JPWO2006118131A1 - 抗不安作用を有するペプチドおよびスクリーニング方法 - Google Patents
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本発明は、抗不安作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを含有する治療剤、当該ポリペプチドを用いる不安の治療方法、当該ポリペプチドの受容体の賦活化もしくは抑制化をする不安調節に係る化合物もしくはその塩またはそれらの水和物をスクリーニングする方法およびそのスクリーニング用キットなどを提供することを目的とする。本発明によれば、リラキシン−3を含有してなる、抗不安剤が提供される。
Description
本発明は、抗不安作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを用いる不安の治療方法、当該ポリペプチドの受容体の賦活化もしくは抑制化をする不安調節に係る化合物もしくはその塩またはそれらの水和物をスクリーニングする方法およびそのスクリーニング用キットなどに関する。
脳腸管ホルモン、ケモカイン、神経ペプチドや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプターを介して機能を発揮する。これらのレセプターの中で細胞膜を7回貫通する構造を有し、細胞内で3量体Gタンパク質と共役するレセプターは特にGタンパク質共役型受容体(GPCR)と分類されている。GPCRは特異的なリガンドが結合した時に細胞内にシグナルを伝達し、細胞の賦活化や抑制化をすることで、各種臓器・器官での機能発現に重要な役割を担っている。それ故にGPCRを賦活化するアゴニストや抑制するアンタゴニストと呼ばれる物質は、医薬品として使用されている。GPCRに分類されるレセプターの中でもその特異的なリガンドが未同定のものが数多く知られており、それらはオーファンGPCRと呼ばれている。オーファンGPCRは新たな治療薬のターゲットとしての可能性を秘めており、生体内のリガンド同定や機能を賦活もしくは抑制する物質の研究が進められている。このようにして同定されたリガンドや物質を生体に投与してレセプターとそのリガンドの機能を解明することは、医薬品の開発を提供する上できわめて重要である。
近年の遺伝子配列情報の充実により、既知のタンパク質・ペプチドの配列を元にその相同性や法則性を導きだし、未知のペプチドやタンパク質を予測して、GPCRの新たなリガンドとして同定する方法も可能となった。インスリン・リラキシン(Insulin・Relaxin)ファミリーに属するリラキシンは、黄体や胎盤から産生される分泌ペプチドであり、妊娠の維持と出産に関わる作用をもつことが以前から知られていた。リラキシンをコードするDNAの塩基配列を元に遺伝子配列データベースから新たに同定されたDNAをコードするタンパク質が、リラキシン−3(Relaxin−3)(またはINSL7とも称される。)と名づけられたポリペプチドである(国際公開第01/068862号パンフレット)。成熟型または活性型のリラキシン−3は、リラキシン−3のプレプロプロテイン(preproprotein)から切断されたB鎖およびA鎖から構成され、当該B鎖および当該A鎖がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである。リラキシン−3は、免疫細胞系であるTHP−1の細胞内サイクリックAMP(cAMP)の上昇をともなって細胞を賦活化することが報告された(国際公開第01/81562号パンフレット、Bathgate et al., J. Biol. Chem., 277, p.1148-1157, 2002)。その後、リラキシン−3はリラキシン−2とともに、GPCRであるLGR7に結合するリガンドの一つであることが示されるとともに、リラキシン−3によるcAMPの上昇にはLGR7が関与していることが示された(Sudo et al., J. Biol. Chem., 278, p.7855-7862, 2003)。LGR7は脳と末梢組織に発現しており、これまでには生殖器官の発達や妊娠・出産に関わることが示唆されているが、精神症状との関連については良く分かっていない。
最近、生体内のリガンドが未同定のGPCRであった、SALPR(GPCR135)と名づけられているレセプターや、GPR100(hGPCR11、GPCR142)と呼ばれるレセプターのリガンドがリラキシン−3であることが報告された(Takeda et al., FEBS Letter, 520, p.97-101, 2002、Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003、Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003、国際公開第2004/082598号パンフレット)。また、リラキシン−3によるcAMPの低下にはSALPR(Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003)やGPR100(Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003)が関与していることが報告された。さらに、国際公開第00/24891号パンフレット、国際公開第01/48189号パンフレット、国際公開第02/31111号パンフレット、および国際公開第02/61087号パンフレットにもこれらのレセプターに関連する記載がある。SALPRは脳に局在することが知られており(Matsumoto et al., Gene, 248, p.183-189, 2000)、特に視床下部の室傍核と視索上核に存在することが報告された(国際公開第2004/082598号パンフレット、Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003)。さらに、SALPRへの選択的な結合を示すリラキシン−3とINSL5のキメラペプチドを用いて、ペプチドの脳内での結合領域を示すことでSALPRの発現を調べている報告もあるが(Sutton et al., Neuroendocrinology, 180, p.298-307, 2004)、SALPRの機能については良く分かっていない。一方、GPR100は全身性に発現しているレセプターであることが報告されている(Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50765-50770, 2003、Boels et al., Br. J. Pharamacol., 140, p.932-938, 2003)が、GPR100の機能についても不明なままである。
一方、リラキシン−3は脳内の特定の領域に存在することが報告されており(Liu et al., J. Biol. Chem., 278, p.50754-50764, 2003)、リラキシン−3が脳内ペプチドとして中枢性に何らかの機能を発揮している可能性は考えられていたが、これまでにリラキシン−3が不安やうつをはじめとする精神状態を調節するか否かについては知られていなかった。
本発明は、抗不安作用を有するポリペプチド、当該ポリペプチドを含有する治療剤、当該ポリペプチドを用いる不安の治療方法、当該ポリペプチドの受容体の賦活化もしくは抑制化をする不安調節に係る化合物もしくはその塩またはそれらの水和物をスクリーニングする方法およびそのスクリーニング用キットなどを提供することを目的とする。
本発明者は、リラキシン−3をラットまたはマウス脳室内に投与し、不安惹起作用、抗不安作用を評価するための実験系にて投与後の前記ラットまたは前記マウスの行動を観察することにより、リラキシン−3が抗不安作用を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
(1)リラキシン−3、その塩、あるいはこれらの水和物を含有する抗不安剤。
(2)リラキシン−3が、ヒト型リラキシン−3である、前記(1)に記載の抗不安剤。
(3)リラキシン−3が、リラキシン−3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖もしくはリラキシン−3のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖からなるポリペプチドであって、A鎖およびB鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、前記(1)に記載の抗不安剤。
(4)次の工程;被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体またはリラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
(4’)次の工程;被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体またはリラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
(C)リラキシン−3受容体(例えば、SALPR)を介した細胞刺激活性が、アデニル酸シクラーゼの活性抑制を示した場合に、当該被験物質が不安作用を抑制する作用を有する化合物であると判定する工程、
を含むことを特徴とする抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
(5)次の工程;
リラキシン−3、その塩、あるいはこれらの水和物と、被験物質とを、
(A)リラキシン−3受容体またはリラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする不安作用を抑制または促進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
(6)リラキシン−3が、ヒト型リラキシン−3である、前記(5)に記載のスクリーニング方法。
(7)リラキシン−3が、リラキシン−3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖もしくはリラキシン−3のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖からなるポリペプチドであって、A鎖およびB鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、前記(5)に記載のスクリーニング方法。
(8)次の工程;
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
をさらに含むことを特徴とする、前記(5)〜(7)のいずれか一項に記載の不安を抑制または亢進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
(8’)次の工程;
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
(C)リラキシン−3受容体(例えば、SALPR)を介した細胞刺激活性が、アデニル酸シクラーゼの活性抑制を示した場合に、当該被験物質が不安作用を抑制する作用を有する化合物であると判定する工程、
をさらに含むことを特徴とする、前記(5)〜(7)のいずれか一項に記載の不安を抑制する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
(9)リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記(4)、(4’)、(5)、(6)、(7)、(8)、および(8’)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
(10)SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、前記(9)に記載のスクリーニング方法。
(11)リラキシン−3受容体またはリラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を含むことを特徴とする、抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング用キット。
(12)リラキシン−3、その塩、あるいはこれらの水和物をさらに含んでなる、前記(11)に記載のスクリーニング用キット。
(13)リラキシン−3が、ヒト型リラキシン−3である、前記(12)に記載のスクリーニング用キット。
(14)リラキシン−3が、リラキシン−3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖もしくはリラキシン−3のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖からなるポリペプチドであって、A鎖およびB鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、前記(12)に記載のスクリーニング用キット。
(15)リラキシン−3が標識されている、前記(12)〜(14)のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
(16)リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする、前記(11)〜(15)のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
(17)SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、前記(16)に記載のスクリーニング用キット。
(18)リラキシン−3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の不安作用を測定する工程を含むことを特徴とする、不安作用を抑制または促進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
(19)不安作用を測定する工程が、defensive burying testまたは高架式十字迷路試験である、前記(18)に記載のスクリーニング方法。
(20)リラキシン−3受容体に作用する化合物が、前記(4)、(4’)、(5)、(6)、(7)、(8)、(8’)、(9)、および(10)のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記(18)または(19)に記載のスクリーニング方法。
(1)リラキシン−3、その塩、あるいはこれらの水和物を含有する抗不安剤。
(2)リラキシン−3が、ヒト型リラキシン−3である、前記(1)に記載の抗不安剤。
(3)リラキシン−3が、リラキシン−3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖もしくはリラキシン−3のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖からなるポリペプチドであって、A鎖およびB鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、前記(1)に記載の抗不安剤。
(4)次の工程;被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体またはリラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
(4’)次の工程;被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体またはリラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
(C)リラキシン−3受容体(例えば、SALPR)を介した細胞刺激活性が、アデニル酸シクラーゼの活性抑制を示した場合に、当該被験物質が不安作用を抑制する作用を有する化合物であると判定する工程、
を含むことを特徴とする抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
(5)次の工程;
リラキシン−3、その塩、あるいはこれらの水和物と、被験物質とを、
(A)リラキシン−3受容体またはリラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする不安作用を抑制または促進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
(6)リラキシン−3が、ヒト型リラキシン−3である、前記(5)に記載のスクリーニング方法。
(7)リラキシン−3が、リラキシン−3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖もしくはリラキシン−3のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖からなるポリペプチドであって、A鎖およびB鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、前記(5)に記載のスクリーニング方法。
(8)次の工程;
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
をさらに含むことを特徴とする、前記(5)〜(7)のいずれか一項に記載の不安を抑制または亢進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
(8’)次の工程;
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
(C)リラキシン−3受容体(例えば、SALPR)を介した細胞刺激活性が、アデニル酸シクラーゼの活性抑制を示した場合に、当該被験物質が不安作用を抑制する作用を有する化合物であると判定する工程、
をさらに含むことを特徴とする、前記(5)〜(7)のいずれか一項に記載の不安を抑制する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
(9)リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記(4)、(4’)、(5)、(6)、(7)、(8)、および(8’)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
(10)SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、前記(9)に記載のスクリーニング方法。
(11)リラキシン−3受容体またはリラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を含むことを特徴とする、抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング用キット。
(12)リラキシン−3、その塩、あるいはこれらの水和物をさらに含んでなる、前記(11)に記載のスクリーニング用キット。
(13)リラキシン−3が、ヒト型リラキシン−3である、前記(12)に記載のスクリーニング用キット。
(14)リラキシン−3が、リラキシン−3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖もしくはリラキシン−3のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖からなるポリペプチドであって、A鎖およびB鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、前記(12)に記載のスクリーニング用キット。
(15)リラキシン−3が標識されている、前記(12)〜(14)のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
(16)リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする、前記(11)〜(15)のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
(17)SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、前記(16)に記載のスクリーニング用キット。
(18)リラキシン−3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の不安作用を測定する工程を含むことを特徴とする、不安作用を抑制または促進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
(19)不安作用を測定する工程が、defensive burying testまたは高架式十字迷路試験である、前記(18)に記載のスクリーニング方法。
(20)リラキシン−3受容体に作用する化合物が、前記(4)、(4’)、(5)、(6)、(7)、(8)、(8’)、(9)、および(10)のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記(18)または(19)に記載のスクリーニング方法。
リラキシン−3
本発明のリラキシン−3は、リラキシン−3(またはINSL7とも称される。)と名づけられたポリペプチドであり、成熟型または活性型のリラキシン−3を意味する。
本発明のリラキシン−3は、リラキシン−3(またはINSL7とも称される。)と名づけられたポリペプチドであり、成熟型または活性型のリラキシン−3を意味する。
具体的には、本発明のリラキシン−3は、配列番号2のN末端から第26番目(Arg)〜第52番目(Trp)のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド(以下、単に「B鎖」と略記する場合がある。)と配列番号2のN末端から第119番目(Asp)〜第142番目(Cys)のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド(以下、単に「A鎖」と略記する場合がある。)が、B鎖およびA鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドを意味する。ジスルフィド結合は、B鎖およびA鎖のシステイン残基が、分子間および分子内で結合していることが望ましい。
より具体的には、本発明のリラキシン−3は、配列番号2のN末端から第26番目(Arg)〜第52番目(Trp)のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)と配列番号2のN末端から第119番目(Asp)〜第142番目(Cys)のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型A鎖)がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドを意味し、B鎖およびA鎖のシステイン残基が分子間および分子内でジスルフィド結合を形成しているポリペプチドである。当該ジスルフィド結合は、配列番号2のN末端から第35番目のB鎖のシステインおよび配列番号2のN末端から第129番目のA鎖のシステインが結合し、配列番号2のN末端から第47番目のB鎖のシステインおよび配列番号2のN末端から第142番目のA鎖のシステインが結合し、並びに配列番号2のN末端から第128番目のA鎖のシステインおよび配列番号2のN末端から第133番目のA鎖のシステインが結合していることが望ましい。
本発明のリラキシン−3としては、下記のものが挙げられる。(数字はジスルフィド結合するシステイン残基を示し、同じ数字同士のシステイン残基がジスルフィド結合する。)
[ヒト型リラキシン−3]
B鎖:RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW(配列番号5)
1 2
A鎖:DVLAGLSSSCCKWGCSKSEISSLC(配列番号6)
31 3 2
B鎖およびA鎖のアミノ酸配列は、本発明のリラキシン−3のプレプロプロテインのアミノ酸配列に含まれる。本発明のリラキシン−3のプレプロプロテインは、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型プレプロプロテイン)(GenBankアクセッション番号NM_080864)または当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド(以下、単に「プレプロプロテイン」と略記する場合もある。)が挙げられる。本発明のリラキシン−3は、前記プレプロプロテインから切断されたB鎖およびA鎖が、B鎖およびA鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドを含む。
[ヒト型リラキシン−3]
B鎖:RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW(配列番号5)
1 2
A鎖:DVLAGLSSSCCKWGCSKSEISSLC(配列番号6)
31 3 2
B鎖およびA鎖のアミノ酸配列は、本発明のリラキシン−3のプレプロプロテインのアミノ酸配列に含まれる。本発明のリラキシン−3のプレプロプロテインは、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型プレプロプロテイン)(GenBankアクセッション番号NM_080864)または当該ポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは当該ポリペプチドの相同ポリペプチド(以下、単に「プレプロプロテイン」と略記する場合もある。)が挙げられる。本発明のリラキシン−3は、前記プレプロプロテインから切断されたB鎖およびA鎖が、B鎖およびA鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドを含む。
本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖およびプレプロプロテインは、ヒトまたはヒト以外の生物[例えば非ヒト哺乳動物(例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に由来する天然由来のポリペプチドであっても良く、組換えポリペプチド、合成ポリペプチドであっても良い。本発明のリラキシン−3には、本発明のリラキシン−3の塩が含まれ、さらには本発明のリラキシン−3またはその塩は糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。塩については、後述の塩の記載を参照するとよい。また、本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖およびプレプロプロテインには、N末端環状グルタミン化、C末端アミド化など、分泌タンパクのプロセッシングを受けた形のポリペプチドを含む。
上述の機能的に等価な改変ポリペプチドとは、配列番号2のN末端から第26番目(Arg)〜第52番目(Trp)のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)、配列番号2のN末端から第119番目(Asp)〜第142番目(Cys)のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型A鎖)または配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型プレプロプロテイン)において、1または複数個(好ましくは1または数個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列であって、しかもB鎖およびA鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドが本発明のリラキシン−3と実質的に同じ活性[例えばリラキシン−3受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性(例えば細胞内のCa2+の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍pH変化、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosおよびc−junの誘導活性、アラキドン酸遊離など)、不安作用の調節]を有するのであれば、上述の生物由来のポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチドのいずれであってもよい。
配列番号2のN末端から第26番目(Arg)〜第52番目(Trp)のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)、配列番号2のN末端から第119番目(Asp)〜第142番目(Cys)のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型A鎖)または配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型プレプロプロテイン)のアミノ酸配列が欠失、置換および/または挿入される場合は、その位置は、特に限定されないが、前記のアミノ酸配列中のシステイン残基以外のアミノ酸残基が挙げられる。
本明細書において「置換」は、好ましくは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、1または複数個(好ましくは1または数個)のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換える保存的置換を意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行なうことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性(中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
前記の欠失、置換、挿入および/または付加されてもよいアミノ酸残基の数は、例えば1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜2個である。
上述の相同ポリペプチドとは、配列番号2のN末端から第26番目(Arg)〜第52番目(Trp)のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)、配列番号2のN末端から第119番目(Asp)〜第142番目(Cys)のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型A鎖)または配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型プレプロプロテイン)のアミノ酸配列に関して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる限り、特に限定されるものではないが、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、しかもB鎖およびA鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されていることを特徴とするポリペプチドが本発明のリラキシン−3と実質的に同じ活性(例えばリラキシン−3受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、不安作用の調節)を有するのであれば、上述の生物由来のポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチドのいずれであってもよい。
本明細書において、「相同性」(「同一性」ということがある)の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の相同性アルゴリズムBLAST(Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト(初期設定)のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
上述の機能的に等価な改変ポリペプチドまたは相同ポリペプチドのB鎖、A鎖、リラキシン−3またはプレプロプロテインの好ましい例としては、例えば、それ自体公知のマウス型、ラット型またはブタ型のB鎖、A鎖、リラキシン−3またはそのプレプロプロテイン(国際公開第01/81562号パンフレット)や、リラキシン−1、リラキシン−2、またはインスリン様ペプチド3(INSL−3)のプレプロプロテインまたはB鎖(国際公開第2006/026355号パンフレット)などが挙げられる。
「リラキシン−3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖もしくはリラキシン−3のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖からなるポリペプチドであって、A鎖およびB鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチド」は、好ましくは、本発明のリラキシン−3と実質的に同じ活性(例えばリラキシン−3受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、不安作用の調節)を有する下記(1)または(2)のポリペプチドである:
(1)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型B鎖と、配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型A鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型A鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号6のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号6のN末端から第24番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号6のN末端から第10番目のA鎖のシステインと、配列番号6のN末端から第15番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;および
(2)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型B鎖と、配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型A鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型A鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号6のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号6のN末端から第24番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号6のN末端から第10番目のA鎖のシステインと、配列番号6のN末端から第15番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド。
また、「リラキシン−3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖もしくはリラキシン−3のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖からなるポリペプチドであって、A鎖およびB鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチド」の例としては、国際公開第2006/026355号パンフレットやChanglu Liu et al., Mol Pharmacol. 67(1):231-40(2005)に開示されたリラキシン−3のキメラペプチドが挙げられる。
リラキシン−3のキメラペプチドは、好ましくは、本発明のリラキシン−3と実質的に同じ活性(例えばリラキシン−3受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、不安作用の調節)を有する以下(3)〜(10)のポリペプチドである:
(3)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型B鎖と、配列番号7のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型リラキシン−1のA鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型リラキシン−1のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号7のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号7のN末端から第24番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号7のN末端から第10番目のA鎖のシステインと、配列番号7のN末端から第15番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;
(4)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型B鎖と、配列番号7のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型リラキシン−1のA鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型リラキシン−1のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号7のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号7のN末端から第24番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号7のN末端から第10番目のA鎖のシステインと、配列番号7のN末端から第15番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;
(5)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型B鎖と、配列番号8のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型リラキシン−2のA鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型リラキシン−2のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号8のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号8のN末端から第24番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号8のN末端から第10番目のA鎖のシステインと、配列番号8のN末端から第15番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;
(6)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型B鎖と、配列番号8のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型リラキシン−2のA鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型リラキシン−2のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号8のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号8のN末端から第24番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号8のN末端から第10番目のA鎖のシステインと、配列番号8のN末端から第15番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;
(7)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型B鎖と、配列番号9のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型インスリン様ペプチド3の改変A鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型インスリン様ペプチド3のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号9のN末端から第9番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号9のN末端から第22番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号9のN末端から第8番目のA鎖のシステインと、配列番号9のN末端から第13番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;
(8)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型B鎖と、配列番号9のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型インスリン様ペプチド3の改変A鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型インスリン様ペプチド3のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号9のN末端から第9番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号9のN末端から第22番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号9のN末端から第8番目のA鎖のシステインと、配列番号9のN末端から第13番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;
(9)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型B鎖と、配列番号10のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型インスリン様ペプチド6の改変A鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型インスリン様ペプチド6のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号10のN末端から第7番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号10のN末端から第20番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号10のN末端から第6番目のA鎖のシステインと、配列番号10のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;および
(10)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型B鎖と、配列番号10のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型インスリン様ペプチド6の改変A鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型インスリン様ペプチド6のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号10のN末端から第7番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号10のN末端から第20番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号10のN末端から第6番目のA鎖のシステインと、配列番号10のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド。
(1)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型B鎖と、配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型A鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型A鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号6のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号6のN末端から第24番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号6のN末端から第10番目のA鎖のシステインと、配列番号6のN末端から第15番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;および
(2)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型B鎖と、配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型A鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型A鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号6のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号6のN末端から第24番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号6のN末端から第10番目のA鎖のシステインと、配列番号6のN末端から第15番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド。
また、「リラキシン−3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖もしくはリラキシン−3のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖からなるポリペプチドであって、A鎖およびB鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチド」の例としては、国際公開第2006/026355号パンフレットやChanglu Liu et al., Mol Pharmacol. 67(1):231-40(2005)に開示されたリラキシン−3のキメラペプチドが挙げられる。
リラキシン−3のキメラペプチドは、好ましくは、本発明のリラキシン−3と実質的に同じ活性(例えばリラキシン−3受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、不安作用の調節)を有する以下(3)〜(10)のポリペプチドである:
(3)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型B鎖と、配列番号7のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型リラキシン−1のA鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型リラキシン−1のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号7のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号7のN末端から第24番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号7のN末端から第10番目のA鎖のシステインと、配列番号7のN末端から第15番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;
(4)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型B鎖と、配列番号7のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型リラキシン−1のA鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型リラキシン−1のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号7のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号7のN末端から第24番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号7のN末端から第10番目のA鎖のシステインと、配列番号7のN末端から第15番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;
(5)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型B鎖と、配列番号8のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型リラキシン−2のA鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型リラキシン−2のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号8のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号8のN末端から第24番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号8のN末端から第10番目のA鎖のシステインと、配列番号8のN末端から第15番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;
(6)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型B鎖と、配列番号8のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型リラキシン−2のA鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型リラキシン−2のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号8のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号8のN末端から第24番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号8のN末端から第10番目のA鎖のシステインと、配列番号8のN末端から第15番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;
(7)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型B鎖と、配列番号9のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型インスリン様ペプチド3の改変A鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型インスリン様ペプチド3のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号9のN末端から第9番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号9のN末端から第22番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号9のN末端から第8番目のA鎖のシステインと、配列番号9のN末端から第13番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;
(8)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型B鎖と、配列番号9のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型インスリン様ペプチド3の改変A鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型インスリン様ペプチド3のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号9のN末端から第9番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号9のN末端から第22番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号9のN末端から第8番目のA鎖のシステインと、配列番号9のN末端から第13番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;
(9)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型B鎖と、配列番号10のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型インスリン様ペプチド6の改変A鎖)またはそのアミノ酸配列において、1または複数個(好ましくは1または数個、より好ましくは1、2、3、または4個、さらに好ましくは、1または2個、特に好ましくは1個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加された改変ヒト型インスリン様ペプチド6のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号10のN末端から第7番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号10のN末端から第20番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号10のN末端から第6番目のA鎖のシステインと、配列番号10のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド;および
(10)配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型B鎖と、配列番号10のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型インスリン様ペプチド6の改変A鎖)またはそのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同ヒト型インスリン様ペプチド6のA鎖とからなるポリペプチドであって、配列番号5のN末端から第10番目のB鎖のシステインと、配列番号10のN末端から第7番目のA鎖のシステインとが結合し、配列番号5のN末端から第22番目のB鎖のシステインと、配列番号10のN末端から第20番目のA鎖のシステインとが結合し、そして配列番号10のN末端から第6番目のA鎖のシステインと、配列番号10のN末端から第11番目のA鎖のシステインとが結合しているポリペプチド。
リラキシン−3のキメラペプチドは、より好ましくは、下記のものが挙げられる。(数字はジスルフィド結合するシステイン残基を示し、同じ数字同士のシステイン残基がジスルフィド結合する。)これらのキメラペプチドは、SALPR(GPCR135)、GPR100(GPCR142)、およびLGR7に対するリガンド活性が確認されている(国際公開第2006/026355号パンフレットおよびChanglu Liu et al., Mol Pharmacol. 67(1):231-40(2005))。
[ヒト型B鎖とヒト型リラキシン−1のA鎖とのキメラペプチド]
B鎖:RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW(配列番号5)
1 2
A鎖:RPYVALFEKCCLIGCTKRSLAKYC(配列番号7)
31 3 2
[ヒト型B鎖とヒト型リラキシン−2のA鎖とのキメラペプチド]
B鎖:RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW(配列番号5)
1 2
A鎖:QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(配列番号8)
31 3 2
[ヒト型B鎖とヒト型インスリン様ペプチド3の改変A鎖とのキメラペプチド]
B鎖:RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW(配列番号5)
1 2
A鎖:ATNPARYCCLSGCTQQDLLTLC(配列番号9)
31 3 2
[ヒト型B鎖とヒト型インスリン様ペプチド6の改変A鎖とのキメラペプチド]
B鎖:RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW (配列番号5)
1 2
A鎖:GYSEKCCLTGCTKEELSIAC(配列番号10)
31 3 2
本発明において用いられるリラキシン−3は、また、リラキシン−3と実質的に同じ活性を有するのであれば、B鎖およびA鎖の分子内あるいは分子間で、ジスルフィド結合あるいはそれ以外の結合形式により、結合していてもよい。このようなペプチドの例は、国際公開第2004/113381号パンフレット、Halls et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 313, p.677-687,2005、 Rosengren et al., J. Biol. Chem., 281, p.5845-5851,2006、Bathgate et al., Biochemistry, 45, p.1043-1053,2006などに記載されている。
[ヒト型B鎖とヒト型リラキシン−1のA鎖とのキメラペプチド]
B鎖:RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW(配列番号5)
1 2
A鎖:RPYVALFEKCCLIGCTKRSLAKYC(配列番号7)
31 3 2
[ヒト型B鎖とヒト型リラキシン−2のA鎖とのキメラペプチド]
B鎖:RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW(配列番号5)
1 2
A鎖:QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(配列番号8)
31 3 2
[ヒト型B鎖とヒト型インスリン様ペプチド3の改変A鎖とのキメラペプチド]
B鎖:RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW(配列番号5)
1 2
A鎖:ATNPARYCCLSGCTQQDLLTLC(配列番号9)
31 3 2
[ヒト型B鎖とヒト型インスリン様ペプチド6の改変A鎖とのキメラペプチド]
B鎖:RAAPYGVRLCGREFIRAVIFTCGGSRW (配列番号5)
1 2
A鎖:GYSEKCCLTGCTKEELSIAC(配列番号10)
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本発明において用いられるリラキシン−3は、また、リラキシン−3と実質的に同じ活性を有するのであれば、B鎖およびA鎖の分子内あるいは分子間で、ジスルフィド結合あるいはそれ以外の結合形式により、結合していてもよい。このようなペプチドの例は、国際公開第2004/113381号パンフレット、Halls et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 313, p.677-687,2005、 Rosengren et al., J. Biol. Chem., 281, p.5845-5851,2006、Bathgate et al., Biochemistry, 45, p.1043-1053,2006などに記載されている。
本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインは、種々の公知の方法、例えば遺伝子工学的手法、合成法などによって得ることができる。具体的には、遺伝子工学的手法の場合、本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することによって調製することができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。
リラキシン−3をコードするポリヌクレオチド
本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインをコードするポリヌクレオチド(以下、単に「本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチド」と略記する場合もある。)は、本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、DNAおよびRNAの両方を意味する。
本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインをコードするポリヌクレオチド(以下、単に「本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチド」と略記する場合もある。)は、本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、DNAおよびRNAの両方を意味する。
本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号1の5'末端から第76番目(c)〜第156番目(g)の塩基配列からなるポリヌクレオチド(ヒト型B鎖をコードするポリヌクレオチド)、配列番号1の5'末端から第355番目(g)〜第426番目(c)の塩基配列からなるポリヌクレオチド(ヒト型A鎖をコードするポリヌクレオチド)、配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド(ヒト型プレプロプロテインをコードするポリヌクレオチド)とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインと実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本明細書において、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、具体的には、FASTA、BLAST、Smith−Waterman(Meth. Enzym., 164, 765, 1988)などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト(初期設定)のパラメーターを用いて計算したときに、配列番号1の5'末端から第76番目(c)〜第156番目(g)の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号1の5'末端から第355番目(g)〜第426番目(c)の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは配列番号1で表される塩基配列と少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上の相同性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントな条件下」とは、当業者が通常使用し得るハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が40℃〜70℃、好ましくは60℃〜65℃などで反応を行い、塩濃度が15〜300mmol/L、好ましくは15〜60mmol/Lなどの洗浄液中で洗浄する方法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプローブの長さに応じて適宜調整することが可能である。
本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドは、例えば天然由来のものであることもできるし、または全合成したものであることもできる。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたはcDNAライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインの部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当なDNAプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。
B鎖(配列番号2のN末端から第26番目(Arg)〜第52番目(Trp)のアミノ酸配列を含むポリペプチド)をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号1の5'末端から第76番目(c)〜第156番目(g)の塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
A鎖(配列番号2のN末端から第119番目(Asp)〜第142番目(Cys)のアミノ酸配列を含むポリペプチド)をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号1の5'末端から第355番目(g)〜第426番目(c)の塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
プレプロプロテイン(配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド)をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号1で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
プラスミド
前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のような本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。また、分離および精製の操作を容易にするために、必要に応じて本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインを切り出す融合タンパク質として発現することのできるプラスミドであってもよい。
前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のような本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。また、分離および精製の操作を容易にするために、必要に応じて本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインを切り出す融合タンパク質として発現することのできるプラスミドであってもよい。
形質転換体
また、前記形質転換体も、上記のような本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明のリラキシン−3を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。また、別の態様によれば、前記形質転換体は、B鎖、A鎖が切り出される切断部位に作用するプロテアーゼを発現するプラスミドを同時に含んでいてもよい。
また、前記形質転換体も、上記のような本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明のリラキシン−3を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。また、別の態様によれば、前記形質転換体は、B鎖、A鎖が切り出される切断部位に作用するプロテアーゼを発現するプラスミドを同時に含んでいてもよい。
前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌(例えばEscherichia coli JM109株)または酵母(例えばSaccharomyces cerevisiae W303株)、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞(例えばCHO細胞、HEK−293細胞、またはCOS細胞)または昆虫細胞(例えばBmN4細胞)を挙げることができる。
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、pUC、pTV、pGEX、pKK、またはpTrcHisを;酵母に対しては、pEMBLYまたはpYES2を;CHO細胞、HEK−293細胞およびCOS細胞に対しては、pcDNA3、pMAMneoまたはpBabe Puroを;BmN4細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス(BmNPV)のポリヘドリンプロモーターを有するベクター(例えばpBK283)を挙げることができる。
前記形質転換体を、本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインをコードするRNAを注入し、本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。
本発明のリラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインを、前記形質転換体の培養物から取得する場合は、培養後に、菌体、細胞または培養液を集め、分離および精製の公知の方法を組合せ、リラキシン−3、B鎖、A鎖またはプレプロプロテインの生化学的性質または物理的性質などを利用しながら行なうことができる。例えば、限外濾過、液体クロマトグラフィー(例えば、アフィニティクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー(HPLC)など)、透析法などの技術を利用することができる。
本発明のリラキシン−3のB鎖およびA鎖をそれぞれ独立に調製した場合、または融合タンパク質からB鎖またはA鎖を切り出して調製する場合は、生産されたまたは切り出されたB鎖およびA鎖を、常法に従い、単離精製し、それぞれ同士をジスルフィド結合で結合させることもできる。
リラキシン−3を含有する医薬組成物
定義
本願明細書において、「精神状態」とは、例えば、不安、緊張、抑うつ状態を意味する。
定義
本願明細書において、「精神状態」とは、例えば、不安、緊張、抑うつ状態を意味する。
本願明細書において、「不安(anxiety)」とは、身体的微候(例えば発汗、頻拍、早められた呼吸、震え)を伴う感覚(例えば危惧、恐怖)で表される感情状態、不快な情緒状態を意味する。不安は正常な感情であるが、重篤になれば不安障害になるため、前記不安には不安障害も含まれる。不安障害には、例えば広場恐怖をもつまたはもたないパニック障害、パニック障害の病歴をもたない広場恐怖(Agoraphobia)、特別な恐怖症、例えば、特定動物恐怖症、社会恐怖症、強迫性、外傷性ストレス障害および急性ストレス障害を含むストレス障害、アルコール、薬物(例えばアンフェタミン、カフェイン、***、コカイン、幻覚剤、吸入剤、フェンシクジン(phencychdine))、鎮静剤、催眠薬、不安解薬、その他物質により引き起こされる不安障害、不安または不安と抑うつの両者を伴う不安障害を含む。不安または不安障害はしばしば、他の病気(例えば精神疾患、免疫疾患、代謝疾患、消化管疾患など)および症状と関連しているか、または、そのような他の症状によって引き起こされるものを含む。不安は、他の障害、例えば抑うつ障害における抑うつを伴ってまたは伴わないで存在しうる。
本願明細書において、「抑うつ(depression)」とは、悲観的な悩み、激しい悲しみ、失望、動揺、精神活動の遅延、集中力の低下および卑下の感情状態を意味する。抑うつは程度によっては、食欲不振、体重減少、過食、不眠、過眠症、性的衝動、正常な概日性リズム(例えば、体温、内分泌機能)の破壊を生じる状態を含む。
本発明のリラキシン−3または本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドは、精神状態の治療、好ましくは不安の治療の抗不安剤として用いることができる。例えば、それらは、精神状態の調節、好ましくは不安作用の調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、他の病気(例えば精神疾患、免疫疾患、代謝疾患、消化管疾患など)および症状と関連しているか、または、そのような他の症状によって引き起こされる不安の治療、アルコール、薬物等の他物質によって引き起こされる不安障害の治療、検査時または手術前後における不安の緩化の治療に用いることができる。また、それらは不安症状を伴う精神疾患の治療、リラキシン−3またはリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬としても用いることができる。
具体的には、不安作用とは、不快な情緒状態であって、しばしば恐怖によって引き起こされるものに似た生理学的変化や行動を伴うことから、抗不安作用を有するリラキシン−3は、ヒトまたはヒト以外の生物の精神状態を安定化させる作用を有する。例えば、不安症、全般性不安障害、パニック障害、恐怖症、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害、心的外傷後ストレス障害の治療、精神疾患(例えばうつ病、抑うつ症状、双極性障害、循環性格、感情障害、情緒障害、睡眠障害、統合失調症)、免疫疾患(例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症)、代謝疾患(例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害、拒食症)、消化管疾患(例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群)、AIDS、癌、悪液質)およびそのような症状と関連しているか、または、そのような症状によって引き起こされる不安の治療、アルコール、薬物(例えばアンフェタミン、カフェイン、***、コカイン、幻覚剤、吸入剤、フェンシクジン(phencychdine))、鎮静剤、催眠薬、不安解薬により引き起こされる不安障害の治療に用いることができる。また、不安症状を伴う精神疾患(例えばうつ病、抑うつ症状、双極性障害、循環性格、感情障害、情緒障害、睡眠障害、統合失調症)の治療にも用いることができる。
前記疾患の治療の医薬として使用するにあたり、本発明のリラキシン−3または本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドは塩を形成していてもよく、さらにそれらは水和物を形成していてもよく、本発明に含まれる。前記疾患の治療の医薬として使用するにあたり、本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドは、単独または適当なベクターに挿入して、あるいは、シグナル配列、ポリペプチド安定化配列などの配列を付加して用いることができる。前記ベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、プラスミド、ファージミド、コスミドなどの公知のものを使用することができる。本発明のリラキシン−3または本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドもしくはその塩またはそれらの水和物は単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬組成物として用いることもできる。
本願明細書における前記の「塩」とは、本発明のリラキシン−3または本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドと塩を形成し、かつ薬学的に許容され得る塩であれば特に限定されないが、好ましくはハロゲン化水素酸塩(例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など)、無機酸塩(例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など)有機カルボン酸塩(例えば酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など)、有機スルホン酸塩(例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など)、アミノ酸塩(例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など)、四級アミン塩、アルカリ金属塩(例えばナトリウム塩、カリウム塩など)、アルカリ土類金属塩(マグネシウム塩、カルシウム塩など)などが挙げられ、当該「薬学的に許容され得る塩」として、より好ましくは、トリフルオロ酢酸塩、塩酸塩、シュウ酸塩、などである。
この時の有効成分の担体に対する割合は、1〜90重量%の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物[例えば非ヒト哺乳動物(例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に、種々の形態、経口または非経口(例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与)のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明のリラキシン−3またはリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クエン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のリラキシン−3または本発明のリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドの選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。適当な投与量は患者の体重1kgあたり例えば約0.1〜500μg、好ましくは約0.1〜100μg、より好ましくは1〜50μg程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
リラキシン−3受容体を用いた精神状態の調節に係る化合物のスクリーニング方法
リラキシン−3受容体
本発明のリラキシン−3に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明のリラキシン−3と結合活性を有し、リラキシン−3受容体発現細胞の細胞刺激活性(例えば細胞内のCa2+の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍pH変化、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosおよびc−junの誘導活性、アラキドン酸遊離など)を有するものであれば、その起源は特に限定されず、例えばヒトまたはヒト以外の生物[例えば非ヒト哺乳動物(例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]のリラキシン−3受容体を発現する臓器、組織、細胞などの天然由来のもの、公知の遺伝子工学的手法、合成法などにより人為的に調製したものも包含される。また、リラキシン−3受容体の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えば本発明のリラキシン−3に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。この場合、部分ポリペプチドを構成するアミノ酸数は、リラキシン−3受容体のアミノ酸数の90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%または5%である。
リラキシン−3受容体
本発明のリラキシン−3に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明のリラキシン−3と結合活性を有し、リラキシン−3受容体発現細胞の細胞刺激活性(例えば細胞内のCa2+の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍pH変化、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosおよびc−junの誘導活性、アラキドン酸遊離など)を有するものであれば、その起源は特に限定されず、例えばヒトまたはヒト以外の生物[例えば非ヒト哺乳動物(例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]のリラキシン−3受容体を発現する臓器、組織、細胞などの天然由来のもの、公知の遺伝子工学的手法、合成法などにより人為的に調製したものも包含される。また、リラキシン−3受容体の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えば本発明のリラキシン−3に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。この場合、部分ポリペプチドを構成するアミノ酸数は、リラキシン−3受容体のアミノ酸数の90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%または5%である。
具体的には、リラキシン−3受容体として、報告されている公知の受容体、例えばLGR7(GenBankアクセッション番号NM_021634)、SALPR(GenBankアクセッション番号NM_016568)(GPCR135とも称されている。)またはGPR100(GenBankアクセッション番号AB_083593)(hGPCR11、GPCR142とも称されている。)などを使用することが可能である。
SALPRを用いた不安作用の調節に係る化合物のスクリーニング方法
以下、本願明細書においては、本発明の好ましい一例として、SALPRを使用し、精神状態の調節、例えば不安作用の調節(不安作用を抑制または促進する)に係る化合物のスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、SALPRまたはその部分ポリペプチドに結合し、不安作用の調節(不安作用を抑制または促進する)に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、SALPRまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、当該被験物質に不安作用を抑制または促進する作用を有するか否かを決定することができる。
以下、本願明細書においては、本発明の好ましい一例として、SALPRを使用し、精神状態の調節、例えば不安作用の調節(不安作用を抑制または促進する)に係る化合物のスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、SALPRまたはその部分ポリペプチドに結合し、不安作用の調節(不安作用を抑制または促進する)に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、SALPRまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、当該被験物質に不安作用を抑制または促進する作用を有するか否かを決定することができる。
ここで、本発明のSALPRまたはその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法により得ることができ、例えば本発明のSALPRをコードするポリヌクレオチド(GenBankアクセッション番号NM_016568)を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。また別の態様として、公知のポリペプチドの合成法により得ることができ、例えば液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。さらに、別の態様によれば、SALPRの部分ポリペプチドは、SALPRを適当なタンパク質分解酵素で切断することによって調製することができる。別の態様によれば、SALPRの部分ポリペプチドは、結合活性部位を有する部分ポリペプチドを調製するのが好ましい。
本発明のSALPRをコードするポリペプチドは、配列番号4で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号4で表されるアミノ酸配列に関して、70%以上の相同性、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、そして最も好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、しかもSALPRと実質的に同じ活性(例えばリラキシン−3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または不安作用の調節)を有するポリペプチドを意味する。
ここで、配列番号4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列が、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて1または複数個(好ましくは1または数個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列であって、しかもSALPRと実質的に同じ活性(例えばリラキシン−3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または不安作用の調節)を有するポリペプチドを意味する。
さらに、SALPRの部分ポリペプチドも、SALPRと実質的に同じ活性(例えばリラキシン−3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または不安作用の調節)を有する限り、使用することができる。SALPRの部分ポリペプチドには、リラキシン−3との結合活性部位を有する部分ポリペプチドを使用することができる。
以下、遺伝子工学的手法について、より具体的にはSALPRを使用する場合について詳述するが、その部分ポリペプチドについても、後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されない。
SALPRの調製方法
SALPRをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、その培養物から所望のポリペプチドを精製しないで調製したものを用いても良いし、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することにより調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインA結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。
SALPRをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、その培養物から所望のポリペプチドを精製しないで調製したものを用いても良いし、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から所望のポリペプチドを分離および精製することにより調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインA結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥などを挙げることができる。
SALPRをコードするポリヌクレオチド
本発明のSALPRをコードするポリヌクレオチドは、本発明のSALPRをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
本発明のSALPRをコードするポリヌクレオチドは、本発明のSALPRをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、DNAおよびRNAの両方が含まれる。本発明のSALPRをコードするポリヌクレオチドには、具体的には下記の(a)〜(e)からなる群より選択されるものが挙げられる。
(a)配列番号3で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド;
(b)「配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;
(c)「配列番号4で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;
(d)「配列番号4で表されるアミノ酸配列の1または複数個(好ましくは1または数個)の箇所において、1または複数個(好ましくは1または数個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;および(e)「配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。
(a)配列番号3で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド;
(b)「配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;
(c)「配列番号4で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;
(d)「配列番号4で表されるアミノ酸配列の1または複数個(好ましくは1または数個)の箇所において、1または複数個(好ましくは1または数個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド;および(e)「配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。
本発明の一つの態様によれば、本発明のSALPRをコードするポリヌクレオチドは、配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号3で表される前記ポリヌクレオチドは、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるSALPRをコードする。
本発明の別の一つの態様によれば、本発明のSALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号4で表されるアミノ酸配列の1または複数個(好ましくは1または数個)の箇所において、1または複数個(好ましくは1または数個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および/または付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜2個である。
本発明の別の一つの態様によれば、本発明のSALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。さらに、本発明の別の一つの態様によれば、本発明のSALPRをコードするポリヌクレオチドは、「配列番号3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、前記SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。
プラスミド
前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のようなSALPRをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。
前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のようなSALPRをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。
形質転換体
また、前記形質転換体も、上記のようなSALPRをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、SALPRを発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
また、前記形質転換体も、上記のようなSALPRをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、SALPRを発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌(例えばEscherichia coli JM109株)または酵母(例えばSaccharomyces cerevisiae W303株)、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞(例えばCHO細胞、HEK−293細胞、またはCOS細胞)または昆虫細胞(例えばBmN4細胞)を挙げることができる。
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、pUC、pTV、pGEX、pKK、またはpTrcHisを;酵母に対しては、pEMBLYまたはpYES2を;CHO細胞、HEK−293細胞およびCOS細胞に対しては、pcDNA3、pMAMneoまたはpBabe Puroを;BmN4細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス(BmNPV)のポリヘドリンプロモーターを有するベクター(例えばpBK283)を挙げることができる。
SALPRを含有する細胞は、SALPRを細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなく、例えば前記形質転換体(すなわち、SALPRをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞)を、SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、SALPRをコードするRNAを注入し、SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできる。
細胞膜画分
また、SALPRを含有する本発明の細胞膜画分は、例えば本発明によるSALPRを発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー(例えばPotter−Elvehiem型ホモジナイザー)で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーまたはポリトロン(Kinematica社)による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。
また、SALPRを含有する本発明の細胞膜画分は、例えば本発明によるSALPRを発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー(例えばPotter−Elvehiem型ホモジナイザー)で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーまたはポリトロン(Kinematica社)による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。
SALPRを介する、本発明による不安作用を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法では、SALPRまたは前記細胞(すなわち、SALPRを含有する細胞)もしくは前記細胞膜画分(すなわち、SALPRを含有する細胞膜画分)を用いることができる。
また、本発明によるスクリーニング方法においては、第一の態様として、被験物質がSALPRに特異的に結合するか否かを調べる方法と、第二の態様として、SALPRに被験物質が結合することにより生じる細胞刺激活性(例えば細胞内のCa2+の遊離、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍pH変化、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosおよびc−junの誘導活性、アラキドン酸遊離など)を調べる方法とが挙げられ、それらを利用することができる。
本発明によるスクリーニング方法の第一の態様では、例えばSALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質とを接触させ、SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、被験物質が結合するか否かを分析することにより、SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と、標識した本発明のリラキシン−3とを接触させ、前記条件下におけるSALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と当該リラキシン−3の特異的結合量を比較することにより、SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を有する場合には、被験物質非存在下におけるSALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と当該リラキシン−3の特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。
本発明によるスクリーニング方法において、SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分と本発明のリラキシン−3の特異的結合量を比較する場合には、当該リラキシン−3として、標識した当該リラキシン−3を用いることができる。前記指標としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、[3H]、[14C]、[125I]、[35S]などを用いることができる。前記酵素としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルオレセイソチオシアネート、BODIPYなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、本発明のリラキシン−3と標識物質を結合させるためにビオチン−アビジンの系、リラキシン−3に対する抗体を用いることもできる。
このように、本発明によるスクリーニング方法において、SALPRまたは前記細胞もしくは前記細胞膜画分に結合して、これらと本発明のリラキシン−3との結合を阻害する化合物を、SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別せずにスクリーニングすることができる。
本発明によるスクリーニング方法における第二の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した本発明のリラキシン−3とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する当該リラキシン−3の特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における当該リラキシン−3の特定の細胞刺激活性を比較することにより、SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。
前記態様においては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、SALPRを介する不安作用を抑制する化合物として選択することができる。
一方、前記態様において、前記細胞と当該リラキシン−3との結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しない被験物質を、SALPRを介する不安作用を促進する化合物として選択することができる。
本発明によるスクリーニング方法は、細胞刺激活性として、例えばアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用することによって実施することができる。
この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデニル酸シクラーゼの活性化によって細胞内に生成するcAMPを公知の手法で測定すればよく、SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、SALPRに本発明のリラキシン−3が結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、SALPRの細胞刺激活性の一つであるアデニル酸シクラーゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、SALPRに当該リラキシン−3が結合すると、SALPRに共役しているGタンパク質ファミリーの一つであるGiファミリーが、アデニル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリックAMP(cAMP:アデニル酸シクラーゼによりATPから生成される)量を減少させることによる。
例えばSALPRを細胞膜上に発現(好ましくは、SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)した哺乳動物由来細胞(例えばHEK−293細胞もしくはCHO細胞)にアデニル酸シクラーゼの活性化剤[例えばフォルスコリン(FSK)]を添加すると、細胞内のcAMPの濃度が上昇する。
また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン−3を加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン−3が本発明によるSALPRに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、cAMPの生成量が減少する。従って、不安作用を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系でSALPRを介する当該リラキシン−3に代わり、被験物質を単独で接触させてcAMPの生成量を減少させる(すなわち当該リラキシン−3と同様の作用を有する)化合物を選択すると良い。
不安作用を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン−3、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン−3の作用でcAMPの生成量が減少するが、被験物質が当該リラキシン−3の作用に拮抗する場合には、cAMP生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は不安作用を促進する化合物として選択できる。
細胞内cAMP量を測定する方法としては、例えばイムノアッセイなどがあるが、例えば市販のcAMP定量キットを使用することもできる。
別の態様のスクリーニング方法においては、例えばSALPRを細胞膜上に発現(好ましくは、SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)し、しかも、cAMP応答配列(CRE)が5’上流に位置するレポーター遺伝子(例えばアルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子など、またはGFP(Green Fluorescent Protein)などの蛍光タンパク質遺伝子など)を含有する細胞(以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある)を用いることにより、SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述のcAMPの生成が減少するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されているCREをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。
以下、前記態様による、SALPRを介する不安作用を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。
すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されているCREは、細胞内のcAMPの濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群(cAMP誘導性遺伝子)の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデニル酸シクラーゼの活性化剤(例えばFSK)をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内のcAMPの濃度が上昇し、その結果、CREの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。
また、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、本発明のリラキシン−3を加えると、アデニル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデニル酸シクラーゼ活性促進に加え、当該リラキシン−3が本発明によるSALPRに作用して生じるアデニル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従って、不安作用を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で、SALPRを介する当該リラキシン−3に代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる(すなわち当該リラキシン−3と同様の作用を有する)化合物を選択すると良い。
不安作用を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、本発明のリラキシン−3、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、当該リラキシン−3の作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少するが、被験物質が当該リラキシン−3の作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は不安作用を促進する化合物として選択できる。
被験物質による作用が、SALPRに対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞(すなわち、SALPRを細胞膜上に発現し、しかも、CREが5’上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞)を用いた前記試験と並行して、コントロール用細胞(例えばCREが5’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、SALPRを細胞膜上に発現していない細胞)を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被験物質による作用が、SALPRに対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被験物質による作用が、SALPRに対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。
また、別の態様として、被験物質、好ましくは上記のスクリーニング方法により選択される被験物質(以下、単に「被験物質」と略記する場合がある。)を被験動物、例えばヒトまたはヒト以外の生物[例えば非ヒト哺乳動物(例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に投与し、投与後の行動観察、自発運動量、血中パラメーター(例えば、血中や脳内のホルモンや分泌ペプチドの量など)の変動などの指標を解析することにより不安作用の調節に影響を与える化合物(すなわち、不安作用を抑制または促進する化合物)を確認および決定することができる。具体的には、Defensive buryingテスト(Treitら、Pharamacology Biochemistry and Behavior, 15, p.619-626, 1981)、オープンフィールド試験、明暗試験、高架式十字迷路試験、Geller−Seifter型コンフリクトテスト、Vogel型コンフリクトテスト、social interaction試験、Hole−board試験、Marble burying試験、恐怖条件付けストレス試験、強制水泳試験、tail suspension試験による行動観察をすることができる。非ヒト哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物または遺伝子改変動物が挙げられる。
被験物質の投与形態としては、経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。被験物質の被験動物の脳室内への投与方法は、薬物などを脳室内の所定の位置へ投与する際の常法に従えばよく、限定はされない。
例えば、まず被験動物を麻酔した上で、ガイドカニューレを所定の位置に固定する手術を施しておき、適当な回復期間(例えば7日間〜14日間、好ましくは少なくとも1週間程度)の経過後、ガイドカニューレにインジェクションニードルを挿し込み、還流ポンプを接続したマイクロシリンジを用い、上記ニードルを介して被験物質を投与することが好ましい。被験物質の投与量は、限定はされず、適宜設定できる。被験物質は、一般的には人工的脳脊髄液(artificial cerebrospinal fluid)または生理食塩水などを用いて所望の濃度の溶液として調製しておく。人工的脳脊髄液としては、公知の常用されているものを用いればよく、限定はされないが、例えば、aCSF(glucose 10mM、KCl 2mM、NaCl 115mM、CaCl2 2.5mM、MgSO4 1.2mM、NaHCO3 25mM、KH2PO4 2.2mM;pH7.4)などが好ましい。被験物質の投与回数は1日あたり一回でも数回に分けても良く、被験物質を投与する期間や観察する期間は1日から数週間にわたってもよい。
リラキシン−3の被験動物への投与方法などは、前記の被験物質の場合と同様の方法が好ましい。また、リラキシン−3の被験動物の脳室内への投与方法も、前記の被験物質と同様に、一般的には人工的脳脊髄液を用いて所望の濃度の溶液となるよう調製しておくことが好ましい。
被験物質
ここで、上述の被験物質はどのような化合物であってもよいが、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、核酸(オリゴDNA、オリゴRNA)、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞(微生物、植物細胞、動物細胞)抽出液、細胞(微生物、植物細胞、動物細胞)培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物など由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを挙げることができる。当該化合物は塩を形成してもよく、さらに当該化合物およびその塩は水和物を形成していてもよく、これらは本発明の被験物質に含まれる。
ここで、上述の被験物質はどのような化合物であってもよいが、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、核酸(オリゴDNA、オリゴRNA)、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞(微生物、植物細胞、動物細胞)抽出液、細胞(微生物、植物細胞、動物細胞)培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物など由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを挙げることができる。当該化合物は塩を形成してもよく、さらに当該化合物およびその塩は水和物を形成していてもよく、これらは本発明の被験物質に含まれる。
本願明細書において被験化合物の「塩」とは、薬学的に許容される塩を示し、化合物と薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定されない。具体的には、例えば好ましくはハロゲン化水素酸塩(例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など)、無機酸塩(例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など)、有機カルボン酸塩(例えば酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など)、有機スルホン酸塩(例えばメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など)、アミノ酸塩(例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩など)、四級アミン塩、アルカリ金属塩(例えばナトリウム塩、カリウム塩など)、アルカリ土類金属塩(例えばマグネシウム塩、カルシウム塩など)などが挙げられる。
スクリーニング用キット
本発明のスクリーニング用キットは、リラキシン−3受容体または前記細胞(すなわち、リラキシン−3受容体を含有する細胞)もしくは前記細胞膜画分(すなわち、リラキシン−3受容体を含有する細胞膜画分)と、場合によっては、リラキシン−3とを少なくとも含有する。当該リラキシン−3は、標識した当該リラキシン−3であってもよい。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えば結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および/または器具などをさらに含むことができる。ここで、リラキシン−3受容体の好適な例は、SALPRである。
本発明のスクリーニング用キットは、リラキシン−3受容体または前記細胞(すなわち、リラキシン−3受容体を含有する細胞)もしくは前記細胞膜画分(すなわち、リラキシン−3受容体を含有する細胞膜画分)と、場合によっては、リラキシン−3とを少なくとも含有する。当該リラキシン−3は、標識した当該リラキシン−3であってもよい。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えば結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および/または器具などをさらに含むことができる。ここで、リラキシン−3受容体の好適な例は、SALPRである。
本発明の別の態様のスクリーニング用キットは、本発明のリラキシン−3、およびリラキシン−3受容体を細胞膜上に発現(好ましくは、リラキシン−3受容体を含む発現ベクターを導入して過剰に発現)し、しかも、cAMP応答配列(CRE)が5’上流に位置するレポーター遺伝子(例えば、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など)を含有する細胞とを少なくとも含有する。前記スクリーニング用キットは、所望により、種々の試薬、例えばレポーター遺伝子産物(例えば、アルカリフォスファターゼもしくはルシフェラーゼなど)の基質、アデニル酸シクラーゼ活性化剤(例えばFSK)、結合反応用緩衝液、洗浄用緩衝液、説明書、および/または器具などをさらに含むことができる。また、前記スクリーニング用キットは、CREが5’上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、リラキシン−3受容体を細胞膜上に発現していない細胞を含んでいてもよい。
ここで、リラキシン−3受容体の好適な例は、SALPRである。
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医薬組成物
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物は、精神状態の調節、好ましくは不安作用の調節(不安作用を抑制または促進する)に係る化合物である。当該化合物は塩を形成してもよく、さらに当該化合物およびその塩は水和物を形成していてもよい。
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物は、精神状態の調節、好ましくは不安作用の調節(不安作用を抑制または促進する)に係る化合物である。当該化合物は塩を形成してもよく、さらに当該化合物およびその塩は水和物を形成していてもよい。
従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物は、精神状態の治療、好ましくは不安の治療の抗不安剤として用いることができる。例えば、それらは、精神状態の調節、好ましくは不安作用の調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、他の病気(例えば精神疾患、免疫疾患、代謝疾患、消化管疾患など)および症状と関連しているか、または、そのような他の症状によって引き起こされる不安の治療、アルコール、薬物等の他物質によって引き起こされる不安障害の治療、検査時または手術前後における不安の緩化の治療に用いることができる。また、それらは、不安症状を伴う精神疾患の治療、リラキシン−3またはリラキシン−3をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬にも用いることができる。
具体的には、不安作用とは、不快な情緒状態であって、しばしば恐怖によって引き起こされるものに似た生理学的変化や行動を伴うことから、不安作用を抑制する化合物は、ヒトまたはヒト以外の生物の精神状態を安定化させる作用を有する。従って、例えば不安症、全般性不安障害、パニック障害、恐怖症、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害、心的外傷後ストレス障害の治療、精神疾患(例えばうつ病、抑うつ症状、双極性障害、循環性格、感情障害、情緒障害、睡眠障害、統合失調症)、免疫疾患(例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症)、代謝疾患(例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害、拒食症)、消化管疾患(例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群)、AIDS、癌、悪液質)およびそのような症状と関連しているか、または、そのような症状によって引き起こされる不安の治療、アルコール、薬物(例えばアンフェタミン、カフェイン、***、コカイン、幻覚剤、吸入剤、フェンシクジン(phencychdine))、鎮静剤、催眠薬、不安解薬により引き起こされる不安障害の治療に用いることができる。また、不安症状を伴う精神疾患(例えばうつ病、抑うつ症状、双極性障害、循環性格、感情障害、情緒障害、睡眠障害、統合失調症)の治療にも用いることができる。
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、1〜90重量%の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物[例えば非ヒト哺乳動物(例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、イヌなど)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に、種々の形態、経口または非経口(例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与)のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤などによる経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤などによる非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クエン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物もしくはその塩またはそれらの水和物の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重1kgあたり例えば約1.0〜1,500μg、好ましくは約10〜500μg程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および/または症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病および/または疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒という点では治療的である。本明細書において「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば以下の(a)〜(c)の治療を含む:
(a)疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを予防すること;
(b)疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること;
(c)疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。
(a)疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを予防すること;
(b)疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること;
(c)疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。
[実施例1]SALPRをコードするポリヌクレオチドの調製
SALPRをコードするポリヌクレオチドの単離は、配列番号3で表される塩基配列を基にして、以下のように行った。配列番号3では1410塩基対が示されており、SALPRをコードする領域は、1番目から1407番目(1410塩基対,469アミノ酸残基)とされている(GenBank アクセッション番号NM_016568)。PCR(polymerase chain reaction)により遺伝子を単離するために、配列番号11および配列番号12で表されるPCRプライマーを常法に従い作製した。
SALPRをコードするポリヌクレオチドの単離は、配列番号3で表される塩基配列を基にして、以下のように行った。配列番号3では1410塩基対が示されており、SALPRをコードする領域は、1番目から1407番目(1410塩基対,469アミノ酸残基)とされている(GenBank アクセッション番号NM_016568)。PCR(polymerase chain reaction)により遺伝子を単離するために、配列番号11および配列番号12で表されるPCRプライマーを常法に従い作製した。
human genomic DNA(Roche Diagostics社)を鋳型として、配列番号11および配列番号12の組合せからなるPCRプライマーと、Expand High Fidelity PCR System(Roche Diagnostics社)を用い、(98℃ 1分−57℃ 1分−72℃ 3分)を添付の操作方法に従い、30回繰り返すことによりPCRを行った。その結果、約1,400塩基対のDNA断片を得た。
このDNA断片を、pCR2.1(Invitrogen社)に挿入し、ABI prism DNA sequencing kit(Perkin−Elmer Applied Biosystems社)により配列を確認した。その結果、配列番号11および12からなるプライマーの組合せによって得られたpCR2.1−SALPRに挿入された1410塩基対の配列は、配列番号3における361番目から1770番目と長さは同一であったが、配列中には1つの変異が見られた。この変異は、該当部位の核酸配列から翻訳されるアミノ酸には影響を与えないことは明らかであったので、SALPRをコードするポリヌクレオチドを得ることができた。
[実施例2]レトロウイルスベクタープラスミドの調製
pBabe Puro(Morgenstern, J.P. and Land, H. Nucleic Acids Res.,18, p.3587-3596, 1990)(配列番号13)からSalIおよびClaIで切断することによりSV40 promoter−puro(r)領域を除き、末端をKlenow fragmentにより平滑化した。ここへpIREShyg(Clontech社)からNsiIおよびXbaIで切断することによりIRES−hyg(r)領域を切り出し、T4ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入しpBabeXIHを得た。
pBabe Puro(Morgenstern, J.P. and Land, H. Nucleic Acids Res.,18, p.3587-3596, 1990)(配列番号13)からSalIおよびClaIで切断することによりSV40 promoter−puro(r)領域を除き、末端をKlenow fragmentにより平滑化した。ここへpIREShyg(Clontech社)からNsiIおよびXbaIで切断することによりIRES−hyg(r)領域を切り出し、T4ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入しpBabeXIHを得た。
pBabeXIHからSspIおよびBamHIで切断することにより5’−LTR−packaging signalを除いた。ここへpCLXSN(IMGENEX社)からSspIおよびBamHIで切断することにより切り出した5’LTR−CMV promoter−packaging signalを挿入しpBabeCLXIHを得た。
[実施例3]SALPR遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの調製
前記実施例2に記載のレトロウイルス発現用プラスミドpBabeCLXIHを制限酵素HpaIで切断した。ここへ前記実施例1で得たpCR2.1−SALPRからEcoRVで切断することによりSALPRをコードするポリヌクレオチドを切り出し、T4ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入しpBabeCL(SALPR)IHを得た(図1)。
前記実施例2に記載のレトロウイルス発現用プラスミドpBabeCLXIHを制限酵素HpaIで切断した。ここへ前記実施例1で得たpCR2.1−SALPRからEcoRVで切断することによりSALPRをコードするポリヌクレオチドを切り出し、T4ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入しpBabeCL(SALPR)IHを得た(図1)。
[実施例4]SALPR遺伝子導入用レトロウイルスベクターの調製
2×106個の293−EBNA細胞(Invitrogen社)を10cmコラーゲンコートディッシュ(IWAKI社)でDMEM(Sigma社)−10% fetal bovine serum (FCS)−ペニシリン(penicillin) 100units/mL ストレプトマイシン(streptomycin) 100μg/ml(PS)(以下、「EBNA培養液」と称する)10mLを用いて培養した。翌日、pV−gp(pVPack−GP(Stratagene社)からNsiIおよびXbaIで切断することによりIRES−hisDを除きT4ポリメラーゼによる平滑化後、自己環化したもの)、pVPack−VSV−G(Stratagene社)、および実施例3で得たSALPR遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミド(pBabeCL(SALPR)IH)それぞれ3.3μgをリポフェクション試薬であるTransIT(Panvera社)を用いて、前記293−EBNA細胞にトランスフェクションした。その6〜12時間後にEBNA培養液を交換し、37℃で培養を続けた。
2×106個の293−EBNA細胞(Invitrogen社)を10cmコラーゲンコートディッシュ(IWAKI社)でDMEM(Sigma社)−10% fetal bovine serum (FCS)−ペニシリン(penicillin) 100units/mL ストレプトマイシン(streptomycin) 100μg/ml(PS)(以下、「EBNA培養液」と称する)10mLを用いて培養した。翌日、pV−gp(pVPack−GP(Stratagene社)からNsiIおよびXbaIで切断することによりIRES−hisDを除きT4ポリメラーゼによる平滑化後、自己環化したもの)、pVPack−VSV−G(Stratagene社)、および実施例3で得たSALPR遺伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミド(pBabeCL(SALPR)IH)それぞれ3.3μgをリポフェクション試薬であるTransIT(Panvera社)を用いて、前記293−EBNA細胞にトランスフェクションした。その6〜12時間後にEBNA培養液を交換し、37℃で培養を続けた。
トランスフェクション2日後に培養液を回収し、1,200×gで10分間遠心した。
その上清を0.45μmのフィルター(Millipore社)でろ過したものを非濃縮レトロウイルスベクターとして、さらにウイルスベクターの濃縮を以下のように行った。
超遠心用チューブ50 Ultra−Clear Tubes(Beckman社)を70%エタノールで消毒後に蒸留水ですすぎ、ここへ非濃縮ウイルスベクター約35mLを入れた。これを超遠心ローターSW28(Beckman社)に入れ、超遠心装置XL−90(Beckman社)を使って19,500rpm 100分間の遠心操作を行った。遠心後、上清を捨てたチューブを氷に入れて放置した。1時間後、チューブ壁面に残った培養液約100μL程度の濃縮ウイルスベクター溶液が得られた。
[実施例5]サイクリックAMP応答配列を含むレポーター系導入細胞SE302の構築
(1)サイクリックAMP応答配列を含むレポーターDNAの作成
公表された論文(Durocher et al. Anal Biochem 2000 284(2):316-26)を参考にcAMPに応じた転写がみられるunitを以下のように構築した。
(1)サイクリックAMP応答配列を含むレポーターDNAの作成
公表された論文(Durocher et al. Anal Biochem 2000 284(2):316-26)を参考にcAMPに応じた転写がみられるunitを以下のように構築した。
cAMP responsive element(CRE)を含むunitの作成のために、CREx2hb用として配列番号14および配列番号15、CREx2bp用として配列番号16および配列番号17で表されるオリゴDNAを常法に従い作成した。
それぞれの組合せからなるオリゴDNAを95℃に熱処理後、徐々に温度を室温まで下げることにより二本鎖DNA(CREx2hb、CREx2bp)を形成させた。CREx2hbをHindIII,BamHI、CREx2bpをBamHI,PstIで消化するとともに、pBluescriptIISK(+)(Stratagene社)をHindIII,PstIで消化した。消化したDNAを電気泳動して両端に制限酵素消化部位をもつDNAを精製した後、これら3つのDNA(CREx2hb、CREx2bp、pBluescriptIISK(+))を一度に連結し(ligation)、得られたプラスミドの配列を解析して、CRE4/pBluescriptIISKを作成した。
次にVIP(vasoactive intestinal peptide)プロモーターを含むDNAを得るために配列番号18および配列番号19で表されるPCRプライマーを常法に従い作成した。
Human genomic DNA(Roche Diagostics社)を鋳型とし、配列番号18および配列番号19の組合せからなるPCRプライマーと、recombinant Taq polymerase(Takara社)を用いて(94℃ 30秒−55℃ 30秒−72℃ 1分)を35回繰り返すことによりPCRしたところ、264塩基対のDNA(配列番号20)が得られた。この264塩基対のDNAをPstIで消化するとともにCRE4/pBluescriptIISK(+)のPstIサイトに挿入し、得られたプラスミドの配列を確認してCRE4VIP/pBluescriptIISK(+)を作成した(図2A)。得られたCRE4VIP/pBluescriptIISK(+)からHindIIIとSmaIで消化した後、得られたCRE4VIPプロモーター断片の末端平滑化を行なった。
前述の発現用ウイルスベクタープラスミドpBabeCLXIHよりIRES〜hygro(r)領域を除去したpBabeCLXを作成した(図2B)。pBabeCLXよりレトロウイルス本来のエンハンサー活性(LTR)中のNheI〜NarI領域を除去することによって得られた外来性プロモーター導入用レトロウイルスベクタープラスミドに、CREとVIPプロモーターを含む配列と、レポーター遺伝子である胎盤由来アルカリフォスファターゼ(PLAP)(Goto et al., Molecular Pharmacology, 49, p.860-873, 1996)を導入し、pBabeCLcre4vPdNNを得た(図2C)。
(2)サイクリックAMP応答配列を含むレポーター系導入細胞SE302の樹立
サイクリックAMP応答配列によりレポーター遺伝子PLAPが誘導されるレトロウイルスベクタープラスミドpBabeCLcre4vPdNNを用い、実施例4に記載の方法に準じてレトロウイルスベクターを調製した。調製したレトロウイルスベクターをHEK293細胞に導入し、限界希釈法により細胞をクローン化して、PLAP誘導の反応性が最も良かったクローン(以下、「SE302細胞」と称する)を以下の実験に供した。
サイクリックAMP応答配列によりレポーター遺伝子PLAPが誘導されるレトロウイルスベクタープラスミドpBabeCLcre4vPdNNを用い、実施例4に記載の方法に準じてレトロウイルスベクターを調製した。調製したレトロウイルスベクターをHEK293細胞に導入し、限界希釈法により細胞をクローン化して、PLAP誘導の反応性が最も良かったクローン(以下、「SE302細胞」と称する)を以下の実験に供した。
[実施例6]SALPR遺伝子導入用レトロウイルスベクターによるSALPR発現細胞の調製
前記の実施例4で調製したレトロウイルスベクターによる細胞へのSALPR遺伝子導入を以下のように行った。
前記の実施例4で調製したレトロウイルスベクターによる細胞へのSALPR遺伝子導入を以下のように行った。
前記実施例5で構築した3×103個のSE302細胞を96well plate(旭テクノガラス社)にDMEM(SIGMA社)−10% fetal bovine serum (FCS)−PS(以下、「培養液」と称する)100μLを用いて培養した。翌日、実施例4で調製したレトロウイルスベクターを適宜希釈し、その100μLを培養液で調製したpolybrene(最終濃度8μg/mL)(別名 hexadimethrine bromide Sigma社)とともにSE302細胞に加えた。その翌日、培養液を500μg/mLのハイグロマイシン(Hygromycin)(Invitrogen社)含有の培養液200μLと交換し培養した。この条件で増殖してきたSALPR遺伝子導入SE302細胞(以下、「SALPR−SE302細胞」と称する)を適時継代して実験に供した。
[実施例7]SALPR−SE302細胞におけるフォルスコリン添加によって増加させた転写活性のリラキシン−3による抑制
前記実施例6で構築したSALPR−SE302細胞を、転写活性測定用培地(DMEM−10%FBS(65℃にて30分非働化)を加えたもの)にて縣濁した後、96 well plate(Beckton Dickison社)に1穴あたり1×104細胞となるようにまいた。翌日、アッセイ用培地(DMEMに0.1%ウシ血清アルブミンを加えたもの)で希釈した各濃度のヒト型リラキシン−3(Phoenix Pharamaceuticals社)またはインスリン(Invitrogen社)を添加し、その後フォルスコリン(Carbio Chem社)を最終濃度1μmol/Lとなるように添加した。さらに一日培養後、細胞上清を15μL回収して化学発光測定用の96well plate(住友ベークライト社)に移し、アッセイ用緩衝液(280mmol/L Na2CO3−NaHCO3、8mmol/L MgSO4、pH10)を60μL、Lumiphos530(Lumigen社)70μLを添加して、室温にて1時間反応させた後、各wellの化学発光をFusionプレートリーダー(Perkin Elmer社)にて測定し転写活性量とした。フォルスコリン1μmol/Lを添加した細胞上清の転写活性を100%とし、フォルスコリンを添加していない細胞の上清の活性を0%として各被験サンプルを加えた細胞上清中の活性を%で表示した(図3)。
前記実施例6で構築したSALPR−SE302細胞を、転写活性測定用培地(DMEM−10%FBS(65℃にて30分非働化)を加えたもの)にて縣濁した後、96 well plate(Beckton Dickison社)に1穴あたり1×104細胞となるようにまいた。翌日、アッセイ用培地(DMEMに0.1%ウシ血清アルブミンを加えたもの)で希釈した各濃度のヒト型リラキシン−3(Phoenix Pharamaceuticals社)またはインスリン(Invitrogen社)を添加し、その後フォルスコリン(Carbio Chem社)を最終濃度1μmol/Lとなるように添加した。さらに一日培養後、細胞上清を15μL回収して化学発光測定用の96well plate(住友ベークライト社)に移し、アッセイ用緩衝液(280mmol/L Na2CO3−NaHCO3、8mmol/L MgSO4、pH10)を60μL、Lumiphos530(Lumigen社)70μLを添加して、室温にて1時間反応させた後、各wellの化学発光をFusionプレートリーダー(Perkin Elmer社)にて測定し転写活性量とした。フォルスコリン1μmol/Lを添加した細胞上清の転写活性を100%とし、フォルスコリンを添加していない細胞の上清の活性を0%として各被験サンプルを加えた細胞上清中の活性を%で表示した(図3)。
その結果、フォルスコリンによる転写活性の上昇をリラキシン−3はSALPRの活性化を介して抑制することが分かった。この転写活性の上昇は関連ペプチドであるインスリンでは影響がなかったので、リラキシン−3特異的な反応であることが分かった。すなわちこの実験系を用いることで、リラキシン−3によるSALPRの活性化に影響を与える化合物、物質を判別できることが示された。
[実施例8]Defensive buryingテストを用いたリラキシン−3脳室内投与による抗不安作用(ラット)
Defensive buryingテスト(Treit et al., Pharamacology Biochemistry and Behavior, 15, p.619-626, 1981)を用いて、リラキシン−3の不安作用へ及ぼす影響を調べた。Defensive buryingテストは、被験動物に電極を介して電流刺激を与えると、その直後から電極を床敷きで覆い隠す行動をとることを利用して、不安作用やその他の精神症状(例えば うつ状態)を評価する実験系である。
Defensive buryingテスト(Treit et al., Pharamacology Biochemistry and Behavior, 15, p.619-626, 1981)を用いて、リラキシン−3の不安作用へ及ぼす影響を調べた。Defensive buryingテストは、被験動物に電極を介して電流刺激を与えると、その直後から電極を床敷きで覆い隠す行動をとることを利用して、不安作用やその他の精神症状(例えば うつ状態)を評価する実験系である。
リラキシン−3は、株式会社ペプチド研究所にて合成されたヒト型リラキシン−3(以下、単に「ヒト型リラキシン−3(ペプチド研究所社製)」と略記する場合もある。)を用いて実験を行った。ヒト型リラキシン−3は、配列番号2のN末端から第26番目(Arg)〜第52番目(Trp)のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型B鎖)と配列番号2のN末端から第119番目(Asp)〜第142番目(Cys)のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヒト型A鎖)が、配列番号2のN末端から第35番目のB鎖のシステインおよび配列番号2のN末端から第129番目のA鎖のシステインが結合し、配列番号2のN末端から第47番目のB鎖のシステインおよび配列番号2のN末端から第142番目のA鎖のシステインが結合し、並びに配列番号2のN末端から第128番目のA鎖のシステインおよび配列番号2のN末端から第133番目のA鎖のシステインが結合しているポリペプチドである。
(1)被験ラットと脳室内投与のための前処置
F344雄性ラット(7週齢、日本チャールスリバー(株))に実験動物用飼料MF(オリエンタル酵母社)を与えて馴化した。ラット(150〜200g)を麻酔下で、側脳室にカニューレを挿入した。その後一週間以上、前記ラットを飼育した後にリラキシン−3の投与実験を行った。
F344雄性ラット(7週齢、日本チャールスリバー(株))に実験動物用飼料MF(オリエンタル酵母社)を与えて馴化した。ラット(150〜200g)を麻酔下で、側脳室にカニューレを挿入した。その後一週間以上、前記ラットを飼育した後にリラキシン−3の投与実験を行った。
(2)試験箱への馴化
Defensive buryingテスト実施の3日前より毎日一回、5cmの高さまで床敷きを敷いた試験箱に被験ラットを導入し30分間以上放置して、被験ラットを試験環境へ馴化させた。テスト実施時まで試験箱には刺激用電極を取り付けず被験ラットを環境に馴化させた。
Defensive buryingテスト実施の3日前より毎日一回、5cmの高さまで床敷きを敷いた試験箱に被験ラットを導入し30分間以上放置して、被験ラットを試験環境へ馴化させた。テスト実施時まで試験箱には刺激用電極を取り付けず被験ラットを環境に馴化させた。
(3)リラキシン−3溶液の調製
ヒト型リラキシン−3(ペプチド研究所社製)を生理食塩水にて溶解した後、最終濃度0.05nmol/ラットまたは1nmol/ラットとなるように調製した。
ヒト型リラキシン−3(ペプチド研究所社製)を生理食塩水にて溶解した後、最終濃度0.05nmol/ラットまたは1nmol/ラットとなるように調製した。
(4)リラキシン−3溶液の脳室内投与
ガイドカニューレを装着した被験ラットを3群に分け、ヒト型リラキシン−3投与液(0.05nmol/ラット、N=6、1nmol/ラット、N=8)もしくはvehicle(生理食塩水、N=6)各5μLを5μL/2分の速度でインフュージョンポンプを用いて投与した。
ガイドカニューレを装着した被験ラットを3群に分け、ヒト型リラキシン−3投与液(0.05nmol/ラット、N=6、1nmol/ラット、N=8)もしくはvehicle(生理食塩水、N=6)各5μLを5μL/2分の速度でインフュージョンポンプを用いて投与した。
(5)Defensive buryingtestの実施と行動観察
試験当日は、刺激用電極を取り付けた試験箱(床敷きの高さ5cm)に被験ラットを導入して実験を開始する。被験ラットが刺激用電極に触れた際に5mAの電気ショックが与えられる。その後、刺激用電極に5mA の電流を通電したまま被験ラットを放置し、15分間(900秒)の行動観察を開始した。被験ラットの行動は全てビデオカメラにて撮影し、録画テープを用いて、最初の電気ショックを受けてから15分間における覆い隠し行動時間(buryingtime(秒))を測定した。なお、覆い隠し行動は、被験ラットが前足を用いて電極方向へ向けて床敷きをかける行動と定義した。ヒト型リラキシン−3投与群とvehicle群との比較には、Dunnett型多重比較検定法による有意差検定を行った。図中において*は、P<0.05を示す。図4に示されるように、vehicle投与群に比べてヒト型リラキシン−3投与群で、覆い隠し行動時間の低下が見られ、1nmol投与群では有意な減少が観察された。この結果から、リラキシン−3が抗不安作用を有することが明らかとなった。
試験当日は、刺激用電極を取り付けた試験箱(床敷きの高さ5cm)に被験ラットを導入して実験を開始する。被験ラットが刺激用電極に触れた際に5mAの電気ショックが与えられる。その後、刺激用電極に5mA の電流を通電したまま被験ラットを放置し、15分間(900秒)の行動観察を開始した。被験ラットの行動は全てビデオカメラにて撮影し、録画テープを用いて、最初の電気ショックを受けてから15分間における覆い隠し行動時間(buryingtime(秒))を測定した。なお、覆い隠し行動は、被験ラットが前足を用いて電極方向へ向けて床敷きをかける行動と定義した。ヒト型リラキシン−3投与群とvehicle群との比較には、Dunnett型多重比較検定法による有意差検定を行った。図中において*は、P<0.05を示す。図4に示されるように、vehicle投与群に比べてヒト型リラキシン−3投与群で、覆い隠し行動時間の低下が見られ、1nmol投与群では有意な減少が観察された。この結果から、リラキシン−3が抗不安作用を有することが明らかとなった。
[実施例9]高架式十字迷路を用いたリラキシン−3脳室内投与による抗不安作用(マウス)
高架式十字迷路を用いて、リラキシン−3の不安作用へ及ぼす影響を調べた。高架式十字迷路試験は、オープンアームにおける探索行動(オープンアーム滞在時間など)を指標にして、実験動物(例えば、ラットまたはマウス)の不安水準の測定や抗不安薬の薬効評価に広く用いられる行動薬理学的試験である。
(1)被験マウスと脳室内投与のための前処置
麻酔下の7週令のBALB/c雄性マウス(日本チャールスリバー(株))の側脳室にカニューレを挿入した。その後一週間以上マウスを飼育した後にリラキシン−3の投与実験を行った。
高架式十字迷路を用いて、リラキシン−3の不安作用へ及ぼす影響を調べた。高架式十字迷路試験は、オープンアームにおける探索行動(オープンアーム滞在時間など)を指標にして、実験動物(例えば、ラットまたはマウス)の不安水準の測定や抗不安薬の薬効評価に広く用いられる行動薬理学的試験である。
(1)被験マウスと脳室内投与のための前処置
麻酔下の7週令のBALB/c雄性マウス(日本チャールスリバー(株))の側脳室にカニューレを挿入した。その後一週間以上マウスを飼育した後にリラキシン−3の投与実験を行った。
(2)リラキシン−3溶液の調製
ヒト型リラキシン−3(ペプチド研究所社製)を生理食塩水にて溶解した後、最終濃度が1nmol/マウスになるように調製した。
ヒト型リラキシン−3(ペプチド研究所社製)を生理食塩水にて溶解した後、最終濃度が1nmol/マウスになるように調製した。
(3)リラキシン−3溶液の脳室内投与
ガイドカニューレを装着した被験マウスに、ヒト型リラキシン−3投与液(N=8)もしくはvehicle(生理食塩水)(N=9)各2μLを1μL/分の速度でインフュージョンポンプを用いて脳室内に投与した。
ガイドカニューレを装着した被験マウスに、ヒト型リラキシン−3投与液(N=8)もしくはvehicle(生理食塩水)(N=9)各2μLを1μL/分の速度でインフュージョンポンプを用いて脳室内に投与した。
(4)抗不安作用の測定
抗不安作用の測定は高架式十字迷路を用いて行った。迷路は床から45cmの高さに設置し、中心に位置する中心プラットフォーム(5cm×5cm)からそれぞれ広がった2つの対立するオープンアーム(長さ30cm×幅5cm)と2つの対立するクローズドアーム(長さ30cm×幅5cm×壁高さ15cm)からなっている。照明はオープンアームの床面が60〜80ルクスになるようにセットした。試験は、脳室内投与10分後にマウスを一方のオープンアームに頭が向くように中心プラットフォームに置いて、5分間行った。試験時間は午前11時から16時に限定した。マウスの行動はビデオで記録し、試験終了後ビデオ解析により、各マウスのオープンおよびクローズドアームへの進入回数、オープンおよびクローズドアームでの滞在時間を測定した。図5および図6に、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計、5分間中のオープンアームに滞在した割合(%)をそれぞれ示した。ヒト型リラキシン−3投与群とvehicle群との比較には、t検定法による有意差検定を行った。図中において*は、P<0.05を示す。図5に示されるように、ヒト型リラキシン−3投与群とvehicle群間でのオープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計に差はなかった。しかしながら図6に示されるように、ヒト型リラキシン−3投与群はvehicle群と比較して、オープンアーム内の滞在時間の割合が有意に高かった。この結果から、リラキシン−3には抗不安作用があることが示された。
抗不安作用の測定は高架式十字迷路を用いて行った。迷路は床から45cmの高さに設置し、中心に位置する中心プラットフォーム(5cm×5cm)からそれぞれ広がった2つの対立するオープンアーム(長さ30cm×幅5cm)と2つの対立するクローズドアーム(長さ30cm×幅5cm×壁高さ15cm)からなっている。照明はオープンアームの床面が60〜80ルクスになるようにセットした。試験は、脳室内投与10分後にマウスを一方のオープンアームに頭が向くように中心プラットフォームに置いて、5分間行った。試験時間は午前11時から16時に限定した。マウスの行動はビデオで記録し、試験終了後ビデオ解析により、各マウスのオープンおよびクローズドアームへの進入回数、オープンおよびクローズドアームでの滞在時間を測定した。図5および図6に、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計、5分間中のオープンアームに滞在した割合(%)をそれぞれ示した。ヒト型リラキシン−3投与群とvehicle群との比較には、t検定法による有意差検定を行った。図中において*は、P<0.05を示す。図5に示されるように、ヒト型リラキシン−3投与群とvehicle群間でのオープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計に差はなかった。しかしながら図6に示されるように、ヒト型リラキシン−3投与群はvehicle群と比較して、オープンアーム内の滞在時間の割合が有意に高かった。この結果から、リラキシン−3には抗不安作用があることが示された。
[実施例10]高架式十字迷路を用いたリラキシン−3脳室内投与による抗不安作用(ラット)
高架式十字迷路を用いて、リラキシン−3の不安作用へ及ぼす影響を調べた。
(1)被験ラットと脳室内投与のための前処置
麻酔下の9週令のWistar雄性ラット(日本チャールスリバー(株))の側脳室にカニューレを挿入した。その後一週間以上飼育した後にリラキシン−3の投与実験を行った。
高架式十字迷路を用いて、リラキシン−3の不安作用へ及ぼす影響を調べた。
(1)被験ラットと脳室内投与のための前処置
麻酔下の9週令のWistar雄性ラット(日本チャールスリバー(株))の側脳室にカニューレを挿入した。その後一週間以上飼育した後にリラキシン−3の投与実験を行った。
(2)リラキシン−3溶液の調製
ヒト型リラキシン−3(ペプチド研究所社製)を生理食塩水にて溶解した後、最終濃度が10pmol/ラットまたは50pmol/ラットになるように調製した。
ヒト型リラキシン−3(ペプチド研究所社製)を生理食塩水にて溶解した後、最終濃度が10pmol/ラットまたは50pmol/ラットになるように調製した。
(3)リラキシン−3溶液の脳室内投与
ガイドカニューレを装着した被験ラットに、ヒト型リラキシン−3投与液(10pmol/ラット、N=8、50pmol/ラット、N=7)、もしくはvehicle群(生理食塩水、N=7)各5μLを2.5μL/分の速度でインフュージョンポンプを用いて投与した。
ガイドカニューレを装着した被験ラットに、ヒト型リラキシン−3投与液(10pmol/ラット、N=8、50pmol/ラット、N=7)、もしくはvehicle群(生理食塩水、N=7)各5μLを2.5μL/分の速度でインフュージョンポンプを用いて投与した。
(4)抗不安作用の測定
抗不安作用の測定は高架式十字迷路を用いて行った。迷路は床から50cmの高さに設置し、中心に位置する中心プラットフォーム(10cm×10cm)からそれぞれ広がった2つの対立するオープンアーム(長さ50cm×幅10cm)および2つの対立するクローズドアーム(長さ50cm×幅10cm×壁高さ40cm)からなっている。照明はオープンアームの床面が60〜80ルクスになるようにセットした。試験は、脳室内投与10分後にラットを一方のオープンアームに頭が向くように中心プラットフォームに置いて5分間行った。試験時間は午前11時から16時に限定した。ラットの行動はビデオで記録し、試験終了後ビデオ解析により、各ラットについて、オープンおよびクローズドアームへの進入回数、オープンおよびクローズドアームでの滞在時間を測定した。図7および図8に、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計、5分間中のオープンアームに滞在した割合(%)をそれぞれ示した。ヒト型リラキシン−3投与群とvehicle群との比較には、Dunnett型多重比較検定法による有意差検定を行った。図中において*印は、P<0.05を示す。図7に示されるように、10pmol/ラット投与群、50pmol/ラット投与群はvehicle群と比較して、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計に差はなかった。しかしながら図8に示されるように、10pmol/ラット投与群および50pmol/ラット投与群はvehicle群と比較してオープンアーム内の滞在時間の割合が高く、10pmol/ラットの作用は統計学的に有意であった。この結果から、リラキシン−3には抗不安作用があることが示された。
抗不安作用の測定は高架式十字迷路を用いて行った。迷路は床から50cmの高さに設置し、中心に位置する中心プラットフォーム(10cm×10cm)からそれぞれ広がった2つの対立するオープンアーム(長さ50cm×幅10cm)および2つの対立するクローズドアーム(長さ50cm×幅10cm×壁高さ40cm)からなっている。照明はオープンアームの床面が60〜80ルクスになるようにセットした。試験は、脳室内投与10分後にラットを一方のオープンアームに頭が向くように中心プラットフォームに置いて5分間行った。試験時間は午前11時から16時に限定した。ラットの行動はビデオで記録し、試験終了後ビデオ解析により、各ラットについて、オープンおよびクローズドアームへの進入回数、オープンおよびクローズドアームでの滞在時間を測定した。図7および図8に、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計、5分間中のオープンアームに滞在した割合(%)をそれぞれ示した。ヒト型リラキシン−3投与群とvehicle群との比較には、Dunnett型多重比較検定法による有意差検定を行った。図中において*印は、P<0.05を示す。図7に示されるように、10pmol/ラット投与群、50pmol/ラット投与群はvehicle群と比較して、オープンおよびクローズドアームへの進入回数の合計に差はなかった。しかしながら図8に示されるように、10pmol/ラット投与群および50pmol/ラット投与群はvehicle群と比較してオープンアーム内の滞在時間の割合が高く、10pmol/ラットの作用は統計学的に有意であった。この結果から、リラキシン−3には抗不安作用があることが示された。
リラキシン−3は抗不安作用を有するので、例えば、不安の治療に有用である。また、リラキシン−3が抗不安作用を有することから、リラキシン−3受容体の賦活化または抑制化をする化合物もしくはその塩またはそれらの水和物は、不安の治療に利用可能であり、リラキシン−3受容体の賦活化または抑制化をする不安調節に係る化合物もしくはその塩またはそれらの水和物をスクリーニングする方法およびそのスクリーニング用キットは有用である。
Claims (20)
- リラキシン−3、その塩、あるいはこれらの水和物を含有する抗不安剤。
- リラキシン−3が、ヒト型リラキシン−3である、請求項1に記載の抗不安剤。
- リラキシン−3が、リラキシン−3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖もしくはリラキシン−3のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖からなるポリペプチドであって、A鎖およびB鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、請求項1に記載の抗不安剤。
- 次の工程;被験物質を、
(A)リラキシン−3受容体またはリラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
を含むことを特徴とする抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。 - 次の工程;
リラキシン−3、その塩、あるいはこれらの水和物と、被験物質とを、
(A)リラキシン−3受容体またはリラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、
を含むことを特徴とする不安作用を抑制または促進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。 - リラキシン−3が、ヒト型リラキシン−3である、請求項5に記載のスクリーニング方法。
- リラキシン−3が、リラキシン−3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖もしくはリラキシン−3のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖からなるポリペプチドであって、A鎖およびB鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、請求項5に記載のスクリーニング方法。
- 次の工程;
(B)リラキシン−3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、
をさらに含むことを特徴とする、請求項5〜7のいずれか一項に記載の不安を抑制または亢進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。 - リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項4〜8のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項9に記載のスクリーニング方法。
- リラキシン−3受容体またはリラキシン−3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を含むことを特徴とする、抗不安作用を有する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング用キット。
- リラキシン−3、その塩、あるいはこれらの水和物をさらに含んでなる、請求項11に記載のスクリーニング用キット。
- リラキシン−3が、ヒト型リラキシン−3である、請求項12に記載のスクリーニング用キット。
- リラキシン−3が、リラキシン−3のプレプロプロテインと機能的に等価な改変ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖もしくはリラキシン−3のプレプロプロテインの相同ポリペプチドから得られるA鎖およびB鎖からなるポリペプチドであって、A鎖およびB鎖のシステイン残基がジスルフィド結合により結合されているポリペプチドである、請求項12に記載のスクリーニング用キット。
- リラキシン−3が標識されている、請求項12〜14のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
- リラキシン−3受容体が、SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする、請求項11〜15のいずれか一項に記載のスクリーニング用キット。
- SALPRが、配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、請求項16に記載のスクリーニング用キット。
- リラキシン−3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の不安作用を測定する工程を含むことを特徴とする、不安作用を抑制または促進する化合物もしくはその塩またはそれらの水和物のスクリーニング方法。
- 不安作用を測定する工程が、defensive burying testまたは高架式十字迷路試験である、請求項18に記載のスクリーニング方法。
- リラキシン−3受容体に作用する化合物が、請求項4〜10のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、請求項18または19に記載のスクリーニング方法。
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