JPWO2007126051A1 - Reagent for anti-phospholipid antibody measurement - Google Patents
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Abstract
要約疎水性が高いリン脂質抗原を不溶性担体へ固定化する効率を従来法よりもさらに高め、臨床から強く求められている、より高感度な測定法を実現する、抗リン脂質抗体測定用試薬が開示されている。抗リン脂質抗体測定用試薬は、少なくとも１種の表面修飾物質が表面に結合した不溶性担体に、リン脂質が固定化されている抗リン脂質抗体測定用試薬であって、(1)表面修飾物質が炭素数１４〜２２のアルキルアミンであり、不溶性担体がラテックス粒子であるか、又は(2)表面修飾物質が炭素数１４〜２２のアルキルアミン、ポリリジン、ベタイン修飾化ポリリジン及びアルキル基の炭素数が１〜３のポリアミノアルキル（メタ）アクリル酸並びにこれらの２種以上の混合物から成る群より選ばれる少なくとも１種であり、不溶性担体がゼラチン粒子である。Abstract Anti-phospholipid antibody measurement reagent that improves the efficiency of immobilizing highly hydrophobic phospholipid antigens on insoluble carriers more than conventional methods and realizes highly sensitive measurement methods that are strongly demanded by the clinic. It is disclosed. An antiphospholipid antibody measurement reagent is an antiphospholipid antibody measurement reagent in which a phospholipid is immobilized on an insoluble carrier in which at least one surface modification substance is bound to the surface, and (1) a surface modification substance Is an alkylamine having 14 to 22 carbon atoms and the insoluble carrier is latex particles, or (2) the carbon number of the alkylamine, polylysine, betaine-modified polylysine and alkyl group whose surface modifying substance is 14 to 22 carbon atoms Is at least one selected from the group consisting of 1 to 3 polyaminoalkyl (meth) acrylic acids and mixtures of two or more thereof, and the insoluble carrier is gelatin particles.
Description
本発明は、抗リン脂質抗体を測定するための、リン脂質固定化修飾不溶性担体試薬に関する。 The present invention relates to a phospholipid-immobilized modified insoluble carrier reagent for measuring antiphospholipid antibodies.
疾病の診断のため、カルジオリピン、リポタンパクと複合化したコレステロール等のリン脂質に対する血液・髄液中の抗体を測定することは臨床診断上不可欠となっている。特に梅毒検査法で用いられる抗リン脂質抗体測定は、梅毒の診断に不可欠である。 For diagnosis of diseases, it is indispensable in clinical diagnosis to measure antibodies in blood and cerebrospinal fluid against phospholipids such as cardiolipin and cholesterol complexed with lipoprotein. In particular, measurement of antiphospholipid antibodies used in the syphilis test method is indispensable for diagnosis of syphilis.
抗リン脂質抗体の測定方法としてはRPR(Rapid Plasma Regain)カード試験法、VDRL(Venereal Disease Research Lab)法、RST(Reagin Screening Test)法等が広く知られている。 As methods for measuring antiphospholipid antibodies, RPR (Rapid Plasma Regain) card test method, VDRL (Venereal Disease Research Lab) method, RST (Reagin Screening Test) method and the like are widely known.
現在用いられている最も代表的な梅毒検査法は、抗梅毒トレポネーマ(TP)抗体測定およびRPR法（Rapid Plasma Regain、凝集法）に代表される抗リン脂質抗体検査法であり、診断にはこれら2種類の検査法を組み合わせて用いられるのが一般的である。これら2種類の検査を組み合わせるのは、これらの検査結果が検査の時期や感染の経過によって必ずしも一致しないからである。例えば、TP抗体陰性で抗リン脂質抗体陽性の場合は、梅毒初期感染である可能性が高い。また、ＴＰ抗体陽性でかつ抗リン脂質抗体も陽性ならば、梅毒陽性と判断されるが、ＴＰ抗体は陽性で抗リン脂質抗体が陰性ならば、梅毒治癒後で抗体価が高い場合が考えられる。従って、抗リン脂質抗体測定が十分な感度で行われないと、感染初期及び予後の経過観察において誤った臨床判定が下される可能性がある。 The most typical syphilis tests currently used are anti-phospholipid antibody test methods such as anti-syphilis treponema (TP) antibody measurement and RPR method (Rapid Plasma Regain, agglutination method). It is common to use a combination of two types of inspection methods. These two types of tests are combined because the results of these tests do not necessarily match depending on the timing of the test and the course of infection. For example, when TP antibody is negative and antiphospholipid antibody is positive, there is a high possibility that the infection is early syphilis. If the TP antibody is positive and the antiphospholipid antibody is also positive, it is judged as syphilis positive. If the TP antibody is positive and the antiphospholipid antibody is negative, the antibody titer may be high after syphilis healing. . Therefore, if the antiphospholipid antibody measurement is not performed with sufficient sensitivity, an erroneous clinical judgment may be made in the follow-up of the early stage and prognosis of the infection.
近年、抗リン脂質抗体の測定方法において、リン脂質をラテックス粒子等の不活性担体に固定化し（リン脂質固定化担体）、これを緩衝液中に懸濁させた試薬が考案されている。この試薬を用いた方法では、粒子上に固定化されたリン脂質抗原に検体中の抗体が結合し、その結合抗体にさらに標識二次抗体が結合し、最終的には間接的に担体に結合した標識量が信号として感知される。この方法は臨床検査の自動化を目的としたもので、現在広く用いられている。 In recent years, in a method for measuring an antiphospholipid antibody, a reagent has been devised in which phospholipid is immobilized on an inert carrier such as latex particles (phospholipid-immobilized carrier) and suspended in a buffer solution. In the method using this reagent, the antibody in the sample binds to the phospholipid antigen immobilized on the particle, and the labeled secondary antibody further binds to the bound antibody, and finally indirectly binds to the carrier. The labeled amount is detected as a signal. This method is aimed at automating clinical tests, and is currently widely used.
一方、リン脂質は疎水性が高く、ラテックスやゼラチンのような負に荷電した担体には接近、吸着がしにくい傾向がみられ、リン脂質をこれらの担体にいかに効率よく固定化するかについて、これまで様々な工夫がなされた。 On the other hand, phospholipids are highly hydrophobic and tend to be difficult to approach and adsorb to negatively charged carriers such as latex and gelatin, and how to efficiently fix phospholipids to these carriers. Various ideas have been made so far.
その一例として、ラテックスをポリリジンで修飾し、VDRL法の感度を改良したデータが示されている（例えば特許文献１）。この感度上昇は、ラテックス表面のマイナス電荷をカチオンポリマーであるポリリジンで中和して疎水性を上昇させることにより、同じく疎水性のリン脂質をより接近・固定化しやすくした結果、固定されたリン脂質量が増加したためと考えられる。しかしポリリジンは使用条件がpH11以下に限定される等の欠点がある。また、特許文献１の実施例の表で示されている当該発明の効果は検体によって異なり、感度の上昇率も十分とは言いがたい。 As an example, data obtained by modifying the latex with polylysine and improving the sensitivity of the VDRL method is shown (for example, Patent Document 1). This increase in sensitivity is achieved by neutralizing the negative charge on the latex surface with polylysine, a cationic polymer, to increase hydrophobicity, thereby making hydrophobic phospholipids easier to approach and immobilize. It is thought that the amount increased. However, polylysine has drawbacks such as the use conditions being limited to pH 11 or less. In addition, the effect of the present invention shown in the table of Examples in Patent Document 1 varies depending on the specimen, and it is difficult to say that the rate of increase in sensitivity is sufficient.
また、例えば、４級アミノ基を有するポリアミンスルホンでプラスチック性のマイクロタイタープレートを処理して梅毒抗原を固定化し、梅毒陽性家兎の血清を測定したところ、処理を行わなかったプレートに比べ約６〜１７倍の吸光度が得られたことが示された（特許文献２ 表１）。しかしながら、同じ文献中のHBs抗原を用いて比較したデータでは、感度の上昇はいずれの希釈率においても約２倍またはそれ以下である。 In addition, for example, when a plastic microtiter plate was treated with polyamine sulfone having a quaternary amino group to immobilize syphilis antigens and the serum of syphilis positive rabbits was measured, it was about 6 compared with the plate not treated. It was shown that an absorbance of ˜17 times was obtained (Table 1 in Patent Document 2). However, in the data compared using HBs antigens in the same document, the sensitivity increase is about twice or less at any dilution.
不活性担体は、一般に負に荷電している。従って、タンパク質（一般に負に荷電）やリン脂質（疎水性）との結合効率を上げるためには、カチオン基や疎水性ポリマーで修飾して担体を中和させることが有効であることは当然に推定される。しかし上記の実施例データは、問題がそれほど単純ではなく実際には他の要素が複雑に関与して、なかなか推定どおりの効果が得られないことを示している。 Inert carriers are generally negatively charged. Therefore, in order to increase the binding efficiency with proteins (generally negatively charged) and phospholipids (hydrophobic), it is naturally effective to neutralize the carrier by modification with a cationic group or hydrophobic polymer. Presumed. However, the above example data shows that the problem is not so simple and in fact, other factors are involved in a complicated manner, and it is difficult to obtain the effect as estimated.
例えば、担体の疎水性を上げることを目的として使用されるポリマーは、担体への吸着を可能とするために一端が正に荷電し、もう一端はリン脂質との結合を可能にするために疎水性であるような構造のものが選択される。その場合、そのポリマーの吸着／結合効率及び免疫反応効率への影響はそれぞれのポリマーの分子量や、結合している官能基により微妙に異なってくる。例えばポリマーの長さが十分でない場合、担体への吸着／結合効率が低く、結果的に、期待するような免疫反応の感度上昇は見られない。しかしポリマー両端の距離を十分取るためにポリマーの分子量を上げ過ぎると、ポリマーの粘度が上がり、効果的な反応が困難となる（特許文献３）。また、ポリマーの構造によっては、測定対象となるタンパク質や脂質が担体上の抗原や抗体へ近づく際の物理的な障害となって、逆に反応効率を下げる場合もあり得る。 For example, a polymer used for the purpose of increasing the hydrophobicity of a carrier may be positively charged at one end to allow adsorption to the carrier and hydrophobic at the other end to allow binding to phospholipids. A structure that is characteristic is selected. In that case, the effect on the adsorption / binding efficiency and immune reaction efficiency of the polymer is slightly different depending on the molecular weight of each polymer and the functional group to which the polymer is bonded. For example, when the length of the polymer is not sufficient, the adsorption / binding efficiency to the carrier is low, and as a result, the sensitivity increase of the immune reaction is not expected. However, if the molecular weight of the polymer is increased too much in order to take a sufficient distance between both ends of the polymer, the viscosity of the polymer increases and an effective reaction becomes difficult (Patent Document 3). Depending on the structure of the polymer, the protein or lipid to be measured may become a physical obstacle when approaching the antigen or antibody on the carrier, and the reaction efficiency may be lowered.
これまでのような比較的穏やかな修飾の効果は、従来のプレートによる免疫測定法においては、プレート法自体が特に高感度とはいえないため、それほど問題にしてはこなかった。 The effect of the relatively mild modification as described above has not been so much a problem in the conventional immunoassay method using a plate because the plate method itself is not particularly sensitive.
しかし、抗体測定化学発光酵素免疫測定法においては、本来高感度であった放射性免疫測定法の流れにより、高感度性が強く求められており、抗リン脂質抗体の検出も例外ではない。また、前述のように、梅毒の診断の正確性を担保するためにも、できるだけ感度のよい測定系が望ましい。しかしそれらの要求に対し、これまでの行われた工夫や改良は必ずしも十分とは言えず、新たな工夫が求められている。 However, in the antibody measurement chemiluminescence enzyme immunoassay, high sensitivity is strongly demanded by the flow of the radioimmunoassay which was originally highly sensitive, and detection of antiphospholipid antibodies is no exception. In addition, as described above, a measurement system that is as sensitive as possible is desirable in order to ensure the accuracy of diagnosis of syphilis. However, in order to meet these demands, the devices and improvements made so far are not always sufficient, and new devices are required.
一方、上述のように、修飾の効果はごくわずかな条件の違いで大きく変わるため、一般論で規定される修飾方法を広く適用して、常に高感度を得ることができるとは考えにくく、再現性よく感度を上昇させるためには、担体や修飾物質の種類を設定する必要がある。しかしわずか数種の担体と修飾物質であっても、それらを組合せることにより、膨大な実験数が必要となるため、最適な組合せを見出すこと自体が困難である。
従って、本発明が解決しようとする課題は、疎水性が高いリン脂質抗原を不溶性担体へ固定化する効率を従来法よりもさらに高め、臨床から強く求められている、より高感度な測定法を実現する、抗リン脂質抗体測定用試薬を提供することである。 Therefore, the problem to be solved by the present invention is to further improve the efficiency of immobilizing a highly hydrophobic phospholipid antigen on an insoluble carrier as compared with the conventional method, and to provide a more sensitive measurement method that is strongly demanded from the clinic. It is to provide an antiphospholipid antibody measurement reagent that is realized.
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の不溶性担体の表面を特定の修飾物質で修飾した表面修飾不溶性担体にリン脂質を固定化した抗リン脂質抗体測定用試薬を用いて抗リン脂質抗体の免疫測定を行なうことにより、より高感度に抗リン脂質抗体を免疫測定できることを見出し、本発明を完成した。 As a result of diligent research, the inventors of the present application have used anti-phospholipid antibody measurement reagents in which a phospholipid is immobilized on a surface-modified insoluble carrier obtained by modifying the surface of a specific insoluble carrier with a specific modifying substance. As a result of the above immunoassay, it was found that the antiphospholipid antibody can be immunoassay with higher sensitivity, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は、少なくとも１種の表面修飾物質が表面に結合した不溶性担体に、リン脂質が固定化されている抗リン脂質抗体測定用試薬であって、(1)前記表面修飾物質が炭素数１４〜２２のアルキルアミンであり、前記不溶性担体がラテックス粒子であるか、又は(2) 前記表面修飾物質が炭素数１４〜２２のアルキルアミン、ポリリジン、ベタイン修飾化ポリリジン及びアルキル基の炭素数が１〜３のポリアミノアルキル（メタ）アクリル酸並びにこれらの２種以上の混合物から成る群より選ばれる少なくとも１種であり、前記不溶性担体がゼラチン粒子である、抗リン脂質抗体測定用試薬を提供する。また、本発明は、上記本発明の抗リン脂質抗体測定用試薬に含まれる前記リン脂質と、検体中のリン脂質抗体との抗原抗体反応を利用した免疫測定法により前記検体中のリン脂質抗体を測定することを含む、検体中のリン脂質抗体の免疫測定法を提供する。さらに、本発明は、上記したリン脂質固定化表面修飾不溶性担体の、抗リン脂質抗体測定用試薬の製造のための使用を提供する。 That is, the present invention provides an antiphospholipid antibody measuring reagent in which a phospholipid is immobilized on an insoluble carrier having at least one surface modifying substance bound to the surface, wherein (1) the surface modifying substance is carbon 14 to 22 alkylamine, and the insoluble carrier is latex particles, or (2) carbon number of the alkylamine, polylysine, betaine-modified polylysine and alkyl group having 14 to 22 carbon atoms as the surface modifying substance. Is a reagent for measuring an antiphospholipid antibody, wherein at least one selected from the group consisting of 1 to 3 polyaminoalkyl (meth) acrylic acids and a mixture of two or more thereof, wherein the insoluble carrier is gelatin particles To do. Further, the present invention provides a phospholipid antibody in the sample by an immunoassay utilizing an antigen-antibody reaction between the phospholipid contained in the antiphospholipid antibody measurement reagent of the present invention and a phospholipid antibody in the sample. An immunoassay for a phospholipid antibody in a specimen is provided. Furthermore, the present invention provides the use of the above-described phospholipid-immobilized surface-modified insoluble carrier for the production of a reagent for measuring an antiphospholipid antibody.
本発明によれば、現在用いられているラテックス粒子、ゼラチン粒子を担体とする抗リン脂質抗体免疫測定方法において、感度が大幅に改善され、臨床の求める高感度測定が可能となる。 According to the present invention, in the currently used anti-phospholipid antibody immunoassay method using latex particles and gelatin particles as a carrier, the sensitivity is greatly improved, and high-sensitivity measurement required by the clinic becomes possible.
本発明に用いる不溶性担体は、ラテックス粒子又はゼラチン粒子であり、その大きさ、形状、磁性の有無は、免疫反応に用いられるものであれば、特に制限はない。これらの粒子は数多く市販されており、例えばラテックス粒子としてはJSR社のIMMUTEX（登録商標）やmicromod社のmicromer（登録商標）等を挙げることができ、また、ゼラチン粒子はメドジェル社等から容易に入手できる。また、自家製の粒子を作製して使用することも可能である（特許文献４）。粒子の大きさは、好ましくは粒径0.5nm〜30μmで、より好ましくは2nm〜10μmである。形状は必ずしも球体とは限らず、立方体やペレット状等、その製法によって様々な形をとる可能性があり、それらのいずれも使用することができる。また、それらの形状で、孔や突起等を持つものを、粒子の表面積を増加する等の目的により用いることが可能である。抗リン脂質抗体の自動測定においては、特に後述の磁性粒子等を好ましく用いることができる。磁性粒子は、非磁性粒子と同様に、容易に市販のものを入手できるが、自家製のものを使用してもよい。なお、磁性粒子は、不溶性担体粒子にフェライト等の磁性物質を配合したものであり、免疫測定の分野において広く用いられているものであり、市販されているものである。 The insoluble carrier used in the present invention is latex particles or gelatin particles, and the size, shape, and presence / absence of magnetism are not particularly limited as long as they are used for immune reactions. Many of these particles are commercially available. Examples of latex particles include JSR IMMUTEX (registered trademark) and micromod micromer (registered trademark). Gelatin particles can be easily obtained from Medgel. Available. Moreover, it is also possible to produce and use homemade particles (Patent Document 4). The size of the particle is preferably a particle size of 0.5 nm to 30 μm, more preferably 2 nm to 10 μm. The shape is not necessarily a sphere, and may have various shapes such as a cube or a pellet depending on the manufacturing method thereof, and any of them can be used. Further, those having a shape such as a hole or a protrusion can be used for the purpose of increasing the surface area of the particles. In the automatic measurement of antiphospholipid antibodies, magnetic particles described later can be preferably used. Similar to non-magnetic particles, commercially available magnetic particles can be easily obtained, but homemade particles may also be used. The magnetic particles are those obtained by blending insoluble carrier particles with a magnetic substance such as ferrite, and are widely used in the field of immunoassay and are commercially available.
上記不溶性担体粒子の表面には、表面修飾物質が結合されている。表面修飾物質は、不溶性担体粒子の表面を修飾して、疎水性が高いリン脂質抗原を不溶性担体へ固定化する効率を高めることに役立つ。 A surface modifying substance is bound to the surface of the insoluble carrier particles. The surface modifying substance is useful for modifying the surface of the insoluble carrier particles to increase the efficiency of immobilizing the highly hydrophobic phospholipid antigen to the insoluble carrier.
不溶性担体粒子がラテックス粒子の場合には、表面修飾物質は、炭素数１４〜２２のアルキルアミン、好ましくはオクタデシルアミンである。なお、炭素数１４〜２２のアルキルアミンは、複数種類のものを混合して用いることもできる。 When the insoluble carrier particles are latex particles, the surface modifier is an alkylamine having 14 to 22 carbon atoms, preferably octadecylamine. In addition, a C14-C22 alkylamine can also be used in mixture of multiple types.
不溶性担体粒子がゼラチン粒子の場合には、表面修飾物質は、炭素数１４〜２２のアルキルアミン、ポリリジン、ベタイン修飾化ポリリジン及びアルキル基の炭素数が１〜３のポリアミノアルキル（メタ）アクリル酸並びにこれらの２種以上の混合物から成る群より選ばれる少なくとも１種である。ここで、炭素数１４〜２２のアルキルアミンとしては、オクタデシルアミンが好ましい。ポリリジンの平均分子量（粘度平均分子量）は、通常、4,000〜300,000程度、好ましくは10,000〜100,000程度である。ベタインは、トリアルキルアミノ酸（アルキル基の炭素数は好ましくは１〜３）であり、好ましくはトリメチルグリシンである。また、「（メタ）アクリル酸」は、メタクリル酸及びアクリル酸を意味する。アルキル基の炭素数が１〜３のポリアミノアルキル（メタ）アクリル酸としては、ポリアミノエチルメタクリル酸が好ましい。ポリアミノアルキル（メタ）アクリル酸の平均分子量（数平均分子量）は、通常10,000〜150,000程度、好ましくは10,000〜50,000程度である。 When the insoluble carrier particles are gelatin particles, the surface modifying material includes alkylamine having 14 to 22 carbon atoms, polylysine, betaine modified polylysine, polyaminoalkyl (meth) acrylic acid having 1 to 3 carbon atoms in the alkyl group, and It is at least one selected from the group consisting of a mixture of two or more of these. Here, as the alkylamine having 14 to 22 carbon atoms, octadecylamine is preferable. The average molecular weight (viscosity average molecular weight) of polylysine is usually about 4,000 to 300,000, preferably about 10,000 to 100,000. Betaine is a trialkylamino acid (the alkyl group preferably has 1 to 3 carbon atoms), and is preferably trimethylglycine. “(Meth) acrylic acid” means methacrylic acid and acrylic acid. As the polyaminoalkyl (meth) acrylic acid having 1 to 3 carbon atoms in the alkyl group, polyaminoethyl methacrylic acid is preferable. The average molecular weight (number average molecular weight) of polyaminoalkyl (meth) acrylic acid is usually about 10,000 to 150,000, preferably about 10,000 to 50,000.
上記表面修飾物質は市販されているので、市販のものを用いてもよく、あるいは合成してもよい。例えばポリアミノエチルメタクリル酸は２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩とジメチルホルムアミドを重合して作製することができる。重合の方法はこの分野においては周知であり、下記実施例にも具体的に記載されている。 Since the surface modifying substance is commercially available, a commercially available substance may be used or synthesized. For example, polyaminoethyl methacrylic acid can be prepared by polymerizing 2-aminoethyl methacrylate hydrochloride and dimethylformamide. Polymerization methods are well known in the art and are also specifically described in the examples below.
ベタインをポリリジンに修飾する手段としてはカルボジイミド(Ｒ-Ｎ=Ｃ=Ｎ-Ｒ)を持つ水溶性架橋剤（水溶性カルボジイミド；ＷＳＣ）例えば1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩やN−シクロヘキシル−N'−(2−モルフォリノエチル)カルボジイミド・メト−p−トルエンスルホン酸塩などによる反応を用いることができる。WSCを用いる結合はこの分野において周知であり、下記実施例にも記載されているように、市販の試薬を用いて簡便に行うことができる。 As a means for modifying betaine to polylysine, a water-soluble crosslinking agent (water-soluble carbodiimide; WSC) having a carbodiimide (RN—C═N—R) such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide A reaction with hydrochloride, N-cyclohexyl-N ′-(2-morpholinoethyl) carbodiimide / meth-p-toluenesulfonate, or the like can be used. Binding using WSC is well known in the art and can be conveniently performed using commercially available reagents as described in the Examples below.
粒子の修飾は、従来から用いられている物理的吸着や、WSCを用いた共有結合によって行うことができる。これら吸着や共有結合による修飾方法は、この分野において周知であり、下記実施例にもWSCを用いた共有結合の例が記載されている。共有結合による修飾は、結合が安定で、その後の反応条件にほとんど制限がないため、望ましい。 The modification of the particles can be performed by conventionally used physical adsorption or covalent bonding using WSC. These modification methods by adsorption or covalent bond are well known in this field, and examples of covalent bonds using WSC are also described in the following examples. Covalent modification is desirable because the bond is stable and there are few restrictions on subsequent reaction conditions.
上記表面修飾不溶性担体粒子には、リン脂質が固定化される。固定化されるリン脂質は、測定しようとする抗リン脂質抗体の対応抗原である。測定すべき抗リン脂質抗体は、リン脂質に対する抗体であればいずれのものでもよく、従来から免疫測定されている抗リン脂質抗体のいずれのものでもよい。リン脂質の好ましい例としては、カルジオリピン、レシチン及びリポタンパクと複合化したコレステロール（LDLコレステロール、HDLコレステロール、VLDLコレステロール、CMコレステロール等）から成る群より選ばれる少なくとも１種を挙げることができ、これらの２種又は３種以上の混合物も好ましい。 A phospholipid is immobilized on the surface-modified insoluble carrier particles. The phospholipid to be immobilized is a corresponding antigen of the antiphospholipid antibody to be measured. The antiphospholipid antibody to be measured may be any antibody as long as it is an antibody against phospholipid, and any antiphospholipid antibody that has been immunoassayed conventionally. Preferred examples of the phospholipid include at least one selected from the group consisting of cardiolipin, lecithin, and cholesterol complexed with lipoprotein (LDL cholesterol, HDL cholesterol, VLDL cholesterol, CM cholesterol, etc.). A mixture of two or more kinds is also preferred.
リン脂質は、通常、従来と同様、物理吸着により固定化される。リン脂質の物理吸着の条件は周知であり、例えば、不溶性担体粒子の懸濁液にリン脂質溶液を加え、室温〜３７℃で0.5時間〜２時間転倒混和又は撹拌することにより行なうことができる（下記実施例参照）。 The phospholipid is usually immobilized by physical adsorption as in the conventional case. The conditions for physical adsorption of phospholipids are well known and can be carried out, for example, by adding a phospholipid solution to a suspension of insoluble carrier particles and inverting or stirring at room temperature to 37 ° C. for 0.5 to 2 hours ( See example below).
リン脂質を固定化した不溶性担体粒子は、非特異吸着を防止するため、マスキング（ブロッキング）を行なうことが好ましい。マスキング（ブロッキング）は、表面修飾不溶性担体粒子上の、リン脂質抗原で被覆されていない部位をタンパク質等でマスキングすることであり、この免疫測定用の抗原固定化担体に対して通常行なわれている。マスキングに用いるタンパク質は、従来と同様でよく、通常、アルブミン（ウシ血清アルブミン(BSA)等）、スキムミルク、カゼイン等が用いられる。マスキングは、従来と全く同様に行なうことができ、下記実施例にも具体的に記載されている。 The insoluble carrier particles on which the phospholipid is immobilized are preferably masked (blocked) to prevent non-specific adsorption. Masking (blocking) is to mask a portion of the surface-modified insoluble carrier particle that is not coated with a phospholipid antigen with a protein or the like, and is usually performed on an antigen-immobilized carrier for immunoassay. . The protein used for masking may be the same as the conventional one, and albumin (such as bovine serum albumin (BSA)), skim milk, casein and the like are usually used. Masking can be performed in the same manner as in the prior art, and is specifically described in the following examples.
リン脂質を固定化した粒子は、抗リン脂質抗体を免疫測定するための抗原感作粒子として従来と全く同様にして用いられる。抗リン脂質抗体の測定方法は、担体を用いる免疫測定方法であればいずれの方法でもよい。例えば下記実施例に記載されている、サンドイッチ法の１種である化学発光酵素免疫測定法や、フローメトリーによる免疫測定法など、シグナル検出の方法に限定されずに広く用いることができる。また、本発明は、抗リン脂質抗体の定量的測定における高感度化を課題としたものであるが、定性試験（検出）においても同じく高感度化を目的として使用することができる。従って、本発明における「測定」は定量と検出の両者を包含する。 The phospholipid-immobilized particles are used in the same manner as in the past as antigen-sensitized particles for immunoassay of anti-phospholipid antibodies. The method for measuring the antiphospholipid antibody may be any method as long as it is an immunoassay method using a carrier. For example, it can be widely used without being limited to a signal detection method such as a chemiluminescent enzyme immunoassay method, which is one of the sandwich methods described in the Examples below, and an immunoassay method by flowmetry. In addition, the present invention is aimed at increasing sensitivity in quantitative measurement of antiphospholipid antibodies, but can also be used for the purpose of increasing sensitivity in qualitative tests (detection). Therefore, “measurement” in the present invention includes both quantification and detection.
免疫測定自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、上記したリン脂質固定化粒子を検体と接触させ、洗浄後、抗リン脂質抗体と抗原抗体反応する抗体を反応させ、洗浄後、粒子に結合した抗体を測定する。抗体を酵素、蛍光物質、放射性物質、ビオチン等で標識しておくことにより粒子に結合した抗体を測定することができる。それぞれ異なる濃度の抗リン脂質抗体を含む、濃度既知の複数の標準試料について上記方法により抗リン脂質抗体を測定し、測定された標識量と標準試料中の抗リン脂質抗体の関係に基づき検量線を作成し、未知濃度の検体についての測定結果をこの検量線に当てはめることにより、検体中の抗リン脂質抗体を定量することができる。標識として、化学発光物質を生成する反応を触媒する酵素を用い、基質として化学発光物質を生成する物質を用いるサンドイッチ法が化学発光酵素免疫測定法であり、この方法によれば、酵素免疫測定の中でも特に高感度な免疫測定が可能になる。粒子として磁性粒子を用いる化学発光酵素免疫測定法は、自動化装置が市販されており、市販の自動化装置を用いて簡便、高感度に免疫測定を行なうことができる（下記実施例参照）。 The immunoassay itself is well known and need not be described in this specification, but briefly described, for example, in the sandwich method, the above-described phospholipid-immobilized particles are brought into contact with the specimen, washed, and then anti-phospholipid antibody. The antibody that reacts with the antigen-antibody is reacted, and after washing, the antibody bound to the particles is measured. The antibody bound to the particles can be measured by labeling the antibody with an enzyme, a fluorescent substance, a radioactive substance, biotin or the like. The antiphospholipid antibody is measured by the above method for a plurality of standard samples of known concentrations including antiphospholipid antibodies of different concentrations, and a calibration curve is based on the relationship between the measured labeling amount and the antiphospholipid antibody in the standard sample. And applying the measurement result of the sample of unknown concentration to the calibration curve, the antiphospholipid antibody in the sample can be quantified. A sandwich method using an enzyme that catalyzes a reaction that generates a chemiluminescent substance as a label and a substance that generates a chemiluminescent substance as a substrate is a chemiluminescent enzyme immunoassay. According to this method, an enzyme immunoassay is performed. In particular, highly sensitive immunoassay becomes possible. An automated apparatus is commercially available for chemiluminescent enzyme immunoassay using magnetic particles as particles, and immunoassay can be performed simply and with high sensitivity using a commercially available automated apparatus (see Examples below).
以下、本発明を実施例及び比較例に基づき本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described based on Examples and Comparative Examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
I. リン脂質固定化表面修飾不溶性担体粒子の調製
１． 表面修飾物質の調製
(1) 500 mLのナスフラスコに2-アミノエチルメタクリレート塩酸塩（ポリサイエンス社）16.6 g（500 mM）、200 mLのジメチルホルムアミド（和光純薬工業（株））を入れ、更に重合開始剤であるAIBN(2, 2'-アゾイソブチロニトリル）（和光純薬工業（株）（株））100 mgを加えた。これに、冷却管とアルゴンガスで満たしたバルーンを三方コックを用いて接続し、三方コックの残されたラインに真空ポンプを接続した。真空ポンプでフラスコを１分以上吸引して減圧した後、三方コックを切り替えてアルゴンガスをフラスコに導いた。この操作を３回行い、十分にフラスコ内をアルゴンガスに置換した。置換終了後、フラスコをオイルバスに浸け65℃に加温し、３時間激しく攪拌した。I. Preparation of phospholipid-immobilized surface-modified insoluble carrier particles Preparation of surface modifiers
(1) Place 16.6 g (500 mM) of 2-aminoethyl methacrylate hydrochloride (Polysciences) and 200 mL of dimethylformamide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in a 500 mL eggplant flask, and use a polymerization initiator. AIBN (2, 2′-azoisobutyronitrile) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 mg was added. A cooling tube and a balloon filled with argon gas were connected to this using a three-way cock, and a vacuum pump was connected to the remaining line of the three-way cock. After reducing the pressure by sucking the flask with a vacuum pump for 1 minute or longer, the three-way cock was switched to introduce argon gas into the flask. This operation was performed three times, and the inside of the flask was sufficiently replaced with argon gas. After completion of the replacement, the flask was immersed in an oil bath and heated to 65 ° C. and stirred vigorously for 3 hours.
反応終了後、反応液をエバポレーターで1/10量まで濃縮し、濃縮終了後、分画分子量10000の透析チューブで２日間超純水に対して透析を行った。 After completion of the reaction, the reaction solution was concentrated to 1/10 volume with an evaporator, and after completion of concentration, dialyzed against ultrapure water for 2 days with a dialysis tube having a molecular weight cut off of 10,000.
透析終了後、目的物を凍結乾燥し、約12 gを得た。平均分子量は45000であった。なお、平均分子量は、以下の条件により測定した。
カラム：G4000PWXL（東ソー社製）
溶媒：臭化リチウム10mMを含有するアセトニトリル溶液
検出装置：示差屈折計After completion of dialysis, the target product was lyophilized to obtain about 12 g. The average molecular weight was 45000. The average molecular weight was measured under the following conditions.
Column: G4000PWXL (manufactured by Tosoh Corporation)
Solvent: Acetonitrile solution containing 10 mM lithium bromide Detector: Differential refractometer
上記方法と同様に重合を行い、ポリ[２−アミノエチルメタクリル-ビニルピリジン]、ポリ[２-アミノエチルメタクリル-ビニルイミダゾール]、ポリ[２-アミノエチルメタクリル-メタクリロキシエチル トリメチルアンモニウム塩酸]を作製した。製造物質、開始材料、重合剤、収量、及び平均分子量を以下にまとめた。 Polymerization is carried out in the same manner as above to produce poly [2-aminoethyl methacryl-vinyl pyridine], poly [2-aminoethyl methacryl-vinyl imidazole], poly [2-aminoethyl methacryl-methacryloxyethyl trimethyl ammonium hydrochloride]. did. The production materials, starting materials, polymerizing agent, yield, and average molecular weight are summarized below.
(2) ポリリジン・臭化水素酸塩（(株)ペプチド研究所）200 mgとベタイン（トリメチルグリシン、和光純薬工業（株））224mgを水10mLに溶解し、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩（同仁化学）552 mgを加え室温で一夜撹拌した。反応液に1-エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩272 mgを追加し、さらに約5時間撹拌した。反応液を透析用セルロースチューブ（三光純薬（株））に移して、はじめ水に対して透析し、続いて6 mM塩酸に対して一夜透析した。その後透析チューブ内の液を凍結乾燥し、収量118.9 mgを得た。 (2) Dissolve 200 mg of polylysine / hydrobromide (Peptide Institute, Inc.) and 224 mg of betaine (trimethylglycine, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 10 mL of water, and add 1-ethyl-3- (3 -Dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (Dojindo) 552 mg was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature. To the reaction mixture, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride 272 mg was added, and the mixture was further stirred for about 5 hours. The reaction solution was transferred to a dialysis cellulose tube (Sanko Junyaku Co., Ltd.), first dialyzed against water, and then dialyzed overnight against 6 mM hydrochloric acid. Thereafter, the liquid in the dialysis tube was freeze-dried to obtain a yield of 118.9 mg.
２． 担体の修飾
(1) ポリアミノエチルメタクリル酸(Poly(AEM))によるゼラチン粒子の修飾
5％磁性ゼラチン粒子(自家製、特許文献５) 1mLを蒸留水1mLで3回すすぎ、10mM MES (pH 5.5) 1mLに置換した。これに、上記で作製したポリ(2-アミノエチルメタクリル酸）25mgを加えて溶解し、更に水溶性カルボジイミド(1-エチル-3-(3-[11]ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸）（同仁化学社製）100mgを加えて3時間激しく攪拌した。これを蒸留水1mLで３回すすぎ、蒸留水1 mLに置換して、5%塩基性ポリマー修飾粒子懸濁液とした。この液0.15 mLを蒸留水1 mLで3回、44％エタノールで2回濯いだ後、蒸留水0.45 mLに置換し、修飾粒子懸濁液とした。2. Modification of carrier
(1) Modification of gelatin particles with polyaminoethylmethacrylic acid (Poly (AEM))
1 mL of 5% magnetic gelatin particles (homemade, Patent Document 5) was rinsed 3 times with 1 mL of distilled water and replaced with 1 mL of 10 mM MES (pH 5.5). To this, 25 mg of the poly (2-aminoethylmethacrylic acid) prepared above was added and dissolved, and water-soluble carbodiimide (1-ethyl-3- (3- [11] dimethylaminopropyl) carbodiimide / hydrochloric acid) 100 mg) was added and stirred vigorously for 3 hours. This was rinsed 3 times with 1 mL of distilled water and replaced with 1 mL of distilled water to obtain a 5% basic polymer-modified particle suspension. 0.15 mL of this solution was rinsed 3 times with 1 mL of distilled water and twice with 44% ethanol, and then replaced with 0.45 mL of distilled water to obtain a modified particle suspension.
(2) その他の修飾
上記と同様の工程で、理論的に可能性のある様々な物質（下記ａ〜ｇ）で、磁性ラテックス粒子と磁性ゼラチン粒子を修飾した。表面修飾物質は、上記１（表１参照）で作製したもの、および市販品を用いた。粒子と表面修飾物質の割合は粒子を1.5から2.0倍（重量比）とした。(2) Other modifications Magnetic latex particles and magnetic gelatin particles were modified with various theoretically possible substances (a to g below) in the same process as described above. As the surface modifier, those prepared in 1 above (see Table 1) and commercially available products were used. The ratio of the particles to the surface modifying substance was 1.5 to 2.0 times (weight ratio).
ａ ポリ-L-リジン(PL)((株)ペプチド研究所製)
ｂ ベタイン化ポリリジン(BPL)（上記１(2)）
ｃ オクタデシルアミン(ODA)(和光純薬工業（株）製)
ｄ ポリ[2-アミノエチルメタクリル酸](Poly(AEM))（上記１(1)）
ｅ ポリ[2-アミノエチルメタクリル-ビニルピリジン]（Poly(2-aminoethylmethacryl-co-vinyl pyridine)）（上記１(1)、表１）
ｆ ポリ[2-アミノエチルメタクリル-ビニルイミダゾール]（Poly(2-aminoethylmethacryl-co-vinyl imidazole)）（上記１(1)、表１）
ｇ ポリ[2-アミノエチルメタクリル−メタクリロキシエチルトリメチルアンモニウム塩酸]（Poly(2-aminoethylmethacryl-co-methacryloxyethyl trimethylammonium-HCl) （上記１(1)、表１）a Poly-L-Lysine (PL) (Peptide Institute, Inc.)
b Betainated polylysine (BPL) (1 (2) above)
c Octadecylamine (ODA) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
d Poly [2-aminoethylmethacrylic acid] (Poly (AEM)) (1 (1) above)
e Poly [2-aminoethylmethacryl-co-vinyl pyridine] (1 (1) above, Table 1)
f Poly [2-aminoethylmethacryl-co-vinyl imidazole] (1 (1) above, Table 1)
g Poly [2-aminoethylmethacryl-co-methacryloxyethyl trimethylammonium-HCl] (above 1 (1), Table 1)
３． 担体の抗原感作及びマスキング
(1) 抗原感作
5 mg/mLカルジオリピン−エタノール溶液(SIGMA) を0.041 mL、10 mg/mLに作製したレシチン(卵黄製)(ナカライテスク株式会社)‐エタノール溶液を 0.206 mL、10 mg/mLに作成したコレステロール(ナカライテスク株式会社)−エタノール溶液 0.062 mLを混合し、計0.35 mLの混合リン脂質抗原液とした。3. Antigen sensitization and masking of carriers
(1) Antigen sensitization
5 mg / mL cardiolipin-ethanol solution (SIGMA) prepared in 0.041 mL, 10 mg / mL lecithin (yolk) (Nacalai Tesque)-ethanol solution prepared in 0.206 mL, 10 mg / mL cholesterol (Nacalai Tesque Corporation) -ethanol solution 0.062 mL was mixed to obtain a total of 0.35 mL of mixed phospholipid antigen solution.
上記２で調製した修飾粒子懸濁液１４種類（修飾物質７種類×担体２種類）の各液粒子に抗原を吸着させた。すなわち、各修飾粒子懸濁液（0.45mL)を攪拌しながら、混合リン脂質抗原液を加え、水浴型超音波処理機にて約３０秒間超音波処理した後、37℃で1時間転倒混和し、粒子にリン脂質抗原を吸着させ、感作粒子懸濁液とした。また、比較のため、非修飾粒子（ラテックス、ゼラチン）もそれぞれ修飾粒子と同様に感作した（「感作粒子懸濁液」と呼ぶ）。 The antigen was adsorbed to each of the 14 kinds of modified particle suspensions prepared in 2 above (7 kinds of modifying substances × 2 kinds of carriers). That is, while stirring each modified particle suspension (0.45 mL), add the mixed phospholipid antigen solution, sonicate for about 30 seconds with a water bath sonicator, and mix by inverting at 37 ° C for 1 hour. The phospholipid antigen was adsorbed on the particles to obtain a sensitized particle suspension. For comparison, unmodified particles (latex, gelatin) were sensitized in the same manner as the modified particles (referred to as “sensitized particle suspension”).
(2) マスキング
上記感作粒子懸濁液を50 mM Tris-HCl (pH 7.2)、150 mM NaCl溶液1 mLですすいだ後、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、150 mM NaCl、１% BSA(SIGMA)、0.1％ NaN3溶液1 mLに置換し、37℃で1晩転倒混和した。0.375 mLの同溶液に置換し、2wt%感作・マスキング粒子とした。(2) Masking After rinsing the sensitized particle suspension with 1 mL of 50 mM Tris-HCl (pH 7.2) and 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% BSA (SIGMA) was replaced with 1 mL of a 0.1% NaN 3 solution, and mixed by inverting at 37 ° C. overnight. The solution was replaced with 0.375 mL of the same solution to obtain 2 wt% sensitizing / masking particles.
II. 測定と結果
１． 測定
上記Iで調製した2wt%感作・マスキング粒子を、150 mM NaCl、0.1% NaN3、１% BSAで100倍希釈したもの0.25 mLを固相とした。また、0.1 mg/L抗ヒトIgG-アルカリフォスファターゼ標識体、0.1 mg/L抗ヒトIgM-アルカリフォスファターゼ標識体、100 mM NaCl、0.1% NaN3、1% BSA溶液0.35 mLを標識相とした。II. Measurements and results Measurement The 2 wt% sensitized / masking particles prepared in I above were diluted 100-fold with 150 mM NaCl, 0.1% NaN 3 , 1% BSA, and 0.25 mL was used as the solid phase. Moreover, 0.15 mg / L anti-human IgG-alkaline phosphatase labeled substance, 0.1 mg / L anti-human IgM-alkaline phosphatase labeled substance, 100 mM NaCl, 0.1% NaN 3 , and 0.35 mL of 1% BSA solution were used as the labeled phase.
RPR陰性血清４例（Aries Diagnostics GmbH）、RPR陽性血清４例（ProMedDx社）、陽性コントロール血清（富士レビオ株式会社)を検体とし、検体中の抗リン脂質抗体を、市販の自動分析装置を用い、発光酵素免疫測定により定量した。すなわち、それぞれルミパルス検体希釈液(富士レビオ株式会社)で１０倍希釈したもの20μLを検体として、ルミパルスフォルテ(富士レビオ株式会社)において2ステップ20μLモードにて測定した。カットオフインデックスの算出は、検体測定発光カウントを陽性コントロール測定発光カウントにカットオフ係数0.22を乗じたもので除して求めた。 Using 4 RPR-negative sera (Aries Diagnostics GmbH), 4 RPR-positive sera (ProMedDx), and positive control serum (Fujirebio Inc.) as samples, anti-phospholipid antibodies in the samples were analyzed using a commercially available automated analyzer. Quantified by luminescent enzyme immunoassay. That is, 20 μL each diluted 10 times with Lumipulse sample diluent (Fujirebio Co., Ltd.) was used as a sample, and measurement was performed in Lumipulse Forte (Fujirebio Co., Ltd.) in a 2-step 20 μL mode. The cut-off index was calculated by dividing the sample measurement luminescence count by the positive control measurement luminescence count multiplied by a cutoff factor of 0.22.
２． 結果
(1) ラテックス粒子
ラテックス粒子の結果の一部を下記表２にまとめた。Ｃはシグナルカウント数、S/N(signal/noise)は、各シグナルカウント(C)を陰性検体のシグナルカウントの平均値で割ったものでノイズの上昇による見かけの感度上昇を排除している。各修飾粒子の感度比較は陽性検体のS/Nの平均（「平均S/N値」）で行った。2. result
(1) Latex particles Some results of latex particles are summarized in Table 2 below. C is the signal count number, and S / N (signal / noise) is obtained by dividing each signal count (C) by the average value of the signal count of the negative sample, and eliminates an increase in apparent sensitivity due to an increase in noise. The sensitivity comparison of each modified particle was performed by the average of S / N (“average S / N value”) of positive specimens.
非修飾粒子（比較例）では陽性検体は陰性検体平均の17.4倍のシグナル値、即ち、S/N値は17.4であった。各修飾粒子の陽性サンプルS/N値をこの非修飾での値と比較すると、ポリリジン(PL)、ベタイン化ポリリジン(BPL)、ポリアミノエチルメタクリル酸(poly(AEM))ではシグナル上昇が見られたものの、非修飾粒子（比較例）の２倍程度の上昇にとどまった。特にポリリジンとベタイン化ポリリジンでは各検体のシグナル値がほとんど同じで、ポリリジンをベタイン化した効果はほとんど見出せなかった。同じベタイン化ポリリジンで修飾したゼラチン粒子はポリリジンのみで修飾したものより感度が上昇していたことから（下記）、ポリリジンへのベタイン化が失敗したのではなく、ラテックス粒子においてはベタインの効果が現れないことが示唆された。 In the unmodified particles (comparative example), the positive sample had a signal value 17.4 times the average of the negative sample, that is, the S / N value was 17.4. When the positive sample S / N value of each modified particle was compared with this unmodified value, there was an increase in signal for polylysine (PL), betanized polylysine (BPL), and polyaminoethylmethacrylic acid (poly (AEM)). However, the increase was only about twice that of unmodified particles (comparative example). In particular, the signal value of each specimen was almost the same between polylysine and betaineated polylysine, and the effect of betaineating polylysine was hardly found. Gelatin particles modified with the same betainized polylysine had higher sensitivity than those modified with polylysine alone (below), so betaine conversion to polylysine did not fail, and betaine was effective in latex particles. Not suggested.
一方オクタデシルアミン(ODA)で修飾した粒子は、S/N値106.5で、非修飾（比較例）の約６倍を示し、明らかな効果が確認できた。 On the other hand, particles modified with octadecylamine (ODA) showed an S / N value of 106.5, which was about 6 times that of the unmodified (comparative example), confirming the clear effect.
その他の修飾粒子（上記I. 2(2)、ｅ〜ｇ）ではS/Nが非修飾粒子（比較例）とほとんど同じかむしろ低下しており、期待したような効果は得られなかった（表には示していない）。 In other modified particles (I.2 (2), e to g), S / N was almost the same as that of unmodified particles (comparative example) or rather decreased, and the expected effect was not obtained ( Not shown in the table).
(3) ゼラチン粒子
不溶性担体としてゼラチン粒子を用いた場合の結果を下記表３に示す。(3) Gelatin particles Table 3 shows the results when gelatin particles were used as the insoluble carrier.
表３に示されるように、ゼラチン粒子では、ラテックス粒子に比べ、修飾の効果が顕著であった。非修飾粒子（比較例）の陽性検体S/Nの平均値3.2に対し、ポリリジン(PL)では33.7(10.5倍)、ベタイン化ポリリジン(BPL)では46.5(14.5倍)、ポリアミノエチルメタクリル酸(poly(AEM))では75.7(23.7倍)、オクタデシルアミン(ODA)では161.4(50.4倍）を示した。また、ポリリジンよりもベタイン化ポリリジンのほうが、S/N値が上昇しており、ラテックスではほとんど示されなかったベタイン化の効果が現れていた。 As shown in Table 3, the modification effect was remarkable in the gelatin particles as compared with the latex particles. The average value of positive sample S / N of non-modified particles (comparative example) is 3.2, 33.7 (10.5 times) for polylysine (PL), 46.5 (14.5 times) for betalyzed polylysine (BPL), polyaminoethylmethacrylic acid (poly (AEM)) showed 75.7 (23.7 times) and octadecylamine (ODA) showed 161.4 (50.4 times). In addition, betaine polylysine had a higher S / N value than polylysine, and the effect of betainization that was hardly exhibited in latex appeared.
その他の修飾粒子（上記I.2(2)、ｅ〜ｇ）ではラテックス粒子と同様、S/N値が非修飾粒子（比較例）とほとんど同じかむしろ低下しており、期待したような効果は得られなかった（データ示さず）。 The other modified particles (I.2 (2), eg) have similar S / N values to those of the non-modified particles (comparative example), as well as the latex particles. Was not obtained (data not shown).
本願発明による担体は、高密度にリン脂質を結合しているため、抗リン脂質抗体の高感度測定試薬として使用できる。 Since the carrier according to the present invention binds phospholipids at high density, it can be used as a highly sensitive measurement reagent for anti-phospholipid antibodies.
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