JPWO2007119808A1 - 融合パートナー細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
Waldman,T.,Science 252:p1657-1662(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 80:p7308-7312,1983 Raybouldら,Science 240:p1788-1790,1988 Kennedyら,J.Gen.Virol.69:p3023-3032,1988 Flynnら,J.Immunol.Methods 121:p237-246,1989
すなわち本発明は、以下の融合パートナー細胞、並びにこの融合パートナー細胞と物質生産細胞とのハイブリドーマに関する。あるいは本発明は、これらの細胞の製造方法、並びにハイブリドーマを利用する物質の製造方法に関する。
〔1〕 次の細胞(a)および(b)を融合することにより得ることができる融合パートナー細胞;
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、および
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞。
〔2〕 第1の動物種がマウスであり、ミエローマ細胞が以下に示すマウスミエローマ細胞、およびこれらの細胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される〔1〕に記載の融合パートナー細胞;
MOPC21、P3X63AG8、SP2/0、NS-1、P3.X63AG8.653、F0、S194/5.XXO.BU-1、FOX-NY、およびSP2/0-Ag14。
〔3〕 第2の動物種がヒトであり、白血病細胞が以下に示す白血病細胞、およびこれらの細胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される〔1〕に記載の融合パートナー細胞;
MEG-01、HEL、UT-7、M07e、MEG-A2、およびDAMI。
〔4〕 第1の細胞がSP2/0−Ag14であり、第2の細胞がMEG-01である、〔1〕に記載の融合パートナー細胞。
〔5〕 受託番号 FERM BP−10761として寄託された融合パートナー細胞SPYMEG。
〔6〕 以下の細胞(1)および(2)を融合することによって得ることができるハイブリドーマ;
(1)次の細胞(a)および(b)を融合することにより得ることができる融合パートナー細胞、および
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞、および
(2)第3の細胞。
〔7〕 第1の動物種がマウスであり、ミエローマ細胞が以下に示すマウスミエローマ細胞、およびこれらの細胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される〔6〕に記載のハイブリドーマ;
MOPC21、P3X63AG8、SP2/0、NS-1、P3.X63AG8.653、F0、S194/5.XXO.BU-1、FOX-NY、およびSP2/0-Ag14。
〔8〕 第2の動物種がヒトであり、白血病細胞が以下に示す白血病細胞、およびこれらの細胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される〔6〕に記載のハイブリドーマ;
MEG-01、HEL、UT-7、M07e、MEG-A2、およびDAMI。
〔9〕 第1の細胞がSP2/0−Ag14であり、第2の細胞がMEG-01である、〔6〕に記載のハイブリドーマ。
〔10〕 融合パートナー細胞が、受託番号 FERM BP−10761として寄託されたSPYMEGである、〔6〕に記載のハイブリドーマ。
〔11〕 第3の細胞が、第2の細胞と同じ動物種に由来する細胞である〔6〕に記載のハイブリドーマ。
〔12〕 第3の細胞が、抗体産生細胞である〔11〕に記載のハイブリドーマ。
〔13〕 以下の工程を含む融合パートナー細胞を製造する方法;
(1)次の細胞(a)および(b)を融合する工程、
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞、および
(2)工程(1)で融合した細胞を培養し、培養物から融合パートナー細胞を回収する工程。
〔14〕 以下の工程を含むハイブリドーマを製造する方法;
(1)〔13〕に記載の方法によって得られた融合パートナー細胞と、抗体産生細胞を融合させる工程、および
(2)工程(1)で融合した細胞を培養し、培養物からハイブリドーマを回収する工程。
〔15〕 以下の工程を含む抗体産生細胞を製造する方法;
(1)〔13〕記載の方法によって得られた、融合パートナー細胞と抗体産生細胞を融合させてハイブリドーマを得る工程、および
(2)工程(1)で得たハイブリドーマを抗体産生細胞として回収する工程。
〔16〕 付加的に工程(1)で得たハイブリドーマをクローニングする工程を含む、〔15〕に記載の方法。
〔17〕 以下の工程を含む抗体を製造する方法;
(1)〔13〕に記載の方法によって得られた融合パートナー細胞と、抗体産生細胞を融合させてハイブリドーマを得る工程、および
(2)工程(1)で得たハイブリドーマを培養し、培養物から抗体を回収する工程。
〔18〕 付加的に工程(1)で得たハイブリドーマをクローニングする工程を含む、〔17〕に記載の方法。
〔19〕以下の工程を含む感染症に対する抗体を製造する方法;
(1)〔13〕に記載の方法によって得られた融合パートナー細胞と、感染症の病原体抗原の暴露履歴のある対象由来の抗体産生細胞を融合させてハイブリドーマを得る工程、および
(2)工程(1)で得たハイブリドーマを培養し、培養物から感染症に対する抗体を回収する工程。
〔20〕感染症が、インフルエンザ、AIDS、またはウイルス性肝炎のいずれかである〔19〕に記載の方法。
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、および
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞
(細胞A)×(細胞B)=[ハイブリドーマα]
[ハイブリドーマα]×(細胞C)=[ハイブリドーマβ]
上記の3種類の細胞を融合させたハイブリドーマβを与える細胞A、細胞B、および細胞Cが由来する種は任意である。したがって、これらの細胞が由来する種は、同一の場合と、異なる場合とが本発明に含まれる。3種類の細胞の融合によって得られるハイブリドーマを、特にトリオーマと呼ぶ場合がある。
本発明の好ましい態様においては、細胞A(第1の細胞)と細胞B(第2の細胞)が由来する種は異なり、細胞Bと細胞C(第3の細胞)が由来する種は同一である。あるいは、細胞A、および細胞Cが由来する種が同一の場合、もしくは細胞A、細胞B、および細胞Cがいずれも異なる種に由来する場合も、本発明におけるハイブリドーマに含まれる。
動物細胞における選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損(以下HGPRT欠損と省略する)、あるいはチミジンキナーゼ欠損(以下TK欠損と省略する)によってもたらされるヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性(以下HAT感受性と省略する)等が知られている。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、および
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞。
(1)次の細胞(a)および(b)を融合する工程、
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞、および
(2)工程(1)で融合した細胞を培養し、培養物から融合パートナー細胞を回収する工程。
MOPC21 (ATCC番号HB-8411)
P3X63AG8 (ATCC番号T1B9)
SP2/0 (ATCC番号CRL 1581)
NS-1 (ATCC番号TIB18)
P3.X63AG8.653 (ATCC番号CRL 1580)
F0 (ATCC番号CRL 1646)
S194/5.XXO.BU-1 (ATCC番号CRL 1580)
FOX-NY (ATCC番号CRL 1732)
SP2/0-Ag14 (JCRB番号0029)
これらの細胞株のうちで先に述べたような好ましい特徴を備えているのは、一群のマウスミエローマ細胞株、あるいはこれらマウスミエローマ細胞株から誘導された細胞株である。誘導された細胞株とは、薬剤耐性などの付加的な形質を導入し改めてクローニングした細胞株を意味する。
-[G1期]-[S期]-[G2期]-[M期]-
このように、本発明においては、細胞周期にExtra-S期を含み、染色体を倍数体にする性質を有する白血病細胞を用いることで、ヘテロハイブリドーマから抗体産生細胞由来の染色体の脱落を防ぐ効果が期待できる。
更に分離された白血病細胞が細胞周期にExtra-S期を含むことは、細胞の染色体の増加を指標として確認することができる。染色体の増加は、たとえば、12-o-tetradecanoyl phorbol 13 acetate (TPA)で処理した細胞のプロイディー(染色体総数)の増加によって確認することができる。ブロイディーの増加は、フローサイトメーターや、ブロイディーアナライザによって検出することができる。
MEG-01 (ATCC番号CRL-2021)
HEL (JCRB番号0062)
UT-7 (N. Komatsu et al. Cancer Res. 51: 341-348, 1991)
M07e (Avanzi GC et al. J Cell Physiol. 1990 Dec;145(3):458-64.)
MEG-A2 (JCRB No.IFO50478)
DAMI(Blood 89: p4238,1997)
特にMEG-01は、選択マーカーとして有用な8AG耐性を有する。またMEG-01自身がイムノグロブリンを産生していないため、抗体産生細胞とのハイブリドーマの作製用の融合パートナーとして好ましい。
細胞融合を容易にするために同様に使用され得る他の方法には電気融合が含まれる。この方法では、細胞を特殊な緩衝液中に置き、電場を加えることによって細胞を整列させる。整列した細胞は、他の細胞と接触の機会が増し、効率的に細胞を融合させることができる。
融合混合物を、例えば15 %ウシ胎仔血清を含有するHB−GRO培地(Irvine Scientific, Santa Ana, California)150ml中で細胞密度8x105細胞/mLにし、2.0×105細胞/ウエルで96ウエルプレートに分散させる。細胞を5−10 %CO2雰囲気下、37 ℃でインキュベーションして8AG耐性とし、融合パートナー細胞を得ることができる。得られた融合パートナー細胞は、必要に応じて、クローニングすることができる。クローニングされた融合パートナー細胞は、ハイブリドーマの製造において、再現性の維持に貢献する。
(a)寄託機関の名称・あて名
名称:独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番1号中央第6(郵便番号305-8566)
(b)寄託日:平成18年2月24日
(c)受託番号:FERM BP-10761
(平成18年2月24日に寄託されたFERM P-20816 より移管)
(1)次の細胞(a)および(b)を融合することにより得ることができる融合パートナー細胞、
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞、および
(2)第3の細胞。
(1)次の細胞(a)および(b)を融合する工程、
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞、
(2)工程(1)で融合した細胞を培養し、培養物から融合パートナー細胞を回収する工程、
(3)工程(2)で回収した融合パートナー細胞に、第3の細胞を融合させる工程、および
(4)工程(3)で融合した細胞を培養し、培養物からハイブリドーマを回収する工程。
特に末梢血リンパ球は、本発明における抗体産生細胞として好ましい。末梢血リンパ球は、採血によって容易に得ることができる。マウスの末梢血リンパ球を本発明に基づいてハイブリドーマとすることにより、マウス抗体を産生するハイブリドーマを容易に得ることができる。さらに、ヒトの末梢血リンパ球を本発明に基づいてハイブリドーマとすることにより、ヒト抗体を産生するハイブリドーマを容易に得ることができる。
PEG:PEG1500(Aldrich, Milwaukee, Wisconsin)
HAT:HAT supplement(50x)(GIBCO製、カタログNo. 21060-017)
無血清培地:RPMI1640(SIGMA製、カタログ No R8758)
(1)以下の工程により融合パートナー細胞を得る工程;
(A)次の細胞(a)および(b)を融合する工程、
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞、および
(B)工程(A)で融合した細胞を培養し、培養物から融合パートナー細胞を回収する工程;
(2)工程(1)で得た融合パートナー細胞に、抗体産生細胞を融合させハイブリドーマを得る工程;および
(3)工程(2)で得たハイブリドーマを培養し、培養物から抗体を回収する工程。
(1)以下の工程により融合パートナー細胞を得る工程;
(A)次の細胞(a)および(b)を融合する工程、
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞、および
(B)工程(A)で融合した細胞を培養し、培養物から融合パートナー細胞を回収する工程。
(2)工程(1)で得た融合パートナー細胞に、抗体産生細胞を再融合させハイブリドーマを得る工程;および
(3)工程(2)で得たハイブリドーマを抗体産生細胞として回収する工程。
(1)以下の工程により融合パートナー細胞を得る工程;
(A)次の細胞(a)および(b)を融合する工程、
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞、および
(B)工程(A)で融合した細胞を培養し、培養物から融合パートナー細胞を回収する工程;
(2)工程(1)で得た融合パートナー細胞に、抗体産生細胞を融合させてハイブリドーマとし、目的とする抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする工程;および
(3)工程(2)でクローニングされたハイブリドーマを培養し、培養物からモノクローナル抗体を回収する工程。
(1)以下の工程により融合パートナー細胞を得る工程;
(A)次の細胞(a)および(b)を融合する工程、
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞、および
(B)工程(A)で融合した細胞を培養し、培養物から融合パートナー細胞を回収する工程。
(2)工程(1)で得た融合パートナー細胞に、抗体産生細胞を再融合させハイブリドーマを得る工程;および
(3)工程(2)で得たハイブリドーマを抗体産生細胞として回収する工程。
(1)以下の工程により融合パートナー細胞を得る工程;
(A)次の細胞(a)および(b)を融合する工程、
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞、および
(B)工程(A)で融合した細胞を培養し、培養物から融合パートナー細胞を回収する工程。
(2)工程(1)で得た融合パートナー細胞に、抗体産生細胞を再融合させハイブリドーマとし、目的とする抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする工程;および
(3)工程(2)でクローニングされたハイブリドーマを抗体産生細胞として回収する工程。
培地に血清を加えるときには、ウシ胎児血清(以下FCSと省略する)を5−10 %v/vで利用するとよい。またこれらの培地で本発明のハイブリドーマを培養するとき、公知の抗体産生増強因子を添加すると有利である。in vitroで抗体産生を増強する成分には、たとえばD−ペニシラミン、アセト酢酸、ビグアナイド類、ビタミンK5、N−アセチルグルタミン酸(特開平8-70858)、インターロイキン6(Nature,324:6092,73-6;1986)、糖アルコール(特開平2-200177)、リポポリサッカライド(特開平4-20294)、フォルボールエステル(特開平1-171494)、あるいは酪酸(hybridoma Vol.4,No.1, p63;1985)等が知られている。このようにして得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、あるいはアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
融合パートナー細胞の作製
RPMI+5 %FCS(通常培地)の培養液で培養してきたSP2/0-Ag-14 (3x107)とMEG-01(3〜6x107)の細胞を常法に従ってPEGで融合させた。融合細胞を3日間通常培地(RPMI+5 % FCS)で培養し、3日目にFCSを含まないRPMI溶液で19日間培養した。19日目に8AGを含む通常培地で限界希釈をし、5日間培養した。融合細胞が増殖してきたので、これをとり融合パートナー細胞SPYMEGとした。SPYMEGは、受託番号 FERM BP-10761(FERM P-20816から移管)として、2006年2月24日付けで、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託された。SPYMEGは8AG耐性であり、HAT培地で培養すると死滅した。
PEG法によるヘテロハイブリドーマの作製
a)ヒト末梢血白血球の回収(比重遠心法)
ヘパリン採血したヒト末梢血40 mLを10 mLずつ50 mLのチューブに分注し、滅菌PBCを25 mL加え混和し、HISTOPAQUE(SIGMA H8889)を50 mLチューブに15 mLずつ分注したものに重層し、800rpm、30min 室温で遠心した。遠心後、白血球層を回収した。
b)融合パートナー細胞(SPYMEG)の回収
75cm2培養フラスコで増殖させたSPYMEG(培地:10 %FBS-RPMI)を回収した。
c)細胞融合
回収したヒト末梢血白血球とSPYMEGを2:1〜10:1の割合になるように混和し、遠心した(末梢血40 mLから4〜8×107個得られた。SPYMEGは75cm2フラスコ4本分を使用した)。ペレットに50 %PEG(PEG4000、MERCK Cat No 1097270100、RPMI(RPMI1640、SIGMA、Cat No R8758)で等量希釈)0.6-1.0 mL加え、細胞融合を行った。RPMI血清無添加培地で洗浄後、15 %FBS(EQUITECH-BIO INC Lot.SFB30-1548)-HAT(HAT supplement(BM-condimed、roche Cat No 663573)(50x)、GIBCO Cat No 21060-017) 1 %BM 培地160 mLでサスペンドし、96穴プレート8枚に播種した。播種より3日後に培地を交換し、ハイブリドーマのコロニー形成が確認された段階で(2〜3週間後)96穴プレートから培養上清をサンプリングし、1次スクリーニングを行った。
IgG精製プロトコール
サンプル(培養上精)を流速1滴/秒でアプライし、パススルーを回収した。PBS/0.1 %NaN3でカラムを流速を最大にして洗った(吸光度計でA280=0.05以下になるまで洗った)。カラムベッド体積の2-5倍量の0.17M Glycine-HCl buffer pH 2.3 で流速は全速で解離した。フラクションコレクターを用いて解離物を試験管に集めた。試験管には1MTris-HCl buffer pH8.0を解離物量(mL)の1/5以上入れておいた。解離物と中和用1M Tris-HCl buffer pH8.0とはなるべく早く混和した。各フラクションのA280を測定後、蛋白のあるフラクションを探し、A280=0.1以上のフラクションをプールした。
プール後pH試験紙でpH8.0であることを確認した。プールしたものは12.5 %ゲル、サンプル buffer(2ME+)でSDS-PAGEを行い、純度をチェックした。各レーン当たりのサンプル量は5 μgとし、前lotも同量泳動し、比較した。透析チューブに詰め、回収体積の100倍以上のPBS又はPBS/0.1 %NaN3で1回6時間以上で3回以上透析した。濃縮終了後透析チューブを脱イオン水で十分に洗浄してから、透析チューブをよく揉み、チューブ壁についたタンパク質を溶かし、濃縮液をチューブから出した。その後、濃度を測定した。
あるいは、フラクションコレクターを用いず、解離物をまとめて1本のメスシリンダー、ビーカー等で撹拌しながら回収することもできる。この場合も中和用1M Tris-HCl buffer pH8.0を解離物回収量(mL)の1/5以上入れ、回収後pH試験紙でpH8.0であることを確認する。仮にpH8.0以下の時は中和用bufferを加え、即座にpH8.0とする。
ELISA法によるヒトIgGの測定
a)感作プレートの作製
ウサギ抗ヒトIgGポリクローナル抗体を感作用Buffer(PBS)で10 μg/mLに希釈した。50μl/wellずつマイクロプレート(Nunc MaxiSorp)に分注した。4 ℃で一晩静置した。感作用Bufferを除去し、水分を振り取った。Blocking用Buffer(1 %BSA 0.1 %NaN3 in PBS)を100μl/wellずつ分注し、4 ℃で1晩静置した。
b)ELISA法
ハイブリドーマ培養上清を感作マイクロプレート(aで準備したもの)に50μl/wellずつ分注した。室温で1時間静置反応した。反応液を除去し、洗浄用Buffer(0.05 %Tween20/PBS)で3回洗浄後、水分を振り取った。標識抗体(Peroxidase系 5000倍希釈して使用、抗ヒト IgG POD標識ポリクローナル抗体)を希釈し、50μl/wellずつ分注した後、室温で1時間静置した。酵素基質液(テトラメチルベンチジン溶液)を調製した。プレートの標識抗体液を除去し、洗浄用Bufferで3回洗浄後、水分を振り取った。酵素基質液を50μl/wellずつ分注した。室温で15分程度反応させた。反応停止液(2N H2SO4)を50μl/wellずつ分注した。プレートリーダーにより吸光度(主波長A450/副波長A620)を測定した。本試験で用いたELISA法の概念図を図2に示す。
Western-blottingによるヒトIgGの確認
1 mg/mLの抗体溶液とサンプルバッファーを等量混和し、5分間煮沸した。10 μl(抗体5 μg)を12.5 %ゲルにアプライした。SDS-PAGEを行い、PVDF膜(immobilon-P CatNo IPVH00010)に転写し、4 ℃ O/N in 2 %スキムミルク/PBSでブロッキングした。検出用抗体として抗ラット IgG POD ×2500 in 10 % BlockAce / PBSを用い、室温で1時間処理した。バッファー(0.05 % Tween 20 in PBS)で3回洗浄した。基質はPIERCE(super signal WestPico Chemiluminescenct Substrate、code.34080 )を用い、露光は1分で現像した。フィルムはHyperfilm ECL Amersham Bioscience Cat No RPN3103Kを用い、現像液はレンドール(富士フィルム)停止液は3 %酢酸、定着液はレンフィックス(富士フィルム)をそれぞれ用いた。
結果
a)融合パートナー細胞の作製
作製した融合パートナー細胞SPYMEGと既存のヒト融合パートナー細胞Karpas(Abraham Karpas et al.,Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Feb 13;98(4):1799-1804)を比較して観察した(図3)。SPYMEGは一般的なマウスミエローマ細胞と同様に球形の細胞であり、Karpasに比較して接着性が弱かった。さらに、増殖能は高かった(データ示さず)。これらのことから、SPYMEGの融合パートナー細胞としての性能は、Karpasよりも高いことが示された。さらに、確立された融合パートナー細胞SPYMEGは、凍結後に起眠し、100 mL培養(1ヶ月培養)をしたときでも産生能を消失することなく、安定的であることが示された(データ示さず)。
表1にSPYMEGとヒト末梢血白血球細胞を融合して得られたハイブリドーマ(抗体産生細胞)からのIgGの産生を示す。ハイブリドーマを96穴マイクロプレート8枚(768ウエル)に播種し、コロニーを形成したウエル数、そのうちIgGを産生したウエル数、さらにその中で3週間以上培養したときにIgGの産生を維持したウエル数を示す。ELISA法によるスクリーニングを行った。
この結果から、本試験によりIgGを産生するハイブリドーマが作製されたことが示された。また、既存の融合パートナー細胞KarpasからはIgG産生クローンを得ることができなかった。このことから、SPYMEGはKarpasよりも効率よくハイブリドーマを作製できる融合パートナー細胞であることが示された。
さらに、各クローンの溶出フラクション、透析・濃縮後のサンプルの確認をした(図5)。SDS-PAGEでELISA陰性クローンでもIgGのH鎖、L鎖と思われるバンドが確認されているが、抗ヒトIgG抗体を用いたWestern-blotの結果、検出されないことから、FBS由来のIgGであると予想された。ELISA陰性クローンのlane5でバンドが検出されているが、陰性の判断が培養上精でのELISAの結果であることから、このクローンはごく少量IgGを産生していることが考えられる。また、今回の結果から、SPYMEG自身もヒトIgGを産生していないことが確認された。
表2に、陽性を示した各クローン培養上清からの精製IgGの収量を示す。培養上清100 mLからの精製IgGから算出した、培養上清中のヒトIgG濃度は2〜11 μg/mLだった。通常のマウスハイブリドーマとほぼ同等の濃度であることが確認された。
ヘテロハイブリドーマの作製方法の改良
〔実施例2〕においては末梢血をPBSで希釈し、HISTPAQUEに重層し遠心していたが、より純度の高い白血球(B細胞)を得るために、末梢血をHetaSep(HETASTARCH)と混和して赤血球を除く前処理を行ってから、HISTPAQUEに重層するという方法によりヒト末梢血白血球を回収した(図6)。
〔実施例2〕に記載の方法により、回収されたヒト末梢血白血球と、融合パートナー細胞SPYMEGの細胞融合を行った。細胞融合における基礎培地として、PRMIの代わりに無血清培地DMEMを用いた。
作製されたヘテロハイブリドーマについて〔実施例3〕および〔実施例4〕に記載の方法により、IgGの精製およびELISA法によるヒトIgGの測定を行った。その結果、細胞融合により得られたコロニーの形成数、およびIgG産生クローン数がともに、ヘテロハイブリドーマの作製方法に改良を加えることで、増加していることが確認された(図7)。
インフルエンザワクチンに対する反応性の確認
〔実施例7〕の方法によって作製されたIgG産生クローンのインフルエンザワクチンに対する反応性の確認を行った。具体的には、以下の工程により、インフルエンザワクチンを感さしたプレート、および何も感させずブロッキングのみ行ったプレート(非特異反応するクローンの除去)におけるクローンのIgG産生をサンドイッチELISAで確認した。
溶液を除き、ブロッキングバッファーを200μl/well加え一晩静置した(ブロッキング)。ブロッキングバッファーを除き、ハイブリドーマの培養上清を50μl/well加え室温で1時間反応させた。上清を除き、0.05%TweenPBSで3回洗浄した。
抗ヒトIgGHRP標識抗体(MBL:206)を5000倍希釈で加え1時間室温で反応させた。3回洗浄後、発色基質を50μlずつ加え15分間発色させ、反応停止液を加えてプレートリーダーで吸光度(OD450)を測定した。
その結果、10クローンほどインフルエンザワクチンに反応するクローンが確認された(図8)。本発明のヘテロハイブリドーマにより、抗原特異的に反応するヒト抗体の確立に成功した。
Western-blottingによるヒトIgGの確認
インフルエンザHAワクチンをサンプルとしてヒトIgG産生ハイブリドーマの培養上清のWestern-blottingの反応性を確認した。
インフルエンザHAワクチンとサンプルバッファーを等量混和し、5分間煮沸した。20μl(ワクチン10μl)を12.5%ゲルにアプライした。SDS-PAGEを行い、PVDF膜(immobilon-P CatNo IPVH00010)に転写し、4 ℃ O/N in 2 %スキムミルク/PBSでブロッキングした。検出用抗体として抗ヒトIgG HRP(MBL code 206)× 3000 in 10 % BlockAce / PBSを用い、室温で1時間処理した。バッファー(0.05 % Tween 20 in PBS)で3回洗浄した。基質はPIERCE(super signal WestPico Chemiluminescenct Substrate、code.34080 )を用い、露光は1分で現像した。フィルムはHyperfilm ECL Amersham Bioscience Cat No RPN3103Kを用い、現像液はレンドール(富士フィルム)停止液は3 %酢酸、定着液はレンフィックス(富士フィルム)をそれぞれ用いた。
その結果、クローン(6-19)において特異的なバンドを検出した(図9)。
精製ヒトIgG(6-19)のSDS-PAGEおよび反応性の確認
まず、〔実施例9〕のWestern-blottingにおいて反応性を示したヒトIgG産生ハイブリドーマの培養上清から、以下の工程によりインフルエンザHAワクチンに反応するヒトIgGを精製した。
以上の結果、培養上清200mlから2.5mgの精製IgGが得られ(図10)、結合活性も保持されていることが確認された。
本発明によって治療用の抗体を得ることができる感染症として、たとえば、インフルエンザ、AIDS、HCVやHBVなどのウイルス性肝炎などを示すことができる。
Claims (20)
- 次の細胞(a)および(b)を融合することにより得ることができる融合パートナー細胞;
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、および
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞。 - 第1の動物種がマウスであり、ミエローマ細胞が以下に示すマウスミエローマ細胞、およびこれらの細胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される請求項1に記載の融合パートナー細胞;
MOPC21、P3X63AG8、SP2/0、NS-1、P3.X63AG8.653、F0、S194/5.XXO.BU-1、FOX-NY、およびSP2/0-Ag14。 - 第2の動物種がヒトであり、白血病細胞が以下に示す白血病細胞、およびこれらの細胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される請求項1に記載の融合パートナー細胞;
MEG-01、HEL、UT-7、M07e、MEG-A2、およびDAMI。 - 第1の細胞がSP2/0−Ag14であり、第2の細胞がMEG-01である、請求項1に記載の融合パートナー細胞。
- 受託番号 FERM BP−10761として寄託された融合パートナー細胞SPYMEG。
- 以下の細胞(1)および(2)を融合することによって得ることができるハイブリドーマ;
(1)次の細胞(a)および(b)を融合することにより得ることができる融合パートナー細胞、および
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞、および
(2)第3の細胞。 - 第1の動物種がマウスであり、ミエローマ細胞が以下に示すマウスミエローマ細胞、およびこれらの細胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される請求項6に記載のハイブリドーマ;
MOPC21、P3X63AG8、SP2/0、NS-1、P3.X63AG8.653、F0、S194/5.XXO.BU-1、FOX-NY、およびSP2/0-Ag14。 - 第2の動物種がヒトであり、白血病細胞が以下に示す白血病細胞、およびこれらの細胞株から誘導された細胞株で構成される群から選択される請求項6に記載のハイブリドーマ;
MEG-01、HEL、UT-7、M07e、MEG-A2、およびDAMI。 - 第1の細胞がSP2/0−Ag14であり、第2の細胞がMEG-01である、請求項6に記載のハイブリドーマ。
- 融合パートナー細胞が、受託番号 FERM BP−10761として寄託されたSPYMEGである、請求項6に記載のハイブリドーマ。
- 第3の細胞が、第2の細胞と同じ動物種に由来する細胞である請求項6に記載のハイブリドーマ。
- 第3の細胞が、抗体産生細胞である請求項11に記載のハイブリドーマ。
- 以下の工程を含む融合パートナー細胞を製造する方法;
(1)次の細胞(a)および(b)を融合する工程、
(a)第1の動物種に由来するミエローマ細胞、
(b)第2の動物種に由来する白血病細胞であって、細胞周期にExtra-S期を含む白血病細胞、および
(2)工程(1)で融合した細胞を培養し、培養物から融合パートナー細胞を回収する工程。 - 以下の工程を含むハイブリドーマを製造する方法;
(1)請求項13に記載の方法によって得られた融合パートナー細胞と、抗体産生細胞を融合させる工程、および
(2)工程(1)で融合した細胞を培養し、培養物からハイブリドーマを回収する工程。 - 以下の工程を含む抗体産生細胞を製造する方法;
(1)請求項13記載の方法によって得られた、融合パートナー細胞と抗体産生細胞を融合させてハイブリドーマを得る工程、および
(2)工程(1)で得たハイブリドーマを抗体産生細胞として回収する工程。 - 付加的に工程(1)で得たハイブリドーマをクローニングする工程を含む、請求項15に記載の方法。
- 以下の工程を含む抗体を製造する方法;
(1)請求項13に記載の方法によって得られた融合パートナー細胞と、抗体産生細胞を融合させてハイブリドーマを得る工程、および
(2)工程(1)で得たハイブリドーマを培養し、培養物から抗体を回収する工程。 - 付加的に工程(1)で得たハイブリドーマをクローニングする工程を含む、請求項17に記載の方法。
- 以下の工程を含む感染症に対する抗体を製造する方法;
(1)請求項13に記載の方法によって得られた融合パートナー細胞と、感染症の病原体抗原の暴露履歴のある対象由来の抗体産生細胞を融合させてハイブリドーマを得る工程、および
(2)工程(1)で得たハイブリドーマを培養し、培養物から感染症に対する抗体を回収する工程。 - 感染症が、インフルエンザ、AIDS、またはウイルス性肝炎のいずれかである請求項19に記載の方法。
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