JPWO2014104076A1 - 形質転換ユーグレナ及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、ユーグレナに対してエレクトロポレーションにより二本鎖RNAを導入し、RNAiにより特定のmRNAを消失させることに成功したという例が報告されている(非特許文献1及び2)。また、ユーグレナを形質転換しようとする様々な試みがなされてきた。
[1−1]
薬剤耐性遺伝子及び目的外来遺伝子を、発現可能に保持しているユーグレナ。
[1−2]
前記薬剤の非存在下における継代培養において、少なくとも10代目まで前記薬剤耐性遺伝子及び前記目的外来遺伝子を発現可能に保持している、[1−1]に記載のユーグレナ。
[1−3]
前記薬剤が、ゼオシン、ハイグロマイシン又はG418である、[1−1]又は[1−2]に記載のユーグレナ。
[1−4]
前記薬剤耐性遺伝子及び前記目的外来遺伝子が、少なくともユーグレナ内在性プロモーターの制御下にある、[1−1]〜[1−3]のいずれか一項に記載のユーグレナ。
[1−5]
前記薬剤耐性遺伝子及び前記目的外来遺伝子が、ゲノムに組み込まれている、[1−1]〜[1−4]のいずれか一項に記載のユーグレナ。
[1−6]
(1)前記薬剤耐性遺伝子及び前記目的外来遺伝子をアグロバクテリウム法によりユーグレナに導入する工程
を含む方法により得られうる、項[1−1]〜[1−5]のいずれか一項に記載のユーグレナ。
[1−7]
さらに、
(2)前記工程(1)で得られたユーグレナを、前記薬剤の存在下で培養する工程
を含む方法により得られうる、[1−6]に記載のユーグレナ。
[1−8]
前記培養を、pH6〜8で行う、[1−7]に記載のユーグレナ。
[2−1]
薬剤耐性遺伝子及び目的外来遺伝子を、発現可能に保持しているユーグレナの製造方法であって:
(1)前記薬剤耐性遺伝子及び前記目的外来遺伝子をアグロバクテリウム法によりユーグレナに導入する工程
を含む方法。
[2−2]
さらに、
(2)前記工程(1)で得られたユーグレナを、前記薬剤の存在下で培養する工程
を含む[2−1]に記載の方法。
[2−3]
前記薬剤が、ゼオシン、ハイグロマイシン又はG418である、[2−1]又は[2−2]に記載の方法。
[2−4]
前記培養を、pH6〜8で行う、[2−3]に記載の方法。
[2−5]
前記薬剤耐性遺伝子及び前記目的外来遺伝子が、少なくともユーグレナ内在性プロモーターの制御下にある、[2−1]〜[2−4]のいずれか一項に記載の方法。
[2−6]
前記ユーグレナが、前記薬剤耐性遺伝子及び前記目的外来遺伝子が、相同組替えにより染色体ゲノムに組み込まれているユーグレナである、[2−1]〜[2−5]のいずれか一項に記載の方法。
本発明のユーグレナは、薬剤耐性遺伝子及び目的外来遺伝子を、発現可能に保持しているユーグレナである。
本発明のユーグレナ製造方法は、薬剤耐性遺伝子及び目的外来遺伝子を、発現可能に保持しているユーグレナの製造方法であって:
(1)前記薬剤耐性遺伝子及び前記目的外来遺伝子をアグロバクテリウム法によりユーグレナに導入する工程
を含む方法である。
(2)前記工程(1)で得られたユーグレナを、導入した薬剤耐性遺伝子が耐性を示す薬剤の存在下で培養する工程
を含んでいてもよい。
二回以上繰り返す場合は、特に限定されないが、培養開始時の細胞数を、必要に応じて段階的に減らしてもよい。特に限定されないが、前の段階の5分の1〜2分の1程度に減らしてもよい。
実施例において、用いたユーグレナは以下の通りである。
実施例において、ユーグレナの培養方法は以下の通りとした。
薬剤耐性遺伝子導入用プラスミドDNAを次のようにして作成した。
LB液体培地を使用して培養し、グリセロールストックからの起菌と、形質転換体の選択の際には、1.5%(w/v)の寒天粉末を含む平板培地を用いた。培地の態様を問わず、以下の文中のLB培地はすべて終濃度50μg/mlのリファンピシンを添加して使用した。また、アグロバクテリウム形質転換体の培養には、リファンピシンだけでなく、カナマイシンを終濃度100 μg/mlで添加したLB培地を用いた。
5.1 アグロバクテリウムコンピテントセルの作製
Cold Spring Harborの方法(Detlef, W.ら、「Transformation of Agrobacterium Using Electroporation.」、2006年、Cold Spring Harbor Protocols.)にしたがって行った。グリセロールストックより、LB平板培地にアグロバクテリウムをストリークし、静置培養(28℃)した。2〜3日後に現れたシングルコロニーを3 mlのLB培地で培養した。定常期に達した培養液2 mlを200 mlのLB培地に加え、180 rpmで振盪培養した。OD550が0.5 〜 1.0になった培養液を遠心分離し(4000×g, 4 ℃, 10 min)、滅菌水で沈殿を3回洗浄した。滅菌水の量は、一回目が200 ml、二回目と三回目が100 mlとした。洗浄した沈殿を、2 mlの10%グリセロールで懸濁し、50 μlずつマイクロ遠心チューブに分注後、液体窒素で凍結し、これをアグロバクテリウムコンピテントセルとして−80℃で保存した。
コンピテントセルに対し、0.5 μgのDNAを加え、キュベット(2 mm gap)に入れた。その後、以下の条件でエレクトロポレーションを行った。
電圧:2.4 kV
抵抗:129 Ω
電気容量:50 μF
プラスミドDNA量:1 μg
パルス後の細胞を回収し、LB液体培地を加え、2〜4 h, 28 ℃で振盪培養後、LB選択平板培地(100 μg/ml カナマイシン, 50 μg/ml リファンピシン)にスプレッドし、28 ℃で静置培養した。3〜5日後に現れたシングルコロニーを、アグロバクテリウム形質転換体として使用した。
KH培地(pH 6.8)で4〜5日培養したユーグレナを、細胞数計測後、IM液体培地で懸濁し、5.0×106cells/mlとした。
薬剤選択を行った細胞の回収は以下のように行った。平板選択培地上において、27℃で2週間程度培養し、プレート上でlawn状になった細胞を、5 mlの滅菌水に懸濁することで回収した。細胞懸濁液中の細胞数を計測し、0.5×106cellsの細胞を再度平板選択培地(ゼオシン25 μg/mlまたは50 μg/ml, セフォタキシム100 μg/ml)で培養した。細胞は増殖後懸濁し、再び選択平板培地で培養した。培養時の初期細胞数は、0.5×106cellsから、継代ごとに段階的に減らした。数回継代した後、平板選択培地上に形成されたシングルコロニーを回収し、3 mlの液体選択培地(ゼオシン50 μg/ml, セフォタキシム50 μg/ml)で培養し、良好な生育が見られたものを単離ユーグレナ形質転換体とした。
50 μg/mlのゼオシンを添加したKH液体培地で培養と継代を繰り返した細胞を、ゼオシンを添加していないKH液体培地で図14、図15に示した回数、培養と継代を繰り返した。継代は1週間ごとに150分の1量の細胞を、新たなKH液体培地に移すことで行った。
これによって一定期間薬剤にさらされなくなった細胞を、再びゼオシン50 μg/mlのKH液体培地で培養し、生育を調べた。
5.6.1 ユーグレナ形質転換体からのtotal DNA抽出
ゼオシンを添加した培地、あるいはしていない培地において4〜5日間培養したユーグレナ形質転換体を、遠心分離により回収した後、PBS(−)(10×PBS(−)の組成を表5に示す)で2回洗浄した。細胞体積に対して3〜4倍量のNTES(表6)で懸濁し、65℃で10分間加熱した。さらに同量のPCIを加えた後、激しく撹拌し、遠心分離(17400×g, 4℃, 5 min)した。ここから回収した上清に対し、等量のPCIを添加し、攪拌後、再度遠心分離した。回収した上清に対して、1/10量の3M NaOAcを添加し、数回反転後、2.5倍量の100%エタノールを加え、混合した。室温で15分間静置し、遠心分離(11100×g, 4℃, 5 min)した。上清を完全に除去し、1 mlの70%エタノールで沈殿を洗浄した。沈殿を室温で風乾した後、20 μg/mlの RNase Aを含むTE bufferで沈殿を溶解し、37℃で一晩RNA分解したものをtotal DNA溶液とした。
下記の条件でPCRを行った。プライマーは、ゼオシン耐性遺伝子領域を増幅するように設計した。PCR 反応系を表7、PCR 反応条件を図4にそれぞれ示す。
Reverse Primer: 5’- TGCTCGCCGATCTCGGTCATGG -3’ (配列番号5)
TAE buffer(表8)に対して1.5%濃度になるようにアガロースを溶解し、0.1 μg/mlとなるようにエチジウムブロマイドを添加してゲルを作製した。PCR終了後の反応液5 μlをウェルにアプライし、100 Vで泳動した後、AE-6905(ATTO)を用い、UV照射によるDNA検出を行った。
5.7.1 ユーグレナ形質転換体からのtotal RNA抽出
RNAの抽出にはISOGEN II(NIPPON GENE)を用いた。試薬は、原則としてRNase freeのものを用い、水はDEPC処理したものを使用した。
逆転写反応にはSuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen)を使用した。total RNA 5 μg分を用いてRT-PCRを行った。
上記の反応液1を65℃で5分間インキュベートし、氷上で急冷した。
6.1.1 ユーグレナ野生株に対するゼオシンの最小生育阻止濃度
pH 6.8の培地におけるユーグレナ野生株に対するゼオシンの最小生育阻止濃度を確認した。その結果、液体培地は50 μg/mlで完全に、平板培地では25 μg/mlで概ね生育を阻害できることが分かった。この生育阻害は、培養開始時の細胞数が比較的多い場合(液体培地では2.0×106cells/ml, 平板培地では2.0×106 cells/plate)においても確認できた。100 μg/mlのゼオシンを含む培地では、液体培地(図5)、平板培地(図6)のどちらにおいてもユーグレナ野生株の生育がほぼ完全に抑制できた。
アグロバクテリウム法による形質転換において、アグロバクテリウムの除去のために用いられるセフォタキシムが、ユーグレナの生育に及ぼす影響について調べた。その結果、少なくともセフォタキシムは500 μg/mlまでユーグレナ野生株の生育に影響を与えないことが分かった(図8)。そのため、選択培地にはセフォタキシムを添加して使用した。
共培養の方法は、5.3に示した方法で行った。共培養に用いた液体培地はKH培地とIM培地である。IM培地はアグロバクテリウム法による形質転換を行う際に頻用される培地である。本実験で用いたものはpHが5.3であり、vir遺伝子群の誘導物質であるアセトシリンゴンが100 μMの濃度で含まれており、誘導因子の一つであるグルコースが10 mMの濃度で含まれているなどの特徴を持つ。これらの培地を用いて共培養を行った結果、ユーグレナ形質転換体が選択培地上においてより良好な生育を見せたのはIM培地を用いたものであった。また、導入遺伝子のプロモーターに外来性のpCMVを用いた系と、内在性のpNORを用いた系で比較した場合は、pNOR系の方が良好な生育を示すという傾向が見られた。
共培養終了後にセフォタキシム(セフォタキシムナトリウム 500 μg/ml)で培養液を洗浄した。そして選択培地のゼオシン濃度を25 μg/mlに、セフォタキシム濃度を100 μg/mlとした。そして形質転換体の単離を行う際に、ゼオシン濃度を段階的に上げていくことにより形質転換体を効果的に得ることができた。
単離したユーグレナ形質転換体の薬剤耐性について観測した。ユーグレナ形質転換体をKH培地および、選択液体培地(いずれもpH 6.8)で培養した。その結果、形質転換体細胞は比較的良好な生育を示したが、薬剤を含まない条件における生育との差は大きかった(図11)。6.1.1の結果より、pH 6.8の選択液体培地では、形質転換体以外の細胞はほぼ増殖しないと考えられため、薬剤による形質転換体の単離は十分であると考えられる。つまり、形質転換体が十分に薬剤耐性を示せていない原因が、細胞株の単離の不完全さによるものではない可能性が示唆された。薬剤耐性が十分でない要因の一つに、導入遺伝子の発現量の問題が挙げられ、今回使用したプロモーターでは十分な発現量が得られていない可能性が考えられる。また、アグロバクテリウム法では、導入遺伝子がゲノムに挿入されるが、その部位はランダムである。導入遺伝子の発現量は挿入箇所に依存する傾向があるとされるため、挿入部位によっては十分な発現レベルに達していない可能性が考えられる。
ユーグレナ形質転換体から抽出したtotal DNAを鋳型としてPCRによる解析を行ったところ、ゼオシン耐性遺伝子領域に相当する断片を増幅することに成功した(図12)。
ユーグレナ形質転換体から抽出したtotal RNAを鋳型として合成したcDNAを鋳型とし、ゼオシン耐性遺伝子の検出を試みたところ、これに相当する断片が得られた(図13)。
ゼオシンを含まない条件で継代を続けた形質転換体と、それを再びゼオシンを含む培地に継代して培養した細胞で生育を比較したところ、どちらにおいても十分な生育が確認できた(図14)。このことから、薬剤非存在下でしばらくの間培養しても、薬剤耐性は十分に維持されることが示された。また、培養開始時からの***回数で比較した場合、両者でほとんど差はみられず、形質転換によって獲得された形質は、安定に維持されているものと考えられた(図15)。
G418耐性を担うネオマイシン耐性遺伝子の導入実験を行った。用いたネオマイシン耐性遺伝子は配列番号7に示した。実験方法は、ゼオシンでの選択と同様に行った。G418濃度は10 μg/mlで行った。得られたG418耐性形質転換体からは図16、図17に示すようにネオマイシン耐性遺伝子のDNAおよび転写産物が検出された。
ハイグロマイシン耐性遺伝子の導入実験を行った。用いたハイグロマイシン耐性遺伝子は配列番号8に示した。実験方法は、ゼオシンでの選択と同様に行った。ハイグロマイシン濃度は10 μg/mlで行った。得られたハイグロマイシン耐性形質転換体からは図18、図19に示すようにハイグロマイシン耐性遺伝子のDNAおよび転写産物が検出された。
Claims (8)
- 薬剤耐性遺伝子及び目的外来遺伝子を、発現可能に保持しているユーグレナ。
- 前記薬剤の非存在下における継代培養において、少なくとも10代目まで前記薬剤耐性遺伝子及び前記目的外来遺伝子を発現可能に保持している、請求項1に記載のユーグレナ。
- 前記薬剤が、ゼオシン、ハイグロマイシン又はG418である、請求項1又は2に記載のユーグレナ。
- (1)薬剤耐性遺伝子及び目的外来遺伝子をアグロバクテリウム法によりユーグレナに導入する工程
を含む方法により得られうる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のユーグレナ。 - 薬剤耐性遺伝子及び目的外来遺伝子を、発現可能に保持しているユーグレナの製造方法であって:
(1)薬剤耐性遺伝子及び目的外来遺伝子をアグロバクテリウム法によりユーグレナに導入する工程
を含む方法。 - さらに、
(2)前記工程(1)で得られたユーグレナを、前記薬剤の存在下で培養する工程
を含む請求項5に記載の方法。 - 前記薬剤が、ゼオシン、ハイグロマイシン又はG418である、請求項5又は6に記載の方法。
- 前記培養を、pH6〜8で行う、請求項7に記載の方法。
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