JPWO2009025094A1 - Method for diagnosing mammalian cancer - Google Patents

Abstract

本発明は、哺乳動物の癌の診断方法を提供することを課題とする。使用する抗体の組み合わせを最適化することにより、悪性腫瘍を有する哺乳動物の血中特に血漿中のミッドカイン濃度の測定方法を提供する。【選択図】なしAn object of the present invention is to provide a method for diagnosing mammalian cancer. By optimizing the combination of antibodies used, a method for measuring the concentration of midkine in the blood, particularly plasma, of a mammal having a malignant tumor is provided. [Selection figure] None

Description

本発明は、哺乳動物特にイヌ、ネコの癌の診断方法に関する。
また、本出願は、参照によりここに援用されるところ、日本特許出願番号2007-213271からの優先権を請求する。The present invention relates to a method for diagnosing cancer in mammals, particularly dogs and cats.
In addition, this application, which is incorporated herein by reference, claims priority from Japanese Patent Application No. 2007-213271.

社会構造の発達と変化は、人間社会の構成員としての愛玩動物の重要性が高まっている。近年、愛玩動物の代表例であるイヌ、ネコは、単にペットという存在ではなく、人間の生活の伴侶、すなわち家族の一員として位置付けられるようになっている。   The development and change of the social structure has increased the importance of pets as members of human society. In recent years, dogs and cats, which are representative examples of pet animals, are not merely pets, but are positioned as companions of human life, that is, as members of families.

また、飼い主とイヌ、ネコの関係は極めて親密であり、飼い主はイヌ、ネコの日々の体調を注意深く観察している。しかし、飼い主が、イヌ、ネコの日々の行動から悪性腫瘍の罹患状態を早期に感知、発見に至る場合はほとんどない。特に、イヌ癌の進行は、ヒトの癌と比較して、5〜8倍の早さで進行する。
飼い主が、イヌ、ネコの症状より獣医師に診察させる事例は、殆ど進行癌の場合である。このような場合でも、現在の診断方法は、エックス線等の画像診断による方法以外の有効な方法がない。
よって、イヌ、ネコの悪性腫瘍による死亡例は多い、ネコの全死亡例の32％は悪性腫瘍が原因であり、イヌの全死亡例の47％は悪性腫瘍が原因である。The relationship between the owner and the dog / cat is extremely close, and the owner carefully observes the daily physical condition of the dog / cat. However, there are few cases where the owner senses and discovers a diseased state of a malignant tumor early from the daily behavior of dogs and cats. In particular, progression of canine cancer proceeds 5 to 8 times faster than human cancer.
Most cases where the owner makes a veterinarian examine the symptoms of dogs and cats are advanced cancer. Even in such a case, the current diagnosis method has no effective method other than the image diagnosis method such as X-ray.
Therefore, there are many deaths from malignant tumors in dogs and cats, 32% of all cat deaths are caused by malignant tumors, and 47% of all dog deaths are caused by malignant tumors.

上記状況が愛玩動物の悪性腫瘍の発見を遅らせ、愛玩動物に有効な治療を施すことができず愛玩動物が死に至るので、飼い主は大きな悲しみを有する。   The above situation delays the discovery of malignant tumors in pets, and the pets are killed because the pets cannot be treated effectively, leading to great sadness.

癌の進展ないし拡大の程度は、一般に早期癌、進行癌、末期癌と表現される。このうち早期癌は、基本的には無症状である。特に哺乳動物の日々の行動から早期癌を検出するのは不可能である。したがって、哺乳動物の早期癌を検出するには、好ましくは定期的に癌の診断を行うことが必要である。
このように定期的に癌の診断の行うには、先ずは簡便な操作で、かつ高感度に検出できる系が必要である。The degree of progression or expansion of cancer is generally expressed as early stage cancer, advanced cancer, and end stage cancer. Of these, early cancer is basically asymptomatic. In particular, it is impossible to detect early cancer from the daily behavior of mammals. Therefore, in order to detect early cancer in mammals, it is preferable to regularly diagnose cancer.
Thus, in order to periodically diagnose a cancer, a system that can be detected with a simple operation and high sensitivity is required.

ミッドカイン（以後、"ＭＫ"と称す場合がある）は、1989年に村松喬氏と門松健治氏により発見され、胎生中期（Midgestation Period）に最も強い発現、そしてヘパリン結合性の成長因子であるサイトカイン（Cytokine）である。ミッドカインは、塩基性の低分子量（分子量：13,240）のタンパク質であり、細胞保護作用・成長作用、炎症性細胞の遊走を促進し炎症を促進する作用、アポトーシス（細胞死）を抑制する作用などを持つサイトカインに分類される。成体での発現は限局されるが、発癌、そして炎症、修復の過程で強く発現するという特徴を有している。該特徴により、癌の診断マーカーとして有用であり、ポリクローナル抗ミッドカイン抗体を使用したELISAキットがすでに販売されている（Elegance MIDKINE ELISA, 販売元：Bioclone Lim. Sydney, Australia）。   Midkine (hereinafter sometimes referred to as “MK”) was discovered in 1989 by Kei Muramatsu and Kenji Kadomatsu, and is the strongest expression in the midgestation period and a heparin-binding growth factor. Cytokine. Midkine is a basic low molecular weight (molecular weight: 13,240) protein that protects and grows cells, promotes migration of inflammatory cells to promote inflammation, and suppresses apoptosis (cell death). Are classified as cytokines. Expression in adults is limited, but it is characterized by strong expression during carcinogenesis, inflammation, and repair. Due to this feature, an ELISA kit using a polyclonal anti-midkine antibody is already on the market (Elegance MIDKINE ELISA, distributor: Bioclone Lim. Sydney, Australia).

また、ＭＫ遺伝子をプローブとしたノーザンブロットによる癌の診断法（特許文献１）、抗ＭＫタンパク質抗体を含む癌の診断薬（特許文献２）、早期癌腫瘍マーカー（特許文献３）が提案されている。しかしながら、これらの公開特許には、哺乳動物の癌の診断方法を対象としていない。
したがって、哺乳動物の癌特に早期癌の診断方法の開発が望まれている。
特開平6−113898 特開平6-172218 再公表特許WO01/020333 In addition, a cancer diagnosis method by Northern blotting using the MK gene as a probe (Patent Document 1), a cancer diagnostic agent containing an anti-MK protein antibody (Patent Document 2), and an early cancer tumor marker (Patent Document 3) have been proposed. Yes. However, these published patents do not cover methods for diagnosing mammalian cancer.
Therefore, development of a diagnostic method for mammalian cancer, particularly early cancer, is desired.
JP-A-6-113898 Japanese Patent Laid-Open No. 6-17218 Republished patent WO01 / 020333

本発明らは、上記記載の従来技術の問題を解決すべく、市販のヒト用ポリクローナル抗ミッドカイン抗体を使用したELISAキットを使用して哺乳動物の癌の診断を行った。しかしながら、担癌哺乳動物の検出結果は、正常哺乳動物の検出結果と比較して、有意な差を得ることができなかった。すなわち、癌の診断を行なうことができなかった。
そこで、本発明者らは、新たに哺乳動物の癌の診断方法を提供することを課題とする。In order to solve the above-described problems of the prior art, the present inventors diagnosed mammalian cancer using an ELISA kit using a commercially available polyclonal anti-midkine antibody for humans. However, the detection result of the cancer-bearing mammal could not obtain a significant difference compared to the detection result of the normal mammal. That is, it was not possible to diagnose cancer.
Then, the present inventors make it a subject to provide the diagnostic method of the cancer of a mammal newly.

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、使用する抗体の組み合わせを最適化することにより、悪性腫瘍を有する哺乳動物の血中特に血漿中のミッドカイン濃度の測定方法を提供する。   As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have determined the midkine concentration in the blood of mammals having malignant tumors, particularly in plasma, by optimizing the combination of antibodies used. Provide a method.

つまり、本発明は、以下の通りである。
「１．以下の工程及び抗体の組み合わせを含む哺乳動物の癌の診断方法：
（１）哺乳動物由来の生体試料を、固相に結合させた１次抗体と反応させる工程；
（２）さらに標識化２次抗体を該生体試料と反応させる工程；
（３）該固相に捕捉された標識量を測定する工程；
および、上記１次抗体と上記２次抗体の組み合わせが以下である、
（a）１次抗体がIP9又はその断片、２次抗体がIP10又はその断片；
（b）１次抗体がIP10又はその断片、２次抗体がIP9又はその断片；
（c）１次抗体がSC2又はその断片、２次抗体がSC4又はその断片；
（d）１次抗体がSC4又はその断片、２次抗体がSC2又はその断片；
ことを特徴とする哺乳動物の癌の診断方法。
２．上記標識量と予め設定しておいたcut off値と比較して、該標識量が該cut off値を超えた場合には、画像診断により癌の病巣部位を検査することを特徴とする前項１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
３．上記標識量と予め設定しておいた基準値と比較して、癌の進行度合いを判定することを特徴とする前項２に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
４．上記標識量と予め設定しておいた基準値と比較して、癌治療による回復度合いを判定することを特徴とする前項１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
５．上記生体試料が、血漿であることを特徴とする前項１〜４のいずれか１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
６．上記癌が、脾腫、乳腺腫瘍、前立腺癌、乳腺癌、骨肉腫又は繊維肉腫であることを特徴とする前項１〜５のいずれか１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
７．上記癌が、扁平上皮癌、メラノーマ、脳腫瘍、肥満細胞腫、肺腫瘍であることを特徴とする前項１〜５のいずれか１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。
８．IP9及びIP10の抗体の組み合わせ又はSC2及びSC4の抗体の組み合わせと、標準試料として用いられるミッドカインを含む哺乳動物の癌の診断キット。」That is, the present invention is as follows.
“1. Method for diagnosing mammalian cancer comprising the following steps and a combination of antibodies:
(1) reacting a mammal-derived biological sample with a primary antibody bound to a solid phase;
(2) a step of further reacting a labeled secondary antibody with the biological sample;
(3) measuring the amount of label captured on the solid phase;
And the combination of the primary antibody and the secondary antibody is as follows:
(A) The primary antibody is IP9 or a fragment thereof, the secondary antibody is IP10 or a fragment thereof;
(B) The primary antibody is IP10 or a fragment thereof, the secondary antibody is IP9 or a fragment thereof;
(C) the primary antibody is SC2 or a fragment thereof, the secondary antibody is SC4 or a fragment thereof;
(D) primary antibody is SC4 or a fragment thereof, secondary antibody is SC2 or a fragment thereof;
A method for diagnosing mammalian cancer characterized by the above.
2. The above item 1 is characterized in that when the amount of labeling exceeds the cut-off value compared with the amount of labeling set in advance, the lesion site of cancer is examined by image diagnosis. A method for diagnosing a mammalian cancer according to 1.
3. 3. The method for diagnosing mammalian cancer according to item 2, wherein the degree of progression of cancer is determined by comparing the amount of labeling with a preset reference value.
4). 2. The method for diagnosing mammalian cancer according to item 1 above, wherein the degree of recovery by cancer treatment is determined by comparing the amount of labeling with a preset reference value.
5). 5. The method for diagnosing mammalian cancer according to any one of items 1 to 4, wherein the biological sample is plasma.
6). 6. The method for diagnosing mammalian cancer according to any one of 1 to 5 above, wherein the cancer is splenomegaly, breast tumor, prostate cancer, breast cancer, osteosarcoma or fibrosarcoma.
7). 6. The method for diagnosing mammalian cancer according to any one of 1 to 5 above, wherein the cancer is squamous cell carcinoma, melanoma, brain tumor, mastocytoma, or lung tumor.
8). A mammalian cancer diagnostic kit comprising a combination of IP9 and IP10 antibodies or a combination of SC2 and SC4 antibodies and midkine used as a standard sample. "

本発明では、悪性腫瘍を有する哺乳動物の血中特に血漿中のミッドカイン濃度の測定方法を完成し、哺乳動物の癌の診断方法を確立した。   In the present invention, a method for measuring the concentration of midkine in blood, particularly plasma, of a mammal having a malignant tumor has been completed, and a method for diagnosing mammalian cancer has been established.

（哺乳動物）
本発明の哺乳動物とは、ヒトを除く哺乳動物一般を意味する。特に、いわゆる愛玩動物である、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ウサギ、ウマ特に競馬ウマ等を意味する。(Mammals)
The mammal of the present invention means all mammals except humans. In particular, it means dogs, cats, horses, cows, rabbits, horses, particularly horses, which are so-called pet animals.

（癌）
本発明の哺乳動物の癌の診断方法における癌種は特に限定されないが、前立腺癌、乳腺癌、骨肉腫、繊維肉腫、胃癌、肝細胞癌、食道癌、大腸癌、胆管癌、転移性肝癌、乳癌、肺癌、膵癌、脾腫、乳腺腫瘍、扁平上皮癌、メラノーマ、脳腫瘍、肥満細胞腫、肺腫瘍、肝癌、滑膜肉腫、平滑筋腫等が挙げられる。
特に、「早期癌」とは、腫瘍が発生した局所（粘膜内）に限局していて、周囲組織への浸潤のないもの、あるいは浸潤があってもその範囲が局所に限局しているものを言う。哺乳動物特にイヌの癌の進行度合いが早く、早期癌を検出することは重要である。(cancer)
The cancer type in the mammalian cancer diagnostic method of the present invention is not particularly limited, but prostate cancer, breast cancer, osteosarcoma, fibrosarcoma, gastric cancer, hepatocellular carcinoma, esophageal cancer, colon cancer, bile duct cancer, metastatic liver cancer, Examples include breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, splenomegaly, breast tumor, squamous cell carcinoma, melanoma, brain tumor, mastocytoma, lung tumor, liver cancer, synovial sarcoma, leiomyoma and the like.
In particular, “early cancer” refers to those that are localized to the tumor site (in the mucous membrane) and that do not invade surrounding tissues, or those that have invasion but the area is locally limited. To tell. It is important to detect early cancer because cancer progresses rapidly in mammals, particularly dogs.

（ミッドカイン）
本発明のミッドカイン（「ＭＫ」）とは、全長ＭＫタンパク質、又はＭＫの生物活性を有する任意の長さのアミノ酸配列を有するフラグメントを含む。Ｎドメインを欠く変異型ＭＫが癌特異的に発現しており（Ｋａｎａｍｅ Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２１９：２５６−２６０，１９９６）、このような変異型ＭＫも含む。遺伝子組み換え技術によって生成されたＭＫ、および化学合成されたＭＫは、本明細書では交換可能に用いられる。ヒト全長ＭＫをコードするＤＮＡ配列は公知（米国特許：５，４６１，０２９）である。ＭＫの生物活性とは、ＭＫが細胞に与える生理的な作用のみならず、抗ＭＫ抗体との免疫学的な反応性も含む。
特に、ミッドカインは、さまざまなタイプの不特定癌において、早期に血中や尿中のレベルが健常人の基準値に比較して上昇することが知られている。すなわち、不特定癌に対する広いスペクトルを有し、感度が高いといってよい。臓器を問わず幅広く早期癌のスクリーニングを行うには、特定癌に対する高い検出感度、特異性とともに、不特定癌検出に対する広いスペクトルが求められる。ミッドカインは、このようなスクリーニングに必要な感度と特異性を備えていると言える。(Midkine)
The midkine (“MK”) of the present invention includes a full-length MK protein or a fragment having an amino acid sequence of any length having the biological activity of MK. Mutant MK lacking the N domain is expressed specifically in cancer (Kaname T. et al .: Biochem. Biophys. Res. Commun., 219: 256-260, 1996), including such mutant MKs . MKs produced by genetic engineering techniques and chemically synthesized MKs are used interchangeably herein. The DNA sequence encoding human full-length MK is known (US Pat. No. 5,461,029). The biological activity of MK includes not only physiological effects of MK on cells but also immunological reactivity with anti-MK antibodies.
In particular, midkine is known to increase in blood and urine at an early stage in various types of unspecified cancers as compared with a reference value of a healthy person. That is, it can be said that it has a broad spectrum for unspecified cancer and has high sensitivity. In order to perform screening of early cancers widely regardless of organs, a wide spectrum for detection of unspecified cancers is required in addition to high detection sensitivity and specificity for specific cancers. Midkine has the sensitivity and specificity necessary for such screening.

（１次抗体、２次抗体）
本発明の１次抗体及び２次抗体は、いずれもミッドカインに対するモノクローナル抗体であり、以下を使用する。なお、以下の抗体は、いずれもabcam^登録商標（アブカム株式会社：日本オフィス）より入手可能である。
IP9：コード番号ab52317
IP10：コード番号ab52318
SC2：コード番号ab52319
SC4：コード番号ab52320
さらに、上記抗体の断片も抗体として使用することができる。なお、「断片」とは、ミッドカインに対する特異的認識能力を保持しながら、抗体の一部のアミノ酸配列が欠如しているタンパク質を意味する。(Primary antibody, secondary antibody)
The primary antibody and secondary antibody of the present invention are both monoclonal antibodies against midkine, and the following are used. The following antibodies are all available from abcam ^{registered trademark} (Abcam Inc .: Japan Office).
IP9: Code number ab52317
IP10: Code number ab52318
SC2: Code number ab52319
SC4: Code number ab52320
Furthermore, the above antibody fragments can also be used as antibodies. The “fragment” means a protein lacking a partial amino acid sequence of an antibody while retaining specific recognition ability for midkine.

（生体試料）
本発明の「生体試料」とは、哺乳動物より得ることができる試料を意味する。より具体的には、例えば、血液、血漿、尿、及びその他の分泌物等を挙げることができる。なお、生体試料にヘパリンを添加しても良い。
なお、血漿は自体公知の方法より得られるが、例えば、血液（全血）から抗凝固作用のあるヘパリン、EDTA、クエン酸等を添加して得る。(Biological sample)
The “biological sample” of the present invention means a sample that can be obtained from a mammal. More specifically, examples include blood, plasma, urine, and other secretions. Heparin may be added to the biological sample.
Plasma can be obtained by a method known per se. For example, blood (whole blood) can be obtained by adding heparin, EDTA, citric acid or the like having anticoagulant action.

（癌の診断）
本発明の「癌の診断」とは、哺乳動物（被検体）の生体内に癌が存在する可能性が高いことを判定することを意味する。
本発明の哺乳動物の癌の診断方法に対しては、任意の集団を対象として癌が存在する可能性が高い被検体を絞り込むことを目的とする。
さらに、本発明の癌の診断方法では、標識量と予め設定しておいたcut off値と比較して、該標識量が該cut off値を超えた場合には、さらにエックス線画像診断等の画像診断により癌の病巣部位を検査することも含む。
なお、cut off値の設定方法としては、癌の存在しない哺乳動物の生体試料から得られる標識量の平均値から算出する。通常、予め決定したcut off値の標準偏差の1.5倍、好ましくは2倍、より好ましくは3倍の標識量を生じる生体試料は、癌に対して陽性であると考えられる。(Diagnosis of cancer)
The “diagnosis of cancer” of the present invention means determining that there is a high possibility that cancer exists in the living body of a mammal (subject).
An object of the method for diagnosing mammalian cancer according to the present invention is to narrow down a subject having a high possibility of having cancer in an arbitrary population.
Further, in the cancer diagnosis method of the present invention, if the amount of label exceeds the cut off value compared with the amount of label and a preset cut off value, an image such as an X-ray image diagnosis is further obtained. It also includes examining the lesion site of cancer by diagnosis.
In addition, as a setting method of cut off value, it calculates from the average value of the labeled amount obtained from the biological sample of the mammal which does not have cancer. Usually, a biological sample that produces a labeled amount of 1.5 times, preferably 2 times, more preferably 3 times the standard deviation of a predetermined cut off value is considered positive for cancer.

さらに、本発明の癌の診断方法では、標識量と予め設定しておいた基準値とを比較して、癌の進行度合いを判定する又は癌治療による回復度合いを判定することも含む。
なお、基準値とは各癌種における進行度を示す標準値を示す。一般的に、生体試料中のミッドカイン濃度は、早期癌、進行癌、末期癌になるにつれて上昇すると考えられる。基準値の設定方法としては、予め各癌の進行度合いを確認している担癌哺乳動物の生体試料から得られる標識量の平均値から算出する。Furthermore, the method for diagnosing cancer of the present invention includes comparing the amount of labeling with a preset reference value to determine the degree of progression of cancer or the degree of recovery by cancer treatment.
The reference value indicates a standard value indicating the degree of progression in each cancer type. In general, the concentration of midkine in a biological sample is considered to increase as it becomes early cancer, advanced cancer, or terminal cancer. As a reference value setting method, it is calculated from the average value of the amount of label obtained from a biological sample of a cancer-bearing mammal whose advance degree of each cancer has been confirmed in advance.

本発明の癌の診断方法では、ある哺乳動物の生体試料中のミッドカイン濃度を測定する。そして、該ミッドカイン濃度が、予め設定しておいたcut off値を超える場合には、該哺乳動物がある悪性腫瘍の罹患状態にある可能性が非常に高い。これにより、獣医師が該哺乳動物の病巣を画像診断より検査する。そして、獣医師が該哺乳動物の病巣位置及び癌種を特定する。
さらに、生体試料中のミッドカイン濃度と基準値を比較することにより、癌の進行度合い（早期癌、進行癌、末期癌）を判定することができる。
また、癌治療中の哺乳動物の生体試料中のミッドカインを定期的に測定することにより、癌治療効果である回復度合いの確認をすることができる。これにより、獣医師は、現在適用している癌治療方法の効果を確認することができる。さらに、獣医師は、測定したミッドカイン濃度と基準値を比較することを基にして、望むような治療効果が得られないような場合には、適宜癌治療方法を変更することができる。In the cancer diagnosis method of the present invention, the midkine concentration in a biological sample of a mammal is measured. When the midkine concentration exceeds a preset cut-off value, it is very likely that the mammal is suffering from a certain malignant tumor. Thereby, the veterinarian examines the lesion of the mammal by image diagnosis. Then, the veterinarian identifies the lesion location and cancer type of the mammal.
Furthermore, by comparing the midkine concentration in the biological sample with the reference value, the degree of cancer progression (early cancer, advanced cancer, end-stage cancer) can be determined.
Further, by periodically measuring midkine in a biological sample of a mammal undergoing cancer treatment, the degree of recovery as a cancer treatment effect can be confirmed. Thereby, the veterinarian can confirm the effect of the cancer treatment method currently applied. Furthermore, the veterinarian can appropriately change the cancer treatment method when the desired therapeutic effect cannot be obtained based on comparing the measured midkine concentration with a reference value.

（生体試料中のミッドカイン濃度の測定方法）
本発明の生体試料中のミッドカイン濃度の測定方法は、ミッドカインに対するモノクローナル抗体を用いたＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ）法、ＲＩＡ法、ＦＩＡ、化学発光イムノアッセイ、あるいはＥＣＬＩＡ法などを用いて測定することができる。特に、ＥＩＡ法が好ましい。
ミッドカイン濃度測定の一例では、１次抗体を固相に自体公知のブロッキング剤を使用して固定化する。次に、生体試料、続いて酵素標識化２次抗体を該固相に添加する。ここで、該固相を洗浄することにより、生体試料中のミッドカインと結合していない標識化２次抗体が固相から除去される。さらに、反応基質を該固相に添加することで、該酵素と該反応基質が反応して、該固相中の標識量である溶液の吸光度が上昇する。
固相としては、試験管、９６穴の反応プレート、ビーズ等が使用できるが、特に限定されない。
また、標識量とは、ミッドカインに特異的に結合した２次抗体量の指標であり、該２次抗体量は生体試料中のミッドカイン濃度に比例する。すなわち、標識量の増減が生体試料中のミッドカイン濃度の増減を意味する。(Measurement method of midkine concentration in biological samples)
The method for measuring the concentration of midkine in the biological sample of the present invention can be measured using EIA (ELISA) method, RIA method, FIA, chemiluminescence immunoassay, or ECLIA method using a monoclonal antibody against midkine. . In particular, the EIA method is preferable.
In one example of midkine concentration measurement, the primary antibody is immobilized on a solid phase using a blocking agent known per se. Next, a biological sample, followed by an enzyme-labeled secondary antibody is added to the solid phase. Here, by washing the solid phase, the labeled secondary antibody not bound to midkine in the biological sample is removed from the solid phase. Furthermore, by adding a reaction substrate to the solid phase, the enzyme and the reaction substrate react to increase the absorbance of the solution, which is the amount of label in the solid phase.
As the solid phase, a test tube, a 96-well reaction plate, beads, or the like can be used, but is not particularly limited.
The labeled amount is an indicator of the amount of secondary antibody specifically bound to midkine, and the amount of secondary antibody is proportional to the midkine concentration in the biological sample. That is, increase / decrease in the amount of label means increase / decrease in the concentration of midkine in the biological sample.

本発明の癌の診断方法の測定装置は、１次抗体をニトロセルロースのようなメンブレン上に固相化したフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）テスト型又はストリップテスト型を用いて実施できる。
フロースルーテスト型においては、生体試料がメンブレンを通り抜けるとき、生体試料中のミッドカインは１次抗体に結合する。次に、標識化２次抗体を含む溶液がメンブレンを通り抜けるとき、該２次抗体は、１次抗体−ミッドカイン複合体に結合する。次に、結合した２次抗体は上記示した方法で検出する。
ストリップテスト型においては、１次抗体が結合したメンブレンの一端を生体試料を含む溶液中に浸す。生体試料は、２次抗体を含む領域を通過するようにメンブレンを移動し１次抗体のエリアに向かって移動する。１次抗体のエリアにおける２次抗体の濃度がミッドカイン濃度を示す。
また、標識量を公知のplate reader等で機械的に読み取ることにより、生体試料中のミッドカインの定量的な測定が可能である。The apparatus for measuring a cancer diagnosis method of the present invention can be implemented using a flow-through test type or a strip test type in which a primary antibody is immobilized on a membrane such as nitrocellulose.
In the flow-through test type, when the biological sample passes through the membrane, midkine in the biological sample binds to the primary antibody. Next, when the solution containing the labeled secondary antibody passes through the membrane, the secondary antibody binds to the primary antibody-midkine complex. Next, the bound secondary antibody is detected by the method described above.
In the strip test type, one end of the membrane bound with the primary antibody is immersed in a solution containing a biological sample. The biological sample moves through the membrane so as to pass through the region containing the secondary antibody and moves toward the area of the primary antibody. The concentration of the secondary antibody in the primary antibody area indicates the midkine concentration.
In addition, it is possible to quantitatively measure midkine in a biological sample by mechanically reading the labeled amount with a known plate reader or the like.

（哺乳動物の癌の診断キット）
本発明の哺乳動物の癌の診断キットは、少なくともIP9及びIP10の抗体の組み合わせ又はSC2及びSC4の抗体の組み合わせと、標準試料として用いられるミッドカインを含む。
さらに、本発明の哺乳動物の癌の診断キットには、２次抗体を標識するための標識成分、標識成分の検出に必要な酵素基質、及び取り扱い指示書等を組み合わせることができる。(Mammalian cancer diagnostic kit)
The mammalian cancer diagnostic kit of the present invention comprises at least a combination of IP9 and IP10 antibodies or a combination of SC2 and SC4 antibodies and midkine used as a standard sample.
Furthermore, the mammalian cancer diagnostic kit of the present invention can be combined with a labeling component for labeling the secondary antibody, an enzyme substrate necessary for detection of the labeling component, a handling instruction, and the like.

以下に本発明を実施例により具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。   Hereinafter, the present invention will be described specifically by way of examples. These examples are for explaining the present invention, and do not limit the scope of the present invention.

（抗体の組合せの検討）
IP9、IP10、SC2及びSC4の４種類のモノクローナル抗体（すべてIgG1 subclass）の組み合わせを検討した。詳細は、以下の通りである。
各１次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg /ml in PBS）を固相であるマイクロタイタープレート（Maxsorp plate, 販売元： NalgeNunk Int. Tokyo, Japan）の各ウエルに添加し、4℃で16時間静置した。次に、PBS（0.05％ Tween 20 ）で該各ウエル内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキング剤200μl｛PBS-1%BSA(RIA grade) 又はPBS-1% Block Ace｝により室温で２時間ブッキングをした。次に、各サンプル20μl｛緩衝液、ミッドカイン（株式会社ペプチド研究所）、前立腺癌細胞の上澄液｝及び予めペロキシダーゼ標識した各２次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg in diluents）を該各ウエルに添加し、室温で4時間プレートシェイカーにより攪拌した。次に、該各ウエルをPBS（0.05％ Tween20）で5回洗浄した。さらに、基質溶液100μl（TMB Microwell Peroxidase Substrate System,販売元：KPL com, Gaithersburg MD, USA）を該各ウエルに添加し、室温で10分間静置した。該各ウエル内の酵素基質反応を停止するために、1M リン酸100μlを該各ウエル内に添加した。最後に、該各ウエル内の吸光度（OD450）をmultiplate reader（Multiskan EX, 販売元：Thermo electron corp., vantaa, Finland）により測定した。
なお、２次抗体のペロキシダーゼ標識には、Peroxidase Labeling Kit-NH₂（販売元：Dojinndo Lab. Kumamoto, Japan）を用いた(Examination of antibody combinations)
A combination of four types of monoclonal antibodies (all IgG1 subclass) of IP9, IP10, SC2 and SC4 was examined. Details are as follows.
Each primary antibody (IP9, IP10, SC2 or SC4: 100 μl of 1.0 μg / ml in PBS) is added to each well of a microtiter plate (Maxsorp plate, sold by NalgeNunk Int. Tokyo, Japan) as a solid phase. And allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours. Next, after washing each well with PBS (0.05% Tween 20), 200 μl of blocking agent {PBS-1% BSA (RIA grade) or PBS-1% Block Ace} was added to each well at room temperature. I booked for hours. Next, 20 μl of each sample {buffer solution, midkine (Peptide Institute, Inc.), supernatant of prostate cancer cells} and each secondary antibody (IP9, IP10, SC2, or SC4: 100 μl of 1.0 previously labeled with peroxidase) μg in diluents) was added to each well and stirred on a plate shaker at room temperature for 4 hours. Next, each well was washed 5 times with PBS (0.05% Tween20). Further, 100 μl of a substrate solution (TMB Microwell Peroxidase Substrate System, distributor: KPL com, Gaithersburg MD, USA) was added to each well and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. To stop the enzyme substrate reaction in each well, 100 μl of 1M phosphoric acid was added into each well. Finally, the absorbance (OD450) in each well was measured with a multiplate reader (Multiskan EX, distributor: Thermo electron corp., Vantaa, Finland).
Peroxidase Labeling Kit-NH ₂ (distributor: Dojinndo Lab. Kumamoto, Japan) was used for labeling the secondary antibody with peroxidase.

上記測定結果を下記表１，２に示す。
１次抗体がIP9の場合には、２次抗体がIP10抗体のみELISA測定反応が得られた。また、１次抗体がIP10の場合には、２次抗体がIP9抗体のみELISA測定反応が得られた。また、１次抗体がSC2の場合には、２次抗体がSC4抗体のみELISA測定反応が得られた。また、１次抗体がSC4の場合には、２次抗体がSC2抗体のみELISA測定反応が得られた。
以上の結果より、本発明の哺乳動物の癌の診断方法に使用する抗体の最適な組み合わせを決定した。
加えて、上記測定では、２種類（BSA、Block Ace）のブロッキング剤を使用した結果、BSAではバックグランド値が高くなる傾向があることを確認した。よって、ブッロキング剤として、Block Aceが優れていることを確認した。しかしながら、BSAをブロッキング剤として使用してELISA測定することもできる。
なお、Block Aceとは、乳タンパク質と有機酸緩衝塩を主成分としてブロッキング剤であり、大日本住友製薬株式会社から購入可能である。The measurement results are shown in Tables 1 and 2 below.
When the primary antibody was IP9, ELISA measurement reaction was obtained only with the secondary antibody being IP10 antibody. When the primary antibody was IP10, ELISA measurement reaction was obtained only for the secondary antibody, which was IP9 antibody. When the primary antibody was SC2, only the SC4 antibody was used as the secondary antibody, and an ELISA measurement reaction was obtained. When the primary antibody was SC4, only the SC2 antibody was the secondary antibody, and an ELISA measurement reaction was obtained.
Based on the above results, the optimal combination of antibodies used in the method for diagnosing mammalian cancer of the present invention was determined.
In addition, in the above measurement, as a result of using two types of blocking agents (BSA, Block Ace), it was confirmed that the background value of BSA tends to increase. Therefore, it was confirmed that Block Ace is excellent as a blocking agent. However, ELISA can also be performed using BSA as a blocking agent.
Block Ace is a blocking agent mainly composed of milk protein and organic acid buffer salt, and can be purchased from Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.

（定量検出の確認）
上記実施例１で最適な抗体の組合で測定した場合には、ミッドカインを定量的に検出することができるかを確認した。また、コントロールとして市販のポリクローナル抗体のELISA kit（Elegance MIDKINE ELISA, 販売元：Bioclone Lim. Sydney, Australia）を使用した。詳細は、以下の通りである。
各１次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg /ml in PBS）を固相であるマイクロタイタープレート（Maxsorp plate, 販売元： NalgeNunk Int. Tokyo, Japan）の各ウエルに添加し、4℃で16時間静置した。次に、PBS（0.05％ Tween 20 ）で該各ウエル内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキング剤200μl（PBS-1% Block Ace）により室温で２時間ブッキングをした。各濃度のミッドカイン｛0、0.00625、0.0125、0.025、0.05、1（μl）：株式会社ペプチド研究所｝及び予めペロキシダーゼ標識した各２次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg in diluents）を該各ウエルに添加し、室温で4時間プレートシェイカーにより攪拌した。次に、該各ウエルをPBS（0.05％ Tween20）で5回洗浄した。さらに、基質溶液100μl（TMB Microwell Peroxidase Substrate System, 販売元：KPL com, Gaithersburg MD, USA）を該各ウエルに添加し、室温で10分間静置した。該各ウエル内の酵素基質反応を停止するために、1M リン酸100μlを該各ウエル内に添加した。最後に、該各ウエル内の吸光度（OD450）をmultiplate reader（Multiskan EX, 販売元：Thermo electron corp., vantaa, Finland）により測定した。
なお、市販のポリクローナル抗体のELISA kitを使用した測定方法は、キット添付の説明書に従った。(Confirmation of quantitative detection)
When measured with the optimal antibody combination in Example 1 above, it was confirmed whether midkine could be detected quantitatively. As a control, a commercially available polyclonal antibody ELISA kit (Elegance MIDKINE ELISA, distributor: Bioclone Lim. Sydney, Australia) was used. Details are as follows.
Each primary antibody (IP9, IP10, SC2 or SC4: 100 μl of 1.0 μg / ml in PBS) is added to each well of a microtiter plate (Maxsorp plate, sold by NalgeNunk Int. Tokyo, Japan) as a solid phase. And allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours. Next, after each well was washed with PBS (0.05% Tween 20), the inside of each well was booked with a blocking agent 200 μl (PBS-1% Block Ace) at room temperature for 2 hours. Midkine at each concentration {0, 0.00625, 0.0125, 0.025, 0.05, 1 (μl): Peptide Laboratories, Inc.} and each secondary antibody pre-labeled with peroxidase (IP9, IP10, SC2, or SC4: 100 μl of 1.0 μg) in diluents) was added to each well and stirred on a plate shaker at room temperature for 4 hours. Next, each well was washed 5 times with PBS (0.05% Tween20). Further, 100 μl of a substrate solution (TMB Microwell Peroxidase Substrate System, distributor: KPL com, Gaithersburg MD, USA) was added to each well and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. To stop the enzyme substrate reaction in each well, 100 μl of 1M phosphoric acid was added into each well. Finally, the absorbance (OD450) in each well was measured with a multiplate reader (Multiskan EX, distributor: Thermo electron corp., Vantaa, Finland).
The measurement method using a commercially available polyclonal antibody ELISA kit was in accordance with the instructions attached to the kit.

上記測定結果を下記表３及び図１〜５に示す。
１次抗体がIP9、２次抗体がIP10抗体を用いての測定では、直線性を示し、十分にミッドカインの定量が可能である（図１）。また、１次抗体がIP10、２次抗体がIP9抗体でも同様な結果であった（図２）。１次抗体がSC2、２次抗体がSC4抗体でも同様な結果であった（図３）。１次抗体がSC4、２次抗体がSC2でも同様な結果であった（図４）。
以上の結果より、本発明の抗体の組み合わせを用いた測定方法は、ミッドカインを定量的に測定することができ、かつ定量線を設定することができる。これにより、cut off値及び基準値を設定することができる。The said measurement result is shown in following Table 3 and FIGS.
Measurement using a primary antibody of IP9 and a secondary antibody of IP10 shows linearity, and midkine can be quantified sufficiently (FIG. 1). Similar results were obtained when the primary antibody was IP10 and the secondary antibody was IP9 antibody (FIG. 2). Similar results were obtained when the primary antibody was SC2 and the secondary antibody was SC4 antibody (FIG. 3). Similar results were obtained when the primary antibody was SC4 and the secondary antibody was SC2 (FIG. 4).
From the above results, the measurement method using the antibody combination of the present invention can quantitatively measure midkine and can set a quantitative line. Thereby, the cut off value and the reference value can be set.

（原発腫瘍細胞の培養上清中のミッドカイン測定）
哺乳動物（イヌ）の原発腫瘍細胞の培養上清中のミッドカイン量を測定できるかを確認した。詳細は、以下の通りである。
各１次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg/ml in PBS）を固相であるマイクロタイタープレート（Maxsorp plate, 販売元： NalgeNunk Int. Tokyo, Japan）の各ウエルに添加し、4℃で16時間静置した。次に、PBS（0.05％ Tween 20 ）で該各ウエル内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキング剤200μl（PBS-1% Block Ace）により室温で２時間ブッキングをした。各サンプル20μl（緩衝液、イヌの前立腺癌細胞の培養上清液、乳腺癌細胞の培養上清液及び骨肉腫細胞の培養上清液）及び予めペロキシダーゼ標識した各２次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg in diluents）を該各ウエルに添加し、室温で4時間プレートシェイカーにより攪拌した。次に、該各ウエルをPBS（0.05％ Tween20）で5回洗浄した。さらに、基質溶液100μl（TMB Microwell Peroxidase Substrate System, 販売元：KPL com, Gaithersburg MD, USA）を該各ウエルに添加し、室温で10分間静置した。該各ウエル内の酵素基質反応を停止するために、1M リン酸100μlを該各ウエル内に添加した。最後に、該各ウエル内の吸光度（OD450）をmultiplate reader（Multiskan EX, 販売元：Thermo electron corp., vantaa, Finland）により測定した。(Measurement of midkine in the culture supernatant of primary tumor cells)
It was confirmed whether the amount of midkine in the culture supernatant of a primary tumor cell of a mammal (dog) can be measured. Details are as follows.
Add each primary antibody (IP9, IP10, SC2 or SC4: 100 μl of 1.0 μg / ml in PBS) to each well of a solid phase microtiter plate (Maxsorp plate, sold by NalgeNunk Int. Tokyo, Japan). And allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours. Next, after each well was washed with PBS (0.05% Tween 20), the inside of each well was booked with a blocking agent 200 μl (PBS-1% Block Ace) at room temperature for 2 hours. 20 μl of each sample (buffer solution, canine prostate cancer cell culture supernatant, breast adenocarcinoma cell culture supernatant and osteosarcoma cell culture supernatant) and peroxidase-labeled secondary antibodies (IP9, IP10) SC2 or SC4: 100 μl of 1.0 μg in diluents) was added to each well, and the mixture was stirred on a plate shaker at room temperature for 4 hours. Next, each well was washed 5 times with PBS (0.05% Tween20). Further, 100 μl of a substrate solution (TMB Microwell Peroxidase Substrate System, distributor: KPL com, Gaithersburg MD, USA) was added to each well and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. To stop the enzyme substrate reaction in each well, 100 μl of 1M phosphoric acid was added into each well. Finally, the absorbance (OD450) in each well was measured with a multiplate reader (Multiskan EX, distributor: Thermo electron corp., Vantaa, Finland).

上記測定結果を下記表４に示す。
いずれの抗体の組み合わせを用いた測定でも各癌種の培養上清液中のミッドカインを定量的に測定することができた。特に、前立腺癌細胞の培養上清液中のミッドカイン値が他の癌種よりも産出されていることがわかった。
以上の結果より、哺乳動物特にイヌの癌細胞の培養上清液でもミッドカインが産出されていることを確認した。さらに、細胞の培養上清中のミッドカイン量を測定することにより、哺乳動物の癌の診断を行なうことができることを確認した。The measurement results are shown in Table 4 below.
Midkine in the culture supernatant of each cancer type could be quantitatively measured by measurement using any combination of antibodies. In particular, it was found that midkine levels in the culture supernatant of prostate cancer cells were produced more than other cancer types.
From the above results, it was confirmed that midkine was produced in the culture supernatant of mammals, particularly dog cancer cells. Furthermore, it was confirmed that a cancer of a mammal can be diagnosed by measuring the amount of midkine in the cell culture supernatant.

（血漿中のミッドカイン測定による哺乳動物の癌の診断）
正常犬及び担癌犬の血漿中のミッドカインを測定することにより、哺乳動物の癌の診断を行なうことができるかを確認した。なお、EDTAとヘパリンで同時採血した血漿で測定を行なった。
詳細は、以下の通りである。
各１次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg /ml in PBS）を固相であるマイクロタイタープレート（Maxsorp plate, 販売元： NalgeNunk Int. Tokyo, Japan）の各ウエルに添加し、4℃で16時間静置した。次に、PBS（0.05％ Tween 20 ）で該各ウエル内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキング剤200μl（PBS-1% Block Ace）により室温で２時間ブッキングをした。各サンプル20μl（緩衝液、クエン酸採血、EDTA採血、ヘパリン採血）及び予めペロキシダーゼ標識した各２次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg in diluents）を該各ウエルに添加し、室温で4時間プレートシェイカーにより攪拌した。次に、該各ウエルをPBS（0.05％ Tween20）で5回洗浄した。さらに、基質溶液100μl（TMB Microwell Peroxidase Substrate System, 販売元：KPL com, Gaithersburg MD, USA）を該各ウエルに添加し、室温で10分間静置した。該各ウエル内の酵素基質反応を停止するために、1M リン酸100μlを該各ウエル内に添加した。最後に、該各ウエル内の吸光度（OD450）をmultiplate reader（Multiskan EX, 販売元：Thermo electron corp., vantaa, Finland）により測定した。
なお、担癌犬では、IP9及びIP10のみを使用して測定した。(Diagnosis of mammalian cancer by measuring midkine in plasma)
It was confirmed whether or not a mammal can be diagnosed by measuring midkine in plasma of normal dogs and cancer-bearing dogs. In addition, the measurement was performed on plasma collected with EDTA and heparin simultaneously.
Details are as follows.
Each primary antibody (IP9, IP10, SC2 or SC4: 100 μl of 1.0 μg / ml in PBS) is added to each well of a microtiter plate (Maxsorp plate, sold by NalgeNunk Int. Tokyo, Japan) as a solid phase. And allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours. Next, after each well was washed with PBS (0.05% Tween 20), the inside of each well was booked with a blocking agent 200 μl (PBS-1% Block Ace) at room temperature for 2 hours. 20 μl of each sample (buffer solution, citrate blood collection, EDTA blood collection, heparin blood collection) and each secondary antibody (IP9, IP10, SC2, or SC4: 100 μl of 1.0 μg in diluents) previously labeled with peroxidase are added to each well. The mixture was stirred with a plate shaker for 4 hours at room temperature. Next, each well was washed 5 times with PBS (0.05% Tween20). Further, 100 μl of a substrate solution (TMB Microwell Peroxidase Substrate System, distributor: KPL com, Gaithersburg MD, USA) was added to each well and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. To stop the enzyme substrate reaction in each well, 100 μl of 1M phosphoric acid was added into each well. Finally, the absorbance (OD450) in each well was measured with a multiplate reader (Multiskan EX, distributor: Thermo electron corp., Vantaa, Finland).
In cancer-bearing dogs, measurements were made using only IP9 and IP10.

上記測定結果を下記表５、６及び図６に示す。
担癌犬の血漿は、正常犬の血漿よりもミッドカイン濃度が高い傾向を示した。特に、骨肉腫の担癌犬では、血漿中のミッドカイン濃度が高い値を示した。
また、EDTA採血とヘパリン採血した血漿のミッドカイン濃度を比較すると、EDTA採血した画分がミッドカイン濃度が高いが、ヘパリン採血でも十分にミッドカイン濃度を検出することができることを確認した。The measurement results are shown in Tables 5 and 6 below and FIG.
Cancer-bearing dog plasma tended to have a higher midkine concentration than normal dog plasma. Particularly, dogs with osteosarcoma showed high plasma midkine levels.
Moreover, when the midkine concentration of EDTA blood collection and heparin blood collection plasma was compared, it was confirmed that the fraction obtained by EDTA blood collection had a high midkine concentration, but heparin blood collection could sufficiently detect the midkine concentration.

（ヘパリン添加効果の確認）
ヘパリン添加によるミッドカイン濃度の影響を確認にした。詳しくは、以下の通りである。
最初に、各濃度ミッドカイン｛0.025、0.05、0.1（μM）：株式会社ペプチド研究所｝にヘパリン（100Ｕ/ml）を添加した後、室温1時間で静置して、サンプルを作成した。
次に、各１次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg/ml in PBS）を固相であるマイクロタイタープレート（Maxsorp plate, 販売元： NalgeNunk Int. Tokyo, Japan）の各ウエルに添加し、4℃で16時間静置した。次に、PBS（0.05％ Tween 20 ）で該各ウエル内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキング剤200μl（PBS-1% Block Ace）により室温で２時間ブッキングをした。上記作成した各サンプル20μl及び予めペロキシダーゼ標識した各２次抗体（IP9、IP10、SC2又はSC4：100μl of 1.0μg in diluents）を該各ウエルに添加し、室温で4時間プレートシェイカーにより攪拌した。次に、該各ウエルをPBS（0.05％ Tween20）で5回洗浄した。さらに、基質溶液100μl（TMB Microwell Peroxidase Substrate System, 販売元：KPL com, Gaithersburg MD, USA）を該各ウエルに添加し、室温で10分間静置した。該各ウエル内の酵素基質反応を停止するために、1M リン酸100μlを該各ウエル内に添加した。最後に、該各ウエル内の吸光度（OD450）をmultiplate reader（Multiskan EX, 販売元：Thermo electron corp., vantaa, Finland）により測定した。(Confirmation of heparin addition effect)
The effect of midkine concentration by adding heparin was confirmed. Details are as follows.
First, heparin (100 U / ml) was added to each concentration of midkine {0.025, 0.05, 0.1 (μM): Peptide Institute, Inc.}, and then allowed to stand at room temperature for 1 hour to prepare a sample.
Next, each well of a microtiter plate (Maxsorp plate, sold by NalgeNunk Int. Tokyo, Japan) that is a solid phase of each primary antibody (IP9, IP10, SC2 or SC4: 100 μl of 1.0 μg / ml in PBS) And allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours. Next, after each well was washed with PBS (0.05% Tween 20), the inside of each well was booked with a blocking agent 200 μl (PBS-1% Block Ace) at room temperature for 2 hours. 20 μl of each sample prepared above and each secondary antibody (IP9, IP10, SC2, or SC4: 100 μl of 1.0 μg in diluents) previously labeled with peroxidase were added to each well, and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours with a plate shaker. Next, each well was washed 5 times with PBS (0.05% Tween20). Further, 100 μl of a substrate solution (TMB Microwell Peroxidase Substrate System, distributor: KPL com, Gaithersburg MD, USA) was added to each well and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. To stop the enzyme substrate reaction in each well, 100 μl of 1M phosphoric acid was added into each well. Finally, the absorbance (OD450) in each well was measured with a multiplate reader (Multiskan EX, distributor: Thermo electron corp., Vantaa, Finland).

上記測定結果を下記表７に示す。
１次抗体がIP9、２次抗体がIP10の場合及び１次抗体がIP10、２次抗体がIP9を用いた測定は、ヘパリンを添加してない場合と比較して、ミッドカイン値が上昇することを確認した。
しかしながら、１次抗体がSC2、２次抗体がSC4の場合及び１次抗体がSC4、２次抗体がSC2を用いた測定の場合は、ヘパリンを添加してない場合と比較して、ミッドカイン値が減少することを確認した。
以上の結果より、１次抗体がIP9、２次抗体がIP10の場合及び１次抗体がIP10、２次抗体がIP9を用いた測定では、生体試料にヘパリンを添加することでミッドカインを高感度で検出することができる。The measurement results are shown in Table 7 below.
When the primary antibody is IP9, the secondary antibody is IP10, and the measurement using the primary antibody is IP10 and the secondary antibody is IP9, the midkine value is increased compared to the case where heparin is not added. It was confirmed.
However, when the primary antibody is SC2, the secondary antibody is SC4, and when the primary antibody is SC4 and the secondary antibody is SC2, the midkine value is compared with the case where heparin is not added. Was confirmed to decrease.
Based on the above results, when the primary antibody is IP9, the secondary antibody is IP10, and when the primary antibody is IP10 and the secondary antibody is IP9, midkine is highly sensitive by adding heparin to the biological sample. Can be detected.

（市販のポリクローナル抗体のELISAキットを使用しての哺乳動物の癌の診断）
市販されているヒトミッドカインELISA kit（Elegance MIDKINE ELISA, 販売元：Bioclone Lim. Sydney, Australia）が哺乳動物の癌の診断に使用できるかを確認した。また、該キットの測定結果を本発明の測定方法により得られる結果と比較した。
詳細は、以下の通りである。
ヒトミッドカインELISA kitの添付説明書に従い、キット中のポリクローナル抗体を固相であるマイクロタイタープレート（Maxsorp plate, 販売元： NalgeNunk Int. Tokyo, Japan）の各ウエルに添加し、4℃で16時間静置した。次に、PBS（0.05％ Tween 20 ）で該各ウエル内を洗浄した後に、該各ウエル内をブロッキング剤200μl（PBS-1% Block Ace）により室温で２時間ブッキングをした。正常犬又は担癌犬（骨肉腫、繊維肉腫）の血漿サンプル20μl及びキット中の予めペロキシダーゼ標識したポリクローナル抗体を該各ウエルに添加し、室温で4時間プレートシェイカーにより攪拌した。次に、該各ウエルをPBS（0.05％ Tween20）で5回洗浄した。さらに、基質溶液100μl（TMB Microwell Peroxidase Substrate System, 販売元：KPL com, Gaithersburg MD, USA）を該各ウエルに添加し、室温で10分間静置した。該各ウエル内の酵素基質反応を停止するために、1M リン酸100μlを該各ウエル内に添加した。最後に、該各ウエル内の吸光度（OD450）をmultiplate reader（Multiskan EX, 販売元：Thermo electron corp., vantaa, Finland）により測定した。
なお、本発明の測定方法は、実施例４に記載の測定方法と同様に行った。サンプルは、正常犬及び担癌犬（骨肉腫、繊維肉腫）の血漿20μlとした。担癌犬のサンプルでは、１次抗体をIP9とし、２次抗体をIP10とした。(Diagnosis of mammalian cancer using a commercially available polyclonal antibody ELISA kit)
It was confirmed that a commercially available human midkine ELISA kit (Elegance MIDKINE ELISA, distributor: Bioclone Lim. Sydney, Australia) can be used for diagnosis of mammalian cancer. Further, the measurement result of the kit was compared with the result obtained by the measurement method of the present invention.
Details are as follows.
In accordance with the instructions attached to the human midkine ELISA kit, add the polyclonal antibody in the kit to each well of a microtiter plate (Maxsorp plate, sold by NalgeNunk Int. Tokyo, Japan) as a solid phase and then at 4 ° C for 16 hours. Left to stand. Next, after each well was washed with PBS (0.05% Tween 20), the inside of each well was booked with a blocking agent 200 μl (PBS-1% Block Ace) at room temperature for 2 hours. A plasma sample of 20 μl of a normal dog or a cancer-bearing dog (osteosarcoma, fibrosarcoma) and a preperoxidase-labeled polyclonal antibody in the kit were added to each well, and the mixture was stirred for 4 hours at room temperature using a plate shaker. Next, each well was washed 5 times with PBS (0.05% Tween20). Further, 100 μl of a substrate solution (TMB Microwell Peroxidase Substrate System, distributor: KPL com, Gaithersburg MD, USA) was added to each well and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. To stop the enzyme substrate reaction in each well, 100 μl of 1M phosphoric acid was added into each well. Finally, the absorbance (OD450) in each well was measured with a multiplate reader (Multiskan EX, distributor: Thermo electron corp., Vantaa, Finland).
The measurement method of the present invention was performed in the same manner as the measurement method described in Example 4. The sample was 20 μl of plasma from normal dogs and cancer-bearing dogs (osteosarcoma, fibrosarcoma). In cancer-bearing dog samples, the primary antibody was IP9 and the secondary antibody was IP10.

上記測定結果を下記表８〜１０及び図７に示す。
市販されているヒトミッドカインELISA kitを用いた測定方法では、正常犬の測定値と担癌犬の測定値間には十分な差異が検出されなかった。より詳しくは、正常犬の測定値が、担癌犬の測定値と比較して、高い場合があった。
一方、本発明の測定方法では、正常犬の測定値と担癌犬との測定値間は十分な差異を検出することができた。
これにより、市販されているヒトミッドカインELISA kitでは、哺乳動物の癌の診断に使用できないことを確認した。The measurement results are shown in Tables 8 to 10 below and FIG.
In the measurement method using a commercially available human midkine ELISA kit, a sufficient difference was not detected between the measurement values of normal dogs and cancer-bearing dogs. More specifically, the measurement values of normal dogs were sometimes higher than those of cancer-bearing dogs.
On the other hand, in the measurement method of the present invention, it was possible to detect a sufficient difference between the measurement values of normal dogs and cancer-bearing dogs.
This confirmed that the commercially available human midkine ELISA kit cannot be used for diagnosis of mammalian cancer.

１次抗体IP9、２次抗体IP10を用いてのミッドカインの定量測定。なお、図中の"Capture ab"は、１次抗体、"Detection ab"は２次抗体を意味する。Quantitative measurement of midkine using primary antibody IP9 and secondary antibody IP10. In the figure, “Capture ab” means a primary antibody, and “Detection ab” means a secondary antibody. １次抗体IP10、２次抗体IP9を用いてのミッドカインの定量測定。Quantitative measurement of midkine using primary antibody IP10 and secondary antibody IP9. １次抗体SC2、２次抗体SC4を用いてのミッドカインの定量測定。Quantitative measurement of midkine using primary antibody SC2 and secondary antibody SC4. １次抗体SC4、２次抗体SC2を用いてのミッドカインの定量測定。Midkine quantitative measurement using primary antibody SC4 and secondary antibody SC2. ポリクローナル抗体を用いてのミッドカインの定量測定。Quantitative measurement of midkine using a polyclonal antibody. 正常犬及び担癌犬の血漿中のミッドカイン濃度測定。（a）正常犬と担癌犬の比較、（ｂ）担癌犬の癌種の比較。Measurement of midkine concentration in plasma of normal dogs and cancer-bearing dogs. (A) Comparison of normal dogs and cancer-bearing dogs, (b) Comparison of cancer types of cancer-bearing dogs. 市販のポリクローナル抗体のELISAキットを使用しての哺乳動物の血漿中のミッドカイン濃度測定。Measurement of midkine concentration in mammalian plasma using a commercially available polyclonal antibody ELISA kit.

Claims (8)

以下の工程及び抗体の組み合わせを含む哺乳動物の癌の診断方法：
（１）哺乳動物由来の生体試料を、固相に結合させた１次抗体と反応させる工程；
（２）さらに標識化２次抗体を該生体試料と反応させる工程；
（３）該固相に捕捉された標識量を測定する工程；
および、上記１次抗体と上記２次抗体の組み合わせが以下である、
（a）１次抗体がIP9又はその断片、２次抗体がIP10又はその断片；
（b）１次抗体がIP10又はその断片、２次抗体がIP9又はその断片；
（c）１次抗体がSC2又はその断片、２次抗体がSC4又はその断片；
（d）１次抗体がSC4又はその断片、２次抗体がSC2又はその断片；
ことを特徴とする哺乳動物の癌の診断方法。A method for diagnosing mammalian cancer comprising the following steps and a combination of antibodies:
(1) reacting a mammal-derived biological sample with a primary antibody bound to a solid phase;
(2) a step of further reacting a labeled secondary antibody with the biological sample;
(3) measuring the amount of label captured on the solid phase;
And the combination of the primary antibody and the secondary antibody is as follows:
(A) The primary antibody is IP9 or a fragment thereof, the secondary antibody is IP10 or a fragment thereof;
(B) The primary antibody is IP10 or a fragment thereof, the secondary antibody is IP9 or a fragment thereof;
(C) the primary antibody is SC2 or a fragment thereof, the secondary antibody is SC4 or a fragment thereof;
(D) primary antibody is SC4 or a fragment thereof, secondary antibody is SC2 or a fragment thereof;
A method for diagnosing mammalian cancer characterized by the above. 上記標識量と予め設定しておいたcut off値と比較して、該標識量が該cut off値を超えた場合には、画像診断により癌の病巣部位を検査することを特徴とする請求項１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。 The comparison between the amount of labeling and a preset cut off value, and when the amount of labeling exceeds the cut off value, a lesion site of cancer is examined by image diagnosis. 2. The method for diagnosing mammalian cancer according to 1. 上記標識量と予め設定しておいた基準値と比較して、癌の進行度合いを判定することを特徴とする請求項２に記載の哺乳動物の癌の診断方法。 The method for diagnosing mammalian cancer according to claim 2, wherein the degree of progression of cancer is determined by comparing the amount of labeling with a preset reference value. 上記標識量と予め設定しておいた基準値と比較して、癌治療による回復度合いを判定することを特徴とする請求項１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。 The method for diagnosing mammalian cancer according to claim 1, wherein the degree of recovery by cancer treatment is determined by comparing the amount of labeling with a preset reference value. 上記生体試料が、血漿であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。 The method for diagnosing mammalian cancer according to any one of claims 1 to 4, wherein the biological sample is plasma. 上記癌が、脾腫、乳腺腫瘍、前立腺癌、乳腺癌、骨肉腫又は繊維肉腫であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。 The method for diagnosing mammalian cancer according to any one of claims 1 to 5, wherein the cancer is splenomegaly, breast tumor, prostate cancer, breast cancer, osteosarcoma or fibrosarcoma. 上記癌が、扁平上皮癌、メラノーマ、脳腫瘍、肥満細胞腫、肺腫瘍、肝癌、滑膜肉腫、平滑筋腫であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１に記載の哺乳動物の癌の診断方法。 The mammalian cancer according to any one of claims 1 to 5, wherein the cancer is squamous cell carcinoma, melanoma, brain tumor, mastocytoma, lung tumor, liver cancer, synovial sarcoma, or leiomyoma. Diagnosis method. IP9及びIP10の抗体の組み合わせ又はSC2及びSC4の抗体の組み合わせと、標準試料として用いられるミッドカインを含む哺乳動物の癌の診断キット。 A mammalian cancer diagnostic kit comprising a combination of IP9 and IP10 antibodies or a combination of SC2 and SC4 antibodies and midkine used as a standard sample.

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