JPWO2007125822A1 - Complex for drug screening - Google Patents
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Abstract
担体、生理活性物質、及びタンパク質を含む複合体であって、担体は生理活性物質と結合しており、生理活性物質はタンパク質と親和性を持ち、その親和性によってタンパク質と結合しており、タンパク質は発光物質又は蛍光物質で標識されている複合体、並びにこの複合体を用いた薬剤のスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法は、病気の原因となるタンパク質に作用するが、強い副作用を持つことから、医薬品として利用できない化合物を有効に利用して、薬剤の効率的な探索を可能にする。A complex comprising a carrier, a physiologically active substance, and a protein, wherein the carrier is bound to the physiologically active substance, the physiologically active substance has an affinity for the protein, and is bound to the protein by the affinity. Provides a complex labeled with a luminescent substance or a fluorescent substance, and a method for screening a drug using the complex. This screening method acts on a protein causing disease, but has a strong side effect, and thus enables efficient search for a drug by effectively using a compound that cannot be used as a drug.
Description
本発明は、生理活性物質のスクリーニングに有効な複合体、およびそれを用いた薬剤スクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a complex effective for screening of physiologically active substances, and a drug screening method using the same.
製薬会社を中心に行われている従来の薬剤探索方法は、標的とする酵素の活性の測定あるいは標的レセプターとの結合定数の測定、さらには様々な生細胞系での応答反応による生化学的な指標による評価で行われている。そのため、中には詳細な作用機構がわからないことにより、強い副作用、毒性がみられるなどの問題が起きている。また、病気の原因となるタンパク質に作用しつつも強い副作用により開発途中でドロップアウトし、臨床に進めない化合物が数多存在する。すなわち、標的酵素・レセプタータンパク質等に対する薬剤の効率的な探索方法が望まれている。 Conventional drug discovery methods, mainly performed by pharmaceutical companies, measure the activity of the target enzyme, measure the binding constant with the target receptor, and biochemical methods based on response reactions in various living cell systems. The evaluation is based on indicators. For this reason, there are problems such as strong side effects and toxicity due to the lack of detailed mechanism of action. In addition, there are many compounds that drop out during development due to strong side effects while acting on proteins that cause illness, and cannot proceed to clinical practice. That is, there is a demand for an efficient drug search method for target enzymes and receptor proteins.
ところで、本発明者らは、フェライトナノ微粒子を有機ポリマーで被覆した磁性ビーズを開発している（特許文献１）。この磁性ビーズは、磁気力によって分離、回収が可能なので、タンパク質などの高速、自動スクリーニングを可能にするものとして期待されている。 By the way, the present inventors have developed magnetic beads in which ferrite nanoparticles are coated with an organic polymer (Patent Document 1). Since these magnetic beads can be separated and recovered by magnetic force, they are expected to enable high-speed, automatic screening of proteins and the like.
本発明は生理活性物質のスクリーニングに有効な複合体、およびそれを用いた薬剤のスクリーニング方法を提供するものである。本発明によれば、例えば、病気の原因となるタンパク質に作用するが、強い副作用を持つことから、医薬品として利用できない数多の化合物およびその化合物の誘導体を有効に利用し、薬剤の候補となる化合物を効率的に探索することが可能になる。本発明の複合体を用いてスクリーニングを行うことにより、新しい医薬等の効率的な開発が可能になる。 The present invention provides a complex effective for screening of a physiologically active substance, and a method for screening a drug using the same. According to the present invention, for example, it acts on a protein that causes disease, but has strong side effects, and thus effectively uses a large number of compounds that cannot be used as pharmaceuticals and derivatives of the compounds to become drug candidates. It becomes possible to search for compounds efficiently. By conducting screening using the complex of the present invention, efficient development of new medicines and the like becomes possible.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた。その結果、標的とするタンパク質を、そのタンパク質と結合する生理活性物質を介して担体と固定しておくと、そこに標的タンパク質と結合する別の生理活性物質が存在する場合には、標的タンパク質が担体から競合的に遊離することに着目し、標的タンパク質を発光能を有する物質（発光物質及び蛍光物質）等によって標識することにより、標的タンパク質の遊離（即ち、タンパク質と結合する別の生理活性物質の存在）を光学的に検出できることを見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１６）を提供するものである。The inventors of the present invention have made extensive studies in order to solve the above problems. As a result, when the target protein is fixed to the carrier via a physiologically active substance that binds to the protein, if there is another physiologically active substance that binds to the target protein, the target protein is Focusing on the competitive release from the carrier, labeling the target protein with a substance having a light-emitting ability (a luminescent substance and a fluorescent substance), etc. to release the target protein (that is, another physiologically active substance that binds to the protein) Based on this finding, the present invention has been completed.
That is, the present invention provides the following (1) to (16).
（１）担体、生理活性物質、及びタンパク質を含む複合体であって、担体は生理活性物質と結合しており、生理活性物質はタンパク質と親和性を持ち、その親和性によってタンパク質と結合しており、タンパク質は発光物質又は蛍光物質で標識されている複合体。
（２）担体が、有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子である、（１）に記載の複合体。
（３）担体が消光性を有する、（１）又は（２）に記載の複合体。
（４）担体が、クエンチャー物質と結合した粒子である、（３）に記載の複合体。
（５）タンパク質が生理活性物質のレセプター又は生理活性物質を基質とする酵素であり、生理活性物質が疾病用の薬剤である、（１）乃至（４）のいずれかに記載の複合体。(1) A complex comprising a carrier, a physiologically active substance, and a protein, wherein the carrier is bound to the physiologically active substance, and the physiologically active substance has an affinity for the protein, and is bound to the protein by the affinity. The protein is a complex labeled with a luminescent or fluorescent substance.
(2) The composite according to (1), wherein the carrier is a ferrite particle having an organic polymer coating.
(3) The complex according to (1) or (2), wherein the carrier has quenching properties.
(4) The complex according to (3), wherein the carrier is a particle bound to a quencher substance.
(5) The complex according to any one of (1) to (4), wherein the protein is a receptor for a physiologically active substance or an enzyme having a physiologically active substance as a substrate, and the physiologically active substance is a disease drug.
（６）発光物質が、発光能を有するタンパク質又は化学発光を触媒するタンパク質であるである、（１）乃至（５）のいずれかに記載の複合体。
（７）蛍光物質が、蛍光能を有する低分子有機化合物、又は蛍光能を有するタンパク質である、（１）乃至（５）のいずれかに記載の複合体。
（８）（１）乃至（７）のいずれかに記載の複合体を使用することを特徴とする薬剤のスクリーニング方法。
（９）被検化合物と（１）乃至（７）のいずれかに記載の複合体とを溶媒中で共存させる工程、この溶媒から前記複合体を分離する工程、さらに、溶媒の発光強度又は蛍光強度を測定する工程を有する、（８）に記載の薬剤のスクリーニング方法。(6) The complex according to any one of (1) to (5), wherein the luminescent substance is a protein having a light-emitting ability or a protein that catalyzes chemiluminescence.
(7) The complex according to any one of (1) to (5), wherein the fluorescent substance is a low-molecular organic compound having fluorescence ability or a protein having fluorescence ability.
(8) A drug screening method using the complex according to any one of (1) to (7).
(9) A step of allowing a test compound and the complex according to any one of (1) to (7) to coexist in a solvent, a step of separating the complex from the solvent, and a luminescence intensity or fluorescence of the solvent The method for screening a drug according to (8), comprising a step of measuring strength.
（１０）少なくとも、発光物質又は蛍光物質で標識されているタンパク質と、前記タンパク質と親和性を持つ生理活性物質と結合した担体と、被検化合物とを溶媒中に共存させる工程、この溶媒から担体を分離する工程、さらに、溶媒の発光強度又は蛍光強度を測定する工程を有する薬剤のスクリーニング方法。
（１１）少なくとも、発光物質又は蛍光物質で標識されているタンパク質と、前記タンパク質と親和性を持つ生理活性物質と結合し且つ消光性を有する担体と、被検化合物とを溶媒中に共存させる工程、さらに、溶媒の発光強度又は蛍光強度を測定する工程を有する薬剤のスクリーニング方法。
（１２）担体が、有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子である、（１０）又は（１１）に記載の薬剤のスクリーニング方法。(10) A step in which at least a protein labeled with a luminescent substance or a fluorescent substance, a carrier bound to a physiologically active substance having affinity for the protein, and a test compound coexist in a solvent, and the carrier from the solvent A method for screening a drug, further comprising a step of separating the solvent, and a step of measuring the emission intensity or fluorescence intensity of the solvent.
(11) A step of coexisting a test compound in a solvent with at least a protein labeled with a luminescent substance or a fluorescent substance, a carrier that binds to a physiologically active substance having affinity for the protein and has quenching properties And a method for screening a drug, further comprising a step of measuring the emission intensity or fluorescence intensity of the solvent.
(12) The drug screening method according to (10) or (11), wherein the carrier is a ferrite particle having an organic polymer coating.
（１３）担体が、クエンチャー物質と結合した粒子である、（１２）に記載の薬剤のスクリーニング方法。
（１４）タンパク質が生理活性物質のレセプター又は生理活性物質を基質とする酵素であり、生理活性物質が疾病用の薬剤である、（１０）乃至（１３）のいずれかに記載の薬剤のスクリーニング方法。
（１５）発光物質が、発光能を有するタンパク質又は化学発光を触媒するタンパク質である、（１０）乃至（１４）のいずれかに記載の薬剤のスクリーニング方法。
（１６）蛍光物質が、蛍光能を有する低分子有機化合物、又は蛍光能を有するタンパク質である、（１０）乃至（１４）のいずれかに記載の薬剤のスクリーニング方法。(13) The drug screening method according to (12), wherein the carrier is a particle bound to a quencher substance.
(14) The drug screening method according to any one of (10) to (13), wherein the protein is a receptor for a physiologically active substance or an enzyme using a physiologically active substance as a substrate, and the physiologically active substance is a drug for diseases. .
(15) The method for screening a drug according to any one of (10) to (14), wherein the luminescent substance is a protein having luminescence ability or a protein that catalyzes chemiluminescence.
(16) The method for screening a drug according to any one of (10) to (14), wherein the fluorescent substance is a low molecular organic compound having fluorescence ability or a protein having fluorescence ability.
担体、生理活性物質、及びタンパク質を含む本発明の複合体を利用することにより、この複合体に使用されている生理活性物質とは異なる、前記タンパク質との親和性を有する生理活性物質を見つけ出すことができる。現在、病気の原因タンパク質と結合するが、副作用を持つことから医薬として利用できない生理活性物質が数多く存在する。このような生理活性物質を用いて、本発明のスクリーニング方法を実施することにより、標的タンパク質との結合性を維持しつつも改良された生理活性物質を効率的に取得することができる。 By using the complex of the present invention containing a carrier, a physiologically active substance, and a protein, a physiologically active substance having an affinity for the protein that is different from the physiologically active substance used in the complex is found. Can do. Currently, there are many physiologically active substances that bind to disease-causing proteins but cannot be used as pharmaceuticals due to side effects. By carrying out the screening method of the present invention using such a physiologically active substance, an improved physiologically active substance can be efficiently obtained while maintaining the binding property with the target protein.
１ 消光性を持つ担体
２ 生理活性物質
３ タンパク質
４ 発光物質又は蛍光物質（白色は発光等している場合、黒色は発光等していない場合を示す。）
５ 被検化合物
６ 磁性を持つ担体（磁性ビーズ）
７ 生理活性物質
８ タンパク質
９ イクオリン（白色は発光している場合、黒色は発光していない場合を示す。）
１０ ケミカルライブラリー又は菌培液ライブラリー（被検化合物）
１１ 96ウェルプレート
１２ リング状磁石
１３ 円筒DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Carrier with quenching | quenching 2 Physiologically active substance 3 Protein 4 Luminescent substance or fluorescent substance (When white is light-emitting etc., black shows the case where it is not light-emitting)
5 Test compound 6 Magnetic carrier (magnetic beads)
7 Bioactive substance 8 Protein 9 Aequorin (when white emits light, black indicates no light emission)
10 Chemical library or bacterial culture library (test compound)
11 96 well plate 12 ring magnet 13 cylinder
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の複合体は、担体、生理活性物質、及びタンパク質を含むものであって、担体は生理活性物質と結合しており、生理活性物質はタンパク質と親和性を持ち、その親和性によってタンパク質と結合しており、タンパク質は発光物質又は蛍光物質で標識されているものである。
担体と生理活性物質間の結合の形態は特に限定されないが、本発明の複合体をスクリーニングに用いた際に、解離しないような比較的強固な結合であることが好ましい。Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The complex of the present invention includes a carrier, a physiologically active substance, and a protein, and the carrier is bound to the physiologically active substance, and the physiologically active substance has an affinity for the protein, and the protein and The protein is bound and labeled with a luminescent or fluorescent substance.
The form of the bond between the carrier and the physiologically active substance is not particularly limited, but is preferably a relatively strong bond that does not dissociate when the complex of the present invention is used for screening.
生理活性物質とタンパク質間の結合は、両者の親和性によって結合できるものであれば特に限定されないが、本発明の複合体をスクリーニングに用いた際に、タンパク質と親和性を持つ別の生理活性物質が存在する場合には解離するような比較的弱い結合であることが好ましい。このような結合としては、受容体タンパク質とリガンド間の結合、酵素タンパク質とその基質間の結合などを例示できる。 The binding between the physiologically active substance and the protein is not particularly limited as long as it can be bound by the affinity between the two. However, when the complex of the present invention is used for screening, another physiologically active substance having an affinity for the protein. It is preferable that the bond is relatively weak so that it is dissociated when is present. Examples of such binding include binding between a receptor protein and a ligand, binding between an enzyme protein and its substrate, and the like.
担体としては、通常、粒子状のものを使用するが、生理活性物質と結合し得るものであれば特に限定されず、例えば、基板のようなものを担体としてもよい。また、担体は溶媒中から容易に分離できる性質を持つもの、例えば、磁性を持つ担体などであることが好ましい。磁性を持つ担体としては、本発明者らによって開発された有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子を例示できる。有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子は、例えば、以下のようにして作製することができる。 The carrier is usually in the form of particles, but is not particularly limited as long as it can bind to a physiologically active substance. For example, a carrier such as a substrate may be used. Further, the carrier is preferably one having a property that can be easily separated from the solvent, for example, a magnetic carrier. Examples of the carrier having magnetism include ferrite particles having an organic polymer coating developed by the present inventors. Ferrite particles having an organic polymer coating can be produced, for example, as follows.
水溶液プロセスによって合成されるフェライト粒子表面を界面活性剤の二重膜によって被覆をおこなう。表面を界面活性剤ミセルによって覆うことによってフェライト粒子表面での疎水性高分子の導入を容易にすることが可能である。二重膜によって被覆されたフェライト粒子存在下、ビニルモノマーの乳化重合を行なうことでフェライト粒子表面の高分子による被覆を行なうことが可能である。 The surface of ferrite particles synthesized by an aqueous solution process is coated with a surfactant double film. By covering the surface with surfactant micelles, it is possible to facilitate the introduction of the hydrophobic polymer on the surface of the ferrite particles. It is possible to coat the surface of the ferrite particle with a polymer by emulsion polymerization of the vinyl monomer in the presence of the ferrite particle coated with the double film.
有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子の粒径は特に限定されないが、5-300nmの範囲内であることが好ましい。被覆する有機ポリマーとしては、スチレンをベースとしたビニルモノマーとの共重合体、もしくはポリアクリル酸、ポリビニルアルコールなどの親水性高分子などが挙げられる。粒子表面に薬剤を固定化することが可能であればよいので、ほかにはPEG、デキストラン、リン脂質、核酸、タンパク質などを被覆材料として使用してもよい。 The particle diameter of the ferrite particles having an organic polymer coating is not particularly limited, but is preferably in the range of 5-300 nm. Examples of the organic polymer to be coated include a copolymer with a vinyl monomer based on styrene, or a hydrophilic polymer such as polyacrylic acid or polyvinyl alcohol. As long as it is possible to immobilize the drug on the particle surface, PEG, dextran, phospholipid, nucleic acid, protein, etc. may be used as the coating material.
担体として、消光性を持つ担体を使用してもよい。消光性を持つ担体を使用することにより、後述のように、遊離したタンパク質と複合体とを分離する工程を持たないスクリーニング方法（図１及び図２）を行うことができる。消光性を持つ担体としては、上述した有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子を例示できるが、クエンチャー物質が結合した粒子やクエンチャー物質そのものを使用してもよい。クエンチャー物質としては、Dabcyl、BHQ1、BHQ2、EclipseTM Dark Quencherなどを例示できる。なお、有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子にクエンチャー物質を結合させ、更に消光性を高めてもよい。A carrier having a quenching property may be used as the carrier. By using a quenching carrier, a screening method (FIGS. 1 and 2) without a step of separating the released protein and the complex can be performed as described later. Examples of the quenching carrier include ferrite particles having the above-described organic polymer coating, but particles to which a quencher substance is bonded or a quencher substance itself may be used. Examples of the quencher substance include Dabcyl, BHQ1, BHQ2, and Eclipse ™ Dark Quencher. A quencher substance may be bonded to the ferrite particles having an organic polymer coating to further enhance the quenching property.
タンパク質は特に限定されるものではないが、例えば、生理活性物質のレセプターや生理活性物質を基質とする酵素などである。これらは生理活性物質が疾病用の薬剤である場合に好ましく用いられる。本発明の複合体の用途が薬剤のスクリーニング方法である場合、タンパク質は病気の原因物質となっているタンパク質であることが好ましい。このようなタンパク質としては、例えば、酵素としてジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、アミロイドタンパク質としてアミロイド（Aβ）、レセプターとしてパエル受容体（Pael Receptor）などを挙げることができる。 The protein is not particularly limited, and examples thereof include a receptor for a physiologically active substance and an enzyme using the physiologically active substance as a substrate. These are preferably used when the physiologically active substance is a disease drug. When the use of the complex of the present invention is a drug screening method, the protein is preferably a protein causing a disease. Examples of such a protein include dihydrofolate reductase (DHFR) as an enzyme, amyloid (Aβ) as an amyloid protein, and Pael Receptor as a receptor.
使用する生理活性物質は特に限定されないが、本発明の複合体の用途が薬剤のスクリーニング方法である場合には、病気の原因となっているタンパク質と結合するが、副作用が強いため医薬として使用できない物質、例えば、サリドマイド、種々の抗がん剤、製薬会社でドロップアウトした薬などが好ましい。
標識に用いる蛍光物質は特に限定されず、FITC、TRITC、TAMRA、Cy3、Cy5などの蛍光能を有する低分子有機化合物、蛍光能を有する蛍光タンパク質である緑色蛍光タンパク質（GFP）などを使用することができる。The physiologically active substance to be used is not particularly limited, but when the use of the complex of the present invention is a drug screening method, it binds to a protein causing a disease, but cannot be used as a medicine because of its strong side effects. Substances such as thalidomide, various anticancer agents, drugs dropped out by pharmaceutical companies and the like are preferred.
The fluorescent substance to be used for labeling is not particularly limited. Use low-molecular organic compounds with fluorescent ability such as FITC, TRITC, TAMRA, Cy3, and Cy5, green fluorescent protein (GFP), which is a fluorescent protein with fluorescent ability, etc. Can do.
標識に用いる発光物質も特に限定されず、発光生物由来のカルシウム結合型発光タンパク質、ルシフェラーゼなどの発光能を有するタンパク質を使用できる。さらに、アルカリフォスファターゼまたは西洋ワサビぺルオキシダーゼなどを利用した化学発光反応系を触媒するタンパク質も発光物質として使用できる。 The luminescent substance used for labeling is not particularly limited, and a luminescent protein such as a calcium-binding photoprotein derived from a luminescent organism or a luciferase can be used. Furthermore, a protein that catalyzes a chemiluminescence reaction system using alkaline phosphatase or horseradish peroxidase can also be used as the luminescent substance.
これらの発光及び蛍光物質の中では、感度が最も高く、毒性のないカルシウム結合型発光タンパク質のひとつであるイクオリンを使用するのが最も好ましい。イクオリンはカルシウム結合型発光タンパク質で、微量のカルシウムイオン（10-7mole/liter以上）と接触するだけで瞬間発光する。発光感度も市販の検出装置においての検出限界が0.1ピコグラム以下と非常に高いものである。Among these luminescent and fluorescent substances, it is most preferable to use aequorin, which is one of the calcium-binding photoproteins having the highest sensitivity and non-toxicity. Aequorin is a calcium-binding photoprotein that emits light instantaneously when it comes into contact with trace amounts of calcium ions (over 10 -7 mole / liter). Luminous sensitivity is also very high with a detection limit of 0.1 picogram or less in a commercially available detector.
本発明の複合体は、薬剤のスクリーニング方法に利用できる。具体的な方法は特に限定されないが、被検化合物と本発明の複合体とを溶媒中で共存させる工程、この溶媒から本発明の複合体を分離する工程、さらに、溶媒の発光強度又は蛍光強度を測定する工程を有する、方法を一例として挙げることができる（以下、このスクリーニング方法を「第一の方法」という場合がある。）。 The complex of the present invention can be used in drug screening methods. The specific method is not particularly limited, but the step of allowing the test compound and the complex of the present invention to coexist in a solvent, the step of separating the complex of the present invention from this solvent, and the emission intensity or fluorescence intensity of the solvent. As an example, a method having a step of measuring can be mentioned (hereinafter, this screening method may be referred to as “first method”).
第一の方法において使用する溶媒は特に限定されず、例えば、適当な緩衝剤を含む水などを例示できる。共存させる時間も特に限定されないが、通常、１時間程度である。溶媒から本発明の複合体を分離する方法は特に限定されず、溶媒から担体を除去してもよく、溶媒中の特定の場所に担体を集めてもよい。担体が磁性を持つ場合は、例えば、後述するように、溶媒の入っているウェルの周囲に磁石を配置し、担体をウェルの周辺部分に移動させ、筒状の仕切りをウェルに入れる方法などを示すことができる。 The solvent used in the first method is not particularly limited, and examples thereof include water containing an appropriate buffer. The coexistence time is not particularly limited, but is usually about 1 hour. The method for separating the complex of the present invention from the solvent is not particularly limited, and the carrier may be removed from the solvent, or the carrier may be collected at a specific location in the solvent. When the carrier has magnetism, for example, as described later, a method of placing a magnet around the well containing the solvent, moving the carrier to the peripheral part of the well, and putting the cylindrical partition into the well, etc. Can show.
第一の方法と同様に被検化合物と生理活性物質との競合作用を利用した薬剤のスクリーニング方法として、少なくとも、発光物質又は蛍光物質で標識されているタンパク質と、前記タンパク質と親和性を持つ生理活性物質と結合した担体と、被検化合物とを溶媒中に共存させる工程、この溶媒から担体を分離する工程、さらに、溶媒の発光強度又は蛍光強度を測定する工程を有する方法を例示できる（以下、このスクリーニング方法を「第二の方法」という場合がある。）。 As in the first method, as a method for screening a drug utilizing the competitive action between a test compound and a physiologically active substance, at least a protein labeled with a luminescent substance or a fluorescent substance and a physiological substance having an affinity for the protein are used. Examples of the method include a step in which a carrier bonded to an active substance and a test compound are allowed to coexist in a solvent, a step of separating the carrier from the solvent, and a step of measuring the emission intensity or fluorescence intensity of the solvent (hereinafter referred to as “the solvent”) This screening method may be referred to as “second method”).
第二の方法において、使用する担体、生理活性物質、タンパク質、蛍光物質、発光物質等は、第一の方法と同様のものでよい。
上記第一の方法及び第二方法によって、特定のタンパク質と相互作用をする生理活性物質を得ることができる。このような生理活性物質は、新規な薬剤の候補物質となり得る。
第一の方法であって、磁性を持つ担体を使用したスクリーニング方法の一例を図３及び図４を用いて説明する。In the second method, the carrier, physiologically active substance, protein, fluorescent substance, luminescent substance and the like to be used may be the same as those in the first method.
By the first method and the second method, a physiologically active substance that interacts with a specific protein can be obtained. Such a physiologically active substance can be a candidate substance for a novel drug.
One example of a screening method using a magnetic carrier as the first method will be described with reference to FIGS.
磁性を持つ担体〔６〕、生理活性物質〔７〕、及び発光タンパク質イクオリン〔９〕で標識された標的とするタンパク質〔８〕を含む複合体を96ウェルプレート〔１１〕に分注する（図３Ａ）。ケミカルライブラリー又は菌培養ライブラリー〔１０〕（これらのライブラリーに含まれる物質が被検化合物になる。）をそれぞれウェルに加える（図３Ｂ）。96ウェルプレート〔１１〕を撹拌台の上に乗せ、30分〜1時間、競合阻害反応をさせる。ウェルの大きさに合ったリング状磁石〔１２〕プレートを96ウェルプレート〔１１〕の下に置く（図３Ｃ）。磁性を持つ担体〔６〕は、ウェルの外側に集まり、遊離したイクオリン標識タンパク質〔８〕は外側へは移動しない（図３Ｄ、図４Ｅ）。（簡易には、ここで遊離しているイクオリン標識タンパク質〔８〕の一部を分取し、CaCl2溶液を注入し、発光強度をプレートリーダーで測定することも可能である。）次に、競合阻害反応した96ウェルプレート〔１１〕へ、リング状磁石〔１２〕より直径が小さい円筒〔１３〕をはめる（図４Ｆ）。これにより磁性を持つ担体〔６〕と遊離した標的タンパク質〔８〕が分離できる。イクオリンの場合は円筒〔１３〕の中にCaCl2溶液を注入し、発光強度をプレートリーダーで測定する（図４Ｇ）。A complex comprising a magnetic carrier [6], a physiologically active substance [7], and a target protein [8] labeled with the photoprotein aequorin [9] is dispensed into a 96-well plate [11] (FIG. 3A). A chemical library or a bacterial culture library [10] (a substance contained in these libraries becomes a test compound) is added to each well (FIG. 3B). A 96-well plate [11] is placed on a stirring table and allowed to undergo a competitive inhibition reaction for 30 minutes to 1 hour. A ring-shaped magnet [12] plate matching the size of the well is placed under the 96-well plate [11] (FIG. 3C). The magnetic carrier [6] gathers outside the well, and the released aequorin-labeled protein [8] does not move outward (FIGS. 3D and 4E). (Simply, it is also possible to fractionate a portion of the aequorin labeled protein [8] released here, inject a CaCl 2 solution, and measure the luminescence intensity with a plate reader.) A cylinder [13] having a diameter smaller than that of the ring magnet [12] is fitted into the 96-well plate [11] that has undergone competitive inhibition reaction (FIG. 4F). As a result, the magnetic carrier [6] and the released target protein [8] can be separated. In the case of aequorin, a CaCl 2 solution is injected into a cylinder [13], and the luminescence intensity is measured with a plate reader (FIG. 4G).
上記のように、リング状磁石〔１２〕を用いることにより、磁性を持つ担体〔６〕を外側に集めることができ、さらに円筒〔１３〕を挿入することにより担体〔６〕と遊離したタンパク質〔８〕とを分離することができる。このように担体〔６〕と遊離したタンパク質〔８〕を分離させることにより、遊離したタンパク質〔８〕のみCaCl2溶液と反応させ、担体〔６〕に付いているタンパク質〔８〕とCaCl2溶液を反応させないようにすることができる。つまり、競合阻害によって遊離したタンパク質〔８〕のみを測定対象することができる。このような方法により、スクリーニングを自動的に進めることができるようになる。
第二の方法であって、消光性を持つ担体を使用する方法の原理を図２を用いて説明する。As described above, by using the ring-shaped magnet [12], the magnetic carrier [6] can be collected on the outside, and by inserting the cylinder [13], the carrier [6] and the released protein [ 8] can be separated. By separating the carrier [6] and the released protein [8] in this way, only the released protein [8] is reacted with the CaCl 2 solution, and the protein [8] and CaCl 2 solution attached to the carrier [6] are reacted. Can be prevented from reacting. That is, only the protein [8] released by competitive inhibition can be measured. By such a method, screening can be automatically advanced.
The principle of the second method using a quenching carrier will be described with reference to FIG.
消光性を持つ担体〔１〕には生理活性物質〔２〕が結合している。この担体〔１〕と発光物質又は蛍光物質〔４〕で標識されているタンパク質〔３〕と被検化合物〔５〕の三者を共存させると、被検化合物〔５〕がタンパク質〔３〕と結合する場合には、タンパク質〔３〕は生理活性物質〔２〕だけでなく、被検化合物〔５〕とも結合するため、担体〔１〕に固定される数は少なくなり、逆に遊離状態のタンパク質〔３〕は多くなる。このため、担体によって消光されない発光物質等（図中の白い星）が多くなり、溶媒中の発光強度等は強い状態で維持される。一方、被検化合物〔５〕がタンパク質〔３〕と結合しない場合には、タンパク質〔３〕は生理活性物質〔２〕にのみ結合するので、担体〔１〕に固定される数は多くなり、逆に遊離状態のタンパク質〔３〕は少なくなる。このため、担体によって消光される発光物質等（図中の黒い星）が多くなり、溶媒中の発光強度等は弱くなる。 The bioactive substance [2] is bound to the carrier [1] having a quenching property. When the carrier [1], the protein [3] labeled with the luminescent substance or fluorescent substance [4], and the test compound [5] coexist, the test compound [5] and the protein [3] When binding, the protein [3] binds not only to the physiologically active substance [2] but also to the test compound [5]. Protein [3] increases. For this reason, the luminescent substance etc. (white star in a figure) which are not quenched with a support | carrier increase, and the luminescence intensity etc. in a solvent are maintained in the strong state. On the other hand, when the test compound [5] does not bind to the protein [3], the protein [3] binds only to the physiologically active substance [2], so that the number immobilized on the carrier [1] increases. Conversely, free protein [3] is reduced. For this reason, the luminescent substance etc. (black star in a figure) quenched by a support | carrier increase, and the emitted light intensity in a solvent becomes weak.
担体が消光性を持つ担体である複合体を使用する薬剤のスクリーニング方法の原理を図１を用いて説明する。
発光物質又は蛍光物質〔４〕で標識されたタンパク質〔３〕は、消光性を持つ担体〔１〕と生理活性物質〔２〕を介して固定されている。このタンパク質〔３〕が固定されている担体〔１〕を被検化合物〔５〕と共存させると、被検化合物〔５〕がタンパク質〔３〕と結合する場合には、競合作用により、タンパク質〔３〕は担体〔１〕から遊離する。発光物質又は蛍光物質〔４〕は、消光性を持つ担体〔１〕と近接しない場合には強く光るが（図中の白い星）、消光性を持つ担体〔１〕と近接すると光は弱くなる（図中の黒い星）。従って、タンパク質〔３〕が遊離することにより、強い光を放つ。一方、被検化合物〔５〕がタンパク質〔３〕と結合しない場合には、タンパク質〔３〕は担体〔１〕に固定されたままであり、発光物質又は蛍光物質〔４〕の光も弱いままである。The principle of a drug screening method using a complex in which the carrier is a quenching carrier will be described with reference to FIG.
Protein [3] labeled with a luminescent or fluorescent substance [4] is immobilized via a quenching carrier [1] and a physiologically active substance [2]. When the carrier [1] on which the protein [3] is immobilized coexists with the test compound [5], when the test compound [5] binds to the protein [3], the protein [3] is 3] is released from the carrier [1]. The luminescent or fluorescent material [4] shines strongly when not in close proximity to the quenching carrier [1] (white star in the figure), but the light becomes weak when close to the quenching carrier [1]. (Black star in the figure). Therefore, the protein [3] is released and emits strong light. On the other hand, when the test compound [5] does not bind to the protein [3], the protein [3] remains fixed on the carrier [1] and the light of the luminescent substance or fluorescent substance [4] remains weak. is there.
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and the like.
〔参考例１〕
特開2006-88131号公報の記載に従い、以下のように有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子を作製した。
水溶液中から析出させた平均粒径が４０ｎｍのフェライト粒子１５０ｍｇにウンデセン酸を飽和吸着させ、疎水化フェライト粒子を得た。
この疎水化フェライト粒子に、ＰＥＯ鎖を有する非イオン性界面活性剤Ｅｍｕｌｇｅｎ １１５０Ｓ−７０（花王株式会社製）０．４ｇを溶解した水溶液を加えてソニケーションすることにより、この非イオン性界面活性剤を疎水化フェライト粒子の表面に吸着させて粒子を再親水化し水に分散させた再親水化フェライト粒子のコロイド溶液を得た。
次に、このコロイド溶液に、スチレン２．７ｇ、ＧＭＡ（グリシジルメタクリレート）０．３ｇ、ＤＶＢ（ジビニルベンゼン、架橋剤）０．０８ｇを有するモノマーミックスを添加し全量が１２５ｇになるように水を添加した後、２００ｒｐｍで攪拌を続けながら加熱し、２０〜３０分後に７０℃に達したところで水溶性開始剤Ｖ−５０（和光純薬工業（株）製）５０ｍｇを純水５ｍｌに溶かした水溶液を添加し、重合反応を１２時間行なった。
こうして得られた乳化重合粒子を洗浄して有機ポリマーの被膜を有するフェライト粒子（以下、「磁性ビーズ」という場合がある。）を得た。透過型電子顕微鏡を用い、得られたポリマー被覆フェライト粒子を観察した結果、粒子は平均粒径が２００ｎｍの単分散粒子であり、粒子内部にフェライト粒子を有していることがわかった。[Reference Example 1]
According to the description in JP-A-2006-88131, ferrite particles having an organic polymer coating were prepared as follows.
Undecenoic acid was saturated and adsorbed on 150 mg of ferrite particles having an average particle size of 40 nm precipitated from an aqueous solution, to obtain hydrophobized ferrite particles.
By adding an aqueous solution in which 0.4 g of a nonionic surfactant Emulgen 1150S-70 (manufactured by Kao Corporation) having a PEO chain is dissolved to the hydrophobized ferrite particles, the nonionic surfactant is obtained. Was adsorbed on the surface of the hydrophobized ferrite particles to rehydrophilize the particles and obtain a colloidal solution of rehydrophilized ferrite particles dispersed in water.
Next, a monomer mix having 2.7 g of styrene, 0.3 g of GMA (glycidyl methacrylate) and 0.08 g of DVB (divinylbenzene, cross-linking agent) is added to this colloid solution, and water is added so that the total amount becomes 125 g. Then, heating was continued while stirring at 200 rpm. When the temperature reached 70 ° C. after 20 to 30 minutes, an aqueous solution in which 50 mg of a water-soluble initiator V-50 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in 5 ml of pure water was prepared. The polymerization reaction was carried out for 12 hours.
The emulsion polymer particles thus obtained were washed to obtain ferrite particles having an organic polymer coating (hereinafter sometimes referred to as “magnetic beads”). As a result of observing the obtained polymer-coated ferrite particles using a transmission electron microscope, it was found that the particles were monodisperse particles having an average particle diameter of 200 nm and had ferrite particles inside.
〔参考例２〕
（１）FITC固定化磁性ビーズの調製
10 mg/ml 磁性ビーズ懸濁液（溶媒：100 mM Hepes-NaOH pH7.0）、25 mM FITC溶液（溶媒：DMF）、及び100 mM Hepes-NaOH pH7.0を表１に示す組成になるように混合し、室温で２時間静置し、磁性ビーズにFITCを固定した。磁性ビーズは、参考例１で作製したものにジスルフィド結合を含むリンカーを付けている（磁性ビーズCH2-S-S-CH2-NH2 ）。
（２）FITC固定化磁性ビーズのジチオスレイトール（DTT）によるリンカー切除
FITC固定化磁性ビーズ懸濁液（0.4 mg/200μl）50μlと0.1M DTT溶液50μlを混合し、45分後に蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定は、磁性ビーズ懸濁液（DTT＋）、懸濁液から磁性ビーズ除去後の溶液（磁気分離後（DTT＋））、及び0.1M DTT溶液を加えなかった磁性ビーズ懸濁液（DTT−）の３種類に対して行なった。結果を図５に示す。
図５に示すように、DTTにより磁性ビーズからFITCを遊離させることにより、蛍光強度が上昇し、また、液中から磁性ビーズを除去することにより、蛍光強度は更に上昇した。[Reference Example 2]
(1) Preparation of FITC-immobilized magnetic beads
10 mg / ml magnetic bead suspension (solvent: 100 mM Hepes-NaOH pH7.0), 25 mM FITC solution (solvent: DMF), and 100 mM Hepes-NaOH pH7.0 to have the composition shown in Table 1. The mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours, and FITC was fixed to the magnetic beads. The magnetic beads were prepared in Reference Example 1 with a linker containing a disulfide bond (magnetic beads CH 2 —SS—CH 2 —NH 2 ).
(2) Linker excision of FITC-immobilized magnetic beads with dithiothreitol (DTT)
50 μl of FITC-immobilized magnetic bead suspension (0.4 mg / 200 μl) and 50 μl of 0.1M DTT solution were mixed, and fluorescence intensity was measured after 45 minutes. The fluorescence intensity is measured using a magnetic bead suspension (DTT +), a solution after removing magnetic beads from the suspension (after magnetic separation (DTT +)), and a magnetic bead suspension without adding a 0.1M DTT solution (DTT). -) It was performed for three types. The results are shown in FIG.
As shown in FIG. 5, the fluorescence intensity increased by releasing FITC from the magnetic beads by DTT, and the fluorescence intensity further increased by removing the magnetic beads from the liquid.
〔参考例３〕
（１）ダブシル修飾磁性ビーズの調製
50 mgのダブシル酸（Promega P4281）を1500μlのDMFに溶かし、66.7mg/mlのダブシル酸溶液を調製した。また、参考例２で作製したFITC固定化磁性ビーズを1000μlのDMFに懸濁させ、1000μlのFITC固定化磁性ビーズ懸濁液を調製した。この懸濁液とダブシル溶液及びDMFを混合し、表２に示す組成の磁性ビーズ懸濁液を調製した。
（２）蛍光強度の測定
50μlのダブシル修飾FITC固定化磁性ビーズを、0.1M DTTを含む0.1M Hepes-NaOH, pH7（50μl）と混合し、15分又は30分反応させた後、FITCの蛍光強度を測定した。比較のため、DTTを含まないHepes-NaOH, pH7と混合した場合の蛍光強度も同様に測定した。この結果を図６に示す。図中の１、２、３、４、５で示されるバーは、それぞれダブシル修飾時のダブシル量が0 mg、0.01 mg、0.1 mg、1 mg、10 mgであった場合の蛍光強度比（DTT処理をした場合の蛍光強度／DTT処理をしなかった場合の蛍光強度）を示す。また、左側のバーがDTT処理時間が15分の場合、右側のバーがDTT処理時間が30分の場合を示す。
図６に示すように、DTTによってFITCが磁性ビーズから遊離することにより、蛍光強度は増大するが、その増大の割合は、ほぼ修飾したダブシルの量に依存して大きくなった。即ち、ダブシル修飾しなかった場合（図中のバー１）は、DTT処理をした場合の蛍光強度は、DTT処理をしなかった場合の蛍光強度の15倍程度であったが、10 mgのダブシルで処理した場合（図中のバー５）は30倍程度であった。[Reference Example 3]
(1) Preparation of dabsyl modified magnetic beads
50 mg of dabsyl acid (Promega P4281) was dissolved in 1500 μl of DMF to prepare a 66.7 mg / ml dabsyl acid solution. In addition, the FITC-immobilized magnetic beads prepared in Reference Example 2 were suspended in 1000 μl of DMF to prepare 1000 μl of FITC-immobilized magnetic beads suspension. This suspension was mixed with a dabsyl solution and DMF to prepare a magnetic bead suspension having the composition shown in Table 2.
(2) Measurement of fluorescence intensity
50 μl of dabsyl-modified FITC-immobilized magnetic beads were mixed with 0.1 M Hepes-NaOH, pH 7 (50 μl) containing 0.1 M DTT, reacted for 15 minutes or 30 minutes, and then the fluorescence intensity of FITC was measured. For comparison, the fluorescence intensity when mixed with Hepes-NaOH, pH 7 containing no DTT was also measured. The result is shown in FIG. The bars indicated by 1, 2, 3, 4, and 5 in the figure indicate the fluorescence intensity ratio (DTT) when the amount of dabsyl at the time of dabsyl modification was 0 mg, 0.01 mg, 0.1 mg, 1 mg, and 10 mg, respectively. Fluorescence intensity when treated / fluorescence intensity when not treated with DTT). Further, the left bar shows a case where the DTT processing time is 15 minutes, and the right bar shows a case where the DTT processing time is 30 minutes.
As shown in FIG. 6, the release of FITC from the magnetic beads by DTT increases the fluorescence intensity, but the rate of increase increased depending on the amount of modified dabsyl. That is, in the case of no dabsyl modification (bar 1 in the figure), the fluorescence intensity after DTT treatment was about 15 times the fluorescence intensity without DTT treatment, but 10 mg dabsyl (Bar 5 in the figure) was about 30 times.
〔実施例１〕
（１）組換えヒスチジンタグジヒドロ葉酸還元酵素アポイクオリン融合タンパク質（rHis-DHFR-apoAQ）の発現
rHis-DHFR-apoAQの発現ベクター（pColdII-DHFR-AQ）を組み込んだ大腸菌BL21(DE3)を37℃で２L培養した。吸光度600nm＝0.3の時点で培養温度を15℃に下げ、引き続き30分培養した。最終濃度0.1mMになるようにIPTGを加え、更に15℃で24時間培養を続け、rHis-DHFR-AQを発現させた。なお、この低温によって発現を誘導するシステムは宝酒造で市販されている。発現ベクターpColdIIに含まれる大腸菌コールドショック遺伝子cspAプロモーターにより発現する。cspAプロモーターの下流には発現を厳密に制御するためのlac operatorが挿入されている。[Example 1]
(1) Expression of recombinant histidine-tagged dihydrofolate reductase apoaequorin fusion protein (rHis-DHFR-apoAQ)
E. coli BL21 (DE3) into which rHis-DHFR-apoAQ expression vector (pColdII-DHFR-AQ) was incorporated was cultured at 37 ° C. for 2 L. When the absorbance was 600 nm = 0.3, the culture temperature was lowered to 15 ° C., and the culture was continued for 30 minutes. IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM, and the culture was further continued at 15 ° C. for 24 hours to express rHis-DHFR-AQ. This system for inducing expression by low temperature is commercially available from Takara Shuzo. It is expressed by the E. coli cold shock gene cspA promoter contained in the expression vector pColdII. A lac operator for strictly controlling expression is inserted downstream of the cspA promoter.
（２）ヒスチジンタグによる精製
rHis-DHFR-apoAQを発現した大腸菌を遠心により回収し、PBSで洗浄した。大腸菌を50mlの溶解溶液（20mM Tris-HCl(pH 7.9)、300mM NaCl、10mM Imidazole、0.1% NP-40）に懸濁し、超音波により大腸菌及びゲノムを破壊した。遠心により不溶性画分を分離し、可溶性画分をニッケルアガロースゲル（Ni-NTA Agarose; QIAGEN）と混合した。4℃で1時間、回転させ、rHis-DHFR-apoAQをニッケルアガロースゲルに結合させた。結合反応後、カラム（Poly-=Prep Chromatography Columns 0.8×4cm, BIORAD）に移し濾過した。カラムに前述した溶解溶液10ml、次いで、洗浄溶液１（20mM Tris-HCl(pH 7.9)、300mM NaCl、20mM Imidazole、0.1% NP-40）10ml、更に洗浄溶液２（20mM Tris-HCl(pH 7.9)、300mM NaCl、20mM Imidazole）10mlを添加し、ニッケルアガロースゲルを洗浄した。その後、カラムに溶出溶液（20mM Tris-HCl(pH 7.9)、300mM NaCl、100mM Imidazole）5mlを添加しニッケルアガロースゲルからrHis-DHFR-apoAQを溶出させた。溶出フラクションを500μlずつ分注して回収した。rHis-DHFR-apoAQは二本目のフラクションで回収できた。(2) Purification with histidine tag
E. coli expressing rHis-DHFR-apoAQ was collected by centrifugation and washed with PBS. Escherichia coli was suspended in 50 ml of a lysis solution (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole, 0.1% NP-40), and Escherichia coli and the genome were disrupted by ultrasound. The insoluble fraction was separated by centrifugation, and the soluble fraction was mixed with Ni-NTA Agarose (QIAGEN). Rotating at 4 ° C. for 1 hour allowed rHis-DHFR-apoAQ to bind to the nickel agarose gel. After the binding reaction, it was transferred to a column (Poly- = Prep Chromatography Columns 0.8 × 4 cm, BIORAD) and filtered. 10 ml of the lysis solution described above, then 10 ml of washing solution 1 (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole, 0.1% NP-40) and further washing solution 2 (20 mM Tris-HCl (pH 7.9) , 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole) was added, and the nickel agarose gel was washed. Thereafter, 5 ml of an elution solution (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 300 mM NaCl, 100 mM Imidazole) was added to the column to elute rHis-DHFR-apoAQ from a nickel agarose gel. The eluted fraction was collected by dispensing 500 μl each. rHis-DHFR-apoAQ was recovered in the second fraction.
（３）rHis-DHFR-apoAQからイクオリン（AQ）への再生
ニッケルカラムにより精製されたrHis-DHFR-apoAQを活性のあるイクオリン（AQ）に再生させるため、以下の処理を行なった。
再生反応液（500μl rHis-DHFR-apoAQ、10μl 0.5M EDTA、2μl 2-メルカプトエタノール、40μg セレントラジン、4.5ml TE(10mM Tris-HCl(pH7.9), 10mM EDTA)）を15mlチューブに入れ、４℃で３時間回転させた。30分ごとに反応チューブの蓋を開けて酸素を供給した。セレントラジンは市販のものではなく、井上の方法（ Inoue, S., Sugiura, S., Kakoi, H., Hasizume, K., Goto, T., and Iio, H. (1975) Chem Lett. 141-144）に従って合成したものを使用した。４℃で３時間回転させた後、一晩４℃で静置した。(3) Regeneration from rHis-DHFR-apoAQ to aequorin (AQ) In order to regenerate rHis-DHFR-apoAQ purified by a nickel column into active aequorin (AQ), the following treatment was performed.
Put the regeneration reaction solution (500 μl rHis-DHFR-apoAQ, 10 μl 0.5 M EDTA, 2 μl 2-mercaptoethanol, 40 μg serentrazine, 4.5 ml TE (10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 10 mM EDTA)) into a 15 ml tube, 4 Rotate for 3 hours at ° C. Every 30 minutes, the reaction tube was opened and oxygen was supplied. Serentrazine is not a commercially available product, but the method of Inoue (Inoue, S., Sugiura, S., Kakoi, H., Hasizume, K., Goto, T., and Iio, H. (1975) Chem Lett. 141- 144) was used. After rotating at 4 ° C. for 3 hours, the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight.
（４）rHis-DHFR-AQのイオン交換カラムによる精製
再生反応後、未反応のセレントラジンとrHis-DHFR-AQの分解物を除去するため以下の処理を行った。反応は全て４℃で行った。
陽イオンカラムのQ Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech)2mlをカラム（Poly-Prep Chromatography Columns 0.8×4cm, BIORAD）に充填した。20ml TE(10mM Tris-HCl(pH7.9), 10mM EDTA)を添加し、カラムを洗浄、平衡化した。再生反応溶液を静かにゆっくりとカラムに添加した。10ml TE(10mM Tris-HCl(pH7.9), 10mM EDTA)、10ml 洗浄TE１(10mM Tris-HCl(pH7.9), 10mM EDTA, 50mM NaCl)、10ml 洗浄TE２(10mM Tris-HCl(pH7.9), 10mM EDTA, 100mM NaCl)をそれぞれ静かにゆっくりと添加し、カラムを洗浄した。10ml 溶出TE(10mM Tris-HCl(pH7.9), 10mM EDTA, 400mM NaCl)を静かにゆっくりと添加し、rHis-DHFR-AQを溶出した。溶出フラクションを500μlずつ分注して回収した。この溶出フラクション及び洗浄時に回収されたフラクション中に含まれるタンパク質をSDS-PAGEで分離し、クマシーブリリアントブルーによって染色した。この結果を図７に示す。
図７に示すように、rHis-DHFR-AQは4-5本目のフラクションで回収できた。精製されたrHis-DHFR-AQは1.5mlエッペンチューブに100μlずつ分注し、-80℃で保存した。(4) Purification of rHis-DHFR-AQ by ion exchange column After the regeneration reaction, the following treatment was performed to remove unreacted serentrazine and rHis-DHFR-AQ degradation products. All reactions were performed at 4 ° C.
2 ml of cation column Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) was packed in a column (Poly-Prep Chromatography Columns 0.8 × 4 cm, BIORAD). 20 ml TE (10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 10 mM EDTA) was added, and the column was washed and equilibrated. The regeneration reaction solution was slowly and slowly added to the column. 10 ml TE (10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 10 mM EDTA), 10 ml washed TE1 (10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 10 mM EDTA, 50 mM NaCl), 10 ml washed TE2 (10 mM Tris-HCl (pH 7.9) ), 10 mM EDTA, 100 mM NaCl) were slowly and slowly added to wash the column. 10 ml elution TE (10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 10 mM EDTA, 400 mM NaCl) was gently and slowly added to elute rHis-DHFR-AQ. The eluted fraction was collected by dispensing 500 μl each. Proteins contained in the eluted fraction and the fraction collected during washing were separated by SDS-PAGE and stained with Coomassie Brilliant Blue. The result is shown in FIG.
As shown in FIG. 7, rHis-DHFR-AQ was recovered in the 4th-5th fraction. Purified rHis-DHFR-AQ was dispensed in 100 μl aliquots into 1.5 ml Eppendorf tubes and stored at −80 ° C.
〔実施例２〕
（１）カルボキシル化磁性ビーズの作製
磁性ビーズ（10mg/tube）を500μlの水で２回洗浄し、次いで、水とDMFの混合液（水：DMF＝1:4）で１回洗浄し、更に、DMFで４回洗浄した後、300μlのDMFに懸濁した。この懸濁液に100μlのトリエチルアミンを添加し、更に600μlの500mM 無水コハク酸のDMF溶液を加え、室温で一晩インキュベートした。
インキュベートした後の磁性ビーズをDMFで一回洗浄した後、430μlのDMFに懸濁した。この懸濁液に50μlのトリエチルアミンと20μlの無水酢酸を添加を添加し、室温で２時間インキュベートした。水で１回洗浄した後、450μlの水に懸濁した。この懸濁液に50μlの1N NaOHを添加し、室温で30分インキュベートした後、磁性ビーズを水で5回洗浄し、水500μlに懸濁して保存した。[Example 2]
(1) Preparation of carboxylated magnetic beads Magnetic beads (10 mg / tube) were washed twice with 500 μl of water, then washed once with a mixture of water and DMF (water: DMF = 1: 4), and further After washing 4 times with DMF, it was suspended in 300 μl of DMF. To this suspension, 100 μl of triethylamine was added, and 600 μl of a 500 mM DMF solution of succinic anhydride was added and incubated overnight at room temperature.
After incubation, the magnetic beads were washed once with DMF and then suspended in 430 μl of DMF. To this suspension was added 50 μl triethylamine and 20 μl acetic anhydride added and incubated at room temperature for 2 hours. After washing once with water, it was suspended in 450 μl of water. After adding 50 μl of 1N NaOH to this suspension and incubating at room temperature for 30 minutes, the magnetic beads were washed 5 times with water, suspended in 500 μl of water and stored.
（２）アミノ基誘導体MTX固定化ビーズ作製
カルボキシル化磁性ビーズ5mgを500μlのmilliQで１回洗浄した後、500μlのメタノールで１回洗浄した。洗浄した磁性ビーズを100μlのメタノールに分散させた後、500μlのジオキサンを添加した。
磁性ビーズをジオキサンで２回洗浄した後、800μlのジオキサンを添加し、更に、200μlの1M HOSu及び38.4mgのEDCを添加し、室温で２時間インキュベートした。
磁性ビーズを500μlのDMFで５回洗浄した後、100μlのDMFに懸濁し、50μl（各2.5mg）ずつ分注し、表３に示す組成のMTX含有磁性ビーズ懸濁液を調製し、室温で70分静置した。
After the magnetic beads were washed twice with dioxane, 800 μl of dioxane was added, 200 μl of 1M HOSu and 38.4 mg of EDC were added, and incubated at room temperature for 2 hours.
The magnetic beads were washed 5 times with 500 μl of DMF, then suspended in 100 μl of DMF, and 50 μl (2.5 mg each) was dispensed to prepare an MTX-containing magnetic bead suspension having the composition shown in Table 3 at room temperature. It was allowed to stand for 70 minutes.
〔実施例３〕
（１）MTX固定化磁性ビーズとrHis-DHFR-AQ融合タンパク質の結合
実施例２で製造したMTX固定化ビーズ（50%メタノール保存）0.2 mgを500μlのBinding Buffer（10mM HEPES, 150mM KCl, 5mM EDTA, 10%Glycerol, 0.1%NP40）で３回洗浄した後、rHis-DHFR-AQ（100ng/100μl）と混合し、４℃で３時間反応させ、結合させた。
rHis-DHFR-AQを結合させたMTX固定化磁性ビーズを、500μlのBinding Bufferで３回洗浄した後、30μlの薬剤（100μM MTX、100μM ストレプトマイシン、又は100μM ペニシリン）と混合し、４℃で１時間反応させた。反応後の溶液の上清（Drug Elution）を採取、保存した。上清採取後の残渣に1×Dye 40μlを加え、98℃で５分間加熱し、上清（Boil Elution after Drug Elution）を採取、保存した。Example 3
(1) Binding of MTX-immobilized magnetic beads and rHis-DHFR-AQ fusion protein 0.2 mg of MTX-immobilized beads (50% methanol storage) prepared in Example 2 was added to 500 μl of Binding Buffer (10 mM HEPES, 150 mM KCl, 5 mM EDTA). , 10% Glycerol, 0.1% NP40) and then mixed with rHis-DHFR-AQ (100 ng / 100 μl), reacted at 4 ° C. for 3 hours, and bound.
MTX-immobilized magnetic beads bound with rHis-DHFR-AQ were washed 3 times with 500 μl of Binding Buffer, mixed with 30 μl of drug (100 μM MTX, 100 μM streptomycin, or 100 μM penicillin) for 1 hour at 4 ° C. Reacted. The supernatant (Drug Elution) of the solution after the reaction was collected and stored. 40 μl of 1 × Dye was added to the residue after collecting the supernatant, heated at 98 ° C. for 5 minutes, and the supernatant (Boil Elution after Drug Elution) was collected and stored.
（２）上清中のタンパク質の検出
結合反応後の上清及び加熱後の上清中に含まれるタンパク質をSDS-PAGEで分離し、銀染色法により染色した。結果を図８に示す。なお、図中の（−）及び（＋＋＋）は、それぞれ前述したMTX固定液Ａ及びMTX固定液ＤによってMTXを固定した磁性ビーズを用いている。
図８に示すように、結合反応後の上清では、MTXと混合した場合にのみ、rHis-DHFR-AQを示すバンドが検出され、ストレプトマイシン（SRM）及びペニシリン（PNC）と混合した場合にはそのようなバンドは検出されなかった。
加熱後の上清では、いずれの薬剤と混合した場合にも、rHis-DHFR-AQを示すバンドが検出された。
これらの結果から、磁性ビーズと結合していたrHis-DHFR-AQは、MTXと混合した場合にのみ競合反応によって遊離し、他の薬剤と混合した場合には結合した状態のままであったと考えられる。(2) Detection of protein in supernatant The protein contained in the supernatant after the binding reaction and the supernatant after the heating was separated by SDS-PAGE and stained by silver staining. The results are shown in FIG. Note that (−) and (++++) in the figure use magnetic beads in which MTX is fixed by the MTX fixing solution A and MTX fixing solution D described above, respectively.
As shown in FIG. 8, in the supernatant after the binding reaction, a band indicating rHis-DHFR-AQ was detected only when mixed with MTX, and when mixed with streptomycin (SRM) and penicillin (PNC). Such a band was not detected.
In the supernatant after heating, a band indicating rHis-DHFR-AQ was detected when mixed with any drug.
From these results, it was considered that rHis-DHFR-AQ bound to magnetic beads was released by competitive reaction only when mixed with MTX, and remained bound when mixed with other drugs. It is done.
（３）Drug Elutionの発光測定
市販のアッセイ用プレート（96 Well Assay Plates, MATRIX）のウェルを5mM EDTA で洗浄した後、9μlのBinding Bufferを加え、更に上清（Drug Elution）を1μl加え、ウェルの中を全量を10μlとした。プレートをプレートリーダー（WALLAC 1420 Multilabel Counter, PerkinElmer）にセットし、ウェルに500mM CaCl2（30mM HCl-Tris(pH7.9)）を50μl添加し、発光強度を測定した。この結果を図９に示す。なお、図中の（−）、（＋）、（＋＋）及び（＋＋＋）は、それぞれ前述したMTX固定液Ａ、MTX固定液Ｂ、MTX固定液Ｃ及びMTX固定液ＤによってMTXを固定した磁性ビーズを用いている。
図９に示すように、ストレプトマイシン（SRM）及びペニシリン（PNC）と混合した場合には、ほとんど発光しなかったのに対し、MTXと混合した場合には強い発光が確認された。MTXと混合した場合の強い発光は、消光性を持つ磁性ビーズからrHis-DHFR-AQが遊離したことによるものと考えられる。この結果は、上述した電気泳動の結果と一致する。(3) Luminescence measurement of Drug Elution Wash wells of commercially available assay plates (96 Well Assay Plates, MATRIX) with 5 mM EDTA, add 9 μl of Binding Buffer, and then add 1 μl of supernatant (Drug Elution). The total volume was 10 μl. The plate was set in a plate reader (WALLAC 1420 Multilabel Counter, PerkinElmer), 50 μl of 500 mM CaCl 2 (30 mM HCl-Tris (pH 7.9)) was added to the well, and the luminescence intensity was measured. The result is shown in FIG. In addition, (-), (+), (++) and (++++) in the figure are magnetic fields in which MTX is fixed by the MTX fixing solution A, MTX fixing solution B, MTX fixing solution C and MTX fixing solution D, respectively. Beads are used.
As shown in FIG. 9, when mixed with streptomycin (SRM) and penicillin (PNC), almost no light was emitted, but when mixed with MTX, strong light emission was confirmed. The strong luminescence when mixed with MTX is considered to be due to the release of rHis-DHFR-AQ from the quenching magnetic beads. This result is consistent with the result of electrophoresis described above.
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願（特願2006-125348号）の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。 This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of the Japanese patent application (Japanese Patent Application No. 2006-125348) which is the basis of the priority of the present application. In addition, all publications, patents and patent applications cited in the present invention are incorporated herein by reference as they are.
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