JPWO2010061862A1 - Anticancer agent containing thalidomide derivative as active ingredient - Google Patents

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Abstract

下記の化合物から選ばれるサリドマイド誘導体を有効成分とする抗癌剤を提供する。Provided is an anticancer agent comprising a thalidomide derivative selected from the following compounds as an active ingredient.

Description

本発明は、サリドマイド誘導体を有効成分として含有するヒト骨髄腫をはじめとする各種癌細胞の増殖を阻害する薬剤及びその阻害方法、更にはヒトの癌治療におけるこのような薬剤の使用に関する。   The present invention relates to a drug that inhibits the growth of various cancer cells including human myeloma containing a thalidomide derivative as an active ingredient, a method for inhibiting the same, and the use of such a drug in the treatment of human cancer.

多発性骨髄腫は、形質細胞が腫瘍性に増殖する造血器腫瘍である。いくつかの化学療法や、大量療法を組み合わせた自家造血幹細胞移植により多発性骨髄腫の患者の生存率は改善しているが、いまだに有効な治療を得られていない。現在、ほとんどの多発性骨髄腫の患者は治療に抵抗性となり、最終的に死に至る。そのため、新しい治療薬の開発が広く求められている。 Multiple myeloma is a hematopoietic tumor in which plasma cells grow neoplasticly. Although some chemotherapy and autologous hematopoietic stem cell transplant combined with high-dose therapy have improved the survival of patients with multiple myeloma, they still have no effective treatment. Currently, most patients with multiple myeloma become resistant to treatment and eventually die. Therefore, the development of new therapeutic drugs is widely demanded.

サリドマイドは1957年ドイツのグリュネンタール社が安全な催眠剤として発売した。日本でも1958年大日本製薬からサリドマイド剤が発売されている。しかし、1961年W.レンツ博士により、サリドマイドを妊娠初期の妊婦が服用すると胎児に奇形が生じることが明らかにされた。サリドマイド剤の発売は日本では1962年に停止されたが、多くのサリドマイド児が生まれた。このように同薬は世界中で甚大な被害をもたらした。1994年、米国よりサリドマイドは抗血管新生作用を有することが発表された(D'Amato, R.J., 等 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,4082-4085)。最近の研究において、骨髄中では微小血管の密度が上昇し、血管新生にかかわる増殖因子の血漿濃度が多発性骨髄腫の患者で有意に上昇していることが明らかになり(Vacca, A., 等(1999) Blood 93,3064-3073; Sato, N., 等 (2002) Jpn. J. Cancer Res., 93,459-466; Du, W., 等 (2004) Pathol. Int., 54,285-294)、同疾患においても血管新生が病態に重要な役割を果たすことが報告されるようになった。   Thalidomide was launched in 1957 by Grunenthal of Germany as a safe hypnotic. In 1958, Dainippon Pharmaceutical launched a thalidomide agent in 1958. However, in 1961, Dr. W. Lenz revealed that when thalidomide was taken by a pregnant woman in early pregnancy, the fetus was malformed. The sale of thalidomide was stopped in Japan in 1962, but many thalidomide children were born. In this way, the drug caused tremendous damage worldwide. In 1994, it was announced by the United States that thalidomide has an anti-angiogenic action (D'Amato, R.J., et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,4082-4085). Recent studies have shown that the density of microvessels is increased in the bone marrow, and that plasma concentrations of growth factors involved in angiogenesis are significantly increased in patients with multiple myeloma (Vacca, A., (1999) Blood 93, 3064-3073; Sato, N., et al. (2002) Jpn. J. Cancer Res., 93,459-466; Du, W., et al. (2004) Pathol. Int., 54, 285-294) In this disease, angiogenesis has been reported to play an important role in the pathology.

そして1999年、サリドマイドが多発性骨髄腫に有効であるということが報告された(非特許文献１)。現在のところ、同薬は多岐にわたる機序によって抗骨髄腫効果がもたらされると推測されている。すなわち、(1)直接骨髄腫細胞死（アポトーシス）を誘導する、(2)骨髄腫細胞と間質細胞の相互利用を抑制する、(3)腫瘍血管新生を抑制する、(4)骨髄腫細胞の増殖因子の産生を抑制する、（5）抗骨髄腫免疫を活性化するなどの作用が考えられている。サリドマイド自体は生物学的活性が低いが、体内で活性化し、TNFα（tumor necrosis factor α：腫瘍壊死因子α）、interferon γ（インターフェロンγ）、IL-10（interleukin-10：インターロイキン-10）、cyclooxygenase（シクロオキシゲナーゼ〔COX-2〕）、nuclear factor-κB（NF-κB：核内転写因子κB）、related adhesion focal tyrosine kinase（RAFTK：関連性接着フォーカルチロシンキナーゼ）などに作用することによって、直接骨髄腫細胞の細胞周期G1停止やアポトーシスを誘導すると推測されている(非特許文献２; 非特許文献３; 非特許文献４)。一方、米国ではサリドマイド誘導体であるレナリドミドが開発されている。第III相試験において、サリドマイドを凌駕する治療成績が報告され、その一方で末梢神経障害が少ないという報告がされた(非特許文献５)。また、レナリドミドはin vitroにおいても骨髄腫細胞の増殖抑制やアポトーシス誘導を引き起こす(非特許文献３)。   In 1999, thalidomide was reported to be effective for multiple myeloma (Non-patent Document 1). At present, it is speculated that the drug has antimyeloma effects through a variety of mechanisms. (1) directly induces myeloma cell death (apoptosis), (2) suppresses mutual use of myeloma cells and stromal cells, (3) suppresses tumor angiogenesis, (4) myeloma cells It has been considered to suppress the production of growth factors, and (5) activate anti-myeloma immunity. Although thalidomide itself has low biological activity, it is activated in the body, such as TNFα (tumor necrosis factor α), interferon γ (interferon γ), IL-10 (interleukin-10), Direct bone marrow by acting on cyclooxygenase (cyclooxygenase [COX-2]), nuclear factor-κB (NF-κB: nuclear transcription factor κB), related adhesion focal tyrosine kinase (RAFTK) It is presumed to induce cell cycle G1 arrest and apoptosis of tumor cells (Non-patent document 2; Non-patent document 3; Non-patent document 4). On the other hand, lenalidomide, a thalidomide derivative, has been developed in the United States. In a phase III study, a therapeutic result surpassing thalidomide was reported, while it was reported that peripheral neuropathy was low (Non-patent Document 5). In addition, lenalidomide causes growth inhibition and apoptosis induction of myeloma cells even in vitro (Non-patent Document 3).

上記のようにさまざまな機構によって抗骨髄腫作用を示すサリドマイドやレナリドミドであるが、催奇形性や好中球減少症、深部静脈血栓症などの副作用が問題となっている(非特許文献６; 非特許文献７; 非特許文献８)。また、第13番染色欠失やt(4;14)転座を起こしたハイリスク群と呼ばれる予後不良な多発性骨髄腫に対する治療効果が不十分であるといわれている(非特許文献９; 非特許文献１０; 非特許文献１１)。サリドマイド誘導体に関しては、これまでTC11がアミノペプチダーゼN酵素阻害剤や血管新生阻害剤(特許文献１)およびチューブリンの重合阻害剤(非特許文献１２; 非特許文献１３)として作用することが知られている。従って、サリドマイドの抗腫瘍効果を増強し、かつ催奇形性や副作用の少ない誘導体の開発が期待されている。   As described above, thalidomide and lenalidomide exhibit antimyeloma action by various mechanisms as described above, but side effects such as teratogenicity, neutropenia and deep vein thrombosis are problematic (Non-Patent Document 6; Non-patent document 7; Non-patent document 8). Moreover, it is said that the therapeutic effect with respect to multiple myeloma with a poor prognosis called the high-risk group which caused No. 13 dyeing | staining deletion and t (4; 14) translocation was inadequate (nonpatent literature 9; Non-patent document 10; Non-patent document 11). Regarding thalidomide derivatives, it has been known that TC11 acts as an aminopeptidase N enzyme inhibitor, angiogenesis inhibitor (Patent Document 1), and a tubulin polymerization inhibitor (Non-Patent Document 12; Non-Patent Document 13). ing. Therefore, it is expected to develop a derivative that enhances the antitumor effect of thalidomide and has few teratogenicity and side effects.

近年では造血器腫瘍のうち悪性リンパ腫や白血病の多くの症例が治癒に至るのに対し、多発性骨髄腫は、いまだに致死性の予後不良疾患である。近年、造血幹細胞移植法に加えて、サリドマイドやその誘導体さらにはボルテゾミブといった新規薬剤が登場し、難治・再発例にも良好な反応が得られている(非特許文献１４)。しかし、いずれの症例も数年先にはこれら新規薬剤にも耐性となり、最終的には致命的となる。また、サリドマイドを使用する限り催奇形性の他、深部静脈血栓症・末梢神経障害・好中球減少症や呼吸器合併症といった重大なリスクは永遠に避けられない(非特許文献１５; 非特許文献１６)。かかる現状打破のために、骨髄腫に対して抗腫瘍効果が高く、催奇形性や耐性化のない薬剤が求められている。   In recent years, many cases of malignant lymphoma and leukemia have been cured among hematopoietic tumors, whereas multiple myeloma is still a fatal disease with a poor prognosis. In recent years, in addition to the hematopoietic stem cell transplantation method, new drugs such as thalidomide, its derivatives, and bortezomib have appeared, and favorable reactions have been obtained in intractable / recurrent cases (Non-patent Document 14). However, both cases become resistant to these new drugs in the years ahead and eventually become fatal. Moreover, as long as thalidomide is used, in addition to teratogenicity, serious risks such as deep vein thrombosis, peripheral neuropathy, neutropenia and respiratory complications are unavoidable (Non-patent Document 15; Non-patent Document) Reference 16). In order to overcome this situation, there is a demand for a drug that has a high antitumor effect against myeloma and does not have teratogenicity or resistance.

WO 98/007421WO 98/007421

Singhal, S., (1999) New Engl. J. Med., 341:1565-1571Singhal, S., (1999) New Engl. J. Med., 341: 1565-1571 Franks, M.E.,等 (2002) Lancet, 363,1802-1811Franks, M.E., etc. (2002) Lancet, 363,1802-1811 Hideshima, T., 等 (2000) Blood 96,2943-2950Hideshima, T., etc. (2000) Blood 96,2943-2950 Mitsiades, N., 等 (2002) Blood, 99,4525-4530Mitsiades, N., etc. (2002) Blood, 99,4525-4530 Richardson, P., (2005) Semin Hematol Oct;42 (4 Suppl 4), S9-15Richardson, P., (2005) Semin Hematol Oct; 42 (4 Suppl 4), S9-15 Glasmacher, A., 等 (2005) Br. J .Haematol., 132,584-593Glasmacher, A., et al. (2005) Br. J. Haematol., 132,584-593 Zangari, M., 等 (2004) Br. J. Haematol., 126,715-721Zangari, M., et al. (2004) Br. J. Haematol., 126,715-721 Weber, D.M., 等 (2007) New Engl. J. Med., 357,2133-2142Weber, D.M., et al. (2007) New Engl. J. Med., 357, 2133-2142 Gertz, M.A., 等 (2005) Blood,106,2837-2840Gertz, M.A., et al. (2005) Blood, 106,2837-2840 Chang, H., 等 (2005) Bone Marrow Transplant, 36,793-796Chang, H., et al. (2005) Bone Marrow Transplant, 36,793-796 van Rhee, F., 等 (2008) Blood, 112,1035-1038van Rhee, F., et al. (2008) Blood, 112,1035-1038 Inatsuki, S., 等 (2005) Bioorg.Med.Chem.Lett., 15,321-325Inatsuki, S., et al. (2005) Bioorg.Med.Chem.Lett., 15,321-325 Inatsuki, S., 等 (2008) Int.J.Mol.Med., 21,163-168Inatsuki, S., et al. (2008) Int.J.Mol.Med., 21,163-168 Karimoto,T., 等 (2002) Jan.J.Cancer Res.. 93,1029-1036Karimoto, T., et al. (2002) Jan. J. Cancer Res .. 93,1029-1036 Hattori, Y., 等 (2005) Br. J. Haematol.,128,885-887Hattori, Y., et al. (2005) Br. J. Haematol., 128,885-887 Hattori, Y., 等 (2004) Int. J. Hematol., 79,283-288Hattori, Y., et al. (2004) Int. J. Hematol., 79,283-288

本発明は、従来の治療薬に比べて優れた効果をもつ薬剤を提供することを目的とする。   An object of this invention is to provide the chemical | medical agent which has the effect outstanding compared with the conventional therapeutic agent.

本発明者らは、独自に設計・合成された多様なサリドマイド誘導体から、日本人の骨髄腫患者由来の各種骨髄腫細胞株に対して増殖抑制を示す薬剤をスクリーニングし、in vitroおよび骨髄腫坦癌マウスにおいて強い抗骨髄腫作用をもち、かつ従来の治療薬に比べて優れた効果をもつ薬剤を得ることに成功し、本発明を完成した。   The present inventors screened drugs showing growth inhibition against various myeloma cell lines derived from Japanese myeloma patients from a variety of thalidomide derivatives designed and synthesized uniquely. The present invention was completed by successfully obtaining a drug having a strong antimyeloma action in cancer mice and an effect superior to that of conventional therapeutic drugs.

本発明は、下記の化合物から選ばれるサリドマイド誘導体を有効成分とする抗癌剤を提供する。本発明の抗癌剤は、好ましくは骨髄腫用である。   The present invention provides an anticancer agent comprising a thalidomide derivative selected from the following compounds as an active ingredient. The anticancer agent of the present invention is preferably for myeloma.

化合物はTC11であることが好ましい。化合物TC11は、アポトーシス誘導剤、チューブリン断片化誘導剤、カスパーゼ依存的アポトーシスの誘導剤、又は、第１７番染色体欠失を有するハイリスク骨髄腫の治療薬として用いることができる。   Preferably the compound is TC11. Compound TC11 can be used as an apoptosis-inducing agent, tubulin fragmentation-inducing agent, caspase-dependent apoptosis-inducing agent, or therapeutic agent for high-risk myeloma having chromosome 17 deletion.

また、本発明は、上記サリドマイド誘導体を、抗癌治療を必要とする対象に投与することを含む癌の治療方法を提供する。   The present invention also provides a method for treating cancer comprising administering the thalidomide derivative to a subject in need of anticancer treatment.

本願明細書において、「抗癌」及び「抗腫瘍」は同義の用語として用いる。   In the present specification, “anticancer” and “antitumor” are used as synonymous terms.

本発明により、日本人の骨髄腫患者由来の各種骨髄腫細胞株に対して強い増殖抑制を示す薬剤が提供される。これらの薬剤はin vitroおよび骨髄腫坦癌マウスにおいても強い抗骨髄腫作用をもち、かつ従来の治療薬に比べて優れた効果をもつことが確認された。既存の医薬品のサリドマイドには、光学異性体のS体にのみ催奇形成などの副作用が見られることがわかっている。本発明のサリドマイド誘導体は光学活性体でないので、催奇形成などの副作用がない可能性が高い。   The present invention provides a drug that exhibits strong growth inhibition against various myeloma cell lines derived from Japanese myeloma patients. It was confirmed that these drugs have a strong antimyeloma action in vitro and in myeloma-bearing mice and have an excellent effect compared with conventional therapeutic agents. It is known that side effects such as teratogenesis are observed only in the S-form of optical isomers of thalidomide, an existing pharmaceutical product. Since the thalidomide derivative of the present invention is not an optically active substance, there is a high possibility that there is no side effect such as teratogenesis.

サリドマイド誘導体ライブラリーのデザインDesign of thalidomide derivative library TC11によるKMS-34細胞のPARPの切断（電気泳動写真）Cleavage of PARP in KMS-34 cells by TC11 (electrophoresis photo) TC11によるKMS-34細胞のDNAの断片化（電気泳動写真）Fragmentation of DNA in KMS-34 cells by TC11 (electrophoresis photo) 骨髄腫瘍坦癌マウスを用いたサリドマイド誘導体TC11の抗腫瘍効果Antitumor effect of thalidomide derivative TC11 using bone marrow tumor-bearing mice ビアコアによるセレクションSelection by Biacore 回収PCR産物の電気泳動（電気泳動写真）Electrophoresis of recovered PCR products (electrophoresis photo) ヌクレオフォスミンのドメイン構造Nucleophosmin domain structure リアルタイムＰＣＲによるヌクレオフォスミンの濃縮量の推移Changes in the concentration of nucleophosmin by real-time PCR KMS-L31-35 (ヌクレオフォスミン)のセンサーグラムKMS-L31-35 (Nucleophosmin) sensorgram 大腸菌発現蛋白質(ヌクレオフォスミン)のセンサーグラムSensorgram of E. coli expressed protein (nucleophosmin) α-チューブリンのドメイン構造Domain structure of α-tubulin KMS-L31-36 (α-チューブリン)の競合実験の結果（電気泳動写真）Results of competitive experiment with KMS-L31-36 (α-tubulin) (electrophoresis photo) TC11処理によるカスパーゼ依存的アポトーシスの誘導（電気泳動写真）Induction of caspase-dependent apoptosis by TC11 treatment (electrophoresis photo) TC11の造血障害作用の検証のためのコロニーアッセイColony assay for verification of TC11's hematopoietic disorder TC11血中濃度測定の検量線Calibration curve for TC11 blood concentration measurement マウスの腹腔内にTC11を低用量投与した場合と高用量投与した場合の血中濃度を比較した結果Results of comparison of blood concentrations between intraperitoneal and low dose administration of TC11 in mice

本発明の抗癌剤の有効成分は、上記のTC10、TC11、TC14、TC15、TC16、TC19、TC24及びTC25の化合物から選ばれるサリドマイド誘導体である。これらのサリドマイド誘導体には、TC10、TC11、TC14、TC15、TC16、TC19、TC24及びTC25の薬理上許容される塩も包含される。   The active ingredient of the anticancer agent of the present invention is a thalidomide derivative selected from the above compounds of TC10, TC11, TC14, TC15, TC16, TC19, TC24 and TC25. These thalidomide derivatives also include pharmacologically acceptable salts of TC10, TC11, TC14, TC15, TC16, TC19, TC24 and TC25.

これらのサリドマイド誘導体は、下記の通り、それ自体は既知の化合物であるか、又は、後述する実施例に示されるように既知の化合物から本明細書に記載の方法により合成できるものである。   These thalidomide derivatives are known compounds per se, as described below, or can be synthesized from known compounds by the methods described herein as shown in the Examples described later.

TC10：EP 051563 A
TC11：Inatsuki, S., 等(2005) Bioorganic. Med. Chem. Lett., 15, 321-325; Inatsuki, S., 等(2008) Int. J. Mol. Med., 21, 163-168; WO 98/07421
TC14：後記実施例参照
TC15：後記実施例参照
TC16：後記実施例参照
TC19：後記実施例参照
TC24：後記実施例参照
TC25：後記実施例参照TC10: EP 051563 A
TC11: Inatsuki, S., et al. (2005) Bioorganic. Med. Chem. Lett., 15, 321-325; Inatsuki, S., et al. (2008) Int. J. Mol. Med., 21, 163-168; WO 98/07421
TC14: See examples below
TC15: See examples below
TC16: See examples below
TC19: See examples below
TC24: See examples below
TC25: See examples below

有効成分であるサリドマイド誘導体は、医薬的に許容可能な担体を用いて製剤（医薬組成物）にすることができる。医薬的に許容可能な担体としては、賦形剤または基剤などが挙げられる。また、製剤は、通常に用いられる添加剤を含んでいてもよい。剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの製剤にして、経口投与してもよいし、注射剤、坐剤などの製剤にして、腹腔内や静脈内への注射により非経口投与することもできる。製剤には、有効成分のサリドマイド誘導体と、他の抗癌剤と別個に包装して一体としたものも包含される。本発明の抗癌剤は、抗癌剤治療を受けているまたは受ける予定の患者に投与することができる。これらのサリドマイド誘導体は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の抗癌剤 ）と組み合わせて使用してもよい。   The thalidomide derivative which is an active ingredient can be made into a preparation (pharmaceutical composition) using a pharmaceutically acceptable carrier. Examples of the pharmaceutically acceptable carrier include an excipient or a base. Moreover, the formulation may contain the additive used normally. The dosage form is appropriately selected depending on the administration route. For example, tablets, capsules, granules, powders, syrups and the like may be administered orally, or injections, suppositories, etc., and parenteral by intraperitoneal or intravenous injection. It can also be administered. The preparation includes a thalidomide derivative of the active ingredient and another anti-cancer agent separately packaged and integrated. The anticancer agent of the present invention can be administered to a patient who is receiving or intending to receive anticancer drug treatment. These thalidomide derivatives may be used alone or in combination with other drugs (for example, other anticancer agents).

サリドマイド誘導体の投与量は、対象とする抗癌剤治療、患者の状態などにより適宜選択される。例えば、上記サリドマイド誘導体をヒトに投与する場合には、１日あたり約0.1〜20 mg/kg（体重）、好ましくは１日あたり約0.1〜0.5 mg/kg（体重）の投与量で、１回または数回に分けて経口投与することができるが、その投与量や投与回数は、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。   The dosage of the thalidomide derivative is appropriately selected depending on the anticancer drug treatment targeted, the patient's condition, and the like. For example, when the above-mentioned thalidomide derivative is administered to humans, the dose is about 0.1 to 20 mg / kg (body weight) per day, preferably about 0.1 to 0.5 mg / kg (body weight) per day. Or it can be administered orally in several divided doses, but the dose and frequency of administration can be appropriately changed depending on symptoms, age, administration method and the like.

上記のサリドマイド誘導体は、特に、骨髄腫、悪性リンパ腫、白血病、骨髄異形成症候群などの造血器腫瘍や大腸癌、肺癌、腎細胞癌、乳癌、脳腫瘍、卵巣癌、メラノーマ、胃癌、前立腺癌などの固形癌などの癌の治療に利用することができる。   The above thalidomide derivatives include hematopoietic tumors such as myeloma, malignant lymphoma, leukemia, myelodysplastic syndrome, colon cancer, lung cancer, renal cell cancer, breast cancer, brain tumor, ovarian cancer, melanoma, stomach cancer, prostate cancer, etc. It can be used for treatment of cancer such as solid cancer.

本発明で使用されるサイドマイド誘導体は、下記のようにして選択されたものであり、以下に説明するような利点を有すると考えられる。   The side amide derivative used in the present invention is selected as follows, and is considered to have the advantages described below.

多様な活性、特に抗癌活性が期待される薬剤ライブラリーの設計と合成を行った。設計には多様な生理活性を示す「スーパーテンプレート」として知られているサリドマイドの骨格をテンプレートとして採用した。既に承認されている、もしくは臨床試験が進んでいる薬剤あるいはその類縁体を優先して設計した。   We designed and synthesized a drug library that is expected to have various activities, especially anticancer activity. For the design, a thalidomide skeleton known as “super template” showing various physiological activities was adopted as a template. Designed with priority on drugs that have already been approved or are in clinical trials or their analogs.

合成は、多検体を迅速に合成できるコンビナトリアルケミストリー（コンビケム）技術を参考にして行った。コンビケム合成では、置換基が異なる各化合物が混合物として得られるスプリット合成法と各化合物を個別に並列合成するパラレル合成法があるが、スプリット合成法は、実際の反応工程が少なく低コストであるが、ライブラリー混合物中の各化合物の比率が不均一になる可能性が大きく、また純度の問題も懸念されるので、純度や量を確保するため、各化合物を個別に合成するパラレル合成法で実施した。   The synthesis was performed with reference to combinatorial chemistry (combchem) technology, which can quickly synthesize many samples. In combichem synthesis, there are a split synthesis method in which compounds with different substituents are obtained as a mixture and a parallel synthesis method in which each compound is individually synthesized in parallel, but the split synthesis method has few actual reaction steps and is low in cost. Since the ratio of each compound in the library mixture is likely to be non-uniform and there are concerns about purity issues, a parallel synthesis method in which each compound is synthesized individually is used to ensure purity and quantity. did.

標的蛋白質のスクリーニングは薬剤をアフィニティ担体に固定して行う予定であるので、ライブラリー構築の際、薬剤毎にアフィニティ担体固定用リンカーを効率良く導入する点が合成上の課題の一つとなる。   Since screening of the target protein is scheduled to be performed with the drug immobilized on the affinity carrier, one of the problems in synthesis is to efficiently introduce an affinity carrier immobilization linker for each drug when constructing the library.

この過程で、下記（１）及び（２）の問題に直面したが、合成ルートの多面的な検討およびHPLCを用いる精製の効率化により、これらを改善しながら合成を進めた。
（１）リンカーの性質上、最終段階で薬剤とリンカーとを縮合させる必要があるため、各薬剤はカルボン酸あるいはアミノ基といった反応性の高い官能基を有していなければならない。よって既知合成ルートの単純な適用、および市販原料の利用が困難となる場合が多く、通常のライブラリー合成と比較して合成作業がさらに数段階増える。
（２）高価なリンカーを使用するため、最終工程は精緻な精製作業が必要であり、この段階が律速になる。In this process, the following problems (1) and (2) were encountered, but the synthesis was advanced while improving them by multifaceted examination of the synthesis route and the efficiency of purification using HPLC.
(1) Because of the nature of the linker, it is necessary to condense the drug and the linker at the final stage, so each drug must have a highly reactive functional group such as a carboxylic acid or an amino group. Therefore, it is often difficult to simply apply a known synthesis route and use a commercially available raw material, and the synthesis work is further increased by several steps as compared with ordinary library synthesis.
(2) Since an expensive linker is used, the final process requires a precise purification operation, and this stage is rate limiting.

サリドマイドは元来催眠薬として使用され、その催奇形生性のため悪名高い薬剤である。しかしながら近年、サリドマイドおよびその誘導体は癌、ハンセン病、エイズなど様々な疾患において良好な薬効を示すことが報告されている。それゆえにサリドマイド骨格は薬剤開発におけるスーパーテンプレートであると考えられている。サリドマイドは図１に示す構造をしており、大きく分類するとフタルイミド環とグルタルイミド環の二つのユニットに分けることができる。そこで、一方のユニットを固定して他方のユニットを変換する、という方針でサリドマイド誘導体ライブラリーを構築することとした（図１）。   Thalidomide was originally used as a hypnotic and is notorious for its teratogenicity. However, in recent years, it has been reported that thalidomide and its derivatives show good drug efficacy in various diseases such as cancer, leprosy, and AIDS. Therefore, the thalidomide skeleton is considered to be a super template in drug development. Thalidomide has the structure shown in FIG. 1, and can be roughly divided into two units, a phthalimide ring and a glutarimide ring. Therefore, it was decided to construct a thalidomide derivative library based on the policy of fixing one unit and converting the other unit (FIG. 1).

現在まで、グルタルイミド環をベンゼン環等の芳香環に変換した例が多数報告されている。実際に種々の生物活性が細胞レベルで確認されていることから、グルタルイミド環の変換体の合成は芳香環を有する薬剤を中心に行った。またサリドマイドの生体内における活性体である可能性が示唆されている、グルタルイミド環が開環した薬剤についても設計した。合成計画をスキーム１に示す。   To date, many examples of converting a glutarimide ring into an aromatic ring such as a benzene ring have been reported. In fact, since various biological activities have been confirmed at the cellular level, the synthesis of glutarimide ring converters was performed mainly on drugs having aromatic rings. In addition, a drug with an open glutarimide ring, which may be an active form of thalidomide in vivo, was also designed. The synthesis scheme is shown in Scheme 1.

R-NH2は芳香族アミンおよび芳香族アルキルアミンを中心に選択した。これら置換基を有するサリドマイト誘導体は細胞レベルで血管新生阻害能、TNF-α調節能、微小管重合阻害能などの報告例が多く、抗癌剤になりやすいものではないかと考えられる。その他、Rが飽和環であるもの、及びサリドマイドそのものも設計した。さらに、多様な活性を示すサリドマイドの生体内における活性本体の一つであると考えられている、グルタルイミド環が開環したものをイメージして、R-NH2がアミノ酸であるものも設計した。R-NH 2 was selected mainly for aromatic amines and aromatic alkyl amines. There are many reports of thalidomite derivatives having these substituents, such as angiogenesis inhibition ability, TNF-α regulation ability, and microtubule polymerization inhibition ability at the cellular level, and it is considered that they are likely to become anticancer agents. In addition, R was a saturated ring and thalidomide itself was designed. In addition, thalidomide with various activities was designed as one of the active bodies in vivo, with the glutarimide ring opened, and R-NH 2 is an amino acid. .

サリドマイド体ライブラリーの合成は以下のように行った。   The thalidomide library was synthesized as follows.

（１）グルタルイミド環の変換（スキーム２）
(1) Conversion of glutarimide ring (Scheme 2)

各反応は以下に示す文献（Bioorg. Med. Chem., 2004, 12, 327-336.）（J. Med. Chem., 1999, 42, 3014-3017.）を参考にした。ただし一部の反応において、加熱は通常の油浴ではなくマイクロウェーブで行った。   Each reaction was performed with reference to the following literature (Bioorg. Med. Chem., 2004, 12, 327-336.) (J. Med. Chem., 1999, 42, 3014-3017.). However, in some reactions, heating was performed in a microwave rather than a normal oil bath.

4-ニトロコハク酸無水物に各種アミンを加えて加熱下で反応を行ったところ、ほとんどのアミンの場合には閉環反応も進行して一段階でフタルイミド体が得られた。閉環しなかったものは無水酢酸中で加熱することにより望む閉環体を得ることができた。続いて水素/パラジウム触媒あるいは塩化スズを用いてニトロ基をアミノ基に変換した。   When various amines were added to 4-nitrosuccinic anhydride and the reaction was carried out under heating, in the case of most amines, the ring closure reaction proceeded and phthalimide compounds were obtained in one step. Those that were not ring-closed could be heated in acetic anhydride to obtain the desired ring-closed product. Subsequently, the nitro group was converted to an amino group using a hydrogen / palladium catalyst or tin chloride.

最終工程ではアニリノキナゾリンのときと同様に、芳香族アミノ基の反応性が低いものであるため、ビオチンリンカーの活性化エステル体とは反応しなかった。芳香環が二つのカルボニル基で置換されているサリドマイド体の場合は、アニリノキナゾリン体の場合よりもさらに反応性が低く、全ての検体においてビオチンリンカーのカルボン酸体との縮合が全く進行しなかった。最終的にはオキシ塩化リンを用いてビオチンリンカーと縮合させたが31検体のうち19検体のみが最終物が得られた。   In the final step, as in the case of anilinoquinazoline, the reactivity of the aromatic amino group was low, so that it did not react with the activated ester form of the biotin linker. The thalidomide form in which the aromatic ring is substituted with two carbonyl groups is much less reactive than the anilinoquinazoline form, and the condensation of the biotin linker with the carboxylic acid form does not proceed at all in all samples. It was. Ultimately, phosphorous oxychloride was used to condense with the biotin linker, but only 19 of 31 samples were final.

そこでカルボン酸型サリドマイド体をビオチンリンカーのアミン体と縮合させることにより、上記のアミン型サリドマイド体で最終物が得られなかったものを含む薬剤群を合成することとした。   Therefore, by condensing a carboxylic acid type thalidomide body with an amine body of a biotin linker, it was decided to synthesize a drug group including the above-mentioned amine type thalidomide body in which the final product was not obtained.

カルボン酸型サリドマイド体は以下のように、市販の4-カルボキシフタル酸無水物とアミンを酢酸中加熱下で反応させて9検体を得た。続いてビオチンリンカーのアミン体と縮合させて最終物を7検体得ることができた（スキーム３）。   As for the carboxylic acid type thalidomide, 9 samples were obtained by reacting commercially available 4-carboxyphthalic anhydride and amine with heating in acetic acid as follows. Subsequently, the final product was obtained by condensation with an amine body of a biotin linker (Scheme 3).

さらに、サリドマイドのベンゼン環をナフタレン環にしたものも同様に合成した。
Further, a thalidomide having a benzene ring as a naphthalene ring was synthesized in the same manner.

合計すると、このタイプのアフィニティ担体固定用リンカー付きサリドマイド体は27検体得られた。   In total, 27 samples of this type of thalidomide with an affinity carrier-immobilizing linker were obtained.

（２）フタルイミド環の修飾
サリドマイドの多様な生理活性の一部は、薬物代謝酵素によるフタルイミド環の芳香環部分の酸化修飾によるものではないかと考えられている。また芳香環上の4つの水素原子がすべてフッ素原子に置き換わった化合物がTNF-α調節剤として有効であることも報告されており、さらにアミノ基で修飾された芳香環を有するサリドマイド誘導体であるLenalidomide(レナリドミド)は既に米国で認可され、CC-4047A(アクチミドあるいはポマリドミド)は臨床試験中である。(2) Modification of phthalimide ring It is considered that some of the various physiological activities of thalidomide are due to oxidative modification of the aromatic ring portion of the phthalimide ring by drug metabolizing enzymes. In addition, it has been reported that a compound in which all four hydrogen atoms on the aromatic ring are replaced with fluorine atoms is effective as a TNF-α regulator, and Lenalidomide is a thalidomide derivative having an aromatic ring modified with an amino group. (Lenalidomide) has already been approved in the United States, and CC-4047A (actimide or pomalidomide) is in clinical trials.

これらの報告例を参考とし、フタルイミド環の芳香環修飾誘導体を今回のライブラリーの一部として設計した。   With reference to these reported examples, aromatic ring-modified derivatives of the phthalimide ring were designed as part of this library.

以下の合成経路に従って最終物を得た（スキーム４）。
The final product was obtained according to the following synthetic route (Scheme 4).

グルタルイミド環を市販の修飾フタル酸無水物と、酢酸中マイクロウェーブ照射下で反応させた。当初はα-クロロ酢酸エステルでイミド窒素原子を修飾したが、その場合には続く加水分解によるカルボン酸への変換の際に、複数の化合物への分解が進行した。そこでα-ブロモ酢酸ベンジルエステルでイミド窒素原子を修飾し、加水素分解によりカルボン酸体を合成することとした。なお、テトラフルオロフタルイミド体およびピリジルフタルイミド体はグルタルイミド環イミド窒素原子のアルキル化自体が進行しなかった。   The glutarimide ring was reacted with commercially available modified phthalic anhydride in acetic acid under microwave irradiation. Initially, the imide nitrogen atom was modified with α-chloroacetic acid ester. In that case, decomposition into a plurality of compounds proceeded during the subsequent conversion to carboxylic acid by hydrolysis. Therefore, the imide nitrogen atom was modified with α-bromoacetic acid benzyl ester, and the carboxylic acid compound was synthesized by hydrogenolysis. In the tetrafluorophthalimide body and the pyridylphthalimide body, alkylation of the glutarimide ring imide nitrogen atom itself did not proceed.

加水素分解による脱ベンジル化によりカルボン酸体は問題なく進行した。この際、R = NO2のものはR = NH2への還元も同時に進行した。最後に縮合剤存在下でアミンタイプのビオチンリンカーと縮合させて、最終物を5検体得た。Carboxylic acid compound proceeded without problems by debenzylation by hydrogenolysis. At this time, reduction of R = NO 2 to R = NH 2 proceeded simultaneously. Finally, it was condensed with an amine type biotin linker in the presence of a condensing agent to obtain 5 final products.

最終的に、サリドマイド体全体では計 33検体の合成が完了し、それらの純度は90〜100%であった。   Finally, a total of 33 samples were synthesized in the entire thalidomide body, and their purity was 90-100%.

これまでの研究成果を踏まえて、サリドマイドをファーマコアとする骨髄腫治療薬が開発可能ではないかと考え、多様なサリドマイド誘導体を合成し、６種の日本人の骨髄腫患者由来の骨髄腫細胞株(KMS-34、KMM-1、KMS-27、KMS-11、RPMI-8226、MUM24)の増殖抑制を指標にスクリーニングを行い、８種類のサリドマイド誘導体(TC10、TC11、TC14、TC15、TC16、TC19、TC24、TC2５)を絞り込んだ。   Based on the research results so far, we thought that it would be possible to develop a therapeutic agent for myeloma with thalidomide as pharmacore, and synthesized various thalidomide derivatives to produce myeloma cell lines derived from 6 Japanese myeloma patients. (KMS-34, KMM-1, KMS-27, KMS-11, RPMI-8226, MUM24) were screened using growth inhibition as an index, and eight thalidomide derivatives (TC10, TC11, TC14, TC15, TC16, TC19) , TC24, TC25).

TC11は、いずれの骨髄腫細胞株に対しても強い増殖抑制(IC50値は3-7μM)とアポトーシス誘導を引き起こした。また、アポトーシス誘導はゲル電気泳動によるDNAおよびPARPの切断、アネキシンV染色によるフローサイトメーター検出によっても確認された。TC11以外の上記７種のサリドマイド誘導体(TC10、TC14、TC15、TC16、TC19、TC24、TC25)も強弱の差があるものの、骨髄腫細胞株に対して増殖抑制とアポトーシスを引き起こした。   TC11 caused strong growth inhibition (IC50 value of 3-7 μM) and induction of apoptosis for all myeloma cell lines. Induction of apoptosis was also confirmed by DNA and PARP cleavage by gel electrophoresis and flow cytometer detection by Annexin V staining. The seven thalidomide derivatives (TC10, TC14, TC15, TC16, TC19, TC24, TC25) other than TC11 also caused growth inhibition and apoptosis in myeloma cell lines, although there were differences in strength.

TC11はKMS-34細胞株において、不可逆的にゴルジ体と微小管構造の破壊を引き起こした。一方、HeLa細胞においてもゴルジ体と微小管構造の破壊を引き起こしたが、その作用は可逆的であり、薬剤を洗浄・除去すると速やかに元に戻るので、骨髄腫に選択的な現象である可能性が高い。   TC11 irreversibly caused destruction of the Golgi apparatus and microtubule structure in the KMS-34 cell line. On the other hand, the Golgi body and microtubule structure were also destroyed in HeLa cells, but the action is reversible, and when the drug is washed and removed, it quickly returns to its original state. High nature.

一方、既存の骨髄腫治療薬(key drug)であるサリドマイドとデキソメタゾンは、KMS-11細胞株のみの増殖を抑制し、他の細胞株(KMS-34、KMM-1、KMS-27、RPMI-8226)の増殖は全く抑制せず、TC11との明確な作用特異性の違いが見られた。   On the other hand, thalidomide and dexamethasone, which are existing myeloma drugs (key drugs), inhibit the growth of only the KMS-11 cell line, and other cell lines (KMS-34, KMM-1, KMS-27, RPMI- The growth of 8226) was not suppressed at all, and a clear difference in action specificity with TC11 was observed.

KMS-34担癌SCIDマウスに5%カルボキシメチルセルロースに懸濁した20mg/kgのTC11を腹腔内注射した。2週間の投与において、コントロールに比べて有意な増殖抑制を認めたが、体重減少などの全身毒性や著明な臓器障害は認められなかった。   KMS-34 cancer-bearing SCID mice were intraperitoneally injected with 20 mg / kg TC11 suspended in 5% carboxymethylcellulose. In the administration for 2 weeks, significant growth inhibition was observed compared with the control, but no systemic toxicity such as weight loss or significant organ damage was observed.

TC11投与マウスにおける形質細胞腫を病理組織学的に観察したところ、核の凝縮や断片化などアポトーシス像が目立った。免疫組織学的検索においても抗シングルDNA抗体陽性細胞の有意な増加を認め、in vivoにおけるアポトーシス誘導も確認された。   Histopathological observation of plasmacytoma in TC11-treated mice revealed prominent apoptotic features such as nuclear condensation and fragmentation. In immunohistological examination, a significant increase in anti-single DNA antibody positive cells was observed, and induction of apoptosis was confirmed in vivo.

本発明により、我々によって独自に設計・合成された多様なサリドマイド誘導体から、日本人の骨髄腫患者由来の各種骨髄腫細胞株に対して強い増殖抑制を示す薬剤をスクリーニングできた。また、得られた薬剤がin vitroおよび骨髄腫坦癌マウスにおいても強い抗骨髄腫作用をもち、かつ従来の治療薬に比べて優れた効果をもつことを確認した。既存の医薬品のサリドマイドには、光学異性体のS体にのみ催奇形成などの副作用が見られることがわかっている。本発明のサリドマイド誘導体は光学活性体でないので、催奇形成などの副作用がない可能性が高い。この先、さらなる検証を重ねることで、これらサリドマイド誘導体の副作用のない抗骨髄腫治療薬への適用が期待できる。   According to the present invention, from various thalidomide derivatives designed and synthesized by us, it was possible to screen drugs showing strong growth inhibition against various myeloma cell lines derived from Japanese myeloma patients. In addition, the obtained drug was confirmed to have a strong antimyeloma action in vitro and in myeloma-bearing mice, and to have an excellent effect compared to conventional therapeutic agents. It is known that side effects such as teratogenesis are observed only in the S-form of optical isomers of thalidomide, an existing pharmaceutical product. Since the thalidomide derivative of the present invention is not an optically active substance, there is a high possibility that there is no side effect such as teratogenesis. From now on, by further examination, it can be expected that these thalidomide derivatives will be applied to antimyeloma therapeutic agents without side effects.

TC11は、後記実施例に示される結果から、従来の抗癌剤とは異質の抗腫瘍作用、または、従来の抗癌剤より優れた抗腫瘍作用を有するものと考えられる。   From the results shown in the Examples below, TC11 is considered to have an antitumor effect that is different from conventional anticancer agents or an antitumor effect superior to conventional anticancer agents.

（１）薬剤TC11の標的タンパク質として、ヌクレオフォスミンとα-チューブリンが同定された。これにより、アポトーシスやチューブリンの断片化などの表現型と結びついていることが分かる。 (1) Nucleophosmin and α-tubulin were identified as target proteins for the drug TC11. This indicates that it is associated with phenotypes such as apoptosis and tubulin fragmentation.

（２）TC11がアポトーシスを引き起こすことがPARPやDNAの切断により確認されたが、さらに、より上流のプロカスパーゼ2，3，8および9の切断が観察され、アポトーシスのシグナルがDeath receptorとミトコンドリアの両方のパスウエイから入ってくることがわかった。作用機構の相違により、TC11は、従来の抗癌剤とは異質の抗腫瘍効果を示すものと考えられる。 (2) It was confirmed by cleavage of PARP and DNA that TC11 causes apoptosis, but further cleavage of procaspases 2, 3, 8, and 9 was observed, and apoptosis signals were observed between Death receptor and mitochondria. I found it coming from both pathways. Due to the difference in the mechanism of action, TC11 is considered to exhibit an antitumor effect that is different from conventional anticancer agents.

（３）正常の骨髄細胞に対するTC11のコロニーアッセイの結果から、TC11は治療域濃度でも造血障害に対する安全性が比較的高いと判断される。 (3) From the results of the TC11 colony assay for normal bone marrow cells, it is determined that TC11 is relatively safe against hematopoietic disorders even at therapeutic concentrations.

（４）マウスの血中濃度測定結果から、TC11の低用量投与でも投与後２時間程度まではIC50値以上の有効な血中濃度が保持され、低用量投与の５倍量の高用量投与では、投与後４時間程度まではIC50値以上の有効な血中濃度が保持されていた。これらの結果から、TC11の血中動態はかなり良好であり、この結果は骨髄腫瘍細胞KMS34の坦癌マウスを用いたTC11の抗腫瘍効果でも有意な効果が認められたことからも支持される。 (4) From the results of measuring blood concentrations in mice, effective blood concentrations above the IC50 value are maintained for up to 2 hours after administration even with low doses of TC11. The effective blood concentration above the IC50 value was maintained until about 4 hours after administration. From these results, the blood kinetics of TC11 is quite good, and this result is supported by the fact that a significant effect was also observed in the antitumor effect of TC11 using a cancer-bearing mouse of bone marrow tumor cells KMS34.

（５）ハイリスク骨髄腫のうち10〜20%を占める第17番染色体欠失を有する症例は、初診時より髄外形質細胞種を形成するなどハイリスク骨髄腫としての臨床像を示し、従来の骨髄腫治療薬であるボルテゾミブやレナリドミドを用いても半年以内に再発を来たし、予後は極めて不良である、という臨床結果がある。後記実施例で用いたKMS34細胞のp53遺伝子は、１７番染色体の両アレルで欠失とナンセンス変異が見られるため、全く機能していないことが判明した。しかし、TC11は従来の骨髄腫治療薬を用いても予後が改善しない１７番染色体を欠失した骨髄腫細胞でも抗腫瘍効果を示した。 (5) Among high-risk myeloma, cases with chromosome 17 deletion, which accounts for 10 to 20%, show clinical features as high-risk myeloma, such as forming extramedullary plasma cell types from the first visit. There is a clinical result that bortezomib and lenalidomide, which are myeloma drugs, have relapsed within half a year and the prognosis is extremely poor. It was found that the p53 gene of KMS34 cells used in the examples described later did not function at all because deletions and nonsense mutations were observed in both alleles of chromosome 17. However, TC11 also showed an antitumor effect even in myeloma cells lacking chromosome 17, whose prognosis was not improved even by using conventional myeloma therapeutic agents.

以上の知見から、化合物TC11は、アポトーシス誘導剤、チューブリン断片化誘導剤、カスパーゼ依存的アポトーシスの誘導剤、又は、第１７番染色体欠失を有するハイリスク骨髄腫の治療薬として用いることができると考えられる。   Based on the above findings, compound TC11 can be used as an apoptosis inducer, a tubulin fragmentation inducer, a caspase-dependent apoptosis inducer, or a therapeutic agent for high-risk myeloma having chromosome 17 deletion. it is conceivable that.

以下、具体的に本発明の実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。   Hereinafter, examples of the present invention will be specifically described. However, the following examples should be regarded as an aid for obtaining specific recognition of the present invention, and the scope of the present invention is limited by the following examples. It is not something.

［実施例１］
1. サリドマイド誘導体の合成(TC11)
TC11は下記のスキームに従って合成した。[Example 1]
1. Synthesis of thalidomide derivatives (TC11)
TC11 was synthesized according to the following scheme.

A : 1の合成
A: Synthesis of 1

4-ニトロフタル酸無水物（193 mg, 1.00 mmol)と2,6-ジソプロピルアニリン（213 mg, 1.20 mmol）を酢酸（4 mL）に加えてマイクロウェーブ照射下、150oCで5分間加熱した。室温まで冷却後、反応液を水（20 mL）にあけた。析出した固体を濾別、乾燥により1を308 mg（0.874 mmol, 87%）得た。4-Nitrophthalic anhydride (193 mg, 1.00 mmol) and 2,6-disopropylaniline (213 mg, 1.20 mmol) were added to acetic acid (4 mL) and heated at 150 ° C for 5 minutes under microwave irradiation . After cooling to room temperature, the reaction solution was poured into water (20 mL). The precipitated solid was separated by filtration and dried to obtain 308 mg (0.874 mmol, 87%) of 1.

B : TC11の合成
B: Synthesis of TC11

THF-EtOH（10 mL, 1 : 1）に1（100 mg, 0.284 mmol）と5% Pd/C（20.0 mg）を窒素雰囲気下で加えた。反応容器内を水素置換して室温で5時間攪拌した後、反応液を濾過した。濾液を濃縮してTC11を91.6 mg（0.284 mmol, 100%）得た。   1 (100 mg, 0.284 mmol) and 5% Pd / C (20.0 mg) were added to THF-EtOH (10 mL, 1: 1) under a nitrogen atmosphere. The reaction vessel was purged with hydrogen and stirred at room temperature for 5 hours, and then the reaction solution was filtered. The filtrate was concentrated to obtain 91.6 mg (0.284 mmol, 100%) of TC11.

TC11以外のサリドマイド誘導体TC10、TC14、TC15、TC16、TC19、TC24、TC25は、4-ニトロフタル酸無水物とそれぞれシクロヘキシルアミン、p-ベンジルアニリン、o-フェニルアニリン、p-フェノキシアニリン、フェニルブチルアミン、ナフチルエチルアミン、フェニルメチルアミンをTC11と同じ方法に従って酢酸中で反応させた後、接触還元することによって合成した。   Thalidomide derivatives other than TC11 are TC10, TC14, TC15, TC16, TC19, TC24, TC25, 4-nitrophthalic anhydride and cyclohexylamine, p-benzylaniline, o-phenylaniline, p-phenoxyaniline, phenylbutylamine, naphthyl, respectively. Ethylamine and phenylmethylamine were synthesized by reacting in acetic acid according to the same method as TC11, and then catalytic reduction.

上記反応例でマイクロウェーブを用いる代わりに通常の過熱方法を用いてもよい。この場合には、マイクロウェーブ加熱の部分を「数時間加熱還流」とすればよい。   Instead of using microwaves in the above reaction example, a normal superheating method may be used. In this case, the microwave heating portion may be set to “several hours heating reflux”.

2. サリドマイド誘導体の骨髄腫細胞増殖アッセイ
サリドマイド誘導体の種々のヒト培養骨髄腫細胞に対する増殖阻害アッセイを行なった。用いたヒト培養骨髄腫細胞株は、KMM-1、KMS-11、KMS-27、KMS-34、RPMI-8226、MUM24の計6種である。KMM-1、KMS-11、KMS-27、KMS-34は、川崎医科大学の大槻剛巳らより樹立された。RPMI-8226は、細胞バンクから入手した（Moore, G.E., Kitamura, H., 1968 N.Y. State., J. Med. 2054-2060; IFO 50013; JCRB0034）。MUM24は、服部豊が骨髄腫瘍患者から独自に樹立した。2. Myeloma cell proliferation assay of thalidomide derivatives Growth inhibition assays of thalidomide derivatives on various human myeloma cells were performed. The human cultured myeloma cell lines used were 6 types in total: KMM-1, KMS-11, KMS-27, KMS-34, RPMI-8226, and MUM24. KMM-1, KMS-11, KMS-27, and KMS-34 were established by Takeshi Ohtsuki and others at Kawasaki Medical School. RPMI-8226 was obtained from a cell bank (Moore, GE, Kitamura, H., 1968 NY State., J. Med. 2054-2060; IFO 50013; JCRB0034). MUM24 was independently established by Yutaka Hattori from bone marrow tumor patients.

KMS-11とKMS-34は第４番染色体と第１４番染色体が転座している。また両細胞株とも線維芽細胞増殖因子FGF3(Fibroblast growth factor 3)の発現が過剰である。この転座は臨床学的に予後不良因子とされている。 MUM24は、服部が独自に６４歳IgG(k)型骨髄腫患者の骨髄血より樹立した細胞株である。RPMI1640+10%牛胎児血清培地で増殖し、その際サイトカインは必要としない。当細胞は、第１３番染色体の一方を欠失している。第１３番染色体欠失は、骨髄腫診療上、化学療法、自家造血幹細胞移植(Chang, H., 等 (2005) Bone Marrow transplantation 36,793-796)、サリドマイド療法(Hattori, Y., 等 (2008) Cancer Science, 99,1243)において独立した予後不良因子とされる。すなわち、第１３番染色体欠失を有する症例は、既存の治療法では予後が極めて不良であり、ハイリスク群と称されるが、このような症例にも有効な新薬開発を目指す際に、当MUM24細胞は重要なツールとなりうる。例えば、骨髄腫治療薬スクリーニングの際に同細胞を用いることによって、第１３番染色体欠失を有する症例にも有効な薬剤を選択的に選び出すことが可能になる。現在、一般に入手可能な骨髄腫細胞株のうち、第１３番染色体欠失を有するものは極めて限られており、MUM24はハイリスク骨髄腫の病態解明や有効な治療薬開発に極めて有用である。   In KMS-11 and KMS-34, chromosomes 4 and 14 are translocated. In both cell lines, the expression of fibroblast growth factor FGF3 (Fibroblast growth factor 3) is excessive. This translocation is clinically regarded as a poor prognostic factor. MUM24 is a cell line whose hat was originally established from bone marrow blood of a 64-year-old IgG (k) type myeloma patient. Grows in RPMI 1640 + 10% fetal calf serum medium, no cytokines required. The cell lacks one of chromosome 13. Chromosome 13 deletion has been reported in myeloma treatment, chemotherapy, autologous hematopoietic stem cell transplantation (Chang, H., et al. (2005) Bone Marrow transplantation 36,793-796), thalidomide therapy (Hattori, Y., et al. (2008) Cancer Science, 99,1243) is regarded as an independent poor prognostic factor. In other words, cases with chromosome 13 deletion have a very poor prognosis with existing therapies and are referred to as high-risk groups. MUM24 cells can be an important tool. For example, by using the same cells in screening for a myeloma therapeutic drug, it is possible to selectively select an effective drug even in cases having chromosome 13 deletion. At present, there are very few commonly available myeloma cell lines with chromosome 13 deletion, and MUM24 is extremely useful for elucidating the pathology of high-risk myeloma and developing effective therapeutic agents.

種々の濃度 (最終濃度で50、10、2、0.5、0.1、0.02、0 μM) のサリドマイド誘導体 (0.5% DMSO溶液) を、96穴プレートにそれぞれ添加した。このプレートに、37℃、5% CO2条件下において、10% (v/v) FBS (Gibco)、1% (v/v) ペニシリン／ストレプトマイシン (Gibco) を含有するRPMI1640培地 (Invitrogen) 中で培養した6種の骨髄腫細胞を、1ウェルにつき1−2.5×104細胞の密度で播いた。この細胞を72時間培養した後、Cell Proliferation Reagent WST-1 (Roche) を添加し、さらに1時間培養した。培養後、細胞の吸光度 (吸収波長：490 nm、リファレンス波長：600 nm) をプレートリーダーにより測定し、生細胞数を求めた。この吸光度について、薬剤非添加 (0.5% DMSO添加) を100%、細胞を播いていない場合を0%とし、細胞生存率を算出した。Various concentrations (50, 10, 2, 0.5, 0.1, 0.02, 0 μM in final concentration) of thalidomide derivatives (0.5% DMSO solution) were added to each 96-well plate. The plate was placed in RPMI1640 medium (Invitrogen) containing 10% (v / v) FBS (Gibco), 1% (v / v) penicillin / streptomycin (Gibco) at 37 ° C. and 5% CO 2. Six cultured myeloma cells were seeded at a density of 1-2.5 × 10 4 cells per well. After culturing the cells for 72 hours, Cell Proliferation Reagent WST-1 (Roche) was added and further cultured for 1 hour. After culture, the absorbance of the cells (absorption wavelength: 490 nm, reference wavelength: 600 nm) was measured with a plate reader to determine the number of viable cells. With respect to this absorbance, the cell viability was calculated with 100% non-drug added (0.5% DMSO added) and 0% when no cells were seeded.

まず最初に、合成したサリドマイド誘導体３３種類全部のKMS-34株の増殖抑制活性を調べた。その結果、８種類のサリドマイド誘導体(TC10、TC11、TC14、TC15、TC16、TC19、TC24、TC25)に増殖抑制活性が見られた。以後、他の骨髄腫瘍細胞株の増殖抑制はこれら８種類のサリドマイド誘導体に絞って調べた。それらの誘導体のIC50値が表１にまとめられている。８種類のサリドマイド誘導体(TC10、TC11、TC14、TC15、TC16、TC19、TC24、TC25)は、６種類のヒト培養骨髄腫細胞株(KMM-1、KMS-11、KMS-27、KMS-34、RPMI-8226、MUM24)に対して細胞増殖抑制活性を示した。中でも、TC11はいずれの骨髄腫細胞株に対しても強い増殖抑制活性(IC50値は3-7μM)を示した。しかし、既存の骨髄腫治療薬(key drug)であるサリドマイドとデキソメタゾンは、KMS-11細胞株のみの増殖を抑制し、他の細胞株(KMS-34、KMM-1、KMS-27、RPMI-8226、KMU24)の増殖は全く抑制せず、TC11との明確な作用特異性の違いが見られた。    First, the growth inhibitory activity of all 33 types of the synthesized thalidomide derivatives KMS-34 strains was examined. As a result, eight types of thalidomide derivatives (TC10, TC11, TC14, TC15, TC16, TC19, TC24, TC25) exhibited growth inhibitory activity. Thereafter, the growth inhibition of other bone marrow tumor cell lines was examined by focusing on these eight kinds of thalidomide derivatives. The IC50 values for these derivatives are summarized in Table 1. Eight types of thalidomide derivatives (TC10, TC11, TC14, TC15, TC16, TC19, TC24, TC25) are divided into six types of human cultured myeloma cell lines (KMM-1, KMS-11, KMS-27, KMS-34, It showed cytostatic activity against RPMI-8226 and MUM24). Among them, TC11 showed strong growth inhibitory activity (IC50 value of 3-7 μM) against any myeloma cell line. However, thalidomide and dexamethasone, the existing drug for myeloma, inhibit the growth of only the KMS-11 cell line and other cell lines (KMS-34, KMM-1, KMS-27, RPMI- 8226 and KMU24) were not inhibited at all, and a clear difference in action specificity from TC11 was observed.

増殖抑制活性が見られたサリドマイド誘導体の化学構造を以下に示す。
The chemical structure of a thalidomide derivative in which growth inhibitory activity was observed is shown below.

３. PARPの切断とゴルジ体および微小管の破壊
サリドマイド誘導体の種々のヒト培養骨髄腫細胞に対するアポトーシスを検出するため、PARPの切断を観察した。3. Cleavage of PARP and destruction of Golgi apparatus and microtubules To detect apoptosis of thalidomide derivatives against various human cultured myeloma cells, we observed cleavage of PARP.

5種の濃度 (最終濃度で50、20、10、5 、0 μM) のサリドマイド誘導体並びにサリドマイド及びスタウロスポリンのそれぞれ (0.5% DMSO) を、12穴プレートにそれぞれ添加した。このプレートに、37℃、5% CO2条件下において、10% (v/v) FBS (Gibco)、1% (v/v) ペニシリン／ストレプトマイシン (Gibco) を含有するRPMI1640培地 (Invitrogen) 中で培養した骨髄腫細胞を、1ウェルにつき2.5×105細胞の密度で播いた。6時間培養した後、1,000 rpmで5分遠心、上清を除去し、D-PBSに懸濁した。再度同じ条件で細胞を回収し、1×サンプルバッファー (62.5 mM トリス塩酸バッファー (pH 6.8)、5% (v/v) 2-メルカプトエタノール、2% (w/v) SDS、5% (w/v) スクロース、0.005% (w/v) BPB) にこの細胞を懸濁した。Five concentrations (50, 20, 10, 5, 0 μM final concentration) of thalidomide derivatives and each of thalidomide and staurosporine (0.5% DMSO) were added to 12-well plates, respectively. The plate was placed in RPMI1640 medium (Invitrogen) containing 10% (v / v) FBS (Gibco), 1% (v / v) penicillin / streptomycin (Gibco) at 37 ° C. and 5% CO 2. Cultured myeloma cells were seeded at a density of 2.5 × 10 5 cells per well. After culturing for 6 hours, the mixture was centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed and suspended in D-PBS. Cells were collected again under the same conditions, and 1x sample buffer (62.5 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8), 5% (v / v) 2-mercaptoethanol, 2% (w / v) SDS, 5% (w / v) The cells were suspended in sucrose, 0.005% (w / v) BPB).

得られた細胞懸濁液について、超音波破砕を行った後、96℃で10分間加熱し、ウェスタンブロッティングを行った。PARPの検出には、SDS-PAGEに12%ポリアクリルアミドゲルを、1次抗体に抗PARP抗体 (Cell Signaling)を、2次抗体にHRP標識された抗体を用いた。   The obtained cell suspension was subjected to ultrasonic disruption and then heated at 96 ° C. for 10 minutes to perform Western blotting. For detection of PARP, 12% polyacrylamide gel was used for SDS-PAGE, anti-PARP antibody (Cell Signaling) was used for the primary antibody, and HRP-labeled antibody was used for the secondary antibody.

また、細胞レベルでPARPの切断、ゴルジ体および微小管の破壊の観察は、以下のように行った。Poly-L-Lysine(Sigma)をコートしたカバーガラス(Matsunami)、もしくは99%エタノールで殺菌したカバーグラスに細胞をのせ、24時間後にDulbecco's Phosphate Buffered Saline(PBS, Bibco)でリンスし、4%パラホルムアルデヒドで30分間固定した。PBSでリンスし、0.2%Triton Xを含むPBSで5分間膜透過処理を行い。PBSでリンスした。Blocking Buffer[1% BSA(Nacalai)、0.05% Sodium Azide(Nacalai)を含むPBS]を用いて30分間室温でブロッキングを行った。PBSで細胞をリンスし、任意の濃度の1次抗体である抗切断PARP抗体、抗GM130抗体、抗チューブリン抗体 (Cell Signaling)をBlocking Bufferで希釈し、細胞に加えた。1時間後PBSで細胞をリンスし、1/600 vol二次抗体を含むBlocking Bufferを細胞に加えた。45分後に細胞をリンスし、SlowFAde Gold antifade reagent with DAPI(Invitrogen)もしくはVECTASHIELD Mounting Media For Fluorescence(Vector Laboratories)を加えたスライドガラス(Matsunami)にカバーガラスをのせ、Axiovert 200M(Zeiss) を用いて画像を取得した。   In addition, observation of PARP cleavage, Golgi apparatus and microtubule destruction at the cellular level was performed as follows. Place the cells on a cover glass (Matsunami) coated with Poly-L-Lysine (Sigma) or a cover glass sterilized with 99% ethanol, rinse after 24 hours with Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS, Bibco), and then add 4% Fix with formaldehyde for 30 minutes. Rinse with PBS and perform membrane permeabilization with PBS containing 0.2% Triton X for 5 minutes. Rinse with PBS. Blocking was performed for 30 minutes at room temperature using Blocking Buffer [PBS containing 1% BSA (Nacalai), 0.05% Sodium Azide (Nacalai)]. The cells were rinsed with PBS, and anti-cleaved PARP antibody, anti-GM130 antibody, and anti-tubulin antibody (Cell Signaling), which are primary antibodies at any concentration, were diluted with Blocking Buffer and added to the cells. After 1 hour, the cells were rinsed with PBS, and Blocking Buffer containing 1/600 vol secondary antibody was added to the cells. After 45 minutes, rinse the cells, place a cover glass on a slide glass (Matsunami) with SlowFAde Gold antifade reagent with DAPI (Invitrogen) or VECTASHIELD Mounting Media For Fluorescence (Vector Laboratories), and image using Axiovert 200M (Zeiss) Acquired.

図２に示すように、TC11はKMS-34細胞のPARPの切断を引き起こしたが、HeLa細胞のPARPの切断は引き起こさなかった。アポトーシスを強く引き起こすことが知られているスタウロスポリンはKMS-34とHeLaの両細胞のPARP の切断を引き起こした。しかし、サリドマイドはどちらの細胞のPARPの切断を引き起こさなかった。このことから、TC11はKMS-34細胞に強くアポトーシスを引き起こすことがわかった。   As shown in FIG. 2, TC11 caused PARP cleavage of KMS-34 cells, but not HeLa cell PARP cleavage. Staurosporine, known to strongly induce apoptosis, caused PARP cleavage in both KMS-34 and HeLa cells. However, thalidomide did not cause PARP cleavage in either cell. This indicates that TC11 strongly induces apoptosis in KMS-34 cells.

また、TC11はKMS-34細胞株において、不可逆的にゴルジ体の構造破壊を引き起こした。また同時に微小管構造の破壊をも引き起こした。一方、TC11はHeLa細胞に対してもゴルジ体と微小管構造の破壊を引き起こしたが、その作用はTC11を洗浄除去すれば直ちに正常に戻る可逆的なものであり、それ故、骨髄腫細胞に選択的な現象である可能性が高い。   TC11 irreversibly caused structural destruction of the Golgi apparatus in the KMS-34 cell line. At the same time, the microtubule structure was destroyed. On the other hand, TC11 also caused destruction of the Golgi apparatus and microtubule structure on HeLa cells, but the action was reversible immediately after washing and removal of TC11. It is likely that this is a selective phenomenon.

４. DNAの断片化
サリドマイド誘導体の種々のヒト培養骨髄腫細胞に対するアポトーシスを検出するため、DNAの断片化を観察した。4. Fragmentation of DNA In order to detect apoptosis of various thalidomide derivatives against various human cultured myeloma cells, DNA fragmentation was observed.

種々の濃度 (最終濃度で50、10、2、0.5、0.1、0.02、0 μM ) のサリドマイド誘導体及びスタウロスポリンのそれぞれ (0.5% DMSO) を、6 cmディッシュにそれぞれ添加した。このプレートに、37℃、5% CO2条件下において、10% (v/v) FBS (Gibco)、1% (v/v) ペニシリン／ストレプトマイシン (Gibco) を含有するRPMI1640培地 (Invitrogen) 中で培養した骨髄腫細胞を、1ウェルにつき1×106細胞の密度で播いた。この細胞を6時間培養した後、1,000 rpmで5分遠心し、沈殿物をリシスバッファー (0.2% Triton X-100、10 mM トリス塩酸バッファー (pH 7.4)、10 mM EDTA) に懸濁した。これを15分間氷上で静置することで、細胞を溶解し、10,000×gで20分の遠心により回収した。回収した上清にRNaseAを添加し、37℃で1時間反応させて、RNAを分解した。この細胞懸濁液から、MaXtract low density gel (Qiagen) を用いて、DNAを回収した。実験操作は、キット付属のプロトコールに従い、溶出はTEバッファーで行なった。Various concentrations (50, 10, 2, 0.5, 0.1, 0.02, 0 μM final concentration) of thalidomide derivative and staurosporine (0.5% DMSO) were added to 6 cm dishes, respectively. The plate was placed in RPMI1640 medium (Invitrogen) containing 10% (v / v) FBS (Gibco), 1% (v / v) penicillin / streptomycin (Gibco) at 37 ° C. and 5% CO 2. Cultured myeloma cells were seeded at a density of 1 × 10 6 cells per well. The cells were cultured for 6 hours and then centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes, and the precipitate was suspended in a lysis buffer (0.2% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4), 10 mM EDTA). The cells were lysed by allowing them to stand for 15 minutes on ice, and collected by centrifugation at 10,000 × g for 20 minutes. RNase A was added to the collected supernatant and reacted at 37 ° C. for 1 hour to degrade RNA. From this cell suspension, DNA was recovered using MaXtract low density gel (Qiagen). The experimental procedure was performed according to the protocol attached to the kit, and elution was performed with TE buffer.

得られた溶出液について、2% アガロースゲル (EtBr含有) を用いた電気泳動を行ない、蛍光イメージャーによりバンドを検出した。   The obtained eluate was subjected to electrophoresis using 2% agarose gel (containing EtBr), and a band was detected by a fluorescence imager.

図３のアガロースゲル電気泳動のパターンからわかるように、TC11はKMS-34細胞のDNA切断を引き起こした。また、ポジティブコントロールのスタウロスポリンもKMS-34細胞のDNA切断を引き起こした。   As can be seen from the agarose gel electrophoresis pattern of FIG. 3, TC11 caused DNA breaks in KMS-34 cells. Positive control staurosporine also caused DNA breaks in KMS-34 cells.

５. 骨髄腫瘍坦癌マウスを用いたサリドマイド誘導体TC11の抗腫瘍効果
KMS-34細胞1.2×107個を5週齢のオスのlcr/scidマウス（CLEA Japan, Inc. Tokyo）の背部に皮下注射し、約6〜7週間たって腫瘍の大きさが50mm3を初めて超えた時点をday=1として、3匹に5%カルボキシメチルセルロース（コントロール）、3匹にTC11（20μg/g mouse）を3日に2日腹腔内注射した。腫瘍の大きさはノギスを用いて経時的に測定し、腫瘍体径は長径×短径2×0.52にて算出した(Tomioka, D., 等 (2001) Cancer Res., 61,7518-7524)。day7、day10、day14にt検定によって評価し、P＜0.05で有意差ありとした。なお当研究は、慶應義塾大学動物実験委員会の承認を得て行なわれた(承認番号09118-(0)号)。5. Antitumor effect of thalidomide derivative TC11 using bone marrow tumor-bearing mice
1.2 x 10 7 KMS-34 cells were injected subcutaneously into the back of a 5-week-old male lcr / scid mouse (CLEA Japan, Inc. Tokyo), and the tumor size was 50 mm 3 for the first time after about 6-7 weeks. When the time was exceeded, day = 1, 3 mice were intraperitoneally injected with 5% carboxymethylcellulose (control) and 3 mice with TC11 (20 μg / g mouse) on the 3rd. Tumor size was measured over time using calipers, and tumor body diameter was calculated as major axis × minor axis 2 × 0.52 (Tomioka, D., et al. (2001) Cancer Res., 61, 7518-7524) . Evaluation was made by t-test on day 7, day 10, and day 14, and P <0.05 was considered significant. This research was conducted with the approval of Keio University Animal Experiment Committee (Approval No. 09118- (0)).

in vivoでのTC11の抗骨髄腫作用を検討するために、lcr/scidマウスに1.2×107個のKMS-34細胞を皮下注射し、腫瘍サイズが50mm3を初めて超えた時点でTC11（20μg/g mouse）の腹腔内投与を開始した。経時的な腫瘍サイズの変化を図４に示す。また、day7、day10、day14にt検定を行った。day7ではP＝0.0002、day14ではP＝0.043となり、TC11処理群ではコントロールに比べて有意な増殖抑制を認めたが、体重減少などの全身毒性や著明な臓器障害は認められなかった。To investigate the antimyeloma effect of TC11 in vivo, lcr / scid mice were injected with 1.2 × 10 7 KMS-34 cells subcutaneously, and TC11 (20 μg when tumor size exceeded 50 mm 3 for the first time. / g mouse) was started. The change in tumor size over time is shown in FIG. In addition, t-tests were performed on day 7, day 10, and day 14. P7 was 0.0002 on day7 and P = 0.043 on day14. The TC11 treatment group showed significant growth inhibition compared to controls, but no systemic toxicity such as weight loss or significant organ damage was observed.

６. TC11を投与した骨髄腫瘍坦癌マウスの病理組織学的検査
in vivoでのTC11のアポトーシス誘導を検討するために、lcr/scidマウスに1.2×107個のKMS-34細胞を皮下注射し、腫瘍サイズが50mm3を初めて超えた時点でTC11（20μg/g mouse）の腹腔内投与を開始し、14日目にマウスをエーテル麻酔により致死させ、取り出した腫瘍において病理組織学的検査を行った。TC11処理群とコントロール群の比較を行った。具体的には、腫瘍の大きさが50mm3に達したら、3匹に5%カルボキシメチルセルロース（コントロール）、3匹にTC11（20μg/g mouse）を3日に2日腹腔内注射した。TC11あるいはコントロールの注射開始14日後（day14）にマウスをエーテル麻酔により致死させ、腫瘍を皮膚切開により分離し、10%ホルマリンで固定し、パラフィン包埋標本を作製した。ヘマトキシリン・エオシン染色によりアポトーシスの検討を行った。免疫組織化学では、アポトーシス検出には1/200希釈した抗single-stranded DNA（ssDNA）ウサギポリクローナル抗体（DakoCytomation, Carpinteria, CA）、細胞増殖の評価には1/100希釈した抗MIB-1マウスモノクローナル抗体（DakoCytomation, Carpinteria, CA）を用い、ペルオキシダーゼ標識2次抗体を添加し、DAB発色を行った。6. Histopathological examination of bone marrow tumor-bearing mice treated with TC11
To study TC11 apoptosis induction in vivo, lcr / scid mice were injected with 1.2 × 10 7 KMS-34 cells subcutaneously and TC11 (20 μg / g when tumor size exceeded 50 mm 3 for the first time. The mouse was killed by ether anesthesia on the 14th day, and histopathological examination was performed on the removed tumor. Comparison was made between the TC11 treatment group and the control group. Specifically, when the tumor size reached 50 mm 3 , 3 mice were intraperitoneally injected with 5% carboxymethylcellulose (control) and 3 mice with TC11 (20 μg / g mouse) on the 3rd. Mice were killed by ether anesthesia 14 days after the start of TC11 or control injection (day 14), and the tumors were isolated by skin incision and fixed with 10% formalin to prepare paraffin-embedded specimens. Apoptosis was examined by hematoxylin and eosin staining. In immunohistochemistry, 1/200 diluted anti-single-stranded DNA (ssDNA) rabbit polyclonal antibody (DakoCytomation, Carpinteria, CA) was used to detect apoptosis, and 1/100 diluted anti-MIB-1 mouse monoclonal was used to assess cell proliferation. Using an antibody (DakoCytomation, Carpinteria, CA), a peroxidase-labeled secondary antibody was added, and DAB color development was performed.

ヘマトキシリン・エオシン染色によると、TC11処理群では核の凝縮や断片化などアポトーシス像がコントロール群よりも顕著に多かった。また、抗ssDNA(single strand DNA;一本鎖DNA)抗体を用いた免疫組織化学によると、TC11群ではDNAの切断を引き起こし一本鎖DNAになったアポトーシス細胞がコントロール群よりも顕著に多かった。よってTC11はin vitroばかりでなく、in vivo骨髄腫細胞のアポトーシスも強く誘導するということがわかった。   According to hematoxylin and eosin staining, the TC11 treatment group had significantly more apoptotic images such as nuclear condensation and fragmentation than the control group. Moreover, according to immunohistochemistry using anti-ssDNA (single strand DNA) antibody, the TC11 group had significantly more apoptotic cells that caused DNA cleavage and became single-stranded DNA than the control group. . Thus, it was found that TC11 strongly induces apoptosis of myeloma cells in vivo as well as in vitro.

［実施例２］
薬剤TC11と結合する標的タンパク質の同定
薬剤TC11と結合する標的タンパク質を同定する目的で、以下の実験を行った。その結果、ヌクレオフォスミンとα-チューブリンがTC11と結合することが明らかになった。
なお、本実施例で用いたプライマーは下記の通りである。[Example 2]
Identification of target protein that binds to drug TC11 In order to identify the target protein that binds to drug TC11, the following experiment was performed. As a result, it was revealed that nucleophosmin and α-tubulin bind to TC11.
The primers used in this example are as follows.

[方法と結果]
１.DNAライブラリーの作成
（１−１）PCRによるライブラリーの増幅
DNA溶液KMS34 cDNA Lib 0.7μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 10μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 10μl、25mM MgSO4 4μl、forwardプライマー：GSP6omega F (10 pmol/μl) 3μl、reverseプライマー：3RV30 (10 pmol/μl) 3μl、KOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 2μlとRNase-Free水を添加し、全体量を100μlとして1チューブに入れ、合計12チューブをPCR反応させた。PCRは94℃、5分間反応後94℃、30秒間、58℃30秒間、68℃2分間を24サイクル行った後68℃5分間反応を行った。cDNAライブラリーはWizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega）で精製し60μlのDNA溶液として回収した後、１%低融点アガロースゲル(Sigma)電気泳動し分子量マーカーを目安に200-400bp、400-750bp、750-1400bp、1400-3000bpそれぞれのバンドを切り出した。ゲルは70℃20分間加熱し融解後、Wizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega）で精製し40μlのDNA溶液として回収しcDNAライブラリーKMS-XS (200-400bp)、KMS-S(400-750bp)、KMS-L(750-1400bp)、KMS-XL(1400-3000bp)とした。[Method and Result]
1. Preparation of DNA library (1-1) Amplification of library by PCR
DNA solution KMS34 cDNA Lib 0.7 μl, 10 × KOD plus buffer (TOYOBO) 10 μl, 2 mM dNTPs (TOYOBO) 10 μl, 25 mM MgSO 4 4 μl, forward primer: GSP6omega F (10 pmol / μl) 3 μl, reverse primer: 3RV30 ( 10 μmol / μl) 3 μl, KOD plus polymerase (TOYOBO) 2 μl and RNase-Free water were added to make a total volume of 100 μl in one tube, and a total of 12 tubes were subjected to PCR reaction. PCR was carried out at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 24 cycles of 94 ° C., 30 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 2 minutes, and then reacted at 68 ° C. for 5 minutes. The cDNA library was purified by Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega) and recovered as a 60 μl DNA solution, and then electrophoresed on a 1% low melting point agarose gel (Sigma), using molecular weight markers as a guideline for 200-400 bp, 400-750 bp, Bands of 750-1400 bp and 1400-3000 bp were cut out. The gel was heated at 70 ° C for 20 minutes, thawed, purified by Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega), recovered as 40 µl of DNA solution, and cDNA libraries KMS-XS (200-400bp), KMS-S (400-750bp) KMS-L (750-1400 bp) and KMS-XL (1400-3000 bp).

２．IVVライブラリーの調製
（２−１）ライブラリーの転写
cDNAライブラリーKMS-Lを2pmol、5×SP6緩衝液 8μl、ATP (100mM) 2μl、CTP (100mM) 2μl、UTP (100mM) 2μl、GTP (10mM) 4μl、キャップアナログ(m7G(5')PPP(5')G) (Invitrogen) (40mM) 5μl、エンザイムミックスSP6RNA ポリメラーゼ（Promega） 4μl、RNase-Free水を添加し全体量を 40μlとして、37℃、3時間反応後、RQ1 RNase-Free DNase（Promega） 10μlを添加し、さらに37℃、1時間反応させた。RNAはRNeasy Mini kit (Qiagen)により精製した。すなわち転写反応液に、RNase-Free水を添加し全体量を 100μlとし、RLT緩衝液(Qiagen) 350μl、2-メルカプトエタノール 5μl、(100%) エタノール 250μlを加えRNeasy ミニスピンカラムに供し、25℃、12000 rpm、15秒間遠心後排出された溶液を除去し、RPE緩衝液(Qiagen)500μlを同カラムに加え、25℃、12000 rpm、25秒間遠心後、排出された溶液を除去し、さらにRPE緩衝液(Qiagen)500μlを同カラムに加え、25℃、12000 rpm、2分間遠心後、排出された溶液を除去し、同カラムを新しいチューブに差し替え、25℃、12000 rpm、1分間遠心し、再び同カラムを新しいチューブに差し替え同カラムに、RNase-Free水を32.5μl添加し、10分間室温で放置後25℃、13200 rpm、1分間遠心しRNA溶液として回収した。2. Preparation of IVV library (2-1) Transcription of library
cDNA library KMS-L 2 pmol, 5 x SP6 buffer 8 μl, ATP (100 mM) 2 μl, CTP (100 mM) 2 μl, UTP (100 mM) 2 μl, GTP (10 mM) 4 μl, cap analog (m7G (5 ') PPP ( 5 ′) G) (Invitrogen) (40 mM) 5 μl, Enzyme mix SP6 RNA polymerase (Promega) 4 μl, RNase-Free water added to bring the total volume to 40 μl, reaction at 37 ° C. for 3 hours, RQ1 RNase-Free DNase (Promega) 10 μl was added, and the mixture was further reacted at 37 ° C. for 1 hour. RNA was purified by RNeasy Mini kit (Qiagen). In other words, add RNase-Free water to the transcription reaction solution to make a total volume of 100 μl, add 350 μl of RLT buffer (Qiagen), 5 μl of 2-mercaptoethanol, 250 μl of (100%) ethanol, and apply to an RNeasy mini spin column at 25 ° Remove the solution drained after centrifugation at 12000 rpm for 15 seconds, add 500 μl of RPE buffer (Qiagen) to the same column, centrifuge at 25 ° C, 12000 rpm for 25 seconds, remove the drained solution, and further add RPE Add 500 μl of buffer (Qiagen) to the same column, centrifuge at 25 ° C, 12000 rpm, 2 minutes, remove the drained solution, replace the column with a new tube, centrifuge at 25 ° C, 12000 rpm, 1 minute, The column was replaced with a new tube again, 32.5 μl of RNase-Free water was added to the column, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes and then centrifuged at 25 ° C., 13200 rpm for 1 minute, and recovered as an RNA solution.

（２−２）PEGスペーサーとのライゲーション
得られたRNA溶液 31.5μl、T4 ligation 10×緩衝液 5μl、0.1 M DTT 1μl、40 mM ATP 0.5μl、100% DMSO 5μl、0.1% BSA 1μl、RNase inhibitor(TOYOBO) 1μl、ピューロマイシン付きポリエチレングリコールスペーサー分子 (特開2002-176987) (10 nmol) 1μl、ポリエチレングリコール（PEG） 2000 （日本油脂）(30 nmol) 1μl、T4 RNA リガーゼ (Takara)(250 U/μl) 5μl、15℃、15時間遮光条件下反応させた。得られたスペーサー分子が結合したPEG-RNAはRNeasy Mini kit (Qiagen)により精製した。(2-2) Ligation with PEG spacer The obtained RNA solution 31.5 μl, T4 ligation 10 × buffer 5 μl, 0.1 M DTT 1 μl, 40 mM ATP 0.5 μl, 100% DMSO 5 μl, 0.1% BSA 1 μl, RNase inhibitor ( TOYOBO) 1 μl, polyethylene glycol spacer molecule with puromycin (JP 2002-176987) (10 nmol) 1 μl, polyethylene glycol (PEG) 2000 (Japanese oil) (30 nmol) 1 μl, T4 RNA ligase (Takara) (250 U / μl) The reaction was carried out under light-shielded conditions at 5 μl, 15 ° C. for 15 hours. The obtained PEG-RNA to which the spacer molecule was bound was purified by RNeasy Mini kit (Qiagen).

（２−３）IVVライブラリーの調製
PEG-RNA 25 pmol、小麦胚芽抽出液（ZoeGene）50μl、クレアチンキナーゼ (40μg/μl)（ZoeGene） 5μl、RNase inhibitor(ZoeGene) 4μl、5×翻訳緩衝液(ZoeGene) 50μl、RNase-Free水を添加し全体量を250μlとし、遮光条件下26℃、1時間反応させ翻訳を行いIVVライブラリーを調製した。(2-3) Preparation of IVV library
PEG-RNA 25 pmol, wheat germ extract (ZoeGene) 50 μl, creatine kinase (40 μg / μl) (ZoeGene) 5 μl, RNase inhibitor (ZoeGene) 4 μl, 5 × translation buffer (ZoeGene) 50 μl, RNase-free water added The total amount was 250 μl, and the reaction was carried out at 26 ° C. for 1 hour under light-shielded conditions for translation to prepare an IVV library.

３．標的薬剤と結合する蛋白質の選択
（３−１）標的薬剤のセンサーチップへの固定化
ビアコアはビアコア3000システムを用い、センサーチップSAに薬剤の固定化を行った。フローは緩衝液HBS-EP(10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Tween-20) で10μl/minで行った。フローセル１〜４に対し50mM NaOH, 1M NaClを含む溶液20μlのインジェクトを5回繰り返し行い固定化の前処理を行った。TC11-biotinは1μM（H2O, 0.05% DMSO）に調整し、フローセル１〜４にTC11-biotinを固定化した。各100μlをマニュアルインジェクションしたところ、TC11-biotinはフローセル１に203.2 RU, フローセル2に205.0 RU, フローセル3に206.2 RU, フローセル4に 206.8 RU結合した。非結合の薬剤を洗浄する目的で緩衝液HBS-EPで30μl/min, 同緩衝液30μl, Glycin HCl pH 2.0 15μlの順にインジェクトする操作を２回行った。3. Selection of protein that binds to target drug (3-1) Immobilization of target drug on sensor chip Biacore used Biacore 3000 system to fix the drug on sensor chip SA. The flow was performed with a buffer HBS-EP (10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Tween-20) at 10 μl / min. The flow cells 1 to 4 were pretreated for immobilization by repeatedly injecting 20 μl of a solution containing 50 mM NaOH and 1M NaCl five times. TC11-biotin was adjusted to 1 μM (H 2 O, 0.05% DMSO), and TC11-biotin was immobilized on the flow cells 1 to 4. When 100 μl of each was manually injected, TC11-biotin was bonded to Flow Cell 1 at 203.2 RU, Flow Cell 2 at 205.0 RU, Flow Cell 3 at 206.2 RU, and Flow Cell 4 at 206.8 RU. In order to wash away the unbound drug, the injection of 30 μl / min with buffer HBS-EP, 30 μl of the same buffer, and 15 μl of Glycin HCl pH 2.0 was performed twice.

（３−２）ビアコア法-選択実験
ANTI-FLAG M2 affinity gel 50μl(50%スラリー)をTBST (20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 138 mM NaCl, 0.1% Tween-20) 500μlで3回洗浄したものに、IVVライブラリー溶液250μl、TBST 250μlを混和させ4℃で１時間ミニディスクローター（Bio craft）で回転攪拌した。ゲルをTBST 500μlで3回洗浄し、FLAGペプチド(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) （配列番号９）100μg/ml 100μlで溶出した。TBST, 10mM EDTAで膨潤ならびに平衡化させたSephadex G200 (Amersham Biosciences)ゲル1 mlをカラム（バイオラッド）に充填したものにFLAG ペプチドで溶出したIVVライブラリー溶液100μlを供し、2滴ずつ96穴プレートに集め１wellから12wellまでを回収した。Multi-detection Microplate Reader POWERSCAN HTで励起波長485nm、蛍光波長528nmで蛍光を検出し、4wellから7wellあたりに溶出したIVV画分を集めた。IVV画分約200μlにHBS-EP約100μlで希釈しビアコアにインジェクトした。ビアコアでのセレクションは緩衝液HBS-EPを用い、流速20μl/minで行い結合750秒、解離1000秒の後、ビアコアの回収メソッドを使い洗浄部分は緩衝液HBS-EP 600秒、溶出部分はTC11 200μM（H2O, 1% DMSO）600秒で行いそれぞれ7μlを回収した。選択実験の1ラウンドは(KMS-L→KMS-L1)洗浄を１回、2ラウンドは(KMS-L1→KMS-L2)洗浄を2回、3ラウンドは(KMS-L2→KMS-L3)洗浄を3回、4ラウンドは(KMS-L3→KMS-L4)洗浄を4回としラウンドごとに選択圧を上げた(図５)。(3-2) Biacore method-selection experiment
ANTI-FLAG M2 affinity gel 50 μl (50% slurry) was washed 3 times with 500 μl TBST (20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 138 mM NaCl, 0.1% Tween-20), 250 μl of IVV library solution, TBST (250 μl) was mixed and stirred at 4 ° C. for 1 hour with a mini disc rotor (Biocraft). The gel was washed 3 times with 500 μl of TBST and eluted with 100 μl of FLAG peptide (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) (SEQ ID NO: 9) 100 μg / ml. 1 ml of Sephadex G200 (Amersham Biosciences) gel swollen and equilibrated with TBST, 10 mM EDTA is packed in a column (Bio-Rad), and then 100 μl of IVV library solution eluted with FLAG peptide is used, and 2 drops are added to a 96-well plate. 1 well to 12 wells were collected. Fluorescence was detected with a Multi-detection Microplate Reader POWERSCAN HT at an excitation wavelength of 485 nm and a fluorescence wavelength of 528 nm, and IVV fractions eluted from 4 to 7 wells were collected. The IVV fraction was diluted with about 100 μl of HBS-EP in about 200 μl and injected into Biacore. Selection at Biacore uses buffer HBS-EP at a flow rate of 20 μl / min, after 750 seconds of binding and after 1000 seconds of dissociation, using Biacore recovery method, washing part is buffer HBS-EP 600 seconds, elution part is TC11 200 μM (H 2 O, 1% DMSO) was performed for 600 seconds, and 7 μl was collected each time. 1 round of selection experiment (KMS-L → KMS-L1) 1 wash, 2 rounds (KMS-L1 → KMS-L2) 2 washings, 3 rounds (KMS-L2 → KMS-L3) washing 3 times and 4 rounds (KMS-L3 → KMS-L4) washing was performed 4 times, and the selection pressure was increased for each round (FIG. 5).

（３−３）RT-PCRによるcDNAライブラリーの回収
標的薬剤と結合する蛋白質の選択実験で回収した溶出液7μlと、5×RT緩衝液(TOYOBO) 20μl、(10 mM) dNTPs(TOYOBO) 10μl、reverseプライマー：3RV30 (10pmol/μl) 5μl、RNase-Free水を添加し全体量を90μlとし混和させ65℃9分間反応後直ちに氷上に冷却し2分間放置した後、ReverTra Ace(TOYOBO) 5μl、RNase inhibitor(TOYOBO) 5μlを加え、50℃30分間、99℃、5分間逆転写反応させた。逆転写反応させた反応溶液2.5μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 2.5μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 2.5μl、25mM MgSO4 1μl、forwardプライマー：GSP6omega F (10 pmol/μl) 0.75μl、reverseプライマー：3RV30 (10 pmol/μl) 0.75μl、KOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 0.5μl、とRNase-Free水を添加し全体量を25μlとしてPCR反応させた。PCRは94℃、5分間反応後94℃、30秒間、58℃30秒間、68℃2分間を28、32あるいは36サイクル行った後68℃5分間反応を行った。PCR産物5μlを2%アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイドの吸収をMOLECULAR IMAGER FX (Bio-rad)で測定しPCRのサイクルを決定した(図６)。残りの逆転写反応させた反応溶液10μl、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 10μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 10μl、25mM MgSO4 4μl、forwardプライマー：GSP6omega F (10 pmol/μl) 3μl、reverseプライマー：3RV30 (10 pmol/μl) 3μl、KOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 2μl、とRNase-Free水を添加し全体量を100μlとして1チューブに入れ、合計10チューブをPCR反応させた。PCRは94℃、5分間反応後94℃、30秒間、58℃30秒間、68℃2分間を28から36サイクル行った後68℃5分間反応を行った。(3-3) Recovery of cDNA library by RT-PCR 7 μl of eluate recovered in the selection experiment of the protein that binds to the target drug, 20 μl of 5 × RT buffer (TOYOBO), (10 mM) dNTPs (TOYOBO) 10 μl , Reverse primer: 5 μl of 3RV30 (10 pmol / μl), add RNase-Free water, mix to a total volume of 90 μl, react at 65 ° C. for 9 minutes, immediately cool on ice and let stand for 2 minutes, then ReverTra Ace (TOYOBO) 5 μl, 5 μl of RNase inhibitor (TOYOBO) was added, and reverse transcription reaction was performed at 50 ° C. for 30 minutes and 99 ° C. for 5 minutes. Reaction solution 2.5 μl subjected to reverse transcription reaction, 10 × KOD plus buffer (TOYOBO) 2.5 μl, 2 mM dNTPs (TOYOBO) 2.5 μl, 25 mM MgSO 4 1 μl, forward primer: GSP6omega F (10 pmol / μl) 0.75 μl, Reverse primer: 0.75 μl of 3RV30 (10 pmol / μl), 0.5 μl of KOD plus polymerase (TOYOBO), and RNase-free water were added to carry out PCR reaction with a total volume of 25 μl. PCR was performed at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 28, 32 or 36 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 2 minutes, and then reacted at 68 ° C. for 5 minutes. 5 μl of the PCR product was subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and the absorption of ethidium bromide was measured with MOLECULAR IMAGER FX (Bio-rad) to determine the PCR cycle (FIG. 6). 10 μl of the remaining reaction solution subjected to reverse transcription, 10 × KOD plus buffer (TOYOBO) 10 μl, 2 mM dNTPs (TOYOBO) 10 μl, 25 mM MgSO 4 4 μl, forward primer: GSP6omega F (10 pmol / μl) 3 μl, reverse primer : 3RV30 (10 pmol / μl) 3 μl, KOD plus polymerase (TOYOBO) 2 μl, and RNase-Free water were added to make a total volume of 100 μl in one tube, and a total of 10 tubes were subjected to PCR reaction. PCR was performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by 28 to 36 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 2 minutes, and then reacted at 68 ° C for 5 minutes.

cDNAライブラリーはWizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega）で精製し60μlのDNA溶液として回収した後１%低融点アガロースゲル(Sigma)電気泳動し分子量マーカーを目安にKMS-L(750-1400bp)のバンドを切り出した。ゲルは70℃10分間加熱し融解後Wizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega）で精製し42μlのDNA溶液として回収しDNAライブラリーKMS-L1〜KMS-L4 (750-1400bp)とした。   The cDNA library was purified by Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega), recovered as 60 μl of DNA solution, then electrophoresed on 1% low melting point agarose gel (Sigma), and the molecular weight marker was used as a guideline for KMS-L (750-1400 bp). A band was cut out. The gel was heated at 70 ° C. for 10 minutes, thawed, purified by Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega), recovered as a 42 μl DNA solution, and used as DNA libraries KMS-L1 to KMS-L4 (750-1400 bp).

４．クローニングと塩基配列の決定
（４−１）クローニングと塩基配列
ライブラリーからクローンを得るためにTOPO クローニングキット（Invitorogen）を用いた。選択実験で得られたDNA 0.16 pmol、taqポリメラーゼ 10×緩衝液(TOYOBO) 5μl、dATP (10 mM) 1μl、25mM MgCl2 3μl、 taqポリメラーゼ (Taq Pol) (TOYOBO)0.5μlにRNase-Free水を添加し全体量を50μlとし72℃、15分間反応させた。生成物はWizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega）で精製し20μlのDNA溶液として回収した後、DNA 4μl、Topo vector （Invitorogen) 1μl、Salt solution（Invitorogen) 1μl、を混和させ室温で20分間放置した。大腸菌にトランスフォームするために氷上で溶解したコンピテントセルに上記に混和溶液5.5μlを入れ氷上で25分間放置後、43℃、32秒間ヒートショックを行った。セルにSOC（Invitorogen) を250μl入れ、37℃、1時間 振とう培養器で培養させ2枚の寒天プレート（500 ml中にトリプトン 5 g、酵母エキス 2.5 g、NaCl 5 g、寒天7.5 g 、カルベニシリン 25 mg)（シャーレ９cm)にまいて37℃で一晩培養した。4). Cloning and determination of nucleotide sequence (4-1) Cloning and nucleotide sequence To obtain a clone from the library, TOPO cloning kit (Invitorogen) was used. RNase-Free water was added to 0.16 pmol of DNA obtained in the selection experiment, 5 μl of taq polymerase 10 × buffer (TOYOBO), 5 μl of dATP (10 mM), 3 μl of 25 mM MgCl 2 and 0.5 μl of taq polymerase (Taq Pol) (TOYOBO). The total amount was 50 μl, and the mixture was reacted at 72 ° C. for 15 minutes. The product was purified by Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega) and recovered as 20 μl of DNA solution, and then mixed with 4 μl of DNA, 1 μl of Topo vector (Invitorogen) and 1 μl of Salt solution (Invitorogen) and left at room temperature for 20 minutes. . In order to transform into Escherichia coli, 5.5 μl of the mixed solution was placed in a competent cell dissolved on ice and allowed to stand on ice for 25 minutes, followed by heat shock at 43 ° C. for 32 seconds. Place 250 μl of SOC (Invitorogen) in the cell and incubate on a shaking incubator for 1 hour at 37 ° C. Two agar plates (5 g tryptone, 2.5 g yeast extract, 5 g NaCl, 7.5 g agar, carbenicillin in 500 ml) 25 mg) (9 cm petri dish) and cultured overnight at 37 ° C.

培養した寒天プレートに生じたコロニーの一部を爪楊枝でつついたものを10×PCR緩衝液(TOYOBO) 2.5μl、(2 mM) dNTPs(TOYOBO) 2.5μl、M13FII (10pmol/μl) 0.5μl、M13RII (10pmol/μl) 0.5μl、KOD DASH ポリメラーゼ(TOYOBO) 0.25μlにRNase-Free水を添加し全体量を 25μlとしてそれぞれPCR反応させた。   10 × PCR buffer (TOYOBO) 2.5 μl, (2 mM) dNTPs (TOYOBO) 2.5 μl, M13FII (10 pmol / μl) 0.5 μl, M13RII RNase-free water was added to 0.5 μl (10 pmol / μl) and 0.25 μl of KOD DASH polymerase (TOYOBO) to make a total volume of 25 μl, followed by PCR reaction.

PCRは96℃、5分間反応後96℃、30秒間、58℃30秒間、72℃ 1分間を30サイクル行った後72℃5分間反応を行った。増幅した遺伝子は1%アガロースゲル電気泳動によりバンドを確認後Wizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega）で精製し25μlのDNA溶液として回収した。クローンDNA 16 ng、M13FII (10pmol/μl) 0.5μl、あるいはM13RII (10pmol/μl) 0.5μl、DTCS kit Premix (Beckman coulter) 4μlにRNase-Free水を添加し全体量を 10μlとしてそれぞれPCR反応させた。PCRは96℃、5分間反応後96℃、20秒間、58℃20秒間、60℃4分間を30サイクル行った後72℃5分間反応を行った。得られたPCR反応物を1.5mlチューブに移し(3M) NaOAc 1 μl、(0.1M) EDTA 1μl、(20 mg/ml)グリコーゲン溶液（ナカライテスク株式会社）1 μlをよく混和させ冷(100%) エタノール 60μlを加えよく混和させた。4℃、14000 rpm、15 分間遠心し上清を除去し(70%)エタノール200μlにてペレットを洗浄後再び14000rpm、2分間遠心して上清を除去することを2回行った。た。その後、30-40分間遠心乾燥した後、脱イオン化したホルムアミド(Beckman coulter) 40 μlを加えよく混和させた。配列分析はCEQ 2000 DNA Analysis System (Beckman coulter)で行った。   PCR was performed at 96 ° C for 5 minutes, followed by 30 cycles of 96 ° C, 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute, and then reacted at 72 ° C for 5 minutes. The amplified gene was confirmed by 1% agarose gel electrophoresis and then purified by Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega) and recovered as a 25 μl DNA solution. Clone DNA 16 ng, M13FII (10 pmol / μl) 0.5 μl, or M13RII (10 pmol / μl) 0.5 μl, DTCS kit Premix (Beckman coulter) 4 μl, RNase-Free water was added to make the total volume 10 μl, and PCR was performed. . PCR was performed at 96 ° C. for 5 minutes, followed by 30 cycles of 96 ° C., 20 seconds, 58 ° C. for 20 seconds, and 60 ° C. for 4 minutes, followed by 72 ° C. for 5 minutes. Transfer the resulting PCR reaction product to a 1.5 ml tube and mix well (3M) NaOAc 1 μl, (0.1M) EDTA 1 μl, (20 mg / ml) glycogen solution (Nacalai Tesque) 1 μl and cool (100% ) Ethanol 60μl was added and mixed well. The supernatant was removed by centrifugation at 4 ° C. and 14000 rpm for 15 minutes (70%), and the pellet was washed with 200 μl of ethanol and then centrifuged again at 14000 rpm for 2 minutes to remove the supernatant twice. It was. Then, after centrifugal drying for 30-40 minutes, 40 μl of deionized formamide (Beckman coulter) was added and mixed well. Sequence analysis was performed with CEQ 2000 DNA Analysis System (Beckman coulter).

（４−２）ライブラリーの配列解析
各選択実験で得られたライブラリーの配列解析を行いBLAST(登録商標)(Basic Local Alignment Search Tool) Human Sequencesでシーケンシングして得られたDNAの遺伝子の同定を行った。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9606 (4-2) Sequence analysis of the library The sequence of the library obtained in each selection experiment was analyzed, and BLAST (registered trademark) (Basic Local Alignment Search Tool) was sequenced with Human Sequences. Identification was performed. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9606

５．ヌクレオフォスミンの活性評価
複数個得られたクローンのうちヌクレオフォスミンは3ラウンドでは23クローン中4クローン（17%）、4ラウンドでは11クローン中3クローン（27%）、トータルでは34クローン中7クローン（21%）含まれていた。この結果から、ヌクレオフォスミンは薬剤TC11の結合タンパク質の候補であることが明らかになった。5. Evaluation of nucleophosmin activity Among the clones obtained, nucleophosmin was 4 out of 23 clones (17%) in 3 rounds, 3 out of 11 clones (27%) in 4 rounds, and 7 out of 34 clones in total Clones (21%) were included. This result revealed that nucleophosmin is a candidate protein binding protein TC11.

（５−１）KMS-L31-35とNPM1のアミノ酸配列
選択実験で得られたKMS-L31-35はヌクレオフォスミンの全長294アミノ酸残基のうちアミノ末端を含めた1-183アミノ酸であった。図７にヌクレオフォスミンのドメイン構造を示す。(5-1) Amino acid sequences of KMS-L31-35 and NPM1 KMS-L31-35 obtained in the selection experiment was 1-183 amino acids including the amino terminus of the full-length 294 amino acid residues of nucleophosmin. . FIG. 7 shows the domain structure of nucleophosmin.

（５−２）リアルタイムＰＣＲ
各ラウンドで選択された、cDNAライブラリー 5 ng中に含まれるヌクレオフォスミン遺伝子のコピー数をLightCyclear FastStrand DNA master SYBR green I kit (Roche)を用いて、LightCycler (Roche) によりリアルタイムPCRで定量した。遺伝子特異的プライマーはUpper Primer (NPM1 Upper), 5' Position 2、Lower Primer(NPM1 Lower), 3' Position 183を用いた。図８にリアルタイムＰＣＲによるヌクレオフォスミンの濃縮量の推移を示す。(5-2) Real-time PCR
The copy number of the nucleophosmin gene contained in 5 ng of the cDNA library selected in each round was quantified by light cycler (Roche) and real-time PCR using LightCycler FastStrand DNA master SYBR green I kit (Roche). As the gene-specific primers, Upper Primer (NPM1 Upper), 5 ′ Position 2, Lower Primer (NPM1 Lower), 3 ′ Position 183 were used. FIG. 8 shows changes in the concentration of nucleophosmin by real-time PCR.

（５−３）ビアコアによる結合の確認
ビアコアはビアコア3000システムを用い、センサーチップSAに薬剤の固定化を行った。フローは緩衝液HBS-EPで10μl/minで行った。フローセル１〜４に対し、50mM NaOH, 1M NaClを含む溶液20 μlのインジェクトを5回繰り返し行い固定化の前処理を行った。TC11-biotinは1μM（H2O, 0.05% DMSO）に調整し、フローセル２にTC11-biotinを固定化した。30μlをマニュアルインジェクションしたところTC11-biotinは276.4.2 RU結合した。非結合の薬剤を洗浄する目的で緩衝液HBS-EPで30μl/min, 同緩衝液30μl, Glycin HCl pH 2.0 15μlの順にインジェクトする操作を２回行った。(5-3) Confirmation of coupling by via core The via core 3000 system was used as the via core, and the drug was immobilized on the sensor chip SA. The flow was carried out with buffer HBS-EP at 10 μl / min. The flow cells 1 to 4 were pretreated for immobilization by repeatedly injecting 20 μl of a solution containing 50 mM NaOH and 1M NaCl five times. TC11-biotin was adjusted to 1 μM (H 2 O, 0.05% DMSO), and TC11-biotin was immobilized on the flow cell 2. When 30 μl was manually injected, TC11-biotin bound to 276.4.2 RU. In order to wash away the unbound drug, the injection of 30 μl / min with buffer HBS-EP, 30 μl of the same buffer, and 15 μl of Glycin HCl pH 2.0 was performed twice.

（５−３−１）小麦胚芽無細胞翻訳蛋白質の調製
クローニングで得られたクローンKMS-L31-35 DNA 0.01pmol、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 10μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 10μl、25mM MgSO4 4μl、forwardプライマー：GSP6omega F (10 pmol/μl) 3μl、reverseプライマー：3RV30 (10 pmol/μl) 3μl、KOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 2μlにRNase-Free水を添加し全体量を100μlとして1チューブに入れ合計４チューブをPCR反応させた。PCRは94℃、5分間反応後94℃、30秒間、58℃30秒間、68℃1分20秒間を24サイクル行った後68℃5分間反応を行った。cDNAライブラリーはWizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega）で精製し60μlのDNA溶液として回収した。(5-3-1) Preparation of wheat germ cell-free translation protein Clone KMS-L31-35 DNA obtained by cloning 0.01 pmol, 10 × KOD plus buffer (TOYOBO) 10 μl, 2 mM dNTPs (TOYOBO) 10 μl, 25 mM MgSO 4 4 μl, forward primer: GSP6omega F (10 pmol / μl) 3 μl, reverse primer: 3RV30 (10 pmol / μl) 3 μl, KOD plus polymerase (TOYOBO) 2 μl with RNase-Free water added to make the total volume 100 μl A total of 4 tubes were put into a tube and subjected to PCR reaction. PCR was conducted at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 24 cycles of 94 ° C., 30 seconds, 58 ° C. 30 seconds, 68 ° C. 1 minute 20 seconds, and then reacted at 68 ° C. for 5 minutes. The cDNA library was purified by Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega) and recovered as a 60 μl DNA solution.

上記のクローンDNA 2pmol、5×SP6緩衝液 4μl、ATP (100mM) 1μl、CTP (100mM) 1μl、UTP (100mM) 1μl、GTP (100mM) 1μl、エンザイムミックスSP6RNA ポリメラーゼ（Promega） 0.25μl、RNase inhibitor(TOYOBO) 2μlにRNase-Free水を添加し全体量を20μl、37℃、3時間反応後、RQ1 RNase-Free DNase（Promega） 5μlを添加しさらに37℃、1時間反応させた。RNAはRNeasy Mini kit (Qiagen)により精製し21μlのRNA溶液として回収した。   2 pmol of the above clone DNA, 4 μl of 5 × SP6 buffer, ATP (100 mM) 1 μl, CTP (100 mM) 1 μl, UTP (100 mM) 1 μl, GTP (100 mM) 1 μl, enzyme mix SP6 RNA polymerase (Promega) 0.25 μl, RNase inhibitor ( TOYOBO) RNase-Free water was added to 2 μl, and the whole amount was reacted at 20 μl and 37 ° C. for 3 hours. Then, 5 μl of RQ1 RNase-Free DNase (Promega) was added and further reacted at 37 ° C. for 1 hour. RNA was purified by RNeasy Mini kit (Qiagen) and recovered as a 21 μl RNA solution.

上記で得られたクローンRNA 15 pmol、小麦胚芽抽出液（ZoeGene）30μl、クレアチンキナーゼ (40μg/μl)（ZoeGene）3μl、RNase inhibitor(ZoeGene) 2.4μl、5×翻訳緩衝液(ZoeGene) 30μlにRNase-Free水を添加し全体量を 150μlとし、遮光条件下26℃、1.5時間反応させ翻訳を行い蛋白質を調製した。   Clone RNA 15 pmol obtained above, wheat germ extract (ZoeGene) 30 μl, creatine kinase (40 μg / μl) (ZoeGene) 3 μl, RNase inhibitor (ZoeGene) 2.4 μl, 5 × translation buffer (ZoeGene) 30 μl RNase -Free water was added to make the total volume 150 μl, and the reaction was carried out at 26 ° C. for 1.5 hours under light-shielded conditions to prepare a protein by translation.

ANTI-FLAG M2 affinity gel 50μl(50%スラリー)をTBST (20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 138 mM NaCl, 0.1% Tween-20) 500μlで3回洗浄したものに翻訳蛋白質溶液150μl、TBST 150μlを混和させ4℃で１時間ミニディスクローター（Bio craft）で回転攪拌した。ゲルをTBST 500μlで3回洗浄し、FLAG ペプチド(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)（配列番号９） 100μg/ml 100μlで溶出した。   ANTI-FLAG M2 affinity gel 50 μl (50% slurry) was washed 3 times with TBST (20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 138 mM NaCl, 0.1% Tween-20) 500 μl, then translated protein solution 150 μl, TBST 150 μl The mixture was mixed and rotated with a minidisc rotor (Biocraft) at 4 ° C. for 1 hour. The gel was washed 3 times with 500 μl of TBST and eluted with 100 μl of FLAG peptide (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) (SEQ ID NO: 9) 100 μg / ml.

HBS-EPで膨潤ならびに平衡化させたG25 650μlをMicroSpin Columns (GE Healthcare)に入れ0.8rcf, 1min遠心し、FLAG ペプチドで溶出した翻訳蛋白質溶液100 μlを１カラムにつき50μlアプライし0.8rcf, 1min遠心した。カラムの外側を新しいチューブと交換後0.8rcf, 2min遠心しHBS-EPにバッファー交換されたサンプルを集めた。蛋白質の濃度はウエスタンブロットによりFlag-tagで検出しコントロール蛋白質と比較し46.6nMと見積もった。   Place 650 μl of G25 swollen and equilibrated with HBS-EP into MicroSpin Columns (GE Healthcare), centrifuge at 0.8 rcf for 1 min, apply 100 μl of translated protein solution eluted with FLAG peptide to 50 μl per column, centrifuge at 0.8 rcf for 1 min did. After exchanging the outside of the column with a new tube, the solution was centrifuged at 0.8 rcf for 2 min to collect the sample whose buffer was exchanged with HBS-EP. The concentration of the protein was detected by Flag-tag by Western blot and estimated to be 46.6 nM compared with the control protein.

ビアコアの分析はHBS-EPを用い流速は20μl/分で行った。サンプルをKINJECTでインジェクトし,再生はGlycine 20を15μl、(50mM) NaCl, (1 M) NaCl を15μl で行った。   The analysis of Biacore was performed using HBS-EP at a flow rate of 20 μl / min. Samples were injected with KINJECT, and regeneration was performed with 15 μl of Glycine 20 and 15 μl of (50 mM) NaCl, (1 M) NaCl.

図９にKMS-L31-35 (ヌクレオフォスミン)のセンサーグラムを示す。常法に従いTC11-biotinを結合させたフローセルから薬剤を非添加のフローセルを引き算しフィッティングさせKDの見積もりを行った。フィッティングを行い3.84x 10-5MのKD値と算出された。小麦胚芽無細胞翻訳系で調製したヌクレオフォスミンとTC11は比較的弱い相互作用が示された。FIG. 9 shows a sensorgram of KMS-L31-35 (nucleophosmin). The KD was estimated by subtracting and fitting the flow cell to which no drug was added from the flow cell to which TC11-biotin was bound according to a conventional method. A fitting was performed and a KD value of 3.84 × 10 −5 M was calculated. Nucleophosmin and TC11 prepared in a wheat germ cell-free translation system showed a relatively weak interaction.

（５−３−２）大腸菌発現蛋白質の調製
クローニングで得られたクローンKMS-L31-35 DNA 0.01pmol、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 10μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 10μl、25mM MgSO4 4μl、forwardプライマー：CACC-NPM1-F (10 pmol/μl) 3μl、reverseプライマー：NPM1-FlagHis (10 pmol/μl) 3μl、KOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 2μlにRNase-Free水を添加し全体量を100μlとして1チューブに入れ、合計４チューブをPCR反応させた。PCRは94℃、5分間反応後94℃、30秒間、58℃30秒間、68℃1分20秒間を24サイクル行った後68℃5分間反応を行った。cDNAライブラリーはWizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega）で精製し60μlのDNA溶液として回収した。得られたPCR産物及をpET101/D-TOPO (Invitrogen)に導入しOne shot top10(Invitrogen)にトランスフォーメーションを行いプラスミド を得た。(5-3-2) Preparation of E. coli expressed protein Clone KMS-L31-35 DNA obtained by cloning 0.01 pmol, 10 × KOD plus buffer (TOYOBO) 10 μl, 2 mM dNTPs (TOYOBO) 10 μl, 25 mM MgSO 4 4 μl , Forward primer: CACC-NPM1-F (10 pmol / μl) 3 μl, reverse primer: NPM1-FlagHis (10 pmol / μl) 3 μl, KOD plus polymerase (TOYOBO) 2 μl with RNase-free water added to 100 μl total volume Were put into one tube, and a total of 4 tubes were subjected to PCR reaction. PCR was conducted at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 24 cycles of 94 ° C., 30 seconds, 58 ° C. 30 seconds, 68 ° C. 1 minute 20 seconds, and then reacted at 68 ° C. for 5 minutes. The cDNA library was purified by Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega) and recovered as a 60 μl DNA solution. The obtained PCR product and the resulting product were introduced into pET101 / D-TOPO (Invitrogen) and transformed into One shot top10 (Invitrogen) to obtain a plasmid.

作製したプラスミドを大腸菌に導入しヌクレオフォスミンを発現した。プラスミドDNAをBL21Star (DE3) (Invitrogen) に形質転換し、LB培地 (+100μg/mL カルベニシリン) に植菌し、37℃で一晩、前培養を行なった。前培養した菌液を20倍量のTB培地に加え、OD600が0.4になるまで37℃で振盪培養した。最終濃度が0.1 mMになるようにIPTGを培養液に加え、 37℃、2〜4時間で発現誘導を行なった。培養液を8,500 rpmで8分間遠心し、菌体を回収した。   The prepared plasmid was introduced into Escherichia coli to express nucleophosmin. Plasmid DNA was transformed into BL21Star (DE3) (Invitrogen), inoculated into LB medium (+100 μg / mL carbenicillin), and precultured overnight at 37 ° C. The pre-cultured bacterial solution was added to 20 times the amount of TB medium and cultured at 37 ° C. with shaking until the OD600 reached 0.4. IPTG was added to the culture solution so that the final concentration was 0.1 mM, and expression was induced at 37 ° C. for 2 to 4 hours. The culture solution was centrifuged at 8,500 rpm for 8 minutes, and the cells were collected.

回収した菌体を0.02% (v/v) プロテアーゼインヒビターカクテルを含むTBSに懸濁して超音波粉砕し、9,500 rpmで15分間遠心を行い、上清を回収した。TALON CellThru Resin (Clontech) 4 mLを10mMイミダゾールを含むTBSバッファーで平衡化後、このレジンに上清（可溶性画分）を加え、4℃で終夜結合させた。この反応液をカラムに加え、洗浄バッファー (TBS、10 mM イミダゾール) で洗浄後、溶出バッファー (TBS、250 mM イミダゾール)でタンパク質を溶出した。   The collected cells were suspended in TBS containing 0.02% (v / v) protease inhibitor cocktail, sonicated, centrifuged at 9,500 rpm for 15 minutes, and the supernatant was collected. After 4 mL of TALON CellThru Resin (Clontech) was equilibrated with a TBS buffer containing 10 mM imidazole, the supernatant (soluble fraction) was added to this resin and allowed to bind overnight at 4 ° C. This reaction solution was added to the column, washed with a washing buffer (TBS, 10 mM imidazole), and then the protein was eluted with an elution buffer (TBS, 250 mM imidazole).

HBS-EPで膨潤ならびに平衡化させたSuperose 12 10/300に 250 mM イミダゾールで溶出した発現蛋白質溶液1000μlをインジェクトし、流速0.5ml/minでゲルろ過を行った。溶出画分は約10ml溶出液で溶出された高分子量画分と約15ml溶出液で溶出された低分子量画分とについて評価した。蛋白質の濃度はウエスタンブロットによりFlag-tagで検出しコントロール蛋白質と比較し高分子量画分は454nM、低分子量画分は80nMと見積もった。   1000 μl of the expressed protein solution eluted with 250 mM imidazole was injected into Superose 12 10/300 swollen and equilibrated with HBS-EP, and gel filtration was performed at a flow rate of 0.5 ml / min. The elution fraction was evaluated for a high molecular weight fraction eluted with about 10 ml eluate and a low molecular weight fraction eluted with about 15 ml eluate. The protein concentration was detected by Flag-tag by Western blot, and compared with the control protein, the high molecular weight fraction was estimated to be 454 nM and the low molecular weight fraction was estimated to be 80 nM.

ビアコアの分析はHBS-EPを用い流速は20μl/分で行った。サンプルをKINJECTでインジェクトし,再生はGlycine 20を15μl、(50mM) NaCl, (1 M) NaCl を15μl で行った。   The analysis of Biacore was performed using HBS-EP at a flow rate of 20 μl / min. Samples were injected with KINJECT, and regeneration was performed with 15 μl of Glycine 20 and 15 μl of (50 mM) NaCl, (1 M) NaCl.

図１０に大腸菌発現蛋白質(ヌクレオフォスミン)のセンサーグラムを示す。常法に従いTC11-biotinを結合させたフローセルから薬剤を非添加のフローセルを引き算しフィッティングさせKDの見積もりを行った。フィッティングを行い高分子量画分は1.25x 10-4Mの低分子量画分6.64x 10-8MのKD値とそれぞれ算出された。大腸菌で発現したヌクレオフォスミンはゲルろ過でサイズ分画することにより、TC11との相互作用の強い画分と弱い画分とに分離することができた。高分子量画分のヌクレオフォスミンは凝集体として存在していることが予想され相互作用は弱いものであったが、低分子量画分のものは単量体の構造を取っているものと予想されTC11との相互作用は比較的強いものであった。FIG. 10 shows a sensorgram of E. coli expressed protein (nucleophosmin). The KD was estimated by subtracting and fitting the flow cell to which no drug was added from the flow cell to which TC11-biotin was bound according to a conventional method. After fitting, the high molecular weight fraction was calculated as the low molecular weight fraction of 1.25 × 10 −4 M and the KD value of 6.64 × 10 −8 M, respectively. Nucleophosmin expressed in E. coli could be separated into a fraction with strong interaction with TC11 and a fraction with weak interaction by size fractionation by gel filtration. The nucleophosmin in the high molecular weight fraction was expected to exist as an aggregate and the interaction was weak, but the low molecular weight fraction was expected to have a monomeric structure. The interaction with TC11 was relatively strong.

以上の結果から、ヌクレオフォスミンは薬剤TC11と結合する標的タンパク質であることがわかった。   From the above results, it was found that nucleophosmin is a target protein that binds to the drug TC11.

６．チューブリンの活性評価
複数個得られたクローンのうちα-チューブリンは3ラウンドでは23クローン中１クローン（4%）、4ラウンドでは11クローン中1クローン（9%）、トータルでは34クローン中2クローン（6%）含まれていた。この結果から、α-チューブリンは薬剤TC11の結合タンパク質の候補であることが明らかになった。6). Tubulin activity evaluation Among the clones obtained, α-tubulin was 1 out of 23 clones (4%) in 3 rounds, 1 out of 11 clones (9%) in 4 rounds, and 2 out of 34 clones in total. Clones (6%) were included. From this result, it was revealed that α-tubulin is a candidate for the protein TC11 binding protein.

（６−１）KMS-L31-36とチューブリンのアミノ酸配列
選択実験で得られたKMS-L31-36はα-チューブリンの全長451アミノ酸残基のうちアミノ末端を含めた1-163アミノ酸であった。図１１にα-チューブリンのドメイン構造を示す。TC11をベイトにしてスクリーニングされたα-チューブリンの領域内(1-163)には、GTP-binding domain(GTP結合ドメイン)が含まれており、TC11はGTPと競合することにより、α-チューブリンとβ-チューブリンの重合を阻害している可能性が高い。この仮説は、TC11存在下で骨髄腫細胞内のチューブリンが断片化する現象と一致する。(6-1) Amino acid sequence of KMS-L31-36 and tubulin KMS-L31-36 obtained in the selection experiment is 1-163 amino acids including the amino terminus of the total 451 amino acid residues of α-tubulin. there were. FIG. 11 shows the domain structure of α-tubulin. The α-tubulin region (1-163) screened using TC11 as a bait contains a GTP-binding domain, and TC11 competes with GTP to produce α-tube. It is likely that the polymerization of phosphorus and β-tubulin is inhibited. This hypothesis is consistent with the phenomenon of tubulin fragmentation in myeloma cells in the presence of TC11.

（６−２）プルダウン実験による競合実験
（６−２−１）小麦胚芽無細胞翻訳蛋白質の調製
クローニングで得られたクローンKMS-L31-36 DNA 0.01pmol、10×KOD plus緩衝液(TOYOBO) 10μl、2 mM dNTPs(TOYOBO) 10μl、25mM MgSO4 4μl、forwardプライマー：GSP6omega F (10 pmol/μl) 3μl、reverseプライマー：3RV30 (10 pmol/μl) 3μl、KOD plus ポリメラーゼ(TOYOBO) 2μlにRNase-Free水を添加し全体量を100μlとして1チューブに入れ合計２チューブをPCR反応させた。PCRは94℃、5分間反応後94℃、30秒間、58℃30秒間、68℃1分20秒間を24サイクル行った後68℃5分間反応を行った。cDNAライブラリーはWizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega）で精製し30μlのDNA溶液として回収した。(6-2) Competition experiment by pull-down experiment (6-2-1) Preparation of wheat germ cell-free translation protein Clone KMS-L31-36 DNA obtained by cloning 0.01 pmol, 10 × KOD plus buffer (TOYOBO) 10 μl , 2 mM dNTPs (TOYOBO) 10 μl, 25 mM MgSO 4 4 μl, forward primer: GSP6omega F (10 pmol / μl) 3 μl, reverse primer: 3RV30 (10 pmol / μl) 3 μl, KOD plus polymerase (TOYOBO) 2 μl RNase-Free Water was added to make a total volume of 100 μl in one tube, and a total of 2 tubes were subjected to PCR reaction. PCR was conducted at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 24 cycles of 94 ° C., 30 seconds, 58 ° C. 30 seconds, 68 ° C. 1 minute 20 seconds, and then reacted at 68 ° C. for 5 minutes. The cDNA library was purified by Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega) and recovered as a 30 μl DNA solution.

上記のクローンDNA 2pmol、5×SP6緩衝液 4μl、ATP (100mM) 1μl、CTP (100mM) 1μl、UTP (100mM) 1μl、GTP (100mM) 1μl、エンザイムミックスSP6RNA ポリメラーゼ（Promega） 0.25μl、RNase inhibitor(TOYOBO) 2μlにRNase-Free水を添加し全体量を20μlとして、37℃、3時間反応後、RQ1 RNase-Free DNase（Promega） 5μlを添加しさらに37℃、1時間反応させた。RNAはRNeasy Mini kit (Qiagen)により精製し30μlのRNA溶液として回収した。   2 pmol of the above clone DNA, 4 μl of 5 × SP6 buffer, ATP (100 mM) 1 μl, CTP (100 mM) 1 μl, UTP (100 mM) 1 μl, GTP (100 mM) 1 μl, enzyme mix SP6 RNA polymerase (Promega) 0.25 μl, RNase inhibitor ( TOYOBO) 2 μl of RNase-Free water was added to make a total volume of 20 μl. After reaction at 37 ° C. for 3 hours, 5 μl of RQ1 RNase-Free DNase (Promega) was added and further reacted at 37 ° C. for 1 hour. RNA was purified by RNeasy Mini kit (Qiagen) and recovered as a 30 μl RNA solution.

上記で得られたクローンRNA 12.5 pmol、小麦胚芽抽出液（ZoeGene）25μl、クレアチンキナーゼ (40 μg/μl)（ZoeGene）2.5μl、RNase inhibitor(ZoeGene) 2μl、5×翻訳緩衝液(ZoeGene) 25μlにRNase-Free水を添加し全体量を 125μlとし、遮光条件下26℃、1時間反応させ翻訳を行い蛋白質を調製した。   Clone RNA 12.5 pmol obtained above, wheat germ extract (ZoeGene) 25 μl, creatine kinase (40 μg / μl) (ZoeGene) 2.5 μl, RNase inhibitor (ZoeGene) 2 μl, 5 × translation buffer (ZoeGene) 25 μl RNase-free water was added to make a total volume of 125 μl, and the mixture was reacted for 1 hour at 26 ° C. under light-shielded conditions to prepare a protein.

（６−２−２）プルダウン実験による競合実験
小麦胚芽無細胞翻訳した蛋白質20μl, ELISA BSA緩衝液(ナカライテスク株式会社 TBS, 0.05%, Tween 20, 1% BSA) 140μlを薬剤結合のレジン40μlあるいは薬剤非結合のレジン40μl分を結合させた。さらに競合実験ではTC11をそれぞれ100μMの濃度で加えた。室温で60分間ミニディスクローター（Bio craft）で回転攪拌した後, ELISA BSA緩衝液500μlで3回洗浄した。レジンはサンプル緩衝液LDS(4x), 0.2mM DTT を加え70℃、10分間加熱後レジンと共にSDS-PAGEに供した。SDS-PAGEは4-12% Bis-Tris NuPAGE ゲル、MES電気泳動緩衝液 (Invitrogen)で200V, 400mA, 35分間電気泳動後、iBlot dry blotting systemでニトロセルロース膜に転写した。膜はBlocking One Buffer： TBST（1：9）でブロッキング後、HRP-conjugated マウス anti-Flag・tag 抗体(Sigma; 2:3000/ Blocking One Buffer： TBST(1：9))を用いて検出はECLで行った。(6-2-2) Competition experiment by pull-down experiment 20 μl of wheat germ cell-free translated protein, ELISA BSA buffer (Nacalai Tesque TBS, 0.05%, Tween 20, 1% BSA) 140 μl of drug-binding resin 40 μl or 40 μl of non-drug-bound resin was bound. Furthermore, in competition experiments, TC11 was added at a concentration of 100 μM. After rotating and stirring with a minidisc rotor (Biocraft) for 60 minutes at room temperature, the plate was washed 3 times with 500 μl of ELISA BSA buffer. The resin was added to the sample buffer LDS (4x), 0.2 mM DTT, heated at 70 ° C. for 10 minutes, and then subjected to SDS-PAGE together with the resin. SDS-PAGE was performed with a 4-12% Bis-Tris NuPAGE gel and MES electrophoresis buffer (Invitrogen) at 200 V, 400 mA for 35 minutes, and then transferred to a nitrocellulose membrane with an iBlot dry blotting system. Membrane blocked with Blocking One Buffer: TBST (1: 9), then detected using ERP using HRP-conjugated mouse anti-Flag • tag antibody (Sigma; 2: 3000 / Blocking One Buffer: TBST (1: 9)) I went there.

図１２にKMS-L31-36 (チューブリン)の競合実験の結果を示す。KMS-L31-36 (α-チューブリン)はTC11が結合したレジンに対してコントロール(control)よりも優位に蛋白質のバンドが観察された。また競合薬剤が100μMの濃度存在下では優位にレジンへの結合を阻害していた。従ってTC11とKMS-L31-36 (α-チューブリン)の特異的な相互作用が確認できた。   FIG. 12 shows the results of a competition experiment with KMS-L31-36 (tubulin). KMS-L31-36 (α-tubulin) showed a protein band superior to the control with respect to the resin to which TC11 was bound. In addition, in the presence of a concentration of 100 μM, the competitive drug inhibited binding to the resin predominantly. Therefore, a specific interaction between TC11 and KMS-L31-36 (α-tubulin) was confirmed.

［実施例３］
TC11によるカスパーゼ依存的アポトーシスの誘導
前述したようにヒト骨髄腫瘍細胞のKMS-34をTC11で処理することにより、細胞の微小管や中心体を形成しているタンパク質であるチューブリンやゴルジ体の断片化が観察された。また、KMS-34細胞をTC11で長時間処理することによりPARPやDNAが切断されたことから、TC11がこれらの癌細胞のアポトーシスを誘導することがわかった。さらに、このアポトーシスが、どのカスパーゼ経路によるものかを、各種カスパーゼ抗体を用いたウェスタンブロットにより調べた。[Example 3]
Induction of caspase-dependent apoptosis by TC11 As mentioned above, treatment of human bone marrow tumor cell KMS-34 with TC11 gives fragments of tubulin and Golgi, which are proteins that form microtubules and centrosomes of cells. Observed. In addition, PRP and DNA were cleaved by treating KMS-34 cells with TC11 for a long time, indicating that TC11 induces apoptosis of these cancer cells. Furthermore, which caspase pathway this apoptosis is caused by was examined by Western blot using various caspase antibodies.

実施方法
KMS34細胞をTC11無添加(コントロールとしてDMSO添加)および5μMと25μMの濃度の TC11でそれぞれ6時間処理後、細胞可溶化液をSDS-PAGEで分離し、それぞれのカスパーゼ特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、カスパーゼ2，3，8および9の全長および切断後の断片を検出した。Implementation method
KMS34 cells were treated without TC11 (DMSO added as a control) and treated with TC11 at concentrations of 5 μM and 25 μM for 6 hours, respectively, and cell lysates were separated by SDS-PAGE and Westernized using each caspase-specific antibody. By blotting, the full length of caspases 2, 3, 8 and 9 and fragments after cleavage were detected.

ウェスタンブロッティング
薬剤TC11でKMS34細胞を6時間処理後、細胞を回収し、サンプルバッファーで懸濁した。これを15% SDS-PAGEにより分離後、ウェスタンブロッティングを行った。一次抗体として、抗PARP、Caspase-2、-3、-8、-9抗体 (全てCell signaling technology社製)、二次抗体としてHRP標識された抗体を用い、ECL chemi-luminescence reagents (GE healthcare) により検出した。Western blotting After treating KMS34 cells with drug TC11 for 6 hours, the cells were collected and suspended in sample buffer. This was separated by 15% SDS-PAGE, followed by Western blotting. Anti-PARP, Caspase-2, -3, -8, -9 antibodies (all manufactured by Cell signaling technology) as primary antibodies, HRP-labeled antibodies as secondary antibodies, ECL chemi-luminescence reagents (GE healthcare) Detected by.

結果
図１３に示す(AおよびB) 。
その結果、エフェクターカスパーゼであるカスパーゼ3、その上流のイニシエーターカスパーゼとして働くカスパーゼ8、および9が切断され、活性型になっていることが確認できた(図１３，A)。カスパーゼ8は細胞死受容体を介したシグナル経路に、またカスパーゼ9はミトコンドリアを介した経路により、それぞれ活性化されることが知られている(Spek,E., Bloem,A.C., Lokhorst,H.M., Kessel,B., Bogers-Boer,L., Donk,N. Inhibition of the mevalonate pathway potentiates the effects of lenalidomide in myeloma. Leukemia Res., 33, 100-108 (2009))。また，両者のクロストークの存在についても示唆されている(Haefen,C., Wieder,T., Essmann,F., Schulze-Osthoff,K., Dorken,B., Daniel,P.T. Paclitaxel-induced apoptosis in BJAB cells proceeds via a death receptor-independent, caspase-3/-8-driven mitochondrial amplicication loop. Oncogene, 22, 2236-2247 (2003))。Results Shown in FIG. 13 (A and B).
As a result, it was confirmed that caspase 3, which is an effector caspase, and caspases 8 and 9 that act as initiator caspases upstream thereof were cleaved and activated (FIG. 13, A). It is known that caspase-8 is activated by a signal pathway via death receptor and caspase-9 by a pathway via mitochondrion (Spek, E., Bloem, AC, Lokhorst, HM, Kessel, B., Bogers-Boer, L., Donk, N. Inhibition of the mevalonate pathway potentiates the effects of lenalidomide in myeloma. Leukemia Res., 33, 100-108 (2009)). The existence of crosstalk between the two has also been suggested (Haefen, C., Wieder, T., Essmann, F., Schulze-Osthoff, K., Dorken, B., Daniel, PT Paclitaxel-induced apoptosis in BJAB cells proceeds via a death receptor-independent, caspase-3 / -8-driven mitochondrial amplicication loop. Oncogene, 22, 2236-2247 (2003)).

細胞骨格が破壊されることにより活性化されるカスパーゼ2は、その基質であるBidを活性化することによりカスパーゼ9経路依存的アポトーシスを誘導することが報告されている(Ho,L.H., Read,S.H., Dorstyn,L., Lambrusco,L., Kumar,S. Caspase-2 is required for cell death induced by cytoskeletal disruption. Oncogene, 27, 3393-3404 (2008))。そこで、TC11がカスパーゼ2の活性に影響を与えるかどうかを調べたが、カスパーゼ2の活性化は見られなかった (図１３，B) 。   Caspase-2, which is activated by disruption of the cytoskeleton, has been reported to induce caspase-9 pathway-dependent apoptosis by activating its substrate Bid (Ho, LH, Read, SH , Dorstyn, L., Lambrusco, L., Kumar, S. Caspase-2 is required for cell death induced by cytoskeletal disruption. Oncogene, 27, 3393-3404 (2008)). Thus, it was examined whether TC11 affects caspase 2 activity, but caspase 2 activation was not observed (FIG. 13, B).

［実施例４］
TC11の造血障害作用の検証のためのコロニーアッセイ
造血障害に対する安全性を調べる目的で、正常の骨髄細胞のコロニー形成能を調べるコロニーアッセイ法を用いて、TC11の毒性試験を行った。[Example 4]
Colony assay for verification of hematopoietic disorder effect of TC11 For the purpose of investigating the safety against hematopoietic disorder, the toxicity test of TC11 was performed using a colony assay method for examining colony-forming ability of normal bone marrow cells.

ICRマウス(♂, 13週齢) の大腿骨より26ゲージ針を用いてフラッシュすることにより骨髄細胞を採取し、2×alpha MEM, 10% FCS培養液中に5×105 cell/mLになるように調整した。methyl cellulose培地(10% 2×alpha MEM, 30% FCS, 1% BSA, 0.1 mM 2ME, 0.1 mM hemine, 1% P/S, 1% L-Glu, 1.2% methyl cellulose含有) にサイトカイン(最終濃度IL-3 20 ng / mL, IL-6 10 ng / mL, SCF 20 ng / mL, EPO 1U ng / mL )および各種濃度のTC11あるいはドキソルビシン塩酸塩を加えたものに、上述の骨髄細胞を5×104 cell / mLになるように添加した。TC11は20 mM DMSOストックソリューションを5% DMSO EtOHで希釈して1 mM, 0.2 mM, 0.04 mMを作成し、それぞれmethyl cellulose 培地1mLあたりに0.025 mLずつ添加して最終濃度25μM, 5μM, 1μMになるように調整した。また、TC11を含まない検体にもDMSO, EtOHの濃度がそれぞれ0.125%, 2.5%になるように調整した。なお、CTRL (-)はDMSOとEtOHを含まない。これらを3.5 cmディッシュ1枚あたり1 mLに分注して、37℃、5% CO2中で2週間培養し、各種コロニー数を光学顕微鏡下でカウントした(Kamata T, Hattori Y, Hamada H, Kizaki M, Terada M, Ikeda Y. Keratinocyte growth factor regulates proliferation and differentiation of hematopoietic cells expressing the receptor gene K-sam. Experimental Hematology 30;297-305 (2002))。いずれのディッシュもquadruplicateとしてその平均を算出した（図１４）。Bone marrow cells are collected from the femur of an ICR mouse (♂, 13 weeks old) using a 26 gauge needle, and become 5 × 10 5 cells / mL in 2 × alpha MEM, 10% FCS medium. Adjusted as follows. Cytokine (final concentration) in methyl cellulose medium (containing 10% 2 × alpha MEM, 30% FCS, 1% BSA, 0.1 mM 2ME, 0.1 mM hemine, 1% P / S, 1% L-Glu, 1.2% methyl cellulose) IL-3 20 ng / mL, IL-6 10 ng / mL, SCF 20 ng / mL, EPO 1U ng / mL) and various concentrations of TC11 or doxorubicin hydrochloride were added to the above bone marrow cells 5 × 10 4 cells / mL were added. TC11 is prepared by diluting 20 mM DMSO stock solution with 5% DMSO EtOH to make 1 mM, 0.2 mM, and 0.04 mM, and adding 0.025 mL to 1 mL of methyl cellulose medium, respectively, to a final concentration of 25 μM, 5 μM, and 1 μM. Adjusted as follows. In addition, the concentration of DMSO and EtOH was adjusted to 0.125% and 2.5% for specimens not containing TC11, respectively. Note that CTRL (-) does not include DMSO and EtOH. These were dispensed into 1 mL per 3.5 cm dish, cultured at 37 ° C in 5% CO 2 for 2 weeks, and the number of various colonies was counted under an optical microscope (Kamata T, Hattori Y, Hamada H, Kizaki M, Terada M, Ikeda Y. Keratinocyte growth factor regulates proliferation and differentiation of hematopoietic cells expressing the receptor gene K-sam. Experimental Hematology 30; 297-305 (2002)). The average of each dish was calculated as quadruplicate (FIG. 14).

図１４からわかるように、代表的な抗癌剤であるドキソルビシン(DOX)では、1μMでもコロニー形成が完全に抑制されたが、TC11では、5μMでもDMSO無添加あるいは添加のコントロール(CTR)に比べてもコロニー形成に明らかな障害を来さず、既存の抗癌剤よりも骨髄抑制は低いと考えられる。従って、TC11のIC50が数μMであったことを考慮すると。治療域濃度でも造血障害に対する安全性が比較的高いと判断される。   As can be seen from FIG. 14, colony formation was completely suppressed even with 1 μM with doxorubicin (DOX), which is a typical anticancer agent, but with TC11, DMSO was not added or added compared to the control (CTR) with or without DMSO added. Myelosuppression is thought to be lower than existing anti-cancer drugs without any apparent obstacle to colony formation. Therefore, considering that the IC50 of TC11 was several μM. It is judged that the safety against hematopoietic disorders is relatively high even at therapeutic concentrations.

［実施例５］
TC11のマウス腹腔内投与後の血中濃度変化
一般的には、薬は少量では効きめは弱く、増量していくとその効きめは強くなると同時に、副作用も発現し、さらに増量すると死に至るというコースをたどる性質をもっている。したがって、薬の効果を最大限に発揮させて、かつ副作用の発現を最小限におさえて使うためには、どの位の量が適切であるかを決めなければならない。人によって同じ量の薬を服用しても同じ血中濃度は得られない。同じ量の薬を服用しても得られる薬物血中濃度は5倍もちがいが生じると言われている。薬によっては30倍もちがいがあるものもある。薬物を投与する場合、投与中の血中濃度が有効域に維持されるようにすれば、薬を安全にかつ有効に使えるということになる。すなわち、いくら投与量が多くても薬物血中濃度がその人の有効域以下では薬効は発揮されず、いくら投与量が少なくても中毒域に入っていれば副作用の発現がみられるということになってしまう。こうしたことから、血中濃度を測定しながら薬物療法を行うことの有効性が認識され、実際に使用されている。「投与量よりも薬物血中濃度の方が大切だ」と言われるのは、こういう理由があるからなのである。ここでは、TC11の薬物動態を調べる目的で、低用量と高用量のTC11をマウスの腹腔内に注射して、その血中濃度の時間変化を測定してみた。[Example 5]
Changes in blood concentration after intraperitoneal administration of TC11 to mice In general, the course is such that drugs are less effective at small doses, the effect is stronger when doses are increased, and at the same time, side effects occur, and death occurs when doses are further increased. It has a nature to follow. Therefore, it is necessary to decide how much is appropriate in order to maximize the effect of the drug and minimize the occurrence of side effects. Even if people take the same amount of medicine, the same blood concentration cannot be obtained. It is said that the drug blood concentration obtained by taking the same amount of drug will be 5 times different. Some drugs are 30 times different. When a drug is administered, if the blood concentration during administration is maintained within the effective range, the drug can be used safely and effectively. In other words, no matter how much the dose is, the drug blood concentration is below the effective range of the person, and the drug effect is not exerted. turn into. For these reasons, the effectiveness of performing drug therapy while measuring blood concentration is recognized and used in practice. This is why it is said that the drug blood concentration is more important than the dose. Here, for the purpose of examining the pharmacokinetics of TC11, low and high doses of TC11 were injected into the abdominal cavity of mice, and the change in blood concentration over time was measured.

実施方法
採血方法
10週齢のオスのlcr/scidマウスにTC11 2.5 mg/mL(低用量)または12.5 mg/mL(高用量)を240 μLを腹腔内注射した。0、1.5、4、8時間後、エーテル麻酔により失神させた。1 mLシリンジ中に最終濃度4.2 mmol/LとなるようにEDTAを加え、21G針を用いてマウスの心臓採血を行った。採血後、2500 rpm、15 min、4℃で遠心分離し、上清（血漿）を回収し、測定まで-30℃で保存した。Method of blood collection
Ten week old male lcr / scid mice were injected intraperitoneally with 240 μL of TC11 2.5 mg / mL (low dose) or 12.5 mg / mL (high dose). After 0, 1.5, 4, and 8 hours, the animals were fainted by ether anesthesia. EDTA was added in a 1 mL syringe to a final concentration of 4.2 mmol / L, and mice were blood collected using a 21G needle. After blood collection, the mixture was centrifuged at 2500 rpm, 15 min, 4 ° C., and the supernatant (plasma) was collected and stored at −30 ° C. until measurement.

移動相調製
HPLC移動相用の25 mM酢酸アンモニウム溶液は、酢酸アンモニウムを1.9261 g秤量し、蒸留水で溶解し、メスフラスコで1 Lにメスアップした。移動相は25 mM酢酸アンモニウムとアセトニトリルを以下の比率で混合し、0.45μmメンブランフィルターで減圧ろ過し、超音波脱気して用いた。
＊HPLC移動相：CH3CN / 25 mM AcONH4=60 / 40Mobile phase preparation
In the 25 mM ammonium acetate solution for the HPLC mobile phase, 1.9261 g of ammonium acetate was weighed, dissolved in distilled water, and made up to 1 L in a volumetric flask. As the mobile phase, 25 mM ammonium acetate and acetonitrile were mixed at the following ratio, filtered under reduced pressure with a 0.45 μm membrane filter, and ultrasonically degassed.
* HPLC mobile phase: CH 3 CN / 25 mM AcONH 4 = 60/40

試料調製
検量線作成用TC11溶液の作成は、TC11 5.8 mg秤量し、エタノール5.8 mLで溶解し、1000μg/mLとした（冷所保存）。また、コンセーラ(登録商標)（日水製薬）に蒸留水15 mLを加え、30分間静置した。TC11溶液をエタノールで希釈し、さらにコンセーラで10倍希釈し（0、0.5、1.5、2.5、3.5、5μg/mL）、検量線作成用の標準血清とした。凍結保存していたマウス血漿は測定時に溶解し、エタノールを最終濃度10%となるように加えた。Sample preparation To prepare a TC11 solution for preparing a calibration curve, 5.8 mg of TC11 was weighed and dissolved in 5.8 mL of ethanol to 1000 μg / mL (stored in a cold place). In addition, 15 mL of distilled water was added to Consera (registered trademark) (Nissui Pharmaceutical) and left to stand for 30 minutes. The TC11 solution was diluted with ethanol and further diluted 10-fold with a consera (0, 0.5, 1.5, 2.5, 3.5, 5 μg / mL), and used as a standard serum for preparing a calibration curve. Mouse plasma that had been cryopreserved was dissolved at the time of measurement, and ethanol was added to a final concentration of 10%.

試料の前処理
C18タイプの固相抽出カートリッジSepPak(登録商標)（Waters）をメタノール500μL、蒸留水500 μLでコンディショニングし、測定試料200μLをロードし、蒸留水500μL、40% CH3CN 500μLで洗浄後、100% CH3CN 1 mLで溶出した。溶出液をエバポレーターにより減圧下溶媒留去し、HPLC用移動相1mLに再溶解し、20400g、10min、25℃で遠心分離した。Sample pretreatment
C18 type solid phase extraction cartridge SepPak (registered trademark) (Waters) is conditioned with 500 μL of methanol and 500 μL of distilled water, loaded with 200 μL of measurement sample, washed with 500 μL of distilled water and 500 μL of 40% CH 3 CN, and then 100% Elute with 1 mL of CH 3 CN. The eluate was evaporated under reduced pressure using an evaporator, redissolved in 1 mL of a mobile phase for HPLC, and centrifuged at 20400 g, 10 min, 25 ° C.

機器及び測定条件
HPLCシステムはJASCOのポンプPU-980、オートサンプラーAS-950、カラムオーブンCO-2060Plus、UV検出器UV-970、蛍光検出器FP-1520Sを用いた。また、データ処理装置には同社のChromNAVを使用した。Equipment and measurement conditions
The HPLC system used was JASCO pump PU-980, autosampler AS-950, column oven CO-2060Plus, UV detector UV-970, and fluorescence detector FP-1520S. The company's ChromNAV was used as the data processor.

HPLC測定条件は、C18カラム：L-Column2、3.0 i.d.×100 mm、3μm、移動相：CH3CN / 25 mM AcONH4=60 / 40、流速：0.30 mL/min、検出波長：UV 255 nm、蛍光励起波長380 nm、蛍光波長530 nm、注入量 10μL、カラム温度：25℃にて行った。
TC11の検量線（TC11の濃度μg/mLとHPLCのピークの高さの関係）を図１５に示す。HPLC measurement conditions are: C18 column: L-Column2, 3.0 id × 100 mm, 3 μm, mobile phase: CH 3 CN / 25 mM AcONH 4 = 60/40, flow rate: 0.30 mL / min, detection wavelength: UV 255 nm, The fluorescence excitation wavelength was 380 nm, the fluorescence wavelength was 530 nm, the injection amount was 10 μL, and the column temperature was 25 ° C.
A calibration curve of TC11 (relationship between TC11 concentration μg / mL and HPLC peak height) is shown in FIG.

結果
マウスの腹腔内にTC11を低用量投与した場合と高用量投与した場合の血中濃度（μMに換算）を比較した結果を図１６に示す。低用量投与は、TC11の2.5mg/mL溶液を240μL投与、すなわち20mg/マウスkgで、高用量投与は、TC11の12.5mg/mL溶液を240μL投与、すなわち100mg/マウスkg）である。その結果、低用量投与では投与1.5時間後でTC11の血中濃度は7μMに達し、4時間後にはほとんど消失してしまった。一方、高用量投与では投与2時間後にTC11の血中濃度は33μMに達していると推定され、4時間後には4μMにまで減少し、9時間後にはほとんど消失してしまった。TC11の骨髄腫瘍細胞KMS-34に対するIC50値は3.5μMであるので、低用量投与でも投与後２時間程度まではIC50値以上の有効な血中濃度が保持されていた。また、低用量投与の５倍量の高用量投与では、投与後４時間程度まではIC50値以上の有効な血中濃度が保持されていた。以上の結果から、TC11の血中動態はかなり良好であり、この結果は骨髄腫瘍細胞KMS34の坦癌マウスを用いたTC11の抗腫瘍効果でも有意な効果が認められたことからも支持される。Results FIG. 16 shows the results of comparing the blood concentration (converted to μM) between the case where TC11 was administered at a low dose and the case where a high dose was administered into the abdominal cavity of a mouse. Low dose administration is 240 μL of a 2.5 mg / mL solution of TC11, ie 20 mg / mouse kg, and high dose administration is 240 μL of a 12.5 mg / mL solution of TC11, ie 100 mg / mouse kg). As a result, at low doses, the blood concentration of TC11 reached 7 μM 1.5 hours after administration, and almost disappeared after 4 hours. On the other hand, in the high dose administration, the blood concentration of TC11 was estimated to reach 33 μM 2 hours after administration, decreased to 4 μM after 4 hours, and almost disappeared after 9 hours. Since the IC50 value of TC11 for bone marrow tumor cell KMS-34 is 3.5 μM, an effective blood concentration equal to or higher than the IC50 value was maintained up to about 2 hours after administration even at a low dose. Further, in the high dose administration of 5 times the low dose administration, an effective blood concentration of IC50 value or more was maintained until about 4 hours after administration. From the above results, the blood kinetics of TC11 is quite good, and this result is supported by the fact that the antitumor effect of TC11 using a bone marrow tumor cell KMS34 cancer-bearing mouse was also found to be significant.

［実施例６］
FISH法による骨髄腫細胞のp53遺伝子の欠損と変異の検出
p53がん抑制遺伝子は393アミノ酸からなる核内タンパク質p53をコードする。p53の主な分子機能は転写活性因子であり、DNA傷害などの各種細胞ストレスやがん遺伝子シグナルなどによりリン酸化、アセチル化などの翻訳後修飾により活性化された後、複数の下流遺伝子の転写調節領域内に存在する特異的塩基配列［(5′-PuPuPuC(A/T)(T/A)GPyPyPy-3′)］×2に結合し転写を活性化する。p53は、塩基配列特異的DNA結合に重要なp53タンパク質の中心部第100-300残基を占めるコア・ドメイン (DNA結合ドメイン)、そのN末端側とC末端側にはそれぞれ転写活性化ドメイン、4量体形成ドメインのほか、リン酸化やアセチル化残基や多くのタンパク質結合部位があり、p53の機能調節に重要な部位と考えられている。これまでに多くのヒトがんにおいてp53変異が報告され、腫瘍の種類によるがヒトがん全体の約50% にp53変異があることがわかっている(Hussain SP, Harris CC. Molecular epidemiology of human cancer:contribution of mutation spectra studies of tumor suppressor genes. Cancer Res 58 : 4023-4037 (1998); Beroud C, Soussi T. The UMD-p53 database:new mutations and analysis tools. Hum Mutat 21 : 176-181 (2003))。[Example 6]
Detection of p53 gene deletion and mutation in myeloma cells by FISH method
The p53 tumor suppressor gene encodes the nuclear protein p53 consisting of 393 amino acids. The main molecular function of p53 is a transcriptional activator, which is activated by post-translational modifications such as phosphorylation and acetylation due to various cellular stresses such as DNA damage and oncogene signals, and then transcription of multiple downstream genes. It binds to a specific base sequence [(5′-PuPuPuC (A / T) (T / A) GPyPyPy-3 ′)] × 2 existing in the regulatory region to activate transcription. p53 is a core domain (DNA binding domain) that occupies residues 100-300 of the central part of p53 protein important for base sequence-specific DNA binding, its transcriptional activation domain on the N-terminal side and C-terminal side, In addition to the tetramerization domain, there are phosphorylation and acetylation residues and many protein binding sites, which are considered to be important sites for p53 function regulation. To date, p53 mutations have been reported in many human cancers, and it is known that about 50% of all human cancers have p53 mutations depending on the type of tumor (Hussain SP, Harris CC. Molecular epidemiology of human cancer : contribution of mutation spectra studies of tumor suppressor genes.Cancer Res 58: 4023-4037 (1998); Beroud C, Soussi T. The UMD-p53 database: new mutations and analysis tools.Hum Mutat 21: 176-181 (2003) ).

近年造血器腫瘍のうち悪性リンパ腫や白血病の多くの症例が治癒に至るのに対し、多発性骨髄腫は、造血幹細胞移植法を導入してもいまだに致死性の予後不良疾患である。サリドマイド誘導体・ボルテゾミブといった新規薬剤が登場し予後が改善しつつあるが、それでも治療への反応性が悪く救命し得ない症例は多く、かつ医療の現場ではこれら新規薬剤および自家・同種移植の適応をどのように決定すべきかについて専門医ですら混乱しているのが現状である。欧米では数多くの臨床試験が行われているものの、決定的な治療指針に至るのには困難であり、ここは原点に戻って骨髄腫の分子基盤にもとずいて治療方針を決定しするのが重要であり、さらに現存の治療法では乗り越えることのできない分子(遺伝子)異常を有する症例には新たな治療薬を開発してゆく必要がある。例えば、化学療法や自家造血幹細胞移植では予後不良とされてきた第13番染色体欠失やt(4;14)染色体転座を有する症例に対して、ボルテゾミブやレナリドミドはその生存期間を延長すると報告され早期からこれらを用いるべきであろう。しかし、ハイリスク骨髄腫のうち10〜20%を占める第17番染色体欠失を有する症例は、初診時より髄外形質細胞種を形成するなどハイリスク骨髄腫としての臨床像を示し、これら新規薬剤を用いても半年以内に再発を来たし、予後は極めて不良である(Dawson MA, et al. Clin Cancer Res 15:714-722 (2009); Reece DE, et al. Blood 112;607a, #1724 (2008); Dimopoulos MA, et al. Blood 112;608a, #1726 (2008); Nizar J Bahlis NJ, et al. Blood 112;609a,#1731 (2008.))。   In recent years, many cases of malignant lymphoma and leukemia have been cured among hematopoietic tumors, whereas multiple myeloma is still a fatal poor prognosis disease even if hematopoietic stem cell transplantation is introduced. Although new drugs such as thalidomide derivatives and bortezomib have appeared and the prognosis is improving, there are still many cases where the response to treatment is poor and lifesaving is not possible, and in the medical field, these new drugs and autologous / allograft indications Even the specialists are confused about how to decide. Although many clinical trials have been conducted in the US and Europe, it is difficult to reach a definitive treatment guideline. This is where we go back to the origin and decide on a treatment strategy based on the molecular basis of myeloma. In addition, it is necessary to develop new therapeutic agents for cases with molecular (gene) abnormalities that cannot be overcome by existing therapies. For example, bortezomib and lenalidomide have been reported to prolong survival in patients with chromosome 13 deletion and t (4; 14) translocation, which have been considered poor in chemotherapy and autologous hematopoietic stem cell transplantation. They should be used from an early stage. However, cases with chromosome 17 deletion, which accounts for 10-20% of high-risk myeloma, show clinical features as high-risk myeloma, such as forming extramedullary plasma cell types from the first visit. Relapse within half a year even with drugs and prognosis is very poor (Dawson MA, et al. Clin Cancer Res 15: 714-722 (2009); Reece DE, et al. Blood 112; 607a, # 1724 (2008); Dimopoulos MA, et al. Blood 112; 608a, # 1726 (2008); Nizar J Bahlis NJ, et al. Blood 112; 609a, # 1731 (2008.)).

すなわち、第17番染色体上にはp53遺伝子が存在し、その欠失および変異を有する骨髄腫には既存の治療法では太刀打ちできない。そこで、独自に新規薬剤を開発することによって現在の治療の壁となっているp53異常を有する症例の克服を第一の目的として、患者由来の骨髄腫細胞株であるKMS34のp53遺伝子の欠損と変異を調べてみた。   That is, the p53 gene is present on chromosome 17, and myeloma having the deletion and mutation cannot be compared with existing therapies. Therefore, with the primary goal of overcoming cases with p53 abnormalities that have been the barriers to current treatment by developing new drugs, the p53 gene deficiency of KMS34, a patient-derived myeloma cell line, I examined mutations.

FISH法によるp53遺伝子の欠失の検出
FISH法によりp53遺伝子の欠失の検出を行った(Hong Chang, et al. p53 gene deletion detected by fluorescence in situ hybridization is an adverse prognostic factor for patients with multiple myeloma following autologous stem cell transplantation. BLOOD 105; 358-360 (2005))。Detection of p53 gene deletion by FISH method
P53 gene deletion was detected by FISH (Hong Chang, et al. P53 gene deletion detected by fluorescence in situ hybridization is an adverse prognostic factor for patients with multiple myeloma following autologous stem cell transplantation.BLOOD 105; 358- 360 (2005)).

FISHプローブはVYSIS LSI P53(17P13.1) SPECTRUMORANGE PROBE(カタログ番号32-190008)とCEP 17 (D17Z1) SPECTRUMGREEN PROBE(カタログ番号32-132017)をAbbott Japan社（東京）より購入した。p53遺伝子の欠失をFISH法により解析した。SpectrumRedラベルしたp53 DNA probe (LSI p53;Vysis, Downers Grove, IL) は染色体17p13.1に位置しp53 locus特異的である。対照として、Spectrum Greenラベルした染色体17 -satellite-DNA centromere probe(CEP17, Vysis)を用いた。赤緑シグナル比が2R2G(p53/CEP17シグナルが2/2)を正常、1R2G(p53/CEP17シグナルが1/2)、または1R1G(p53/CEP17シグナルが1/1)をp53欠失ありと判断した。いずれの細胞も1000個につきカウントを行った。結果を表１に示す。その結果、KMS34、KMS28、KMS26、KMS11、KMM1は片方のアレルではp53が欠失しており、KMS27とKMS21はp53アレルの欠失がないことがわかった。   As FISH probes, VYSIS LSI P53 (17P13.1) SPECTRUMORANGE PROBE (Catalog No. 32-190008) and CEP 17 (D17Z1) SPECTRUMGREEN PROBE (Catalog No. 32-132017) were purchased from Abbott Japan (Tokyo). The deletion of p53 gene was analyzed by FISH method. The Spectrum Red labeled p53 DNA probe (LSI p53; Vysis, Downers Grove, IL) is located on chromosome 17p13.1 and is p53 locus specific. As a control, a spectrum green labeled chromosome 17-satellite-DNA centromere probe (CEP17, Vysis) was used. Red / green signal ratio of 2R2G (p53 / CEP17 signal is 2/2) is normal, 1R2G (p53 / CEP17 signal is 1/2), or 1R1G (p53 / CEP17 signal is 1/1) is judged to have p53 deletion did. All cells were counted per 1000 cells. The results are shown in Table 1. As a result, it was found that K53, KMS28, KMS26, KMS11, and KMM1 had p53 deletion in one allele, and KMS27 and KMS21 had no p53 allele deletion.

p53遺伝子の変異の検出
KMS34のp53遺伝子のExon4〜9について、genomic DNAを用いてPCR amplify後にPRISMにてsequenceを決定した。PCRに用いたprimerは下記する。いずれの反応も、Denature 95℃ 30sec、anealing 58℃ 30sec、extension 72℃ 1minで35cycle行った。Detection of mutations in the p53 gene
About Exon4-9 of p53 gene of KMS34, sequence was determined by PRISM after PCR amplify using genomic DNA. The primer used for PCR is described below. All the reactions were carried out for 35 cycles at Denature 95 ° C. 30 sec, anealing 58 ° C. 30 sec, extension 72 ° C. 1 min.

Exon4
Sense 5'TCC TCT GAC TGC TCT TTT CAC-3'（配列番号１０）
Antisense 5'-TGA AGT CTC ATG GAA GCC AG-3'' （配列番号１１）Exon4
Sense 5'TCC TCT GAC TGC TCT TTT CAC-3 '(SEQ ID NO: 10)
Antisense 5'-TGA AGT CTC ATG GAA GCC AG-3 '' (SEQ ID NO: 11)

Exon5
Forward 5'- CTT GTG CCC TGA CTT TCA ACT -3' （配列番号１２）
Reverse 5'- CAA CCA GCC CTG TCG TCT -3' （配列番号１３）Exon5
Forward 5'- CTT GTG CCC TGA CTT TCA ACT -3 '(SEQ ID NO: 12)
Reverse 5'-CAA CCA GCC CTG TCG TCT -3 '(SEQ ID NO: 13)

Exon6
Sense 5'-TCT GAT TCC TCA CTG ATT GCT C-3' （配列番号１４）
Antisense 5'-CCA CTG ACA ACC ACC CTT AAC-3' （配列番号１５）Exon6
Sense 5'-TCT GAT TCC TCA CTG ATT GCT C-3 '(SEQ ID NO: 14)
Antisense 5'-CCA CTG ACA ACC ACC CTT AAC-3 '(SEQ ID NO: 15)

Exon7
Forward 5'- TCA TCT TGG GCC TGT GTT ATC -3'（配列番号１６）
Reverse 5'-AGT GTG CAG GGT GGC AAG-3' （配列番号１７）Exon7
Forward 5'-TCA TCT TGG GCC TGT GTT ATC-3 '(SEQ ID NO: 16)
Reverse 5'-AGT GTG CAG GGT GGC AAG-3 '(SEQ ID NO: 17)

Exon8
Sense 5'-AGG ACC TGA TTT CCT TAC TGC C-3' （配列番号１８）
Antisense 5'-ATA ACT GCA CCC TTG GTC TCC-3' （配列番号１９）Exon8
Sense 5'-AGG ACC TGA TTT CCT TAC TGC C-3 '(SEQ ID NO: 18)
Antisense 5'-ATA ACT GCA CCC TTG GTC TCC-3 '(SEQ ID NO: 19)

Exon9
Sense 5'-ACT TTT ATC ACC TTT CCT TGC C-3' （配列番号２０）
Antisense 5'-CAC TTG ATA AGA GGT CCC AAG AC-3' （配列番号２１）Exon9
Sense 5'-ACT TTT ATC ACC TTT CCT TGC C-3 '(SEQ ID NO: 20)
Antisense 5'-CAC TTG ATA AGA GGT CCC AAG AC-3 '(SEQ ID NO: 21)

なお、exon 5および7では、さらに下記の条件でnested PCRをかけて特異性を高めた。
Primer(exon5)
Forward (5'-TGC CCT GAC TTT CAA CTC TG-3') （配列番号２２）
Reverse (5'-GCT GCT CAC CAT CGC TAT C-3') （配列番号２３）
Denature 94℃ 40sec、aneal 56℃ 40sec、denature 72℃ 1minで35cycleIn exon 5 and 7, specificity was further increased by performing nested PCR under the following conditions.
Primer (exon5)
Forward (5'-TGC CCT GAC TTT CAA CTC TG-3 ') (SEQ ID NO: 22)
Reverse (5'-GCT GCT CAC CAT CGC TAT C-3 ') (SEQ ID NO: 23)
Denature 94 ℃ 40sec, aneal 56 ℃ 40sec, denatur 72 ℃ 35min for 1min

Primer(exon7)
Forward（5'-CCT GTG TTA TCT CCT AGG TTG-3') （配列番号２４）
Reverse（5'-AGT GTG CAG GGT GGC AAG-3'）（配列番号２５）
Denature 94℃ 40sec、aneal 58℃ 40sec、denature 72℃ 1minで35cyclePrimer (exon7)
Forward (5'-CCT GTG TTA TCT CCT AGG TTG-3 ') (SEQ ID NO: 24)
Reverse (5'-AGT GTG CAG GGT GGC AAG-3 ') (SEQ ID NO: 25)
Denature 94 ℃ 40sec, aneal 58 ℃ 40sec, denatur 72 ℃ 35min for 1min

ABI PRISM BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kitsを用いて反応を行った後、塩基配列を決定した。
反応条件 denature 96℃10s、anealing 50℃ 5s、extension 60℃ 4min ×25After reaction using ABI PRISM BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kits, the nucleotide sequence was determined.
Reaction conditions denature 96 ℃ 10s, anealing 50 ℃ 5s, extension 60 ℃ 4min × 25

いずれも+strandと-strand両方の反応により塩基配列を確認した。Sequence primerは、exon4、6、8、9はPCR時と同じprimerを用いた。Exon5と7は、nested PCR時のprimerを用いた。   In both cases, the nucleotide sequence was confirmed by both + strand and -strand reactions. For sequence primers, exon 4, 6, 8, and 9 used the same primers as in PCR. Exon 5 and 7 used primers for nested PCR.

以上解析した結果、KMS34のp53遺伝子のExon5に単塩基置換による変異が検出された。すなわち、ゲノム DNA(GenBank accession No U94788)ではp53遺伝子の13116番目の塩基がGからAに変わっていた。cDNAにおいては、p53遺伝子の437番目の塩基がGからAに変わっていた。その結果、146番目のアミノ酸（トリプトファン）が終始コドンに変化するため、p53タンパク質は145番目のアミノ酸（ロイシン）でストップしていた。   As a result of the above analysis, a mutation due to single base substitution was detected in Exon5 of the p53 gene of KMS34. That is, in genomic DNA (GenBank accession No U94788), the 13116th base of the p53 gene was changed from G to A. In cDNA, the 437th base of the p53 gene was changed from G to A. As a result, since the 146th amino acid (tryptophan) was changed to a stop codon, the p53 protein was stopped at the 145th amino acid (leucine).

FISHとPCR-塩基配列の解析結果を総合すると、患者由来の骨髄腫細胞KMS34のゲノムでは、片方のアレルではp53遺伝子が欠失しており、もう片方のアレルではp53遺伝子にナンセンス変異が入っているため、N末端から完全長の約1/3の長さの不完全なp53タンパク質しか合成されないものと推察される。その結果、KMS34細胞のp53遺伝子は、両アレルで欠失とナンセンス変異が見られるため、全く機能していないことが判明した。   When FISH and PCR-base sequence analysis results are combined, the genome of patient-derived myeloma cell KMS34 has the p53 gene deleted in one allele and the p53 gene has a nonsense mutation in the other allele. Therefore, it is presumed that only an incomplete p53 protein having a length of about 1/3 of the full length from the N-terminus is synthesized. As a result, it was found that the p53 gene of KMS34 cells did not function at all because deletion and nonsense mutation were observed in both alleles.

本発明により、日本人の骨髄腫患者由来の各種骨髄腫細胞株に対して強い増殖抑制を示す薬剤が提供される。   The present invention provides a drug that exhibits strong growth inhibition against various myeloma cell lines derived from Japanese myeloma patients.

Claims (7)

下記の化合物から選ばれるサリドマイド誘導体を有効成分とする抗癌剤。
An anticancer agent comprising a thalidomide derivative selected from the following compounds as an active ingredient.
骨髄腫用である請求項１記載の抗癌剤。 The anticancer agent according to claim 1, which is used for myeloma. 化合物がTC11である請求項１又は２の抗癌剤。 The anticancer agent according to claim 1 or 2, wherein the compound is TC11. アポトーシス誘導剤である請求項３記載の抗癌剤。 The anticancer agent according to claim 3, which is an apoptosis inducer. チューブリン断片化誘導剤である請求項３記載の抗癌剤。 The anticancer agent according to claim 3, which is a tubulin fragmentation inducer. カスパーゼ依存的アポトーシスの誘導剤である請求項３記載の抗癌剤。 The anticancer agent according to claim 3, which is an inducer of caspase-dependent apoptosis. 第１７番染色体欠失を有するハイリスク骨髄腫の治療薬である請求項３記載の抗癌剤。 The anticancer agent according to claim 3, which is a therapeutic agent for high-risk myeloma having chromosome 17 deletion.
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