JPWO2007094218A1 - Modified oligonucleotide - Google Patents

Abstract

オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含む修飾オリゴヌクレオチドであり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、カルボン酸またはステロイド骨格を有する化合物をリンカーを介して結合させた修飾ヌクレオシドである修飾オリゴヌクレオチドを提供する。この修飾オリゴヌクレオチドは、式（ＸＩＡ）で表される固相合成用ユニット化合物または式（ＸＩＳ）で表される固相合成用ユニット化合物を出発原料として、固相合成により製造することができる。【化１】前記式中、Ｒ1、Ｒ2、ｎ、ｍ、ＲAおよびＲSは、明細書中に定義のとおり。A modified oligonucleotide comprising a modified nucleoside as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide, wherein the modified nucleoside is bound to the 3 ′ end of the nucleoside via a linker with a compound having a carboxylic acid or a steroid skeleton A modified oligonucleotide is provided. This modified oligonucleotide can be produced by solid-phase synthesis using a solid-phase synthesis unit compound represented by the formula (XIA) or a solid-phase synthesis unit compound represented by the formula (XIS) as a starting material. Wherein R 1, R 2, n, m, RA and R S are as defined in the specification.

Description

本発明は、修飾オリゴヌクレオチドに関するものである。   The present invention relates to modified oligonucleotides.

近年、遺伝情報そのものを治療の対象としてとらえるという方法論が普及しつつある。この方法論の一つに、オリゴヌクレオチドを用いたアンチセンス法がある。アンチセンス法とは、化学合成したオリゴヌクレオチド（例えば、１５〜２０の塩基対から成る一本鎖DNA）を細胞に加え、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とＤＮＡ等／ｍＲＮＡ二本鎖核酸を形成させることにより、標的遺伝子の発現を塩基配列特異的に抑制し、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳過程を阻害する方法である。アンチセンス法では、病因となるウイルスまたは遺伝子の塩基配列が既知の場合、アンチセンス分子を理論的に設計し、それを合成するのが可能であることから、これまで治癒が困難と考えられてきた様々なウイルスを原因とする疾患および遺伝子疾患に対する有効な治療方法の一つとして期待されている。   In recent years, a methodology of treating genetic information itself as a target for treatment has been spreading. One of the methodologies is an antisense method using oligonucleotides. In the antisense method, a chemically synthesized oligonucleotide (for example, a single-stranded DNA consisting of 15 to 20 base pairs) is added to a cell to form a target messenger RNA (mRNA) and DNA / mRNA double-stranded nucleic acid. Thus, the expression of the target gene is suppressed in a base sequence-specific manner, and the translation process from mRNA to protein is inhibited. In the antisense method, if the base sequence of the pathogenic virus or gene is known, it is possible to theoretically design an antisense molecule and synthesize it. It is expected as one of the effective treatment methods for diseases caused by various viruses and genetic diseases.

また、ごく最近、オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子発現抑制法として、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ interference、ＲＮＡ干渉）を利用した方法に、注目が集まっている。このＲＮＡｉとは、二本鎖ＲＮＡを細胞に導入することにより、同じ塩基配列を有する細胞の染色体由来のＲＮＡが分解され、切断される現象を指す。このＲＮＡｉの機構は、現在のところ、次のように考えられている。先ず、長鎖二本鎖ＲＮＡが、酵素（Ｄｉｃｅｒと呼ばれる）により３’−ＵＵ型のダングリングエンド構造を持つ２１塩基程度の長さの二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）と呼ばれる）に加水分解される。そのｓｉＲＮＡが、標的ｍＲＮＡとＲＮＡ／ｍＲＮＡ二本鎖核酸を形成し、この二本鎖核酸を認識する細胞内タンパク質（ＲＩＳＣ（RNA-induced Silencing Complex）と呼ばれる）と、この二本鎖核酸とが結合し、この結合体により、標的ｍＲＮＡが切断されるというものである。このＲＮＡｉを利用する方法によると、多くの場合、アンチセンス法と比較して１／１００程度の濃度のＲＮＡを用いて同等の効果が得られている。従って、ＲＮＡｉを利用する方法も、これまで治癒が困難と考えられてきた様々なウイルスを原因とする疾患および遺伝子疾患に対する有効な治療方法の一つとして期待が高まっている。   Recently, attention has been focused on a method using RNAi (RNA interference) as a gene expression suppression method using oligonucleotides. RNAi refers to a phenomenon in which RNA derived from a cell chromosome having the same base sequence is degraded and cleaved by introducing double-stranded RNA into a cell. The mechanism of RNAi is currently considered as follows. First, a long double-stranded RNA is a double-stranded RNA having a length of about 21 bases (called siRNA (short interfering RNA)) having a 3′-UU type dangling end structure by an enzyme (called Dicer). To be hydrolyzed. The siRNA forms an RNA / mRNA double-stranded nucleic acid with a target mRNA, and an intracellular protein (referred to as RISC (RNA-induced Silencing Complex)) that recognizes the double-stranded nucleic acid, and the double-stranded nucleic acid It binds and the target mRNA is cleaved by this conjugate. According to the method using RNAi, in many cases, an equivalent effect is obtained using RNA at a concentration of about 1/100 compared with the antisense method. Therefore, the method using RNAi is also expected to be one of effective treatment methods for diseases caused by various viruses and genetic diseases that have been considered difficult to cure.

アンチセンス法、ＲＮＡｉを利用する方法等、オリゴヌクレオチドを用いる方法では、細胞内に導入されたオリゴヌクレオチドを、安定に存在させる必要もあるが、細胞内外には核酸加水分解酵素（ヌクレアーゼ）が存在し、導入されたオリゴヌクレオチド、特に天然型のオリゴヌクレオチドは容易に分解されてしまうという問題があった。   In the method using oligonucleotides such as antisense method and RNAi method, it is necessary to make the oligonucleotide introduced into the cell stable, but there is a nucleic acid hydrolase (nuclease) inside and outside the cell. However, the introduced oligonucleotide, particularly the natural oligonucleotide, has a problem that it is easily degraded.

天然型オリゴヌクレオチドとの二本鎖形成能力向上および形成した二本鎖の安定性向上を目的とする、種々のオリゴヌクレオチド類似体も開発されてきた。このようなオリゴヌクレオチド類似体としては、例えば、天然型オリゴヌクレオチドのヌクレオシドのリボースの２’水酸基を、アルコキシ基（例えばメトキシ基）やハロゲン原子（例えばフッ素原子）に置き換えたオリゴヌクレオチド類似体（例えば、非特許文献１参照）等が知られている。これらのオリゴヌクレオチド類似体は、天然型オリゴヌクレオチドとの二本鎖形成能力の向上および形成した二本鎖の安定性の向上が確認されている。しかし、これらのオリゴヌクレオチド類似体は、天然型オリゴヌクレオチドと構造が類似しているため、ヌクレアーゼ耐性の向上は実現されていなかった。   Various oligonucleotide analogs have also been developed for the purpose of improving the ability to form a double strand with a natural oligonucleotide and improving the stability of the formed double strand. As such an oligonucleotide analogue, for example, an oligonucleotide analogue in which the 2 ′ hydroxyl group of the ribose of a nucleoside of a natural oligonucleotide is replaced with an alkoxy group (eg, a methoxy group) or a halogen atom (eg, a fluorine atom) (for example, And non-patent document 1). These oligonucleotide analogues have been confirmed to improve the ability to form double strands with natural oligonucleotides and to improve the stability of the double strands formed. However, since these oligonucleotide analogues are similar in structure to natural oligonucleotides, no improvement in nuclease resistance has been realized.

一方、前記修飾オリゴヌクレオチドとしてセンス鎖の３’末端にコレステロールを結合させた修飾ｓｉＲＮＡが、動物モデルで高脂血症の治療において有用であることが確認されている（例えば、非特許文献２参照）。   On the other hand, it has been confirmed that a modified siRNA in which cholesterol is bound to the 3 ′ end of the sense strand as the modified oligonucleotide is useful in the treatment of hyperlipidemia in an animal model (see, for example, Non-Patent Document 2). ).

このように、優れたヌクレアーゼ耐性という特性と、優れた二本鎖形成能力および形成した二本鎖の優れた安定性という特性は、両立するのが困難であるという問題があった。しかし、ＤＮＡチップ、遺伝子診断薬等にオリゴヌクレオチド類似体を用いる場合、安定した診断結果を得るためにも、これらの特性が優れたオリゴヌクレオチド修飾体の提供が望まれていた。
Andrew M. Kawasaki, Martin D. Casper, Susan M. Freier, Elena A. Lesnik, Maryann C. Zounes, Lendell L. Cummins, Carolyn Gonzalez and P. Dan Cook, "Uniformly modified 2'-deoxy-2'-fluoro phophorothioate oligonucleotides as nuclease-resistant antisense compounds with highly affinity and specificity for RNA targets", Journal of Medicinal Chemistry, １９９３年、第３６巻、p.831. Jurgen Sontschek et al., Nature, 2004年、第432巻、p.173 As described above, there is a problem that it is difficult to achieve both the characteristics of excellent nuclease resistance and the characteristics of excellent duplex forming ability and excellent stability of the formed duplex. However, when oligonucleotide analogues are used for DNA chips, gene diagnostics, etc., it has been desired to provide modified oligonucleotides having excellent properties in order to obtain stable diagnostic results.
Andrew M. Kawasaki, Martin D. Casper, Susan M. Freier, Elena A. Lesnik, Maryann C. Zounes, Lendell L. Cummins, Carolyn Gonzalez and P. Dan Cook, "Uniformly modified 2'-deoxy-2'-fluoro phophorothioate oligonucleotides as nuclease-resistant antisense compounds with highly affinity and specificity for RNA targets ", Journal of Medicinal Chemistry, 1993, 36, p.831. Jurgen Sontschek et al., Nature, 2004, 432, p.173

そこで、本発明は、ヌクレアーゼ耐性および二本鎖形成能という２つの特性が優れた３’末端が修飾されたオリゴヌクレオチドの提供を目的とする。   Accordingly, an object of the present invention is to provide an oligonucleotide having a modified 3 'end that is excellent in two properties of nuclease resistance and double-strand forming ability.

本発明は、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含む修飾オリゴヌクレオチドであり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、下記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾ヌクレオシドである修飾オリゴヌクレオチドである。
Ｒ^A−ＣＯＯＨ （ＩＩＩ）
前記式中、Ｒ^Aは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味する。The present invention is a modified oligonucleotide containing a modified nucleoside as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide, and the modified nucleoside is represented by the following formula (III) via a linker at the 3 ′ end of the nucleoside. A modified oligonucleotide that is a modified nucleoside with a carboxylic acid attached.
R ^A —COOH (III)
In the above formula, R ^A represents a saturated aliphatic hydrocarbon group, an unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an aryl group, or a heterocyclic group.

また、本発明は、二本鎖修飾オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列をするセンス鎖と、前記センス鎖に対するアンチセンス鎖とを含み、
前記アンチセンス鎖および前記センス鎖のうち、少なくとも前記アンチセンス鎖が、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド類似体であり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、下記式（ＩＩ）で表されるステロイド骨格を有する化合物を結合させた修飾ヌクレオシドである二本鎖修飾オリゴヌクレオチドである。
Ｒ^S−ＯＨ （ＩＩ）
前記式中、Ｒ^Sは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味する。Moreover, the present invention is a double-stranded modified oligonucleotide,
The modified oligonucleotide comprises a sense strand having the same base sequence as a part of the target mRNA, and an antisense strand to the sense strand;
Among the antisense strand and the sense strand, at least the antisense strand is an oligonucleotide analogue containing a modified nucleoside as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide, and the modified nucleoside is at the 3 ′ end of the nucleoside And a double-stranded modified oligonucleotide which is a modified nucleoside to which a compound having a steroid skeleton represented by the following formula (II) is bound via a linker.
R ^S —OH (II)
In the above formula, R ^S means a steroid skeleton optionally having one or more substituents, wherein one or more single bonds in the skeleton are optionally replaced with double bonds.

本発明は、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれるヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、カルボン酸またはステロイド骨格を有する化合物を結合させることにより修飾し、その修飾オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性向上および二本鎖形成能の向上を実現した。   The present invention is modified by attaching a compound having a carboxylic acid or a steroid skeleton to a 3 ′ end of a nucleoside contained as a constituent component at the 3 ′ end of an oligonucleotide via a linker, and the nuclease of the modified oligonucleotide Improved resistance and improved duplex formation ability.

図１（ａ）は、３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの例および非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例のＲＮａｓｅＬ発現濃度を示すグラフである。レーン１はコントロールを、レーン２は５０ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、レーン３は１００ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、レーン４は２００ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、意味する。FIG. 1 (a) is a graph showing RNase L expression levels of an example of a modified double-stranded oligonucleotide in which palmitic acid is bound to the 3 'end via a linker and an example of an unmodified double-stranded oligonucleotide. Lane 1 represents a control, lane 2 represents a 50 nM modified double-stranded oligonucleotide, lane 3 represents a 100 nM modified double-stranded oligonucleotide, and lane 4 represents a 200 nM modified double-stranded oligonucleotide. 図１（ｂ）は、３’末端にオレイン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖の例および非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例のＲＮａｓｅＬ発現濃度を示すグラフである。レーン１はコントロールを、レーン２は５０ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、レーン３は１００ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、レーン４は２００ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、意味する。FIG. 1 (b) is a graph showing RNase L expression levels of an example of a modified DNA sense strand in which oleic acid is bound to the 3 'end via a linker and an example of an unmodified double-stranded oligonucleotide. Lane 1 represents a control, lane 2 represents a 50 nM modified double-stranded oligonucleotide, lane 3 represents a 100 nM modified double-stranded oligonucleotide, and lane 4 represents a 200 nM modified double-stranded oligonucleotide. 図１（ｃ）は、３’末端にコレステロールがリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖の例および非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの一例のＲＮａｓｅＬ発現濃度を示すグラフである。レーン１はコントロールを、レーン２は５０ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、レーン３は１００ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、レーン４は２００ｎＭの修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを、意味する。FIG. 1 (c) is a graph showing the RNase L expression concentration of an example of a modified DNA sense strand in which cholesterol is bound to the 3 'end via a linker and an example of an unmodified double-stranded oligonucleotide. Lane 1 represents a control, lane 2 represents a 50 nM modified double-stranded oligonucleotide, lane 3 represents a 100 nM modified double-stranded oligonucleotide, and lane 4 represents a 200 nM modified double-stranded oligonucleotide.

本発明は、前記のように、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含む修飾オリゴヌクレオチドであり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、下記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾ヌクレオシドである修飾オリゴヌクレオチドである。
Ｒ^A−ＣＯＯＨ （ＩＩＩ）
前記式中、Ｒ^Aは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味する。The present invention, as described above, is a modified oligonucleotide containing a modified nucleoside as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide, and the modified nucleoside is attached to the 3 ′ end of the nucleoside via a linker through the following formula (III The modified oligonucleotide which is the modified nucleoside which the carboxylic acid represented by this is couple | bonded.
R ^A —COOH (III)
In the above formula, R ^A represents a saturated aliphatic hydrocarbon group, an unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an aryl group, or a heterocyclic group.

前記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾オリゴヌクレオチドとしては、下記式（ＩＡ）で表される修飾オリゴヌクレオチドが好ましい。   The modified oligonucleotide to which the carboxylic acid represented by the formula (III) is bound is preferably a modified oligonucleotide represented by the following formula (IA).

前記式中、
Ｒ’−ＯＨはオリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｌは二価の基を意味し、
Ｒ^Aは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味する。

In the above formula,
R′—OH means an oligonucleotide,
The hydroxyl group in R′—OH means the hydroxyl group at the 3 ′ end of the modified nucleoside contained as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide,
L means a divalent group,
R ^A means a saturated aliphatic hydrocarbon group, an unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an aryl group, or a heterocyclic group.

前記式（ＩＡ）中、前記飽和脂肪族炭化水素基は、炭素数１〜２５を有する飽和脂肪族炭化水素基であるのが好ましい。また、前記式（ＩＡ）中、前記不飽和脂肪族炭化水素基は、炭素数３〜２５を有する不飽和脂肪族炭化水素基であるのが好ましい。   In the formula (IA), the saturated aliphatic hydrocarbon group is preferably a saturated aliphatic hydrocarbon group having 1 to 25 carbon atoms. In the formula (IA), the unsaturated aliphatic hydrocarbon group is preferably an unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 3 to 25 carbon atoms.

前記式（ＩＡ）中、前記Ｒ^Aは、ＣＨ₃−（ＣＨ₂）₁₄−またはＣＨ₃−（ＣＨ₂）₇−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ₂）₇−であるのがより好ましい。In the formula (IA), R ^A is more preferably CH ₃ — (CH ₂ ) ₁₄ — or CH ₃ — (CH ₂ ) ₇ —CH═CH— (CH ₂ ) ₇ —.

前記式（ＩＡ）中、前記二価の基は、下記式（ＩＶＡ）に示す二価の基であるのが好ましい。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ− （ＩＶＡ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ₂）_m−または（ＣＨ₂）_m−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ₂）_n−または−（ＣＨ₂）_n−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。In the formula (IA), the divalent group is preferably a divalent group represented by the following formula (IVA).
-X-M-Y- (IVA)
In the above formula,
—X— is — (CH ₂ ) _m — or (CH ₂ ) _m —CH (CH ₂ OH) —,
-Y- is, - (CH _{2) n} - or _{- (CH 2) n -CH (} CH 2 OH) - and is,
-M- is -O-C (= O) NH-, -O-, -C (= O) -NH- or -NH-C (= O)-,
m and n are each independently an integer of 1 to 20.

前記式（ＩＡ）中、前記二価の基は、下記式（ＩＶＡ−１）に示す二価の基であるのが好ましい。
―ＣＨ₂―ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ₂）_n− （ＩＶＡ−１）
前記式中、ｎは１〜２０の整数である。In the formula (IA), the divalent group is preferably a divalent group represented by the following formula (IVA-1).
—CH ₂ —CH (CH ₂ OH) —O—C (═O) NH— (CH ₂ ) _n — (IVA-1)
In said formula, n is an integer of 1-20.

前記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。前記修飾オリゴヌクレオチドが、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列を有するのが好ましい。   The modified oligonucleotide to which the carboxylic acid represented by the formula (III) is bound may be a single-stranded oligonucleotide. It is preferable that the modified oligonucleotide is antisense DNA or antisense RNA, and the modified oligonucleotide has a sequence complementary to at least a part of mRNA encoding an endonuclease.

前記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。   The modified oligonucleotide to which the carboxylic acid represented by the formula (III) is bound may be a double-stranded oligonucleotide.

本発明は、また、前記のように、二本鎖修飾オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列をするセンス鎖と、前記センス鎖に対するアンチセンス鎖とを含み、
前記アンチセンス鎖および前記センス鎖のうち、少なくとも前記アンチセンス鎖が、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド類似体であり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、下記式（ＩＩ）で表されるステロイド骨格を有する化合物を結合させた修飾ヌクレオシドである二本鎖修飾オリゴヌクレオチドである。
Ｒ^S−ＯＨ （ＩＩ）
前記式中、Ｒ^Sは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味する。The present invention is also a double-stranded modified oligonucleotide as described above,
The modified oligonucleotide comprises a sense strand having the same base sequence as a part of the target mRNA, and an antisense strand to the sense strand;
Among the antisense strand and the sense strand, at least the antisense strand is an oligonucleotide analogue containing a modified nucleoside as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide, and the modified nucleoside is at the 3 ′ end of the nucleoside And a double-stranded modified oligonucleotide which is a modified nucleoside to which a compound having a steroid skeleton represented by the following formula (II) is bound via a linker.
R ^S —OH (II)
In the above formula, R ^S means a steroid skeleton optionally having one or more substituents, wherein one or more single bonds in the skeleton are optionally replaced with double bonds.

前記オリゴヌクレオチド類似体は、式（ＩＳ）で表されるのが好ましい。   The oligonucleotide analog is preferably represented by the formula (IS).

前記式中、
Ｒ’−ＯＨはオリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｌは二価の基を意味し、
Ｒ^Sは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味する。

In the above formula,
R′—OH means an oligonucleotide,
The hydroxyl group in R′—OH means the hydroxyl group at the 3 ′ end of the modified nucleoside contained as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide,
L means a divalent group,
R ^S means a steroid skeleton optionally having one or more substituents, wherein one or more single bonds in the skeleton are optionally replaced with double bonds.

前記式（ＩＳ）中、前記Ｒ^Sは、In the formula (IS), R ^S is

からなる群から選択されるのが好ましい。

Preferably it is selected from the group consisting of

前記式（ＩＳ）中、 前記二価の基は、下記式（ＩＶＳ）に示す二価の基であるのが好ましい。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ− （ＩＶＳ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ₂）_m−または（ＣＨ₂）_m−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ₂）_n−または−（ＣＨ₂）_n−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。In the formula (IS), the divalent group is preferably a divalent group represented by the following formula (IVS).
-X-M-Y- (IVS)
In the above formula,
—X— is — (CH ₂ ) _m — or (CH ₂ ) _m —CH (CH ₂ OH) —,
-Y- is, - (CH _{2) n} - or _{- (CH 2) n -CH (} CH 2 OH) - and is,
-M- is -O-C (= O) NH-, -O-, -C (= O) -NH- or -NH-C (= O)-,
m and n are each independently an integer of 1 to 20.

前記式（ＩＳ）中、前記二価の基は、下記式（ＩＶＳ−１）に示す二価の基であるのが好ましい。
―ＣＨ₂―ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ₂）_n− （ＩＶＳ−１）
前記式中、ｎは１〜２０の整数である。In the formula (IS), the divalent group is preferably a divalent group represented by the following formula (IVS-1).
—CH ₂ —CH (CH ₂ OH) —O—C (═O) NH— (CH ₂ ) _n — (IVS-1)
In said formula, n is an integer of 1-20.

前記修飾オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ interference）を引き起こすオリゴヌクレオチドであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列を有するのが好ましい。   The modified oligonucleotide is an oligonucleotide that causes RNAi (RNA interference), and the modified oligonucleotide preferably has the same base sequence as that of a part of mRNA encoding endonuclease.

前記修飾オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）であり、
前記ｍＲＮＡの一部が、
スタートコドンから７５塩基以上上流の、最初のＡＡ配列に続く１９塩基配列であって、
前記ｍＲＮＡの一部が、前記ｍＲＮＡに対して特異的であり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記１９塩基配列のセンス鎖とアンチセンス鎖との組み合わせであるのがより好ましく、前記センス鎖およびアンチセンス鎖の少なくとも一方が、その３’末端にさらに２つの塩基配列を含むヌクレオチドを有するのがさらに好ましい。The modified oligonucleotide is siRNA (short interfering RNA),
A portion of the mRNA is
A 19-base sequence following the first AA sequence, more than 75 bases upstream from the start codon,
A portion of the mRNA is specific for the mRNA;
More preferably, the modified oligonucleotide is a combination of a sense strand and an antisense strand of the 19 base sequence, and at least one of the sense strand and the antisense strand has two more base sequences at its 3 ′ end. It is further preferred to have a nucleotide containing.

本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼ耐性であるのが好ましい。   In the modified oligonucleotide of the present invention, the oligonucleotide is preferably resistant to nuclease.

本発明はまた、オリゴヌクレオチドを含む遺伝子発現抑制剤であって、前記オリゴヌクレオチドが、本発明の修飾オリゴヌクレオチドである遺伝子発現抑制剤である。   The present invention is also a gene expression inhibitor comprising an oligonucleotide, wherein the oligonucleotide is a modified oligonucleotide of the present invention.

本発明はまた、遺伝子発現に伴う疾患を治療するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、本発明の遺伝子発現抑制剤を含む医薬組成物である。前記医薬組成物は、さらに細胞導入用賦形剤を含むのが好ましい。前記細胞導入用賦形剤は、トランスフェクション試薬であるのが好ましい。The present invention also provides a pharmaceutical composition for treating a disease associated with gene expression,
The said pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition containing the gene expression inhibitor of this invention. The pharmaceutical composition preferably further contains an excipient for cell introduction. The cell introduction excipient is preferably a transfection reagent.

本発明はまた、ＲＮＡｉキットであって、前記キットが、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを含むキットである。   The present invention is also an RNAi kit, wherein the kit includes the modified oligonucleotide of the present invention.

本発明はまた、ＲＮＡｉ研究用試薬であって、前記試薬が、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを含む試薬である。   The present invention is also a reagent for RNAi research, wherein the reagent contains the modified oligonucleotide of the present invention.

本発明はまた、オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を抑制する方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、本発明の修飾オリゴヌクレオチドである方法である。   The present invention is also a method for suppressing gene expression using an oligonucleotide, wherein the oligonucleotide is a modified oligonucleotide of the present invention.

本発明はまた、オリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡｉを引き起こす方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、本発明の修飾オリゴヌクレオチドである方法である。   The present invention is also a method for causing RNAi using an oligonucleotide, wherein the oligonucleotide is a modified oligonucleotide of the present invention.

本発明はまた、下記式（ＸＩＡ）で表される固相合成用化合物を出発原料として、
下記式（ＩＡ）で表される修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
式（ＸＩＡ）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ¹を除去して遊離の水酸基へ変換し、前記遊離の水酸基にオリゴヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得る製造方法である。The present invention also provides a solid phase synthesis compound represented by the following formula (XIA) as a starting material.
A method for producing a modified oligonucleotide represented by the following formula (IA),
R ^{1 of the} unit compound for solid phase synthesis represented by the formula (XIA) is removed and converted to a free hydroxyl group, the oligonucleotide is extended to the free hydroxyl group, then cut out from the solid support and the modified oligo This is a production method for obtaining nucleotides.

前記式中、
Ｒ’−ＯＨは、オリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｒ^Aは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味し、
Ｒ¹は、水酸基の保護基であり、
Ｒ²は、固相担体であり、
Ｌは、式（ＩＶＡ）で表される基である。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ− （ＩＶＡ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ₂）_m−または（ＣＨ₂）_m−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ₂）_n−または−（ＣＨ₂）_n−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。

In the above formula,
R′—OH means an oligonucleotide,
The hydroxyl group in R′—OH means the hydroxyl group at the 3 ′ end of the modified nucleoside contained as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide,
R ^A means a saturated aliphatic hydrocarbon group, an unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an aryl group, or a heterocyclic group;
R ¹ is a hydroxyl protecting group;
R ² is a solid support,
L is a group represented by the formula (IVA).
-X-M-Y- (IVA)
In the above formula,
—X— is — (CH ₂ ) _m — or (CH ₂ ) _m —CH (CH ₂ OH) —,
-Y- is, - (CH _{2) n} - or _{- (CH 2) n -CH (} CH 2 OH) - and is,
-M- is -O-C (= O) NH-, -O-, -C (= O) -NH- or -NH-C (= O)-,
m and n are each independently an integer of 1 to 20.

本発明はまた、下記式（ＩＡ）で表される修飾オリゴヌクレオチド製造のための下記式（ＸＩＡ）で表される固相合成用ユニット化合物である。   The present invention is also a unit compound for solid phase synthesis represented by the following formula (XIA) for producing a modified oligonucleotide represented by the following formula (IA).

前記式中、
Ｒ’−ＯＨは、オリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｒ^Aは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味し、
Ｒ¹は、水酸基の保護基であり、
Ｒ²は、固相担体であり、
Ｌは、式（ＩＶＡ）で表される基である。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ− （ＩＶＡ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ₂）_m−または（ＣＨ₂）_m−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ₂）_n−または−（ＣＨ₂）_n−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。

In the above formula,
R′—OH means an oligonucleotide,
The hydroxyl group in R′—OH means the hydroxyl group at the 3 ′ end of the modified nucleoside contained as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide,
R ^A means a saturated aliphatic hydrocarbon group, an unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an aryl group, or a heterocyclic group;
R ¹ is a hydroxyl protecting group;
R ² is a solid support,
L is a group represented by the formula (IVA).
-X-M-Y- (IVA)
In the above formula,
—X— is — (CH ₂ ) _m — or (CH ₂ ) _m —CH (CH ₂ OH) —,
-Y- is, - (CH _{2) n} - or _{- (CH 2) n -CH (} CH 2 OH) - and is,
-M- is -O-C (= O) NH-, -O-, -C (= O) -NH- or -NH-C (= O)-,
m and n are each independently an integer of 1 to 20.

本発明はまた、下記式（ＸＩＳ）で表される固相合成用化合物を出発原料として、下記式（ＩＳ）で表される修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法であって、
式（ＸＩＳ）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ¹を除去して遊離の水酸基へ変換し、前記遊離の水酸基にオリゴヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得る製造方法である。The present invention is also a method for producing a modified oligonucleotide represented by the following formula (IS) using a compound for solid phase synthesis represented by the following formula (XIS) as a starting material,
R ^{1 of the} unit compound for solid phase synthesis represented by the formula (XIS) is removed and converted to a free hydroxyl group, an oligonucleotide is extended to the free hydroxyl group, then cut out from the solid support and the modified oligo This is a production method for obtaining nucleotides.

前記式中、
Ｒ’−ＯＨは、オリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｒ^Sは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味し、
Ｒ¹は、水酸基の保護基であり、
Ｒ²は、固相担体であり、
Ｌは、式（ＩＶＳ）で表される基であり、
−Ｘ−Ｍ−Ｙ− （ＩＶＳ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ₂）_m−または（ＣＨ₂）_m−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ₂）_n−または−（ＣＨ₂）_n−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。

In the above formula,
R′—OH means an oligonucleotide,
The hydroxyl group in R′—OH means the hydroxyl group at the 3 ′ end of the modified nucleoside contained as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide,
R ^S means a steroid skeleton optionally having one or more substituents, wherein one or more single bonds in the skeleton are optionally replaced with double bonds;
R ¹ is a hydroxyl protecting group;
R ² is a solid support,
L is a group represented by the formula (IVS);
-X-M-Y- (IVS)
In the above formula,
—X— is — (CH ₂ ) _m — or (CH ₂ ) _m —CH (CH ₂ OH) —,
-Y- is, - (CH _{2) n} - or _{- (CH 2) n -CH (} CH 2 OH) - and is,
-M- is -O-C (= O) NH-, -O-, -C (= O) -NH- or -NH-C (= O)-,
m and n are each independently an integer of 1 to 20.

本発明はまた、下記式（ＩＳ）で表される修飾オリゴヌクレオチド製造のための下記式（ＸＩＳ）で表される固相合成用ユニット化合物である。   The present invention is also a unit compound for solid phase synthesis represented by the following formula (XIS) for producing a modified oligonucleotide represented by the following formula (IS).

前記式中、
Ｒ’−ＯＨは、オリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｒ^Sは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味し、
Ｒ¹は、水酸基の保護基であり、
Ｒ²は、固相担体であり、
Ｌは、式（ＩＶＳ）で表される基であり、
−Ｘ−Ｍ−Ｙ− （ＩＶＳ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ₂）_m−または（ＣＨ₂）_m−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ₂）_n−または−（ＣＨ₂）_n−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。

In the above formula,
R′—OH means an oligonucleotide,
The hydroxyl group in R′—OH means the hydroxyl group at the 3 ′ end of the modified nucleoside contained as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide,
R ^S means a steroid skeleton optionally having one or more substituents, wherein one or more single bonds in the skeleton are optionally replaced with double bonds;
R ¹ is a hydroxyl protecting group;
R ² is a solid support,
L is a group represented by the formula (IVS);
-X-M-Y- (IVS)
In the above formula,
—X— is — (CH ₂ ) _m — or (CH ₂ ) _m —CH (CH ₂ OH) —,
-Y- is, - (CH _{2) n} - or _{- (CH 2) n -CH (} CH 2 OH) - and is,
-M- is -O-C (= O) NH-, -O-, -C (= O) -NH- or -NH-C (= O)-,
m and n are each independently an integer of 1 to 20.

次に、本発明について具体的に説明する。   Next, the present invention will be specifically described.

本発明において、「オリゴヌクレオチド」は、例えばヌクレオシドサブユニットのポリマーをいい、そのサブユニット数は特に限定されないが、例えば、４から１００個である。中でも、本発明の修飾オリゴヌクレオチドがＤＮＡである場合には、それらのサブユニット数は、２〜１００個が好ましく、４〜３０個がより好ましく、ＲＮＡである場合には、２〜５０個が好ましく、４〜３０個がより好ましい。なお、本発明における「オリゴヌクレオチド」は、３’末端のヌクレオシドの３’−水酸基が修飾されていること以外は、特に限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドのサブユニットであるヌクレオシドについては、糖部（例えば、２’置換体）および塩基は、当業者に公知な修飾体であってもよい。   In the present invention, “oligonucleotide” refers to, for example, a polymer of nucleoside subunits, and the number of subunits is not particularly limited, but is, for example, 4 to 100. Among them, when the modified oligonucleotide of the present invention is DNA, the number of subunits thereof is preferably 2 to 100, more preferably 4 to 30, and when RNA is RNA, 2 to 50 are preferable. 4 to 30 is more preferable. The “oligonucleotide” in the present invention is not particularly limited except that the 3′-hydroxy group of the 3 ′ terminal nucleoside is modified. For example, for a nucleoside that is a subunit of an oligonucleotide, the sugar moiety (eg 2'-substitution) and base may be modifications known to those skilled in the art.

前記のように、本発明は、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含み、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端にリンカーを介して、前記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾オリゴヌクレオチドであるが、以下、これを便宜的に酸修飾オリゴヌクレオチドと呼ぶ。   As described above, the present invention includes a modified nucleoside as a constituent component at the 3 ′ end of an oligonucleotide, and the modified nucleoside is represented by the formula (III) via a linker at the 3 ′ end of the nucleoside. Although it is a modified oligonucleotide to which an acid is bound, hereinafter, this is referred to as an acid-modified oligonucleotide for convenience.

前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含み、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端にリンカーを介して、下記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた酸修飾オリゴヌクレオチドとしては、下記式（ＩＡ）で表される修飾オリゴヌクレオチドが好ましい。   An acid-modified oligo comprising a modified nucleoside as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide, and the modified nucleoside bound to a carboxylic acid represented by the following formula (III) via a linker at the 3 ′ end of the nucleoside As the nucleotide, a modified oligonucleotide represented by the following formula (IA) is preferable.

前記式中、
Ｒ’−ＯＨはオリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｌは二価の基を意味し、
Ｒ^Aは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味する。

In the above formula,
R′—OH means an oligonucleotide,
The hydroxyl group in R′—OH means the hydroxyl group at the 3 ′ end of the modified nucleoside contained as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide,
L means a divalent group,
R ^A means a saturated aliphatic hydrocarbon group, an unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an aryl group, or a heterocyclic group.

前記式（ＩＡ）で表される修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、以下のように表わすことができる。   The modified oligonucleotide represented by the formula (IA) can be represented, for example, as follows.

前記式中、Ｗ¹およびＷ²は、水素または水酸基であり、Base１およびBase２は、下記式（１）で表される基、下記式（２）で表される基、下記式（３）で表される基、下記式（４）で表される基および下記式（５）で表される基から独立して選択される。

In the above formula, W ¹ and W ² are hydrogen or a hydroxyl group, Base 1 and Base 2 are a group represented by the following formula (1), a group represented by the following formula (2), and the following formula (3). It is independently selected from the group represented by the group represented by the following formula (4) and the group represented by the following formula (5).

前記飽和脂肪族炭化水素基としては、飽和炭化水素にカルボキシ基が置換されたものを意味し、例えば炭素数１〜２５、好ましくは１０〜２５、より好ましくは１５〜２０の飽和脂肪族炭化水素基である。飽和脂肪族炭化水素基としては、たとえば、メタン酸（ギ酸）、エタン酸（酢酸）、プロパン酸（プロピオン酸）、ブタン酸（酪酸）、２−メチルプロパン酸（イソ酪酸）、ペンタン酸（吉草酸）、３−メチルブタン酸（イソ吉草酸）、２，２−ジメチルプロパン酸（ピバル酸）、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ドデカン酸（ラウリン酸）、トリデカン酸、テトラデカン酸（ミリスチン酸）、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸（ステアリン酸）、ノナデカン酸、イコサン酸等が挙げられる。中でも、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）が好ましい。

The saturated aliphatic hydrocarbon group means a saturated hydrocarbon substituted with a carboxy group, for example, a saturated aliphatic hydrocarbon having 1 to 25 carbon atoms, preferably 10 to 25 carbon atoms, more preferably 15 to 20 carbon atoms. The group. Examples of the saturated aliphatic hydrocarbon group include methanic acid (formic acid), ethanoic acid (acetic acid), propanoic acid (propionic acid), butanoic acid (butyric acid), 2-methylpropanoic acid (isobutyric acid), and pentanoic acid (good). Herbic acid), 3-methylbutanoic acid (isovaleric acid), 2,2-dimethylpropanoic acid (pivalic acid), hexanoic acid, heptanoic acid, octanoic acid, nonanoic acid, decanoic acid, dodecanoic acid (lauric acid), tridecanoic acid, Examples include tetradecanoic acid (myristic acid), pentadecanoic acid, hexadecanoic acid (palmitic acid), heptadecanoic acid, octadecanoic acid (stearic acid), nonadecanoic acid, and icosanoic acid. Among these, hexadecanoic acid (palmitic acid) is preferable.

前記不飽和脂肪族炭化水素基としては、アルケン、アルキン等の不飽和炭化水素にカルボキシ基が置換されたものを意味し、例えば炭素数３〜２５、好ましくは１０〜２５、より好ましくは１５〜２０の飽和脂肪族炭化水素基である。不飽和脂肪族炭化水素基としては、たとえば、プロペン酸（アクリル酸）、プロピン酸（プロピオル酸）、２−メチルプロペン酸（メタクリル酸）、trans−ブタ−２−エン酸（クロトン酸）、cis−ブタ−２−エン酸（イソクロトン酸）、cis−オクタデカ−９−エン酸（オレイン酸）、trans−オクタデカ−９−エン酸（ライジン酸）等が挙げられる。中でもcis−オクタデカ−９−エン酸（オレイン酸）が好ましい。   The unsaturated aliphatic hydrocarbon group means an unsaturated hydrocarbon such as an alkene or alkyne substituted with a carboxy group, and has, for example, 3 to 25 carbon atoms, preferably 10 to 25 carbon atoms, more preferably 15 to 15 carbon atoms. 20 saturated aliphatic hydrocarbon groups. Examples of the unsaturated aliphatic hydrocarbon group include propenoic acid (acrylic acid), propionic acid (propiolic acid), 2-methylpropenoic acid (methacrylic acid), trans-but-2-enoic acid (crotonic acid), cis -Buta-2-enoic acid (isocrotonic acid), cis-octadeca-9-enoic acid (oleic acid), trans-octadeca-9-enoic acid (raidic acid) and the like. Of these, cis-octadeca-9-enoic acid (oleic acid) is preferred.

前記アリール基としては、全体で５〜５０の環原子を有し、少なくとも１つの環が芳香族であり、各環が５〜８の環原子を有する単環式、二環式、三環式および四環式炭素環式基を意味する。前記アリール基としては、例えば、フェニル、インデニル、ナフチル、フルオレニル等が挙げられる。   The aryl group has a total of 5-50 ring atoms, at least one ring is aromatic and each ring has 5-8 ring atoms, monocyclic, bicyclic, tricyclic And tetracyclic carbocyclic groups. Examples of the aryl group include phenyl, indenyl, naphthyl, fluorenyl and the like.

前記複素環式基としては、全体で５〜５０の環原子を有し、少なくとも１つの環がヘテロ原子を有し、各環が５〜８の環原子を有する単環式、二環式、三環式および四環式炭素環式基を意味する。前記複素環式基としては、たとえば、チオフェニル、フラニル、ピラニル、キサンテニル、ピロリル、イミダゾリル、ピリジル等が挙げられる。   The heterocyclic group has a total of 5-50 ring atoms, at least one ring has a heteroatom, and each ring has 5-8 ring atoms, monocyclic, bicyclic, Refers to tricyclic and tetracyclic carbocyclic groups. Examples of the heterocyclic group include thiophenyl, furanyl, pyranyl, xanthenyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyridyl and the like.

前記式（ＩＡ）中における前記二価の基としては、例えば、下記式（ＩＶＡ）に示す二価の基が挙げられるが、この基には限定されない。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ− （ＩＶＡ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ₂）_m−または（ＣＨ₂）_m−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ₂）_n−または−（ＣＨ₂）_n−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。Examples of the divalent group in the formula (IA) include, but are not limited to, a divalent group represented by the following formula (IVA).
-X-M-Y- (IVA)
In the above formula,
—X— is — (CH ₂ ) _m — or (CH ₂ ) _m —CH (CH ₂ OH) —,
-Y- is, - (CH _{2) n} - or _{- (CH 2) n -CH (} CH 2 OH) - and is,
-M- is -O-C (= O) NH-, -O-, -C (= O) -NH- or -NH-C (= O)-,
m and n are each independently an integer of 1 to 20.

本発明の酸修飾オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド等であってもよい。本発明の酸修飾オリゴヌクレオチドは、二本鎖形成能に優れるので、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ等として用いるのに好ましい。酸修飾オリゴヌクレオチドが、二本鎖である場合、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの一方または両方の一本鎖オリゴヌクレオチドが、酸修飾オリゴヌクレオチドであるのが好ましい。前記二本鎖オリゴヌクレオチドの両方の一本鎖オリゴヌクレオチドが酸修飾オリゴヌクレオチドである場合、両酸修飾オリゴヌクレオチドは、同一であっても、相違してもよい。   The acid-modified oligonucleotide of the present invention may be a single-stranded oligonucleotide, a double-stranded oligonucleotide or the like. The acid-modified oligonucleotide of the present invention is preferable for use as an antisense, siRNA or the like because of its excellent ability to form a double strand. When the acid-modified oligonucleotide is double-stranded, it is preferred that one or both single-stranded oligonucleotides of the double-stranded oligonucleotide are acid-modified oligonucleotides. When both single-stranded oligonucleotides of the double-stranded oligonucleotide are acid-modified oligonucleotides, the two acid-modified oligonucleotides may be the same or different.

前記酸修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖である場合、前記修飾オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼ等をコードするｍＲＮＡの一部または全部と相補的な配列を有するのが好ましい。修飾オリゴヌクレオチドが、このようなｍＲＮＡと二本鎖を形成し、エンドヌクレアーゼ等の発現を抑制可能だからである。   When the acid-modified oligonucleotide is single-stranded, the modified oligonucleotide is antisense DNA or antisense RNA, and the modified oligonucleotide is complementary to part or all of mRNA encoding endonuclease or the like. It is preferable to have the following sequence. This is because the modified oligonucleotide forms a double strand with such mRNA and can suppress the expression of endonuclease and the like.

また、前記のように、本発明は、二本鎖修飾オリゴヌクレオチドであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列をするセンス鎖と、前記センス鎖に対するアンチセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖および前記センス鎖のうち、少なくとも前記アンチセンス鎖が、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド類似体であり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、前記式（ＩＩ）で表されるステロイド骨格を有する化合物を結合させた修飾ヌクレオシドであるが、以下、これを便宜的にステロイド修飾オリゴヌクレオチドと呼ぶ。   Further, as described above, the present invention is a double-stranded modified oligonucleotide, wherein the modified oligonucleotide comprises a sense strand having the same base sequence as a part of the target mRNA, and an antisense strand against the sense strand. And at least the antisense strand of the antisense strand and the sense strand is an oligonucleotide analogue containing a modified nucleoside as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide, and the modified nucleoside is a 3 ′ nucleoside A modified nucleoside having a compound having a steroid skeleton represented by the formula (II) bonded to the terminal via a linker is referred to as a steroid-modified oligonucleotide for convenience.

前記オリゴヌクレオチド類似体としては、下記式（ＩＳ）で表される修飾オリゴヌクレオチドが好ましい。   As the oligonucleotide analogue, a modified oligonucleotide represented by the following formula (IS) is preferable.

前記式中、
Ｒ’−ＯＨはオリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｌは二価の基を意味し、
Ｒ^Sは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味する。

In the above formula,
R′—OH means an oligonucleotide,
The hydroxyl group in R′—OH means the hydroxyl group at the 3 ′ end of the modified nucleoside contained as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide,
L means a divalent group,
R ^S means a steroid skeleton optionally having one or more substituents, wherein one or more single bonds in the skeleton are optionally replaced with double bonds.

前記式（ＩＳ）で表されるオリゴヌクレオチド類似体は、例えば、以下のように表わすことができる。   The oligonucleotide analog represented by the formula (IS) can be represented, for example, as follows.

前記式中、Ｗ¹およびＷ²は、水素または水酸基であり、Base１およびBase２は、下記式（１）で表される基、下記式（２）で表される基、下記式（３）で表される基、下記式（４）で表される基および下記式（５）で表される基から独立して選択される。

In the above formula, W ¹ and W ² are hydrogen or a hydroxyl group, Base 1 and Base 2 are a group represented by the following formula (1), a group represented by the following formula (2), and the following formula (3). It is independently selected from the group represented by the group represented by the following formula (4) and the group represented by the following formula (5).

前記ステロイド骨格とは、シクロペンタヒフォロフェナントレン誘導体を意味し、３つの六員環と１つの五員環とが縮合した構造を有する。前記Ｒ^Sにおいては、このステロイド骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられていてもよい。前記Ｒ^S中の置換基とは、例えば、低級アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、１，５−ジメチルヘキシル等）、水酸基、等である。前記置換基は、０〜１０個有していてもよい。前記Ｒ^Sとしては、例えば、以下の式に示すものが挙げられる。

The steroid skeleton means a cyclopentahyphenophenanthrene derivative and has a structure in which three six-membered rings and one five-membered ring are condensed. In the R ^S , one or more single bonds in the steroid skeleton may be optionally replaced with a double bond. Examples of the substituent in R ^S include a lower alkyl group (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, 1,5-dimethylhexyl), a hydroxyl group, and the like. The substituent may have 0 to 10 substituents. Examples of R ^S include those shown in the following formula.

前記式（ＩＳ）中における前記二価の基としては、例えば、下記式（ＩＶＳ）に示す二価の基が挙げられるが、この基には限定されない。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ− （ＩＶＳ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ₂）_m−または（ＣＨ₂）_m−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ₂）_n−または−（ＣＨ₂）_n−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。

Examples of the divalent group in the formula (IS) include, but are not limited to, a divalent group represented by the following formula (IVS).
-X-M-Y- (IVS)
In the above formula,
—X— is — (CH ₂ ) _m — or (CH ₂ ) _m —CH (CH ₂ OH) —,
-Y- is, - (CH _{2) n} - or _{- (CH 2) n -CH (} CH 2 OH) - and is,
-M- is -O-C (= O) NH-, -O-, -C (= O) -NH- or -NH-C (= O)-,
m and n are each independently an integer of 1 to 20.

前記修飾オリゴヌクレオチド（酸修飾オリゴヌクレオチドおよびステロイド修飾オリゴヌクレオチド）が二本鎖である場合、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ interference）を引き起こすオリゴヌクレオチドであり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼ等をコードするｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドが好ましい。このような修飾オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ研究等に有用だからである。前記エンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＲＮａｓｅＬ等が挙げられる。   When the modified oligonucleotide (acid-modified oligonucleotide and steroid-modified oligonucleotide) is double-stranded, it is an oligonucleotide that causes RNAi (RNA interference), and the modified oligonucleotide is an mRNA that encodes an endonuclease or the like. A modified oligonucleotide having the same base sequence as the portion is preferred. This is because such a modified oligonucleotide is useful for RNAi research and the like. Examples of the endonuclease include RNase L.

前記修飾オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合、前記修飾オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）であり、前記ｍＲＮＡの一部が、スタートコドンから７５塩基以上上流の、最初のＡＡ配列に続く１９塩基配列であって、前記ｍＲＮＡの一部が、前記ｍＲＮＡに対して特異的であり、前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記１９塩基配列のセンス鎖とアンチセンス鎖との組み合わせであるのが好ましい。このようなセンス鎖は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ（European Molecular Biology Laboratory - European Bioinformatics Institute）等の公知遺伝子データベースを用いて、例えばエキソヌクレアーゼのｍＲＮＡ配列を取得する。その遺伝子配列中、スタートコドンから７５塩基以上下流の、最初のＡＡ配列を見つける。そのＡＡ配列に続く１９塩基配列、合計２１塩基配列が、再度、公知の遺伝子データベースを用いて、目的とする遺伝子に対して特異的であることを確認する。なお、この１９塩基配列は、ＧＣ含有量が５０％前後であることも確認する。この２つを確認して、得られた１９塩基配列が、前記のようなセンス鎖である。   When the modified oligonucleotide is double-stranded, the modified oligonucleotide is siRNA (short interfering RNA), and a part of the mRNA follows the first AA sequence that is 75 bases or more upstream from the start codon. It is a base sequence, It is preferable that a part of the mRNA is specific for the mRNA, and the modified oligonucleotide is a combination of a sense strand and an antisense strand of the 19 base sequence. Such a sense strand can be obtained, for example, as follows. First, using a known gene database such as NCBI (National Center for Biotechnology Information) and EMBL-EBI (European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute), for example, an exonuclease mRNA sequence is obtained. In the gene sequence, the first AA sequence that is 75 bases or more downstream from the start codon is found. It is confirmed that the 19-base sequence following the AA sequence and the total 21-base sequence are specific to the target gene again using a known gene database. This 19-base sequence also confirms that the GC content is around 50%. The 19 base sequence obtained by confirming these two is the sense strand as described above.

前述のように修飾オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡである場合、前記センス鎖およびアンチセンス鎖の一方またはその両方は、その３’末端にさらに２つの塩基配列を有するのが好ましい。３’末端にこのような配列を有すると、ＲＮＡｉが引き起こされやすくなるからである。このような２つの塩基配列としては、例えばＴＴ、ＴＡ等が挙げられるが、これに限定されない。   As described above, when the modified oligonucleotide is siRNA, one or both of the sense strand and the antisense strand preferably have two more base sequences at the 3 'end. This is because having such a sequence at the 3 'end tends to cause RNAi. Examples of such two base sequences include TT and TA, but are not limited thereto.

本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性であるのが好ましい。本発明の修飾オリゴヌクレオチドが、細胞内に取り込まれた際、ヌクレアーゼで分解されるのを防ぐことができ、その結果、修飾オリゴヌクレオチドの細胞内での活性を、持続させることが可能だからである。   The modified oligonucleotide of the present invention is preferably nuclease resistant. This is because the modified oligonucleotide of the present invention can be prevented from being degraded by a nuclease when taken into a cell, and as a result, the activity of the modified oligonucleotide in the cell can be sustained. .

本発明の遺伝子発現抑制剤は、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを含む。このような遺伝子発現抑制剤は、修飾オリゴヌクレオチドが、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断したり、標的遺伝子のｍＲＮＡと二本鎖を形成等して、その結果、遺伝子発現を抑制することができる。   The gene expression inhibitor of the present invention includes the modified oligonucleotide of the present invention. Such a gene expression inhibitor can suppress gene expression as a result of the modified oligonucleotide cleaving the target gene mRNA or forming a double strand with the target gene mRNA, for example. .

本発明の医薬組成物は、遺伝子発現に伴う疾患を治療するためであり、前記遺伝子発現抑制剤を含むものである。遺伝子発現に伴う疾患、例えば、あるタンパク質が発現されることにより疾患が引き起こされる場合、この医薬組成物により、その遺伝子発現を抑制し、その遺伝子発現に伴う疾患を治療するのに用いることが可能である。   The pharmaceutical composition of the present invention is for treating a disease associated with gene expression, and contains the gene expression inhibitor. When a disease associated with gene expression, for example, a disease is caused by the expression of a protein, this pharmaceutical composition can be used to suppress the gene expression and treat the disease associated with the gene expression. It is.

このような医薬組成物は、さらに細胞導入用賦形剤を含むのが好ましい。遺伝子発現に伴う疾患を治療する際、細胞内への導入を容易にすることが可能になるからである。前記細胞導入用賦形剤としては、例えば、トランスフェクション試薬等が挙げられる。前記トランスフェクション試薬とは、例えば、ＤＮＡ分子（前記医薬組成物）を、リン脂質を用いて構成された人工脂質小胞（リポソーム）で包み込み、この人工脂質小胞を細胞懸濁液に加え、細胞表面に付着させ、細胞膜と融合させて、人工脂質小胞中のＤＮＡ分子を細胞内に取り込ませるリポフェクション方法において、用いられる、人工脂質小胞を形成する試薬である。前記トランスフェクション試薬としては、例えば、リポフェクタミン（インビトロジェン（Invitrogen）社製）、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）、オリゴフェクタミン（Oligofectamin（インビトロジェン社製））、トランスメッセンジャー（TransMessenger（キーゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製））、ｓｉＲＮＡトランスフェクション・キット・ジェットＳＩ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製）、ジーンスライサーＳｉＲＮＡトランスフェクション試薬（ジーン・セラピー・システムズ（Gene Therapy Systems）社製）等が、挙げられる。   Such a pharmaceutical composition preferably further contains an excipient for cell introduction. This is because, when a disease associated with gene expression is treated, introduction into cells can be facilitated. Examples of the cell introduction excipient include transfection reagents and the like. With the transfection reagent, for example, a DNA molecule (the pharmaceutical composition) is wrapped with artificial lipid vesicles (liposomes) composed of phospholipids, and the artificial lipid vesicles are added to a cell suspension. It is a reagent for forming artificial lipid vesicles, which is used in a lipofection method in which DNA molecules in artificial lipid vesicles are attached to the cell surface and fused with cell membranes to take them into cells. Examples of the transfection reagent include Lipofectamine (Invitrogen), Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Oligofectamine (Oligofectamin (Invitrogen)), Transmessenger (TransMessenger (QIAGEN), Inc. SiRNA Transfection Kit Jet SI (Ambion), Gene Slicer SiRNA Transfection Reagent (Gene Therapy Systems), and the like.

前述のように細胞導入用賦形剤を含むことによる他、本発明の医薬組成物は、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等を用いて、細胞内に導入することもできる。前記エレクトロポレーション法は、例えば、細胞に電気パルスをかけてその細胞壁に穴をあけ、その穴から本発明の医薬組成物を細胞内へ導入する方法である。前記パーティクルガン法は、金微粒子にＤＮＡ分子（前記医薬組成物）などの分子を付着させ、パーティクルガン（粒子銃）を用いて、圧縮ヘリウムガスを利用し、銃弾を撃ち込むように金微粒子を細胞膜に透過させて、ＤＮＡ分子（前記医薬組成物）を細胞内に導入する方法である。   In addition to the inclusion of a cell introduction excipient as described above, the pharmaceutical composition of the present invention can also be introduced into cells using an electroporation method, a particle gun method, or the like. The electroporation method is, for example, a method in which an electric pulse is applied to a cell to make a hole in the cell wall, and the pharmaceutical composition of the present invention is introduced into the cell through the hole. In the particle gun method, molecules such as DNA molecules (the pharmaceutical composition) are attached to gold fine particles, and using a particle gun (particle gun), the compressed gold gas is used to shoot the gold fine particles into the cell membrane. In which the DNA molecule (the pharmaceutical composition) is introduced into the cell.

本発明のＲＮＡｉキットは、ｓｉＲＮＡである修飾オリゴヌクレオチドを含む。このようなキットは、他に、ウエルと修飾オリゴヌクレオチド等とが固定されたプレート、ファイバー、バイオチップ等の固定化担体等が挙げられる。このようなキットには、前記修飾オリゴヌクレオチド等のほかに、例えば、薬物、反応して発色する発色試薬、検出を容易にする検出試薬等を含んでもよい。   The RNAi kit of the present invention comprises a modified oligonucleotide that is an siRNA. Other examples of such kits include plates on which wells and modified oligonucleotides are fixed, immobilized carriers such as fibers and biochips, and the like. In addition to the modified oligonucleotide and the like, such a kit may include, for example, a drug, a coloring reagent that reacts to develop a color, a detection reagent that facilitates detection, and the like.

本発明のＲＮＡｉ研究用試薬は、ｓｉＲＮＡである修飾オリゴヌクレオチドを含む。ＲＮＡｉ研究の際、３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡを細胞へ導入すると、細胞固有の防御反応が活性化され、ｍＲＮＡをランダムに分解する反応が生じたりして、細胞内でＲＮＡｉが生じているかどうかが、判断できない場合がある。このｍＲＮＡのランダム分解は、以下のメカニズムで生じると考えられている。まず、ｄｓＲＮＡにより２−５オリゴアデニル酸合成酵素（２−５ＡＳ）が活性化され、それにより生じた２−５Ａが、ＲＮＡａｓｅＬを活性化する。そのＲＮＡａｓｅＬが、ｍＲＮＡをランダムに分解するというものである。ｓｉＲＮＡである修飾オリゴヌクレオチドは、このＲＮＡａｓｅＬの発現を抑制可能であるので、ｍＲＮＡのランダム分解を抑制でき、その結果、例えばＲＮＡｉが細胞内で生じているか否かが判断しやすくなる。   The RNAi research reagent of the present invention includes a modified oligonucleotide that is an siRNA. During RNAi research, if dsRNA of 30 bp or more is introduced into a cell, the cell-specific defense reaction is activated, and a reaction that randomly degrades mRNA occurs, thus determining whether RNAi is generated in the cell. There are cases where it is not possible. This random degradation of mRNA is considered to occur by the following mechanism. First, 2-5 oligoadenylate synthase (2-5AS) is activated by dsRNA, and 2-5A generated thereby activates RNAaseL. The RNAaseL degrades mRNA randomly. Since the modified oligonucleotide that is siRNA can suppress the expression of RNAaseL, it can suppress the random degradation of mRNA, and as a result, for example, it is easy to determine whether or not RNAi occurs in the cell.

本発明の遺伝子発現抑制方法は、修飾オリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子の発現を抑制する方法である。この方法では、修飾オリゴヌクレオチドが、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断したり、標的遺伝子のｍＲＮＡと二本鎖を形成等して、その結果、遺伝子発現を抑制することができる。   The gene expression suppression method of the present invention is a method of suppressing gene expression using a modified oligonucleotide. In this method, for example, the modified oligonucleotide cleaves the mRNA of the target gene or forms a double strand with the mRNA of the target gene, and as a result, the gene expression can be suppressed.

本発明のＲＮＡｉを引き起こす方法は、ｓｉＲＮＡである修飾オリゴヌクレオチドを用いて、ＲＮＡｉを引き起こす方法である。この方法では、修飾オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡであるので、ＲＮＡｉを引き起こすことができる。   The method for causing RNAi of the present invention is a method for causing RNAi using a modified oligonucleotide that is siRNA. In this method, RNAi can be caused because the modified oligonucleotide is siRNA.

次に、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを製造するための製造方法について、例を挙げて説明する。このような製造方法により、従来製造することができなかった本発明の修飾オリゴヌクレオチドの製造が可能になった。   Next, the production method for producing the modified oligonucleotide of the present invention will be described with examples. Such a production method made it possible to produce the modified oligonucleotide of the present invention that could not be produced conventionally.

まず、酸修飾オリゴヌクレオチドの製造例を説明する。   First, production examples of acid-modified oligonucleotides will be described.

例えば、下記式（ＸＩＡ）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ¹を除去して遊離の水酸基に変換し、
前記遊離の水酸基にオリゴヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得ることができる。For example, R ^{1 of the} unit compound for solid phase synthesis represented by the following formula (XIA) is removed and converted to a free hydroxyl group,
The modified oligonucleotide can be obtained by extending the oligonucleotide to the free hydroxyl group and then cutting it out from the solid support.

前記式中、Ｒ^Aは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味し、
Ｒ¹は、水酸基の保護基であり、
Ｒ²は、固相担体であり、
ｍは、１〜２０の整数であり、
ｎは、１〜２０の整数である。

In the above formula, R ^A represents a saturated aliphatic hydrocarbon group, an unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an aryl group, or a heterocyclic group;
R ¹ is a hydroxyl protecting group;
R ² is a solid support,
m is an integer of 1 to 20,
n is an integer of 1-20.

前記式（ＸＩＡ）中、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、および複素環式基については、前記式（ＩＡ）中の飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、および複素環式基について定義したとおりである。   In the formula (XIA), the saturated aliphatic hydrocarbon group, the unsaturated aliphatic hydrocarbon group, the aryl group, and the heterocyclic group are the same as the saturated aliphatic hydrocarbon group and the unsaturated fat in the formula (IA). As defined for the group hydrocarbon group, aryl group, and heterocyclic group.

次に、ステロイド修飾オリゴヌクレオチドの製造例を説明する。   Next, production examples of steroid-modified oligonucleotides will be described.

例えば、下記式（ＸＩＳ）で表される固相合成用ユニット化合物のＲ¹を除去して遊離の水酸基へ変換し、前記遊離の水酸基にオリゴヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して前記修飾オリゴヌクレオチドを得ることができる。For example, R ^{1 of the} unit compound for solid phase synthesis represented by the following formula (XIS) is removed and converted to a free hydroxyl group, an oligonucleotide is extended to the free hydroxyl group, and then cut out from the solid phase carrier. The modified oligonucleotide can be obtained.

前記式中、Ｒ^Sは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味し、
Ｒ¹は、水酸基の保護基であり、
Ｒ²は、固相担体であり、
ｍは、１〜２０の整数であり、
ｎは、１〜２０の整数である。

In the above formula, R ^S means a steroid skeleton optionally having one or more substituents, wherein one or more single bonds in the skeleton are optionally replaced with double bonds,
R ¹ is a hydroxyl protecting group;
R ² is a solid support,
m is an integer of 1 to 20,
n is an integer of 1-20.

前記式（ＸＩＳ）中のＲ^Sについては、前記式（ＩＳ）中のＲ^Sについて定義したとおりである。R ^S in the formula (XIS) is as defined for R ^S in the formula (IS).

本発明において、前記水酸基の保護基とは、従来公知の１級アルコールの保護基、例えば、ヌクレオシド化学の分野で公知の、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４
−モノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ）、（９−フェニル）キサンテン−９−イル［ピキシル（pixyl）］等が、その保護基として用いられうる。In the present invention, the hydroxyl-protecting group is a conventionally known primary alcohol protecting group, for example, 4,4′-dimethoxytrityl (DMTr), 4 known in the field of nucleoside chemistry.
Monomethoxytrityl (MMTr), (9-phenyl) xanthen-9-yl [pixyl], etc. can be used as the protecting group.

本発明において、前記固相担体とは、固相担体でＤＮＡ、ＲＮＡ等を合成するのに適した固相担体であれば限定されず、例えば、ＣＰＧ（コントロール細孔ガラス）、ＨＣＰ（highly cross-linked polystyrene)等である。   In the present invention, the solid phase carrier is not limited as long as it is a solid phase carrier suitable for synthesizing DNA, RNA and the like on the solid phase carrier. For example, CPG (control pore glass), HCP (highly cross) -linked polystyrene).

前記方法においてＲ¹を除去するには、Ｒ¹の種類に応じて適宜酸、アルカリ、触媒等を選択して行うことができる。In the method, R ¹ can be removed by appropriately selecting an acid, an alkali, a catalyst or the like according to the type of R ¹ .

前記方法において前記固相合成用ユニット化合物の遊離の水酸基にヌクレオチドを伸長させるには、オリゴヌクレオチド合成分野で従来公知の技術を用いて、修飾オリゴヌクレオチドの配列に従い、ヌクレオシドを順次カップリングさせて行うことができる。   In the above method, the nucleotide is extended to the free hydroxyl group of the unit compound for solid phase synthesis by using a conventionally known technique in the field of oligonucleotide synthesis and sequentially coupling nucleosides according to the sequence of the modified oligonucleotide. be able to.

なお、ヌクレオシド、カップリング試薬、脱保護試薬、洗浄試薬等は、通常核酸固相合成に用いられるものを用いる。得られた固相担体上の修飾オリゴヌクレオチドは、必要であればオリゴヌクレオチド側鎖の脱保護を行った後、固相担体から切り出して、粗修飾オリゴヌクレオチドを得る。切り出しに用いる試薬は、固相担体およびリンカー（固相担体と修飾オリゴヌクレオチドを接続する部分）構造等に応じて、従来公知の試薬から、適宜選択することができる。この粗修飾オリゴヌクレオチドは、必要であれば、ＨＰＬＣ等で精製してもよい。   As nucleosides, coupling reagents, deprotecting reagents, washing reagents, etc., those usually used for nucleic acid solid phase synthesis are used. The obtained modified oligonucleotide on the solid phase carrier is subjected to deprotection of the oligonucleotide side chain, if necessary, and then cut out from the solid phase carrier to obtain a crude modified oligonucleotide. The reagent used for excision can be appropriately selected from conventionally known reagents according to the structure of the solid phase carrier and the linker (part connecting the solid phase carrier and the modified oligonucleotide). The crude modified oligonucleotide may be purified by HPLC or the like if necessary.

次に、修飾オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合の製造について例を挙げて説明する。例えば前記のような方法に従い、一本鎖の修飾オリゴヌクレオチドをまず製造する。その修飾オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有する、一本鎖の天然オリゴヌクレオチドも別途、従来公知の方法に従い、製造する。次いで、得られた一本鎖の修飾オリゴヌクレオチドをアニーリング用緩衝液（例えば、１００ｍＭのＫＯＡｃ水溶液、２ｍＭのＭｇＯＡｃ溶液、および３０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）を含む緩衝液）中に溶解させたものと、一本鎖の天然オリゴヌクレオチドをアニーリング用緩衝液中に溶解させたものとを、例えば混合し、９５℃で５分間処理し、その後、徐々に２５℃まで冷却させて、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチドを得ることができる。この二本鎖の修飾オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿等をさらに行って、単離精製することができる。   Next, an example is given and demonstrated about manufacture in case a modified oligonucleotide is double stranded. For example, a single-stranded modified oligonucleotide is first produced according to the method as described above. A single-stranded natural oligonucleotide having a sequence complementary to the modified oligonucleotide is also separately produced according to a conventionally known method. Next, the obtained single-stranded modified oligonucleotide is dissolved in an annealing buffer (for example, a buffer containing 100 mM KOAc aqueous solution, 2 mM MgOAc solution, and 30 mM HEPES-KOH (pH 7.4)). And a single-stranded natural oligonucleotide dissolved in an annealing buffer, for example, mixed, treated at 95 ° C. for 5 minutes, and then gradually cooled to 25 ° C. Strand modified oligonucleotides can be obtained. This double-stranded modified oligonucleotide can be isolated and purified by further performing phenol / chloroform extraction, ethanol precipitation or the like, if necessary.

前記製造方法で用いる式（ＸＩＡ）の固相合成用ユニット化合物および式（ＸＩＳ）の固相合成用ユニット化合物は、例えば、以下のような方法で製造することができる。   The unit compound for solid phase synthesis of the formula (XIA) and the unit compound for solid phase synthesis of the formula (XIS) used in the production method can be produced, for example, by the following method.

まず、ユニット化合物（ＸＩＡ）の製造についてスキーム１を参照して説明する。例えば、式（ＸＩＩ）で表される化合物と、Ｒ^A−ＣＯＯＨおよびペプチド用縮合剤とを反応させ、式（ＸＩＩＩＡ）で表される化合物を得る工程と、前記式（ＸＩＩＩＡ）で表される化合物のＲ³を除去し、次いで下記式（ＸＩＶ）で表される化合物と反応させて下記式（ＸＶＡ）で表される化合物を得る工程と、前記式（ＸＶＡ）で表される化合物と、アミノ基を有する固相担体とを反応させ、前記式（ＸＩＡ）で表される化合物を得る方法により、製造することができる。First, production of the unit compound (XIA) will be described with reference to Scheme 1. For example, a step of reacting a compound represented by the formula (XII) with R ^A —COOH and a peptide condensing agent to obtain a compound represented by the formula (XIIIA); and the above formula (XIIIA) Removing R ³ of the compound and then reacting with a compound represented by the following formula (XIV) to obtain a compound represented by the following formula (XVA); a compound represented by the above formula (XVA); It can be produced by a method in which a compound represented by the formula (XIA) is obtained by reacting with a solid phase carrier having an amino group.

まず、ユニット化合物（ＸＩＡ）の製造について、スキーム１を参照しながら説明する。式（ＸＩＩ）のアミン誘導体と、Ｒ^A−ＣＯＯＨとを、ペプチド用縮合剤（例えば、ＷＳＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩）存在下に縮合させ、式（ＸＩＩＩＡ）の化合物を得る。式（ＸＩＩ）のアミン誘導体は、市販で入手してもよいし、グリセロールの１位と３位の水酸基を保護した、例えば、１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグリセロール（De Napoli, et. al, Tetrahedron 1999, 55(32), 9899-9914参照）から公知文献を利用して自家製造してもよい。

First, the production of the unit compound (XIA) will be described with reference to Scheme 1. The amine derivative of formula (XII) and R ^A —COOH are condensed in the presence of a condensing agent for peptides (for example, WSC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride), The compound of formula (XIIIA) is obtained, and the amine derivative of formula (XII) may be obtained commercially, for example, 1-O- (4,4) in which the hydroxyl groups at positions 1 and 3 of glycerol are protected. '-Dimethoxytrityl) -3-O-tert-butyldimethylsilylglycerol (De Napoli, et. Al, Tetrahedron 1999, 55 (32), 9899-9914) may be used to make home-made products using known literature. .

次に、得られた式（ＸＩＩＩＡ）の化合物のＲ³を除去し、次いで無水物（ＸＩＶ）を、任意に、塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）、触媒（例えば４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等）等の存在下に反応させ、式（ＸＶＡ）の化合物を得る。Next, R ³ of the resulting compound of formula (XIIIA) is removed and then the anhydride (XIV) is optionally replaced with a base (eg pyridine, triethylamine, etc.), a catalyst (eg 4-dimethylaminopyridine (DMAP)). ) Etc.) to obtain a compound of formula (XVA).

次に、得られた式（ＸＶＡ）の化合物と、アミノ基を有する固相担体Ｒ²−ＮＨ₂とをカップリング試薬（例えば、ＷＳＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩））存在下に縮合させ、ユニット化合物（ＸＩＡ）を得る。Next, the obtained compound of formula (XVA) and solid phase carrier R ² —NH ₂ having an amino group are coupled with a coupling reagent (for example, WSC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)- Carbodiimide / hydrochloride)) is condensed in the presence of unit compound (XIA).

つぎに、ユニット化合物（ＸＩＳ）の製造についてスキーム２を参照して説明する。例えば、式（ＸＩＩ）で表される化合物と、Ｒ^S−ＯＨおよび１，１’−カルボニルジイミダゾールとを反応させ、式（ＸＩＩＩＳ）で表される化合物を得る工程と、前記式（ＸＩＩＩＳ）で表される化合物のＲ³を除去し、次いで下記式（ＸＩＶ）で表される化合物と反応させて下記式（ＸＶＳ）で表される化合物を得る工程と、前記式（ＸＶＳ）で表される化合物と、アミノ基を有する固相担体とを反応させ、前記式（ＸＩＳ）で表される化合物を得る方法により、製造することができる。Next, production of the unit compound (XIS) will be described with reference to Scheme 2. For example, a step of reacting a compound represented by the formula (XII) with R ^S —OH and 1,1′-carbonyldiimidazole to obtain a compound represented by the formula (XIIIS); Removing R ³ of the compound represented by formula (II) and then reacting with a compound represented by formula (XIV) below to obtain a compound represented by formula (XVS) below; And a solid phase carrier having an amino group are reacted to obtain a compound represented by the above formula (XIS).

式（ＸＩＩ）のアミン誘導体と、Ｒ^S−ＯＨとを、１，１’−カルボニルジイミダゾール存在下に縮合させ、式（ＸＩＩＩＳ）の化合物を得る。式（ＸＩＩ）のアミン誘導体は、市販で入手してもよいし、グリセロールの１位と３位の水酸基を保護した、例えば、１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグリセロール（De Napoli, et. al, Tetrahedron 1999, 55(32), 9899-9914参照）から公知文献を利用して自家製造してもよい。

An amine derivative of formula (XII) and R ^S —OH are condensed in the presence of 1,1′-carbonyldiimidazole to give a compound of formula (XIIIS). The amine derivative of the formula (XII) may be obtained commercially, for example, 1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -3-O in which the hydroxyl groups at positions 1 and 3 of glycerol are protected. -Tert-butyldimethylsilyl glycerol (see De Napoli, et. Al, Tetrahedron 1999, 55 (32), 9899-9914) may be used to make a home-made article.

次に、得られた式（ＸＩＩＩＳ）の化合物のＲ³を除去し、次いで無水物（ＸＩＶ）を、任意に、塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）、触媒（例えば４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等）等の存在下に反応させ、式（ＸＶＳ）の化合物を得る。Next, R ³ of the resulting compound of formula (XIIIS) is removed and then the anhydride (XIV) is optionally replaced with a base (eg pyridine, triethylamine, etc.), a catalyst (eg 4-dimethylaminopyridine (DMAP)). ) Etc.) to obtain a compound of formula (XVS).

次に、得られた式（ＸＶＳ）の化合物と、アミノ基を有する固相担体Ｒ²−ＮＨ₂とをカップリング試薬（例えば、ＷＳＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩））存在下に縮合させ、ユニット化合物（ＸＩＳ）を得る。Next, the obtained compound of formula (XVS) and solid phase carrier R ² —NH ₂ having an amino group are coupled with a coupling reagent (for example, WSC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)- Carbodiimide / hydrochloride)) is condensed in the presence to obtain a unit compound (XIS).

なお、スキーム１および２の各工程において、必要であれば、各官能基に保護基を導入したり、保護基を脱保護したり、保護基を変更してもよい。なお、官能基の種類に応じた保護基の選択、保護基の導入および保護基の除去は、当該分野で公知の方法に従い、行うことができ、例えば、「有機合成における保護基（"Protective Groups in Organic Synthesis"）, T. Greeneら著、John Wiley & Sons, Inc.出版」等を参照することができる。   In each step of Schemes 1 and 2, if necessary, a protective group may be introduced into each functional group, the protective group may be deprotected, or the protective group may be changed. The selection of the protecting group according to the type of the functional group, the introduction of the protecting group, and the removal of the protecting group can be carried out according to methods known in the art. For example, “protective groups in organic synthesis (“ Protective Groups ” in Organic Synthesis "), T. Greene et al., published by John Wiley & Sons, Inc.".

本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＡＰＳ： アンモニウム ペルオキソジサルフェート（ammonium peroxodisulfate）
ＣＰＧ： コントロール細孔ガラス （controlled pore glass）
ＤＭＡＰ： 4-ジメチルアミノピリジン （4-dimethylaminopyridine ）
ＤＭＴｒＣｌ： 4,4'-ジメトキシトリチルクロライド （4,4'-dimethoxytritylchloride ）
ＤＭＦ： ジメチルホルムアミド （dimethylformamide ）
ＥＤＴＡ： エチレンジアミン-Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸・ジナトリウム塩・de
hydrate （ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, disodium salt, dehydrate ）
ＦＡＢ： 高速原子衝撃（fast atom bombardment ）
ＨＲＭＳ： 高分解能質量分析（high-resolution mass spectrometry ）
Ｉｍ₂ＣＯ： １−１’−カルボニルビス−１Ｈ−イミダゾール （1-1'-Carbonylbis-1
H-imidazole ）
ｍＲＮＡ： メッセンジャー リボ核酸 （messenger ribonucleic acid ）
ＮＢＡ： ３-ニトロベンジルアルコール （3-nitrobenzylalchol）
ＰＡＧＥ： ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （polyacrylamide gel electrophoresis ）
ＴＢＡＦ： トリブチルアンモニウムフルオライド（tributylammoniumfluoride）
ＴＢＥ： Tris-ホウ酸-EDTA（Tris-boric acid-EDTA）
ＴＥＡＡ： トリエチルアミン-酢酸（triethylamine-acetic acid）
ＴＢＤＭＳＣｌ： tert-ブチルジメチルシリルクロライド（tert-butyldimethylsilylchloride）
ＴＥＭＥＤ： Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−エチレンジアミン（N,N,N',N'-tetr
amethyl-ethylenediamine）
ＴＨＦ： テトラヒドロフラン（tetrahydrofuran）
TRIS： トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（tris(hydroxymethyl)aminomethane）
ＷＳＣ： １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, hydrochloride）
ＣＰＧ上の化合物の活性は、以下のようにして算出した。The following abbreviations are used in the description of the present specification.
APS: ammonium peroxodisulfate
CPG: controlled pore glass
DMAP: 4-dimethylaminopyridine
DMTrCl: 4,4'-dimethoxytritylchloride (4,4'-dimethoxytritylchloride)
DMF: dimethylformamide
EDTA: Ethylenediamine-N, N, N ', N'-tetraacetic acid, disodium salt, de
hydrate (ethylenediamine-N, N, N ', N'-tetraacetic acid, disodium salt, dehydrate)
FAB: fast atom bombardment
HRMS: high-resolution mass spectrometry
Im ₂ CO: 1-1′-carbonylbis-1H-imidazole (1-1′-Carbonylbis-1
H-imidazole)
mRNA: messenger ribonucleic acid
NBA: 3-nitrobenzylalchol
PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis
TBAF: tributylammoniumfluoride
TBE: Tris-boric acid-EDTA
TEAA: triethylamine-acetic acid
TBDMSCl: tert-butyldimethylsilylchloride
TEMED: N, N, N ′, N′-tetramethyl-ethylenediamine (N, N, N ′, N′-tetr
amethyl-ethylenediamine)
THF: Tetrahydrofuran
TRIS: tris (hydroxymethyl) aminomethane
WSC: 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide, hydrochloride
The activity of the compound on CPG was calculated as follows.

乾燥させたＣＰＧ６ｍｇをガラスフィルターにのせ、そこへＨＣｌＯ₄およびエタノールの混合物（ＨＣｌＯ₄：ＥｔＯＨ＝３：２）を流し込んだ。得られたろ液の吸光度（波長４９８ｎｍ（ＤＭＴｒ基の吸収波長））を測定し、その値を以下の式に代入して算出した。6 mg of dried CPG was placed on a glass filter, and a mixture of HClO ₄ and ethanol (HClO ₄ : EtOH = 3: 2) was poured into the glass filter. The absorbance (wavelength 498 nm (DMTr group absorption wavelength)) of the obtained filtrate was measured, and the calculated value was substituted into the following equation.

前記式中、Abs.は、波長４９８ｎｍにおけるＣＰＧの吸光度であり、
Vol.は、測定したろ液の容量であり、
weightは、測定したCPGの重量である。

In the above formula, Abs. Is the absorbance of CPG at a wavelength of 498 nm,
Vol. Is the measured volume of the filtrate,
weight is the weight of the measured CPG.

１．修飾１本鎖オリゴヌクレオチドまたは修飾２本鎖オリゴヌクレオチド製造のための、モノマー製造   1. Monomer production for the production of modified single-stranded oligonucleotides or modified double-stranded oligonucleotides

（Ｉ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−グリセロール（1-O- (4,4'-dimet
hoxytrityl)-glycerol）（２３）の製造
グリセロール（１．０ｇ、１０．８６ｍｍｏｌ）のピリジン（２４ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰを少量加え撹拌した。そこにＤＭＴｒＣｌ（３．６８ｇ、１０．８６ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）のピリジン（３０ｍＬ）溶液を加え、１２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、ＮａＨＣＯ₃飽和水溶液（×２）、ＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機相の溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝５：１〜１：１）で単離精製して、黄色のオイル状の表題化合物を得た（収量２．５２ｇ、６．３９ｍｍｏｌ、収率５９％）。

(I) 1-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -glycerol (1-O- (4,4'-dimet
hoxytrityl) -glycerol) (23) To a solution of glycerol (1.0 g, 10.86 mmol) in pyridine (24 mL), a small amount of DMAP was added and stirred. A solution of DMTrCl (3.68 g, 10.86 mmol, 1 eq.) In pyridine (30 mL) was added thereto and stirred for 12 hours. The reaction solution was diluted with ethyl acetate and extracted with a saturated aqueous solution of NaHCO ₃ (× 2) and a saturated aqueous solution of NaCl (× 1). The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent of the organic phase was distilled off, and the obtained residue was isolated and purified by silica gel column chromatography (N-hexane: EtOAc = 5: 1 to 1: 1) to give the title compound as a yellow oil. (Yield 2.52 g, 6.39 mmol, 59% yield).

¹H NMR(400MHz, DMSO-d₆) δ：2.87-2.93 (2H, m, 1-H), 3.30-3.41 (2H, m, 3-H), 3.53-3.65 (1H, m, cross), 3.71 (6H, s, -OCH₃), 4.44 (1H, t, J=5.6Hz, 3-OH), 4.74 (1H, d, J=4.8Hz, 2-OH), 6.85-7.40 (13H, m, DMTr)。 ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 2.87-2.93 (2H, m, 1-H), 3.30-3.41 (2H, m, 3-H), 3.53-3.65 (1H, m, cross), 3.71 (6H, s, -OCH ₃ ), 4.44 (1H, t, J = 5.6Hz, 3-OH), 4.74 (1H, d, J = 4.8Hz, 2-OH), 6.85-7.40 (13H, m , DMTr).

（ＩＩ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグリセロール（1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)- 3-O-tert-butyldimethylsilylglycerol）（２４）の製造
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−グリセロール（２４）（２．４６ｇ、６．２４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液に、イミダゾール（０．８５ｇ、１２．５ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を加えて溶解させた。そこにＴＢＤＭＳＣｌ（０．９４ｇ、６．２４ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）のＤＭＦ（１５ｍＬ）溶液を加え、１２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、水（×３）、ＮａＨＣＯ₃飽和水溶液（×２）およびＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機相の溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１０：１〜１：３）で単離精製して、黄色のオイル状の表題化合物を得た（収量２．６０ｇ、５．１１ｍｍｏｌ、収率８２％）。(II) 1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -3-O-tert-butyldimethylsilylglycerol (1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -3-O-tert-butyldimethylsilylglycerol) 24) Preparation of 1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -glycerol (24) (2.46 g, 6.24 mmol) in DMF (5 mL) was added imidazole (0.85 g, 12.5 mmol, 2 eq). .) Was added and dissolved. Thereto was added a solution of TBDMSCl (0.94 g, 6.24 mmol, 1 eq.) In DMF (15 mL), and the mixture was stirred for 12 hours. The reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with water (× 3), saturated aqueous NaHCO ₃ (× 2) and saturated aqueous NaCl (× 1). The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent of the organic phase was distilled off, and the resulting residue was isolated and purified by silica gel column chromatography (N-hexane: EtOAc = 10: 1 to 1: 3) to give the title compound as a yellow oil. (Yield 2.60 g, 5.11 mmol, 82% yield).

¹H NMR(400MHz, CDCl₃) δ：0.12 (6H, s, TBDMS-CH₃), 0.94 (9H, s, t-ブチル), 3.20-3.31 (2H, m, 1-H), 3.69-3.81 (2H, m, 3-H), 3.88 (7H, s, -OCH₃ and cross), 7.25-7.53 (13H, m, DMTr)。 ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ: 0.12 (6H, s, TBDMS-CH ₃ ), 0.94 (9H, s, t-butyl), 3.20-3.31 (2H, m, 1-H), 3.69-3.81 (2H, m, 3-H), 3.88 (7H, s, -OCH ₃ and cross), 7.25-7.53 (13H, m, DMTr).

（ＩＩＩ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチル−シリルグリセロール（1-O-(4,4'-dimethoxytrityl)- 2-O- [N-(4-aminobutyl)carbamoyl]- 3-O-tert-butyldimethyl- silylglycerol）（２５）の製造
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグリセロール（２４）（２．６０ｇ、５．１１ｍｍｏｌ）のピリジン（１７ｍＬ）溶液に、Ｉｍ₂ＣＯ（１．６６ｇ、１０．２２ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を溶解させ、その反応溶液を１時間撹拌した。原料の消失を確認した後、反応溶液にプトレシン（３ｍＬ、３０．６６ｍｍｏｌ、６ｅｑ．）を氷冷下で滴下した。３時間撹拌した後、反応溶液をクロロホルムで希釈した。前記反応溶液を、水（×３）、ＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。反応溶液の溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ₃＝１０〜２５％）で単離精製して、無色のオイル状の表題化合物を得た（収量３．００ｇ、４．８２ｍｍｏｌ、収率９４％）。(III) 1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2-O- [N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -3-O-tert-butyldimethyl-silylglycerol (1-O- ( 4,4'-dimethoxytrityl)-2-O- [N- (4-aminobutyl) carbamoyl]-3-O-tert-butyldimethyl-silylglycerol) (25) 1-O- (4,4'-dimethoxytrityl) ) -3-O-tert-butyldimethylsilylglycerol (24) (2.60 g, 5.11 mmol) in pyridine (17 mL) was dissolved in Im ₂ CO (1.66 g, 10.22 mmol, 2 eq.). The reaction solution was stirred for 1 hour. After confirming disappearance of the raw materials, putrescine (3 mL, 30.66 mmol, 6 eq.) Was added dropwise to the reaction solution under ice cooling. After stirring for 3 hours, the reaction solution was diluted with chloroform. The reaction solution was washed with water (× 3) and saturated aqueous NaCl solution (× 1), and then dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent of the reaction solution was distilled off, and the resulting residue was isolated and purified by silica gel column chromatography (MeOH: CHCl ₃ = 10 to 25%) to give the title compound as a colorless oil (yield 3. 00 g, 4.82 mmol, 94% yield).

¹H NMR(400MHz, DMSO-d₆) δ：0.13 (6H, s, TBDMS-CH₃), 0.97 (9H, s, t-ブチル), 1.72 (4H, s, ブチル), 3.62 (8H, m, ブチル and 1-H and 3-H), 3.94 (7H, s, -OCH₃ and cross), 6.96-7.61 (13H, m, DMTr), 8.36 (1H, m, NH).
¹³C-NMR (100MHz, DMSO-d₆) δ：-5.58, 17.73, 25.58, 26.76, 27.83, 48.53, 54.97, 61.67, 62.26, 72.52, 85.22, 113.09, 126.58, 127.62, 127.74, 129.63, 135.51, 144.85, 149.28, 155.77, 158.03.
FAB-HRMS(NBA) calcd for C₃₅H₅₁N₂O₆Si (MH⁺), 623.3516; found, 623.3508。 ¹ H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: 0.13 (6H, s, TBDMS-CH ₃ ), 0.97 (9H, s, t-butyl), 1.72 (4H, s, butyl), 3.62 (8H, m , Butyl and 1-H and 3-H), 3.94 (7H, s, -OCH ₃ and cross), 6.96-7.61 (13H, m, DMTr), 8.36 (1H, m, NH).
¹³ C-NMR (100 MHz, DMSO-d ₆ ) δ: -5.58, 17.73, 25.58, 26.76, 27.83, 48.53, 54.97, 61.67, 62.26, 72.52, 85.22, 113.09, 126.58, 127.62, 127.74, 129.63, 135.51, 144.85 , 149.28, 155.77, 158.03.
FAB-HRMS (NBA) calcd for C ₃₅ H ₅₁ N ₂ O ₆ Si (MH ⁺ ), 623.3516; found, 623.3508.

（ＩＶａ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−パルミトイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリル−グリセロール（1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)- 2-O- [N-palmitoyl- N-(4-aminobutyl)carbamoyl]- 3-O-tert- butyl- dimethylsilyl- glycerol ）(26a)の製造
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチル−シリルグリセロール（２５）（０．９０ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）のＣＨ₂Ｃｌ₂（１４ｍＬ）溶液に、パルミチン酸（０．５５ｇ、２．１６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を加えて撹拌した。３０分間撹拌した後、前記反応溶液にＷＳＣ（０．４１ｇ、２．１６ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を加えて２４時間撹拌した。前記反応溶液をクロロホルムで希釈し、水（×１）、ＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。反応溶液の溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝９：１〜１：１）で単離精製して、黄色のオイル状の表題化合物を得た（収量０．８５ｇ、０．９９ｍｍｏｌ、収率６９％）。(IVa) 1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2-O- [N-palmitoyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -3-O-tert-butyl-dimethylsilyl-glycerol ( 1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)-2-O- [N-palmitoyl- N- (4-aminobutyl) carbamoyl]-3-O-tert-butyl-dimethylsilyl-glycerol) (26a) 1 -O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2-O- [N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -3-O-tert-butyldimethyl-silylglycerol (25) (0.90 g, 1. (44 mmol) in CH ₂ Cl ₂ (14 mL) was added palmitic acid (0.55 g, 2.16 mmol, 1.5 eq.) And stirred. After stirring for 30 minutes, WSC (0.41 g, 2.16 mmol, 1.5 eq.) Was added to the reaction solution and stirred for 24 hours. The reaction solution was diluted with chloroform, washed with water (× 1) and saturated aqueous NaCl solution (× 1), and dried over anhydrous sodium sulfate. After evaporating the solvent of the reaction solution, the obtained residue was isolated and purified by silica gel column chromatography (N-hexane: EtOAc = 9: 1 to 1: 1) to give the title compound as a yellow oil. (Yield 0.85 g, 0.99 mmol, 69% yield).

¹H NMR(400MHz, CDCl₃) δ：0.01 (6H, s, TBDMS-CH₃), 0.82 (9H, s, t-ブチル), 0.88-0.91 (3H, m, pal), 1.26 (14H, s, pal), 2.06-2.18 (4H, m, ブチル), 3.24 (8H, m, ブチル and 1-H and 3-H), 3.76-3.80 (7H, m, -OCH₃ and cross), 6.81-7.46 (13H, m, DMTr).
¹³C-NMR (100MHz, CDCl₃) δ：-5.44, 14.09, 25.73, 29.32, 29.47, 29.60, 29.61, 29.65, 31.88, 36.74, 38.99, 40.44, 55.14, 60.37, 62.14, 74.01, 85.74, 112.96, 126.63, 127.68, 128.11, 130.02, 130.03, 136.05, 136.11, 144.92, 156.24, 158.33, 173.26。 ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ: 0.01 (6H, s, TBDMS-CH ₃ ), 0.82 (9H, s, t-butyl), 0.88-0.91 (3H, m, pal), 1.26 (14H, s pal), 2.06-2.18 (4H, m, butyl), 3.24 (8H, m, butyl and 1-H and 3-H), 3.76-3.80 (7H, m, -OCH ₃ and cross), 6.81-7.46 (13H, m, DMTr).
¹³ C-NMR (100 MHz, CDCl ₃ ) δ: -5.44, 14.09, 25.73, 29.32, 29.47, 29.60, 29.61, 29.65, 31.88, 36.74, 38.99, 40.44, 55.14, 60.37, 62.14, 74.01, 85.74, 112.96, 126.63 , 127.68, 128.11, 130.02, 130.03, 136.05, 136.11, 144.92, 156.24, 158.33, 173.26.

（Ｖａ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−パルミトイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−グリセロール（1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)- 2-O-[N-palmitoyl-N-(4-aminobutyl)carbamoyl]- glycerol）（２７ａ）の製造
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−パルミトイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリル−グリセロール（２６ａ）（０．７５ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４．４ｍＬ）溶液に、ＴＢＡＦ（２ｍＬ、２ｍｍｏｌ、２．３ｅｑ．）を滴下した後、１時間撹拌した。前記反応溶液を酢酸エチルで希釈し、ＮａＨＣＯ₃飽和水溶液（×２）、ＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記反応溶液の溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ１００％）で単離精製して、黄色のオイル状の表題化合物を得た（収量０．５２ｇ、０．７０ｍｍｏｌ、収率８０％）。(Va) 1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2-O- [N-palmitoyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -glycerol (1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) )-2-O- [N-palmitoyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -glycerol) (27a) 1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2-O- [N-palmitoyl -N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -3-O-tert-butyl-dimethylsilyl-glycerol (26a) (0.75 g, 0.87 mmol) in THF (4.4 mL) was added to TBAF (2 mL, 2 mmol, 2.3 eq.) Was added dropwise, followed by stirring for 1 hour. The reaction solution was diluted with ethyl acetate, washed with a saturated aqueous NaHCO ₃ solution (× 2), a saturated aqueous NaCl solution (× 1), and dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent of the reaction solution was distilled off, and the resulting residue was isolated and purified by silica gel column chromatography (EtOAc 100%) to give the title compound as a yellow oil (yield 0.52 g, 0.70 mmol, Yield 80%).

¹H NMR(400MHz, CDCl₃) δ：0.86-0.95 (3H, m, pal), 1.25 (14H, s, pal), 2.02-2.30 (4H, m, ブチル), 3.22-3.30 (8H, m, ブチル and 1-H and 3-H), 3.79 (7H, m, -OCH₃ and cross), 6.81-7.43 (13H, m, DMTr).
¹³C-NMR (100MHz, CDCl₃) δ：13.85, 14.09, 20.49, 22.65, 25.74, 26.74, 27.18, 29.32, 29.47, 29.61, 29.65, 31.87, 36.75, 38.95, 40.55, 52.06, 55.17, 62.86, 63.22, 74.57, 86.12, 113.09, 126.78, 127.80, 128.01, 129.97, 135.72, 144.61, 156.57, 158.45, 173.37.
FAB-HRMS(NBA) calcd for C₄₅H₆₇N₂O₇ (MH+), 747.49485; found, 747.49549。 ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ: 0.86-0.95 (3H, m, pal), 1.25 (14H, s, pal), 2.02-2.30 (4H, m, butyl), 3.22-3.30 (8H, m, Butyl and 1-H and 3-H), 3.79 (7H, m, -OCH ₃ and cross), 6.81-7.43 (13H, m, DMTr).
¹³ C-NMR (100 MHz, CDCl ₃ ) δ: 13.85, 14.09, 20.49, 22.65, 25.74, 26.74, 27.18, 29.32, 29.47, 29.61, 29.65, 31.87, 36.75, 38.95, 40.55, 52.06, 55.17, 62.86, 63.22, 74.57, 86.12, 113.09, 126.78, 127.80, 128.01, 129.97, 135.72, 144.61, 156.57, 158.45, 173.37.
FAB-HRMS (NBA) calcd for C 45 H 67 N 2 O 7 (MH +), 747.49485; found, 747.49549.

（ＶＩａ）パルミチン酸が結合されたＣＰＧユニット（２９ａ）
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−パルミトイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−グリセロール（２７ａ）（０．５２ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）のピリジン（７．０ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（少量）および無水コハク酸（０．２１ｇ、２．１０ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を加え、１日撹拌した。前記反応溶液をクロロホルムで希釈し、水（×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、有機溶媒を留去した。得られた残渣を１２時間真空乾燥した後、ＤＭＦ（１７．５ｍＬ）に溶解させ、ＣＰＧ（０．３０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ、２２２μｍｏｌ／ｇ）に３０分間なじませた。前記反応混合物にＷＳＣ（０．１３ｇ、０．７０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を加えた後、３日間振とうした。前記反応混合物から溶媒を除去した後、得られたＣＰＧをピリジンで洗浄した。乾燥させた後、前記ＣＰＧに０．１ＭのＤＭＡＰ溶液（溶媒はピリジンと無水酢酸の混合物（ピリジン：Ａｃ₂Ｏ＝９：１））２０ｍＬを加え、室温で１日ほど振とうさせた。前記反応溶液を除去した後、前記ＣＰＧをＭｅＯＨついでアセトンで洗浄し、乾燥させた。得られたＣＰＧの活性は、２８．１μｍｏｌ／ｇであった（収量０．３２ｇ）。(VIa) CPG unit to which palmitic acid is bound (29a)
1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2-O- [N-palmitoyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -glycerol (27a) (0.52 g, 0.70 mmol) in pyridine ( 7.0 mL) solution was added DMAP (small amount) and succinic anhydride (0.21 g, 2.10 mmol, 3.0 eq.) And stirred for 1 day. The reaction solution was diluted with chloroform, washed with water (x3), dried over anhydrous sodium sulfate, and the organic solvent was distilled off. The obtained residue was vacuum-dried for 12 hours, then dissolved in DMF (17.5 mL), and applied to CPG (0.30 g, 0.18 mmol, 222 μmol / g) for 30 minutes. WSC (0.13 g, 0.70 mmol, 1.0 eq.) Was added to the reaction mixture and then shaken for 3 days. After removing the solvent from the reaction mixture, the resulting CPG was washed with pyridine. After drying, 20 mL of a 0.1 M DMAP solution (a mixture of pyridine and acetic anhydride (pyridine: Ac ₂ O = 9: 1)) was added to the CPG, and the mixture was shaken at room temperature for about 1 day. After removing the reaction solution, the CPG was washed with MeOH and then with acetone and dried. The activity of the obtained CPG was 28.1 μmol / g (yield 0.32 g).

（ＩＶｂ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−オレイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔブチル−ジメチル−シリルグリセロール(1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)- 2-O -[N-oleoyl- N-(4-aminobutyl)carbamoyl]- 3-O-tertbutyl- dimethyl- silylglycerol）（２６ｂ）の製造
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチル−シリルグリセロール（２５）（１．５ｇ、２．４１ｍｍｏｌ）のＣＨ₂Ｃｌ₂（１２ｍＬ）溶液に、オレイン酸（１．１５ｍＬ、３．６２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を加え撹拌した。３０分撹拌した後、その溶液にＷＳＣ（０．６９ｇ、３．６２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を加え、さらに２６時間撹拌した。前記反応溶液をクロロホルムで希釈し、水（×１）およびＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝２：１〜１：１）で単離精製して、黄色のオイル状の表題化合物を得た（収量１．８３ｇ、２．０６ｍｍｏｌ、収率８６％）。(IVb) 1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2-O- [N-oleyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -3-O-tertbutyl-dimethyl-silylglycerol (1 Preparation of -O- (4,4'-dimethoxytrityl)-2-O- [N-oleoyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl]-3-O-tertbutyl-dimethyl-silylglycerol) (26b) 1-O- Of (4,4′-dimethoxytrityl) -2-O- [N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -3-O-tert-butyldimethyl-silylglycerol (25) (1.5 g, 2.41 mmol) To a CH ₂ Cl ₂ (12 mL) solution, oleic acid (1.15 mL, 3.62 mmol, 1.5 eq.) Was added and stirred. After stirring for 30 minutes, WSC (0.69 g, 3.62 mmol, 1.5 eq.) Was added to the solution and further stirred for 26 hours. The reaction solution was diluted with chloroform, washed with water (× 1) and saturated aqueous NaCl solution (× 1), and dried over anhydrous sodium sulfate. After distilling off the organic solvent, the resulting residue was isolated and purified by silica gel column chromatography (N-hexane: EtOAc = 2: 1 to 1: 1) to give the title compound as a yellow oil ( Yield 1.83 g, 2.06 mmol, 86% yield).

¹H NMR(400MHz, CDCl₃) δ：0.04 (6H, s, TBDMS-CH₃), 0.86 (14H, s, t-ブチル and ole), 1.29-2.19 (32H, m, ole and ブチル), 3.23-3.53 (8H, m, ブチル and 1-H and 3-H), 3.83 (7H, m, -OCH₃ and cross), 5.37-5.40 (2H, m, ole), 6.84-7.49 (13H, m, DMTr).
¹³C-NMR (100MHz, CDCl₃) δ：-5.44, 14.10, 18.14, 22.65, 25.74, 26.58, 27.15, 27.19, 27.51, 29.14, 29.25, 29.28, 29.49, 29.62, 29.69, 29.74, 31.87, 36.71, 39.00, 40.44, 50.62, 55.15, 60.39, 62.15, 62.38, 74.03, 85.75, 112.98, 126.64, 127.70, 128.12, 129.72, 129.95, 130.03, 136.06, 136.13, 144.93, 156.30, 158.35, 173.32.
元素分析 Calced for C₅₃H₈₂N₂O₇Si・CHCl₃+1/2CH₃OH : C, 71.74; H, 9.31; N, 3.61, Found : C, 64.08; H, 8.30; N, 2.75。 ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ: 0.04 (6H, s, TBDMS-CH ₃ ), 0.86 (14H, s, t-butyl and ole), 1.29-2.19 (32H, m, ole and butyl), 3.23 -3.53 (8H, m, butyl and 1-H and 3-H), 3.83 (7H, m, -OCH ₃ and cross), 5.37-5.40 (2H, m, ole), 6.84-7.49 (13H, m, DMTr).
¹³ C-NMR (100 MHz, CDCl ₃ ) δ: -5.44, 14.10, 18.14, 22.65, 25.74, 26.58, 27.15, 27.19, 27.51, 29.14, 29.25, 29.28, 29.49, 29.62, 29.69, 29.74, 31.87, 36.71, 39.00 , 40.44, 50.62, 55.15, 60.39, 62.15, 62.38, 74.03, 85.75, 112.98, 126.64, 127.70, 128.12, 129.72, 129.95, 130.03, 136.06, 136.13, 144.93, 156.30, 158.35, 173.32.
Elemental analysis _{Calced for C 53 H 82 N 2} O 7 Si · CHCl 3 + 1 / 2CH 3 OH: C, 71.74; H, 9.31; N, 3.61, Found: C, 64.08; H, 8.30; N, 2.75.

（Ｖｂ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−オレイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−グリセロール（1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)- 2-O-[N-oleoyl-N-(4-aminobutyl)carbamoyl]- glycerol）（２７ｂ）の製造
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−オレイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔブチル−ジメチル−シリルグリセロール（２６ｂ）（１．６６ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１８ｍＬ）溶液に、ＴＢＡＦ（２ｍＬ、３．７６ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を滴下した。７時間後、前記反応溶液を酢酸エチルで希釈し、ＮａＨＣＯ₃飽和水溶液（×２）およびＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。反応溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：２〜０：１）で単離精製して、黄色のオイル状の表題化合物を得た（収量１．１９ｇ、１．５４ｍｍｏｌ、収率８２％）。(Vb) 1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2-O- [N-oleyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -glycerol (1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) )-2-O- [N-oleoyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -glycerol) (27b) 1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2-O- [N-oleyl To a solution of -N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -3-O-tertbutyl-dimethyl-silylglycerol (26b) (1.66 g, 1.88 mmol) in THF (18 mL) was added TBAF (2 mL, 3.76 mmol). 2 eq.) Was added dropwise. After 7 hours, the reaction solution was diluted with ethyl acetate, washed with a saturated aqueous NaHCO ₃ solution (× 2) and a saturated aqueous NaCl solution (× 1), and dried over anhydrous sodium sulfate. The reaction solvent was distilled off, and the resulting residue was isolated and purified by silica gel column chromatography (N-hexane: EtOAc = 1: 2 to 0: 1) to give the title compound as a yellow oil (yield) 1.19 g, 1.54 mmol, 82% yield).

¹H NMR(400MHz, CDCl₃) δ：0.85 (3H, m, ole), 1.26-2.16 (32H, m, ole and ブチル), 2.68 (1H, br, 3-OH), 3.21-3.29 (8H, m, ブチル and 1-H and 3-H), 3.78 (7H, m, -OCH₃ and cross), 5.29-5.38 (2H, m, ole), 6.81-7.43 (13H, m, DMTr).
¹³C-NMR (100MHz, CDCl₃) δ：14.05, 22.60, 25.70, 26.68, 27.14, 29.09, 29.24, 29.45, 29.65, 29.69, 31.83, 32.53, 36.67, 38.92, 40.50, 55.12, 62.84, 63.06, 74.53, 86.06, 113.05, 126.74, 127.76, 127.98, 129.67, 129.93, 135.70, 144.60, 156.58, 158.40, 173.34.
元素分析. Calced for C₄₇H₆₈N₂O₇・10/3 CHCl₃ : C, 73.02; H, 8.87; N, 3.62, Found : C, 51.79; H, 6.08; N, 2.48。 ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ: 0.85 (3H, m, ole), 1.26-2.16 (32H, m, ole and butyl), 2.68 (1H, br, 3-OH), 3.21-3.29 (8H, m, butyl and 1-H and 3-H), 3.78 (7H, m, -OCH ₃ and cross), 5.29-5.38 (2H, m, ole), 6.81-7.43 (13H, m, DMTr).
¹³ C-NMR (100 MHz, CDCl ₃ ) δ: 14.05, 22.60, 25.70, 26.68, 27.14, 29.09, 29.24, 29.45, 29.65, 29.69, 31.83, 32.53, 36.67, 38.92, 40.50, 55.12, 62.84, 63.06, 74.53, 86.06, 113.05, 126.74, 127.76, 127.98, 129.67, 129.93, 135.70, 144.60, 156.58, 158.40, 173.34.
Elemental analysis. Calced for C ₄₇ H ₆₈ N ₂ O ₇ · 10/3 CHCl ₃ : C, 73.02; H, 8.87; N, 3.62, Found: C, 51.79; H, 6.08; N, 2.48.

（ＶＩｂ）オレイン酸が結合されたＣＰＧユニット（２９ｂ）
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−オレイル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−グリセロール（２７ｂ）（０．７７ｇ、１．００ｍｍｏｌ）のピリジン（１０ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（少量）および無水コハク酸（０．３０ｇ、３．００ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を加え、１日撹拌した。前記反応溶液を酢酸エチルで希釈し、水（×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、有機溶媒を留去した。得られた残渣を１２時間真空乾燥した後、ＤＭＦ（１２．５ｍＬ）に溶解させ、ＣＰＧ（０．５０ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、２２２μｍｏｌ／ｇ）に３０分間なじませた。前記反応混合物にＷＳＣ（０．１９ｇ、１．００ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を加えた後、３日間振とうした。前記反応混合物から溶媒を除去した後、得られたＣＰＧをピリジンで洗浄した。乾燥させた後、前記ＣＰＧに０．１ＭのＤＭＡＰ溶液（溶媒はピリジンと無水酢酸の混合物（ピリジン：Ａｃ₂Ｏ＝９：１））２０ｍＬを加え、室温で１日ほど振とうさせた。前記ＣＰＧをＭｅＯＨついでアセトンで洗浄し、乾燥させた。得られたＣＰＧの活性は８３．２μｍｏｌ／ｇであった（収量０．５２ｇ）。(VIb) CPG unit conjugated with oleic acid (29b)
1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2-O- [N-oleyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -glycerol (27b) (0.77 g, 1.00 mmol) in pyridine ( 10 mL) solution was added DMAP (small amount) and succinic anhydride (0.30 g, 3.00 mmol, 3.0 eq.) And stirred for 1 day. The reaction solution was diluted with ethyl acetate, washed with water (x3), dried over anhydrous sodium sulfate, and the organic solvent was distilled off. The obtained residue was vacuum-dried for 12 hours, then dissolved in DMF (12.5 mL), and applied to CPG (0.50 g, 0.25 mmol, 222 μmol / g) for 30 minutes. WSC (0.19 g, 1.00 mmol, 1.0 eq.) Was added to the reaction mixture and then shaken for 3 days. After removing the solvent from the reaction mixture, the resulting CPG was washed with pyridine. After drying, 20 mL of a 0.1 M DMAP solution (a mixture of pyridine and acetic anhydride (pyridine: Ac ₂ O = 9: 1)) was added to the CPG, and the mixture was shaken at room temperature for about 1 day. The CPG was washed with MeOH followed by acetone and dried. The activity of the obtained CPG was 83.2 μmol / g (yield 0.52 g).

（ＩＶｃ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−グリセロール（1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)- 2-O- [N-cholesteryloxycarbonyl- N-(4-aminobutyl)carbamoyl]- 3-O-tert- butyldimethylsilyl- glycerol）（２６ｃ）の製造
コレステロール（０．２２ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）のピリジン（３ｍＬ）溶液に、Ｉｍ₂ＣＯ（０．１０ｇ、０．６３ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を加え、２時間撹拌した。前記反応溶液に、１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチル−シリルグリセロール（２５）（０．４３ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）を加え、１２時間撹拌した。前記反応溶液を酢酸エチルで希釈し、ＮａＨＣＯ₃飽和水溶液（×２）およびＮａＣｌ飽和水溶液（×１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１０：１）で単離精製して、白色泡状の表題化合物を得た（収量０．３９ｇ、０．３７ｍｍｏｌ、収率６４％）。(IVc) 1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2-O- [N-cholesteryloxycarbonyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -3-O-tert-butyldimethylsilyl-glycerol Preparation of (1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)-2-O- [N-cholesteryloxycarbonyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl]-3-O-tert-butyldimethylsilyl-glycerol) (26c) Cholesterol ( 0.22 g, 0.58 mmol) in pyridine (3 mL) was added Im ₂ CO (0.10 g, 0.63 mmol, 1.1 eq.) And stirred for 2 hours. To the reaction solution, 1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2-O- [N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -3-O-tert-butyldimethyl-silylglycerol (25) ( 0.43 g, 0.70 mmol) was added and stirred for 12 hours. The reaction solution was diluted with ethyl acetate, washed with a saturated aqueous NaHCO ₃ solution (× 2) and a saturated aqueous NaCl solution (× 1), and dried over anhydrous sodium sulfate. The organic solvent was distilled off, and the resulting residue was isolated and purified by silica gel column chromatography (N-hexane: EtOAc = 10: 1) to give the title compound as a white foam (yield 0.39 g, 0). 37 mmol, 64% yield).

¹H NMR(400MHz, CDCl₃) δ：0.10 (6H, s, TBDMS-CH₃), 0.68-2.34 (58H, m, t-ブチル and chol and ブチル), 3.09-3.18 (4H, m, ブチル), 3.76-3.79 (7H, m, -OCH₃ and cross), 4.48-4.74 (2H, m, 1-H), 4.96-5.37 (2H, m, 2-H), 6.80-7.44 (13H, m, DMTr).
¹³C-NMR (100MHz, CDCl₃) δ：-5.40, -3.60, 11.84, 17.96, 18.69, 19.31, 21.01, 22.54, 22.81, 23.80, 24.26, 25.63, 25.76, 27.27, 27.99, 28.15, 28.21, 31.84, 31.87, 35.77, 36.15, 36.52, 36.95, 38.54, 39.48, 39.71, 40.57, 42.28, 49.97, 55.17, 56.09, 56.65, 62.13, 76.68, 85.76, 112.99, 112.45, 126.63, 127.70, 128.14, 130.05, 135.62, 136.13, 139.81, 144.94, 156.10, 158.34.
元素分析 Calced for C₆₃H₉₄N₂O₈Si・2 H₂O : C, 73.07; H, 9.15; N, 2.71, Found : C, 70.63; H, 9.40; N, 2.34。 ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ: 0.10 (6H, s, TBDMS-CH ₃ ), 0.68-2.34 (58H, m, t-butyl and chol and butyl), 3.09-3.18 (4H, m, butyl) , 3.76-3.79 (7H, m, -OCH ₃ and cross), 4.48-4.74 (2H, m, 1-H), 4.96-5.37 (2H, m, 2-H), 6.80-7.44 (13H, m, DMTr).
¹³ C-NMR (100 MHz, CDCl ₃ ) δ: −5.40, −3.60, 11.84, 17.96, 18.69, 19.31, 21.01, 22.54, 22.81, 23.80, 24.26, 25.63, 25.76, 27.27, 27.99, 28.15, 28.21, 31.84, 31.87, 35.77, 36.15, 36.52, 36.95, 38.54, 39.48, 39.71, 40.57, 42.28, 49.97, 55.17, 56.09, 56.65, 62.13, 76.68, 85.76, 112.99, 112.45, 126.63, 127.70, 128.14, 130.05, 135.62, 136.13 139.81, 144.94, 156.10, 158.34.
Elemental analysis _{Calced for C 63 H 94 N 2} O 8 Si · 2 H 2 O: C, 73.07; H, 9.15; N, 2.71, Found: C, 70.63; H, 9.40; N, 2.34.

（Ｖｃ）１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−グリセロール（1-O- (4,4'-dimethoxytrityl)- 2-O-[N- cholesteryloxycarbonyl -N-(4-aminobutyl)carbamoyl]- glycerol）（２７ｃ）の製造
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−グリセロール（２６ｃ）（０．３４ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５．０ｍＬ）溶液に、ＴＢＡＦ（１ｍＬ、１ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を滴下した後、４時間撹拌した。反応溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝５：１〜０：１）で単離精製して、無色オイル状の表題化合物を得た（収量０．６１ｇ、０．１８ｍｍｏｌ、収率５３％）。(Vc) 1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2-O- [N-cholesteryloxycarbonyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -glycerol (1-O— (4,4 ′ -dimethoxytrityl)-2-O- [N-cholesteryloxycarbonyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -glycerol) (27c) 1-O- (4,4'-dimethoxytrityl) -2-O- [N -Cholesteryloxycarbonyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -3-O-tert-butyldimethylsilyl-glycerol (26c) (0.34 g, 0.33 mmol) in THF (5.0 mL) was added to TBAF. (1 mL, 1 mmol, 3.0 eq.) Was added dropwise, followed by stirring for 4 hours. After the reaction solvent was distilled off, the resulting residue was isolated and purified by silica gel column chromatography (N-hexane: EtOAc = 5: 1 to 0: 1) to give the title compound as a colorless oil (yield) 0.61 g, 0.18 mmol, 53% yield).

¹H NMR(400MHz, CDCl₃) δ：0.62-2.28 (49H, m, chol and ブチル), 3.12-3.22 (4H, m, ブチル), 3.73 (8H, s, -OCH₃ and cross), 4.42-4.61 (2H, m, 1-H), 4.83-5.30 (2H, m, 2-H), 6.75-7.37 (13H, m, DMTr).
¹³C-NMR (100MHz, CDCl₃) δ：11.83, 18.68, 19.30, 21.01, 22.54, 22.80, 23.80, 24.26, 27.08, 27.28, 27.98, 28.14, 28.21, 31.83, 31.87, 35.77, 36.14, 36.51, 36.93, 38.52, 39.48, 39.70, 40.68, 42.27, 49.95, 55.19, 56.09, 56.65, 62.86, 63.37, 74.55, 86.18, 113.12, 122.46, 126.82, 127.84, 128.02, 129.97, 130.01, 135.71, 135.73, 139.77, 144.59, 156.21, 158.47.
元素分析 Calced for C₅₇H₈₀N₂O₈・1/3 H₂O : C, 74.31; H, 8.75; N, 3.04, Found : C, 73.87; H, 8.68; N, 2.92。 ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ: 0.62-2.28 (49H, m, chol and butyl), 3.12-3.22 (4H, m, butyl), 3.73 (8H, s, -OCH ₃ and cross), 4.42- 4.61 (2H, m, 1-H), 4.83-5.30 (2H, m, 2-H), 6.75-7.37 (13H, m, DMTr).
¹³ C-NMR (100 MHz, CDCl ₃ ) δ: 11.83, 18.68, 19.30, 21.01, 22.54, 22.80, 23.80, 24.26, 27.08, 27.28, 27.98, 28.14, 28.21, 31.83, 31.87, 35.77, 36.14, 36.51, 36.93, 38.52, 39.48, 39.70, 40.68, 42.27, 49.95, 55.19, 56.09, 56.65, 62.86, 63.37, 74.55, 86.18, 113.12, 122.46, 126.82, 127.84, 128.02, 129.97, 130.01, 135.71, 135.73, 139.771, 144.59, 15 158.47.
Elemental analysis _{Calced for C 57 H 80 N 2} O 8 · 1/3 H 2 O: C, 74.31; H, 8.75; N, 3.04, Found: C, 73.87; H, 8.68; N, 2.92.

（ＶＩｃ）コレステロールが結合されたＣＰＧユニット（２９ｃ）
１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−［Ｎ−コレステリルオキシカルボニル−Ｎ−（４−アミノブチル）カルバモイル］−グリセロール（２７ｃ）（０．６０ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）のピリジン（１．７ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（少量）および無水コハク酸（０．０５１ｇ、０．５１ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を加え、１日撹拌した。前記反応溶液をクロロホルムで希釈し、水（×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、有機溶媒を留去した。得られた残渣を１２時間真空乾燥した後、ＤＭＦ（２．２ｍＬ）に溶解させ、ＣＰＧ（０．１９ｇ、０．０４３ｍｍｏｌ、２２２μｍｏｌ／ｇ）に３０分間なじませた。前記反応混合物にＷＳＣ（０．０３３ｇ、０．１７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を加えた後、３日間振とうした。前記反応混合物から溶媒を除去した後、得られたＣＰＧをピリジンで洗浄した。乾燥させた後、前記ＣＰＧに０．１ＭのＤＭＡＰ溶液（溶媒はピリジンと無水酢酸の混合物（ピリジン：Ａｃ₂Ｏ＝９：１））２０ｍＬを加え、室温で２４時間振とうさせた。前記ＣＰＧをＭｅＯＨついでアセトンで洗浄し、乾燥させた。得られたＣＰＧの活性は８８．３μｍｏｌ／ｇであった（収量０．２０ｇ）。(VIc) CPG unit to which cholesterol is bound (29c)
Of 1-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -2-O- [N-cholesteryloxycarbonyl-N- (4-aminobutyl) carbamoyl] -glycerol (27c) (0.60 g, 0.17 mmol) To the pyridine (1.7 mL) solution, DMAP (small amount) and succinic anhydride (0.051 g, 0.51 mmol, 3.0 eq.) Were added and stirred for 1 day. The reaction solution was diluted with chloroform, washed with water (x3), dried over anhydrous sodium sulfate, and the organic solvent was distilled off. The obtained residue was vacuum-dried for 12 hours, then dissolved in DMF (2.2 mL), and applied to CPG (0.19 g, 0.043 mmol, 222 μmol / g) for 30 minutes. WSC (0.033 g, 0.17 mmol, 1.0 eq.) Was added to the reaction mixture and then shaken for 3 days. After removing the solvent from the reaction mixture, the resulting CPG was washed with pyridine. After drying, 20 mL of a 0.1 M DMAP solution (a mixture of pyridine and acetic anhydride (pyridine: Ac ₂ O = 9: 1)) was added to the CPG, and the mixture was shaken at room temperature for 24 hours. The CPG was washed with MeOH followed by acetone and dried. The activity of the obtained CPG was 88.3 μmol / g (yield 0.20 g).

２．一本鎖の修飾オリゴヌクレオチドの製造
標的タンパクはホモサピエンス・リボヌクレアーゼＬ（Homo sapiens ribonuclease L ）(2',5'-oligoisoadenylate synthetase-dependent， RNase L) [gi:30795246]とし、標的配列は開始コドンから92番目から114番目にあたる配列番号１からなる塩基配列とした。修飾一本鎖オリゴヌクレオチドとして、この配列番号１からなる塩基配列に対し、３’末端にパルミチン酸、オレイン酸またはコレステロールがリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖（配列番号２）と、３’末端にパルミチン酸、オレイン酸またはコレステロールがリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号３）とを製造した。比較として、配列番号１からなる塩基配列に対し、ＤＮＡセンス鎖（配列番号４）およびＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号５）を有するｓｉＲＮＡ（Ambion社製）を用いた。2. Production of single-stranded modified oligonucleotide The target protein is Homo sapiens ribonuclease L (2 ', 5'-oligoisoadenylate synthetase-dependent, RNase L) [gi: 30795246], and the target sequence is the start codon The nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 1 from the 92nd to the 114th. As a modified single-stranded oligonucleotide, a modified DNA sense strand (SEQ ID NO: 2) in which palmitic acid, oleic acid or cholesterol is bound to the 3 ′ end via a linker with respect to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1, and 3 A modified DNA antisense strand (SEQ ID NO: 3) having palmitic acid, oleic acid or cholesterol bound to the end via a linker was prepared. For comparison, siRNA (manufactured by Ambion) having a DNA sense strand (SEQ ID NO: 4) and a DNA antisense strand (SEQ ID NO: 5) with respect to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 was used.

実施例１
３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖の製造
前記ＣＰＧユニット（２９ａ）（各々の活性に基づき１μｍｏｌに相当する量）を核酸自動合成機（Nucleic Acid Synthesis System (Expedite 8909 system, Applied Biosystems社製)）にセットして、配列番号２に従い、ホスホロアミダイト法により３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖をＣＰＧ上に合成した。Example 1
Production of modified DNA sense strand in which palmitic acid is bound to the 3 ′ end via a linker The above CPG unit (29a) (amount corresponding to 1 μmol based on each activity) was added to a nucleic acid synthesizer (Nucleic Acid Synthesis System (Expedite) 8909 system, manufactured by Applied Biosystems)), and a modified DNA sense strand in which palmitic acid was bound to the 3 ′ end via a linker according to SEQ ID NO: 2 was synthesized on CPG according to SEQ ID NO: 2.

縮合時間は１５分とし、ＤＭＴｒ基を除去した状態で合成を終了した。ＣＰＧに結合した修飾ＤＮＡセンス鎖にエタノールとアンモニアの混合（ＥｔＯＨ：ＮＨ₃＝１：３）溶液２ｍＬを加え、５５°Ｃで１２時間反応させた。反応後、得られたろ液をエッペンドルフチューブに移し、減圧下に濃縮した。得られた残渣に１ＭのＴＢＡＦのＴＨＦ溶液を１ｍＬ加え、１２時間振とうさせた。前記反応溶液を、０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液で希釈し、３０ｍＬとした。この反応液を、Ｃ−１８逆相カラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）（ＣＨ₃ＣＮ１０ｍＬ、０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液１０ｍＬを流し平衡化した）に通し、修飾ＤＮＡセンス鎖混合物をカラムに吸着させた。前記カラムを滅菌水で洗浄して塩を取り除き、その後、８０％ＣＨ₃ＣＮ水溶液３ｍＬで溶出した。溶出液を減圧下に濃縮した。得られた残渣にローディング溶液（１×９０％ ホルムアミド中のＴＢＥ）１００μＬを加え、２０％ＰＡＧＥ（２０Ａ、６時間）により目的とする修飾ＤＮＡセンス鎖とその他を分離した。目的とする修飾ＤＮＡセンス鎖のバンドを前記ＰＡＧＥから切り出し、前記バンドに０．１ＭのＥＤＴＡ水溶液を２０ｍＬ加え、一晩放置した。この溶液をＣ−１８逆相カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）により５０％ＣＨ₃ＣＮ水溶液３ｍＬで精製して表題化合物を得た。The condensation time was 15 minutes, and the synthesis was completed with the DMTr group removed. 2 mL of a mixed solution of ethanol and ammonia (EtOH: NH ₃ = 1: 3) was added to the modified DNA sense strand bound to CPG, and the mixture was reacted at 55 ° C. for 12 hours. After the reaction, the obtained filtrate was transferred to an Eppendorf tube and concentrated under reduced pressure. 1 mL of 1M TBAF in THF was added to the resulting residue and shaken for 12 hours. The reaction solution was diluted with 0.1 M TEAA buffer to 30 mL. The reaction solution was passed through a C-18 reverse phase column (Sep-Pak) (CH ₃ CN 10 mL, 0.1 M TEAA buffer 10 mL was allowed to equilibrate), and the modified DNA sense strand mixture was adsorbed onto the column. The column was washed with sterilized water to remove salts, and then eluted with 3 mL of 80% CH ₃ CN aqueous solution. The eluate was concentrated under reduced pressure. To the obtained residue, 100 μL of a loading solution (TBE in 1 × 90% formamide) was added, and the desired modified DNA sense strand and other were separated by 20% PAGE (20 A, 6 hours). A target band of the modified DNA sense strand was excised from the PAGE, and 20 mL of 0.1 M EDTA aqueous solution was added to the band and left overnight. This solution was purified by C-18 reverse phase column chromatography (Sep-Pak) with 3 mL of 50% aqueous CH ₃ CN solution to give the title compound.

前記溶液の調製方法について説明する。   A method for preparing the solution will be described.

０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液は、以下のようにして調製した。まず、２Ｎの酢酸（１１４．３８ｍＬ）およびトリエチルアミン（２７７．６ｍＬ）の混合物に、水を加えて１Ｌにした。その溶液に酢酸を加えて、ｐＨを７．０に調整し、次いでその溶液を２０倍に希釈することにより調製した。   A 0.1 M TEAA buffer was prepared as follows. First, water was added to 1 L to a mixture of 2N acetic acid (114.38 mL) and triethylamine (277.6 mL). Acetic acid was added to the solution to adjust the pH to 7.0, and then the solution was prepared by diluting 20 times.

２０％ＰＡＧＥは、以下のようにして調製した。まず、４０％アクリルアミド（アクリルアミド：Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド＝１９：１）溶液（４５ｍＬ）、尿素（３７．８ｇ）および１０×ＴＢＥ緩衝液（９ｍＬ）を混合して溶解させ、その後水を加えて９０ｍＬとした。その溶液に、ＡＰＳ（６２ｍｇ）を加えて溶解させた後、ＴＥＭＥＤ（４５μＬ）を加えて振り混ぜた。その溶液を、１．５ｍｍスペーサーを挟んで固定した２枚ガラス板の間に流し込み、１時間以上静置して固化させて、２０％ＰＡＧＥを得た。   20% PAGE was prepared as follows. First, 40% acrylamide (acrylamide: N, N′-methylenebisacrylamide = 19: 1) solution (45 mL), urea (37.8 g) and 10 × TBE buffer (9 mL) are mixed and dissolved, and then water is added. To 90 mL. APS (62 mg) was added to the solution and dissolved, and then TEMED (45 μL) was added and shaken. The solution was poured between two glass plates fixed with a 1.5 mm spacer in between, and allowed to stand for 1 hour or more to solidify to obtain 20% PAGE.

０．１ＭのＥＤＴＡ水溶液は、ＥＤＴＡ・４Ｎａ（１．８０ｇ）を水（４０ｍＬ）に溶解させることにより調製した。   A 0.1 M EDTA aqueous solution was prepared by dissolving EDTA.4Na (1.80 g) in water (40 mL).

１×９０％ ホルムアミドは、１０×ＴＢＥ緩衝液（１ｍｌ）とホルミアミド（９ｍｌ）を混合して調製した。   1 × 90% formamide was prepared by mixing 10 × TBE buffer (1 ml) and formamide (9 ml).

実施例１Ｐ
配列番号２からなる修飾一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端に³²Ｐラベルを施した以外は、実施例１と同様にして、配列番号２からなる一本鎖の５’末端が³²Ｐでラベルされた修飾ＤＮＡセンス鎖を製造した。Example 1P
The single-stranded 5 ′ end consisting of SEQ ID NO: 2 is labeled with ³² P in the same manner as in Example 1, except that the 5 ′ end of the modified single-stranded oligonucleotide consisting of SEQ ID NO: 2 is labeled with the ³² P label. A modified DNA sense strand was produced.

実施例２
３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖の製造
配列番号２の代わりに配列番号３を用いた以外は、実施例１と同様にして製造して、表題化合物を得た。Example 2
Production of modified DNA antisense strand in which palmitic acid is bound to the 3 ′ end via a linker Except that SEQ ID NO: 3 was used instead of SEQ ID NO: 2, the title compound was produced in the same manner as in Example 1. Obtained.

実施例３
３’末端にオレイン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖の製造
ＣＰＧユニット（２９ａ）の代わりにＣＰＧユニット（２９ｂ）を用いた以外は、実施例１と同様にして製造して、表題化合物を得た。Example 3
Production of modified DNA sense strand in which oleic acid is bound to the 3 ′ end via a linker Production was carried out in the same manner as in Example 1 except that CPG unit (29b) was used instead of CPG unit (29a). The title compound was obtained.

実施例４
３’末端にオレイン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖の製造
配列番号２の代わりに配列番号３を用いた以外は、実施例３と同様にして製造して、表題化合物を得た。Example 4
Production of modified DNA antisense strand in which oleic acid was bound to 3 ′ end via linker. Except that SEQ ID NO: 3 was used instead of SEQ ID NO: 2, the title compound was produced in the same manner as in Example 3. Obtained.

参考例１
３’末端にコレステロールがリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖の製造
ＣＰＧユニット（２９ａ）の代わりにＣＰＧユニット（２９ｃ）を用いた以外は、実施例１と同様にして製造して、表題化合物を得た。Reference example 1
Production of modified DNA sense strand in which cholesterol is bonded to the 3 ′ end via a linker Production was conducted in the same manner as in Example 1 except that CPG unit (29c) was used instead of CPG unit (29a). A compound was obtained.

参考例２
３’末端にコレステロールがリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖の製造
配列番号２の代わりに配列番号３を用いた以外は、参考例１と同様にして製造して、表題化合物を得た。Reference example 2
Production of modified DNA antisense strand in which cholesterol is bonded to the 3 ′ end via a linker Production is performed in the same manner as in Reference Example 1 except that SEQ ID NO: 3 is used instead of SEQ ID NO: 2 to obtain the title compound. It was.

得られたオリゴヌクレオチドを、水（１ｍＬ）に溶解させ、水で１００倍に希釈して希釈液を調製した。その希釈液の吸光度（２６０ｎｍ）を測定し、収量を算出した。その吸光度のε値、２６０ｎｍにおける吸光度および収率を、表１に示す。また、得られたオリゴヌクレオチドの分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより確認した。その結果も、表１に示す。   The obtained oligonucleotide was dissolved in water (1 mL) and diluted 100 times with water to prepare a diluted solution. The absorbance (260 nm) of the diluted solution was measured, and the yield was calculated. Table 1 shows the ε value of the absorbance, the absorbance at 260 nm and the yield. Moreover, the molecular weight of the obtained oligonucleotide was confirmed by MALDI-TOF / MS. The results are also shown in Table 1.

前記オリゴヌクレオチドの吸光度および収量は、以下のようにして測定した。

The absorbance and yield of the oligonucleotide were measured as follows.

前記オリゴヌクレオチドを水に溶解させて、水溶液を調製し、その水溶液を、波長２６０ｎｍでの吸光度（Ａｂｓ₂₆₀）が、吸光度計の有効範囲になるように希釈した。光路長（ｌ）１ｃｍの吸光度測定用石英セルを用い、室温にてＡｂｓ₂₆₀を測定した。ＯＤ₂₆₀値の計算には以下の式（１）を用いて算出した。

ＯＤ₂₆₀（ε・Ｍ・ｍＬ^-1）＝Ａｂｓ₂₆₀（ε・ｃｍ・Ｍ）×Ｖ^-1（ｍＬ）×ｌ^-1（ｃｍ） （１）

前記式（１）中、Ａｂｓ₂₆₀は、前記オリゴヌクレオチド溶液の波長２６０ｎｍにおける吸光度を示し、Ｖは溶液の全量を示し、ｌは光路長を示し、Ｍはモル濃度を示す。The oligonucleotide was dissolved in water to prepare an aqueous solution, and the aqueous solution was diluted such that the absorbance at a wavelength of 260 nm (Abs ₂₆₀ ) was within the effective range of the absorptiometer. Abs ₂₆₀ was measured at room temperature using a quartz cell for measuring absorbance with an optical path length (1) of 1 cm. The OD ₂₆₀ value was calculated using the following formula (1).

OD ₂₆₀ (ε · M · mL ⁻¹ ) = Abs ₂₆₀ (ε · cm · M) × V ⁻¹ (mL) × l ⁻¹ (cm) (1)

In the formula (1), Abs ₂₆₀ represents the absorbance of the oligonucleotide solution at a wavelength of 260 nm, V represents the total amount of the solution, 1 represents the optical path length, and M represents the molar concentration.

前記式（１）中、前記オリゴヌクレオチドのモル吸光係数ε２６０は、以下の式（２）を用いて算出した。

ε＝２｛ε（Ｎ_1pＮ₂）＋ε（Ｎ_2pＮ₃）＋・・・＋ε（Ｎ_n-1pＮ_n）｝−｛ε（Ｎ₂）＋ε（Ｎ₃）＋・・・＋ε（Ｎ_n-1）｝ （２）

前記式（２）中、ε（Ｎ_n）はある核酸Ｎ_nのε₂₆₀を示し、ε（Ｎ_n-1pＮ_n）はある核酸二量体Ｎ_n-1pＮ_nのε₂₆₀を示す。なお、（１１−ｓ）、（１１−ａ）、（１２−ｓ）、（１２−ａ）、（１３−ｓ）、（１３−ａ）、（Ｆ１２−ｓ）、（Ｆ１２−ａ）、（Ｐ−１２−ａ）および（Ｐ１３−ａ）については、修飾された３’末端部分のＴＴ配列をＵＵ配列としてε₂₆₀を計算した。In the formula (1), the molar extinction coefficient ε260 of the oligonucleotide was calculated using the following formula (2).

ε = 2 {ε (N _1p N ₂ ) + ε (N _2p N ₃ ) +... + ε (N _n-1p N _n )} − {ε (N ₂ ) + ε (N ₃ ) +. N _n-1 )} (2)

In the formula (2), ε (N _n ) represents ε ₂₆₀ of a certain nucleic acid N _n , and ε (N _n-1p N _n ) represents ε ₂₆₀ of a certain nucleic acid dimer N _n-1p N _n . (11-s), (11-a), (12-s), (12-a), (13-s), (13-a), (F12-s), (F12-a), For (P-12-a) and (P13-a), ε ₂₆₀ was calculated using the modified TT sequence at the 3 ′ end as the UU sequence.

濃度Ｃ（ｍｏｌ／Ｌ）は、以下の式（３）を用いて算出した。

Ｃ＝Ａｂｓ₂₆₀×ε₂₆₀ ^-1×ｌ^-1 （３）

前記式（３）中、Ａｂｓ₂₆₀、ε₂₆₀、およびｌは、前記のとおりである。
３．修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの製造
実施例５
実施例１で製造した修飾ＤＮＡセンス鎖（１ｎｍｍｏｌ）と実施例２で製造した修飾アンチセンス鎖（１ｎｍｍｏｌ）を、アニーリングバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１００ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解させた。その溶液を９０℃で１分間、次いで３７℃で１時間の間、インキュベートして３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖（配列番号２）および３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号３）からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。The concentration C (mol / L) was calculated using the following formula (3).

C = Abs ₂₆₀ × ε ₂₆₀ ⁻¹ × l ⁻¹ (3)

In the formula (3), Abs ₂₆₀ , ε ₂₆₀ , and l are as described above.
3. Production of modified double-stranded oligonucleotide Example 5
The modified DNA sense strand (1 nmol) produced in Example 1 and the modified antisense strand (1 nmol) produced in Example 2 are dissolved in annealing buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 100 mM NaCl). I let you. The solution was incubated at 90 ° C. for 1 minute, and then at 37 ° C. for 1 hour, and the modified DNA sense strand (SEQ ID NO: 2) having palmitic acid bound to the 3 ′ end via a linker and palmiticin at the 3 ′ end A modified double-stranded oligonucleotide consisting of a modified DNA antisense strand (SEQ ID NO: 3) to which an acid was bound via a linker was obtained.

実施例６
実施例１で製造した修飾ＤＮＡセンス鎖の代わりに、実施例３で製造した修飾ＤＮＡセンス鎖を、実施例２で製造した修飾ＤＮＡアンチセンス鎖の代わりに、実施例４で製造した修飾ＤＮＡアンチセンス鎖を用いた以外は実施例５と同様にして、３’末端にオレイン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖（配列番号２）および３’末端にオレイン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号３）からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。Example 6
Instead of the modified DNA sense strand produced in Example 1, the modified DNA sense strand produced in Example 3 was used as the modified DNA antisense strand produced in Example 4 instead of the modified DNA antisense strand produced in Example 2. A modified DNA sense strand (SEQ ID NO: 2) in which oleic acid was bound to the 3 ′ end via a linker and oleic acid to the 3 ′ end via a linker in the same manner as Example 5 except that the sense strand was used A modified double-stranded oligonucleotide consisting of a bound modified DNA antisense strand (SEQ ID NO: 3) was obtained.

実施例７
実施例１で製造した修飾ＤＮＡセンス鎖の代わりに、参考例１で製造した修飾ＤＮＡセンス鎖を、実施例２で製造した修飾ＤＮＡアンチセンス鎖の代わりに、参考例２で製造した修飾ＤＮＡアンチセンス鎖を用いた以外は実施例５と同様にして、３’末端にコレステロールがリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖（配列番号２）および３’末端にコレステロールがリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号３）からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。Example 7
Instead of the modified DNA sense strand produced in Example 1, the modified DNA sense strand produced in Reference Example 1 was replaced with the modified DNA antisense strand produced in Reference Example 2 instead of the modified DNA antisense strand produced in Example 2. A modified DNA sense strand (SEQ ID NO: 2) in which cholesterol is bound to the 3 ′ end via a linker and cholesterol is bound to the 3 ′ end via a linker in the same manner as in Example 5 except that the sense strand is used. A modified double-stranded oligonucleotide consisting of the modified DNA antisense strand (SEQ ID NO: 3) was obtained.

得られたアンチセンス鎖およびセンス鎖の構造は、以下の式（anti）および式（sens）に示すとおりである。   The structure of the obtained antisense strand and sense strand is as shown in the following formula (anti) and formula (sens).

実施例８
実施例２で製造した修飾ＤＮＡアンチセンス鎖の代わりに、天然型ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号５）（Ａｍｂｉｏｎ製）を用いた以外は実施例５と同様にして、３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡセンス鎖（配列番号２）および天然型ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号５）からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。得られたアンチセンス鎖およびセンス鎖の構造は、以下の式（anti）および式（sens）に示すとおりである。

Example 8
Instead of the modified DNA antisense strand prepared in Example 2, a natural DNA antisense strand (SEQ ID NO: 5) (manufactured by Ambion) was used as in Example 5 except that palmitic acid was present at the 3 ′ end. A modified double-stranded oligonucleotide consisting of a modified DNA sense strand (SEQ ID NO: 2) and a natural DNA antisense strand (SEQ ID NO: 5) bound via a linker was obtained. The structure of the obtained antisense strand and sense strand is as shown in the following formula (anti) and formula (sens).

実施例９
実施例１で製造した修飾ＤＮＡセンス鎖の代わりに、天然型ＤＮＡセンス鎖（配列番号４）（Ａｍｂｉｏｎ製）を用いた以外は実施例５と同様にして、天然型ＤＮＡセンス鎖（配列番号４）および３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された修飾ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号３）からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。得られたアンチセンス鎖およびセンス鎖の構造は、以下の式（anti）および式（sens）に示すとおりである。

Example 9
A natural DNA sense strand (SEQ ID NO: 4) was used in the same manner as in Example 5 except that a natural DNA sense strand (SEQ ID NO: 4) (Ambion) was used instead of the modified DNA sense strand prepared in Example 1. ) And a modified double-stranded oligonucleotide consisting of a modified DNA antisense strand (SEQ ID NO: 3) having palmitic acid bound to the 3 ′ end via a linker. The structure of the obtained antisense strand and sense strand is as shown in the following formula (anti) and formula (sens).

（修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの評価）
１．熱的安定性
実施例５〜７で製造した修飾二本鎖オリゴヌクレオチドについて、５０％%融解温度Tmを測定した。得られた結果を表２に示す。

(Evaluation of modified double-stranded oligonucleotide)
1. Thermal Stability For the modified double-stranded oligonucleotides produced in Examples 5-7, 50%% melting temperature Tm was measured. The obtained results are shown in Table 2.

天然型ｓｉＲＮＡの構造は、以下のとおりである。

The structure of natural siRNA is as follows.

前記表２から、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドが二本鎖形成能に優れることが確認できた。

From Table 2 above, it was confirmed that the modified double-stranded oligonucleotide of the present invention was excellent in double-stranded forming ability.

２．細胞内でのＲＮａｓｅＬ発現の評価
（１） 細胞培養
細胞培養１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）およびストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃でＨＴ１０８０細胞を増殖させた。指数増殖を維持するため、細胞を定期的に継代した。約２５％コンフルエンシーでのトランスフェクションの２４時間前に、ＨＴ１０８０細胞をトリプシン処理し、抗生物質を含まない新しい培地を用いて希釈し、３５ミリデイッシュに移した（２ｍｌ／デイッシュ）。2. Evaluation of intracellular RNase L expression (1) Cell culture HT1080 cells grown at 37 ° C in RPMI 1640 medium supplemented with cell culture 10% FBS, penicillin (100 units / ml) and streptomycin (0.1 mg / ml) I let you. Cells were passaged periodically to maintain exponential growth. Twenty-four hours prior to transfection at approximately 25% confluency, HT1080 cells were trypsinized, diluted with fresh medium without antibiotics, and transferred to a 35 millidish (2 ml / dish).

（２） 修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの細胞へのトランスフェクション
リポフェクタミン２０００試薬（インビトロジェン（Invitrogen）社製）を用いて、接着細胞株に対して以下に記載する方法で修飾二本鎖オリゴヌクレオチドのトランスフェクションを行った。まず、ＲＰＭＩ１６４０培地（抗生物質およびＦＢＳを含まない）に、二本鎖オリゴヌクレオチド（前記培地２５０μｌ当たり５０、１００ｎＭまたは２００ｎＭ）（実施例５で得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチド）を溶解させ、５分間室温でインキュベートした。その溶液に、５０倍希釈した等量のリポフェクタミン２０００試薬を添加し、その後２０分間室温でインキュベートした。得られた溶液のうち、５００μｌを採取して、前記（１）で調製した３５ミリデイッシュへ移してトランスフェクションを行った。トランスフェクションから２４時間インキュベーション後および４８時間インキュベーション後に、その３５ミリディッシュ中の細胞をインキュベートした。なお、その後、実施例６または実施例７で得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチドのいずれについても、トランスフェクションされた細胞に対する毒性は確認されなかった。(2) Transfection of modified double-stranded oligonucleotide into cells Using Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen), transfection of the modified double-stranded oligonucleotide with the method described below for the adherent cell line Was performed. First, a double-stranded oligonucleotide (50, 100 nM or 200 nM per 250 μl of the medium) (modified double-stranded oligonucleotide obtained in Example 5) was dissolved in RPMI 1640 medium (without antibiotics and FBS), Incubated for 5 minutes at room temperature. An equal volume of Lipofectamine 2000 reagent diluted 50-fold was added to the solution and then incubated at room temperature for 20 minutes. Of the obtained solution, 500 μl was collected and transferred to the 35 millidice prepared in (1) above for transfection. The cells in the 35 millidish were incubated 24 and 48 hours after transfection. Thereafter, no toxicity to the transfected cells was confirmed for any of the modified double-stranded oligonucleotides obtained in Example 6 or Example 7.

（３） ウエスタンブロット法によるＲＮａｓｅＬ発現のモニター
トランスフェクションから２４時間インキュベーション後および４８時間インキュベーション後に得られたＨＴ１０８０細胞をトリプシン処理し、冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。その後、得られた細胞ペレットを２倍量の低浸透圧緩衝液Ａ（０．５％（ｖ／ｖ）のノニデット（Nonidet）Ｐ−４０、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＣＨ₃ＣＯ₂Ｋ、１５ｍＭの（ＣＨ₃ＣＯ₂）₂Ｍｇ、１ｍＭのジチオトレイトール、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン）に懸濁させた。(3) Monitoring of RNase L expression by Western blotting HT1080 cells obtained after 24 hours and 48 hours after transfection were trypsinized and washed twice with cold PBS (−). The resulting cell pellet was then added to 2 volumes of hypotonic buffer A (0.5% (v / v) Nonidet P-40, 20 mM Hepes (pH 7.5), 10 mM CH _3. It was suspended in CO ₂ K, 15 mM (CH ₃ CO ₂ ) ₂ Mg, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 μg / ml aprotinin).

得られた細胞懸濁液を１０分間氷上でインキュベートした後、タイト・フィッティング・ガラス・ドウース・ホモジナイザー（Tight-fitting glass dounce homogenizer）を用いて氷上で３０回上下へストロークしてホモゲナイズした。得られたホモジナイズ液を、超遠心機（１００００×ｇ）を用いて４℃で１０分間遠心した。その後、遠心分離された上清液を回収し、その上清液に等量の２×サンプル緩衝液（０．１４ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、０．２％（ｖ／ｖ）のグリセロール、２．８％（ｖ／ｖ）のＳＤＳ、適量のブロモフェノール・ブルー）を加え、沸騰水中で５分間インキュベートした。インキュベートされた上清液を７．５％のポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ）を用いて２０ｍＡ、７０分間、電気泳動により分離し、その後、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社（Millipore）製）へタンパクを転写した。   The obtained cell suspension was incubated on ice for 10 minutes, and then homogenized by stroke up and down 30 times on ice using a Tight-fitting glass dounce homogenizer. The obtained homogenized solution was centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes using an ultracentrifuge (10000 × g). Thereafter, the centrifuged supernatant was collected, and an equal volume of 2 × sample buffer (0.14 M Tris-HCl pH 6.8, 0.2% (v / v) glycerol, 2.8% (v / v) SDS, appropriate amount of bromophenol blue) was added and incubated in boiling water for 5 minutes. The incubated supernatant was separated by electrophoresis using 7.5% polyacrylamide gel (ATTO) at 20 mA for 70 minutes, and then the protein was transferred to a PVDF membrane (Millipore).

前記ＰＶＤＦメンブレンを、５％の牛血清アルブミンで２５℃で１時間の間インキュベートした。その後、前記ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴ（２００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．６、１．３７Ｍの塩化ナトリウム、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で２回リンスした。そのＰＶＤＦメンブレンを、０．５μｇ／ｍｌの抗ＲＮａｓｅＬモノクローナル抗体で４℃、１６時間インキュベートした。その後、前記ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴで１５分間１回、次いで５分間３回、順次洗浄した。そのＰＶＤＦメンブレンを、次いでセイヨウワザビ・ペルオキシダーゼ（Horseradish peroxidase）で標識された抗マウスＩｇＧ（５００μｇ／ｍＬを、１０００００倍希釈した）で２５℃で１時間インキュベートした。その後、前記ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴで１５分間１回、次いで５分間３回、順次洗浄した。   The PVDF membrane was incubated with 5% bovine serum albumin for 1 hour at 25 ° C. Thereafter, the PVDF membrane was rinsed twice with TBST (200 mM Tris pH 7.6, 1.37 M sodium chloride, 0.1% Tween-20). The PVDF membrane was incubated with 0.5 μg / ml anti-RNase L monoclonal antibody at 4 ° C. for 16 hours. Thereafter, the PVDF membrane was sequentially washed with TBST once for 15 minutes and then 3 times for 5 minutes. The PVDF membrane was then incubated for 1 hour at 25 ° C. with anti-mouse IgG (500 μg / mL diluted 100,000 times) labeled with horseradish peroxidase. Thereafter, the PVDF membrane was sequentially washed with TBST once for 15 minutes and then 3 times for 5 minutes.

前記ＰＶＤＦメンブラン上のセイヨウワザビ・ペルオキシダーゼ標識の検出には、ＥＣＬプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット（prus western blotting detection kit）（アマシャム（Amersham）社製）を用いて行った。前記ＰＶＤＦメンブラン上のセイヨウワザビ・ペルオキシダーゼ標識の定量は、デンシトメーター（Kodak Digital Science DC290 Zoom Digital Camera）を用いて行った。二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理を行っていない細胞におけるＲＮａｓｅＬ強度を１として、二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理細胞のＲＮａｓｅＬ強度の相対比を求めた。なお、求めた数値はＧＡＰＤＨ強度を１とし標準化した。得られた結果を図１（ａ）に示す。   Detection of horseradish peroxidase labeling on the PVDF membrane was carried out using an ECL plus western blotting detection kit (Amersham). Quantification of horseradish peroxidase labeling on the PVDF membrane was performed using a densitometer (Kodak Digital Science DC290 Zoom Digital Camera). The relative ratio of the RNase L intensity of the cells treated with the double-stranded oligonucleotide was determined by setting the RNase L intensity in the cells not treated with the double-stranded oligonucleotide to 1. The obtained values were standardized with the GAPDH intensity set to 1. The obtained result is shown in FIG.

（４） 実施例５で得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの代わりに、実施例６および実施例７でそれぞれ得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを用いる以外は、（１）〜（３）と同様にして、修飾二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理細胞のＲＮａｓｅＬ強度の相対比を求めた。その結果は、図１（ｂ）および図１（ｃ）にそれぞれ示す。   (4) (1) to (3) except that the modified double-stranded oligonucleotides obtained in Example 6 and Example 7 are used in place of the modified double-stranded oligonucleotide obtained in Example 5. In the same manner as above, the relative ratio of the RNase L intensity of the cells treated with the modified double-stranded oligonucleotide was determined. The results are shown in FIG. 1 (b) and FIG. 1 (c), respectively.

前記図１（ａ）〜（ｃ）に示すように、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、非修飾二本鎖オリゴヌクレオチドと比較して、ＲＮａｓｅＬの発現を抑制する効果が著しく向上し、ＲＮＡｉ活性が向上していることが確認できた。   As shown in FIGS. 1 (a) to (c), the modified double-stranded oligonucleotide of the present invention has a significantly improved effect of suppressing the expression of RNase L compared to the unmodified double-stranded oligonucleotide, It was confirmed that the RNAi activity was improved.

３．細胞内でのＲＮａｓｅＬに対するＩＣ₅₀の測定
（１） ２．（２）において用いる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの濃度を、前記培地２５０μｌ当たり５０、１００ｎＭまたは２００ｎＭの代わりに１ｎＭ、５ｎＭまたは１０ｎＭを用いる以外は、前記２．（１）〜（４）と同様にして修飾二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理細胞のＲＮａｓｅＬ強度の相対比を求めた。3. Measurement of IC ₅₀ against RNase L in cells (1) The concentration of the modified double-stranded oligonucleotide used in (2) is 2 except that 1 nM, 5 nM or 10 nM is used instead of 50, 100 nM or 200 nM per 250 μl of the medium. In the same manner as in (1) to (4), the relative ratio of the RNase L intensity of the cells treated with the modified double-stranded oligonucleotide was determined.

（２） また、実施例５で得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの代わりに、実施例８および９でそれぞれ得られた修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを用いる以外は、４．（１）と同様にして、二本鎖オリゴヌクレオチドでの処理細胞のＲＮａｓｅＬ強度の相対比を求めた。   (2) Further, instead of the modified double-stranded oligonucleotide obtained in Example 5, the modified double-stranded oligonucleotide obtained in Examples 8 and 9 was used, respectively. In the same manner as in (1), the relative ratio of the RNase L intensity of the cells treated with the double-stranded oligonucleotide was determined.

（３）得られた相対比からＩＣ₅₀を求め、以下の表３に示す。(3) IC ₅₀ was determined from the obtained relative ratio and shown in Table 3 below.

前記表３に示すように、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドは、天然型（非修飾）二本鎖オリゴヌクレオチドと比較して、ＲＮａｓｅＬの発現を抑制する効果が著しく向上していることが確認できた。この著しい向上は、本発明の修飾二本鎖オリゴヌクレオチドが、細胞膜の透過性に優れ、ヌクレアーゼ耐性が向上したことから予想される以上の優れた効果である。また、アンチセンス鎖の３’末端が修飾されている実施例９について、センス鎖の３’末端が修飾されている実施例８よりもＲＮａｓｅＬの発現を抑制する効果が向上していることが確認できた。

As shown in Table 3, the modified double-stranded oligonucleotide of the present invention has a markedly improved effect of suppressing the expression of RNase L compared to the natural (unmodified) double-stranded oligonucleotide. It could be confirmed. This remarkable improvement is more excellent than expected because the modified double-stranded oligonucleotide of the present invention has excellent cell membrane permeability and improved nuclease resistance. Further, it was confirmed that Example 9 in which the 3 ′ end of the antisense strand was modified was more effective in suppressing the expression of RNase L than Example 8 in which the 3 ′ end of the sense strand was modified. did it.

４．ヌクレーゼ耐性
二本鎖修飾オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ耐性の評価
二本鎖修飾オリゴヌクレオチド、天然型の二本鎖オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ耐性を評価した。エキソヌクレアーゼとしては、ヘビ毒ホスホロジエステラーゼ（ＳＶＰ）を使用した。ＳＶＰは、リン酸ジエステル結合を選択的に切断しオリゴヌクレオチドを５’−モノリン酸ヌクレオチドに分解する。4). Nuclease resistance Evaluation of exonuclease resistance of double-stranded modified oligonucleotides The exonuclease resistance of double-stranded modified oligonucleotides and natural double-stranded oligonucleotides was evaluated. As the exonuclease, snake venom phosphorodiesterase (SVP) was used. SVP selectively cleaves phosphodiester bonds and breaks oligonucleotides into 5'-monophosphate nucleotides.

実施例１Ｐで製造した５’末端が³²Ｐでラベルされた修飾ＤＮＡセンス鎖（２０μＭ、４μｌ）と天然型ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号５）（Ａｍｂｉｏｎ製）（８ｐｍｍｏｌ）を、アニーリングバッファー（２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および５０ｍＭのＭｇＣｌ₂、６μｌ）および水（２６μｌ）の混合物中に溶解させた。その溶液を９５℃で５分間、次いで室温で１時間の間インキュベートして、３’末端にパルミチン酸がリンカーを介して結合された、５’末端が³²Ｐでラベルされた修飾ＤＮＡセンス鎖（配列番号２）および天然型ＤＮＡアンチセンス鎖（配列番号５）からなる修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを得た。得られた二本鎖の構造は、下記式に示すとおりである。A modified DNA sense strand (20 μM, 4 μl) labeled with ³² P at the 5 ′ end prepared in Example 1P and a natural DNA antisense strand (SEQ ID NO: 5) (Ambion) (8 pmmol) were added to an annealing buffer (250 mM). Of Tris-HCl (pH 8.0) and 50 mM MgCl ₂ (6 μl) and water (26 μl). The solution was incubated at 95 ° C. for 5 minutes and then at room temperature for 1 hour, and a modified DNA sense strand in which palmitic acid was attached to the 3 ′ end via a linker (labeled with ³² P at the 5 ′ end) ( A modified double-stranded oligonucleotide consisting of SEQ ID NO: 2) and a natural DNA antisense strand (SEQ ID NO: 5) was obtained. The structure of the obtained double strand is as shown in the following formula.

前記溶液に、ＳＶＰ（０．４μｇ／ｍｌ、１０μｌ）を添加した。ＳＶＰを添加後、０、１、３、５、１０、３０、６０分後に各エッペンドルフチューブに反応液（５μｌ）をサンプリングし、８Ｍ尿素溶液（５μｌ）と混合して反応を停止させた。なお、０分後のサンプルは、ＳＶＰ水溶液を加えていないものである。得られた各時間におけるサンプルを、９５℃で５分間アニーリングを行った後、２０％変性ＰＡＧＥ（７Ｍ尿素溶液）により解析した（電気泳動緩衝液：１×ＴＢＥ、〜３００Ｖ、２時間電気泳動）。得られた結果を以下の表４に示す。

To the solution, SVP (0.4 μg / ml, 10 μl) was added. After 0, 1, 3, 5, 10, 30, 60 minutes after adding SVP, the reaction solution (5 μl) was sampled in each Eppendorf tube and mixed with 8 M urea solution (5 μl) to stop the reaction. In addition, the sample after 0 minute is a thing which has not added SVP aqueous solution. The obtained sample at each time was annealed at 95 ° C. for 5 minutes and then analyzed by 20% denatured PAGE (7 M urea solution) (electrophoresis buffer: 1 × TBE, ˜300 V, 2 hours electrophoresis). . The results obtained are shown in Table 4 below.

前記表４から、修飾オリゴヌクレオチドは、天然型オリゴヌクレオチドと比較して、エキソヌクレアーゼ耐性が向上していることが確認された。

From Table 4 above, it was confirmed that the modified oligonucleotide had improved exonuclease resistance compared to the natural oligonucleotide.

本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、疾患治療剤として有用である。   The modified oligonucleotide of the present invention is useful, for example, as a disease therapeutic agent.

配列番号１ ＲＮａｓｅＬの標的配列
配列番号２ 配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列の修飾センス鎖
配列番号３ 配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列の修飾アンチセンス鎖
配列番号４ 配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖
配列番号５ 配列番号１の標的配列に対するｓｉＲＮＡ配列のアンチセンス鎖SEQ ID NO: 1 Target sequence of RNase L SEQ ID NO: 2 Modified sense strand of siRNA sequence against target sequence of SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3 Modified siRNA sequence against target sequence of SEQ ID NO: 1 Antisense strand SEQ ID NO: 4 against target sequence of SEQ ID NO: 1 Sense strand of siRNA sequence SEQ ID NO: 5 Antisense strand of siRNA sequence against target sequence of SEQ ID NO: 1

Claims (12)

オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含む修飾オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、下記式（ＩＩＩ）で表されるカルボン酸を結合させた修飾ヌクレオシドである修飾オリゴヌクレオチド。
Ｒ^A−ＣＯＯＨ （ＩＩＩ）
前記式中、Ｒ^Aは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味する。A modified oligonucleotide comprising a modified nucleoside as a constituent at the 3 ′ end of the oligonucleotide;
A modified oligonucleotide in which the modified nucleoside is a modified nucleoside in which a carboxylic acid represented by the following formula (III) is bound to the 3 ′ end of the nucleoside via a linker.
R ^A —COOH (III)
In the above formula, R ^A represents a saturated aliphatic hydrocarbon group, an unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an aryl group, or a heterocyclic group. 式（ＩＡ）で表される請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。

前記式中、
Ｒ’−ＯＨは、オリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｌは二価の基を意味し、
Ｒ^Aは、飽和脂肪族炭化水素基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、または複素環式基を意味する。The modified oligonucleotide according to claim 1, which is represented by the formula (IA).

In the above formula,
R′—OH means an oligonucleotide,
The hydroxyl group in R′—OH means the hydroxyl group at the 3 ′ end of the modified nucleoside contained as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide,
L means a divalent group,
R ^A means a saturated aliphatic hydrocarbon group, an unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an aryl group, or a heterocyclic group. 前記飽和脂肪族炭化水素基が、炭素数１〜２５を有する飽和脂肪族炭化水素基である請求項１または２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。   The modified oligonucleotide according to claim 1 or 2, wherein the saturated aliphatic hydrocarbon group is a saturated aliphatic hydrocarbon group having 1 to 25 carbon atoms. 前記不飽和脂肪族炭化水素基が、炭素数３〜２５を有する不飽和脂肪族炭化水素基である請求項１または２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。   The modified oligonucleotide according to claim 1 or 2, wherein the unsaturated aliphatic hydrocarbon group is an unsaturated aliphatic hydrocarbon group having 3 to 25 carbon atoms. 前記Ｒ^Aが、ＣＨ₃−（ＣＨ₂）₁₄−またはＣＨ₃−（ＣＨ₂）₇−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ₂）₇−である請求項１または２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。The modified oligonucleotide according to claim 1, wherein the ^RA is CH ₃ — (CH ₂ ) ₁₄ — or CH ₃ — (CH ₂ ) ₇ —CH═CH— (CH ₂ ) ₇ —. 前記二価の基が、下記式（ＩＶＡ）に示す二価の基である請求項２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ− （ＩＶＡ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ₂）_m−または（ＣＨ₂）_m−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ₂）_n−または−（ＣＨ₂）_n−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。The modified oligonucleotide according to claim 2, wherein the divalent group is a divalent group represented by the following formula (IVA).
-X-M-Y- (IVA)
In the above formula,
—X— is — (CH ₂ ) _m — or (CH ₂ ) _m —CH (CH ₂ OH) —,
-Y- is, - (CH _{2) n} - or _{- (CH 2) n -CH (} CH 2 OH) - and is,
-M- is -O-C (= O) NH-, -O-, -C (= O) -NH- or -NH-C (= O)-,
m and n are each independently an integer of 1 to 20. 前記二価の基が、下記式（ＩＶＡ−１）に示す二価の基である請求項２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
―ＣＨ₂―ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ₂）_n− （ＩＶＡ−１）
前記式中、ｎは１〜２０の整数である。The modified oligonucleotide according to claim 2, wherein the divalent group is a divalent group represented by the following formula (IVA-1).
—CH ₂ —CH (CH ₂ OH) —O—C (═O) NH— (CH ₂ ) _n — (IVA-1)
In said formula, n is an integer of 1-20. 二本鎖修飾オリゴヌクレオチドであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡの一部と同じ塩基配列をするセンス鎖と、前記センス鎖に対するアンチセンス鎖とを含み、
前記アンチセンス鎖および前記センス鎖のうち、少なくとも前記アンチセンス鎖が、オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド類似体であり、前記修飾ヌクレオシドが、ヌクレオシドの３’末端に、リンカーを介して、下記式（ＩＩ）で表されるステロイド骨格を有する化合物を結合させた修飾ヌクレオシドである二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
Ｒ^S−ＯＨ （ＩＩ）
前記式中、Ｒ^Sは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味する。A double-stranded modified oligonucleotide,
The modified oligonucleotide comprises a sense strand having the same base sequence as a part of the target mRNA, and an antisense strand to the sense strand;
Among the antisense strand and the sense strand, at least the antisense strand is an oligonucleotide analogue containing a modified nucleoside as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide, and the modified nucleoside is at the 3 ′ end of the nucleoside A double-stranded modified oligonucleotide which is a modified nucleoside to which a compound having a steroid skeleton represented by the following formula (II) is bound via a linker.
R ^S —OH (II)
In the above formula, R ^S means a steroid skeleton optionally having one or more substituents, wherein one or more single bonds in the skeleton are optionally replaced with double bonds. 前記オリゴヌクレオチド類似体が、式（ＩＳ）で表される請求項８に記載の二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。

前記式中、
Ｒ’−ＯＨはオリゴヌクレオチドを意味し、
Ｒ’−ＯＨ中の水酸基は、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に構成成分として含まれる修飾ヌクレオシドの３’末端の水酸基を意味し、
Ｌは二価の基を意味し、
Ｒ^Sは、１以上の置換基を任意に有し、骨格中の１以上の単結合が任意に二重結合に置き換えられているステロイド骨格を意味する。The double-stranded modified oligonucleotide according to claim 8, wherein the oligonucleotide analog is represented by the formula (IS).

In the above formula,
R′—OH means an oligonucleotide,
The hydroxyl group in R′—OH means the hydroxyl group at the 3 ′ end of the modified nucleoside contained as a constituent component at the 3 ′ end of the oligonucleotide,
L means a divalent group,
R ^S means a steroid skeleton optionally having one or more substituents, wherein one or more single bonds in the skeleton are optionally replaced with double bonds. 前記Ｒ^Sが、

からなる群から選択される請求項８に記載の二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。R ^S is

The double-stranded modified oligonucleotide according to claim 8, which is selected from the group consisting of: 前記二価の基が、下記式（ＩＶＳ）に示す二価の基である請求項９に記載の二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
−Ｘ−Ｍ−Ｙ− （ＩＶＳ）
前記式中、
−Ｘ−は、−（ＣＨ₂）_m−または（ＣＨ₂）_m−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｙ−は、−（ＣＨ₂）_n−または−（ＣＨ₂）_n−ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−であり、
−Ｍ−は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜２０の整数である。The double-stranded modified oligonucleotide according to claim 9, wherein the divalent group is a divalent group represented by the following formula (IVS).
-X-M-Y- (IVS)
In the above formula,
—X— is — (CH ₂ ) _m — or (CH ₂ ) _m —CH (CH ₂ OH) —,
-Y- is, - (CH _{2) n} - or _{- (CH 2) n -CH (} CH 2 OH) - and is,
-M- is -O-C (= O) NH-, -O-, -C (= O) -NH- or -NH-C (= O)-,
m and n are each independently an integer of 1 to 20. 前記二価の基が、下記式（ＩＶＳ−１）に示す二価の基である請求項９に記載の二本鎖修飾オリゴヌクレオチド。
―ＣＨ₂―ＣＨ（ＣＨ₂ＯＨ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ₂）_n− （ＩＶＳ−１）
前記式中、ｎは１〜２０の整数である。The double-stranded modified oligonucleotide according to claim 9, wherein the divalent group is a divalent group represented by the following formula (IVS-1).
—CH ₂ —CH (CH ₂ OH) —O—C (═O) NH— (CH ₂ ) _n — (IVS-1)
In said formula, n is an integer of 1-20.

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