim 1 or a salt thereof as an active ingredient. 請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む，
血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血の治療剤又は予防剤。Containing the peptide of claim 1 or a salt thereof as an active ingredient,
A therapeutic or prophylactic agent for movement disorders or cerebral hemorrhage caused by a thrombolytic agent. 請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む神経細胞死抑制剤。   The nerve cell death inhibitor which contains the peptide of Claim 1 or its salt as an active ingredient. 請求項１に記載のペプチドまたはその塩，及び血栓溶解剤を有効成分として含む，
脳虚血性疾患用治療剤。 Comprising the peptide of claim 1 or a salt thereof, and a thrombolytic agent as active ingredients,
A therapeutic agent for cerebral ischemic disease. 請求項１１に記載の脳虚血性疾患用治療剤であって，前記血栓溶解剤が，プラスミノーゲンアクチベータである，治療剤。   The therapeutic agent for cerebral ischemic disease according to claim 11, wherein the thrombolytic agent is a plasminogen activator. 請求項１１に記載の脳虚血性疾患用治療剤であって， 脳虚血性疾患が脳梗塞である，治療剤。   The therapeutic agent for cerebral ischemic disease according to claim 11, wherein the cerebral ischemic disease is cerebral infarction.

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