JPWO2014200068A1 - Hypoxic culture of mesenchymal stem cells - Google Patents

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重良 藤原
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Abstract

未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞の新規な培養方法を提供する。未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法。A novel method for culturing mesenchymal stem cells maintaining undifferentiated and healthy properties is provided. A method for culturing mesenchymal stem cells maintaining undifferentiated and healthy conditions, and culturing mesenchymal stem cells at an oxygen concentration suitable for maintaining undifferentiated and healthy mesenchymal stem cells A method comprising:

Description

本発明は、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法に関する。   The present invention is a method for culturing mesenchymal stem cells that maintain undifferentiated and healthy, and mesenchymal in an oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy of mesenchymal stem cells. The present invention relates to a method comprising culturing a stem cell.

近年の医学の目覚しい進歩により、疾患の原因の除去、例えば癌の外科的切除といった対症療法的な治療技術、あるいは組織・臓器の生体移植技術などにより、人命の救われる機会は益々高まりつつある。しかしながら、患部切除に伴い、患者は治療後のＱＯＬの大幅な低下に悩まされることがある。また、移植ドナーの不足、拒絶反応など、生体移植を頼りとする治療にも限界がある。外科的治療又は不慮の事故で失われた組織、器官、臓器などを再生させることが可能となれば、患者のＱＯＬを大幅に改善することができる。また、再生医療は生体移植が抱える問題の解消も図ることが可能である。その観点で再生医療に対する期待度は高い。   Due to remarkable advances in medicine in recent years, opportunities for saving human lives are increasing more and more by removing the cause of diseases, for example, symptomatic treatment techniques such as surgical excision of cancer, or tissue / organ transplantation techniques. However, with excision of the affected area, the patient may suffer from a significant decrease in QOL after treatment. In addition, there are limits to treatments that rely on living transplantation, such as a lack of transplant donors and rejection. If it becomes possible to regenerate tissues, organs, organs, etc. lost due to surgical treatment or accidents, the QOL of the patient can be greatly improved. Regenerative medicine can also solve the problems of living transplantation. In that respect, expectations for regenerative medicine are high.

これに関して、間葉系幹細胞は、間葉系に属する細胞（骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）への分化能を有することから、近年、骨や血管、心筋の再構築などの再生医療への応用についての研究が広く行われている。再生医療の実現のためには、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞の大量入手が必要となるが、間葉系幹細胞の継代培養では、十分な量の活性な細胞を獲得することは困難であった。例えば、間葉系幹細胞である毛乳頭細胞の継代培養を行なった場合、増殖性の極端な低下や毛包誘導能の喪失が認められ、これらの性質を維持することは困難であることが知られている（Jahoda CAB et al. (1984) Nature 311 : 560-562）。   In this regard, mesenchymal stem cells have the ability to differentiate into cells belonging to the mesenchymal system (bone cells, cardiomyocytes, chondrocytes, tendon cells, adipocytes, etc.). Research on application to regenerative medicine such as construction has been widely conducted. In order to realize regenerative medicine, it is necessary to obtain a large amount of mesenchymal stem cells that maintain undifferentiated and healthy conditions, but a sufficient amount of active cells can be obtained by subculture of mesenchymal stem cells. It was difficult to do. For example, when subcultures of dermal papilla cells that are mesenchymal stem cells are observed, it is difficult to maintain these properties due to the extreme decrease in proliferation and loss of hair follicle induction ability. (Jahoda CAB et al. (1984) Nature 311: 560-562).

これまでに、Sox2やNanogなどの特定の遺伝子を間葉系幹細胞に導入することにより、増殖・分化能を維持した間葉系幹細胞の培養方法については知られているが（特開2009-11254号公報）、一定の低酸素濃度条件下で培養することにより、in vitroで長期にわたって間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持できることについては知られていない。   So far, a method for culturing mesenchymal stem cells that has maintained proliferation / differentiation ability by introducing a specific gene such as Sox2 or Nanog into mesenchymal stem cells is known (JP 2009-11254 A). No.), it is not known that the undifferentiated and healthy state of mesenchymal stem cells can be maintained in vitro for a long period of time by culturing under certain low oxygen concentration conditions.

特開2009-11254号公報JP 2009-11254 特開2012-157263号公報JP 2012-157263 A 特開平7-274950号公報JP 7-274950 A

Jahoda CAB et al. (1984) Nature 311 : 560-562Jahoda CAB et al. (1984) Nature 311: 560-562 Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol.10, No.1, Jan. 2004Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol.10, No.1, Jan. 2004

本発明の課題は、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞の新規な培養方法を提供することにある。   An object of the present invention is to provide a novel method for culturing mesenchymal stem cells maintaining undifferentiated and healthy properties.

本発明者は、メタボローム解析及びＤＮＡアッセイ解析を行い、鋭意研究を行った結果、一定の低酸素濃度条件下で間葉系幹細胞を培養することにより、その未分化性及び健常性を維持させることが可能となる、という驚くべき知見を得た。   The present inventor has conducted metabolomic analysis and DNA assay analysis, and as a result of earnest research, has maintained its undifferentiation and normality by culturing mesenchymal stem cells under certain low oxygen concentration conditions I got a surprising finding that it is possible.

従って、本願は以下の発明を包含する：
［１］ 未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法。
［２］ 間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約１％超から約２１％未満であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［３］ 間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約３％から約７％であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［４］ 間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約１％超から約５％以下であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［５］ 間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約５％であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［６］ 前記間葉系幹細胞が真皮毛根鞘（ＤＳ）細胞であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］ 前記間葉系幹細胞が脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。Accordingly, this application includes the following inventions:
[1] A method for culturing mesenchymal stem cells maintaining undifferentiated and healthy conditions, the mesenchymal system at an oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy characteristics of mesenchymal stem cells Culturing the stem cells.
[2] The method according to [1], wherein the oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy state of mesenchymal stem cells is more than about 1% to less than about 21%.
[3] The method according to [1], wherein the oxygen concentration suitable for maintaining undifferentiated and healthy mesenchymal stem cells is about 3% to about 7%.
[4] The method according to [1], wherein the oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy state of the mesenchymal stem cells is more than about 1% to about 5% or less.
[5] The method according to [1], wherein the oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy state of mesenchymal stem cells is about 5%.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the mesenchymal stem cells are dermal root sheath (DS) cells.
[7] The method according to any one of [1] to [5], wherein the mesenchymal stem cells are adipose-derived mesenchymal stem cells.

本発明により、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を大量に得ることができる。   According to the present invention, a large amount of mesenchymal stem cells maintaining undifferentiated and healthy properties can be obtained.

各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）におけるNAD+/NADH 量の比較を示す。A comparison of the amount of NAD + / NADH in subcutaneous fat-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under various oxygen concentration (1%, 5%, 21%) conditions is shown. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における還元型グルタチオン（GSH）、酸化型グルタチオン（GSSG）及びシステイン（Cys）の量、ならびにGSH／GSSG 比の比較を示す。The amount of reduced glutathione (GSH), oxidized glutathione (GSSG) and cysteine (Cys) in subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under various oxygen concentrations (1%, 5%, 21%) And a comparison of the GSH / GSSG ratio. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）におけるグルコース６リン酸（G6P）、乳酸及びATPの量の比較を示す。A comparison of the amounts of glucose 6-phosphate (G6P), lactic acid and ATP in subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under each oxygen concentration (1%, 5%, 21%) condition is shown. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における、グルコース６リン酸及びリブロース５リン酸の量の比較を示す。A comparison of the amounts of glucose 6-phosphate and ribulose 5-phosphate in subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under various oxygen concentration (1%, 5%, 21%) conditions is shown. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）におけるベータカテニン（CTNNB1）、カゼインキナーゼ１D(CSNK1D)、及びPPARγ(PPARG)の遺伝子発現量の比較を示す。Expression of beta-catenin (CTNNB1), casein kinase 1D (CSNK1D), and PPARγ (PPARG) in subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under various oxygen concentrations (1%, 5%, 21%) A comparison of quantities is shown. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における白血病抑制因子受容体（LIFR）及びＴ細胞因子−４（TCF-4）の遺伝子発現量の比較を示す。Leukemia inhibitory factor receptor (LIFR) and T cell factor-4 (TCF-4) genes in subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under various oxygen concentrations (1%, 5%, 21%) Comparison of expression levels is shown. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における塩基性繊維芽細胞増殖因子（FGF2）の遺伝子発現量の比較を示す。A comparison of gene expression levels of basic fibroblast growth factor (FGF2) in subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under various oxygen concentration (1%, 5%, 21%) conditions is shown. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における血管内皮細胞増殖因子（VEGFA）及びトランスフォーミング増殖因子２（TGFB2）の遺伝子発現量の比較を示す。Gene expression levels of vascular endothelial growth factor (VEGFA) and transforming growth factor 2 (TGFB2) in subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under various oxygen concentrations (1%, 5%, 21%) A comparison of is shown. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した真皮毛根鞘（DS）細胞におけるアルカリフォスファターゼ（AP）活性の比較を示す。A comparison of alkaline phosphatase (AP) activity in dermal hair sheath (DS) cells cultured under various oxygen concentration (1%, 5%, 21%) conditions is shown. 各酸素濃度（5%, 21%）条件下で培養した真皮毛根鞘（DS）細胞における還元型グルタチオン（GSH）及び酸化型グルタチオン（GSSG）の量、ならびにGSH／GSSG 比の比較を示す。The amount of reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG) and the GSH / GSSG ratio in dermal root sheath (DS) cells cultured under various oxygen concentration (5%, 21%) conditions are shown. 各酸素濃度（5%, 21%）条件下で培養した真皮毛根鞘（DS）細胞におけるヒポキサンチンの量の比較を示す。The comparison of the amount of hypoxanthine in the dermal root sheath (DS) cell cultured under each oxygen concentration (5%, 21%) condition is shown. 各酸素濃度（5%, 21%）条件下で培養した真皮毛根鞘（DS）細胞における解糖系（G6P, F6P, F1,6P, 3PG, ホスホエノールピルビン酸, 乳酸）の量の比較を示す。Comparison of the amount of glycolysis (G6P, F6P, F1,6P, 3PG, phosphoenolpyruvate, lactic acid) in dermal root sheath (DS) cells cultured under various oxygen concentrations (5%, 21%) . 各酸素濃度（5%, 21%）条件下で培養した真皮毛根鞘（DS）細胞におけるNADHの量、及びNADH／NAD+ 比の比較を示す。A comparison of the amount of NADH and the NADH / NAD + ratio in dermal root sheath (DS) cells cultured under various oxygen concentration (5%, 21%) conditions is shown. 各酸素濃度（5%, 21%）条件下で培養した真皮毛根鞘（DS）細胞における各因子（GSK-3β, OCT-4)のウェスタンブロットの解析結果を示す（HIF-1αは検出不可のためデータ無し）。Western blot analysis of each factor (GSK-3β, OCT-4) in dermal root sheath (DS) cells cultured under various oxygen concentration (5%, 21%) conditions (HIF-1α is not detectable) Therefore no data). 各酸素濃度（5%, 21%）条件下で培養した真皮毛根鞘（DS）細胞におけるWnt3Aを用いたルシフェラーゼアッセイの解析結果を示す。The analysis result of the luciferase assay using Wnt3A in the dermal root sheath (DS) cell cultured under each oxygen concentration (5%, 21%) condition is shown.

本発明は、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法を提供する。   The present invention is a method for culturing mesenchymal stem cells that maintain undifferentiated and healthy, and mesenchymal in an oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy of mesenchymal stem cells. A method is provided that comprises culturing a stem cell.

間葉系幹細胞は、脂肪、臍帯、骨髄中、滑膜などに存在する、多分化能を有する体性幹細胞である。間葉系幹細胞は種々の中胚葉細胞、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、心筋細胞及び血管内皮細胞に分化することができる。間葉系幹細胞はその多分化能から、骨、関節、筋肉、肝臓、腎臓、心臓、中枢神経系及び膵臓等の臓器再生医療への応用が期待されており、例えば、間葉系幹細胞の移植による心筋梗塞、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、自己免疫疾患、慢性腎不全、変形性関節症、脳梗塞、ならびに脳神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病）等の治療に関する研究が進められている（例えば特開2012-157263号公報を参照のこと）。   Mesenchymal stem cells are somatic stem cells having multipotency that are present in fat, umbilical cord, bone marrow, synovium, and the like. Mesenchymal stem cells can differentiate into various mesodermal cells such as osteoblasts, chondrocytes, skeletal muscle cells, cardiomyocytes and vascular endothelial cells. Mesenchymal stem cells are expected to be applied to regenerative medicine for organs such as bone, joint, muscle, liver, kidney, heart, central nervous system and pancreas due to their multipotency. For example, transplantation of mesenchymal stem cells Myocardial infarction, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), autoimmune disease, chronic renal failure, osteoarthritis, cerebral infarction, and cranial nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease) Research related to such treatments is underway (see, for example, JP 2012-157263 A).

本発明において培養できる間葉系幹細胞は、あらゆる哺乳動物、例えばヒト、チンパンジー、その他の霊長類、家畜動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、他に実験用動物、例えばラット、マウス、モルモット、より好ましくはヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットの脂肪、臍帯、骨髄中、滑膜に由来し得るが、ヒトへの移植や、研究用の三次元モデルの製造の観点から、ヒト由来の細胞が好ましい。間葉系幹細胞は、好ましくは真皮毛根鞘（ＤＳ）細胞又は脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）であり、特に好ましくはＤＳ細胞である。ＤＳ細胞は、真皮毛根鞘に存在する細胞であり、間葉系細胞の一種として知られている。真皮毛根鞘（DS；Dermal sheath)は、結合組織性毛鞘や結合組織鞘とも呼ばれることもあり、上皮性の外毛根鞘を取り囲む真皮性の組織である。また、毛乳頭（ＤＰ；hair papilla）細胞はＤＳ細胞に由来するとされており、中でも、発毛期でのＤＰ細胞の増殖に先駆けて、真皮毛根鞘（ＤＳ）のうち特に毛乳頭に近い基底部位である真皮毛根鞘カップ（ＤＳＣ）領域に由来する細胞が増殖することから、ＤＳ細胞、特にＤＳＣ領域に由来する細胞（ＤＳＣ細胞とも称する）がＤＰ細胞を供給すると考えられている。   Mesenchymal stem cells that can be cultured in the present invention may be any mammal, such as humans, chimpanzees, other primates, livestock animals such as dogs, cats, rabbits, horses, sheep, goats, cows, pigs, and other experimental animals. For example, rat, mouse, guinea pig, more preferably nude mouse, skid mouse, nude rat fat, umbilical cord, bone marrow, synovial, but can be used for transplantation into humans or production of 3D models for research. From the viewpoint, human-derived cells are preferred. The mesenchymal stem cells are preferably dermal root sheath (DS) cells or adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC), and particularly preferably DS cells. DS cells are cells present in the dermal root sheath and are known as a kind of mesenchymal cells. The dermal sheath (DS) is also called a connective tissue sheath or connective tissue sheath, and is a dermal tissue that surrounds the epithelial outer root sheath. In addition, hair papilla (DP) cells are said to be derived from DS cells. In particular, prior to the proliferation of DP cells in the hair growth stage, the dermal root sheath (DS) is particularly close to the base of hair papilla. Since cells derived from the dermal root sheath (DSC) region, which is a site, proliferate, it is considered that DS cells, particularly cells derived from the DSC region (also referred to as DSC cells) supply DP cells.

また、本発明において培養できる間葉系幹細胞は、上記哺乳動物の組織から初代培養により取得された細胞であってもよいし、継代培養により取得された細胞であってもよく、また、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、及びＥＳ細胞から分化誘導されて得られた細胞であってもよい。移植を行う観点からは、移植対象から取得した細胞を継代培養により増殖させた細胞が好ましい。   In addition, the mesenchymal stem cell that can be cultured in the present invention may be a cell obtained by primary culture from the above mammalian tissue, may be a cell obtained by subculture, or may be a body. It may be a cell obtained by inducing differentiation from a sex stem cell, iPS cell, or ES cell. From the viewpoint of transplantation, cells obtained by proliferating cells obtained from the transplantation subject by subculture are preferred.

本発明において使用することができる基礎培地は、ヒトや動物の細胞の培養に用いられる培地ならば特に制限されないが、市販の栄養培地をそのまま、または改性したもので培養することができる。間葉系幹細胞を培養するために使用できる代表的な培地としては、ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地（Gibco社）やチャン培地(Irvine Scientific）が挙げられるが、移植を行う観点からは、無血清培地であることが好ましい。多様な種類の無血清培地が市販されており、例えば、HFDM-1 (+) (細胞科学研究所）、HFDM-1 (-) (細胞科学研究所）、StemPro MSC SFM CTS（sup+） (Lifetechnologies)、StemPro MSC SFM CTS（sup-） (Lifetechnologies)、Mosaic hMSC SF Culture Medium (sup+) (BD)などが挙げられる。これらの市販培地の組成として、HFDM-1 (-)は、基礎培地 RITC80-7、インスリン5 μg/ml、 デキサメサゾン10-7Mを含有しており、HFDM-1 (+)は、これらに加えて、EGF 10 ng/mlを含有することが知られている。The basal medium that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a medium used for culturing human or animal cells. However, a commercially available nutrient medium can be used as it is or modified. Typical media that can be used for culturing mesenchymal stem cells include Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) and Chang's medium (Irvine Scientific) containing fetal bovine serum, but from the viewpoint of transplantation, A serum-free medium is preferred. Various types of serum-free media are commercially available, such as HFDM-1 (+) (Cell Science Laboratory), HFDM-1 (-) (Cell Science Laboratory), StemPro MSC SFM CTS (sup +) (Lifetechnologies ), StemPro MSC SFM CTS (sup-) (Lifetechnologies), Mosaic hMSC SF Culture Medium (sup +) (BD), and the like. As the composition of these commercial media, HFDM-1 (-) contains basal media RITC80-7, insulin 5 μg / ml, dexamethasone 10 -7 M, and HFDM-1 (+) It is known to contain 10 ng / ml of EGF.

基礎培地には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含んでもよい。ＰＤＧＦは、主に間葉系幹細胞（線維芽細胞、平滑筋細胞、グリア細胞等）の遊走や増殖などの調節に関与する増殖因子であり、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーに属する。主に巨核球によって産生されるほか、血小板のα顆粒中にも含まれ、上皮細胞や内皮細胞などの様々な細胞によって産生されることが知られている。ＰＤＧＦは、Ａ鎖、Ｂ鎖、Ｃ鎖及びＤ鎖により、ＰＤＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの少なくとも４種類が存在している。これらはいずれも、ホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成し、ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、−ＢＢ、−ＣＣ、−ＤＤの５種類のアイソフォームが存在することが知られている。これらのうち、ＰＤＧＦ−ＢＢが特に好ましい。基礎培地に添加されるＰＤＧＦの添加量は特に制限されるものではないが、例えば0.01 ng/ml〜10 μg/ml、好ましくは0.1 ng/ml〜100 ng/ml、より好ましくは1〜10 ng/ml程度である。   The basal medium may contain platelet derived growth factor (PDGF). PDGF is a growth factor mainly involved in the regulation of migration and proliferation of mesenchymal stem cells (fibroblasts, smooth muscle cells, glial cells, etc.), and belongs to the PDGF / VEGF family. In addition to being produced mainly by megakaryocytes, it is also contained in platelet α-granule and is known to be produced by various cells such as epithelial cells and endothelial cells. There are at least four types of PDGF, PDGF-A, B, C and D, depending on the A chain, B chain, C chain and D chain. All of these form homodimers or heterodimers, and it is known that there are five types of isoforms of PDGF-AA, -AB, -BB, -CC, and -DD. Of these, PDGF-BB is particularly preferred. The amount of PDGF added to the basal medium is not particularly limited. For example, 0.01 ng / ml to 10 μg / ml, preferably 0.1 ng / ml to 100 ng / ml, more preferably 1 to 10 ng. About / ml.

また、基礎培地には、Ｗｎｔシグナル活性化剤を添加してもよい。Ｗｎｔシグナルとは、β−カテニンの核移行を促し、転写因子としての機能を発揮する一連の作用をいう。本シグナルは細胞間相互作用に起因し、例えば、ある細胞から分泌されたＷｎｔ３Ａというタンパクがさらに別の細胞に作用し、細胞内のβ−カテニンが核移行し、転写因子として作用する一連の流れが含まれる。一連の流れは上皮間葉相互作用を例とする器官構築の最初の現象を引き起こす。Ｗｎｔシグナルはβ−カテニン経路、ＰＣＰ経路、Ｃａ2+経路の三つの経路を活性化することにより、細胞の増殖や分化、器官形成や初期発生時の細胞運動など各種細胞機能を制御することで知られる。Ｗｎｔシグナルがもつその未分化状態維持機能により、分化を抑制する目的でＥＳ細胞の培養の際に利用されている（例えば、Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol.10, No.1, Jan. 2004)。Further, a Wnt signal activator may be added to the basal medium. The Wnt signal refers to a series of actions that promote the nuclear translocation of β-catenin and exert a function as a transcription factor. This signal is caused by cell-cell interaction. For example, a protein called Wnt3A secreted from one cell acts on another cell, and β-catenin in the cell translocates to the nucleus and acts as a transcription factor. Is included. A series of flows causes the first phenomenon of organ construction, exemplified by epithelial-mesenchymal interactions. Wnt signal activates three pathways, β-catenin pathway, PCP pathway, and Ca 2+ pathway, thereby controlling various cell functions such as cell proliferation and differentiation, organ formation, and cell movement during early development. known. Due to its undifferentiated state maintaining function of the Wnt signal, it is used in the culture of ES cells for the purpose of suppressing differentiation (for example, Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol. 10, No. 1, Jan. 2004).

Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、特に限定されるわけではないが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の阻害活性を示すものであればいかなるものでもよく、例えばビス−インドロ（インジルビン）化合物（ＢＩＯ）（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、そのアセトキシム類似体ＢＩＯ−アセトキシム（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム）、チアジアゾリジン（ＴＤＺＤ）類似体（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、オキソチアジアゾリジン―３−チオン類似体（２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン）、チエニルα−クロロメチルケトン化合物（２−クロロ−１−（４，４−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物（α−４−ジブロモアセトフェノン）、チアゾール含有尿素化合物（Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ユレア）やＧＳＫ−３βペプチド阻害剤、例えばＨ−ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ2、さらには塩化リチウムなどが挙げられる。また、ＣＴ９９０２１（分子量：４６５．３４，純度：９９．１％，ＣＡＳ Ｎｏ：２５２９１７−０６−９，別名：ＣＨＩＲ９９０２１）は非常に強力な選択的ＧＳＫ−３阻害物質として知られ、マウスＥＳ細胞培養時に、ＰＤ１８４３５２（ＭＥＫ／ＭＡＰＫ阻害物質）やＳＵ５４０２（ＦＧＦＲ阻害物質）と共に使用することにより、長期培養を可能にする。The Wnt signal activator is not particularly limited, and any Wnt signal activator may be used as long as it exhibits inhibitory activity for glycogen synthase kinase-3 (GSK-3). For example, a bis-indolo (indirubin) compound ( BIO) ((2′Z, 3′E) -6-bromoindirubin-3′-oxime), its acetoxime analog BIO-acetoxime (2′Z, 3′E) -6-bromoindirubin-3 ′ -Acetoxime), thiadiazolidine (TDZD) analog (4-benzyl-2-methyl-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione), oxothiadiazolidine-3-thione analog (2 , 4-Dibenzyl-5-oxothiadiazolidine-3-thione), thienyl α-chloromethyl ketone compound (2-chloro-1- (4,4-dibromo-thi Phen-2-yl) -ethanone), phenyl α bromomethyl ketone compound (α-4-dibromoacetophenone), thiazole-containing urea compound (N- (4-methoxybenzyl) -N ′-(5-nitro-1,3) -Thiazol-2-yl) urea) and GSK-3β peptide inhibitors such as H-KEAPPAPPQSpP-NH 2 and lithium chloride. CT99021 (molecular weight: 465.34, purity: 99.1%, CAS No: 252917-06-9, also known as CHIR99021) is known as a very potent selective GSK-3 inhibitor, and is a mouse ES cell culture. Sometimes used with PD184352 (MEK / MAPK inhibitor) or SU5402 (FGFR inhibitor) to enable long-term culture.

Ｗｎｔシグナル活性化剤の添加量は特に制限されるものではなく、Ｗｎｔシグナル活性化、換言すれば、ＧＳＫ−３の阻害が奏され、且つ細胞増殖が停止しない量であればよく、使用する薬剤の種類及び増殖すべき細胞の種類に依存し、当業者により適宜決定されるであろう。例えば、Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＢＩＯを使用する場合、その量は、例えば0.01 μM〜100 μM、好ましくは0.1 μM〜10 μM、より好ましくは10 μM程度である。また、Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＣＴ９９０２１を使用する場合、その量は、例えば0.1〜10 μM、最適には1 μM程度である。   The addition amount of the Wnt signal activator is not particularly limited, and may be any amount that activates Wnt signal, in other words, inhibits GSK-3 and does not stop cell growth. Depending on the type of cell and the type of cell to be proliferated, and will be determined by those skilled in the art. For example, when BIO is used as the Wnt signal activator, the amount is, for example, 0.01 μM to 100 μM, preferably 0.1 μM to 10 μM, and more preferably about 10 μM. When CT99021 is used as the Wnt signal activator, the amount is, for example, about 0.1 to 10 μM, and optimally about 1 μM.

さらに、無血清培地には、必要に応じてほかの細胞増殖因子、ホルモンやその他の微量栄養素を加えることができる。これらの具体的なものとして、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β１，２，３（ＴＧＦβ１，２，３）、骨形成因子（ＢＭＰ）又はインスリン様成長因子−１，２（ＩＧＦ−１，２）を使用する場合、その量は、例えば0.1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。リン脂質（例えば、フォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、エタノールアミン）を使用する場合、その量は、例えば0.1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。脂肪酸（例えば、リノール酸、オレイン酸、アラキドン酸を使用する場合、その量は、例えば0.001 μg/ml 〜100 μg/ml程度である。プロスタグランジン類を使用する場合、その量は0.1 ng/ml 〜 100 ng/ml 程度である。還元剤（例えば、アスコルビン酸、還元型グルタチオン）を使用する場合、その量は、例えば1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。メルカプトエタノールを使用する場合、その量は、例えば0.1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。トランスフェリン又はインスリンを使用する場合、その量は0.01 μg/ml〜100 μg/ml程度である。デキサメタゾンを使用する場合、その量は0.000001 μM〜0.1 μM程度である。トリヨードチロニンを使用する場合、その量は0.1 pM〜100 pM程度である。グルカゴンを使用する場合、その量は0.0001 μM〜0.1 μM程度である。コレステロールを使用する場合、その量は、例えば0.1μg/ml〜100μg/ml程度である。ハイドロコーチゾンを使用する場合、その量は、例えば0．01 μg/ml〜10 μg/ml程度である。テストステロンを使用する場合、その量は、例えば0.1 μM〜100 μM程度である。エストラジオール又はプロゲステロンを使用する場合、その量は、例えば0．01 ng/ml〜100 ng/ml程度である。微量元素（例えば、銅、亜鉛、コバルト、マンガン、モリブデン、セレン）を使用する場合、その量は、例えば0.000001 mg/ml〜0.1 mg/ml程度である。アルブミン、ファイブロネクチン又はビトロネクチンを使用する場合、その量は、例えば0．1 μg/ml〜1000 μg/ml程度である。   Furthermore, other cell growth factors, hormones and other micronutrients can be added to the serum-free medium as necessary. Specific examples of these include, for example, epidermal growth factor (EGF), tumor necrosis factor α (TNFα), hepatocyte growth factor (HGF), fibroblast growth factor 7 (FGF7), vascular endothelial growth factor (VEGF). Basic fibroblast growth factor (bFGF), transforming growth factor β1,2,3 (TGFβ1,2,3), bone morphogenetic factor (BMP) or insulin-like growth factor-1,2 (IGF-1,2) ) Is, for example, about 0.1 μg / ml to 100 μg / ml. When using a phospholipid (for example, phosphatidic acid, phosphatidylinositol, ethanolamine), the amount is, for example, about 0.1 μg / ml to 100 μg / ml. When using fatty acids (for example, linoleic acid, oleic acid, arachidonic acid, the amount is, for example, about 0.001 μg / ml to 100 μg / ml. When using prostaglandins, the amount is 0.1 ng / ml. When using a reducing agent (for example, ascorbic acid, reduced glutathione), the amount is, for example, about 1 μg / ml to 100 μg / ml. In this case, the amount is, for example, about 0.1 μg / ml to 100 μg / ml, and when using transferrin or insulin, the amount is about 0.01 μg / ml to 100 μg / ml. The amount is about 0.000001 μM to 0.1 μM.When triiodothyronine is used, the amount is about 0.1 pM to 100 pM.When glucagon is used, the amount is about 0.0001 μM to 0.1 μM. Use cholesterol In the case where hydrocortisone is used, the amount is, for example, about 0.01 μg / ml to 10 μg / ml, and testosterone is used. When using estradiol or progesterone, the amount is, for example, about 0.01 ng / ml to 100 ng / ml. (Copper, zinc, cobalt, manganese, molybdenum, selenium), the amount is, for example, about 0.000001 mg / ml to 0.1 mg / ml.When using albumin, fibronectin or vitronectin, the amount is For example, it is about 0.1 μg / ml to 1000 μg / ml.

このような培地において、間葉系幹細胞の培養は、通常、培養皿を用い、「間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度」において、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃のインキユベーター内に静置して行い、アウトグロースが確認されたら、培地を交換してさらに培養を続けることに(継代培養)より実施する。こうして得られる培養細胞はさらに必要な継代数にわたって、継代培養を行う。継代は間葉系幹細胞の所望する量が達成されるまで行なうことができ、たとえば10回以上の継代、所望量が多い場合は好ましくは15回以上、さらに好ましくは20回以上まで継代を行なうことができる。In such a medium, culture of mesenchymal stem cells is usually performed using a culture dish, and in a “oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy state of mesenchymal stem cells” in a 5% CO 2 atmosphere. Then, it is allowed to stand in an incubator at 37 ° C. When outgrowth is confirmed, it is carried out by exchanging the medium and continuing the culture (subculture). The cultured cells thus obtained are further subcultured over the necessary number of passages. Passage can be performed until the desired amount of mesenchymal stem cells is achieved, for example, passage 10 times or more, preferably 15 times or more when the desired amount is large, more preferably 20 times or more. Can be performed.

本発明においては、「未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度」において間葉系幹細胞が培養されるが、ここで、「未分化性」とは、間葉系幹細胞が、骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞などの細胞へ分化しておらず、依然として、多分化能を有している状態を意味し、「健常性」とは、細胞毒性をもたらす活性酸素や炎症性サイトカインの発現量が少なく、正常な生存・増殖能を有している状態を意味する。   In the present invention, mesenchymal stem cells are cultured at “oxygen concentration suitable for maintaining undifferentiated and healthy”, but here, “undifferentiated” means that mesenchymal stem cells are It means a state that has not differentiated into cells such as bone cells, cardiomyocytes, chondrocytes, tendon cells, adipocytes, etc., and still has pluripotency, and “health” brings cytotoxicity It means a state where active oxygen and inflammatory cytokine are expressed in a small amount and have normal survival / proliferation ability.

このような間葉系幹細胞の「未分化性」や「健常性」は、メタボローム解析やＤＮＡアレイ解析により、間葉系幹細胞内に存在する代謝産物及び／又は発現遺伝子を網羅的に解析することによって、判定することができる。   Such “undifferentiation” and “health” of mesenchymal stem cells is to comprehensively analyze metabolites and / or expressed genes present in mesenchymal stem cells by metabolomic analysis or DNA array analysis. Can be determined.

メタボローム解析は、アミノ酸、アミン、ヌクレオチド、糖、脂質などを含む、細胞内の低分子代謝産物を包括的に分離し、これらを同定・定量することにより行われる。メタボローム解析において、用いることができる分離手法としては、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）が用いられる。これらの分離手法は一般に質量分析（ＭＳ）と組み合わせることで、分離−検出機器として利用される。なお、メタボローム解析は、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社などの解析サービスを提供している会社・機関に委託してもよい。   Metabolome analysis is performed by comprehensively separating intracellular low-molecular metabolites including amino acids, amines, nucleotides, sugars, lipids, etc., and identifying and quantifying them. Separation techniques that can be used in metabolomic analysis include gas chromatography (GC), liquid chromatography (LC), and capillary electrophoresis (CE). These separation techniques are generally used as a separation-detection instrument by being combined with mass spectrometry (MS). Metabolome analysis may be outsourced to a company / institution that provides analysis services such as Human Metabolome Technologies, Inc.

このように包括的に同定・定量された代謝産物の中から、間葉系幹細胞の未分化性や健常性に関与する因子を評価する。このような因子としては、生体内の酸化・還元反応やＡＴＰなどのエネルギー産生に関与する生体内低分子、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド関連（ＮＡＤ+／ＮＡＤＨ）、グルタチオン関連（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）、解糖系関連（グルコース６リン酸／乳酸／ＡＴＰ）、及びペントースリン酸回路関連（グルコース６リン酸／リブロース５リン酸）などが挙げられる。Among the metabolites comprehensively identified and quantified in this way, the factors involved in the undifferentiation and health of mesenchymal stem cells are evaluated. Such factors include small in vivo molecules involved in in vivo oxidation / reduction reactions and energy production such as ATP, such as nicotinamide adenine dinucleotide-related (NAD + / NADH), glutathione-related (GSH / GSSG) , Glycolysis-related (glucose 6-phosphate / lactic acid / ATP), pentose phosphate cycle-related (glucose 6-phosphate / ribulose 5-phosphate), and the like.

上述のメタボローム解析に加えて、マイクロアレイ解析により間葉系幹細胞の遺伝子発現量を網羅的に測定し、その中から、間葉系幹細胞の未分化性や健常性に関与する遺伝子を指標とすることにより、さらに包括的な評価を行うことができる。このような指標としては、幹細胞で特異的に発現する遺伝子や炎症性サイトカイン遺伝子、例えば、ベータカテニン（ＣＴＮＮＢ１）、カゼインキナーゼ１Ｄ（ＣＳＮＫ１Ｄ）、ＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲＧ）、白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）、Ｔ細胞因子−４（ＴＣＦ−４）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子２（ＴＧＦＢ２）、Frizzled ホモログ１（Drosophila）（ＦＲＺ−１）、Frizzled ホモログ４（Drosophila）（ＦＲＺ−４）などの遺伝子が挙げられる。   In addition to the above-described metabolome analysis, the gene expression level of mesenchymal stem cells is comprehensively measured by microarray analysis, and the genes involved in the undifferentiation and health of mesenchymal stem cells are used as indicators. Makes it possible to perform a more comprehensive evaluation. Examples of such indicators include genes specifically expressed in stem cells and inflammatory cytokine genes such as beta-catenin (CTNNB1), casein kinase 1D (CSNK1D), PPARγ (PPARG), leukemia inhibitory factor receptor (LIFR), T cell factor-4 (TCF-4), basic fibroblast growth factor (FGF2), vascular endothelial growth factor (VEGFA), transforming growth factor 2 (TGFB2), Frizzled homolog 1 (Drosophila) (FRZ-1) ) And Frizzled homolog 4 (Drosophila) (FRZ-4).

このように、間葉系幹細胞内に存在する代謝産物及び発現遺伝子を網羅的に解析することにより、「間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度」を決定することができる。このような酸素濃度は、具体的には、１％超から２１％（常酸素濃度）未満の低酸素濃度である。また、典型的には２％から１６％、好ましくは３％から１２％、より好ましくは３％から７％、更により好ましくは４％から６％、最も好ましくは５％である。   In this way, by comprehensively analyzing metabolites and expressed genes present in mesenchymal stem cells, the "oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy state of mesenchymal stem cells" is determined. can do. Such an oxygen concentration is specifically a low oxygen concentration of more than 1% to less than 21% (normal oxygen concentration). Also, it is typically 2% to 16%, preferably 3% to 12%, more preferably 3% to 7%, even more preferably 4% to 6%, and most preferably 5%.

好ましくは、このようにして培養した間葉系幹細胞をスフェア形成させる（特開平7-274950号公報）。スフェア形成は、飽和状態になるまで細胞を増殖させ、細胞を剥離した後、培地で懸濁させ、この細胞懸濁物を非接着処理した培養皿中の培地上に捲き、数日放置することにより丸い細胞塊（スフェロイド）の細胞集合体を形成することで行う。好ましくは、スフェア形成はｂＦＧＦの非存在下で行うが、ｂＦＧＦ存在下でも十分にスフェア形成は達成される。なお、スフェア形成を行う時期は特に制限されるものではなく、最後の継代を終えた培養細胞に対し行ってよい。スフェロイドを形成させる培養法として、ローラボトル培養、スピナーフラスコ培養、ハンギングドロップ培養などが知られており、また、凹陥部を有する培養容器や、細胞接着性の低いコーティングが施された培養容器が市販されている。さらに、細胞接着性領域と細胞非接着性領域が共存するようにコーティングがされ、細胞非接着性領域として、ホスホリルコリン（ＰＣ）基コーティングを用いた培養容器を用いて培養を行うことにより、サイズが揃ったスフェロイドを大量に形成することが可能になった。   Preferably, the mesenchymal stem cells cultured in this way are sphere-formed (Japanese Patent Laid-Open No. 7-274950). For sphere formation, the cells are grown until they reach saturation, the cells are detached, suspended in a medium, and the cell suspension is spread on a medium in a non-adherent culture dish and left for several days. To form a round cell cluster (spheroid) cell aggregate. Preferably, sphere formation is performed in the absence of bFGF, but sphere formation is sufficiently achieved even in the presence of bFGF. In addition, the time in which sphere formation is performed is not particularly limited, and may be performed on cultured cells after the last passage. Known culture methods for forming spheroids include roller bottle culture, spinner flask culture, and hanging drop culture, and commercially available culture vessels with concave portions or coatings with low cell adhesion coating. Has been. Further, the cell adhesion region and the cell non-adhesion region are coated so that the cell non-adhesion region is coexisted. It became possible to form a large number of aligned spheroids.

このようにして調製したスフェア化した間葉系幹細胞は、多分化能を維持しており、したがって、間葉系幹細胞の分化のメカニズムの解明のために研究のin vitro実験や、再生医療などのために利用できる。   The sphered mesenchymal stem cells prepared in this way maintain pluripotency. Therefore, in order to elucidate the mechanism of mesenchymal stem cell differentiation, research in vitro experiments, regenerative medicine, etc. Available for.

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.

１−１）皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）の培養
資生堂リサーチセンター（新横浜）にて、１％、５％又は２１％の酸素、各５％の二酸化炭素、その他のバランスとして窒素を充填した標準ガスを準備し、該標準ガスを用いて密閉容器内でＡＤＳＣ（Invitrogenn社から購入）を培養した。培養は、StemPro SFM MSC（Gibco社）を培地として用い、容器をインキュベーター内に静置して３７℃で行った。1-1) Culture of subcutaneous fat-derived mesenchymal stem cells (ADSC) Filled with 1%, 5% or 21% oxygen, 5% carbon dioxide, and nitrogen as the other balance at Shiseido Research Center (Shin Yokohama) The prepared standard gas was prepared, and ADSC (purchased from Invitrogenn) was cultured in a sealed container using the standard gas. Culturing was performed at 37 ° C. using StemPro SFM MSC (Gibco) as a medium and the container left still in an incubator.

１−２）ＡＤＳＣのメタボローム解析（質量分析）
前処理
上記１−１）に従い、ＡＤＳＣの培養を行った。各酸素条件（１％、５％、２１％）にて各Ｎ＝３とし、２日間培養したものを試料として用いた。培養後の細胞群は１０ｃｍディッシュあたり約１００万個存在した。細胞内の生体物質を取得するために、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社（ＨＭＴ）に送付した（具体的には、等張マンニトール水溶液にて２回洗浄し、１ｍＬの５０％メタノール水溶液にて抽出を行った後、遠心フィルター処理にて徐タンパクが行われた）。ＨＭＴにて試料を受領後、ろ液を乾固させ、再び50 μL のMilli-Q 水に溶解して測定に供した。1-2) Metabolome analysis of ADSC (mass spectrometry)
Pretreatment ADSC was cultured according to 1-1) above. Each oxygen condition (1%, 5%, 21%), each N = 3, and cultured for 2 days were used as samples. There were about 1 million cells per 10 cm dish after culturing. We sent to Human Metabolome Technologies, Inc. (HMT) to acquire intracellular biological material (specifically, washed twice with isotonic mannitol aqueous solution and extracted with 1 mL of 50% aqueous methanol solution. After that, slow protein was performed by centrifugal filter treatment). After receiving the sample at HMT, the filtrate was dried and dissolved again in 50 μL of Milli-Q water for measurement.

測定
本試験ではカチオンモード、アニオンモードの測定を以下に示す条件で行った。
陽イオン性代謝物質（カチオンモード）:
装置
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社） 3号機
Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm
測定条件
Run buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Rinse buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 10 sec
CE voltage : Positive, 27 kV
MS ionization : ESI Positive
MS capillary voltage : 4,000 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)
陰イオン性代謝物質（アニオンモード）:
装置
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社）1号機
Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm
測定条件
Run buffer : Anion Buffer Solution (p/n : I3302-1023)
Rinse buffer : Anion Buffer Solution (p/n : I3302-1023)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 25 sec
CE voltage : Positive, 30 kV
MS ionization : ESI Negative
MS capillary voltage : 3,500 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)Measurement In this test, the cation mode and the anion mode were measured under the following conditions.
Cationic metabolite (cation mode):
apparatus
Agilent CE-TOFMS system (Agilent Technologies) Unit 3
Capillary: Fused silica capillary id 50 μm × 80 cm
Measurement condition
Run buffer: Cation Buffer Solution (p / n: H3301-1001)
Rinse buffer: Cation Buffer Solution (p / n: H3301-1001)
Sample injection: Pressure injection 50 mbar, 10 sec
CE voltage: Positive, 27 kV
MS ionization: ESI Positive
MS capillary voltage: 4,000 V
MS scan range: m / z 50-1,000
Sheath liquid: HMT Sheath Liquid (p / n: H3301-1020)
Anionic metabolites (anion mode):
apparatus
1st Agilent CE-TOFMS system (Agilent Technologies)
Capillary: Fused silica capillary id 50 μm × 80 cm
Measurement condition
Run buffer: Anion Buffer Solution (p / n: I3302-1023)
Rinse buffer: Anion Buffer Solution (p / n: I3302-1023)
Sample injection: Pressure injection 50 mbar, 25 sec
CE voltage: Positive, 30 kV
MS ionization: ESI Negative
MS capillary voltage: 3,500 V
MS scan range: m / z 50-1,000
Sheath liquid: HMT Sheath Liquid (p / n: H3301-1020)

データ処理及び解析
CE-TOFMS で検出されたピークは、自動積分ソフトウェアのMasterHands ver.2.13.0.8.h（慶應義塾大学開発）を用いて自動抽出し、ピーク情報として質量電荷比 (m/z)、泳動時間(Migration time: MT)とピーク面積値を得た。得られたピーク面積値は、下記の式：
相対面積値 =目的ピークの面積値/内部標準物質の面積値 × 試料量
を用いて相対面積値に変換した。また、これらのデータにはＮａ+やＫ+などのアダクトイオン及び、脱水、脱アンモニウムなどのフラグメントイオンが含まれているので、これらの分子量関連イオンを削除した。しかし、物質特異的なアダクトやフラグメントも存在するため、すべてを精査することはできなかった。精査したピークについて、ｍ／ｚとＭＴの値をもとに、各試料間のピークの照合・整列化を行った。
ＡＤＳＣの未分化性及び健常性に関与し得る代謝産物の解析結果を以下に示す。Data processing and analysis
Peaks detected by CE-TOFMS are automatically extracted using MasterHands ver.2.13.0.8.h (developed by Keio University), an automatic integration software. As peak information, mass-to-charge ratio (m / z), electrophoresis time ( Migration time: MT) and peak area values were obtained. The peak area value obtained is the following formula:
Relative area value = Area value of target peak / Area value of internal standard substance × Sample amount was converted into a relative area value. Moreover, since these data include adduct ions such as Na + and K + and fragment ions such as dehydration and deammonium, these molecular weight related ions were deleted. However, since there were substance-specific adducts and fragments, it was not possible to examine all of them. With respect to the examined peaks, the peaks between the samples were collated and aligned based on the values of m / z and MT.
The analysis results of metabolites that may be involved in ADSC undifferentiation and health are shown below.

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド関連（ＮＡＤ+／ＮＡＤＨ）
ＮＡＤＨは生体内の還元剤であり、エネルギー通貨である。ＮＡＤＨは酸化されることによってＮＡＤ+となり、引き換えにエネルギーを別の分子に供与する（酸化還元反応）。ＮＡＤＨは主に解糖系から産生されるため、酸素濃度２１％にてＮＡＤＨが高水準にあることが見て取れる。一方で使用済みのＮＡＤＨ、すなわちＮＡＤ+は酸素濃度１％がもっとも高く、ついで２１％、５％の順であった（図１）。酸素濃度１％では、ＮＡＤＨが少なくＮＡＤ+が多いことから、解糖系以外のミトコンドリアなどによるエネルギー産生に傾いていることが考えられ、フリーラジカルの発生など細胞へのストレスが過大になっていると推察できる。また、酸素濃度２１％では過大に解糖をおこなってＮＡＤＨを産生するものの、酸化物ＮＡＤ+も多くなっており、細胞全体として過剰なエネルギー消費（浪費）をしていると考えられる。一方、酸素濃度５％はちょうど中間であり、特にＮＡＤ+が少ないという面では酸化物の蓄積が少ないと考察できる。ＮＡＤ+が少ないということは、それだけ細胞の酸化ストレスがかかっていないと考えることができる。Nicotinamide adenine dinucleotide-related (NAD + / NADH)
NADH is an in vivo reducing agent and an energy currency. When NADH is oxidized, it becomes NAD + and exchanges energy to another molecule (oxidation-reduction reaction). Since NADH is mainly produced from glycolysis, it can be seen that NADH is at a high level at an oxygen concentration of 21%. On the other hand, used NADH, that is, NAD +, had the highest oxygen concentration of 1%, followed by 21% and 5% in this order (FIG. 1). At an oxygen concentration of 1%, NADH is low and NAD + is high, so it may be inclined to produce energy by mitochondria other than glycolytic systems, and stress on cells such as generation of free radicals is excessive. Can be guessed. In addition, when the oxygen concentration is 21%, glycolysis is excessively produced and NADH is produced, but the oxide NAD + is also increased, and it is considered that the entire cell consumes excessive energy (waste). On the other hand, the oxygen concentration of 5% is just in the middle, and it can be considered that there is little oxide accumulation especially in terms of low NAD + . It can be considered that the amount of NAD + is small, the cell is not so oxidative stressed.

グルタチオン関連（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）
還元型グルタチオン（ＧＳＨ）が酸素濃度５％で減少し、酸化型（ＧＳＳＧ）に変動がなかった（図２）。細胞ではＧＳＨの量が増えると活性酸素除去に働き、活動に好影響があるといわれている。一方で、ＧＳＨの出発物質であるシステイン（Ｃｙｓ）の量が少ないことがわかる。すなわち、幹細胞においてはＧＳＨを必要としない状況、つまり解毒、還元反応が行われていない状況が酸素濃度５％で起こっていると考えられる。Glutathione related (GSH / GSSG)
Reduced glutathione (GSH) decreased at an oxygen concentration of 5%, and there was no change in oxidized form (GSSG) (FIG. 2). It is said that when the amount of GSH increases in cells, it works to remove active oxygen and has a positive effect on the activity. On the other hand, it can be seen that the amount of cysteine (Cys) which is the starting material of GSH is small. That is, it is considered that a situation where stem cells do not require GSH, that is, a situation where no detoxification or reduction reaction is performed occurs at an oxygen concentration of 5%.

解糖系関連（グルコース６リン酸／乳酸／ＡＴＰ）
低酸素性ストレスマーカーとして乳酸が上げられる。乳酸が増加する環境下では、解糖系よるエネルギー獲得が不利になり、活性酸素が増加することが知られている。これについて、酸素濃度１％で乳酸量が増えていることがわかる（図３）。さらに解糖系の中間代謝物であるグルコース６リン酸（Ｇ６Ｐ）が酸素濃度１％で増加している。これらのデータは解糖経路の反応速度が酸素不足により低下し、中間産物の滞留が起きていることを示す。どの場合においても、酸素濃度１％での低酸素ストレスが顕著であるのに対し、酸素濃度５％及び２１％では、解糖系において大きな障害は見られなかった。さらにＡＴＰについても酸素濃度１％にて増加が見られた。酸素濃度１％では他条件に比べてミトコンドリアによるＡＴＰ獲得が優位になっていることが考察される。ミトコンドリアでのエネルギー産生は過酸化物質を副産物として生じるため、酸素濃度１％では、細胞毒性が亢進しているものと考えられる。Glycolysis related (glucose 6-phosphate / lactic acid / ATP)
Lactic acid is raised as a hypoxic stress marker. In an environment where lactic acid increases, it is known that energy acquisition by the glycolysis system is disadvantageous and active oxygen increases. It can be seen that the amount of lactic acid increases at an oxygen concentration of 1% (FIG. 3). Furthermore, glucose 6-phosphate (G6P), an intermediate metabolite of glycolysis, increases at an oxygen concentration of 1%. These data indicate that the reaction rate of the glycolytic pathway is decreased due to lack of oxygen, and intermediate product retention occurs. In all cases, hypoxic stress at an oxygen concentration of 1% was significant, whereas no major obstacles were found in the glycolysis at oxygen concentrations of 5% and 21%. Further, ATP also increased at an oxygen concentration of 1%. It is considered that ATP acquisition by mitochondria is superior to other conditions at an oxygen concentration of 1%. Since energy production in mitochondria occurs as a by-product of peroxide, it is considered that cytotoxicity is enhanced at an oxygen concentration of 1%.

ペントースリン酸回路関連（グルコース６リン酸／リブロース５リン酸）
ニコチンアミドを供給するペントースリン酸回路が酸素濃度１％で活性化しており、具体的には、グルコース６リン酸、リブロース５リン酸の増加が認められた（図４）。この回路は低酸素で停滞する解糖系の迂回路であるとともに、低酸素性ＲＯＳの消去に必要なニコチンアミドの産生強化を支えている。Pentose phosphate cycle related (glucose 6 phosphate / ribulose 5 phosphate)
The pentose phosphate cycle supplying nicotinamide was activated at an oxygen concentration of 1%, and specifically, increases in glucose 6-phosphate and ribulose 5-phosphate were observed (FIG. 4). This circuit is a bypass of the glycolysis that stagnate in low oxygen, and supports the enhancement of nicotinamide production necessary for eliminating hypoxic ROS.

１−３）ＡＤＳＣのマイクロアレイ解析
アジレント human 4x44K マイクロアレイ（Agilent Technologies 社）を用いてマイクロアレイ解析を行った。
試料の調製及びハイブリダイゼーションはAgilent Technologies 社推奨プロトコルに準じた。また、試料に用いた細胞は、上記１−１）に従い、各酸素条件（１％、５％、２１％）にて各Ｎ＝４とし、３日間培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞を用いた。ＲＮＡの全量１〜２μgを、ｃＲＮＡラベル化キット（Agilent Technologies 社）を用いてラベル化した。Qiaquick（Qiagen社，メーカー推奨プロトコル）にて精製後、SpeedVacにより溶媒を乾燥した。次に、アジレント human 4x44K マイクロアレイを用いてハイブリダイゼーション後、スライドガラスを洗浄した。スキャナー（Agilent Technologies 社）によりデータ読み取りを行った。
ＡＤＳＣの未分化性及び健常性に関与し得るマイクロアレイの解析結果を以下に示す。1-3) Microarray analysis of ADSC Microarray analysis was performed using an Agilent human 4x44K microarray (Agilent Technologies).
Sample preparation and hybridization were in accordance with Agilent Technologies recommended protocol. The cells used in the samples were mesenchymal stem cells derived from subcutaneous fat that had been cultured for 3 days with each N = 4 under each oxygen condition (1%, 5%, 21%) according to 1-1) above. It was. A total amount of 1-2 μg of RNA was labeled using a cRNA labeling kit (Agilent Technologies). After purification with Qiaquick (Qiagen, manufacturer recommended protocol), the solvent was dried with SpeedVac. Next, the slide glass was washed after hybridization using an Agilent human 4x44K microarray. Data reading was performed with a scanner (Agilent Technologies).
The analysis results of the microarray that can be involved in undifferentiated and healthy ADSC are shown below.

ＣＴＮＮＢ１／ＣＳＮＫ１Ｄ／ＰＰＡＲＧ
酸素濃度５％の優位性として幹細胞の自己複製に関与するベータカテニン（ＣＴＮＮＢ１）の発現が特異的に亢進した（図５）。同時にシグナル上流にあたるカゼインキナーゼ１Ｄ（ＣＳＮＫ１Ｄ）の発現も亢進した。さらに同条件にてＡＤＳＣの性質を運命付けるＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲＧ）も特異的に亢進した。CTNNB1 / CSNK1D / PPARG
The expression of beta-catenin (CTNNB1) involved in stem cell self-replication was specifically enhanced as an advantage of 5% oxygen concentration (FIG. 5). At the same time, the expression of casein kinase 1D (CSNK1D) upstream of the signal was also increased. Furthermore, PPARγ (PPARG), which fate the properties of ADSC under the same conditions, was also specifically enhanced.

ＬＩＦＲ／ＴＣＦ−４
ＬＩＦＲは白血病抑制因子（ＬＩＦ）受容体であり、ＬＩＦＲにＬＩＦが結合することで、幹細胞の未分化維持機構が亢進することが知られている。また、ＴＣＦ−４は幹細胞にてベータカテニンと特異的に共役して働く転写因子であり、自己複製能力と発生誘導に関与する。酸素濃度５％の環境において、ＬＩＦＲ及びＴＣＦ−４の有意な発現亢進が認められた（図６）。LIFR / TCF-4
LIFR is a leukemia inhibitory factor (LIF) receptor, and it is known that the mechanism for maintaining undifferentiation of stem cells is enhanced by binding of LIF to LIFR. TCF-4 is a transcription factor that specifically couples with beta-catenin in stem cells and is involved in self-replication ability and developmental induction. Significant increases in expression of LIFR and TCF-4 were observed in an environment with an oxygen concentration of 5% (FIG. 6).

ＦＧＦ２
塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）は酸素濃度が高い（２１％）場合に発現が減少した（図７）。ＦＧＦ２は体性幹細胞の培養において必要な因子である。FGF2
Expression of basic fibroblast growth factor (FGF2) decreased when the oxygen concentration was high (21%) (FIG. 7). FGF2 is a factor necessary for the culture of somatic stem cells.

ＶＥＧＦＡ／ＴＧＦＢ２
過度な血管新生を生じる因子として血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦＡ）が挙げられるが、この遺伝子も酸素濃度１％で亢進することが示された（図８）。
また、細胞死に関わる因子であるトランスフォーミング増殖因子２（ＴＧＦＢ２）の発現亢進も認められた。VEGFA / TGFB2
Vascular endothelial growth factor (VEGFA) is mentioned as a factor causing excessive angiogenesis, and this gene was also shown to be enhanced at an oxygen concentration of 1% (FIG. 8).
In addition, increased expression of transforming growth factor 2 (TGFB2), which is a factor related to cell death, was also observed.

２−１）真皮毛根鞘（ＤＳ）細胞の培養
資生堂リサーチセンター（新横浜）にて、１％、５％又は２１％の酸素、各５％の二酸化炭素、その他のバランスとして窒素を充填した標準ガスを準備し、該標準ガスを用いて密閉容器内でＤＳ細胞（Invitrogenn社から購入）を培養した。培養は、StemPro SFM MSC（Gibco社）を培地として用い、容器をインキュベーター内に静置して３７℃で行った。2-1) Culturing of dermal hair root sheath (DS) cells Shiseido Research Center (Shin-Yokohama) 1%, 5% or 21% oxygen, 5% carbon dioxide each, and other standard gas filled with nitrogen as a balance And DS cells (purchased from Invitrogenn) were cultured in a sealed container using the standard gas. Culturing was performed at 37 ° C. using StemPro SFM MSC (Gibco) as a medium and the container left still in an incubator.

２−２）ＤＳ細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）アッセイ
上記２−１）にしたがい培養した各ＤＳ細胞について、幹細胞・毛包誘導マーカーであるＡＰ活性を測定した。
６穴細胞培養プレートで培養したＤＳ細胞を、ＰＢＳ（−）で１回リンスした後、５０μｌの固定液（４％パラフォルムアルデヒド−リン酸緩衝液）を各ウェルに入れた。５分後、１ｍｌのＰＢＳ（−）で２回リンスした後、ＴＢＳ（ｐＨ９．５）で１回リンスを行い、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）の基質ＢＭ−ｐｕｒｐｌｅ（Roche）を用いて３７℃で１時間発色反応を行なった。超純水で４回リンスを行い、次にＰＢＳ（−）に置き換えた。
図９に示されるとおり、ＤＳ細胞におけるＡＰ活性は酸素濃度に対し逆比例することが分かった。酸素濃度が低い方が幹細胞らしさを強める傾向があると考えられる。2-2) DS Cell Alkaline Phosphatase (AP) Assay With respect to each DS cell cultured according to the above 2-1), AP activity as a stem cell / hair follicle induction marker was measured.
The DS cells cultured in the 6-well cell culture plate were rinsed once with PBS (−), and 50 μl of a fixing solution (4% paraformaldehyde-phosphate buffer) was added to each well. 5 minutes later, after rinsing twice with 1 ml of PBS (−), rinsing once with TBS (pH 9.5), and using alkaline phosphatase (AP) substrate BM-purple (Roche), 1 at 37 ° C. The color development reaction was performed for a time. Rinse four times with ultrapure water and then replaced with PBS (-).
As shown in FIG. 9, it was found that AP activity in DS cells was inversely proportional to oxygen concentration. It is considered that the lower the oxygen concentration, the stronger the tendency of stem cells.

２−３）ＤＳ細胞のメタボローム解析（質量分析）
上記１−２）と同様に、５％酸素濃度と２１％酸素濃度で培養したＤＳ細胞における細胞内代謝物変動を質量分析器により定量的に解析した（受託解析：ＨＭＴ社）。
ＤＳ細胞の未分化性及び健常性に関与し得る代謝産物の解析結果を以下に示す。2-3) Metabolome analysis of DS cells (mass spectrometry)
Similar to 1-2) above, intracellular metabolite fluctuations in DS cells cultured at 5% oxygen concentration and 21% oxygen concentration were quantitatively analyzed with a mass spectrometer (contract analysis: HMT).
The analysis results of metabolites that may be involved in DS cell undifferentiation and health are shown below.

グルタチオン関連（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）
図１０に示されるとおり、酸化型グルタチオンならびに還元型グルタチオンは共に２１％酸素条件で増加した。さらにグルタチオンの還元比率を見た場合、２１％に比べ５％酸素条件では還元型の比率が高いことが分かった。
高酸素条件（２１％）では細胞の活動が高まり、酸化還元に密接に関与するグルタチオン全体の容量が増加していると考えられる。一方、生体内濃度に近い５％酸素条件では、グルタチオンの容量が低下し、かつ酸化ストレスが低減されていると考えられる。Glutathione related (GSH / GSSG)
As shown in FIG. 10, both oxidized glutathione and reduced glutathione increased under 21% oxygen conditions. Further, when the reduction ratio of glutathione was observed, it was found that the reduced ratio was higher under 5% oxygen conditions than 21%.
Under high oxygen conditions (21%), the cell activity is increased, and it is thought that the total capacity of glutathione, which is closely involved in redox, is increased. On the other hand, it is considered that the glutathione capacity is reduced and the oxidative stress is reduced under 5% oxygen conditions close to the in vivo concentration.

ヒポキサンチン
細胞内のＤＮＡ複製に関与し、代謝時に活性酸素ストレスと関連するヒポキサンチンについて解析した。
ヒポキサンチン量は２１％に比べ５％酸素条件では１／４に低下した（図１１）。高酸素条件（２１％）では細胞の活動が高まり、ＤＮＡ代謝が活発になっていると考えられる。一方、生体内濃度にちかい５％酸素条件では、ヒポキサンチン低下による活性酸素による酸化ストレスが低減されていると考えられる。Hypoxanthine Hypoxanthine involved in intracellular DNA replication and associated with active oxygen stress during metabolism was analyzed.
The amount of hypoxanthine decreased to ¼ under 5% oxygen condition compared to 21% (FIG. 11). Under high oxygen conditions (21%), cell activity is increased, and DNA metabolism is considered to be active. On the other hand, it is considered that oxidative stress due to active oxygen due to hypoxanthine reduction is reduced under the 5% oxygen condition close to the in vivo concentration.

解糖系関連（グルコース６リン酸／乳酸／ＡＴＰ）
図１２に示されるとおり、２１％酸素条件は５％条件と比較して初期の代謝物グルコース６リン酸（Ｇ６Ｐ）および後期代謝物であるホスホエノールピルビン酸は２倍以上増加した。高酸素条件（２１％）では細胞の解糖系の活性が高まっていると考えられる。高酸素条件（２１％）は、多くのエネルギーを獲得する一方、前述における高酸化ストレスも誘導していると考えられる。５％酸素条件では、エネルギー産生は低下する一方、前述のとおり、酸化ストレスから回避できていると考えられる。Glycolysis related (glucose 6-phosphate / lactic acid / ATP)
As shown in FIG. 12, the 21% oxygen condition increased the initial metabolite glucose 6-phosphate (G6P) and the late metabolite phosphoenolpyruvate more than 2-fold compared to the 5% condition. It is considered that the activity of cell glycolysis is increased under high oxygen conditions (21%). It is considered that the high oxygen condition (21%) acquires a lot of energy, but also induces the high oxidative stress described above. Under the 5% oxygen condition, energy production decreases, but as described above, it is considered that the energy production can be avoided from oxidative stress.

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド関連（ＮＡＤ+／ＮＡＤＨ）
細胞内のエネルギー代謝指標である中心炭素代謝（ＮＡＤＨ／ＮＡＤ+レシオ）は、５％酸素条件と比較し高酸素条件（２１％）で２倍となった。また、ＴＣＡ回路の活性をしめすＮＡＤＨ量も高酸素条件で２倍となった（図１３）。
高酸素条件（２１％）は、解糖系だけではなく、ミトコンドリアＴＣＡ回路でも多くのエネルギーを獲得していると考えられる。Nicotinamide adenine dinucleotide-related (NAD + / NADH)
Central carbon metabolism (NADH / NAD + ratio), which is an intracellular energy metabolism index, doubled under high oxygen conditions (21%) compared to 5% oxygen conditions. In addition, the amount of NADH that shows the activity of the TCA circuit doubled under high oxygen conditions (FIG. 13).
The high oxygen condition (21%) is considered to acquire a lot of energy not only in the glycolytic system but also in the mitochondrial TCA circuit.

２−４）ＤＳ細胞のウェスタンブロット解析
５％酸素濃度と２１％酸素濃度にて２日間培養したＤＳ細胞から細胞内タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットにより解析した（一次抗体はセルシグナリング社）。
抗体の対応は、ＧＳＫ−３β（幹細胞らしさ）、ＯＣＴ−４（幹細胞らしさ）、ＨＩＦ−１α（低酸素転写因子）となる。図１４に示されるとおり、幹細胞らしさを負に制御するＧＳＫ−３βは高酸素で増加、幹細胞らしさを性に制御するＯＣＴ−４は高酸素で低下、低酸素で誘導される転写因子（ＨＩＦ−１α）は中立（検出不可）であった。
これらの結果から、生体内酸素条件（５％）は、高酸素条件（２１％）に比較し、幹細胞らしさを亢進する状態にあると考えられる。2-4) Western blot analysis of DS cells Intracellular proteins were extracted from DS cells cultured for 2 days at 5% oxygen concentration and 21% oxygen concentration, and analyzed by Western blotting (the primary antibody was Cell Signaling).
Corresponding antibodies are GSK-3β (likeness of stem cells), OCT-4 (likeness of stem cells), HIF-1α (hypoxic transcription factor). As shown in FIG. 14, GSK-3β that negatively regulates stem cell-likeness increases with high oxygen, OCT-4 that regulates stem cell-like sex sexually decreases, hypoxia-induced transcription factor (HIF− 1α) was neutral (not detectable).
From these results, it is considered that the in vivo oxygen condition (5%) is in a state of enhancing the quality of stem cells as compared to the high oxygen condition (21%).

２−５）ＤＳ細胞のルシフェラーゼアッセイ
５％酸素濃度と２１％酸素濃度にて、MesenPro RS 培地（Gibco社）で２日間培養したＤＳ細胞について幹細胞らしさを評価するために、デュアルルシフェラーゼアッセイによりＷｎｔシグナル経路の転写因子（ＴＣＦ−Ｌｅｆ）活性レポーターアッセイを行った（Promega社）。刺激物質として組み換えヒトＷｎｔ−３ａタンパク質を使用した。
Ｗｎｔ−３Ａ濃度依存的に、どの酸素濃度においてもＴＣＦ−Ｌｅｆ活性の上昇がみられた（図１５）。５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ存在下における２１％と５％酸素条件の比較では、ＴＣＦ−Ｌｅｆ活性は２倍以上亢進した。
幹細胞および発毛誘導時の特徴的なシグナル経路が亢進している状態において、Ｗｎｔシグナルも亢進すると考えられている。本実験において、生体内酸素条件（５％）は、高酸素条件（２１％）に比較し、ＤＳ細胞の幹細胞らしさ・毛包誘導能を維持するＷｎｔシグナルシステムが亢進していると考えられる。2-5) Luciferase assay of DS cells In order to evaluate the stem cell susceptibility of DS cells cultured for 2 days in MesenPro RS medium (Gibco) at 5% oxygen concentration and 21% oxygen concentration, Wnt signal was determined by dual luciferase assay. A pathway transcription factor (TCF-Lef) activity reporter assay was performed (Promega). Recombinant human Wnt-3a protein was used as a stimulant.
An increase in TCF-Lef activity was observed at any oxygen concentration depending on the Wnt-3A concentration (FIG. 15). In a comparison between 21% and 5% oxygen conditions in the presence of 50 ng / ml Wnt3a, TCF-Lef activity was increased by more than 2-fold.
In the state where the characteristic signal pathway at the time of stem cell and hair growth induction is enhanced, it is considered that the Wnt signal is also enhanced. In this experiment, the in vivo oxygen condition (5%) is considered to be enhanced by the Wnt signal system that maintains the stem cell likeness and hair follicle induction ability of DS cells compared to the high oxygen condition (21%).

本発明は、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法に関する。   The present invention is a method for culturing mesenchymal stem cells that maintain undifferentiated and healthy, and mesenchymal in an oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy of mesenchymal stem cells. The present invention relates to a method comprising culturing a stem cell.

近年の医学の目覚しい進歩により、疾患の原因の除去、例えば癌の外科的切除といった対症療法的な治療技術、あるいは組織・臓器の生体移植技術などにより、人命の救われる機会は益々高まりつつある。しかしながら、患部切除に伴い、患者は治療後のＱＯＬの大幅な低下に悩まされることがある。また、移植ドナーの不足、拒絶反応など、生体移植を頼りとする治療にも限界がある。外科的治療又は不慮の事故で失われた組織、器官、臓器などを再生させることが可能となれば、患者のＱＯＬを大幅に改善することができる。また、再生医療は生体移植が抱える問題の解消も図ることが可能である。その観点で再生医療に対する期待度は高い。   Due to remarkable advances in medicine in recent years, opportunities for saving human lives are increasing more and more by removing the cause of diseases, for example, symptomatic treatment techniques such as surgical excision of cancer, or tissue / organ transplantation techniques. However, with excision of the affected area, the patient may suffer from a significant decrease in QOL after treatment. In addition, there are limits to treatments that rely on living transplantation, such as a lack of transplant donors and rejection. If it becomes possible to regenerate tissues, organs, organs, etc. lost due to surgical treatment or accidents, the QOL of the patient can be greatly improved. Regenerative medicine can also solve the problems of living transplantation. In that respect, expectations for regenerative medicine are high.

これに関して、間葉系幹細胞は、間葉系に属する細胞（骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）への分化能を有することから、近年、骨や血管、心筋の再構築などの再生医療への応用についての研究が広く行われている。再生医療の実現のためには、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞の大量入手が必要となるが、間葉系幹細胞の継代培養では、十分な量の活性な細胞を獲得することは困難であった。例えば、間葉系幹細胞である毛乳頭細胞の継代培養を行なった場合、増殖性の極端な低下や毛包誘導能の喪失が認められ、これらの性質を維持することは困難であることが知られている（Jahoda CAB et al. (1984) Nature 311 : 560-562）。   In this regard, mesenchymal stem cells have the ability to differentiate into cells belonging to the mesenchymal system (bone cells, cardiomyocytes, chondrocytes, tendon cells, adipocytes, etc.). Research on application to regenerative medicine such as construction has been widely conducted. In order to realize regenerative medicine, it is necessary to obtain a large amount of mesenchymal stem cells that maintain undifferentiated and healthy conditions, but a sufficient amount of active cells can be obtained by subculture of mesenchymal stem cells. It was difficult to do. For example, when subcultures of dermal papilla cells that are mesenchymal stem cells are observed, it is difficult to maintain these properties due to the extreme decrease in proliferation and loss of hair follicle induction ability. (Jahoda CAB et al. (1984) Nature 311: 560-562).

これまでに、Sox2やNanogなどの特定の遺伝子を間葉系幹細胞に導入することにより、増殖・分化能を維持した間葉系幹細胞の培養方法については知られているが（特開2009-11254号公報）、一定の低酸素濃度条件下で培養することにより、in vitroで長期にわたって間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持できることについては知られていない。   So far, a method for culturing mesenchymal stem cells that has maintained proliferation / differentiation ability by introducing a specific gene such as Sox2 or Nanog into mesenchymal stem cells is known (JP 2009-11254 A). No.), it is not known that the undifferentiated and healthy state of mesenchymal stem cells can be maintained in vitro for a long period of time by culturing under certain low oxygen concentration conditions.

特開2009-11254号公報JP 2009-11254 特開2012-157263号公報JP 2012-157263 A 特開平7-274950号公報JP 7-274950 A

Jahoda CAB et al. (1984) Nature 311 : 560-562Jahoda CAB et al. (1984) Nature 311: 560-562 Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol.10, No.1, Jan. 2004Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol.10, No.1, Jan. 2004

本発明の課題は、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞の新規な培養方法を提供することにある。   An object of the present invention is to provide a novel method for culturing mesenchymal stem cells maintaining undifferentiated and healthy properties.

本発明者は、メタボローム解析及びＤＮＡアッセイ解析を行い、鋭意研究を行った結果、一定の低酸素濃度条件下で間葉系幹細胞を培養することにより、その未分化性及び健常性を維持させることが可能となる、という驚くべき知見を得た。   The present inventor has conducted metabolomic analysis and DNA assay analysis, and as a result of earnest research, has maintained its undifferentiation and normality by culturing mesenchymal stem cells under certain low oxygen concentration conditions I got a surprising finding that it is possible.

従って、本願は以下の発明を包含する：
［１］ 未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法。
［２］ 間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約１％超から約２１％未満であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［３］ 間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約３％から約７％であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［４］ 間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約１％超から約５％以下であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［５］ 間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約５％であることを特徴とする、［１］に記載の方法。
［６］ 前記間葉系幹細胞が脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。 Accordingly, this application includes the following inventions:
[1] A method for culturing mesenchymal stem cells maintaining undifferentiated and healthy conditions, the mesenchymal system at an oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy characteristics of mesenchymal stem cells Culturing the stem cells.
[2] The method according to [1], wherein the oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy state of mesenchymal stem cells is more than about 1% to less than about 21%.
[3] The method according to [1], wherein the oxygen concentration suitable for maintaining undifferentiated and healthy mesenchymal stem cells is about 3% to about 7%.
[4] The method according to [1], wherein the oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy state of the mesenchymal stem cells is more than about 1% to about 5% or less.
[5] The method according to [1], wherein the oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy state of mesenchymal stem cells is about 5%.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the mesenchymal stem cells are adipose-derived mesenchymal stem cells.

本発明により、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を大量に得ることができる。   According to the present invention, a large amount of mesenchymal stem cells maintaining undifferentiated and healthy properties can be obtained.

各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）におけるNAD+/NADH 量の比較を示す。A comparison of the amount of NAD + / NADH in subcutaneous fat-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under various oxygen concentration (1%, 5%, 21%) conditions is shown. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における還元型グルタチオン（GSH）、酸化型グルタチオン（GSSG）及びシステイン（Cys）の量、ならびにGSH／GSSG 比の比較を示す。The amount of reduced glutathione (GSH), oxidized glutathione (GSSG) and cysteine (Cys) in subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under various oxygen concentrations (1%, 5%, 21%) And a comparison of the GSH / GSSG ratio. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）におけるグルコース６リン酸（G6P）、乳酸及びATPの量の比較を示す。A comparison of the amounts of glucose 6-phosphate (G6P), lactic acid and ATP in subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under each oxygen concentration (1%, 5%, 21%) condition is shown. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における、グルコース６リン酸及びリブロース５リン酸の量の比較を示す。A comparison of the amounts of glucose 6-phosphate and ribulose 5-phosphate in subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under various oxygen concentration (1%, 5%, 21%) conditions is shown. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）におけるベータカテニン（CTNNB1）、カゼインキナーゼ１D(CSNK1D)、及びPPARγ(PPARG)の遺伝子発現量の比較を示す。Expression of beta-catenin (CTNNB1), casein kinase 1D (CSNK1D), and PPARγ (PPARG) in subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under various oxygen concentrations (1%, 5%, 21%) A comparison of quantities is shown. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における白血病抑制因子受容体（LIFR）及びＴ細胞因子−４（TCF-4）の遺伝子発現量の比較を示す。Leukemia inhibitory factor receptor (LIFR) and T cell factor-4 (TCF-4) genes in subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under various oxygen concentrations (1%, 5%, 21%) Comparison of expression levels is shown. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における塩基性繊維芽細胞増殖因子（FGF2）の遺伝子発現量の比較を示す。A comparison of gene expression levels of basic fibroblast growth factor (FGF2) in subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under various oxygen concentration (1%, 5%, 21%) conditions is shown. 各酸素濃度（1%, 5%, 21%）条件下で培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ADSC）における血管内皮細胞増殖因子（VEGFA）及びトランスフォーミング増殖因子２（TGFB2）の遺伝子発現量の比較を示す。Gene expression levels of vascular endothelial growth factor (VEGFA) and transforming growth factor 2 (TGFB2) in subcutaneous adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC) cultured under various oxygen concentrations (1%, 5%, 21%) A comparison of is shown.

本発明は、未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法を提供する。   The present invention is a method for culturing mesenchymal stem cells that maintain undifferentiated and healthy, and mesenchymal in an oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy of mesenchymal stem cells. A method is provided that comprises culturing a stem cell.

間葉系幹細胞は、脂肪、臍帯、骨髄中、滑膜などに存在する、多分化能を有する体性幹細胞である。間葉系幹細胞は種々の中胚葉細胞、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、心筋細胞及び血管内皮細胞に分化することができる。間葉系幹細胞はその多分化能から、骨、関節、筋肉、肝臓、腎臓、心臓、中枢神経系及び膵臓等の臓器再生医療への応用が期待されており、例えば、間葉系幹細胞の移植による心筋梗塞、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、自己免疫疾患、慢性腎不全、変形性関節症、脳梗塞、ならびに脳神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病）等の治療に関する研究が進められている（例えば特開2012-157263号公報を参照のこと）。   Mesenchymal stem cells are somatic stem cells having multipotency that are present in fat, umbilical cord, bone marrow, synovium, and the like. Mesenchymal stem cells can differentiate into various mesodermal cells such as osteoblasts, chondrocytes, skeletal muscle cells, cardiomyocytes and vascular endothelial cells. Mesenchymal stem cells are expected to be applied to regenerative medicine for organs such as bone, joint, muscle, liver, kidney, heart, central nervous system and pancreas due to their multipotency. For example, transplantation of mesenchymal stem cells Myocardial infarction, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), autoimmune disease, chronic renal failure, osteoarthritis, cerebral infarction, and cranial nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson's disease) Research related to such treatments is underway (see, for example, JP 2012-157263 A).

本発明において培養できる間葉系幹細胞は、あらゆる哺乳動物、例えばヒト、チンパンジー、その他の霊長類、家畜動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、他に実験用動物、例えばラット、マウス、モルモット、より好ましくはヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットの脂肪、臍帯、骨髄中、滑膜に由来し得るが、ヒトへの移植や、研究用の三次元モデルの製造の観点から、ヒト由来の細胞が好ましい。間葉系幹細胞は、好ましくは脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）である。   Mesenchymal stem cells that can be cultured in the present invention may be any mammal, such as humans, chimpanzees, other primates, livestock animals such as dogs, cats, rabbits, horses, sheep, goats, cows, pigs, and other experimental animals. For example, rat, mouse, guinea pig, more preferably nude mouse, skid mouse, nude rat fat, umbilical cord, bone marrow, synovial, but can be used for transplantation into humans or production of 3D models for research. From the viewpoint, human-derived cells are preferred. The mesenchymal stem cell is preferably a fat-derived mesenchymal stem cell (ADSC).

また、本発明において培養できる間葉系幹細胞は、上記哺乳動物の組織から初代培養により取得された細胞であってもよいし、継代培養により取得された細胞であってもよく、また、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞、及びＥＳ細胞から分化誘導されて得られた細胞であってもよい。移植を行う観点からは、移植対象から取得した細胞を継代培養により増殖させた細胞が好ましい。   In addition, the mesenchymal stem cell that can be cultured in the present invention may be a cell obtained by primary culture from the above mammalian tissue, may be a cell obtained by subculture, or may be a body. It may be a cell obtained by inducing differentiation from a sex stem cell, iPS cell, or ES cell. From the viewpoint of transplantation, cells obtained by proliferating cells obtained from the transplantation subject by subculture are preferred.

本発明において使用することができる基礎培地は、ヒトや動物の細胞の培養に用いられる培地ならば特に制限されないが、市販の栄養培地をそのまま、または改性したもので培養することができる。間葉系幹細胞を培養するために使用できる代表的な培地としては、ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地（Gibco社）やチャン培地(Irvine Scientific）が挙げられるが、移植を行う観点からは、無血清培地であることが好ましい。多様な種類の無血清培地が市販されており、例えば、HFDM-1 (+) (細胞科学研究所）、HFDM-1 (-) (細胞科学研究所）、StemPro MSC SFM CTS（sup+） (Lifetechnologies)、StemPro MSC SFM CTS（sup-） (Lifetechnologies)、Mosaic hMSC SF Culture Medium (sup+) (BD)などが挙げられる。これらの市販培地の組成として、HFDM-1 (-)は、基礎培地 RITC80-7、インスリン5 μg/ml、 デキサメサゾン10-7Mを含有しており、HFDM-1 (+)は、これらに加えて、EGF 10 ng/mlを含有することが知られている。 The basal medium that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a medium used for culturing human or animal cells. However, a commercially available nutrient medium can be used as it is or modified. Typical media that can be used for culturing mesenchymal stem cells include Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) and Chang's medium (Irvine Scientific) containing fetal bovine serum, but from the viewpoint of transplantation, A serum-free medium is preferred. Various types of serum-free media are commercially available, such as HFDM-1 (+) (Cell Science Laboratory), HFDM-1 (-) (Cell Science Laboratory), StemPro MSC SFM CTS (sup +) (Lifetechnologies ), StemPro MSC SFM CTS (sup-) (Lifetechnologies), Mosaic hMSC SF Culture Medium (sup +) (BD), and the like. As the composition of these commercial media, HFDM-1 (-) contains basal media RITC80-7, insulin 5 μg / ml, dexamethasone 10 -7 M, and HFDM-1 (+) It is known to contain 10 ng / ml of EGF.

基礎培地には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含んでもよい。ＰＤＧＦは、主に間葉系幹細胞（線維芽細胞、平滑筋細胞、グリア細胞等）の遊走や増殖などの調節に関与する増殖因子であり、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーに属する。主に巨核球によって産生されるほか、血小板のα顆粒中にも含まれ、上皮細胞や内皮細胞などの様々な細胞によって産生されることが知られている。ＰＤＧＦは、Ａ鎖、Ｂ鎖、Ｃ鎖及びＤ鎖により、ＰＤＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの少なくとも４種類が存在している。これらはいずれも、ホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成し、ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、−ＢＢ、−ＣＣ、−ＤＤの５種類のアイソフォームが存在することが知られている。これらのうち、ＰＤＧＦ−ＢＢが特に好ましい。基礎培地に添加されるＰＤＧＦの添加量は特に制限されるものではないが、例えば0.01 ng/ml〜10 μg/ml、好ましくは0.1 ng/ml〜100 ng/ml、より好ましくは1〜10 ng/ml程度である。   The basal medium may contain platelet derived growth factor (PDGF). PDGF is a growth factor mainly involved in the regulation of migration and proliferation of mesenchymal stem cells (fibroblasts, smooth muscle cells, glial cells, etc.), and belongs to the PDGF / VEGF family. In addition to being produced mainly by megakaryocytes, it is also contained in platelet α-granule and is known to be produced by various cells such as epithelial cells and endothelial cells. There are at least four types of PDGF, PDGF-A, B, C and D, depending on the A chain, B chain, C chain and D chain. All of these form homodimers or heterodimers, and it is known that there are five types of isoforms of PDGF-AA, -AB, -BB, -CC, and -DD. Of these, PDGF-BB is particularly preferred. The amount of PDGF added to the basal medium is not particularly limited. For example, 0.01 ng / ml to 10 μg / ml, preferably 0.1 ng / ml to 100 ng / ml, more preferably 1 to 10 ng. About / ml.

また、基礎培地には、Ｗｎｔシグナル活性化剤を添加してもよい。Ｗｎｔシグナルとは、β−カテニンの核移行を促し、転写因子としての機能を発揮する一連の作用をいう。本シグナルは細胞間相互作用に起因し、例えば、ある細胞から分泌されたＷｎｔ３Ａというタンパクがさらに別の細胞に作用し、細胞内のβ−カテニンが核移行し、転写因子として作用する一連の流れが含まれる。一連の流れは上皮間葉相互作用を例とする器官構築の最初の現象を引き起こす。Ｗｎｔシグナルはβ−カテニン経路、ＰＣＰ経路、Ｃａ2+経路の三つの経路を活性化することにより、細胞の増殖や分化、器官形成や初期発生時の細胞運動など各種細胞機能を制御することで知られる。Ｗｎｔシグナルがもつその未分化状態維持機能により、分化を抑制する目的でＥＳ細胞の培養の際に利用されている（例えば、Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol.10, No.1, Jan. 2004)。 Further, a Wnt signal activator may be added to the basal medium. The Wnt signal refers to a series of actions that promote the nuclear translocation of β-catenin and exert a function as a transcription factor. This signal is caused by cell-cell interaction. For example, a protein called Wnt3A secreted from one cell acts on another cell, and β-catenin in the cell translocates to the nucleus and acts as a transcription factor. Is included. A series of flows causes the first phenomenon of organ construction, exemplified by epithelial-mesenchymal interactions. Wnt signal activates three pathways, β-catenin pathway, PCP pathway, and Ca 2+ pathway, thereby controlling various cell functions such as cell proliferation and differentiation, organ formation, and cell movement during early development. known. Due to its undifferentiated state maintaining function of the Wnt signal, it is used in the culture of ES cells for the purpose of suppressing differentiation (for example, Noburo Sato et al., Nature Medicine Vol. 10, No. 1, Jan. 2004).

Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、特に限定されるわけではないが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の阻害活性を示すものであればいかなるものでもよく、例えばビス−インドロ（インジルビン）化合物（ＢＩＯ）（（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、そのアセトキシム類似体ＢＩＯ−アセトキシム（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム）、チアジアゾリジン（ＴＤＺＤ）類似体（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、オキソチアジアゾリジン―３−チオン類似体（２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン）、チエニルα−クロロメチルケトン化合物（２−クロロ−１−（４，４−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物（α−４−ジブロモアセトフェノン）、チアゾール含有尿素化合物（Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）ユレア）やＧＳＫ−３βペプチド阻害剤、例えばＨ−ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ2、さらには塩化リチウムなどが挙げられる。また、ＣＴ９９０２１（分子量：４６５．３４，純度：９９．１％，ＣＡＳ Ｎｏ：２５２９１７−０６−９，別名：ＣＨＩＲ９９０２１）は非常に強力な選択的ＧＳＫ−３阻害物質として知られ、マウスＥＳ細胞培養時に、ＰＤ１８４３５２（ＭＥＫ／ＭＡＰＫ阻害物質）やＳＵ５４０２（ＦＧＦＲ阻害物質）と共に使用することにより、長期培養を可能にする。 The Wnt signal activator is not particularly limited, and any Wnt signal activator may be used as long as it exhibits inhibitory activity for glycogen synthase kinase-3 (GSK-3). For example, a bis-indolo (indirubin) compound ( BIO) ((2′Z, 3′E) -6-bromoindirubin-3′-oxime), its acetoxime analog BIO-acetoxime (2′Z, 3′E) -6-bromoindirubin-3 ′ -Acetoxime), thiadiazolidine (TDZD) analog (4-benzyl-2-methyl-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione), oxothiadiazolidine-3-thione analog (2 , 4-Dibenzyl-5-oxothiadiazolidine-3-thione), thienyl α-chloromethyl ketone compound (2-chloro-1- (4,4-dibromo-thi Phen-2-yl) -ethanone), phenyl α bromomethyl ketone compound (α-4-dibromoacetophenone), thiazole-containing urea compound (N- (4-methoxybenzyl) -N ′-(5-nitro-1,3) -Thiazol-2-yl) urea) and GSK-3β peptide inhibitors such as H-KEAPPAPPQSpP-NH 2 and lithium chloride. CT99021 (molecular weight: 465.34, purity: 99.1%, CAS No: 252917-06-9, also known as CHIR99021) is known as a very potent selective GSK-3 inhibitor, and is a mouse ES cell culture. Sometimes used with PD184352 (MEK / MAPK inhibitor) or SU5402 (FGFR inhibitor) to enable long-term culture.

Ｗｎｔシグナル活性化剤の添加量は特に制限されるものではなく、Ｗｎｔシグナル活性化、換言すれば、ＧＳＫ−３の阻害が奏され、且つ細胞増殖が停止しない量であればよく、使用する薬剤の種類及び増殖すべき細胞の種類に依存し、当業者により適宜決定されるであろう。例えば、Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＢＩＯを使用する場合、その量は、例えば0.01 μM〜100 μM、好ましくは0.1 μM〜10 μM、より好ましくは10 μM程度である。また、Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＣＴ９９０２１を使用する場合、その量は、例えば0.1〜10 μM、最適には1 μM程度である。   The addition amount of the Wnt signal activator is not particularly limited, and may be any amount that activates Wnt signal, in other words, inhibits GSK-3 and does not stop cell growth. Depending on the type of cell and the type of cell to be proliferated, and will be determined by those skilled in the art. For example, when BIO is used as the Wnt signal activator, the amount is, for example, 0.01 μM to 100 μM, preferably 0.1 μM to 10 μM, and more preferably about 10 μM. When CT99021 is used as the Wnt signal activator, the amount is, for example, about 0.1 to 10 μM, and optimally about 1 μM.

さらに、無血清培地には、必要に応じてほかの細胞増殖因子、ホルモンやその他の微量栄養素を加えることができる。これらの具体的なものとして、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β１，２，３（ＴＧＦβ１，２，３）、骨形成因子（ＢＭＰ）又はインスリン様成長因子−１，２（ＩＧＦ−１，２）を使用する場合、その量は、例えば0.1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。リン脂質（例えば、フォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、エタノールアミン）を使用する場合、その量は、例えば0.1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。脂肪酸（例えば、リノール酸、オレイン酸、アラキドン酸を使用する場合、その量は、例えば0.001 μg/ml 〜100 μg/ml程度である。プロスタグランジン類を使用する場合、その量は0.1 ng/ml 〜 100 ng/ml 程度である。還元剤（例えば、アスコルビン酸、還元型グルタチオン）を使用する場合、その量は、例えば1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。メルカプトエタノールを使用する場合、その量は、例えば0.1 μg/ml〜100 μg/ml程度である。トランスフェリン又はインスリンを使用する場合、その量は0.01 μg/ml〜100 μg/ml程度である。デキサメタゾンを使用する場合、その量は0.000001 μM〜0.1 μM程度である。トリヨードチロニンを使用する場合、その量は0.1 pM〜100 pM程度である。グルカゴンを使用する場合、その量は0.0001 μM〜0.1 μM程度である。コレステロールを使用する場合、その量は、例えば0.1μg/ml〜100μg/ml程度である。ハイドロコーチゾンを使用する場合、その量は、例えば0．01 μg/ml〜10 μg/ml程度である。テストステロンを使用する場合、その量は、例えば0.1 μM〜100 μM程度である。エストラジオール又はプロゲステロンを使用する場合、その量は、例えば0．01 ng/ml〜100 ng/ml程度である。微量元素（例えば、銅、亜鉛、コバルト、マンガン、モリブデン、セレン）を使用する場合、その量は、例えば0.000001 mg/ml〜0.1 mg/ml程度である。アルブミン、ファイブロネクチン又はビトロネクチンを使用する場合、その量は、例えば0．1 μg/ml〜1000 μg/ml程度である。   Furthermore, other cell growth factors, hormones and other micronutrients can be added to the serum-free medium as necessary. Specific examples of these include, for example, epidermal growth factor (EGF), tumor necrosis factor α (TNFα), hepatocyte growth factor (HGF), fibroblast growth factor 7 (FGF7), vascular endothelial growth factor (VEGF). Basic fibroblast growth factor (bFGF), transforming growth factor β1,2,3 (TGFβ1,2,3), bone morphogenetic factor (BMP) or insulin-like growth factor-1,2 (IGF-1,2) ) Is, for example, about 0.1 μg / ml to 100 μg / ml. When using a phospholipid (for example, phosphatidic acid, phosphatidylinositol, ethanolamine), the amount is, for example, about 0.1 μg / ml to 100 μg / ml. When using fatty acids (for example, linoleic acid, oleic acid, arachidonic acid, the amount is, for example, about 0.001 μg / ml to 100 μg / ml. When using prostaglandins, the amount is 0.1 ng / ml. When using a reducing agent (for example, ascorbic acid, reduced glutathione), the amount is, for example, about 1 μg / ml to 100 μg / ml. In this case, the amount is, for example, about 0.1 μg / ml to 100 μg / ml, and when using transferrin or insulin, the amount is about 0.01 μg / ml to 100 μg / ml. The amount is about 0.000001 μM to 0.1 μM.When triiodothyronine is used, the amount is about 0.1 pM to 100 pM.When glucagon is used, the amount is about 0.0001 μM to 0.1 μM. Use cholesterol In the case where hydrocortisone is used, the amount is, for example, about 0.01 μg / ml to 10 μg / ml, and testosterone is used. When using estradiol or progesterone, the amount is, for example, about 0.01 ng / ml to 100 ng / ml. (Copper, zinc, cobalt, manganese, molybdenum, selenium), the amount is, for example, about 0.000001 mg / ml to 0.1 mg / ml.When using albumin, fibronectin or vitronectin, the amount is For example, it is about 0.1 μg / ml to 1000 μg / ml.

このような培地において、間葉系幹細胞の培養は、通常、培養皿を用い、「間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度」において、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃のインキユベーター内に静置して行い、アウトグロースが確認されたら、培地を交換してさらに培養を続けることに(継代培養)より実施する。こうして得られる培養細胞はさらに必要な継代数にわたって、継代培養を行う。継代は間葉系幹細胞の所望する量が達成されるまで行なうことができ、たとえば10回以上の継代、所望量が多い場合は好ましくは15回以上、さらに好ましくは20回以上まで継代を行なうことができる。 In such a medium, culture of mesenchymal stem cells is usually performed using a culture dish, and in a “oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy state of mesenchymal stem cells” in a 5% CO 2 atmosphere. Then, it is allowed to stand in an incubator at 37 ° C. When outgrowth is confirmed, it is carried out by exchanging the medium and continuing the culture (subculture). The cultured cells thus obtained are further subcultured over the necessary number of passages. Passage can be performed until the desired amount of mesenchymal stem cells is achieved, for example, passage 10 times or more, preferably 15 times or more when the desired amount is large, more preferably 20 times or more. Can be performed.

本発明においては、「未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度」において間葉系幹細胞が培養されるが、ここで、「未分化性」とは、間葉系幹細胞が、骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞などの細胞へ分化しておらず、依然として、多分化能を有している状態を意味し、「健常性」とは、細胞毒性をもたらす活性酸素や炎症性サイトカインの発現量が少なく、正常な生存・増殖能を有している状態を意味する。   In the present invention, mesenchymal stem cells are cultured at “oxygen concentration suitable for maintaining undifferentiated and healthy”, but here, “undifferentiated” means that mesenchymal stem cells are It means a state that has not differentiated into cells such as bone cells, cardiomyocytes, chondrocytes, tendon cells, adipocytes, etc., and still has pluripotency, and “health” brings cytotoxicity It means a state where active oxygen and inflammatory cytokine are expressed in a small amount and have normal survival / proliferation ability.

このような間葉系幹細胞の「未分化性」や「健常性」は、メタボローム解析やＤＮＡアレイ解析により、間葉系幹細胞内に存在する代謝産物及び／又は発現遺伝子を網羅的に解析することによって、判定することができる。   Such “undifferentiation” and “health” of mesenchymal stem cells is to comprehensively analyze metabolites and / or expressed genes present in mesenchymal stem cells by metabolomic analysis or DNA array analysis. Can be determined.

メタボローム解析は、アミノ酸、アミン、ヌクレオチド、糖、脂質などを含む、細胞内の低分子代謝産物を包括的に分離し、これらを同定・定量することにより行われる。メタボローム解析において、用いることができる分離手法としては、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）が用いられる。これらの分離手法は一般に質量分析（ＭＳ）と組み合わせることで、分離−検出機器として利用される。なお、メタボローム解析は、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社などの解析サービスを提供している会社・機関に委託してもよい。   Metabolome analysis is performed by comprehensively separating intracellular low-molecular metabolites including amino acids, amines, nucleotides, sugars, lipids, etc., and identifying and quantifying them. Separation techniques that can be used in metabolomic analysis include gas chromatography (GC), liquid chromatography (LC), and capillary electrophoresis (CE). These separation techniques are generally used as a separation-detection instrument by being combined with mass spectrometry (MS). Metabolome analysis may be outsourced to a company / institution that provides analysis services such as Human Metabolome Technologies, Inc.

このように包括的に同定・定量された代謝産物の中から、間葉系幹細胞の未分化性や健常性に関与する因子を評価する。このような因子としては、生体内の酸化・還元反応やＡＴＰなどのエネルギー産生に関与する生体内低分子、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド関連（ＮＡＤ+／ＮＡＤＨ）、グルタチオン関連（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）、解糖系関連（グルコース６リン酸／乳酸／ＡＴＰ）、及びペントースリン酸回路関連（グルコース６リン酸／リブロース５リン酸）などが挙げられる。 Among the metabolites comprehensively identified and quantified in this way, the factors involved in the undifferentiation and health of mesenchymal stem cells are evaluated. Such factors include small in vivo molecules involved in in vivo oxidation / reduction reactions and energy production such as ATP, such as nicotinamide adenine dinucleotide-related (NAD + / NADH), glutathione-related (GSH / GSSG) , Glycolysis-related (glucose 6-phosphate / lactic acid / ATP), pentose phosphate cycle-related (glucose 6-phosphate / ribulose 5-phosphate), and the like.

上述のメタボローム解析に加えて、マイクロアレイ解析により間葉系幹細胞の遺伝子発現量を網羅的に測定し、その中から、間葉系幹細胞の未分化性や健常性に関与する遺伝子を指標とすることにより、さらに包括的な評価を行うことができる。このような指標としては、幹細胞で特異的に発現する遺伝子や炎症性サイトカイン遺伝子、例えば、ベータカテニン（ＣＴＮＮＢ１）、カゼインキナーゼ１Ｄ（ＣＳＮＫ１Ｄ）、ＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲＧ）、白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）、Ｔ細胞因子−４（ＴＣＦ−４）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦＡ）、トランスフォーミング増殖因子２（ＴＧＦＢ２）、Frizzled ホモログ１（Drosophila）（ＦＲＺ−１）、Frizzled ホモログ４（Drosophila）（ＦＲＺ−４）などの遺伝子が挙げられる。   In addition to the above-described metabolome analysis, the gene expression level of mesenchymal stem cells is comprehensively measured by microarray analysis, and the genes involved in the undifferentiation and health of mesenchymal stem cells are used as indicators. Makes it possible to perform a more comprehensive evaluation. Examples of such indicators include genes specifically expressed in stem cells and inflammatory cytokine genes such as beta-catenin (CTNNB1), casein kinase 1D (CSNK1D), PPARγ (PPARG), leukemia inhibitory factor receptor (LIFR), T cell factor-4 (TCF-4), basic fibroblast growth factor (FGF2), vascular endothelial growth factor (VEGFA), transforming growth factor 2 (TGFB2), Frizzled homolog 1 (Drosophila) (FRZ-1) ) And Frizzled homolog 4 (Drosophila) (FRZ-4).

このように、間葉系幹細胞内に存在する代謝産物及び発現遺伝子を網羅的に解析することにより、「間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度」を決定することができる。このような酸素濃度は、具体的には、１％超から２１％（常酸素濃度）未満の低酸素濃度である。また、典型的には２％から１６％、好ましくは３％から１２％、より好ましくは３％から７％、更により好ましくは４％から６％、最も好ましくは５％である。   In this way, by comprehensively analyzing metabolites and expressed genes present in mesenchymal stem cells, the "oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy state of mesenchymal stem cells" is determined. can do. Such an oxygen concentration is specifically a low oxygen concentration of more than 1% to less than 21% (normal oxygen concentration). Also, it is typically 2% to 16%, preferably 3% to 12%, more preferably 3% to 7%, even more preferably 4% to 6%, and most preferably 5%.

好ましくは、このようにして培養した間葉系幹細胞をスフェア形成させる（特開平7-274950号公報）。スフェア形成は、飽和状態になるまで細胞を増殖させ、細胞を剥離した後、培地で懸濁させ、この細胞懸濁物を非接着処理した培養皿中の培地上に捲き、数日放置することにより丸い細胞塊（スフェロイド）の細胞集合体を形成することで行う。好ましくは、スフェア形成はｂＦＧＦの非存在下で行うが、ｂＦＧＦ存在下でも十分にスフェア形成は達成される。なお、スフェア形成を行う時期は特に制限されるものではなく、最後の継代を終えた培養細胞に対し行ってよい。スフェロイドを形成させる培養法として、ローラボトル培養、スピナーフラスコ培養、ハンギングドロップ培養などが知られており、また、凹陥部を有する培養容器や、細胞接着性の低いコーティングが施された培養容器が市販されている。さらに、細胞接着性領域と細胞非接着性領域が共存するようにコーティングがされ、細胞非接着性領域として、ホスホリルコリン（ＰＣ）基コーティングを用いた培養容器を用いて培養を行うことにより、サイズが揃ったスフェロイドを大量に形成することが可能になった。   Preferably, the mesenchymal stem cells cultured in this way are sphere-formed (Japanese Patent Laid-Open No. 7-274950). For sphere formation, the cells are grown until they reach saturation, the cells are detached, suspended in a medium, and the cell suspension is spread on a medium in a non-adherent culture dish and left for several days. To form a round cell cluster (spheroid) cell aggregate. Preferably, sphere formation is performed in the absence of bFGF, but sphere formation is sufficiently achieved even in the presence of bFGF. In addition, the time in which sphere formation is performed is not particularly limited, and may be performed on cultured cells after the last passage. Known culture methods for forming spheroids include roller bottle culture, spinner flask culture, and hanging drop culture, and commercially available culture vessels with concave portions or coatings with low cell adhesion coating. Has been. Further, the cell adhesion region and the cell non-adhesion region are coated so that the cell non-adhesion region is coexisted. It became possible to form a large number of aligned spheroids.

このようにして調製したスフェア化した間葉系幹細胞は、多分化能を維持しており、したがって、間葉系幹細胞の分化のメカニズムの解明のために研究のin vitro実験や、再生医療などのために利用できる。   The sphered mesenchymal stem cells prepared in this way maintain pluripotency. Therefore, in order to elucidate the mechanism of mesenchymal stem cell differentiation, research in vitro experiments, regenerative medicine, etc. Available for.

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.

１−１）皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）の培養
資生堂リサーチセンター（新横浜）にて、１％、５％又は２１％の酸素、各５％の二酸化炭素、その他のバランスとして窒素を充填した標準ガスを準備し、該標準ガスを用いて密閉容器内でＡＤＳＣ（Invitrogenn社から購入）を培養した。培養は、StemPro SFM MSC（Gibco社）を培地として用い、容器をインキュベーター内に静置して３７℃で行った。 1-1) Culture of subcutaneous fat-derived mesenchymal stem cells (ADSC) Filled with 1%, 5% or 21% oxygen, 5% carbon dioxide, and nitrogen as the other balance at Shiseido Research Center (Shin Yokohama) The prepared standard gas was prepared, and ADSC (purchased from Invitrogenn) was cultured in a sealed container using the standard gas. Culturing was performed at 37 ° C. using StemPro SFM MSC (Gibco) as a medium and the container left still in an incubator.

１−２）ＡＤＳＣのメタボローム解析（質量分析）
前処理
上記１−１）に従い、ＡＤＳＣの培養を行った。各酸素条件（１％、５％、２１％）にて各Ｎ＝３とし、２日間培養したものを試料として用いた。培養後の細胞群は１０ｃｍディッシュあたり約１００万個存在した。細胞内の生体物質を取得するために、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社（ＨＭＴ）に送付した（具体的には、等張マンニトール水溶液にて２回洗浄し、１ｍＬの５０％メタノール水溶液にて抽出を行った後、遠心フィルター処理にて徐タンパクが行われた）。ＨＭＴにて試料を受領後、ろ液を乾固させ、再び50 μL のMilli-Q 水に溶解して測定に供した。 1-2) Metabolome analysis of ADSC (mass spectrometry)
Pretreatment ADSC was cultured according to 1-1) above. Each oxygen condition (1%, 5%, 21%), each N = 3, and cultured for 2 days were used as samples. There were about 1 million cells per 10 cm dish after culturing. We sent to Human Metabolome Technologies, Inc. (HMT) to acquire intracellular biological material (specifically, washed twice with isotonic mannitol aqueous solution and extracted with 1 mL of 50% aqueous methanol solution. After that, slow protein was performed by centrifugal filter treatment). After receiving the sample at HMT, the filtrate was dried and dissolved again in 50 μL of Milli-Q water for measurement.

測定
本試験ではカチオンモード、アニオンモードの測定を以下に示す条件で行った。
陽イオン性代謝物質（カチオンモード）:
装置
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社） 3号機
Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm
測定条件
Run buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Rinse buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 10 sec
CE voltage : Positive, 27 kV
MS ionization : ESI Positive
MS capillary voltage : 4,000 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)
陰イオン性代謝物質（アニオンモード）:
装置
Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社）1号機
Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm
測定条件
Run buffer : Anion Buffer Solution (p/n : I3302-1023)
Rinse buffer : Anion Buffer Solution (p/n : I3302-1023)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 25 sec
CE voltage : Positive, 30 kV
MS ionization : ESI Negative
MS capillary voltage : 3,500 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020) Measurement In this test, the cation mode and the anion mode were measured under the following conditions.
Cationic metabolite (cation mode):
apparatus
Agilent CE-TOFMS system (Agilent Technologies) Unit 3
Capillary: Fused silica capillary id 50 μm × 80 cm
Measurement condition
Run buffer: Cation Buffer Solution (p / n: H3301-1001)
Rinse buffer: Cation Buffer Solution (p / n: H3301-1001)
Sample injection: Pressure injection 50 mbar, 10 sec
CE voltage: Positive, 27 kV
MS ionization: ESI Positive
MS capillary voltage: 4,000 V
MS scan range: m / z 50-1,000
Sheath liquid: HMT Sheath Liquid (p / n: H3301-1020)
Anionic metabolites (anion mode):
apparatus
1st Agilent CE-TOFMS system (Agilent Technologies)
Capillary: Fused silica capillary id 50 μm × 80 cm
Measurement condition
Run buffer: Anion Buffer Solution (p / n: I3302-1023)
Rinse buffer: Anion Buffer Solution (p / n: I3302-1023)
Sample injection: Pressure injection 50 mbar, 25 sec
CE voltage: Positive, 30 kV
MS ionization: ESI Negative
MS capillary voltage: 3,500 V
MS scan range: m / z 50-1,000
Sheath liquid: HMT Sheath Liquid (p / n: H3301-1020)

データ処理及び解析
CE-TOFMS で検出されたピークは、自動積分ソフトウェアのMasterHands ver.2.13.0.8.h（慶應義塾大学開発）を用いて自動抽出し、ピーク情報として質量電荷比 (m/z)、泳動時間(Migration time: MT)とピーク面積値を得た。得られたピーク面積値は、下記の式：
相対面積値 =目的ピークの面積値/内部標準物質の面積値 × 試料量
を用いて相対面積値に変換した。また、これらのデータにはＮａ+やＫ+などのアダクトイオン及び、脱水、脱アンモニウムなどのフラグメントイオンが含まれているので、これらの分子量関連イオンを削除した。しかし、物質特異的なアダクトやフラグメントも存在するため、すべてを精査することはできなかった。精査したピークについて、ｍ／ｚとＭＴの値をもとに、各試料間のピークの照合・整列化を行った。
ＡＤＳＣの未分化性及び健常性に関与し得る代謝産物の解析結果を以下に示す。 Data processing and analysis
Peaks detected by CE-TOFMS are automatically extracted using MasterHands ver.2.13.0.8.h (developed by Keio University), an automatic integration software. As peak information, mass-to-charge ratio (m / z), electrophoresis time ( Migration time: MT) and peak area values were obtained. The peak area value obtained is the following formula:
Relative area value = Area value of target peak / Area value of internal standard substance × Sample amount was converted into a relative area value. Moreover, since these data include adduct ions such as Na + and K + and fragment ions such as dehydration and deammonium, these molecular weight related ions were deleted. However, since there were substance-specific adducts and fragments, it was not possible to examine all of them. With respect to the examined peaks, the peaks between the samples were collated and aligned based on the values of m / z and MT.
The analysis results of metabolites that may be involved in ADSC undifferentiation and health are shown below.

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド関連（ＮＡＤ+／ＮＡＤＨ）
ＮＡＤＨは生体内の還元剤であり、エネルギー通貨である。ＮＡＤＨは酸化されることによってＮＡＤ+となり、引き換えにエネルギーを別の分子に供与する（酸化還元反応）。ＮＡＤＨは主に解糖系から産生されるため、酸素濃度２１％にてＮＡＤＨが高水準にあることが見て取れる。一方で使用済みのＮＡＤＨ、すなわちＮＡＤ+は酸素濃度１％がもっとも高く、ついで２１％、５％の順であった（図１）。酸素濃度１％では、ＮＡＤＨが少なくＮＡＤ+が多いことから、解糖系以外のミトコンドリアなどによるエネルギー産生に傾いていることが考えられ、フリーラジカルの発生など細胞へのストレスが過大になっていると推察できる。また、酸素濃度２１％では過大に解糖をおこなってＮＡＤＨを産生するものの、酸化物ＮＡＤ+も多くなっており、細胞全体として過剰なエネルギー消費（浪費）をしていると考えられる。一方、酸素濃度５％はちょうど中間であり、特にＮＡＤ+が少ないという面では酸化物の蓄積が少ないと考察できる。ＮＡＤ+が少ないということは、それだけ細胞の酸化ストレスがかかっていないと考えることができる。 Nicotinamide adenine dinucleotide-related (NAD + / NADH)
NADH is an in vivo reducing agent and an energy currency. When NADH is oxidized, it becomes NAD + and exchanges energy to another molecule (oxidation-reduction reaction). Since NADH is mainly produced from glycolysis, it can be seen that NADH is at a high level at an oxygen concentration of 21%. On the other hand, used NADH, that is, NAD +, had the highest oxygen concentration of 1%, followed by 21% and 5% in this order (FIG. 1). At an oxygen concentration of 1%, NADH is low and NAD + is high, so it may be inclined to produce energy by mitochondria other than glycolytic systems, and stress on cells such as generation of free radicals is excessive. Can be guessed. In addition, when the oxygen concentration is 21%, glycolysis is excessively produced and NADH is produced, but the oxide NAD + is also increased, and it is considered that the entire cell consumes excessive energy (waste). On the other hand, the oxygen concentration of 5% is just in the middle, and it can be considered that there is little oxide accumulation especially in terms of low NAD + . It can be considered that the amount of NAD + is small, the cell is not so oxidative stressed.

グルタチオン関連（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）
還元型グルタチオン（ＧＳＨ）が酸素濃度５％で減少し、酸化型（ＧＳＳＧ）に変動がなかった（図２）。細胞ではＧＳＨの量が増えると活性酸素除去に働き、活動に好影響があるといわれている。一方で、ＧＳＨの出発物質であるシステイン（Ｃｙｓ）の量が少ないことがわかる。すなわち、幹細胞においてはＧＳＨを必要としない状況、つまり解毒、還元反応が行われていない状況が酸素濃度５％で起こっていると考えられる。 Glutathione related (GSH / GSSG)
Reduced glutathione (GSH) decreased at an oxygen concentration of 5%, and there was no change in oxidized form (GSSG) (FIG. 2). It is said that when the amount of GSH increases in cells, it works to remove active oxygen and has a positive effect on the activity. On the other hand, it can be seen that the amount of cysteine (Cys) which is the starting material of GSH is small. That is, it is considered that a situation where stem cells do not require GSH, that is, a situation where no detoxification or reduction reaction is performed occurs at an oxygen concentration of 5%.

解糖系関連（グルコース６リン酸／乳酸／ＡＴＰ）
低酸素性ストレスマーカーとして乳酸が上げられる。乳酸が増加する環境下では、解糖系よるエネルギー獲得が不利になり、活性酸素が増加することが知られている。これについて、酸素濃度１％で乳酸量が増えていることがわかる（図３）。さらに解糖系の中間代謝物であるグルコース６リン酸（Ｇ６Ｐ）が酸素濃度１％で増加している。これらのデータは解糖経路の反応速度が酸素不足により低下し、中間産物の滞留が起きていることを示す。どの場合においても、酸素濃度１％での低酸素ストレスが顕著であるのに対し、酸素濃度５％及び２１％では、解糖系において大きな障害は見られなかった。さらにＡＴＰについても酸素濃度１％にて増加が見られた。酸素濃度１％では他条件に比べてミトコンドリアによるＡＴＰ獲得が優位になっていることが考察される。ミトコンドリアでのエネルギー産生は過酸化物質を副産物として生じるため、酸素濃度１％では、細胞毒性が亢進しているものと考えられる。 Glycolysis related (glucose 6-phosphate / lactic acid / ATP)
Lactic acid is raised as a hypoxic stress marker. In an environment where lactic acid increases, it is known that energy acquisition by the glycolysis system is disadvantageous and active oxygen increases. It can be seen that the amount of lactic acid increases at an oxygen concentration of 1% (FIG. 3). Furthermore, glucose 6-phosphate (G6P), an intermediate metabolite of glycolysis, increases at an oxygen concentration of 1%. These data indicate that the reaction rate of the glycolytic pathway is decreased due to lack of oxygen, and intermediate product retention occurs. In all cases, hypoxic stress at an oxygen concentration of 1% was significant, whereas no major obstacles were found in the glycolysis at oxygen concentrations of 5% and 21%. Further, ATP also increased at an oxygen concentration of 1%. It is considered that ATP acquisition by mitochondria is superior to other conditions at an oxygen concentration of 1%. Since energy production in mitochondria occurs as a by-product of peroxide, it is considered that cytotoxicity is enhanced at an oxygen concentration of 1%.

ペントースリン酸回路関連（グルコース６リン酸／リブロース５リン酸）
ニコチンアミドを供給するペントースリン酸回路が酸素濃度１％で活性化しており、具体的には、グルコース６リン酸、リブロース５リン酸の増加が認められた（図４）。この回路は低酸素で停滞する解糖系の迂回路であるとともに、低酸素性ＲＯＳの消去に必要なニコチンアミドの産生強化を支えている。 Pentose phosphate cycle related (glucose 6 phosphate / ribulose 5 phosphate)
The pentose phosphate cycle supplying nicotinamide was activated at an oxygen concentration of 1%, and specifically, increases in glucose 6-phosphate and ribulose 5-phosphate were observed (FIG. 4). This circuit is a bypass of the glycolysis that stagnate in low oxygen, and supports the enhancement of nicotinamide production necessary for eliminating hypoxic ROS.

１−３）ＡＤＳＣのマイクロアレイ解析
アジレント human 4x44K マイクロアレイ（Agilent Technologies 社）を用いてマイクロアレイ解析を行った。
試料の調製及びハイブリダイゼーションはAgilent Technologies 社推奨プロトコルに準じた。また、試料に用いた細胞は、上記１−１）に従い、各酸素条件（１％、５％、２１％）にて各Ｎ＝４とし、３日間培養した皮下脂肪由来間葉系幹細胞を用いた。ＲＮＡの全量１〜２μgを、ｃＲＮＡラベル化キット（Agilent Technologies 社）を用いてラベル化した。Qiaquick（Qiagen社，メーカー推奨プロトコル）にて精製後、SpeedVacにより溶媒を乾燥した。次に、アジレント human 4x44K マイクロアレイを用いてハイブリダイゼーション後、スライドガラスを洗浄した。スキャナー（Agilent Technologies 社）によりデータ読み取りを行った。
ＡＤＳＣの未分化性及び健常性に関与し得るマイクロアレイの解析結果を以下に示す。 1-3) Microarray analysis of ADSC Microarray analysis was performed using an Agilent human 4x44K microarray (Agilent Technologies).
Sample preparation and hybridization were in accordance with Agilent Technologies recommended protocol. The cells used in the samples were mesenchymal stem cells derived from subcutaneous fat that had been cultured for 3 days with each N = 4 under each oxygen condition (1%, 5%, 21%) according to 1-1) above. It was. A total amount of 1-2 μg of RNA was labeled using a cRNA labeling kit (Agilent Technologies). After purification with Qiaquick (Qiagen, manufacturer recommended protocol), the solvent was dried with SpeedVac. Next, the slide glass was washed after hybridization using an Agilent human 4x44K microarray. Data reading was performed with a scanner (Agilent Technologies).
The analysis results of the microarray that can be involved in undifferentiated and healthy ADSC are shown below.

ＣＴＮＮＢ１／ＣＳＮＫ１Ｄ／ＰＰＡＲＧ
酸素濃度５％の優位性として幹細胞の自己複製に関与するベータカテニン（ＣＴＮＮＢ１）の発現が特異的に亢進した（図５）。同時にシグナル上流にあたるカゼインキナーゼ１Ｄ（ＣＳＮＫ１Ｄ）の発現も亢進した。さらに同条件にてＡＤＳＣの性質を運命付けるＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲＧ）も特異的に亢進した。 CTNNB1 / CSNK1D / PPARG
The expression of beta-catenin (CTNNB1) involved in stem cell self-replication was specifically enhanced as an advantage of 5% oxygen concentration (FIG. 5). At the same time, the expression of casein kinase 1D (CSNK1D) upstream of the signal was also increased. Furthermore, PPARγ (PPARG), which fate the properties of ADSC under the same conditions, was also specifically enhanced.

ＬＩＦＲ／ＴＣＦ−４
ＬＩＦＲは白血病抑制因子（ＬＩＦ）受容体であり、ＬＩＦＲにＬＩＦが結合することで、幹細胞の未分化維持機構が亢進することが知られている。また、ＴＣＦ−４は幹細胞にてベータカテニンと特異的に共役して働く転写因子であり、自己複製能力と発生誘導に関与する。酸素濃度５％の環境において、ＬＩＦＲ及びＴＣＦ−４の有意な発現亢進が認められた（図６）。 LIFR / TCF-4
LIFR is a leukemia inhibitory factor (LIF) receptor, and it is known that the mechanism for maintaining undifferentiation of stem cells is enhanced by binding of LIF to LIFR. TCF-4 is a transcription factor that specifically couples with beta-catenin in stem cells and is involved in self-replication ability and developmental induction. Significant increases in expression of LIFR and TCF-4 were observed in an environment with an oxygen concentration of 5% (FIG. 6).

ＦＧＦ２
塩基性繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）は酸素濃度が高い（２１％）場合に発現が減少した（図７）。ＦＧＦ２は体性幹細胞の培養において必要な因子である。 FGF2
Expression of basic fibroblast growth factor (FGF2) decreased when the oxygen concentration was high (21%) (FIG. 7). FGF2 is a factor necessary for the culture of somatic stem cells.

ＶＥＧＦＡ／ＴＧＦＢ２
過度な血管新生を生じる因子として血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦＡ）が挙げられるが、この遺伝子も酸素濃度１％で亢進することが示された（図８）。
また、細胞死に関わる因子であるトランスフォーミング増殖因子２（ＴＧＦＢ２）の発現亢進も認められた。 VEGFA / TGFB2
Vascular endothelial growth factor (VEGFA) is mentioned as a factor causing excessive angiogenesis, and this gene was also shown to be enhanced at an oxygen concentration of 1% (FIG. 8).
In addition, increased expression of transforming growth factor 2 (TGFB2), which is a factor related to cell death, was also observed.

Claims (7)

未分化性及び健常性を維持した間葉系幹細胞を培養するための方法であって、間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度において間葉系幹細胞を培養することを含んで成る、方法。   A method for culturing mesenchymal stem cells maintaining undifferentiated and healthy conditions, and culturing mesenchymal stem cells at an oxygen concentration suitable for maintaining undifferentiated and healthy mesenchymal stem cells A method comprising: 間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約１％超から約２１％未満であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。   2. The method of claim 1, wherein the oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy state of mesenchymal stem cells is greater than about 1% to less than about 21%. 間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約３％から約７％であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, wherein the oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy state of mesenchymal stem cells is about 3% to about 7%. 間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約１％超から約５％以下であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy state of the mesenchymal stem cells is more than about 1% to about 5% or less. 間葉系幹細胞の未分化性及び健常性を維持するために適した酸素濃度が、約５％であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the oxygen concentration suitable for maintaining the undifferentiated and healthy state of mesenchymal stem cells is about 5%. 前記間葉系幹細胞が真皮毛根鞘（ＤＳ）細胞であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the mesenchymal stem cell is a dermal root sheath (DS) cell. 前記間葉系幹細胞が脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the mesenchymal stem cell is a fat-derived mesenchymal stem cell.
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