JPWO2007072941A1 - Method for measuring glycated protein - Google Patents
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Abstract
二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定方法であって、水性媒体中、（ｉ）試料中の該二種以上の糖化タンパク質にタンパク質分解酵素を作用させ該二種以上の糖化タンパク質を糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに分解する工程、（ii）測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を除去する工程、（iii）測定すべき糖化タンパク質から生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を測定する工程を含む糖化タンパク質の測定方法。A method for measuring a glycated protein to be measured in a sample containing two or more kinds of glycated proteins, wherein (i) the two kinds of glycated proteins are caused to act on the two or more glycated proteins in a sample in an aqueous medium. A step of degrading the above glycated protein into a glycated amino acid and / or a glycated oligopeptide; (ii) reacting by reacting an enzyme acting on a glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from a glycated protein other than the glycated protein to be measured A step of removing a product generated in the solution, and a step of (iii) measuring a product generated in the reaction solution by allowing an enzyme acting on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from the glycated protein to be measured to act. A method for measuring a glycated protein.
Description
本発明は、糖化タンパク質の測定方法、測定用試薬及び測定用キットに関する。 The present invention relates to a method for measuring a glycated protein, a measuring reagent, and a measuring kit.
生体試料、食品等には、タンパク質のアミノ基がグルコース等の還元糖と非酵素的に結合して生成する多種類の糖化タンパク質が含有されている。特に血中のタンパク質であるヘモグロビン、アルブミン等は、血中のグルコース濃度に依存して、それぞれ糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等を生成し、また、各タンパク質は生体中で一定の半減期を持つことから、これら糖化タンパク質は、過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、糖尿病患者の血糖の指標として臨床の現場で日常的に測定されている。 Biological samples, foods, and the like contain many types of glycated proteins that are produced by non-enzymatic binding of protein amino groups to reducing sugars such as glucose. In particular, blood proteins such as hemoglobin and albumin produce glycated hemoglobin and glycated albumin depending on the blood glucose concentration, and each protein has a certain half-life in the body. These glycated proteins reflect the average blood glucose level over a certain period in the past, and are routinely measured in clinical settings as an index of blood glucose in diabetic patients.
糖化タンパク質の測定方法としては、ＨＰＬＣ法等のクロマトグラフィ法、電気泳動法、ラテックス免疫凝集法など抗体を利用する免疫測定方法、糖化タンパク質及び／又は糖化オリゴペプチド及び／又は糖化アミノ酸に作用する酵素を用いる酵素測定方法などが知られている。酵素測定方法は操作が比較的簡便であり、安価であるという利点を有する。
糖化タンパク質の酵素測定方法としては、例えば糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特許文献１）、フルクトシルペプチドオキシダーゼ（特許文献２〜７）、フルクトシルアミノ酸キナーゼ（特許文献８）を用いる方法等が知られている。As a method for measuring glycated protein, an immunoassay method using an antibody such as a chromatography method such as HPLC method, electrophoresis, latex immunoagglutination method, glycated protein and / or glycated oligopeptide and / or enzyme acting on glycated amino acid is used. The enzyme measurement method used is known. The enzyme measurement method has the advantage that the operation is relatively simple and inexpensive.
Examples of enzyme measurement methods for glycated proteins include fructosyl amino acid oxidase (Patent Document 1), fructosyl peptide oxidase (Patent Documents 2 to 7), and fructosyl amino acid kinase (Patent Document) that act on glycated amino acids and / or glycated oligopeptides. A method using 8) is known.
二種以上の糖化タンパク質を含む生体試料中の測定すべき構造の糖化タンパク質を分別測定する方法としては、測定すべき構造の糖化タンパク質を選択的に加水分解させることにより生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを測定する方法が知られている。例えばヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端が糖化されている糖化タンパク質、即ちヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと略記する）のみを選択的に測定するために、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを生じる作用よりもβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼを用いる方法（特許文献９）が知られている。 As a method for differentially measuring a glycated protein having a structure to be measured in a biological sample containing two or more kinds of glycated proteins, a glycated amino acid generated by selectively hydrolyzing the glycated protein having a structure to be measured and / or Methods for measuring glycated oligopeptides are known. For example, in order to selectively measure only a glycated protein in which the β-chain N-terminus of hemoglobin is glycated, namely hemoglobin A1c (hereinafter abbreviated as HbA1c), a glycated amino acid at the α-chain N-terminus and a glycated amino acid There is known a method using a protease having a greater effect of producing a glycated amino acid at the N-terminus of the β chain and / or a glycated oligopeptide than that of producing a glycated oligopeptide (Patent Document 9).
また、検体中に元々存在する、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化化合物である、例えば測定値の誤差のもととなる遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチド等の影響を除去するため、この遊離の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを除いた検体中に存在する糖化タンパク質を測定する方法(特許文献１０及び１１)が知られている。
また、試料中の糖化タンパク質に、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて、その酸化還元反応を測定することにより糖化タンパク質を測定する方法であって、前記試料中に糖化タンパク質とは別に存在する糖化アミノ酸を除去することを目的として、前記酸化還元反応に先立ち、前記糖化アミノ酸にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて分解し、テトラゾリウム化合物及びアジ化ナトリウムの存在下で、前記酸化還元反応を行う糖化タンパク質の測定方法（特許文献１２）が知られている。In addition, in order to remove the influence of a glycated compound other than the glycated protein to be measured, which is originally present in the specimen, for example, a free glycated amino acid and / or a glycated oligopeptide that causes an error in the measurement value, There are known methods (Patent Documents 10 and 11) for measuring glycated proteins present in a sample excluding free glycated amino acids and / or glycated oligopeptides.
Also, a method for measuring a glycated protein by allowing fructosyl amino acid oxidase to act on a glycated protein in a sample and measuring its oxidation-reduction reaction, wherein the glycated amino acid is present separately from the glycated protein in the sample In order to remove the glycated protein, the glycated protein undergoes the redox reaction in the presence of a tetrazolium compound and sodium azide in the presence of a tetrazolium compound and sodium azide prior to the redox reaction. A measurement method (Patent Document 12) is known.
また、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に、ｐＨ４．０〜７．０でフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素を特異的に作用させ、得られる生成物をｐＨ４．０〜７．０にて測定することを特徴とする、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定におけるフルクトシルリジン類の影響の軽減方法（特許文献１３）が知られている。さらに、カタラーゼを共存させたプロテア−ゼ含有試薬を用いた糖化タンパク質の定量方法（特許文献１４）が知られている。
本発明の目的は、二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質を正確に測定する方法、試薬及びキットを提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method, a reagent and a kit for accurately measuring a glycated protein to be measured in a sample containing two or more glycated proteins.
本発明は、二種以上の糖化タンパク質を含む試料にタンパク質分解酵素を作用させて、糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを生成させ、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質由来の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを予め除去した後、測定すべき糖化タンパク質由来の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを測定することを特徴とする、試料中の測定すべき糖化タンパク質を選択的に測定する方法を提供するものである。 In the present invention, a proteolytic enzyme is allowed to act on a sample containing two or more types of glycated proteins to generate glycated amino acids and / or glycated oligopeptides, and glycated amino acids derived from glycated proteins other than glycated proteins to be measured and / or Provided is a method for selectively measuring a glycated protein to be measured in a sample, characterized by measuring a glycated amino acid and / or a glycated oligopeptide derived from a glycated protein to be measured after removing the glycated oligopeptide in advance. To do.
本発明は、以下の［１］〜［２１］に関する。
［１］ 二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定方法であって、水性媒体中、（ｉ）試料中の該二種以上の糖化タンパク質にタンパク質分解酵素を作用させ該二種以上の糖化タンパク質を分解する工程、（ii）測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を除去する工程、（iii）測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を測定する工程を含む糖化タンパク質の測定方法。The present invention relates to the following [1] to [21].
[1] A method for measuring a glycated protein to be measured in a sample containing two or more glycated proteins, wherein (i) a proteolytic enzyme is allowed to act on the two or more glycated proteins in the sample in an aqueous medium. A step of decomposing the two or more glycated proteins, (ii) a product produced in a reaction solution by reacting a glycated amino acid and / or an enzyme acting on a glycated oligopeptide other than the glycated protein to be measured And (iii) a method for measuring a glycated protein comprising a step of measuring a product produced in a reaction solution by allowing an enzyme acting on a glycated amino acid and / or a glycated oligopeptide generated from the glycated protein to be measured to act. .
［２］ さらに、(iv)試料中の測定すべき糖化タンパク質を構成するタンパク質（以下、対象タンパク質という）の濃度を測定する工程、及び、(v)工程(iii)で測定した試料中の測定すべき糖化タンパク質の濃度と、工程(iv)で測定した試料中の対象タンパク質の濃度とから、試料中の測定すべき糖化タンパク質の対象タンパク質に対する割合を決定する工程を含む［１］記載の方法。 [2] Further, (iv) a step of measuring the concentration of a protein constituting the glycated protein to be measured in the sample (hereinafter referred to as target protein), and (v) the measurement in the sample measured in step (iii) Determining the ratio of the glycated protein to be measured in the sample to the target protein from the concentration of the glycated protein to be measured and the concentration of the target protein in the sample measured in step (iv) .
［３］ 工程（i）が、一種又は二種以上の界面活性剤の存在下に行われる［１］又は[２]記載の方法。
［４］ 工程（ii）が、糖化アミノ酸に作用するオキシダーゼを該生成した糖化アミノ酸に作用させ、生成する過酸化水素を除去する工程であり、かつ、工程（iii）が、糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼを該生成した糖化オリゴペプチドに作用させ、生成する過酸化水素を測定することにより行われる［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。[3] The method according to [1] or [2], wherein step (i) is performed in the presence of one or more surfactants.
[4] Step (ii) is a step in which an oxidase that acts on a glycated amino acid is allowed to act on the generated glycated amino acid to remove the generated hydrogen peroxide, and step (iii) acts on a glycated oligopeptide The method according to any one of [1] to [3], wherein the oxidase is reacted with the generated glycated oligopeptide and the generated hydrogen peroxide is measured.
［５］ 工程(ii)での生成物の除去が、カタラーゼを用いる過酸化水素の除去であり、工程(iii)での生成物の測定が、パーオキシダーゼと酸化発色型色原体とを用いる過酸化水素の測定である［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］ 測定すべき糖化タンパク質が、ヘモグロビンＡ１ｃである［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。[5] Removal of the product in step (ii) is removal of hydrogen peroxide using catalase, and measurement of the product in step (iii) uses peroxidase and an oxidative coloring chromogen. The method according to any one of [1] to [4], which is a measurement of hydrogen peroxide.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the glycated protein to be measured is hemoglobin A1c.
［７］ 対象タンパク質が、ヘモグロビンである［２］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ 二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定用試薬であって、タンパク質分解酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含むことを特徴とする試薬。[7] The method according to any one of [2] to [6], wherein the target protein is hemoglobin.
[8] A reagent for measuring a glycated protein to be measured in a sample containing two or more types of glycated proteins, which is a proteolytic enzyme, a glycated amino acid and / or a glycated oligo produced from a glycated protein other than the glycated protein to be measured Eliminates products that are produced by the reaction of enzymes acting on peptides, glycated amino acids and / or glycated oligopeptides generated from glycated proteins other than glycated proteins to be measured, and enzymes acting on glycated amino acids and / or glycated oligopeptides And a glycated amino acid produced from the glycated protein to be measured and / or an enzyme acting on the glycated oligopeptide, and a glycated amino acid and / or glycated oligopeptide produced from the glycated protein to be measured and the glycated amino acid and / or Or an enzyme that acts on a glycated oligopeptide A reagent comprising a reagent for measuring a product produced by the above reaction.
［９］ さらに、対象タンパク質を測定するための試薬を含む［８］記載の試薬。
［１０］ さらに、一種又は二種以上の界面活性剤を含む［８］又は［９］記載の試薬。
［１１］ 測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が、糖化アミノ酸に作用するオキシダーゼであり、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が、糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼである［８］〜［１０］のいずれかに記載の試薬。
［１２］ 測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬が、カタラーゼを含む試薬であり、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬が、パーオキシダーゼ及び酸化発色型色原体を含む試薬である［８］〜［１１］のいずれかに記載の試薬。[9] The reagent according to [8], further including a reagent for measuring the target protein.
[10] The reagent according to [8] or [9], further comprising one or more surfactants.
[11] The glycated amino acid produced from the glycated protein other than the glycated protein to be measured and / or the enzyme acting on the glycated oligopeptide is an oxidase acting on the glycated amino acid, and the glycated amino acid produced from the glycated protein to be measured and / or Alternatively, the reagent according to any one of [8] to [10], wherein the enzyme that acts on the glycated oligopeptide is an oxidase that acts on the glycated oligopeptide.
[12] For removing a product produced by a reaction between a glycated amino acid and / or a glycated oligopeptide generated from a glycated protein other than the glycated protein to be measured and an enzyme acting on the glycated amino acid and / or the glycated oligopeptide The reagent is a reagent containing catalase, and the product produced by the reaction between the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from the glycated protein to be measured and the enzyme acting on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide is measured. The reagent according to any one of [8] to [11], wherein the reagent for the preparation comprises a peroxidase and an oxidative coloring chromogen.
［１３］ 測定すべき糖化タンパク質が、ヘモグロビンＡ１ｃである［８］〜［１２］のいずれかに記載の試薬。
［１４］ 対象タンパク質が、ヘモグロビンである［９］〜［１３］のいずれかに記載の試薬。
［１５］ 二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定用キットであって、（Ａ）タンパク質分解酵素を含む第一試薬と、（Ｂ）測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬を含む第二試薬と、（Ｃ）測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、及び、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む第三試薬と、を含むことを特徴とするキット。[13] The reagent according to any one of [8] to [12], wherein the glycated protein to be measured is hemoglobin A1c.
[14] The reagent according to any one of [9] to [13], wherein the target protein is hemoglobin.
[15] A kit for measuring a glycated protein to be measured in a sample containing two or more glycated proteins, wherein (A) a first reagent containing a proteolytic enzyme and (B) other than the glycated protein to be measured Enzyme acting on glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from glycated protein, and glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from glycated protein other than glycated protein to be measured and the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide A second reagent containing a reagent for removing a product produced by a reaction with an enzyme acting on the enzyme, (C) an enzyme acting on a glycated amino acid and / or glycated oligopeptide produced from the glycated protein to be measured, and A glycated amino acid and / or a glycated oligopeptide generated from the glycated protein to be measured And a third reagent containing a reagent for measuring a product produced by a reaction with the enzyme acting on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide.
［１６］ さらに、対象タンパク質を測定するための第四試薬を含む［１５］記載のキット。
［１７］ タンパク質分解酵素を含む第一試薬が、一種又は二種以上の界面活性剤を含む試薬である［１５］又は［１６］記載のキット。
［１８］ 測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が、糖化アミノ酸に作用するオキシダーゼであり、測定すべき糖化タンパク質から生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が、糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼである［１５］〜［１７］のいずれかに記載のキット。[16] The kit according to [15], further comprising a fourth reagent for measuring the target protein.
[17] The kit according to [15] or [16], wherein the first reagent containing a proteolytic enzyme is a reagent containing one or more surfactants.
[18] The glycated amino acid produced from the glycated protein other than the glycated protein to be measured and / or the enzyme acting on the glycated oligopeptide is an oxidase acting on the glycated amino acid, and the glycated amino acid produced from the glycated protein to be measured and / or Alternatively, the kit according to any one of [15] to [17], wherein the enzyme that acts on the glycated oligopeptide is an oxidase that acts on the glycated oligopeptide.
［１９］ 測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬が、カタラーゼを含む試薬であり、かつ、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬が、パーオキシダーゼ及び酸化発色型色原体を含む試薬である［１５］〜［１８］のいずれかに記載のキット。 [19] For removing a product produced by a reaction between a glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from a glycated protein other than the glycated protein to be measured and an enzyme acting on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide The reagent is a reagent containing catalase, and a product produced by a reaction between a glycated amino acid and / or glycated oligopeptide produced from the glycated protein to be measured and an enzyme acting on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide The kit according to any one of [15] to [18], wherein the reagent for measuring is a reagent containing peroxidase and an oxidative coloring chromogen.
［２０］ 測定すべき糖化タンパク質が、ヘモグロビンＡ１ｃである［１５］〜［１９］のいずれかに記載のキット。
［２１］ 対象タンパク質が、ヘモグロビンである［１６］〜［２０］のいずれかに記載のキット。[20] The kit according to any one of [15] to [19], wherein the glycated protein to be measured is hemoglobin A1c.
[21] The kit according to any one of [16] to [20], wherein the target protein is hemoglobin.
本発明により、二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質を正確に測定する方法、試薬及びキットが提供される。 The present invention provides a method, a reagent, and a kit for accurately measuring a glycated protein to be measured in a sample containing two or more glycated proteins.
（試料及び測定対象物）
本発明の測定方法に用いられる試料としては、二種以上の糖化タンパク質を含む試料であれば特に制限はなく、例えば全血液、血漿、血清、血球、細胞試料、尿、髄液、汗、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料、及び食品等が挙げられる。試料としては、全血液、血漿、血清、血球等が好ましい。これらの試料は、溶血、分離、希釈、濃縮、精製等の前処理を施したものを用いてもよい。(Sample and measurement object)
The sample used in the measurement method of the present invention is not particularly limited as long as it contains two or more kinds of glycated proteins. For example, whole blood, plasma, serum, blood cells, cell samples, urine, spinal fluid, sweat, tears Examples thereof include biological samples such as liquid, saliva, skin, mucous membrane, hair, and food. As the sample, whole blood, plasma, serum, blood cells and the like are preferable. These samples may be subjected to pretreatment such as hemolysis, separation, dilution, concentration and purification.
本発明において、測定すべき糖化タンパク質を構成するタンパク質を対象タンパク質という。例えばＨｂＡ１ｃなどの糖化ヘモグロビンに対してヘモグロビンを、糖化アルブミンに対してアルブミンを対象タンパク質という。
本発明において種類の異なる糖化タンパク質としては、糖化タンパク質を構成するタンパク質、即ち対象タンパク質の種類が異なる場合だけでなく、糖化タンパク質を構成する対象タンパク質の種類が同一であっても、該糖化タンパク質がそれぞれ異なる構造として区別される場合も挙げられる。In the present invention, a protein constituting a glycated protein to be measured is referred to as a target protein. For example, hemoglobin is referred to as glycated hemoglobin such as HbA1c, and albumin is referred to as glycated albumin as glycated albumin.
In the present invention, the glycated proteins of different types include not only when the proteins constituting the glycated protein, that is, the types of the target proteins are different, but also when the types of the target proteins constituting the glycated proteins are the same. In some cases, the structures are distinguished from each other.
例えばヘモグロビンβ鎖のＮ末アミノ酸が糖化されたタンパク質、即ちＨｂＡ１ｃを特異的に測定する場合、対象タンパク質であるヘモグロビンは、α鎖とβ鎖とからなる複合体であり、α鎖が糖化されたタンパク質とβ鎖が糖化されたタンパク質の二種の糖化タンパク質を含みうるので、タンパク質としてヘモグロビンのみを含む試料も、本発明の二種以上の糖化タンパク質を含む試料に含まれる。 For example, when Nb-terminal amino acid of hemoglobin β chain is glycated, that is, when HbA1c is specifically measured, the target protein hemoglobin is a complex composed of α chain and β chain, and α chain is glycated Since two types of glycated protein, that is, a protein and a protein in which the β chain is glycated, can be included, a sample containing only hemoglobin as a protein is also included in the sample containing two or more types of glycated protein of the present invention.
さらには、同一種の対象タンパク質分子内の異なるアミノ酸位置に糖が結合している糖化タンパク質の混合物から、測定すべき特定のアミノ酸位置に糖が結合した糖化タンパク質を測定する場合、該糖化タンパク質の混合物も二種以上の糖化タンパク質に包含される。
例えばＨｂＡ１ｃを測定する場合、対象タンパク質であるヘモグロビンβ鎖は、ヘモグロビンのβ鎖のＮ末のバリン残基のα−アミノ基と、ヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列中のリジン残基のε−アミノ基とが糖化されているヘモグロビンβ鎖の二種類の糖化タンパク質を含みうるので、タンパク質としてヘモグロビンβ鎖のみを含む試料も、本発明の二種以上の糖化タンパク質を含む試料に含まれる。Furthermore, when measuring a glycated protein in which a saccharide is bound to a specific amino acid position to be measured from a mixture of glycated proteins in which the sugar is bound to different amino acid positions in the target protein molecule of the same species, Mixtures are also encompassed by two or more glycated proteins.
For example, when measuring HbA1c, the target protein hemoglobin β chain is composed of an α-amino group of the N-terminal valine residue of the β chain of hemoglobin and an ε-amino group of a lysine residue in the amino acid sequence of the hemoglobin β chain. Therefore, a sample containing only the hemoglobin β chain as a protein is also included in the sample containing two or more glycated proteins of the present invention.
測定すべき糖化タンパク質としては、糖化を受けるタンパク質であれば特に制限はないが、測定すべき糖化タンパク質濃度及び／又は測定すべきタンパク質濃度に対する対象タンパク質濃度の割合を測定する意味があるタンパク質であることが好ましい。
生体内に存在する糖化を受けるタンパク質としては、例えばマトリックスタンパク質、細胞内タンパク質、酵素、血漿タンパク質、ホルモン等が挙げられる。The glycated protein to be measured is not particularly limited as long as it is a protein that undergoes glycation, but is a protein that is meaningful for measuring the glycated protein concentration to be measured and / or the ratio of the target protein concentration to the protein concentration to be measured. It is preferable.
Examples of proteins that undergo saccharification in vivo include matrix proteins, intracellular proteins, enzymes, plasma proteins, hormones, and the like.
マトリックスタンパク質としては、例えばコラーゲン、ミエリン、フィブロネクチン、フィブリン等が挙げられる。膜タンパク質としては、例えば赤血球グルコース輸送タンパク質、赤血球スペクトクリン、赤血球膜タンパク質、内皮細胞膜タンパク質等が挙げられる。細胞内タンパク質としては、例えばヘモグロビンA、水晶体クリスタリン、チューブリン、カルモジュリン等が挙げられる。酵素としては、例えばカテプシンB、リゾチーム、膵リボアーゼ、銅／亜鉛スーパーオキサイドジムスターゼ、炭酸デヒドラターゼ、β−N−アセチルヘキソサミニダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルドースレダクターゼ、アルデヒドレダクターゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、Na＋／K＋−ATPアーゼ等が挙げられる。血漿タンパク質としては、例えばアルブミン、免疫グロブリン、アポA−I、アポA−II、アポB、アポC−I、アポE、ハプトグロビン、フェリチン、トランスフェリン、α１−アンチトリプシン、プラスミノーゲン、プラスミノーゲンアクチベータ、フィブリノーゲン、フィブリン、アンチトロンビンIII、β２−ミクログロビン、セルロプラスミン等が挙げられる。ホルモンとしては、例えば甲状腺ホルモン、インスリン等が挙げられる。Examples of matrix proteins include collagen, myelin, fibronectin, fibrin and the like. Examples of membrane proteins include erythrocyte glucose transport protein, erythrocyte spectrin, erythrocyte membrane protein, and endothelial cell membrane protein. Examples of intracellular proteins include hemoglobin A, lens crystallin, tubulin, and calmodulin. Examples of the enzyme include cathepsin B, lysozyme, pancreatic riboase, copper / zinc superoxide dismutase, carbonate dehydratase, β-N-acetylhexosaminidase, alcohol dehydrogenase, aldose reductase, aldehyde reductase, sorbitol dehydrogenase, Na + / K + -ATPase etc. are mentioned. Examples of plasma proteins include albumin, immunoglobulin, apo A-I, apo A-II, apo B, apo C-I, apo E, haptoglobin, ferritin, transferrin, α1-antitrypsin, plasminogen, plasminogen Activators, fibrinogen, fibrin, antithrombin III, β2-microglobin, ceruloplasmin and the like can be mentioned. Examples of hormones include thyroid hormone and insulin.
ヘモグロビンは、α 鎖及びβ鎖の２本のポリペプチドからなる分子量６４，５００の４量体である。ヘモグロビンのα鎖のＮ末端の３アミノ酸配列はバリン−ロイシン−セリンであり、β鎖のＮ末端の３アミノ酸配列はバリン−ヒスチジン−ロイシンである。ＨｂＡ１ｃは、β鎖のＮ末端バリンが糖化されたものと定義されている。また、ヘモグロビンは分子内に複数の糖化部位を有することが知られている（The Journal of Biological Chemistry (1980), 256, 3120-3127）。 Hemoglobin is a tetramer with a molecular weight of 64,500 consisting of two polypeptides, α chain and β chain. The N-terminal 3 amino acid sequence of the α chain of hemoglobin is valine-leucine-serine, and the N-terminal 3 amino acid sequence of the β chain is valine-histidine-leucine. HbA1c is defined as a glycated N-terminal valine of the β chain. Hemoglobin is known to have a plurality of glycation sites in the molecule (The Journal of Biological Chemistry (1980), 256, 3120-3127).
血清アルブミンは、分子量６９，０００で、分子内の４カ所のリジン残基が糖化されることが知られている（The Journal of Biological Chemistry (1986), 261, 13542-13545）。
本発明では、糖化ヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃ、糖化アルブミン等が測定すべき糖化タンパク質として好ましく例示される。Serum albumin has a molecular weight of 69,000 and is known to be glycated at four lysine residues in the molecule (The Journal of Biological Chemistry (1986), 261, 13542-13545).
In the present invention, glycated hemoglobin, HbA1c, glycated albumin and the like are preferably exemplified as glycated proteins to be measured.
（糖化アミノ酸及び糖化オリゴペプチド）
本発明において、「糖化アミノ酸」とは、グルコース等の還元糖とアミノ酸１分子が結合しているものであり、「糖化オリゴペプチド」とは、グルコース等の還元糖とオリゴペプチドが結合しているものである。本発明において糖化オリゴペプチドのペプチドとは、アミノ酸残基数が２〜１０の範囲のものをいい、２〜６の範囲のものが好ましい。(Glycated amino acids and glycated oligopeptides)
In the present invention, “glycated amino acid” means that a reducing sugar such as glucose and one molecule of amino acid are bonded, and “glycated oligopeptide” means that a reducing sugar such as glucose and an oligopeptide are bonded. Is. In the present invention, the peptide of a glycated oligopeptide means a peptide having 2 to 10 amino acid residues, and preferably 2 to 6 amino acids.
特に、本発明において、後述するオキシダーゼを用いる場合は、糖化オリゴペプチドのペプチドとは該酵素が作用する長さのペプチドとして定義され、通常アミノ酸残基数が２〜６の範囲のものをいう。オキシダーゼが作用しないアミノ酸残基が１１以上の長さのペプチド及びタンパク質が糖化されているものを併せて「糖化タンパク質」という。 In particular, in the present invention, when an oxidase described later is used, the glycated oligopeptide peptide is defined as a peptide having a length that the enzyme acts on, and usually refers to a peptide having 2 to 6 amino acid residues. A peptide having a length of 11 or more amino acid residues to which oxidase does not act and a protein glycated are collectively referred to as “glycated protein”.
（タンパク質分解酵素）
本発明に使用しうるタンパク質分解酵素は、試料中に含まれる測定すべき糖化タンパク質に作用するものであればいかなるものを用いてもよく、例えば動物、植物、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。(Proteolytic enzyme)
Any proteolytic enzyme that can be used in the present invention may be used as long as it acts on the glycated protein to be measured contained in the sample, and examples thereof include proteases derived from animals, plants, and microorganisms.
動物由来のプロテアーゼとしては、例えばエラスターゼ（Elastase）、トリプシン（Trypsin)、キモトリプシン（Chymotrypsin）、ペプシン（Pepsin）、牛膵臓プロテアーゼ、ブタ肝由来ロイシンアミノペプチダーゼ、カテプシン（Cathepsin）、カルパイン（Calpain)、プロテアーゼタイプ−I 、プロテアーゼタイプ−XX（以上、シグマ社製）、アミノペプチダーゼＭ（Aminopeptidase Ｍ）、カルボキシペプチダーゼＡ（Carboxypeptidase Ａ）（以上、ベーリンガー・マンハイム社製）、パンクレアチン（Pancreatin：和光純薬工業社製、シグマ社製）等が挙げられる。 Examples of animal-derived proteases include elastase, trypsin, chymotrypsin, pepsin, bovine pancreatic protease, porcine liver leucine aminopeptidase, cathepsin, calpain, protease Type-I, protease type-XX (above, Sigma), aminopeptidase M (Aminopeptidase M), carboxypeptidase A (Carboxypeptidase A) (above, Boehringer Mannheim), pancreatin (Pancreatin: Wako Pure Chemical Industries) And Sigma).
植物由来のプロテアーゼとしては、例えばカリクレイン（Kallikrein）、フィシン（Ficin)、パパイン（Papain）、キモパパイン（Chymopapain)、ブロメライン、カルボキシペプチダーゼＷ（以上、シグマ社製）、パパインW-40、ブロメラインF （以上、天野エンザイム社製）等が挙げられる。
微生物由来のプロテアーゼとしては、例えば下記(1) 〜(14)が挙げられる。Plant-derived proteases include, for example, kallikrein, ficin, papain, chymopapain, bromelain, carboxypeptidase W (above, Sigma), papain W-40, bromelain F (above And Amano Enzyme).
Examples of the microorganism-derived protease include the following (1) to (14).
(1) バチルス（Bacillus）属由来プロテアーゼ；ズブチリシン(Subtilisin)、プロテアーゼ−タイプ-VIII 、プロテアーゼ−タイプ-IX 、プロテアーゼ−タイプ-X、プロテアーゼ−タイプ-XV 、プロテアーゼ−タイプ-XXIV 、プロテアーゼ−タイプ-XXVII、プロテアーゼ−タイプ-XXXI、プロテイナーゼTypeVII、バチルスリケニフォルミス由来プロテアーゼ(以上、シグマ社製)、サーモリシン(以上、和光純薬社製)、オリエンターゼ-90N、オリエンターゼ-10NL、オリエンターゼ-22BF 、オリエンターゼ-Y、オリエンターゼ-5BL、ヌクレイシン（以上、エイチビィアイ株式会社製）、プロレザーFG-F、プロテアーゼNL「アマノ」、プロテアーゼS「アマノ」G、プロテアーゼN「アマノ」G（以上、天野エンザイム社製）、GODO-BNP、GODO-BAP、GODO高純度プロテアーゼ（以上、合同酒清社精製）、プロチン-AC10F、プロチン-NL10、プロチン-NC25、プロチン-NY10、プロチン-PC10F、プロチン−PS10、デスキン、デピレイス、ビオソーク、サモアーゼ-PC10F、サーモリシン（以上、大和化成社製）、トヨチームNEP、中性プロテアーゼ（以上、東洋紡績社製）、ニュートラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、デュラザイム、バイオフィードプロ、アルカラーゼ、NUE 、ピラーゼ、クリアーレンズプロ、エバラーゼ、ノボザイム-FM 、ボラン（以上、ノボノルディスクバイオインダストリー社製）、エンチロン-NBS、エンチロン-SA(以上、洛東化成工業社製)、ナガーゼ（Nagarse）、ビオプラーゼAPL-30、ビオプラーゼSP-4FG、ビオプラーゼXL-416F 、ビオプラーゼAL-15FG、ペクチナーゼXP-534 (以上、ナガセケムテックス社製)、アロアーゼAP-10 、プロテアーゼYB、（以上、ヤクルト薬品工業社製）、コロラーゼ-N、コロラーゼ-7089 、ベロンW （以上、樋口商会社製）、キラザイム P-1、ディスパーゼ(以上、ロシュ社製)、サチライシン（ベーリンガー・マンハイム社製）、プロテイナーゼＮ、プロテイナーゼBacterial Subtilisin（以上、フルカ社製）、プロナーゼＥ（科研製薬社製）等。(1) Bacillus (Bacillus) from genus protease; subtilisin (Subtilisin), protease - type -VIII, protease - type -IX, protease - type -X, protease - type -XV, protease - type -XXIV, protease - Type - XXVII, protease-type-XXXI, proteinase TypeVII, protease derived from Bacillus licheniformis (above, manufactured by Sigma), thermolysin (above, made by Wako Pure Chemical Industries), orientase-90N, orientase-10NL, orientase- 22BF, Orientase-Y, Orientase-5BL, Nucleicin (above, manufactured by HBI Corporation), Pro Leather FG-F, Protease NL “Amano”, Protease S “Amano” G, Protease N “Amano” G (above, Amano Enzyme), GODO-BNP, GODO-BAP, GODO high purity protease Purification), Protin-AC10F, Protin-NL10, Protin-NC25, Protin-NY10, Protin-PC10F, Protin-PS10, Deskin, Depilace, Biosoak, Samoaase-PC10F, Thermolysin (above, manufactured by Daiwa Kasei), Toyoteam NEP, Neutral protease (above, manufactured by Toyobo Co., Ltd.), Neutase, Esperase, Sabinase, Durazyme, Biofeed Pro, Alcalase, NUE, Pyrase, Clear Lens Pro, Everase, Novozyme-FM, Borane (above, Novo Nordisk Bioindustry ), Entilon-NBS, Entilon-SA (manufactured by Nitto Kasei Kogyo Co., Ltd.), Nagase, Biolase APL-30, Biolase SP-4FG, Biolase XL-416F, Biolase AL-15FG, Pectinase XP- 534 (above, manufactured by Nagase ChemteX), Aloase AP-10, Protease YB, ( Top, Yakult Yakuhin Kogyo Co., Ltd.), Corolase-N, Corolase-7089, Belon W (above, made by Higuchi Trading Co.), Kirazyme P-1, Dispase (above, made by Roche), Subtilisin (Boehringer Mannheim) Proteinase N, Proteinase Bacterial Subtilisin (Fluka), Pronase E (Kaken Pharmaceutical), etc.
(2) アスペルギルス（Aspergillus)由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプ-XIII 、-XIX、-XXIII（以上、シグマ社製）、スミチーム -MP、スミチーム-AP 、スミチーム-LP L、スミチーム-LP20、スミチーム-FP、エンザイム P-3（以上、新日本化学工業株式会社製）、オリエンターゼ-20A、オリエンターゼ-ONS、オリエンターゼ-ON5、テトラーゼS （以上、エイチビィアイ株式会社製）、ウマミザイムG、ニューラーゼA、ニューラーゼF3G、プロテアーゼA「アマノ」G、プロテアーゼK「アマノ」、プロテアーゼM「アマノ」G、プロテアーゼP「アマノ」3G（以上、天野エンザイム社製）、アルカリプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、モルシン 、AOプロテアーゼ、ペプチダーゼ（以上、キッコーマン社製）、プロチン-F、プロチン-FN 、プロチン-FA(以上、大和化成社製）、デナプシン2P、デナチーム-SA-7、デナチーム-AP 、デナザイムAP (以上、ナガセケムテックス社製）、プロテアーゼYP-SS 、パンチダーゼ-NP-2 、パンチダーゼ-P (以上、ヤクルト薬品工業社製）、サカナーゼ（科研製薬社製）、フレーバーザイム (ノボノルディスクバイオインダストリー社製）、ベロンPS（樋口商会社製）、プロテイナーゼ６（フルカ社製）、プロテアーゼA5（協和化成社製）等。(2) Aspergillus (Aspergillus) derived protease; protease type -XIII, -XIX, -XXIII (manufactured by Sigma), Sumizyme -MP, sumizyme -AP, sumizyme -LP L, Sumizyme -LP20, sumizyme -FP, Enzyme P-3 (above, Shin Nippon Chemical Industry Co., Ltd.), orientase-20A, orientase-ONS, orientase-ON5, tetolase S (above, made by HIBI), equinezyme G, newase A, newase F3G, Protease A “Amano” G, Protease K “Amano”, Protease M “Amano” G, Protease P “Amano” 3G (above, Amano Enzyme), Alkaline Protease, Acid Protease, Morsine, AO Protease, Peptidase ( Kikkoman), Protin-F, Protin-FN, Protin-FA (above, Daiwa Kasei), Pushin 2P, Denateam-SA-7, Denateam-AP, Denazyme AP (above, manufactured by Nagase ChemteX), Protease YP-SS, Pendidase-NP-2, Punchase-P (above, Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.), Sakanase (Manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.), flavorzyme (manufactured by Novo Nordisk Bio Industry Co., Ltd.), Belon PS (manufactured by Higuchi Trading Company), proteinase 6 (manufactured by Fluka Co., Ltd.), protease A5 (manufactured by Kyowa Kasei Co., Ltd.) and the like.
(3) リゾパス（Rhizopus）由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプXVIII(シグマ社製）、ペプチダーゼR 、ニューラーゼF（以上、天野エンザイム社製）、XP-415（ナガセケムテックス社製）等。
(4) ペニシリウム（Penicillium）由来プロテアーゼ；PD酵素（キッコーマン社製）、プロテアーゼＢ「アマノ」（天野エンザイム社製）、デオキシン１（ナガセケムテックス社製）等。(3) Rhizopus- derived protease; protease type XVIII (manufactured by Sigma), peptidase R, neurase F (above, Amano Enzyme), XP-415 (manufactured by Nagase ChemteX), etc.
(4) Penicillium (Penicillium) derived protease; PD enzyme (Kikkoman Corporation), (manufactured by Amano Enzyme Inc.) Protease B "Amano", Deokishin 1 (manufactured by Nagase ChemteX Corporation), and the like.
(5) ストレプトマイセス（Streptomyces）由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプXIV（別称Pronase） 、プロテアーゼ-XXI（以上、シグマ社製）、アクチナーゼ-AS 、アクチナーゼ-AF 、アクチナーゼ-E（以上、科研製薬社製）、Alkalofilic Proteinase （東洋紡社製）、プロナーゼE（ロシュ社製、カルビオケム−ノバイオケム社製、シグマ社製）、プロナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）等。(5) Streptomyces (Streptomyces) derived protease; Protease Type XIV (aka Pronase), protease -XXI (manufactured by Sigma), Actinase -AS, actinase -AF, actinase -E (manufactured by Kaken Pharmaceutical Co.) Alkalofilic Proteinase (Toyobo), Pronase E (Roche, Calbiochem-Nobiochem, Sigma), Pronase (Boehringer Mannheim), etc.
(6) スタフィロコッカス（Staphylococcus）由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプXVII（シグマ社製）、エンドプロテイナーゼGlu-C（ベーリンガー・マンハイム社製）、V8プロテアーゼ（タカラ社製、和光純薬社製）等。
(7) クロストリジウム（Clostridium)由来プロテアーゼ；クロストリパイン、ノンスペシフィックニュートラルプロテアーゼ、コラゲナーゼType1A(以上、シグマ社製）等。(6) Protease derived from Staphylococcus ; protease type XVII (manufactured by Sigma), endoproteinase Glu-C (manufactured by Boehringer Mannheim), V8 protease (manufactured by Takara, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and the like.
(7) Clostridium (Clostridium) derived protease; clostripain, non-specific neutral protease, collagenase Type1A (manufactured by Sigma) or the like.
(8) リソバクター（Lysobacter）由来プロテアーゼ；エンドプロテイナーゼLys-C （シグマ社製）等。
(9) グリフォラ（Grifola)由来プロテアーゼ；メタロエンドペプチダーゼ（Metalloendopeptidase ；シグマ社製）等。
(10)酵母（Yeast)由来プロテアーゼ；プロテイナーゼA （Proteinase A ；シグマ社製）、カルボキシペプチダーゼY （Carboxypeptidase Y；ベーリンガー・マンハイム社製）等。(8) Lysobacter- derived protease; endoproteinase Lys-C (manufactured by Sigma), etc.
(9) Grifola- derived protease; metalloendopeptidase (manufactured by Sigma), etc.
(10) Yeast-derived protease; proteinase A (Proteinase A; manufactured by Sigma), carboxypeptidase Y (Carboxypeptidase Y; manufactured by Boehringer Mannheim), etc.
(11)トリチラチウム（Tritirachium）由来プロテアーゼ；プロテイナーゼK (Proteinase K；シグマ社製、ロシュ社製、和光純薬社製）等。
(12)サーマス（Thermus)由来プロテアーゼ；アミノペプチダーゼＴ(AminopeptidaseT ；ベーリンガー・マンハイム社製）等。
(13)シュードモナス（Pseudomonas)由来プロテアーゼ；エンドプロテイナーゼAsp-N (Endoproteinase Asp-N；和光純薬社製)等。(11) Torichirachiumu (Tritirachium) derived protease; proteinase K (Proteinase K; manufactured by Sigma, Roche, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and the like.
(12) Thermus (Thermus) derived protease; aminopeptidase T (AminopeptidaseT; Boehringer Mannheim) or the like.
(13) Pseudomonas (Pseudomonas) from protease; endoproteinase Asp-N (Endoproteinase Asp-N ; manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and the like.
(14)アクロモバクター（Achromobacter）由来プロテアーゼ；リジルエンドペプチダーゼ（Lysylendopeptidase）、アクロモペプチダーゼ（以上、和光純薬社製）、AP-1(タカラ社製)等。(14) Achromobacter- derived protease; lysylendopeptidase, achromopeptidase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), AP-1 (manufactured by Takara), etc.
本発明の測定方法においては、対象タンパク質がヘモグロビンである場合には、バチルス属、アスペルギルス属、ストレプトマイセス属、トリチラチウム属由来のプロテアーゼがヒトヘモグロビンに対する作用が大きいので好ましく、特にバチルス属由来のプロテアーゼが好ましい。また対象タンパク質がアルブミンである場合にはバチルス属及びストレプトマイセス属の微生物由来プロテアーゼがヒトアルブミンに対する作用が大きいので好ましい。 In the measurement method of the present invention, when the target protein is hemoglobin, a protease derived from the genus Bacillus, Aspergillus, Streptomyces, or Trityratium is preferred because it has a large effect on human hemoglobin, and in particular, a protease derived from the genus Bacillus. Is preferred. When the target protein is albumin, a microorganism-derived protease belonging to the genus Bacillus and Streptomyces is preferable because it has a large effect on human albumin.
タンパク分解酵素の濃度としては、反応液中で０．０１〜１００，０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．１〜１０，０００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。また、本発明においては、２種類以上の酵素を組み合わせて用いることもできる。
また本発明に使用するタンパク質分解酵素は着色していないものが好ましく、例えば該タンパク質分解酵素の１，０００Ｕ／ｍＬの水溶液において波長３００〜８００ｎｍの吸光度が１００ｍＡｂｓ以下であるものが好ましく０〜１０ｍＡｂｓがより好ましい。タンパク質分解酵素は各種クロマトグラム、塩析、透析、活性炭処理等で精製し上述の吸光度を減少させたものを使用するのが好ましい。The concentration of the proteolytic enzyme is preferably 0.01 to 100,000 U / mL, more preferably 0.1 to 10,000 U / mL in the reaction solution. In the present invention, two or more kinds of enzymes can be used in combination.
In addition, the proteolytic enzyme used in the present invention is preferably not colored, and for example, in a 1,000 U / mL aqueous solution of the proteolytic enzyme, the absorbance at a wavelength of 300 to 800 nm is preferably 100 mAbs or less, and preferably 0 to 10 mAbs. More preferred. It is preferable to use a proteolytic enzyme that has been purified by various chromatograms, salting out, dialysis, activated carbon treatment or the like to reduce the absorbance described above.
（糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素）
本発明に使用しうる糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素としては、前記タンパク質分解酵素の作用により、試料中の糖化タンパク質から生成される糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するものであれば如何なるものを用いてもよい。(Enzyme acting on glycated amino acid and / or glycated oligopeptide)
The enzyme that acts on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide that can be used in the present invention acts on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from the glycated protein in the sample by the action of the proteolytic enzyme. Any one can be used.
糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素としては、例えば糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼ、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ等があげられる。
糖化ヘモグロビンを測定対象とする場合には、α-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が好ましい。糖化アルブミンを測定対象とする場合には、ε-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素が好ましい。Examples of the enzyme that acts on glycated amino acids and / or glycated oligopeptides include oxidase, kinase, dehydrogenase, etc. that act on glycated amino acids and / or glycated oligopeptides.
When glycated hemoglobin is the measurement target, an enzyme that acts on a glycated amino acid and / or glycated oligopeptide in which the α-amino group is glycated is preferable. When glycated albumin is a measurement target, an enzyme that acts on a glycated amino acid and / or a glycated oligopeptide in which the ε-amino group is glycated is preferable.
(オキシダーゼ)
本発明におけるオキシダーゼとしては、糖化タンパク質にタンパク質分解酵素を作用させて生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと酸素とに作用し、過酸化水素及びアミノ酸若しくはオリゴペプチド等が生成するオキシダーゼであれば特に制限はないが、例えばフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、ケトアミンオキシダーゼ等が挙げられる。(Oxidase)
The oxidase in the present invention is an oxidase that acts on a glycated amino acid and / or glycated oligopeptide and oxygen produced by allowing a proteolytic enzyme to act on a glycated protein to produce hydrogen peroxide, an amino acid, an oligopeptide, or the like. Although there is no restriction | limiting in particular, For example, fructosyl amino acid oxidase, fructosyl peptide oxidase, ketoamine oxidase etc. are mentioned.
該オキシダーゼとしては、ε-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼ、α-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼなどが挙げられる。
ε-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼとしては、例えばギベレラ（Gibberella）属（例えばIFO-6356等）又はアスペルギルス（Aspergillus)属（例えばIFO-6365、-4242 、-5710 、FERM BP-5684等）由来フルクトサミンオキシダーゼ、カンジダ（Candida)属由来フルクトシルアミンデグリカーゼ、ペニシリウム(Penicillium)属（例えばIFO-4651、-6581、-7905、-5748、-7994、-4897、-5337、FERM BP-5475等）由来、トリコスポロン(Trichosporon)属（例えばFERM P-17134）由来、フサリウム（Fusarium）属（例えばIFO-4468、-4471、-6384、-7706、-9964、-9971、-31180、-9972、FERM BP-5010等）由来フルクトシルアミノ酸分解酵素、アクレモニウム（Acremonium）属由来又はデバリオマイゼス（Debaryomyces）属由来ケトアミンオキシダーゼ等が挙げられる。Examples of the oxidase include oxidases that act on glycated amino acids and / or glycated oligopeptides with ε-amino groups glycated, oxidases that act on glycated amino acids and / or glycated oligopeptides with glycated α-amino groups, and the like. .
Examples of oxidases that act on glycated amino acids and / or glycated oligopeptides in which the ε-amino group is glycated include, for example, the genus Gibberella (for example, IFO-6356) or the genus Aspergillus (for example, IFO-6365, -4242). , -5710, FERM BP-5684, etc.) from fructosamine oxidase, Candida (Candida) from genus fructosylamine de glycidyl gauze, Penicillium (Penicillium) genus (e.g. IFO-4651, -6581, -7905, -5748, -7994, -4897, -5337, FERM BP-5475, etc.) derived, Trichosporon (Trichosporon) genus (e.g. FERM P-17134) derived from Fusarium (Fusarium) genus (e.g. IFO-4468, -4471, -6384, -7706, -9964 , -9971, -31180, -9972, and FERM BP-5010, etc.) from fructosyl amino acid degrading enzymes, Acremonium (Acremonium) derived from the genus or Debariomaizesu (Debaryomyces) derived from genus ketoamine oxidase is
α-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼとしては、例えばコリネバクテリウム（Corynebacterium）属由来、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属(例えばNBRC-7590等)由来、コニオケチジウム（Coniochaetidium）属（例えば ATCC36547等）由来、アルスリニウム属由来、ピレノケータ属由来、レプトスフェリア（例えばNBRC7480等）属由来、オフィオボラス属由来、カーブラリア属由来、フォーマ属由来のフルクトシルアミンオキシダーゼ（特開2004-275013）、ユウペニシリウム属（例えばATCC 18547等）由来、コニオカエタ属（例えばNISL 9330等）由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（特開2003−235585）等が挙げられる。なお、α-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼとしては、前述のε-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼも挙げられる。Examples of oxidases that act on glycated amino acids and / or glycated oligopeptides in which the α-amino group is glycated include, for example, the genus Corynebacterium, the genus Neocosmospora (for example, NBRC-7590, etc.), the conioketidium Fructosylamine oxidase derived from the genus ( Coniochaetidium ) (for example, ATCC36547), derived from the genus Arsurinium, derived from the genus Pyrenocateta, derived from the genus Leptosperia (for example, NBRC7480), derived from the genus Ophioboras, derived from the genus Carbularia, 275013), fructosyl peptide oxidase (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-235585) derived from the genus Eupenicillium (eg, ATCC 18547), and the genus Coniocaeta (eg, NISL 9330). Examples of the oxidase that acts on a glycated amino acid and / or glycated oligopeptide in which the α-amino group is glycated include oxidases that act on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide in which the ε-amino group is glycated. .
この他、例えばフルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-CE、フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-EE、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOX-TE、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOD-E（以上、キッコーマン社製）、ショウガ科に属する植物由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（WO04/038034）、バラ科、ブドウ科又はセリ科に属する植物由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（WO04/038033）等が挙げられる。 In addition, for example, fructosyl peptide oxidase FPOX-CE, fructosyl peptide oxidase FPOX-EE, fructosyl amino acid oxidase FAOX-TE, fructosyl amino acid oxidase FAOD-E (manufactured by Kikkoman), plant-derived fruct belonging to the ginger family Examples thereof include tosyl peptide oxidase (WO04 / 038034), plant-derived fructosyl peptide oxidase (WO04 / 038033) belonging to the family Rosaceae, Grapeaceae or Apiaceae.
ε-アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに特異的に作用し、実質的にαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸には作用しないオキシダーゼとしては遺伝子操作フルクトサミンオキシダーゼ（FODVII；旭化成社製；WO02/061119）が挙げられる。
さらに、α−アミノ基及びε−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用し、タンパク質分解酵素と共存させた状態でも充分な活性を有する酵素の例としては、遺伝子組み替え型フルクトサミンオキシダーゼ（FODII；旭化成社製）が挙げられる。As an oxidase that specifically acts on glycated amino acids and / or glycated oligopeptides whose ε-amino group is glycated but does not substantially act on glycated amino acids whose α amino group is glycated, genetically engineered fructosamine oxidase (FODVII; Asahi Kasei) (WO02 / 061119).
Furthermore, as an example of an enzyme that acts on a glycated amino acid and / or glycated oligopeptide in which α-amino group and ε-amino group are glycated and coexist with a proteolytic enzyme, Examples include fructosamine oxidase (FODII; manufactured by Asahi Kasei Corporation).
該酵素の濃度としては、反応液中で０．０１〜１，０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。また、本発明においては、２種類以上の酵素を組み合わせて用いることもできる。 As a density | concentration of this enzyme, it is preferable that it is a density | concentration of 0.01-1,000 U / mL in a reaction liquid, and it is more preferable that it is 0.1-100 U / mL. In the present invention, two or more kinds of enzymes can be used in combination.
（キナーゼ）
本発明に使用しうる糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するキナーゼとしては、ATPの存在下、糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用し、ADPとリン酸化された糖化アミノ酸及び／又はリン酸化された糖化オリゴペプチドとを生成するキナーゼであれば特に制限はないが、例えばε−フルクトシルリジンに作用する酵素としては、フルクトシルリジン−６−キナーゼ（The Journal of Biological Chemistry (2002)，277，42523-42529）等が挙げられる。また、α−フルクトシルバリン及びα-フルクトシルバリルロイシンに作用するキナーゼとしてはアブラナ科植物由来フルクシルアミノ酸キナーゼ（特開2005-58157）等が挙げられる。(Kinase)
As the kinase that acts on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide that can be used in the present invention, the glycated amino acid and / or phosphorylated on ADP and phosphorylated on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide in the presence of ATP. The kinase is not particularly limited as long as it is a kinase that generates an oxidized glycated oligopeptide. For example, as an enzyme that acts on ε-fructosyl lysine, fructosyl lysine-6-kinase (The Journal of Biological Chemistry (2002), 277, 42523-42529) and the like. Examples of kinases that act on α-fructosyl valine and α-fructosyl valyl leucine include cruciferous plant-derived frucsyl amino acid kinase (Japanese Patent Laid-Open No. 2005-58157).
該酵素の濃度としては、反応液中で０．００１〜１，０００Ｕ／ｍＬ以上の濃度であることが好ましく、１〜１００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。また、本発明においては、２種類以上の酵素を組み合わせて用いることもできる。 As a density | concentration of this enzyme, it is preferable that it is a density | concentration of 0.001-1,000 U / mL or more in a reaction liquid, and it is more preferable that it is 1-100 U / mL. In the present invention, two or more kinds of enzymes can be used in combination.
（界面活性剤）
本発明においてタンパク質分解酵素を作用させる際に界面活性剤を共存させるのが好ましい。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤を共存させることが好ましく、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が特に好ましい。(Surfactant)
In the present invention, it is preferable that a surfactant coexists when a proteolytic enzyme is allowed to act. As the surfactant, for example, a nonionic surfactant, a cationic surfactant, an anionic surfactant, and an amphoteric surfactant are preferably allowed to coexist. Activators and amphoteric surfactants are particularly preferred.
非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アルキレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。 Nonionic surfactants include, for example, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, polyoxyethylene polycyclic phenyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene condensate, polyoxyethylene alkylamine, alkylenediamine-poly Examples thereof include oxyethylene polyoxypropylene condensate, polyoxyethylene fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, fatty acid alkanolamide, and sucrose fatty acid ester.
ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルエーテル等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等が挙げられる。Examples of the polyoxyethylene alkyl ether include polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene dodecyl ether and the like.
Examples of the polyoxyethylene alkyl phenyl ether include polyoxyethylene octyl phenyl ether and polyoxyethylene nonyl phenyl ether.
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンジベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（ジスチレン化）フェニルエーテル、ポリオキシエチレン（トリスチレン化）フェニルエーテル等が挙げられる。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物としては、例えばポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンランダム重合体等が挙げられる。Examples of the polyoxyethylene polycyclic phenyl ether include polyoxyethylene dibenzyl phenyl ether, polyoxyethylene tribenzyl phenyl ether, polyoxyethylene (distyrenated) phenyl ether, polyoxyethylene (tristyrenated) phenyl ether, and the like. It is done.
Examples of the polyoxyethylene polyoxypropylene condensate include a polyoxyethylene polyoxypropylene copolymer and a polyoxyethylene polyoxypropylene random polymer.
ポリオキシエチレンアルキルアミンとしては、例えばポリオキシエチレンドデシルアミン等が挙げられる。
アルキレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物としては、例えばエチレンジアミンテトラポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン・ブロックポリマー等が挙げられる。Examples of the polyoxyethylene alkylamine include polyoxyethylene dodecylamine.
Examples of the alkylenediamine-polyoxyethylene polyoxypropylene condensate include ethylenediaminetetrapolyoxyethylene / polyoxypropylene / block polymer.
ポリオキシエチレン脂肪酸エステルとしては、例えばポリオキシエチレングリコールモノラウレート、ポリオキシエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレングリコールジステアレート、ポリオキシエチレングリコールモノオレエート等が挙げられる。
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等が挙げられる。Examples of the polyoxyethylene fatty acid ester include polyoxyethylene glycol monolaurate, polyoxyethylene glycol monostearate, polyoxyethylene glycol distearate, polyoxyethylene glycol monooleate and the like.
Examples of the polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester include polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan tristearate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, Examples include polyoxyethylene sorbitan trioleate.
ソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えばソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンジステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキオレエート等が挙げられる。
ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルとしては、例えばテトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール等が挙げられる。Examples of sorbitan fatty acid esters include sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate, sorbitan monostearate, sorbitan distearate, sorbitan tristearate, sorbitan monooleate, sorbitan trioleate, sorbitan sesquioleate and the like.
Examples of the polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester include polyoxyethylene sorbitol tetraoleate.
ポリオキシエチレンアルキルアミンとしては、例えばポリオキシエチレンドデシルアミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン等が挙げられる。グリセリン脂肪酸エステルとしては、例えばステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセライド等が挙げられる。
脂肪酸アルカノールアミドとしては、例えばラウリン酸ジエタノールアミド等が挙げられる。Examples of the polyoxyethylene alkylamine include polyoxyethylene dodecylamine and polyoxyethylene stearylamine. Examples of the glycerin fatty acid ester include stearic acid monoglyceride and oleic acid monoglyceride.
Examples of fatty acid alkanolamides include lauric acid diethanolamide.
ショ糖脂肪酸エステルとしては、例えばショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル等が挙げられる。
これら非イオン性界面活性剤の中でも、特にポリオキシエチレン鎖を有するものが好ましく、例えばポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンモノラウリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンドデシルアミン等が挙げられる。Examples of the sucrose fatty acid ester include sucrose palmitate ester and sucrose stearate ester.
Among these nonionic surfactants, those having a polyoxyethylene chain are particularly preferred. For example, polyoxyethylene octyl phenyl ether, polyoxyethylene monolaurate sorbitan, polyoxyethylene octyl phenyl ether, polyoxyethylene polycyclic phenyl ether , Polyoxyethylene octyl phenyl ether, polyoxyethylene dodecylamine and the like.
陽イオン性界面活性剤としては、例えば脂肪族アミン塩、脂肪族４級アンモニウム塩等が挙げられる。
脂肪族アミン塩としては、例えばモノドデシルアミン、モノステアリルアミン、ジステアリルアミン、トリステアリルアミン等の高級脂肪族アミン等と、塩酸、硫酸等の無機酸或いは酢酸、乳酸、クエン酸等の低級カルボン酸等との塩等が挙げられる。具体的には、例えばドデシルアミン酢酸塩、ステアリルアミン酢酸塩等が挙げられる。Examples of the cationic surfactant include aliphatic amine salts and aliphatic quaternary ammonium salts.
Examples of the aliphatic amine salt include higher aliphatic amines such as monododecylamine, monostearylamine, distearylamine, and tristearylamine, and inorganic acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid, or lower carboxylic acids such as acetic acid, lactic acid, and citric acid. And the like. Specific examples include dodecylamine acetate and stearylamine acetate.
脂肪族４級アンモニウム塩としては、例えばドデシルトリメチルアンモニウム、ステアリルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、オクタデシルトリメチルアンモニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、アルキルジメチルベンジルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウム、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム等の高級脂肪族アンモニウム等と塩素、臭素等との塩等が挙げられる。具体的には、例えばドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロライド等が挙げられる。 Examples of aliphatic quaternary ammonium salts include higher fats such as dodecyltrimethylammonium, stearyltrimethylammonium, cetyltrimethylammonium, octadecyltrimethylammonium, hexadecyltrimethylammonium, alkyldimethylbenzylammonium, didecyldimethylammonium, and benzyldimethyltetradecylammonium. And salts of group ammonium and the like with chlorine, bromine and the like. Specifically, for example, dodecyltrimethylammonium chloride, stearyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium chloride, octadecyltrimethylammonium chloride, hexadecyltrimethylammonium chloride, alkyldimethylbenzylammonium chloride, didecyldimethylammonium chloride, benzyldimethyltetradecylammonium chloride Etc.
陰イオン性界面活性剤としては、例えばカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩、コール酸塩等が挙げられる。
カルボン酸塩としては、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等との塩等が挙げられ。具体的には、例えばオレイン酸カリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム、ポリオキシエチレンドデシルエーテル酢酸ナトリウム等が挙げられる。Examples of the anionic surfactant include carboxylate, sulfonate, sulfate ester salt, phosphate ester salt, cholate salt and the like.
Examples of the carboxylate include salts with higher fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, and oleic acid, and alkali metals such as sodium and potassium. Specific examples include potassium oleate, sodium lauroyl sarcosine, sodium N-myristoyl-N-methyl-β-alanine, sodium polyoxyethylene dodecyl ether acetate, and the like.
スルホン酸塩としては、例えばドデシルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸、ジプロピルナフタレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸等のナフタレンスルホン酸、ジオクチルスルホコハク酸等のスルホコハク酸等と、ナトリウム等との塩等が挙げられる。具体的には、例えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等が挙げられる。 Examples of the sulfonate include alkylbenzene sulfonic acid such as dodecylbenzene sulfonic acid, naphthalene sulfonic acid such as dipropylnaphthalene sulfonic acid and dibutyl naphthalene sulfonic acid, sulfosuccinic acid such as dioctyl sulfosuccinic acid, and a salt with sodium. Can be mentioned. Specific examples include sodium dodecylbenzenesulfonate, sodium dipropylnaphthalenesulfonate, sodium dibutylnaphthalenesulfonate, sodium dioctylsulfosuccinate and the like.
硫酸エステル塩としては、例えば高級アルコール硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。高級アルコール硫酸エステル塩の具体例としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸アンモニウム等が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩の具体例としては、例えばポリオキシエチレンドデシルエーテル硫酸ナトリウム等が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩の具体例としては、例えばポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸ナトリウム等が挙げられる。 Examples of sulfate salts include higher alcohol sulfate salts, polyoxyethylene alkyl ether sulfate salts, polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate salts, and the like. Examples of the salt include sodium salt and ammonium salt. Specific examples of the higher alcohol sulfate ester salt include sodium dodecyl sulfate and ammonium dodecyl sulfate. Specific examples of the polyoxyethylene alkyl ether sulfate ester salt include polyoxyethylene dodecyl ether sodium sulfate and the like. Specific examples of the cyclic phenyl ether sulfate ester salt include sodium polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate.
リン酸エステル塩としては、例えばモノアルキルリン酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル塩等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。モノアルキルリン酸エステル塩の具体例としては、例えばモノステアリルリン酸ナトリウム、モノドデシルリン酸ナトリウム等が、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル塩の具体例としては、例えばポリオキシエチレンドデシルエーテルリン酸カリウム等が挙げられる。 Examples of phosphoric acid ester salts include monoalkyl phosphoric acid ester salts and polyoxyethylene alkyl ether phosphoric acid ester salts. Examples of the salt include sodium salt and potassium salt. Specific examples of monoalkyl phosphate salts include, for example, sodium monostearyl phosphate, sodium monododecyl phosphate, and the like. Specific examples of polyoxyethylene alkyl ether phosphate salts include, for example, polyoxyethylene dodecyl ether phosphate. Potassium etc. are mentioned.
コール酸塩としては、例えばコール酸ナトリウム等が挙げられる。
陰イオン性界面活性剤の中でも、ポリオキシエチレン鎖を有するものが特に好ましく、具体例としては、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩等が挙げられる。
両性界面活性剤としては、例えばベタイン類、グリシン類、アラニン類、２−アルキルイミダゾリンの誘導体類、アミンオキサイド類、アルキルアミノ塩類等が挙げられる。ベタイン類としては、例えばアルキルベタイン類、カルボキシベタイン類、スルホベタイン類等が挙げられる。Examples of the cholate include sodium cholate.
Of the anionic surfactants, those having a polyoxyethylene chain are particularly preferred, and specific examples thereof include polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate salts.
Examples of amphoteric surfactants include betaines, glycines, alanines, 2-alkylimidazoline derivatives, amine oxides, and alkylamino salts. Examples of betaines include alkylbetaines, carboxybetaines, and sulfobetaines.
アルキルベタイン類としては、例えばＮ−ドデシルベタイン等が挙げられる。
カルボキシベタイン類としては、例えばラウリン酸アミドプロピルベタイン、ドデシルジメチルアミノ酢酸ベタイン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ ’−カルボキシメチル−Ｎ ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられる。
スルホベタイン類としては、例えばラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン等が挙げられる。Examples of the alkylbetaines include N-dodecylbetaine.
Examples of carboxybetaines include lauric acid amidopropyl betaine, dodecyldimethylaminoacetic acid betaine, and N-lauroyl-N′-carboxymethyl-N′-hydroxyethylethylenediamine sodium.
Examples of the sulfobetaines include lauric acid amidopropyl hydroxysulfobetaine.
グリシン類としては、例えばドデシルジアミノエチルグリシンナトリウム等が挙げられる。
アラニン類としては、例えばＮ−オクトデシル−β−アラニンナトリウム、Ｎ−ミスチリル−β−アラニンナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等が挙げられる。
２−アルキルイミダゾリンの誘導体類としては、例えば２−ラウロイル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ −ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等の２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられる。Examples of glycines include sodium dodecyldiaminoethylglycine.
Examples of alanines include N-octdecyl-β-alanine sodium, N-mystyryl-β-alanine sodium, sodium laurylaminopropionate, and the like.
Examples of 2-alkylimidazoline derivatives include 2-alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazolinium betaine such as 2-lauroyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazolinium betaine. It is done.
アミンオキサイド類としては、例えばドデシルジメチルアミンオキサイド、ジヒドロキシエチルドデシルアミンオキサイド、ポリオキシエチレンヤシ油アルキルジメチルアミンオキサイド等が挙げられる。
アルキルアミノ塩類としては、例えばドデシルアミノジ酢酸ナトリウム等が挙げられる。Examples of amine oxides include dodecyldimethylamine oxide, dihydroxyethyl dodecylamine oxide, polyoxyethylene coconut oil alkyldimethylamine oxide, and the like.
Examples of the alkylamino salts include sodium dodecylaminodiacetate.
両性界面活性剤の中でも、特にアミンオキサイド類、ベタイン類が特に好ましく、アミンオキサイド類が最も好ましい。アミンオキサイド類としては、例えばドデシルジメチルアミンオキサイド、ジヒドロキシエチルドデシルアミンオキサイド、ポリオキシエチレンヤシ油アルキルジメチルアミンオキサイド等が挙げられる。ベタイン類としては、例えばドデシルジメチルアミノ酢酸ベタイン等が挙げられる。 Among the amphoteric surfactants, amine oxides and betaines are particularly preferable, and amine oxides are most preferable. Examples of amine oxides include dodecyldimethylamine oxide, dihydroxyethyl dodecylamine oxide, polyoxyethylene coconut oil alkyldimethylamine oxide, and the like. Examples of betaines include dodecyldimethylaminoacetic acid betaine.
尚、これら界面活性剤の使用濃度は、反応液中の濃度として、０．０００１〜２０％が好ましく、０．００１〜１０％がより好ましい。また界面活性剤は、複数の界面活性剤を併用して用いることができる。 In addition, as for the use density | concentration of these surfactant, 0.0001 to 20% is preferable as a density | concentration in a reaction liquid, and 0.001 to 10% is more preferable. The surfactant can be used in combination with a plurality of surfactants.
（水性媒体）
本発明において使用される水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（トリス緩衝剤）、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。(Aqueous medium)
Examples of the aqueous medium used in the present invention include deionized water, distilled water, and a buffer solution, and a buffer solution is preferable. Examples of the buffer used in the buffer include tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (Tris buffer), phosphate buffer, borate buffer, Good's buffer, and the like.
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。 Good buffers include, for example, 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA) Piperazine-N, N′-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), 3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO) ), N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] -2-aminoethanesulfone Acid (TES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethane Lufonic acid (HEPES), 3- [N, N-bis (2-hydroxyethyl) amino] -2-hydroxypropanesulfonic acid (DIPSO), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] -2-hydroxy-3- Aminopropanesulfonic acid (TAPSO), piperazine-N, N′-bis (2-hydroxypropanesulfonic acid) (POPSO), 3- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] -2-hydroxypropanesulfone Acid (HEPPSO), 3- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid [(H) EPPS], N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine (Tricine), N, N- Bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bicine), N-tris (hydroxymethyl) 3-aminopropanesulfonic acid (TAPS), N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES), N-cyclohexyl-3-amino-2-hydroxypropanesulfonic acid (CAPSO), N-cyclohexyl-3- Examples include aminopropane sulfonic acid (CAPS).
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。 The concentration of the buffer solution is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but is preferably 0.001 to 2.0 mol / L, more preferably 0.005 to 1.0 mol / L.
（測定方法）
本発明の二種以上の糖化タンパク質を含む試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定は、水性媒体中、下記（ｉ）〜（iii）の工程を順次行うことによって行うことができる。
（ｉ）試料中の二種以上の糖化タンパク質にタンパク質分解酵素を作用させ該糖化タンパク質を糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに分解する工程、
（ii）測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を除去する工程、
（iii）測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を測定する工程。(Measuring method)
The measurement of the glycated protein to be measured in the sample containing two or more glycated proteins of the present invention can be performed by sequentially performing the following steps (i) to (iii) in an aqueous medium.
(I) a step of degrading the glycated protein into a glycated amino acid and / or a glycated oligopeptide by causing a proteolytic enzyme to act on two or more types of glycated protein in the sample;
(Ii) a step of removing a product produced in the reaction solution by allowing an enzyme acting on a glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from a glycated protein other than the glycated protein to be measured;
(Iii) A step of measuring a product produced in a reaction solution by allowing an enzyme acting on a glycated amino acid and / or a glycated oligopeptide generated from a glycated protein to be measured to act.
各工程の反応の反応温度としては、例えば１０〜５０℃で、好ましくは２０〜４０℃であり、反応時間としては、１秒間〜６０分間、好ましくは１〜１０分間である。工程（ｉ）と工程（ii）は、同時に行うこともできる。
工程（i）のタンパク質分解酵素を作用させる反応は、前述の界面活性剤の存在下に行うのが好ましい。なお、タンパク質分解酵素は、工程(ii)及び/又は工程(iii)の反応に影響を及ぼさなければ、工程（i）を行った後に、特に失活させなくともよいが、加熱、冷却、遠心分離、膜濾過、阻害剤の添加等によって該酵素が工程(ii)及び/又は工程(iii)で作用することがないようにすることもできる。As reaction temperature of reaction of each process, it is 10-50 degreeC, for example, Preferably it is 20-40 degreeC, As reaction time, it is 1 second-60 minutes, Preferably it is 1-10 minutes. Process (i) and process (ii) can also be performed simultaneously.
The reaction for causing the proteolytic enzyme to act in step (i) is preferably performed in the presence of the aforementioned surfactant. It should be noted that the proteolytic enzyme need not be inactivated after step (i) as long as it does not affect the reaction of step (ii) and / or step (iii). The enzyme can be prevented from acting in step (ii) and / or step (iii) by separation, membrane filtration, addition of an inhibitor or the like.
工程（ii）における、反応液中に生成する生成物（以下、生成物Ａという）を除去する工程とは、該生成物を工程（iii）で反応液中に生成する生成物（以下、生成物Ｂという
）の測定に関与しない物質に酵素変換することを意味する。
なお、工程（iii）における生成物Ｂの測定方法との組み合わせで、工程（ii）の生成物Ａの除去方法は、当業者が適宜選択できる。In step (ii), the step of removing a product (hereinafter referred to as product A) generated in the reaction solution is a product (hereinafter referred to as production) in which the product is generated in the reaction solution in step (iii). It means enzymatic conversion to a substance that does not participate in the measurement of the substance B).
Note that a method for removing the product A in the step (ii) can be appropriately selected by those skilled in the art in combination with the method for measuring the product B in the step (iii).
即ち、工程（ii）及び工程（iii）に使用する酵素反応の組み合わせは特に制限はない。
工程（ii）及び／又は工程（iii）において、糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼを作用させて生成する生成物としては、過酸化水素、アミノ酸、オリゴペプチド等が挙げられる。That is, there is no particular limitation on the combination of enzyme reactions used in step (ii) and step (iii).
In the step (ii) and / or step (iii), examples of the product generated by the action of oxidase acting on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide include hydrogen peroxide, amino acid, oligopeptide and the like.
工程（ii）及び／又は工程（iii）において、糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するキナーゼをＡＴＰ存在下で作用させて生成する生成物としては、リン酸化糖化アミノ酸、リン酸化糖化オリゴペプチド、ＡＤＰ等が挙げられる。さらに生成物にリン酸化糖化アミノ酸に作用するデグリカーゼを作用させて生成する生成物としては、グルコース−６−リン酸、アミノ酸等が挙げられる。リン酸化糖化アミノ酸に作用するデグリカーゼとしては、例えばフルクトシルリジン−6−リン酸に作用する大腸菌由来デグリカーゼ（The Journal of Biological Chemistry（2002），277, 42523-42529）等が例示される。 In the step (ii) and / or the step (iii), a product produced by acting a kinase that acts on a glycated amino acid and / or a glycated oligopeptide in the presence of ATP includes a phosphorylated glycated amino acid and a phosphorylated glycated oligopeptide. , ADP and the like. Furthermore, glucose-6-phosphate, an amino acid, etc. are mentioned as a product produced | generated by making deglycase which acts on a phosphorylated glycated amino acid act on a product. Examples of deglycases that act on phosphorylated glycated amino acids include E. coli-derived deglycases that act on fructosyl lysine-6-phosphate (The Journal of Biological Chemistry (2002), 277, 42523-42529).
工程（ii）及び／又は工程（iii）において、糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するデヒドロゲナーゼを酸化型補酵素の存在下で作用させて生成する生成物としては、例えば酸化型補酵素としてＮＡＤＰを用いた場合、生成物としては還元型補酵素ＮＡＤＰＨと脱水素化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチド、例えば補酵素としてピロロキノリンキノンを用いた場合、生成物としては、還元型ピロロキノリンキノンと脱水素化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドが挙げられる。 In step (ii) and / or step (iii), a product produced by reacting a dehydrogenase that acts on a glycated amino acid and / or glycated oligopeptide in the presence of an oxidized coenzyme is, for example, an oxidized coenzyme. When NADP is used, the reduced coenzyme NADPH and the dehydrogenated glycated amino acid and / or glycated oligopeptide, for example, pyrroloquinoline quinone as the coenzyme, are used as the product. Examples thereof include quinoline quinone and glycated amino acid and / or glycated oligopeptide dehydrogenated.
以下、工程（ii）及び工程（iii）に基質特異性の異なる２種類のオキシダーゼを使用し、測定する場合について詳細に説明する。
工程（ii）の生成物の除去方法としては、オキシダーゼの作用により生成する過酸化水素を除去する方法、アミノ酸もしくはオリゴペプチドを除去する方法等が挙げられるが、過酸化水素を除去する方法が好ましい。Hereinafter, the case where measurement is performed using two types of oxidases having different substrate specificities in step (ii) and step (iii) will be described in detail.
Examples of the method for removing the product in step (ii) include a method for removing hydrogen peroxide generated by the action of oxidase, a method for removing amino acids or oligopeptides, and the like, and a method for removing hydrogen peroxide is preferable. .
過酸化水素を除去する方法としては、パーオキシダーゼ、カタラーゼ等の酵素を作用させる方法、各種金属等の還元性物質を作用させる方法等が挙げられる。
工程（ii）でパーオキシダーゼ、カタラーゼ等の酵素を作用させる場合、工程（iii）の測定反応に影響を及ぼさなければ酵素反応を停止しなくてもよいが、工程（iii）の測定反応に影響を及ぼす場合、加熱、冷却、遠心分離、膜ろ過、阻害剤の添加などの方法によって該酵素が工程（iii）で作用することがないように調整するのが好ましい。また酵素反応を失活させる操作を必要としない点で、担体、カラム等に固定化した酵素を用いて除去反応を行うのが好ましい。カタラーゼは、例えばアジ化ナトリウム等の阻害剤を添加して失活させることができる。Examples of the method for removing hydrogen peroxide include a method in which an enzyme such as peroxidase and catalase is allowed to act, and a method in which a reducing substance such as various metals is caused to act.
When an enzyme such as peroxidase or catalase is allowed to act in step (ii), the enzyme reaction does not have to be stopped if it does not affect the measurement reaction in step (iii), but the measurement reaction in step (iii) is affected. Is preferably adjusted so that the enzyme does not act in step (iii) by a method such as heating, cooling, centrifugation, membrane filtration, or addition of an inhibitor. Moreover, it is preferable to carry out the removal reaction using an enzyme immobilized on a carrier, a column, or the like, because an operation for deactivating the enzyme reaction is not required. Catalase can be inactivated by adding an inhibitor such as sodium azide.
また、工程（ii）で生成する過酸化水素を還元性物質を用いて除去する場合、該過酸化水素と反応後の反応液中に残存する還元性物質は、工程（iii）の測定反応に影響を及ぼさないようにするのが好ましい。還元性物質を用いて、工程（ii）で生成する過酸化水素除去する方法としては、還元性物質を固定化して反応液に接触させる方法が好ましい。
生成物Ａの除去を、例えば測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用するオキシダーゼの作用により生成する過酸化水素を除去することにより行い、生成物Ｂの測定を、測定すべき糖化タンパク質から生成した糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する前記オキシダーゼとは基質特異性の異なる他のオキシダーゼにより生成する過酸化水素を測定することにより行う場合に好適な方法を以下に記載する。In addition, when the hydrogen peroxide generated in the step (ii) is removed using a reducing substance, the reducing substance remaining in the reaction solution after the reaction with the hydrogen peroxide is included in the measurement reaction in the step (iii). It is preferable not to exert an influence. As a method for removing hydrogen peroxide produced in step (ii) using a reducing substance, a method in which the reducing substance is immobilized and brought into contact with the reaction solution is preferable.
The product A is removed by, for example, removing hydrogen peroxide generated by the action of oxidase acting on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from the glycated protein other than the glycated protein to be measured, and the product B Suitable for measurement of hydrogen peroxide produced by another oxidase having a substrate specificity different from that of the oxidase acting on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide produced from the glycated protein to be measured This method is described below.
工程（ii）の過酸化水素の除去は、例えば過酸化水素除去試薬により除去することができる。該過酸化水除去試薬としては、例えばカタラーゼ以外に、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と後述の酸化カップリング型色原体の片方（即ち、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物又は４−アミノアンチピリン等のカプラー）との組み合わせ等が挙げられる。過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを用いる場合は、工程（ii）においてカタラーゼを該過酸化水素に作用させて該過酸化水素を水と酸素に変換することにより除去することができる。 The removal of hydrogen peroxide in the step (ii) can be removed by, for example, a hydrogen peroxide removing reagent. Examples of the reagent for removing peroxide water include, in addition to catalase, one of a peroxidase active substance such as peroxidase and an oxidative coupling type chromogen described later (that is, a phenolic or aniline hydrogen donor compound or 4-amino acid). And a combination with a coupler such as antipyrine). When catalase is used as the hydrogen peroxide removal reagent, it can be removed by allowing catalase to act on the hydrogen peroxide in step (ii) to convert the hydrogen peroxide into water and oxygen.
過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と後述の酸化カップリング型色原体の片方（即ち、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物又は４−アミノアンチピリン等のカプラー）との組み合わせを用いる場合は、該過酸化水素を過酸化活性物質の存在下、該酸化カップリング型色原体と反応させて、無色の物質を生成させることによって除去することができる。 A combination of a peroxide active substance such as peroxidase as a hydrogen peroxide removing reagent and one of the oxidative coupling type chromogens described later (that is, a coupler such as a phenolic or aniline hydrogen donor compound or 4-aminoantipyrine). Can be removed by reacting the hydrogen peroxide with the oxidatively coupled chromogen in the presence of a peroxide active substance to produce a colorless substance.
過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合のカタラーゼの濃度としては、工程（ii）で生成する過酸化水素を除去可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．１〜１０，０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、１０〜２，０００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と酸化カップリング型色原体の片方との組み合わせを使用する場合、過酸化活性物質の濃度としては、該過酸化活性物質と過酸化水素との反応により、無色の物質が生成し得る濃度であれば特に制限はない。過酸化活性物質としてパーオキシダーゼを用いる場合、パーオキシダーゼの濃度としては、反応液中で１〜１００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、２〜５０Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。The concentration of catalase in the case of using catalase as a hydrogen peroxide removal reagent is not particularly limited as long as it is a concentration that can remove hydrogen peroxide generated in step (ii). It is preferable that it is a density | concentration of -10,000 U / mL, and it is more preferable that it is a density | concentration of 10-2,000 U / mL.
When a combination of a peroxide active substance such as peroxidase and one of the oxidative coupling type chromogens is used as a hydrogen peroxide removal reagent, the concentration of the peroxide active substance is selected from the peroxide active substance and hydrogen peroxide. The concentration is not particularly limited as long as a colorless substance can be generated by the reaction with. When peroxidase is used as the peroxide active substance, the concentration of peroxidase is preferably 1 to 100 U / mL, and more preferably 2 to 50 U / mL in the reaction solution.
過酸化水素除去試薬として使用される酸化カップリング型色原体は、過酸化水素測定用試薬として使用される酸化カップリング型色原体の組み合わせ、即ち、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と４−アミノアンチピリン等のカプラーとの組み合わせにおける１つの構成成分である。フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と４−アミノアンチピリン等のカプラーとは、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、酸化カップリング反応により色素を生成する。 The oxidative coupling type chromogen used as a hydrogen peroxide removing reagent is a combination of an oxidative coupling type chromogen used as a hydrogen peroxide measuring reagent, that is, a phenol-based or aniline-based hydrogen donor compound. One component in combination with a coupler such as 4-aminoantipyrine. A phenol-based or aniline-based hydrogen donor compound and a coupler such as 4-aminoantipyrine react with hydrogen peroxide in the presence of a peroxidase active substance such as peroxidase to generate a dye by an oxidative coupling reaction.
カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。
フェノール系水素供与体化合物としては、例えばフェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、２，４，６−トリクロロフェノール、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、２，４−ジブロモフェノール、２，４，６−トリブロモフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。Examples of the coupler include 4-aminoantipyrine (4-AA) and 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone.
Examples of the phenolic hydrogen donor compound include phenol, 4-chlorophenol, 3-methylphenol, 2,4-dichlorophenol, 2,6-dichlorophenol, 2,4,6-trichlorophenol, and 3,5-dichloro. 2-hydroxybenzenesulfonic acid, 2,4-dibromophenol, 2,4,6-tribromophenol, 3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzoic acid (HTIB) and the like.
アニリン系水素供与体化合物としては、例えばＮ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ） 、Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−ｍ−トルイジン（ＣＥＭＢ） 、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ）−３−ホスホプロピル−ｍ−トルイジン（ＥＨＳＰＴ） 、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン（ ＴＯＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−ｍ−トルイジン（ＥＳＥＴ）等が挙げられる。 Examples of aniline-based hydrogen donor compounds include N- (3-sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOOS), and N-ethyl-N. -(2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N -Ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOPS), N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N, N-dimethyl-3 -Methylaniline, N, N-di (3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methoxy Niline (ADPS), N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) aniline (ALPS), N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAPS), N- (3- Sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAPS), N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAPS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3- Sulfopropyl) -3-methoxyaniline (ADOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) aniline (ALOS), N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N′-succinyl Ethylenediamine (EMSE), N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N′-acetylethylenediamine, N-ethyl-N- (2-hydroxy) 3-sulfopropyl) -4-fluoro-3,5-dimethoxyaniline (F-DAOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxy-4-fluoroaniline ( FDAOS), N-sulfopropylaniline (HALPS), N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N-acetylethylenediamine (EMAE), N- (2-carboxyethyl) -N-ethyl-m-toluidine ( CEMB), N-ethyl-N- (2-hydroxy) -3-phosphopropyl-m-toluidine (EHSPT), N, N-bis- (4-sulfobutyl) -3-methylaniline (TODB), N-ethyl -N- (2-succinylaminoethyl) -m-toluidine (ESET) etc. are mentioned.
過酸化水素除去試薬としてカプラー又はフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物を使用する場合、該カプラー、該フェノール系水素供与体化合物、該アニリン系水素供与体化合物の濃度としては、生成した過酸化水素を除去可能とする濃度であれば特に限定はされないが、好ましくは０．０５〜４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌである。 When a coupler or a phenolic or aniline hydrogen donor compound is used as the hydrogen peroxide removal reagent, the concentration of the coupler, the phenolic hydrogen donor compound, or the aniline hydrogen donor compound is defined as the hydrogen peroxide produced. Although it will not specifically limit if it is a density | concentration which can remove | eliminate, Preferably it is 0.05-4 g / L, More preferably, it is 0.1-2 g / L.
本発明の工程（ii）において、過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを用いる場合は、工程（iii）においてカタラーゼ阻害剤を共存させることが好ましい。カタラーゼ阻害剤としては、例えばアジ化ナトリウム、Ｈ2Ｓ、ＨＣＮ、ＮＨ2ＯＨ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール等が挙げられ、使用する濃度としてはカタラーゼ活性を阻害し、工程（iii）で生成する過酸化水素の測定に影響を及ぼさない濃度であればとくに限定はされないが、好ましくは０．５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌである。In the step (ii) of the present invention, when catalase is used as the hydrogen peroxide removing reagent, it is preferable that a catalase inhibitor coexists in the step (iii). Examples of the catalase inhibitor include sodium azide, H 2 S, HCN, NH 2 OH, 3-amino-1,2,4-triazole and the like. Although it will not specifically limit if it is a density | concentration which does not affect the measurement of the hydrogen peroxide produced | generated in iii), Preferably it is 0.5-60 mmol / L, More preferably, it is 1-30 mmol / L.
本発明の工程（iii）において生成する過酸化水素は、例えば光学的手法又は電気化学的手法を用いて測定することができる。光学的手法としては、例えば吸光度法、発光法等が挙げられる。具体的には、過酸化水素測定試薬を用いた光学的測定法、過酸化水素電極を用いた電気化学的測定法等が挙げられる。
過酸化水素測定試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば発色物質、発光物質等が挙げられるが、発色物質が好ましい。The hydrogen peroxide produced in step (iii) of the present invention can be measured using, for example, an optical technique or an electrochemical technique. Examples of the optical method include an absorbance method and a luminescence method. Specific examples include an optical measurement method using a hydrogen peroxide measurement reagent, an electrochemical measurement method using a hydrogen peroxide electrode, and the like.
The hydrogen peroxide measuring reagent is a reagent for converting the generated hydrogen peroxide into a detectable substance. Examples of the detectable substance include a coloring substance and a luminescent substance, and a coloring substance is preferable.
検出可能な物質が発色物質の場合には、過酸化水素測定試薬は、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含む。酸化発色型色原体としては、例えば前述の酸化カップリング型色原体や後述のロイコ型色原体が挙げられる。
検出可能な物質が発光物質の場合には、過酸化水素測定試薬は、化学発光物質を含む。化学発光物質としては、生物発光物質も含まれ、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル、シュウ酸エステル等が挙げられる。When the detectable substance is a color developing substance, the hydrogen peroxide measuring reagent contains an oxidation coloring type chromogen and a peroxidation active substance such as peroxidase. Examples of the oxidative coloring chromogen include the aforementioned oxidative coupling chromogen and the leuco chromogen described below.
When the detectable substance is a luminescent substance, the hydrogen peroxide measuring reagent contains a chemiluminescent substance. The chemiluminescent substance includes a bioluminescent substance, and examples thereof include luminol, isoluminol, lucigenin, acridinium ester, and oxalate ester.
過酸化水素測定試薬として、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含む試薬を用いる場合には、過酸化水素を、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応させ色素を生成し、生成した色素を測定することにより、過酸化水素を測定することができる。また、化学発光物質を含む過酸化水素測定試薬を用いる場合には、過酸化水素を、化学発光物質と反応させフォトンを生じ、生じたフォトンを測定することにより、過酸化水素を測定することができる。 When using a reagent containing an oxidative coloring chromogen and a peroxidase active substance such as peroxidase as a hydrogen peroxide measuring reagent, hydrogen peroxide is oxidized in the presence of the peroxidative active substance. It is possible to measure hydrogen peroxide by reacting with, producing a dye and measuring the produced dye. When a reagent for measuring hydrogen peroxide containing a chemiluminescent substance is used, hydrogen peroxide can be measured by reacting hydrogen peroxide with the chemiluminescent substance to generate photons and measuring the generated photons. it can.
前述のように、酸化カップリング型色原体は、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、酸化カップリング反応により色素を生成する色原体である。前述のように、４−ＡＡ等のカプラーとフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物とが酸化カップリング反応により色素を生成する。
ロイコ型色原体は、パーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、単独で色素を生成する色原体である。具体的には、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ−６７）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’,Ｎ’,Ｎ’’,Ｎ’’−ヘキサ−３−スルホプロピル−４，４’，４’’−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ）、ジアミノベンチジン、ヒドロキシフェニルプロピオン酸、テトラメチルベンチジン、オルトフェニレンジアミン等が挙げられる。As described above, the oxidative coupling type chromogen is a chromogen that reacts with hydrogen peroxide in the presence of a peroxidase active substance such as peroxidase to generate a dye by an oxidative coupling reaction. As described above, a coupler such as 4-AA and a phenol-based or aniline-based hydrogen donor compound form a dye by an oxidative coupling reaction.
A leuco chromogen is a chromogen that reacts with hydrogen peroxide in the presence of a peroxidase active substance such as peroxidase to produce a pigment alone. Specifically, 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (CCAP), 10-N-methylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (MCDP), N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium salt (DA-64), 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) Phenothiazine sodium salt (DA-67), 4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine, bis [3-bis (4-chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine (BCMA), N, N, N ′ , N ′, N ″, N ″ -Hexa-3-sulfopropyl-4,4 ′, 4 ″ -triami Examples include notriphenylmethane (TPM-PS), diaminobenzidine, hydroxyphenylpropionic acid, tetramethylbenzidine, and orthophenylenediamine.
工程（ii）において、過酸化水素除去試薬としてカプラー又はフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物を使用し、工程（iii）において、過酸化水素測定試薬として酸化カップリング型色原体を使用する場合、工程（ii）において使用する該カプラー又は該フェノール系もしくは該アニリン系水素供与体化合物を工程（iii）における過酸化水素測定試薬として使用することができる。過酸化水素除去試薬としてカプラーを用いた場合には、工程（iii）において、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物を添加すればよく、また、過酸化水素除去試薬としてフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物を用いた場合には、工程（iii）において、４−ＡＡ等のカプラーを添加すればよい。 When a coupler or a phenolic or aniline hydrogen donor compound is used as a hydrogen peroxide removal reagent in step (ii) and an oxidative coupling type chromogen is used as a hydrogen peroxide measurement reagent in step (iii) The coupler or phenolic or aniline hydrogen donor compound used in step (ii) can be used as a reagent for measuring hydrogen peroxide in step (iii). When a coupler is used as a hydrogen peroxide removing reagent, a phenolic or aniline hydrogen donor compound may be added in step (iii), and a phenolic or aniline hydrogen donating agent as a hydrogen peroxide removing reagent. When the body compound is used, a coupler such as 4-AA may be added in step (iii).
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてパーオキシダーゼを用いる場合は、１〜１００Ｕ／ｍＬが好ましく、２〜５０Ｕ／ｍＬがより好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましく、０．０２〜５ｇ／Ｌがより好ましい。 In the measurement of hydrogen peroxide, the concentration of the peroxide active substance is not particularly limited as long as it is suitable for the measurement. However, when peroxidase is used as the peroxide active substance, 1 to 100 U / mL is preferable. 50 U / mL is more preferable. The concentration of the oxidative coloring type chromogen is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but is preferably 0.01 to 10 g / L, more preferably 0.02 to 5 g / L.
過酸化水素を過酸化水素電極を用いて測定する場合、使用する電極は、過酸化水素との間で電子を授受する材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙げられる。測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いることができる。オキシダーゼ又は基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定することもできる。 When hydrogen peroxide is measured using a hydrogen peroxide electrode, the electrode to be used is not particularly limited as long as it is a material that exchanges electrons with hydrogen peroxide. Examples thereof include platinum, gold, and silver. . As a measuring method, known methods such as amperometry, potentiometry, coulometry, and the like can be used. An electron carrier can be interposed in the reaction between the oxidase or substrate and the electrode, and the resulting oxidation, reduction current, or electric quantity thereof can be measured.
電子伝達体としては、電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流又はその電気量を測定することができる。
オキシダーゼを工程（iii）に用いる場合は、過酸化水素とα−ケトアルデヒド体が生成するので、生成するα−ケトアルデヒド体にグルコースオキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を併せて測定することにより、高感度に測定することができる。As the electron carrier, any substance having an electron transfer function can be used, and examples thereof include substances such as ferrocene derivatives and quinone derivatives. In addition, the oxidation, reduction current, or electric quantity thereof obtained by interposing an electron carrier between hydrogen peroxide generated by the oxidase reaction and the electrode can be measured.
When oxidase is used in step (iii), hydrogen peroxide and α-ketoaldehyde form are produced, so measure the hydrogen peroxide produced by the action of glucose oxidase on the produced α-ketoaldehyde form. Therefore, it is possible to measure with high sensitivity.
前述の場合、工程（ii）でα−ケトアルデヒド体が生成する場合は、予め工程（ii）でα−ケトアルデヒド体及びグルコースを除去する。
工程（ii）の反応にキナーゼを使用する場合は、リン酸化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに対して、工程（iii）の測定に用いる酵素が作用しない場合は、反応を停止することなくそのまま使用することができる。In the case described above, when an α-ketoaldehyde compound is produced in step (ii), the α-ketoaldehyde compound and glucose are removed in advance in step (ii).
When using a kinase for the reaction of step (ii), stop the reaction when the enzyme used for the measurement of step (iii) does not act on the phosphorylated glycated amino acid and / or glycated oligopeptide. It can be used as it is.
また、工程（ii）の反応に用いる酵素としてキナーゼを使用する場合は、リン酸化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに対して、特異的に作用するデグリカーゼを作用させてリン酸化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを分解することができる。
工程（iii）の反応にキナーゼを使用する場合は、反応系内にＡＴＰを共存させて、糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドがキナーゼによってリン酸化される反応に伴うＡＴＰの変化量を公知の方法によって測定することができる。In addition, when a kinase is used as the enzyme used in the reaction of step (ii), glycation phosphorylated by causing a specifically acting deglycase to act on the phosphorylated glycated amino acid and / or glycated oligopeptide. Amino acids and / or glycated oligopeptides can be degraded.
In the case where a kinase is used in the reaction of step (iii), ATP is allowed to coexist in the reaction system, and the amount of change in ATP accompanying the reaction in which the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide is phosphorylated by the kinase is a known method. Can be measured.
工程（ii）の反応にデヒドロゲナーゼを使用する場合は、脱水素化された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに対して、工程（iii）の測定に用いる酵素が作用しない場合は、反応を停止することなくそのまま使用することができる。
工程（iii）の反応にデヒドロゲナーゼを使用する場合は、反応系内に酸化型補酵素を共存させ、酸化型補酵素の消費量又は還元型補酵素の生成量を測定することにより、測定すべき糖化タンパク質を定量することができる。生成する還元型補酵素の測定は、例えばその極大吸収波長域である３４０ｎｍ付近の波長にて比色計で測定する等公知の技術を用いた直接的方法や、生成した還元型補酵素を各種ジアフォラーゼ、又はフェナジンメトサルフェート等の電子キャリアー及びニトロテトラゾリウム、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８（以上、同仁化学研究所社製）に代表される各種テトラゾリウム塩等の還元系発色試薬を用いた間接的方法等により行うことができ、またこれ以外の公知の方法により測定することもできる。When dehydrogenase is used in the reaction of step (ii), the reaction is stopped when the enzyme used in the measurement of step (iii) does not act on the dehydrogenated glycated amino acid and / or glycated oligopeptide. It can be used as it is.
When dehydrogenase is used in the reaction of step (iii), it should be measured by coexisting oxidized coenzyme in the reaction system and measuring consumption of oxidized coenzyme or production of reduced coenzyme. Glycated proteins can be quantified. For the measurement of the reduced coenzyme to be produced, for example, a direct method using a known technique such as measurement with a colorimeter at a wavelength around 340 nm which is the maximum absorption wavelength region, or various kinds of reduced coenzymes produced are used. An indirect method using an electron carrier such as diaphorase or phenazine methosulfate and a reducing coloring reagent such as nitrotetrazolium, various tetrazolium salts represented by WST-1, WST-8 (above, manufactured by Dojindo Laboratories) Etc., and can also be measured by other known methods.
また補酵素として例えばピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を用いることができ、例えば反応系に電子メディエータを共存させ、電気化学的手法を用いて補酵素の変化量を測定することもできる。
本発明に基づく糖化タンパク質の測定方法において、ケトアミン構造を認識する酵素を用いる場合には、例えば前述のデヒドロゲナーゼを用いた場合の方法により、測定すべき糖化タンパク質を測定することができる。For example, pyrroloquinoline quinone (PQQ) can be used as a coenzyme. For example, the amount of change in coenzyme can be measured using an electrochemical method in the presence of an electron mediator in the reaction system.
In the method for measuring a glycated protein according to the present invention, when an enzyme that recognizes a ketoamine structure is used, the glycated protein to be measured can be measured by, for example, the method using the aforementioned dehydrogenase.
（対象タンパク質の測定）
本発明の対象タンパク質の測定方法は、対象タンパク質を正確に測定できる方法であれば如何なる方法を用いてもよい。なお、測定する対象タンパク質は、糖化されていないタンパク質だけであっても、該タンパク質の糖化体を含んでもよい。対象タンパク質の測定方法としては、吸光度法（比色法）や視差屈折法が公知であり、これらの方法は広く用いられている。吸光度法（比色法）は、物質溶液の紫外吸収や、可視吸収、赤外吸収を測定し、溶液濃度を算出する方法である。一方、視差屈折法は屈折率の違いから溶液濃度を導出する方法であり、主に糖類などのように比色法を適用しにくい物質に対して利用されている。また、物質が電解質である場合には、イオン濃度や電気伝導度から溶液濃度の測定が行われている。(Measurement of target protein)
As the method for measuring the target protein of the present invention, any method may be used as long as it can accurately measure the target protein. The target protein to be measured may be only a non-glycated protein or a glycated product of the protein. Absorbance methods (colorimetric methods) and parallax refraction methods are known as methods for measuring the target protein, and these methods are widely used. The absorbance method (colorimetric method) is a method of measuring the ultraviolet absorption, visible absorption, and infrared absorption of a substance solution and calculating the solution concentration. On the other hand, the parallax refraction method is a method for deriving the solution concentration from the difference in refractive index, and is mainly used for substances that are difficult to apply the colorimetric method, such as sugars. When the substance is an electrolyte, the solution concentration is measured from the ion concentration and electrical conductivity.
例えば対象タンパク質がヘモグロビンである場合には、公知のヘモグロビンを測定する方法であれば如何なる方法も用いることができる。このような方法には、例えばメトへモグロビン法、シアンメトヘモグロビン法、アザイドメトヘモグロビン法、ドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＬＳ）法、アルカリヘマチン法、緑色発色団形成法又はオキシヘモグロビン法等が挙げられる。また、試料中のヘモグロビンをテトラゾリウム化合物で変性させ得られた変性ヘモグロビンに特異的な吸収波長で、前記試料の光学的変化量を測定する方法等を用いることができる。 For example, when the target protein is hemoglobin, any method can be used as long as it is a known method for measuring hemoglobin. Examples of such methods include methemoglobin method, cyan methemoglobin method, azide methemoglobin method, sodium dodecyl sulfonate (SLS) method, alkali hematin method, green chromophore formation method or oxyhemoglobin method. . In addition, a method of measuring an optical change amount of the sample at an absorption wavelength specific to the modified hemoglobin obtained by modifying hemoglobin in the sample with a tetrazolium compound can be used.
さらにまた、対象タンパク質がアルブミンである場合には、公知のアルブミンを測定する方法であれば如何なる方法も用いることができる。このような方法には、例えばブロムクレゾールグリーン、ブロムクレゾールパープル、ブロモフェノールブルー、メチルオレンジ、又は2-（4'- ヒドロキシベンゼンアゾ）安息香酸等のアルブミン特異的な色素を用いる方法等が挙げられる。 Furthermore, when the target protein is albumin, any method can be used as long as it is a known method for measuring albumin. Examples of such a method include a method using an albumin-specific dye such as bromocresol green, bromocresol purple, bromophenol blue, methyl orange, or 2- (4′-hydroxybenzeneazo) benzoic acid. .
（測定すべき糖化タンパク質の対象タンパク質に対する割合の算出方法）
本発明において、測定すべき糖化タンパク質の対象タンパク質に対する割合とは、試料中の測定すべき糖化タンパク質の含量又は濃度に対する同一試料中の対象タンパク質の含量又は濃度の割合を意味する。測定すべき糖化タンパク質の対象タンパク質に対する割合を算出する方法としては、標準品として既知濃度の対象タンパク質及び既知濃度の測定すべき糖化タンパク質をそれぞれ用いて検量線を作成し、その検量線を用いて試料中の対象タンパク質濃度及び測定すべき糖化タンパク質濃度を決定することができる。両者の濃度から対象タンパク質に対する測定すべき糖化タンパク質の割合を算出することができる。(Calculation method of ratio of glycated protein to be measured to target protein)
In the present invention, the ratio of the glycated protein to be measured to the target protein means the ratio of the content or concentration of the target protein in the same sample to the content or concentration of the glycated protein to be measured in the sample. As a method of calculating the ratio of the glycated protein to be measured to the target protein, a standard curve is prepared using the target protein at a known concentration and the glycated protein to be measured at a known concentration, respectively, and the calibration curve is used. The concentration of the protein of interest in the sample and the glycated protein concentration to be measured can be determined. The ratio of the glycated protein to be measured with respect to the target protein can be calculated from the concentrations of both.
（試料の調製方法）
測定すべき糖化タンパク質及び対象タンパク質を含む試料は、必要に応じて生体試料から分離することができる。分離方法としては、遠心、濾過、血球分離膜を用いた方法等が挙げられる。例えば遠心による分離方法は、全血を血球、血漿もしくは血清に分離することができる。必要に応じて、該血球を生理食塩水等の等張液で洗浄することで、血漿由来の成分を除去した洗浄血球を得ることもできる。(Sample preparation method)
The sample containing the glycated protein to be measured and the target protein can be separated from the biological sample as necessary. Examples of the separation method include centrifugation, filtration, and a method using a blood cell separation membrane. For example, the separation method by centrifugation can separate whole blood into blood cells, plasma or serum. If necessary, the blood cells can be washed with an isotonic solution such as physiological saline to obtain washed blood cells from which plasma-derived components have been removed.
試料として血球を用いる場合は、全血、血球、洗浄血球等の血球を含む試料を低張液で希釈して溶血することができる。低張液としては、血球を溶血させることができれば如何なる溶液でもよいが、水、緩衝液等が挙げられ、前述の界面活性剤等の添加剤を含むのが好ましい。 When blood cells are used as a sample, a sample containing blood cells such as whole blood, blood cells, and washed blood cells can be diluted with a hypotonic solution for hemolysis. The hypotonic solution may be any solution as long as it can lyse blood cells, but includes water, a buffer solution and the like, and preferably contains an additive such as the aforementioned surfactant.
洗浄血球の調製方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
健常人及び糖尿病患者から血液を採取、転倒混和後、２５℃で５分間、遠心分離（３，０００ｒｐｍ）を行う。遠心分離後、上澄みの血漿は除去する。下層部分の血球層１容に対して、４容の生理食塩水を追加し、転倒混和後、２５℃で５分間、遠心分離（３，０００ｒｐｍ）を行う。遠心分離後、上澄みの生理食塩水を除去する。この洗浄操作を３回繰り返した後、洗浄された血球層1容に対して９容の蒸留水を添加し、洗浄血球を得ることができる。Examples of methods for preparing washed blood cells include the following methods.
Blood is collected from healthy individuals and diabetic patients, mixed by inversion, and then centrifuged (3,000 rpm) at 25 ° C. for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant plasma is removed. Add 4 volumes of physiological saline to 1 volume of blood cell layer in the lower layer, mix by inverting, and then centrifuge (3,000 rpm) at 25 ° C. for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant saline is removed. After this washing operation is repeated three times, 9 volumes of distilled water is added to 1 volume of the washed blood cell layer to obtain washed blood cells.
（工程（ii）と工程（iii）で使用する酵素の選択）
工程（ii）と工程（iii）で使用する酵素の選択について試料中のＨｂＡ１ｃを測定する場合を例に具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。(Selection of enzyme used in step (ii) and step (iii))
The selection of the enzyme used in step (ii) and step (iii) will be specifically described by taking the case of measuring HbA1c in a sample as an example, but the present invention is not limited to this.
ＨｂＡ１ｃを含む精製ヘモグロビン試料にタンパク質分解酵素を作用させることにより、β鎖N末端のバリン残基が糖化された糖化ヘモグロビンに由来するフルクトシルバリン（以下、Fru-Valと略記する）及びフルクトシルバリルヒスチジン（以下、Fru-Val-Hisと略記する）、α鎖N末端のバリン残基が糖化された糖化ヘモグロビンに由来するFru-Val及びフルクトシルバリルロイシン（以下、Fru-Val-Leuと略記する）、α鎖及び／又はβ鎖の内部のリジン残基のε−アミノ基の糖化に由来するフルクトシルリジン（以下、Fru-Lysと略記する）等の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドが生成する。 By treating a purified hemoglobin sample containing HbA1c with a proteolytic enzyme, fructosyl valine derived from glycated hemoglobin in which the β-chain N-terminal valine residue is glycated (hereinafter abbreviated as Fru-Val) and fructose Silvalylhistidine (hereinafter abbreviated as Fru-Val-His), Fru-Val and fructosylvalylleucine (hereinafter referred to as Fru-Val-Leu) derived from glycated hemoglobin in which the α-chain N-terminal valine residue is glycated Glycated amino acids and / or glycated oligos such as fructosyl lysine (hereinafter abbreviated as Fru-Lys) derived from glycation of the ε-amino group of the lysine residue inside the α chain and / or β chain A peptide is produced.
さらに試料が全血の場合、例えば糖化アルブミンなど血液中の測定すべき糖化蛋白質以外の糖化タンパク質からも例えばFru-Lys等の糖化アミノ酸が生成する。
即ち、精製ヘモグロビンを含む試料又は全血を含む試料にタンパク質分解酵素を作用させると、例えばFru-Val-His、Fru-Val、Fru-Lys、Fru-Val-Leu等が生成し、Fru-Val-His及びFru-Val-Leuは糖化ヘモグロビンに由来し、Fru-Val-Hisは、ＨｂＡ１ｃに特異的に由来する。
従って、糖化ヘモグロビンを測定するには、例えばFru-Val-His及びFru-Val-Leuを特異的に測定すればよく、ＨｂＡ１ｃを測定する場合は、Fru-Val-Hisを特異的に測定すればよい。
第１表は、Fru-Val-His、Fru-Val、Fru-Lys、Fru-Val-Leuに対する酵素の理論的な特異性のパターンを示す。○印は、酵素が作用することを、×印は酵素が作用しないことを示す。Furthermore, when the sample is whole blood, a glycated amino acid such as Fru-Lys is also produced from a glycated protein other than the glycated protein to be measured in blood such as glycated albumin.
That is, when a proteolytic enzyme is allowed to act on a sample containing purified hemoglobin or a sample containing whole blood, for example, Fru-Val-His, Fru-Val, Fru-Lys, Fru-Val-Leu, etc. are generated, and Fru-Val -His and Fru-Val-Leu are derived from glycated hemoglobin, and Fru-Val-His is specifically derived from HbA1c.
Therefore, in order to measure glycated hemoglobin, for example, Fru-Val-His and Fru-Val-Leu may be specifically measured. When measuring HbA1c, Fru-Val-His is specifically measured. Good.
Table 1 shows the theoretical specificity patterns of the enzymes for Fru-Val-His, Fru-Val, Fru-Lys and Fru-Val-Leu. A circle indicates that the enzyme acts, and a cross indicates that the enzyme does not act.
ここで、糖化アミノ酸即ちFru-Val及び／又はFru-Lysにのみ作用し、糖化オリゴペプチド、即ちFru-Val-HisとFru-Val-Leuとに作用しない酵素としては、タイプ１０、タイプ１２、及びタイプ１４に属する酵素が挙げられる。
糖化オリゴペプチド即ちFru-Val-His及び／又はFru-Val-Leuに作用する酵素としては、タイプ１〜タイプ９、タイプ１１、タイプ１３及びタイプ１５があげられ、Fru-Val-Hisに作用する酵素としてはタイプ１〜タイプ８が挙げられる。Here, as an enzyme that acts only on glycated amino acids, ie, Fru-Val and / or Fru-Lys, and does not act on glycated oligopeptides, ie, Fru-Val-His and Fru-Val-Leu, type 10, type 12, And enzymes belonging to type 14.
Enzymes that act on glycated oligopeptides, that is, Fru-Val-His and / or Fru-Val-Leu, include type 1 to type 9, type 11, type 13, and type 15 and act on Fru-Val-His. Examples of the enzyme include Type 1 to Type 8.
Fru-Val-Hisに作用し、Fru-Val-Leuに作用しない酵素としては、タイプ２、タイプ４、タイプ６、タイプ８が挙げられる。
これらの酵素を工程（ii）及び工程（iii）に組み合わせて使用すれば目的とする糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを測定することができる。
ＨｂＡ１ｃの測定においては、工程(ii)と工程(iii)で使用し得る酵素の組み合わせとして、例えば第２表の例１及び例２に示す酵素の組み合わせが挙げられる。また、Fru-Val又はFru-Lysが生成しないタンパク質分解酵素等を用いることによって、例えば第２表の例３又は例４に示す酵素の組み合わせも使用できる。Examples of enzymes that act on Fru-Val-His and do not act on Fru-Val-Leu include type 2, type 4, type 6, and type 8.
If these enzymes are used in combination in step (ii) and step (iii), the target glycated amino acid and / or glycated oligopeptide can be measured.
In the measurement of HbA1c, examples of combinations of enzymes that can be used in step (ii) and step (iii) include the combinations of enzymes shown in Example 1 and Example 2 in Table 2. Further, by using a proteolytic enzyme that does not produce Fru-Val or Fru-Lys, for example, combinations of enzymes shown in Example 3 or Example 4 in Table 2 can also be used.
なお、前述のＨｂＡ１ｃの測定方法に置いては、工程（ii）で、試料中にもともと存在する糖化アミノ酸も除去される。
先行文献等の情報により特定の酵素が第１表に記載したどのタイプに属するか分類することができる。例えばタイプ２に属する酵素として、FPOX-CE（キッコーマン社製）が、タイプ４に属する酵素として、FPOX-EE（キッコーマン社製）が、タイプ１０に属する酵素として、FAOD-E（キッコーマン社製）、タイプ１１に属する酵素として、フルクトシルアミノ酸キナーゼ（特開２００５−５８１５７）が、タイプ１２に属する酵素として、FAOX-TE（キッコーマン社製）が、タイプ１４に属する酵素として、遺伝子操作フルクトサミンオキシダーゼFODVII（旭化成社製；ＷＯ０２／０６１１１９）挙げられる。In addition, in the method for measuring HbA1c described above, in step (ii), the glycated amino acid originally present in the sample is also removed.
It is possible to classify which type a specific enzyme belongs to Table 1 according to information such as prior literature. For example, FPOX-CE (manufactured by Kikkoman) is an enzyme belonging to type 2, FPOX-EE (manufactured by Kikkoman) is an enzyme belonging to type 4, and FAOD-E (manufactured by Kikkoman) is an enzyme belonging to type 10. As an enzyme belonging to type 11, fructosyl amino acid kinase (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-58157), as an enzyme belonging to type 12, FAOX-TE (manufactured by Kikkoman) as an enzyme belonging to type 14, genetically engineered fructosamine oxidase FODVII (Asahi Kasei Corporation; WO02 / 061119).
ＨｂＡ１ｃ以外の糖化タンパク質について同様に測定系を構築する場合、 (a)タンパク質分解酵素によって生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドの、クロマトグラフィ、質量分析、キャピラリー電気泳動法等の方法による同定、(b)同定された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドには反応せず、当該糖化タンパク質以外の糖化タンパク質に由来する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに反応する酵素、及び、同定された糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに反応する酵素の選択、という手順により、測定系を構築することができる。 When a measurement system is similarly constructed for glycated proteins other than HbA1c, (a) identification of glycated amino acids and / or glycated oligopeptides produced by proteolytic enzymes by methods such as chromatography, mass spectrometry, capillary electrophoresis, b) an enzyme that does not react with the identified glycated amino acid and / or glycated oligopeptide but reacts with a glycated amino acid and / or glycated oligopeptide derived from a glycated protein other than the glycated protein, and the identified glycated amino acid and A measurement system can be constructed by a procedure of selecting an enzyme that reacts with a glycated oligopeptide.
本発明において使用するフルクトシルアミンオキシダーゼ等の酵素の基質特異性は、既知の構造の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを用いて、例えば以下の試薬Ａ及び試料からなる酵素の基質特異性検討用試薬を用いて確認することができる。 The substrate specificity of an enzyme such as fructosylamine oxidase used in the present invention is determined by using a glycated amino acid and / or a glycated oligopeptide having a known structure, for example, for examining the substrate specificity of an enzyme comprising the following reagent A and a sample. It can be confirmed using a reagent.
試薬Ａ 発色試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
西洋わさび由来パーオキシダーゼ ９．７８Ｕ／ｍＬ
ＤＡ−６４ ０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-CE １０Ｕ／ｍＬ
試料
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチド（基質）
１μｍｏｌ／ＬReagent A Coloring reagent Tris buffer (pH 7.5) 100 mmol / L
Horseradish peroxidase 9.78 U / mL
DA-64 0.025mmol / L
Fructosyl peptide oxidase FPOX-CE 10U / mL
Sample Tris buffer (pH 7.5) 100 mmol / L
Glycated amino acid and / or glycated oligopeptide (substrate)
1 μmol / L
上記試料中の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドはいかなる濃度でもよく、例えば一定濃度、例えば１μｍｏｌ／Ｌを調製する。この調製した試料（０．１５ｍＬ）を、３７℃で１分間加温した後に７５０ｎｍにおける吸光度Ａ０基を測定する。続いて、反応開始５分後に試薬Ａ５０μＬを添加して、続けて３７℃で５分間反応させる。反応開始１０分後に７５０ｎｍにおける吸光度Ａ１基を測定する。反応吸光度ΔＡ基を下記式The glycated amino acid and / or glycated oligopeptide in the sample may have any concentration, for example, a constant concentration, for example, 1 μmol / L is prepared. This prepared sample (0.15 mL) is heated at 37 ° C. for 1 minute, and then the absorbance A0 group at 750 nm is measured. Subsequently, 50 μL of reagent A is added 5 minutes after the start of the reaction, followed by reaction at 37 ° C. for 5 minutes. Absorbance A1 group at 750 nm is measured 10 minutes after the start of the reaction. The reaction absorbance ΔA group is represented by the following formula:
により算出する。同様に、コントロールとして、糖化アミノ酸又は糖化オリゴペプチド水溶液の代わりに精製水を使用して測定を行い、ΔＡコントロールを下記式Calculated by Similarly, as a control, was measured by using purified water instead of the glycated amino acid or glycated oligopeptide solution, the following equation ΔA Control
により算出する。測定の結果の判定は、測定対象とする糖化タンパク質を特異的に測定する目的において、当業者が適宜選択できるが、例えば下記式 Calculated by The determination of the measurement result can be appropriately selected by those skilled in the art for the purpose of specifically measuring the glycated protein to be measured.
により算出した反応吸光度ΔＡが１ｍＡｂｓ以上得られた場合、反応性があると判定することができる。また、例えばある基質に対する反応吸光度ΔＡに対し、他の基質に対する反応吸光度が５０％以下の場合、他の基質に対しては反応性がないと判定することもできる。 When the reaction absorbance ΔA calculated by 1 is 1 mAbs or more, it can be determined that there is reactivity. For example, when the reaction absorbance for another substrate is 50% or less with respect to the reaction absorbance ΔA for a certain substrate, it can be determined that there is no reactivity with respect to the other substrate.
（測定すべき糖化タンパク質測定用試薬及び測定用キット）
本発明の測定すべき糖化タンパク質測定用試薬及び測定用キットは、本発明の測定すべき糖化タンパク質の測定方法に使用することができる。本発明の測定すべき糖化タンパク質測定用試薬は、保存、運搬、流通に適した形態として、キットの形態をとり得る。キットの形態としては、２試薬系、３試薬系等が挙げられる。(Reagent for measuring glycated protein to be measured and measurement kit)
The reagent for measuring glycated protein to be measured and the kit for measuring of the present invention can be used in the method for measuring a glycated protein to be measured of the present invention. The reagent for measuring glycated protein to be measured of the present invention can take the form of a kit as a form suitable for storage, transportation and distribution. Examples of the kit include a two-reagent system and a three-reagent system.
本発明の測定すべき糖化タンパク質測定用試薬は、タンパク質分解酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む。 The reagent for measuring a glycated protein to be measured of the present invention includes a proteolytic enzyme, an enzyme acting on a glycated amino acid and / or a glycated oligopeptide generated from a glycated protein other than the glycated protein to be measured, and a saccharification other than the glycated protein to be measured. Saccharified amino acids and / or glycated oligopeptides produced from proteins and reagents for removing products produced by the reaction between the glycated amino acids and / or glycated oligopeptides and glycated proteins to be measured It is generated by a reaction between an enzyme that acts on an amino acid and / or glycated oligopeptide, and a reaction between the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from the glycated protein to be measured and the enzyme that acts on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide. Tests for measuring products Including the.
本発明の測定すべき糖化タンパク質測定用キットとしては、例えば以下の態様のキットが挙げられる。 Examples of the kit for measuring glycated protein to be measured of the present invention include kits of the following embodiments.
キット１（３試薬系キット）
以下の３つの試薬を含むキット。
（Ａ）タンパク質分解酵素を含む第一試薬；
（Ｂ）測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬を含む第二試薬；
（Ｃ）測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、及び、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む第三試薬。Kit 1 (3-reagent kit)
A kit containing the following three reagents.
(A) a first reagent containing a proteolytic enzyme;
(B) Enzyme acting on glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from glycated protein other than glycated protein to be measured, and glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from glycated protein other than glycated protein to be measured A second reagent comprising a reagent for removing a product produced by a reaction between the glycated amino acid and / or an enzyme acting on the glycated oligopeptide;
(C) Enzyme acting on glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from glycated protein to be measured, and glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from glycated protein to be measured and glycated amino acid and / or glycated A third reagent including a reagent for measuring a product produced by a reaction with an enzyme that acts on an oligopeptide.
キット２（２試薬系キット）
以下の２つの試薬を含むキット。
（Ａ）タンパク質分解酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、並びに、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するため試薬を含むの第一試薬；
（Ｂ）測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、及び、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬を含む第二試薬。Kit 2 (2-reagent kit)
A kit containing the following two reagents.
(A) a proteolytic enzyme, an enzyme acting on a glycated amino acid and / or a glycated oligopeptide generated from a glycated protein other than the glycated protein to be measured, and a glycated amino acid generated from a glycated protein other than the glycated protein to be measured and / or Or a first reagent containing a reagent for removing a product produced by the reaction of the glycated oligopeptide with the glycated amino acid and / or the enzyme acting on the glycated oligopeptide;
(B) Enzyme acting on glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from glycated protein to be measured, and glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from glycated protein to be measured and glycated amino acid and / or glycated A second reagent containing a reagent for measuring a product produced by a reaction with an enzyme acting on an oligopeptide.
タンパク質分解酵素による、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素の分解を抑制する観点から、本発明のキットは３試薬系が好ましい。
本発明の測定用試薬及び測定用キットにおいて使用されるタンパク質分解酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、測定すべき糖化タンパク質以外の糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を除去するための試薬、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素、測定すべき糖化タンパク質から生成する糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドと当該糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素との反応により生成する生成物を測定するための試薬としては、それぞれ、前述のものが挙げられる。From the viewpoint of suppressing degradation of an enzyme acting on a glycated amino acid and / or glycated oligopeptide produced from a glycated protein other than the glycated protein to be measured by a proteolytic enzyme, the kit of the present invention is preferably a three-reagent system.
Proteolytic enzymes used in the measurement reagents and measurement kits of the present invention, enzymes acting on glycated amino acids and / or glycated oligopeptides produced from glycated proteins other than glycated proteins to be measured, and glycated proteins other than glycated proteins to be measured Generated from a glycated amino acid and / or glycated oligopeptide generated from a glycated protein, a reagent for removing a product generated by a reaction between the glycated amino acid and / or an enzyme acting on the glycated aminopeptide and a glycated protein to be measured Enzyme acting on glycated amino acid and / or glycated oligopeptide, glycated amino acid and / or glycated oligopeptide produced from glycated protein to be measured and production produced by reaction of the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide with the enzyme Reagents for measuring objects It is then, respectively, include those described above.
以下、工程（ii）及び工程（iii）の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素として、特異性の異なるオキシダーゼを使用する場合の試薬構成について詳細に説明する。
工程（ii）の生成物の除去試薬としては、オキシダーゼの作用により生成する過酸化水素を除去する過酸化水素除去剤、グルコースを除去するグルコース除去剤、アミノ酸若しくはオリゴペプチドを除去するアミノ酸もしくはオリゴペプチド除去剤等が挙げられるが、過酸化水素除去剤が好ましい。Hereinafter, the reagent configuration in the case where oxidases having different specificities are used as the enzyme acting on the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide in step (ii) and step (iii) will be described in detail.
The product removal reagent in step (ii) includes a hydrogen peroxide remover that removes hydrogen peroxide generated by the action of oxidase, a glucose remover that removes glucose, and an amino acid or oligopeptide that removes amino acids or oligopeptides. Examples of the removing agent include a hydrogen peroxide removing agent.
本発明の工程（iii）の生成物測定試薬としては、過酸化水素測定試薬が挙げられる。
３試薬系のキットにおいては、過酸化水素除去試薬は、第二試薬に含有される。過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合は、第三試薬はカタラーゼ活性阻害剤を含む。該カタラーゼ活性阻害剤としては、前述のカタラーゼ活性阻害剤が挙げられる。過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質と１種類の酸化カップリング型色原体を含む試薬を使用する場合、該過酸化活性物質と該酸化カップリング型色原体は、過酸化水素測定試薬の構成成分も兼ねているので、特に過酸化水素除去試薬を除去又は不活性化する必要はなく、第三試薬に、発色に必要なもう一方の酸化カップリング発色型色原体を含有させればよい。また、過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合においても、過酸化水素測定試薬中の一部の構成成分、特に、１種類の酸化カップリング型色原体は第二試薬に含有されてもよい。Examples of the product measurement reagent in step (iii) of the present invention include a hydrogen peroxide measurement reagent.
In the three-reagent kit, the hydrogen peroxide removal reagent is contained in the second reagent. When catalase is used as the hydrogen peroxide removing reagent, the third reagent contains a catalase activity inhibitor. Examples of the catalase activity inhibitor include the aforementioned catalase activity inhibitors. When a reagent containing a peroxidase active substance such as peroxidase and one oxidative coupling type chromogen is used as a hydrogen peroxide removal reagent, the peroxidative active substance and the oxidative coupling type chromogen are Since it also serves as a component of the hydrogen oxide measurement reagent, it is not necessary to remove or inactivate the hydrogen peroxide removal reagent in particular. The other oxidative coupling chromogen that is necessary for color development is used as the third reagent. May be contained. Even when catalase is used as the hydrogen peroxide removal reagent, some components in the hydrogen peroxide measurement reagent, particularly one oxidative coupling type chromogen, may be contained in the second reagent. Good.
本発明の測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、標準タンパク質等の測定用標準物質が含有されてもよい。
また本発明の測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、対象タンパク質を測定するための試薬が含有されてもよい。対象タンパク質がヘモグロビンの場合は、ヘモグロビン測定試薬としては、メトへモグロビン法、シアンメトヘモグロビン法、アザイドメトヘモグロビン法、ドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＬＳ）法、アルカリヘマチン法、緑色発色団形成法又はオキシヘモグロビン法等に用いられる公知のヘモグロビン測定試薬が挙げられる。The measurement reagent and measurement kit of the present invention may contain a measurement standard substance such as a standard protein, if necessary.
The measurement reagent and measurement kit of the present invention may contain a reagent for measuring the target protein, if necessary. When the target protein is hemoglobin, the hemoglobin measurement reagent includes methemoglobin method, cyan methemoglobin method, azide methemoglobin method, sodium dodecyl sulfonate (SLS) method, alkaline hematin method, green chromophore formation method or oxy Examples include known hemoglobin measuring reagents used in the hemoglobin method and the like.
本発明の測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、それぞれ緩衝剤、安定化剤、防腐剤、影響物質除去剤、非特異反応抑制等が含有されてもよい。緩衝剤としては、例えば前述の緩衝剤等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、アミノ酸類、アルブミン、デキストラン、塩化カルシウム及び酢酸カルシウム等の塩類等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質除去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。非特異反応抑制剤としては、デキストラン硫酸等の高分子化合物等が挙げられる。 The reagent for measurement and the kit for measurement of the present invention may each contain a buffer, a stabilizer, a preservative, an influential substance removing agent, a nonspecific reaction inhibitor, and the like, if necessary. Examples of the buffering agent include the aforementioned buffering agents. Examples of the stabilizer include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sucrose, calcium chloride, amino acids, albumin, dextran, calcium chloride, calcium acetate, and the like. Examples of the preservative include sodium azide and antibiotics. Examples of the influence substance removing agent include ascorbate oxidase for eliminating the influence of ascorbic acid. Examples of the nonspecific reaction inhibitor include polymer compounds such as dextran sulfate.
本発明の測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、反応液に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態のキットを用いる場合には、当該キットは前述の水性媒体又は反応液に溶解して使用することができる。凍結乾燥された状態のキットを用いる場合には、必要に応じて、該キットに凍結乾燥試薬を溶解するための試薬等が含有されてもよい。
本発明の測定用キットにおけるタンパク質分解酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０１〜１，０００，０００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．１〜１００，０００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。The measurement kit of the present invention may be lyophilized or dissolved in a reaction solution. In the case of using a lyophilized kit, the kit can be used by dissolving in the aforementioned aqueous medium or reaction solution. When a lyophilized kit is used, a reagent for dissolving a lyophilized reagent may be contained in the kit as necessary.
The content of the proteolytic enzyme in the measurement kit of the present invention is preferably such that the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 0.01 to 1,000,000 U / mL, and 0.1 to 100,000 U. A content of / mL is more preferable.
本発明のフルクトシルアミンオキシダーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０１〜１，０００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。
本発明のキットにおける界面活性剤の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜２０％となる含量が好ましく、０．０１〜１０％となる含量がより好ましい。The fructosylamine oxidase content of the present invention is preferably such that the concentration when dissolved in an aqueous medium is 0.01 to 1,000 U / mL, more preferably 0.1 to 100 U / mL. preferable.
The surfactant content in the kit of the present invention is preferably such that the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 0.001 to 20%, more preferably 0.01 to 10%.
過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合のキットにおけるカタラーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．１〜１０，０００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、１０〜２，０００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。また、過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合のキットにおけるカタラーゼ活性阻害剤の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が５〜６００ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量が好ましく、１〜９０ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量がより好ましい。 The content of catalase in the kit in the case of using catalase as a hydrogen peroxide removing reagent is preferably such that the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 0.1 to 10,000 U / mL, A content of 000 U / mL is more preferable. The content of the catalase activity inhibitor in the kit in the case of using catalase as a hydrogen peroxide removing reagent is preferably a content in which the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 5 to 600 mmol / L, 1 to 90 mmol A content of / L is more preferable.
過酸化水素除去試薬剤としてパーオキシダーゼと１種類の酸化カップリング型色原体を含む試薬を使用する場合のキットにおけるパーオキシダーゼ及び該酸化カップリング型色原体の含量としては、それぞれ、水性媒体で溶解された状態での濃度が１〜６００Ｕ／ｍＬ、０．０５〜８ｇ／Ｌとなる含量が好ましく、２〜１５０Ｕ／ｍＬ、０．１〜４ｇ／Ｌとなる含量がより好ましい。 In the case of using a reagent containing peroxidase and one kind of oxidative coupling type chromogen as a reagent for removing hydrogen peroxide, the content of peroxidase and the oxidative coupling type chromogen is respectively an aqueous medium. The content in which the concentration in the dissolved state is 1 to 600 U / mL and 0.05 to 8 g / L is preferable, and the content that is 2 to 150 U / mL and 0.1 to 4 g / L is more preferable.
過酸化水素測定試薬としてパーオキシダーゼと酸化カップリング型色原体を含む試薬を使用する場合のキットにおけるパーオキシダーゼ及び該酸化カップリング型色原体の含量としては、それぞれ、水性媒体で溶解された状態での濃度が１〜６００Ｕ／ｍＬ、０．５〜４０ｇ／Ｌとなる含量が好ましく、２〜１５０Ｕ／ｍＬ、１〜２０ｇ／Ｌとなる含量がより好ましい。 In the case of using a reagent containing peroxidase and an oxidative coupling type chromogen as a hydrogen peroxide measurement reagent, the content of peroxidase and the oxidative coupling type chromogen was dissolved in an aqueous medium, respectively. The content in which the concentration in the state is 1 to 600 U / mL and 0.5 to 40 g / L is preferable, and the content that is 2 to 150 U / mL and 1 to 20 g / L is more preferable.
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記の試薬を使用した。
トリス緩衝剤（和光純薬工業社製）
フルクトシルバリルヒスチジン(Fru-Val-His)（ペプチド研究所社製）
プロテアーゼN「アマノ」G（天野エンザイム社製）
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-CE（キッコーマン社製）
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOD-E（キッコーマン社製）
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOX-TE（キッコーマン社製）
西洋わさび由来パーオキシダーゼ（東洋紡績社製）
カタラーゼ（東洋紡績社製）
ＤＡ−６４（和光純薬工業社製）
ＭＣＤＰ（協和メデックス社製）
アンヒトール２０Ｎ（ドデシルジメチルアミンオキサイド；花王社製）
ニューコール７２３（ＰＯＥ多環フェニルエーテル；日本乳化剤社製）
Nonidet Ｐ−４０（ＰＯＥオクチルフェニルエーテル；Fluka社製）EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, these do not limit the scope of the present invention at all. In this example, the following reagents were used.
Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries)
Fructosylvalyl histidine (Fru-Val-His) (Peptide Institute, Inc.)
Protease N “Amano” G (Amano Enzyme)
Fructosyl peptide oxidase FPOX-CE (Kikkoman)
Fructosyl amino acid oxidase FAOD-E (Kikkoman)
Fructosyl amino acid oxidase FAOX-TE (Kikkoman)
Horseradish peroxidase (Toyobo Co., Ltd.)
Catalase (Toyobo Co., Ltd.)
DA-64 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
MCDP (manufactured by Kyowa Medex)
Amphital 20N (Dodecyldimethylamine oxide; manufactured by Kao Corporation)
New Coal 723 (POE polycyclic phenyl ether; manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.)
Nonidet P-40 (POE octyl phenyl ether; manufactured by Fluka)
フルクトシルオリゴペプチドの特異的測定（１）
下記の試薬からなるキット（コントロールキット、キットＡ、キットＢ）を調製した。尚、基質Fru-Val及びFru-Lysは、ハシバらの方法（Hashiba H, J.Agric.Food.Chem.24:70,1976）を用いて調製した。Specific measurement of fructosyl oligopeptide (1)
A kit (control kit, kit A, kit B) comprising the following reagents was prepared. Substrates Fru-Val and Fru-Lys were prepared using the method of Hashiba et al. (Hashiba H, J. Agric. Food. Chem. 24:70, 1976).
コントロールキット
第１試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
Fru-Val-His Ｘμｍｏｌ／Ｌ
（Ｘ＝０，１．４，２．８，５．６）
第２試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
第３試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-CE １０Ｕ／ｍＬ
西洋わさび由来ペルオキシダーゼ ９．７８Ｕ／ｍＬ
ＤＡ−６４ ０．０２５ｍｍｏｌ／ＬControl kit first reagent Tris buffer (pH 7.5) 100 mmol / L
Fru-Val-His Xμmol / L
(X = 0, 1.4, 2.8, 5.6)
Second reagent Tris buffer (pH 7.5) 100 mmol / L
Third reagent Tris buffer (pH 7.5) 100 mmol / L
Fructosyl peptide oxidase FPOX-CE 10U / mL
Horseradish peroxidase 9.78 U / mL
DA-64 0.025mmol / L
キットＡ
第１試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
Fru-Val ５．６μｍｏｌ／Ｌ
Fru-Lys ５．６μｍｏｌ／Ｌ
Fru-Val-His Ｘμｍｏｌ／Ｌ
（Ｘ＝０，１．４，２．８，５．６）
第２試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
第３試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-CE １０Ｕ／ｍＬ
西洋わさび由来ペルオキシダーゼ ９．７８Ｕ／ｍＬ
ＤＡ−６４ ０．０２５ｍｍｏｌ／ＬKit A
First reagent Tris buffer (pH 7.5) 100 mmol / L
Fru-Val 5.6μmol / L
Fru-Lys 5.6μmol / L
Fru-Val-His Xμmol / L
(X = 0, 1.4, 2.8, 5.6)
Second reagent Tris buffer (pH 7.5) 100 mmol / L
Third reagent Tris buffer (pH 7.5) 100 mmol / L
Fructosyl peptide oxidase FPOX-CE 10U / mL
Horseradish peroxidase 9.78 U / mL
DA-64 0.025mmol / L
キットＢ
第１試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
Fru-Val ５．６μｍｏｌ／Ｌ
Fru-Lys ５．６μｍｏｌ／Ｌ
Fru-Val-His Ｘμｍｏｌ／Ｌ
（Ｘ＝０，１．４，２．８，５．６）
第２試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOD-E １０Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ ３００Ｕ／ｍＬ
第３試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-CE １０Ｕ／ｍＬ
西洋わさび由来ペルオキシダーゼ ９．７８Ｕ／ｍＬ
ＤＡ−６４ ０．０２５ｍｍｏｌ／ＬKit B
First reagent Tris buffer (pH 7.5) 100 mmol / L
Fru-Val 5.6μmol / L
Fru-Lys 5.6μmol / L
Fru-Val-His Xμmol / L
(X = 0, 1.4, 2.8, 5.6)
Second reagent Tris buffer (pH 7.5) 100 mmol / L
Fructosyl amino acid oxidase FAOD-E 10U / mL
Catalase 300U / mL
Third reagent Tris buffer (pH 7.5) 100 mmol / L
Fructosyl peptide oxidase FPOX-CE 10U / mL
Horseradish peroxidase 9.78 U / mL
DA-64 0.025mmol / L
フルクトシルオリゴペプチドの特異的測定（２）
二種以上の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを含む試料中の測定すべきの糖化オリゴペプチドの分別測定を検証するため、実施例１の各キットを用いて、以下の実験を行った。
Fru-Val-Hisの濃度が０，１．４，２．８，５．６μｍｏｌ／Ｌとなるように調製した第１試薬４９０μＬに、第２試薬２１０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。反応液を９５℃で５分間加熱した後、氷冷した。更に、４℃で１０分間遠心分離（５，０００ｒｐｍ）し、得られた上清３５μＬに１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を１１５μＬ添加し、３７℃で１分間加温した後に７５０nmにおける吸光度（Ａ０’）を測定した。続いて、反応開始５分後に第３試薬５０μＬを添加して、続けて３７℃で５分間反応させた。反応開始１０分後に７５０nmにおける吸光度（Ａ１’）を測定した。反応吸光度ΔＡ’を以下の式Specific measurement of fructosyl oligopeptide (2)
In order to verify the fractionation measurement of the glycated oligopeptide to be measured in a sample containing two or more kinds of glycated amino acids and / or glycated oligopeptides, the following experiment was performed using each kit of Example 1.
To 490 μL of the first reagent prepared so that the concentration of Fru-Val-His is 0, 1.4, 2.8, 5.6 μmol / L, 210 μL of the second reagent is added and reacted at 37 ° C. for 5 minutes. It was. The reaction solution was heated at 95 ° C. for 5 minutes and then ice-cooled. Further, the mixture was centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes (5,000 rpm), 115 μL of 100 mmol / L Tris buffer (pH 7.5) was added to 35 μL of the obtained supernatant, and the mixture was heated at 37 ° C. for 1 minute, and then at 750 nm. Absorbance (A0 ′) was measured. Subsequently, 50 μL of the third reagent was added 5 minutes after the start of the reaction, and the reaction was continued at 37 ° C. for 5 minutes. Absorbance (A1 ′) at 750 nm was measured 10 minutes after the start of the reaction. The reaction absorbance ΔA ′ is expressed by the following formula:
により算出した。
各キットを用いた測定における測定値を第３表に示す。Calculated by
Table 3 shows the measured values in the measurement using each kit.
第３表から明らかなように、キットＡではコントロールキットに対し、反応吸光度が増大した。これは、反応液中に一定濃度で共存させたFru-Lys及びFru-Valを消去しておらず、Fru-Lys及びFru-Val由来の過酸化水素を、Fru-Val-His由来の過酸化水素と同時に測定しているためである。一方、キットＢでは、コントロールキットを用いた場合とほぼ同様の反応吸光度が得られた。これは、第２試薬中に含まれるFAOD−E及びカタラーゼを作用させることにより、反応液中に一定濃度で共存させたFru-Lys及びFru-Valを除去し、共存させたFru-Lys及びFru-Val由来の過酸化水素をほとんど測定することなく、測定対象物であるFru-Val-His由来の過酸化水素を選択的に測定していることを示唆する。 As is apparent from Table 3, the absorbance of the kit A increased with respect to the control kit. This does not erase Fru-Lys and Fru-Val coexisting at a constant concentration in the reaction solution, but converts hydrogen peroxide derived from Fru-Lys and Fru-Val to peroxidation derived from Fru-Val-His. This is because measurement is performed simultaneously with hydrogen. On the other hand, with Kit B, reaction absorbance almost the same as that obtained when the control kit was used was obtained. This is due to the action of FAOD-E and catalase contained in the second reagent, thereby removing Fru-Lys and Fru-Val coexisting at a constant concentration in the reaction solution and coexisting Fru-Lys and Fru. This suggests that the hydrogen peroxide derived from Fru-Val-His, which is the measurement object, is selectively measured without almost measuring hydrogen peroxide derived from -Val.
以上より、二種以上の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドが存在する反応液中において、測定すべき糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチド以外の糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドに作用する酵素を作用させ、反応液中に生じる生成物を除去することによって、測定すべき糖化アミノ酸及び／又は糖化オリゴペプチドを選択的に測定できることが示された。 As described above, in a reaction solution in which two or more kinds of glycated amino acids and / or glycated oligopeptides are present, the glycated amino acid to be measured and / or the enzyme acting on the glycated oligopeptide other than the glycated oligopeptide acts. It was shown that the glycated amino acid and / or glycated oligopeptide to be measured can be selectively measured by removing the product produced in the reaction solution.
ＨｂＡ１ｃ測定用キット
下記の試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第１試薬：タンパク質分解酵素を含む試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
プロテアーゼN「アマノ」Ｇ ５，０００Ｕ／ｍＬ
アンヒトール２０Ｎ ０．５％
ニューコール７２３ ０．１％
第２試薬：生成物除去試薬を含む試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOD-E １０Ｕ／ｍＬ
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOX-TE １０Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ ３００Ｕ／ｍＬ
第３試薬：生成物測定試薬を含む試薬
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
フルクトシルペプチドオキシダーゼFPOX-CE １０Ｕ／ｍＬ
西洋わさび由来ペルオキシダーゼ ９．７８Ｕ／ｍＬ
ＭＣＤＰ ０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ
Nonidet Ｐ−４０ ０．１％HbA1c measurement kit A HbA1c measurement kit comprising the following reagents was prepared.
First reagent: a reagent containing a proteolytic enzyme Tris buffer (pH 7.5) 100 mmol / L
Protease N “Amano” G 5,000 U / mL
Amhitor 20N 0.5%
New Call 723 0.1%
Second reagent: Reagent containing product removal reagent Tris buffer (pH 7.5) 100 mmol / L
Fructosyl amino acid oxidase FAOD-E 10U / mL
Fructosyl amino acid oxidase FAOX-TE 10U / mL
Catalase 300U / mL
Third reagent: Reagent containing product measurement reagent Tris buffer (pH 7.5) 100 mmol / L
Fructosyl peptide oxidase FPOX-CE 10U / mL
Horseradish peroxidase 9.78 U / mL
MCDP 0.025mmol / L
Nonidet P-40 0.1%
試料中のＨｂＡ１ｃの測定
（１）測定用試料の調製〜試料中のＨｂＡ１ｃ濃度の測定
健常人及び糖尿病患者から血液を採取、転倒混和後、全血1容に対して４容の蒸留水を添加し、標準品を得た。
また、健常人及び糖尿病患者から血液を採取、転倒混和後、２５℃で５分間遠心分離（３，０００ｒｐｍ）した。遠心分離後、下層部分の血球層を蒸留水で１００倍希釈したもの、及び蒸留水をデタミナーＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）の用法・用量に従ってＨｂＡ１ｃ（％）値を測定し、濃度を測定した。
（２）実施例３のキットを用いた試料中のＨｂＡ１ｃ（測定すべき糖化タンパク質）の測定 試料として、（１）で濃度を測定した健常人及び糖尿病患者由来の試料及び蒸留水を、測定用キットとして、実施例３のキットを用いて、各試料中のＨｂＡ１ｃ濃度を次の手順により測定した。Measurement of HbA1c in sample (1) Preparation of sample for measurement-Measurement of HbA1c concentration in sample After collecting blood from healthy subjects and diabetics, mixing by inversion, 4 volumes of distilled water are added to 1 volume of whole blood. The standard product was obtained.
In addition, blood was collected from healthy individuals and diabetic patients, mixed by inversion, and then centrifuged (3,000 rpm) at 25 ° C. for 5 minutes. After centrifugation, the HbA1c (%) value was measured according to the usage / dosage of the determiner HbA1c (manufactured by Kyowa Medex Co., Ltd.) and the lower layer blood cell layer diluted 100 times with distilled water, and the concentration was measured.
(2) Measurement of HbA1c (glycated protein to be measured) in a sample using the kit of Example 3 As a sample, a sample derived from a healthy person and a diabetic patient whose concentration was measured in (1) and distilled water were used for measurement. Using the kit of Example 3 as a kit, the HbA1c concentration in each sample was measured by the following procedure.
実施例３のキット中の第１試薬５０μＬ及び試料２０μＬを反応容器に分注し２５℃で１分間反応させた後、反応液を９５℃で５分間加熱し氷冷した。４℃で１０分間遠心分離（５，０００ｒｐｍ）し、得られた上清を以下の反応に供した。
上記上清３５μＬに第２試薬１μＬセルに分注し、３７℃で５分間反応させた後、反応液を９５℃で５分間加熱し氷冷した。更に、４℃で１０分間遠心分離（５，０００ｒｐｍ）し、得られた上清３５μＬに１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を１１５μＬ添加し、３７℃で１分間加温した後に、６６０ｎｍにおける吸光度（Ａ０Ｘ）を測定した。続いて、反応開始５分後に第３試薬５０μＬを添加して、続けて３７℃で５分間反応させた。反応開始１０分後に６６０ｎｍにおける吸光度（Ａ１Ｘ）を測定した。反応吸光度ΔＡＸは、下記の式50 μL of the first reagent and 20 μL of the sample in the kit of Example 3 were dispensed into a reaction vessel and reacted at 25 ° C. for 1 minute, and then the reaction solution was heated at 95 ° C. for 5 minutes and cooled on ice. Centrifugation (5,000 rpm) was performed at 4 ° C. for 10 minutes, and the obtained supernatant was subjected to the following reaction.
After dispensing 35 μL of the supernatant into a 1 μL cell of the second reagent and reacting at 37 ° C. for 5 minutes, the reaction solution was heated at 95 ° C. for 5 minutes and cooled on ice. Further, the mixture was centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes (5,000 rpm), and 115 μL of 100 mmol / L Tris buffer solution (pH 7.5) was added to 35 μL of the obtained supernatant. After heating at 37 ° C. for 1 minute, 660 nm Absorbance (A0 X ) was measured. Subsequently, 50 μL of the third reagent was added 5 minutes after the start of the reaction, and the reaction was continued at 37 ° C. for 5 minutes. Absorbance (A1 X ) at 660 nm was measured 10 minutes after the start of the reaction. The reaction absorbance ΔA X is the following formula:
より算出した。
（３）試料中のヘモグロビン（対象タンパク質）の測定
試料として、（１）で濃度を測定した健常人及び糖尿病患者由来の試料並びに蒸留水を、ヘモグロビン測定用キットとして、ヘモグロビンＢ−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて、各試料中のヘモグロビン濃度を、ヘモグロビンＢ−テストワコーの用法・用量に従って測定した。得られたヘモグロビン濃度より、本反応系の反応液総量２００μＬ中のヘモグロビン量（μｇ）を算出した。
（４）試料中のヘモグロビン（対象タンパク質）に対するＨｂＡ１ｃ（測定すべき糖化タンパク質）の割合の算出
（２）で得られた反応吸光度ΔＡＸを、（３）で得られたヘモグロビン量で除して、ヘモグロビン１μｇ当たりの反応吸光度（ΔＡ’Ｘ）を算出し、試料中のヘモグロビン（対象タンパク質）に対するＨｂＡ１ｃ（測定すべき糖化タンパク質）の割合の指標とした。
（５）免疫法を用いた試料中のヘモグロビン（対象タンパク質）に対するＨｂＡ１ｃ（測定すべき糖化タンパク質）の割合の算出
デタミナーＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）の用法・用量に従って、（１）で濃度を測定した各試料中のヘモグロビン（対象タンパク質）に対するＨｂＡ１ｃ（測定すべき糖化タンパク質）の割合（ＨｂＡ１ｃ％）を測定した。
（６）本発明の方法と免疫法との相関
（４）で算出したΔＡ’Ｘと、（５）で算出した割合（ＨｂＡ１ｃ％）との相関関係を図１に示す。縦軸に本発明の測定キットを用いた酵素法による測定で得られたΔＡ’Ｘを、横軸にデタミナーＨｂＡ１ｃ試薬を用いた免疫法による測定で得られたＨｂＡ１ｃ％を取り、各試料についての値をプロットしたところ、図１に示すように、両者の間で、良好な相関関係及び直線性が認められた。従って、本発明の測定方法により、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが示された。Calculated from
(3) Measurement of hemoglobin (target protein) in a sample As a sample, a sample from a healthy person and a diabetic patient whose concentration was measured in (1) and distilled water were used as a hemoglobin measurement kit. The concentration of hemoglobin in each sample was measured according to the usage and dosage of hemoglobin B-Test Wako. From the obtained hemoglobin concentration, the amount of hemoglobin (μg) in the total reaction solution volume of 200 μL of this reaction system was calculated.
(4) The reaction absorbance .DELTA.A X obtained in calculating (2) the percentage of hemoglobin in the sample (glycated protein to be determined) HbA1c for (protein of interest), by dividing the amount of hemoglobin obtained in (3) The reaction absorbance (ΔA ′ X ) per 1 μg of hemoglobin was calculated and used as an indicator of the ratio of HbA1c (glycated protein to be measured) to hemoglobin (target protein) in the sample.
(5) Calculation of the ratio of HbA1c (glycated protein to be measured) to hemoglobin (target protein) in the sample using the immunization method According to the usage and dose of Determiner HbA1c (manufactured by Kyowa Medex), measure the concentration in (1) The ratio (HbA1c%) of HbA1c (glycated protein to be measured) to hemoglobin (target protein) in each sample was measured.
(6) Correlation between the method of the present invention and the immunization method FIG. 1 shows the correlation between ΔA ′ X calculated in (4) and the ratio (HbA1c%) calculated in (5). The .DELTA.A 'X obtained in the measurement by the enzymatic method using a measurement kit of the present invention on the vertical axis, taking the HbA1c% obtained in the measurement by the horizontal axis immunization method using Determiner HbA1c reagent, for each sample When the values were plotted, as shown in FIG. 1, good correlation and linearity were observed between the two. Therefore, it was shown that HbA1c in the sample can be measured by the measurement method of the present invention.
本発明によれば、糖尿病等の疾患の診断に有用な、試料中の測定すべき糖化タンパク質の測定方法、測定用試薬及び測定用キットが提供される。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the measuring method of the glycated protein which should be measured in a sample, a measuring reagent, and a measuring kit useful for diagnosis of diseases, such as diabetes, are provided.
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