JPWO2006040920A1 - CTL inducibility evaluation method and screening method using the same - Google Patents

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Abstract

タンパク質における特異的なＣＴＬ誘導能を迅速かつ簡便に評価できる方法の提供を目的とする。 前記目的を達成するために、本発明のタンパク質特異的なＣＴＬ誘導能評価方法は、被検タンパク質をコードする遺伝子を、抗原提示細胞に、前記タンパク質が発現可能に導入する工程と、前記遺伝子が導入された前記抗原提示細胞をリンパ球と共培養する工程と、前記リンパ球におけるＣＴＬの誘導効率を調べる工程とを含み、前記抗原提示細胞として、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立された細胞株に由来する細胞を使用する評価方法である。本発明によれば、特異的なＣＴＬ誘導能を有する抗原タンパク質や抗原エピトープペプチドを迅速かつ簡便にスクリーニングでき、新規な抗原エピトープペプチドの探索が容易となる。It is an object of the present invention to provide a method capable of evaluating a specific CTL inducing ability in a protein quickly and easily. To achieve the above object, the protein-specific CTL inducing ability evaluation method of the present invention comprises a step of introducing a gene encoding a test protein into an antigen-presenting cell so that the protein can be expressed; Co-culturing the introduced antigen-presenting cells with lymphocytes, and examining the induction efficiency of CTL in the lymphocytes, and expressing T cell costimulatory factors and MHC class I molecules as the antigen-presenting cells And an evaluation method using cells derived from an established cell line capable of presenting all or part of the protein expressed in the cells as an antigen on the MHC class I molecule. According to the present invention, antigen proteins and antigen epitope peptides having specific CTL inducing ability can be screened quickly and easily, and the search for novel antigen epitope peptides becomes easy.

Description

本発明は、ＣＴＬ誘導能評価方法及びそれを用いたスクリーニング方法に関する。  The present invention relates to a CTL inducibility evaluation method and a screening method using the same.

免疫は、生体内で異物（抗原）と認識されたものに対して働く一連の生体防御システムと自他の認識システムである。このシステムにより、生物は様々な疾患から防御されている。  Immunity is a series of biological defense systems and other recognition systems that work against what is recognized as a foreign body (antigen) in the body. This system protects organisms from various diseases.

例えば、健常人の体内においては、常にがん細胞が発生しているが、その大部分は免疫応答により抑え込まれ、病気にまで至らずに消滅していると考えられている。しかし、何かのきっかけによりがんの力が免疫による抑止力を上回った場合には、がん細胞が増殖を続け、やがて病気としてのがんが成立するということになる。  For example, cancer cells are constantly generated in the body of a healthy person, but most of them are thought to be suppressed by an immune response and disappear without reaching a disease. However, if the cancer power exceeds the deterrent due to immunity due to some reason, the cancer cells continue to grow and eventually the cancer as a disease is established.

近年、人工的に細胞性免疫を強化し、様々な疾患（特にがんやウイルス性感染症）を治療する免疫細胞療法が注目されている。免疫細胞療法の特に優れている点は、副作用が非常に少なく、現れたとしても軽度な発熱程度で済むことである。  In recent years, immune cell therapy that artificially enhances cellular immunity and treats various diseases (particularly cancer and viral infections) has attracted attention. The particular advantage of immune cell therapy is that it has very few side effects and, if present, only a mild fever.

免疫細胞療法の中で特に効果が高いと言われているものに、細胞傷害性Ｔ細胞療法（ＣＴＬ療法）がある。細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下、ＣＴＬともいう。）は、腫瘍（がん細胞）やウイルス等を認識して排除する生体防御反応の中心的な役割を担っている。ＣＴＬ療法とは、がんや感染症に対する治療や予防を目的として、このような抗原に特異的なＣＴＬを誘導する治療・予防方法であって、がんやウイルスに対する免疫応答の中心を担うＣＴＬを誘導し、がん細胞やウイルス感染細胞を排除することを目的とした治療・予防方法である。  Among immune cell therapies, cytotoxic T cell therapy (CTL therapy) is said to be particularly effective. Cytotoxic T Lymphocyte (hereinafter, also referred to as CTL) plays a central role in a biological defense reaction that recognizes and eliminates tumors (cancer cells) and viruses. CTL therapy is a treatment / prevention method for inducing CTLs specific to such antigens for the purpose of treatment and prevention against cancer and infectious diseases, and is responsible for the immune response against cancer and viruses. Is a treatment / prevention method aimed at eliminating cancer cells and virus-infected cells.

ＣＴＬが認識するのは、がん細胞やウイルス感染細胞の表面上あるいは細胞内に特異的に発現しているタンパク質の一部で抗原エピトープペプチドと呼ばれる部位である。抗原エピトープペプチドは、通常、９〜１１アミノ酸残基からなる。この抗原エピトープペプチドが、主要組織適合抗原複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ、以下、ＭＨＣともいう。）クラスＩと結合し、抗原提示細胞上に提示される。リンパ球は、提示された抗原エピトープペプチドを認識し、同様の抗原エピトープペプチドを持つがん細胞やウイルス感染細胞等を特異的に攻撃するＣＴＬとなる（例えば、非特許文献１参照）。  CTL recognizes a site called an antigen epitope peptide in a part of a protein that is specifically expressed on or in the surface of cancer cells or virus-infected cells. Antigen epitope peptides usually consist of 9-11 amino acid residues. This antigen epitope peptide binds to major histocompatibility antigen complex (hereinafter also referred to as MHC) class I and is presented on antigen-presenting cells. The lymphocyte recognizes the presented antigen epitope peptide and becomes a CTL that specifically attacks cancer cells or virus-infected cells having the same antigen epitope peptide (see, for example, Non-Patent Document 1).

そのため、ＣＴＬを誘導するには、ＣＴＬが認識する抗原エピトープペプチドの同定が重要となる。同定された抗原エピトープペプチドのアミノ酸配列の情報に基づけば、例えば、エピトープペプチドを合成し、直接ペプチドワクチンとして投与してＣＴＬを誘導したり、また、前記エピトープペプチドを樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ、以下、ＤＣともいう。）にパルスしてより強力なＤＣワクチンを作製することが可能となる（例えば、非特許文献２参照）。そのため、現在まで様々な方法によりエピトープペプチドの同定が試みられている。  Therefore, in order to induce CTL, it is important to identify an antigen epitope peptide recognized by CTL. Based on the information on the amino acid sequence of the identified antigenic epitope peptide, for example, the epitope peptide is synthesized and directly administered as a peptide vaccine to induce CTL, or the epitope peptide is expressed as a dendritic cell (hereinafter referred to as a dendritic cell). , Also referred to as DC), and a more powerful DC vaccine can be produced (see, for example, Non-Patent Document 2). Therefore, identification of epitope peptides has been attempted by various methods until now.

しかしながら、今までのがん抗原エピトープペプチド検索法においては、例えば、下記のような問題点がある。
１．腫瘍特異的なＣＴＬ細胞株を樹立しなければならない。
２．モチーフ構造を持った多数のペプチドを抗原エピトープペプチドの候補として合成し、スクリーニングしなければならない。
３．抗原提示細胞としてＤＣを毎回分化誘導して培養しなければならない。
４．ＤＣへの遺伝子（ＤＮＡ）導入が、非常に効率が悪く困難である。
Ｔｈｉｅｒｒｙ Ｂｏｏｎ ｅｔ ａｌ，″Ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ″Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ ２６７−２６８ Ｖｏｌ．１８，１９９７ Ｊｏａｃｈｉｍ Ｌ．Ｓｃｈｕｌｔｚｅａｎｄ ｅｔ ａｌ，″Ｆｒｏｍ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｔｏｗａｒｄ ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ″Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２２ Ｎｏ．９：５１６−５２３，２００１ However, conventional cancer antigen epitope peptide search methods have the following problems, for example.
1. Tumor-specific CTL cell lines must be established.
2. A large number of peptides having a motif structure must be synthesized as antigen epitope peptide candidates and screened.
3. As antigen-presenting cells, DC must be induced to differentiate each time and cultured.
4). Introduction of genes (DNA) into DC is very inefficient and difficult.
Thierry Boon et al, "Tumor antigens recognized by T cells" Immunology today 267-268 Vol. 18, 1997 Joachim L. Schultzeand et al., “From cancer genomics to cancer immunotherapy: Trend second in generation VOLT.” Trends in Immunology Vol. 22 No. 9: 516-523,2001

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、抗原提示細胞としてＤＣを使用することなく、迅速かつ簡便な抗原エピトープペプチドのスクリーニングを可能とする特異的なＣＴＬ誘導能の評価方法の提供を目的とする。  The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a specific CTL inducing ability evaluation method that enables rapid and simple screening of antigen epitope peptides without using DC as antigen-presenting cells. With the goal.

上記課題を解決するために、本発明のタンパク質における特異的なＣＴＬ誘導能の評価方法（以下、本発明の評価方法ともいう。）は、
被検タンパク質をコードする遺伝子を、抗原提示細胞に、前記タンパク質が発現可能に導入する工程と、
前記遺伝子が導入された前記抗原提示細胞をリンパ球と共培養する工程と、
前記リンパ球におけるＣＴＬの誘導効率を調べる工程とを含み、
前記抗原提示細胞として、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立した細胞株に由来する細胞を使用する評価方法である。In order to solve the above problems, a method for evaluating the specific CTL inducing ability of the protein of the present invention (hereinafter also referred to as the evaluation method of the present invention) is as follows.
Introducing a gene encoding a test protein into an antigen-presenting cell so that the protein can be expressed;
Co-culturing the antigen-presenting cells into which the gene has been introduced with lymphocytes;
Examining the induction efficiency of CTL in the lymphocytes,
An established cell line that expresses a T cell costimulatory factor and an MHC class I molecule as the antigen-presenting cell, and can present all or part of the protein expressed in the cell on the MHC class I molecule. This is an evaluation method using cells derived from.

本発明者らは、抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法のなかでも、抗原エピトープペプチドに特異的に誘導されるＣＴＬを指標とするスクリーニング方法について、従来から抗原提示細胞として使用されているＤＣに代えて、増殖能に優れ、分化誘導の必要が無い確立された細胞株を使用することを着想し、鋭意研究を重ねた。その結果、前記抗原提示細胞が、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現する又は発現するように改変された細胞株由来のものであれば、抗原エピトープペプチドを含むタンパク質をコードする遺伝子を前記抗原提示細胞内に発現可能に導入した場合に、前記抗原エピトープペプチドがＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示され、特異的なＣＴＬを誘導できることを見出した。さらに、本発明者らは、前記抗原提示細胞への遺伝子導入効率が、従来のＤＣのそれに比べて優れるため、前記抗原提示細胞を用いれば、導入したタンパク質の特異的なＣＴＬ誘導能を従来よりも迅速・簡便に評価でき、この評価方法を用いれば、迅速・簡便な抗原エピトープペプチドのスクリーニングが可能となることを見出し、本発明に到達した。  Among the screening methods for antigen epitope peptides, the present inventors have used a screening method using CTL specifically induced by an antigen epitope peptide as an index, instead of DC that has been conventionally used as an antigen-presenting cell, Intensive research was conducted with the idea of using an established cell line that has excellent proliferation ability and does not require differentiation induction. As a result, if the antigen-presenting cell is derived from a cell line that expresses or has been modified to express a T cell costimulatory factor and an MHC class I molecule, a gene encoding a protein containing an antigen epitope peptide can be obtained. It was found that when introduced into the antigen-presenting cell so that it can be expressed, the antigen epitope peptide is presented on the MHC class I molecule and can induce specific CTLs. Furthermore, since the gene transfer efficiency into the antigen-presenting cells is superior to that of the conventional DC, the present inventors have demonstrated that the antigen-presenting cells have a specific CTL inducing ability of the introduced protein. It has been found that using this evaluation method enables rapid and simple screening of antigen epitope peptides, and the present invention has been achieved.

ここで、「特異的なＣＴＬ誘導能」とは、タンパク質又はペプチドが、その一部又は全部がエピトープペプチドとして抗原提示された場合に、前記エピトープペプチドに特異的なＣＴＬを活性化し、増殖を促すことができる能力を意味する。また、「確立された細胞株」とは、増殖能を有し、同一の性質・特性を示すクローン細胞を産生できる細胞株を意味する。  Here, the “specific CTL inducing ability” means that when a protein or peptide is presented as an antigen as a part or all of it as an epitope peptide, it activates CTL specific for the epitope peptide to promote proliferation. It means ability that can. Further, “established cell line” means a cell line capable of producing a clonal cell having proliferative ability and showing the same properties and characteristics.

本発明の評価方法は、抗原提示細胞として、ＤＣの代わりに、増殖しやすく、分化誘導の必要もない確立された細胞株に由来する本発明の抗原提示細胞を使用するから、短時間で効率よく行うことができる。また、本発明の抗原提示細胞は、遺伝子導入効率が優れるから、必要となる準備作業がさらに短時間で効率よく行える。したがって、本発明によれば、迅速かつ簡便なＣＴＬ誘導能評価方法の提供が可能である。また、本発明の評価方法における前記遺伝子導入は、一過性の導入であってもよく、本発明の評価方法をさらに迅速・簡便なものとすることができる。  Since the evaluation method of the present invention uses the antigen-presenting cell of the present invention derived from an established cell line that is easy to proliferate and does not require differentiation induction instead of DC as the antigen-presenting cell, it is efficient in a short time. Can be done well. In addition, since the antigen-presenting cell of the present invention has excellent gene transfer efficiency, the necessary preparatory work can be efficiently performed in a shorter time. Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a quick and simple method for evaluating CTL inducibility. Further, the gene introduction in the evaluation method of the present invention may be a transient introduction, and the evaluation method of the present invention can be made more rapid and simple.

また、本発明の評価方法によれば、タンパク質の大きさによらず、前記タンパク質全体をコードする遺伝子を導入しても、前記タンパク質に含まれる抗原エピトープペプチドに特異的なＣＴＬ誘導能を評価できるから、特異的なＣＴＬを誘導する抗原エピトープペプチドを含むタンパク質のスクリーニング方法が可能である。また、導入する遺伝子を、前記タンパク質の一部をコードする遺伝子であって、前記タンパク質における部位や長さを変化させた遺伝子とすれば、本発明の評価方法により、抗原エピトープペプチドのスクリーニングが可能である。すなわち、本発明の評価方法によれば、例えば、抗原特異的なＣＴＬ細胞株の樹立や、抗原エピトープ候補のペプチド合成等を行うことなく、特異的にＣＴＬを誘導するタンパク質や抗原エピトープペプチドのスクリーニングを迅速かつ簡便に行うことができる。  Further, according to the evaluation method of the present invention, the ability to induce CTL specific for an antigen epitope peptide contained in the protein can be evaluated even if a gene encoding the whole protein is introduced regardless of the size of the protein. Therefore, a method for screening a protein containing an antigen epitope peptide that induces a specific CTL is possible. In addition, if the gene to be introduced is a gene encoding a part of the protein and the site or length of the protein is changed, the antigen epitope peptide can be screened by the evaluation method of the present invention. It is. That is, according to the evaluation method of the present invention, for example, screening of a protein or antigen epitope peptide that specifically induces CTL without establishing an antigen-specific CTL cell line or synthesizing a peptide of an antigen epitope candidate. Can be performed quickly and easily.

図１は、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株のフローサイトメーター解析図の一例の図である。FIG. 1 is an example of a flow cytometer analysis diagram of the MDA-CD80 cell line. 図２は、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株のＲＴ−ＰＣＲの結果の一例の図である。FIG. 2 is a diagram showing an example of RT-PCR results for the MDA-CD80 cell line. 図３Ａは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒを導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。FIG. 3A is a diagram showing an example in which pTracer was introduced into an MDA-CD80 cell line to present antigen, co-cultured with lymphocytes, and specific CTL inducing ability was measured by FACS. 図３Ｂは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒ−ＢＭＬＦ１を導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。FIG. 3B is a diagram showing an example in which pTracer-BMLF1 was introduced into an MDA-CD80 cell line for antigen presentation, co-cultured with lymphocytes, and specific CTL inducing ability was measured by FACS. 図３Ｃは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。FIG. 3C is a diagram showing an example in which pTracer-Ub-BMLF1 was introduced into an MDA-CD80 cell line, antigen presentation was performed, co-cultured with lymphocytes, and specific CTL inducing ability was measured by FACS. 図４Ａは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒを導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。FIG. 4A is a diagram showing an example in which pTracer was introduced into an MDA-CD80 cell line to present antigen, co-cultured with lymphocytes, and specific CTL inducing ability was measured by FACS. 図４Ｂは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒ−Ｍａｒｔ１を導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。FIG. 4B is a diagram showing an example in which pTracer-Mart1 was introduced into an MDA-CD80 cell line to present antigen, co-cultured with lymphocytes, and specific CTL inducing ability was measured by FACS. 図４Ｃは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−Ｍａｒｔ１を導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。FIG. 4C is a diagram showing an example in which pTracer-Ub-Mart1 was introduced into an MDA-CD80 cell line for antigen presentation, co-cultured with lymphocytes, and specific CTL inducing ability was measured by FACS. 図５Ａは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒを導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、ＩＮＦ−γを指標の一つとして特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。FIG. 5A shows an example in which pTracer was introduced into an MDA-CD80 cell line to present antigen, co-cultured with lymphocytes, and specific CTL inducing ability was measured by FACS using INF-γ as one of the indices. FIG. 図５Ｂは、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株にｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を導入して抗原提示を行わせ、リンパ球と共培養し、ＩＮＦ−γを指標の一つとして特異的なＣＴＬ誘導能をＦＡＣＳにて測定した一例の図である。FIG. 5B shows the introduction of pTracer-Ub-BMLF1 into the MDA-CD80 cell line, antigen presentation, co-culture with lymphocytes, and specific CTL inducing ability using INF-γ as one of the indices in FACS. FIG.

本発明の評価方法において、前記Ｔ細胞共刺激因子は、ＣＤ８０であることが好ましい。また、前記遺伝子を導入する工程において、前記タンパク質に加え、ユビキチンをコードする遺伝子を発現可能に導入することが好ましく、より好ましくは、前記タンパク質とユビキチンとの融合タンパク質をコードする遺伝子を発現可能に導入する。前記遺伝子導入は、一過性の遺伝子導入であってもよい。前記タンパク質は、がん細胞由来のものであってもよく、ウイルス由来のものであってもよい。前記抗原提示細胞は、付着性であることが好ましく、また、腫瘍細胞由来細胞株に由来する細胞であることが好ましい。前記腫瘍細胞由来細胞株としては、乳がん由来細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１であることが好ましい。  In the evaluation method of the present invention, the T cell costimulatory factor is preferably CD80. In addition, in the step of introducing the gene, in addition to the protein, it is preferable to introduce a gene encoding ubiquitin so that it can be expressed, and more preferably, a gene encoding a fusion protein of the protein and ubiquitin can be expressed. Introduce. The gene transfer may be a transient gene transfer. The protein may be derived from cancer cells or may be derived from viruses. The antigen-presenting cell is preferably adherent, and is preferably a cell derived from a tumor cell-derived cell line. The tumor cell-derived cell line is preferably a breast cancer-derived cell line MDA-MB-231.

本発明のスクリーニング方法は、ＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質のスクリーニング方法（以下、本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法ともいう。）であって、本発明の評価方法により、被検タンパク質の特異的なＣＴＬ誘導能を評価し、特異的なＣＴＬ誘導能を有するタンパク質を同定する工程を含むスクリーニング方法である。  The screening method of the present invention is a method for screening a protein capable of specifically inducing CTL (hereinafter, also referred to as the antigen protein screening method of the present invention). It is a screening method comprising the steps of evaluating a specific CTL inducing ability and identifying a protein having a specific CTL inducing ability.

その他の態様として、本発明のスクリーニング方法は、ＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質中の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法（以下、本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法ともいう。）であって、下記（Ａ）及び（Ｂ）の少なくとも一方の工程を含むスクリーニング方法である。
（Ａ）被検タンパク質をコードする遺伝子を前記抗原提示細胞に前記タンパク質が発現可能に導入する工程に代えて、前記タンパク質の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記抗原提示細胞に発現可能に導入する工程を有する本発明の評価方法により、前記部分ペプチドのＣＴＬ誘導能を評価し、特異的なＣＴＬ誘導能を有するペプチドを同定する工程。
（Ｂ）被検タンパク質をコードする遺伝子を抗原提示細胞に前記タンパク質が発現可能に導入する工程及び前記遺伝子が導入された前記抗原提示細胞をリンパ球と共培養する工程の前記両工程に代えて、前記タンパク質の部分ペプチドを、前記抗原提示細胞と接触させた後、又は接触させながらリンパ球と共培養する工程を有する本発明の評価方法により、前記部分ペプチドのＣＴＬ誘導能を評価し、特異的なＣＴＬ誘導能を有するペプチドを同定する工程。As another aspect, the screening method of the present invention is a screening method for an antigen epitope peptide in a protein capable of specifically inducing CTL (hereinafter also referred to as the screening method for an antigen epitope peptide of the present invention), which is described below. A screening method comprising at least one of steps (A) and (B).
(A) Instead of the step of introducing a gene encoding a test protein into the antigen-presenting cell so that the protein can be expressed, a polynucleotide encoding a partial peptide of the protein is introduced into the antigen-presenting cell so that the protein can be expressed. A step of evaluating the CTL inducing ability of the partial peptide by the evaluation method of the present invention having a step, and identifying a peptide having a specific CTL inducing ability.
(B) In place of both the steps of introducing a gene encoding a test protein into an antigen-presenting cell so that the protein can be expressed and co-culturing the antigen-presenting cell into which the gene has been introduced with lymphocytes The CTL inducing ability of the partial peptide is evaluated by the evaluation method of the present invention, which comprises the step of co-culturing the partial peptide of the protein with lymphocytes after or after contacting with the antigen-presenting cell. Identifying a peptide having a potential to induce CTL.

本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法において、前記被検タンパク質は、本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法で同定されたタンパク質であることが好ましい。本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法において、前記部分ペプチドは、アミノ酸残基数が９〜１１残基であるペプチドであってもよい。  In the antigen epitope peptide screening method of the present invention, the test protein is preferably a protein identified by the antigen protein screening method of the present invention. In the antigen epitope peptide screening method of the present invention, the partial peptide may be a peptide having 9 to 11 amino acid residues.

本発明の抗原提示細胞は、本発明の評価方法に用いられる抗原提示細胞であって、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立された細胞株に由来する抗原提示細胞である。また、本発明の抗原提示細胞は、その他の態様として、本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法に用いられる前記抗原提示細胞であり、さらにその他の態様として、本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法に用いられる前記抗原提示細胞である。  The antigen-presenting cell of the present invention is an antigen-presenting cell used in the evaluation method of the present invention, and expresses T cell costimulatory factor and MHC class I molecule, and all or the protein expressed in the cell or Antigen presenting cells derived from established cell lines, some of which can present antigens on the MHC class I molecules. Moreover, the antigen-presenting cell of the present invention is the antigen-presenting cell used in the screening method for the antigen protein of the present invention as another embodiment, and is used in the screening method for the antigen epitope peptide of the present invention as another embodiment. The antigen-presenting cell.

本発明のキットは、本発明の評価方法に用いられる評価キットであって、本発明の抗原提示細胞を含む。また、本発明のキットは、その他の態様として、本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法に用いられるスクリーニングキットであって、本発明の抗原提示細胞を含む。本発明のキットは、さらなるその他の態様として、本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法に用いられるスクリーニングキットであって、本発明の抗原提示細胞を含む。  The kit of the present invention is an evaluation kit used for the evaluation method of the present invention, and includes the antigen-presenting cell of the present invention. Moreover, the kit of this invention is a screening kit used for the screening method of the antigen protein of this invention as another aspect, Comprising: The antigen presentation cell of this invention is included. The kit of this invention is a screening kit used for the screening method of the antigen epitope peptide of this invention as the further another aspect, Comprising: The antigen presenting cell of this invention is included.

本発明の製造方法は、特異的なＣＴＬ誘導能を有する抗原エピトープペプチドの製造方法であって、本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法により、前記タンパク質の抗原エピトープペプチドを同定する工程を含む製造方法である。本発明の製造方法は、さらに、前記タンパク質から同定された抗原エピトープペプチドを分離する工程及び同定された抗原エピトープペプチドを合成する工程の少なくとも一方の工程を含むことが好ましい。  The production method of the present invention is a method for producing an antigen epitope peptide having a specific CTL inducing ability, comprising the step of identifying the antigen epitope peptide of the protein by the antigen epitope peptide screening method of the present invention. It is. The production method of the present invention preferably further includes at least one of a step of separating the identified antigen epitope peptide from the protein and a step of synthesizing the identified antigen epitope peptide.

本発明の評価方法は、前述のとおり、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現する細胞株である本発明の抗原提示細胞を使用し、前記抗原提示細胞に被検タンパク質をコードする遺伝子を導入して抗原提示させることを技術的特徴の一つとする。  As described above, the evaluation method of the present invention uses the antigen-presenting cell of the present invention, which is a cell line that expresses a T cell costimulatory factor and an MHC class I molecule, and a gene encoding a test protein in the antigen-presenting cell. One of the technical features is to introduce an antigen to present an antigen.

抗原提示細胞内では、導入された遺伝子の転写・翻訳が行われ、被検タンパク質が合成される。合成された被検タンパク質は、細胞内のタンパク質分解酵素（以下、プロテアソームともいう。）によりいくつかの断片に分解される。被検タンパク質にエピトープ部位が含まれる場合には、ＭＨＣクラスＩ分子と結合し、細胞表面に提示される。  In the antigen-presenting cell, the introduced gene is transcribed and translated, and a test protein is synthesized. The synthesized test protein is degraded into several fragments by intracellular proteolytic enzymes (hereinafter also referred to as proteasomes). When the test protein contains an epitope site, it binds to an MHC class I molecule and is displayed on the cell surface.

Ｔリンパ球表面に存在するＴ細胞レセプター（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、ＴＣＲともいう。）は、抗原提示細胞表面に提示されたＭＨＣクラスＩ分子とエピトープペプチドとの複合体を認識する。エピトープと結合するＴＣＲを持つＴリンパ球は、活性化されＣＴＬとなる。  A T cell receptor (hereinafter also referred to as TCR) present on the surface of a T lymphocyte recognizes a complex of an MHC class I molecule and an epitope peptide presented on the surface of an antigen presenting cell. T lymphocytes with a TCR that binds to the epitope are activated to CTL.

すなわち、本発明の評価方法によれば、特異的なＣＴＬ誘導能を確認することで、被検タンパク質中に、ＭＨＣクラスＩ分子に結合でき、かつ、ＴＣＲにより認識される抗原エピトープペプチドが存在することを容易に確認することが可能となる。  That is, according to the evaluation method of the present invention, an antigen epitope peptide that can bind to an MHC class I molecule and is recognized by TCR exists in a test protein by confirming a specific CTL inducing ability. This can be confirmed easily.

以下に、本発明の評価方法の一例を具体的に説明する。  Below, an example of the evaluation method of this invention is demonstrated concretely.

（１．遺伝子導入工程）
まず、特異的なＣＴＬ誘導能の評価を行う被検タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを作製し、本発明の抗原提示細胞に導入する。(1. Gene transfer process)
First, a vector incorporating a gene encoding a test protein for evaluating specific CTL inducing ability is prepared and introduced into the antigen-presenting cell of the present invention.

前記被検タンパク質は、特に制限されず、アミノ酸がペプチド結合で直鎖状につながったものをいい、アミノ酸のみからなる単純タンパク質であってもよく、アミノ酸以外の構成成分を含む複合タンパク質（例えば、糖タンパク質、核タンパク質、リポタンパク質、ヘムタンパク質、金属タンパク質等）であってもよい。また、アミノ酸残基数も特に制限されず、例えば、オリゴペプチドやポリペプチド等であってもよい。  The test protein is not particularly limited, and refers to a protein in which amino acids are connected in a straight chain by peptide bonds, and may be a simple protein consisting of only amino acids, or a complex protein containing components other than amino acids (for example, Glycoprotein, nucleoprotein, lipoprotein, heme protein, metal protein, etc.). The number of amino acid residues is not particularly limited, and may be, for example, an oligopeptide or a polypeptide.

前記遺伝子が組み込まれたベクターの作製方法としては、特に制限されず、従来公知の方法が適用でき、例えば、発現させたい遺伝子のｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ；相補的デオキシリボ核酸）を得た後、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法；ポリメラーゼ連鎖反応法）によりｃＤＮＡを増幅させ、適当な発現ベクターに組み込むという方法等があげられる。前記発現ベクターとしては、特に制限されず、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等があげられる。  A method for preparing the vector in which the gene is incorporated is not particularly limited, and a conventionally known method can be applied. For example, after obtaining cDNA (complementary DNA; complementary deoxyribonucleic acid) of a gene to be expressed, PCR method Examples thereof include a method of amplifying cDNA by (Polymerase Chain Reaction method; polymerase chain reaction method) and incorporating it into an appropriate expression vector. The expression vector is not particularly limited, and examples thereof include a plasmid vector and a virus vector.

前記遺伝子の大きさには、特に制限はない。例えば、被検タンパク質の全長をコードした遺伝子を用いた場合であっても、細胞内でタンパク質分解を受け、エピトープ部位が抗原提示されるため、操作が非常に簡便である。また、前記遺伝子は、被検タンパク質の一部をコードするポリヌクレオチドであってもよい。  There is no restriction | limiting in particular in the magnitude | size of the said gene. For example, even when a gene that encodes the full length of the test protein is used, since it undergoes proteolysis in the cell and the epitope site is presented as an antigen, the operation is very simple. Further, the gene may be a polynucleotide encoding a part of the test protein.

被検タンパク質としては、例えば、がん細胞由来のものを用いることができる。ここで、ターゲットとするがん細胞としては、例えば、肝がん、胃がん、大腸がん、肺がん、乳がん、子宮がん、脳腫瘍等があげられる。本発明の評価方法によれば、後述のとおり、例えば、抗原エピトープペプチドを同定してそのペプチドを合成し、その合成ペプチドをペプチドワクチンとしてがん患者に投与して患者の体内でＣＴＬを誘導することや、その合成ペプチドを樹状細胞（ＤＣ）にパルスすることによりＤＣワクチンを製造してそのＤＣワクチンを患者に投与することが可能となる。また、抗原エピトープペプチドを含むタンパク質又はペプチド配列をコードする遺伝子をＤＮＡ等のポリヌクレオチドの形でワクチンとして患者に投与することも可能である（例えば、ＤＮＡワクチン等）。  As the test protein, for example, a protein derived from cancer cells can be used. Here, examples of the target cancer cell include liver cancer, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, uterine cancer, brain tumor and the like. According to the evaluation method of the present invention, as described later, for example, an antigen epitope peptide is identified and the peptide is synthesized, and the synthesized peptide is administered to a cancer patient as a peptide vaccine to induce CTL in the patient's body. In addition, it is possible to produce a DC vaccine by pulsing the synthetic peptide into dendritic cells (DC) and to administer the DC vaccine to a patient. Moreover, it is also possible to administer the gene which codes the protein or peptide sequence containing an antigen epitope peptide to a patient as a vaccine in the form of polynucleotides, such as DNA (for example, DNA vaccine etc.).

前記被検タンパク質としては、また、例えば、ウイルス由来のものを用いることができる。前記ウイルスとしては、例えば、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ；ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＢＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ；Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ；Ｃ型肝炎ウイルス）、ＳＡＲＳ（Ｓｅｖｅｒ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；重症急性呼吸器症候群）の原因ウイルス等があげられる。本発明の評価方法によれば、後述のとおり、例えば、抗原エピトープペプチドを同定してそのペプチドを合成し、その合成ペプチドをウイルス感染症に対するワクチンとして利用することが可能である。よって、本発明の評価方法は、ウイルス感染症に対するワクチン開発システムとして利用することができる。  As the test protein, for example, a virus-derived protein can be used. Examples of the virus include HIV (Human Immunodeficiency Virus), HBV (Hepatitis B Virus; hepatitis B virus), HCV (Hepatitis C Virus; hepatitis C virus), SARS (Sever Acrate Respire; Viruses that cause severe acute respiratory syndrome). According to the evaluation method of the present invention, as described later, for example, it is possible to identify an antigen epitope peptide, synthesize the peptide, and use the synthesized peptide as a vaccine against viral infection. Therefore, the evaluation method of the present invention can be used as a vaccine development system for viral infections.

作製した前記ベクターを、抗原提示能を有する本発明の抗原提示細胞に導入する。  The prepared vector is introduced into the antigen-presenting cell of the present invention having antigen-presenting ability.

本発明の抗原提示細胞は、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立された細胞株由来の細胞である。  The antigen-presenting cell of the present invention is established to express a T cell costimulatory factor and an MHC class I molecule, and to present all or part of the protein expressed in the cell on the MHC class I molecule. Cells derived from different cell lines.

抗原提示細胞は、従来、ＤＣ等が用いられているが、末梢血から得られるＤＣは数が少なく、増殖させることができないため、抗原提示細胞として使用するための数の確保が困難な場合が多い。また、末梢血等からＤＣの前駆細胞を分離する場合には、サイトカインを用いて分化誘導を行わなければならない。対照的に、本発明の抗原提示細胞であれば、例えば、増殖が容易であり、分化誘導を行う必要もないため、抗原提示細胞の調製が容易である等の利点がある。  Conventionally, DCs and the like have been used as antigen-presenting cells. However, since DCs obtained from peripheral blood are small in number and cannot be proliferated, it may be difficult to ensure the number for use as antigen-presenting cells. Many. In addition, when DC precursor cells are separated from peripheral blood or the like, differentiation induction must be performed using cytokines. In contrast, the antigen-presenting cell of the present invention is advantageous in that, for example, it is easy to proliferate and it is not necessary to induce differentiation, so that the preparation of the antigen-presenting cell is easy.

また、従来のＤＣを用いるＣＴＬ誘導能の検査の場合では、検査のたびにドナーから細胞を採取しなければならない。さらに、ドナーにより細胞の性質が異なるため、一定の結果が得られにくい。対照的に、本発明の抗原提示細胞であれば、例えば、継代培養により均一の細胞が得られるため、条件を適宜設定することにより一定の結果が得られ、それにより、本発明の評価方法の再現性も向上する等の利点がある。  Moreover, in the case of the test | inspection of the CTL inducibility using conventional DC, you have to extract | collect a cell from a donor for every test. Furthermore, since the cell properties differ depending on the donor, it is difficult to obtain a certain result. In contrast, in the case of the antigen-presenting cell of the present invention, for example, a uniform cell can be obtained by subculture, so that a certain result can be obtained by appropriately setting the conditions, whereby the evaluation method of the present invention. There are advantages such as improved reproducibility.

本発明の抗原提示細胞は、付着性細胞であることが好ましい。ＤＣを抗原提示細胞として用いる場合、被検遺伝子の導入効率が非常に低いという問題がある。抗原提示細胞が付着性細胞であると、例えば、リポフェクション法等によるベクター導入効率が向上する利点がある。また、リンパ球と共培養する際にも、抗原提示細胞がシャーレ等の底面に付着しているほうが、リンパ球へのパルス効率が高くなる利点がある。  The antigen-presenting cell of the present invention is preferably an adherent cell. When DC is used as an antigen-presenting cell, there is a problem that the introduction efficiency of the test gene is very low. When the antigen-presenting cell is an adherent cell, for example, there is an advantage that the vector introduction efficiency by the lipofection method or the like is improved. In addition, when co-cultured with lymphocytes, it is advantageous that the antigen-presenting cells are attached to the bottom surface of a petri dish or the like, so that the pulse efficiency to the lymphocytes is increased.

本発明の抗原提示細胞は、腫瘍細胞由来細胞株に由来することが好ましい。腫瘍由来の細胞は、株の樹立が容易ではないが、常に半永久的に増殖が可能であり、さらに、その性質が安定しているからである。また、腫瘍細胞由来細胞株をＭＨＣクラスＩ分子やＴ細胞共刺激因子を発現するように改変した細胞株を、本発明の抗原提示細胞としてもよい。そのような本発明の抗原提示細胞は、従来公知の方法を適宜用いて作製することができる。例えば、文献［Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３ Ｆｅｂ １；２０８（２）：３５２−６．Ｍａｘｉｍａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃＤＮＡｓ ＩＮ ＣＯＳ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ＩＮ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｋｌｕｘｅｎ ＦＷ，Ｌｕｂｂｅｒｔ Ｈ．］を参照できる。  The antigen-presenting cell of the present invention is preferably derived from a tumor cell-derived cell line. This is because tumor-derived cells are not easy to establish strains, but can always grow semipermanently and have stable properties. In addition, a cell line obtained by modifying a tumor cell-derived cell line so as to express an MHC class I molecule or a T cell costimulatory factor may be used as the antigen-presenting cell of the present invention. Such antigen-presenting cells of the present invention can be prepared by appropriately using conventionally known methods. For example, the literature [Anal Biochem. 1993 Feb 1; 208 (2): 352-6. Maximum expression of Recombinant cDNAs IN COS cells for use IN expression cloning. Kluxen FW, Rubber H. ] Can be referred to.

具体的には、例えば、以下のような手順を用いて本発明の抗原提示細胞を作製できる。
１）ＭＨＣクラスＩ分子やＴ細胞共刺激因子等の発現させたい分子の遺伝子を増幅してｃＤＮＡを得た後、ＰＣＲ法で増幅し、適当な発現ベクターに組み込む。
２）使用する細胞株に前記発現ベクターを導入し、培地中で培養した後、抗生物質を含む培地でセレクションを行う。
３）さらに、抗体結合ビーズを用いて、組み換えタンパク質（前記発現させたい分子の遺伝子の遺伝子産物）を発現している細胞を濃縮する。
４）前記ビーズにより濃縮された細胞を選択し、前記細胞を限界希釈法等によってクローニングを行い、安定している細胞株を選択する。Specifically, for example, the antigen-presenting cell of the present invention can be prepared using the following procedure.
1) After amplifying a gene of a molecule to be expressed such as an MHC class I molecule or a T cell costimulatory factor to obtain cDNA, it is amplified by a PCR method and incorporated into an appropriate expression vector.
2) The expression vector is introduced into the cell line to be used, cultured in a medium, and then selected in a medium containing antibiotics.
3) Further, using antibody-bound beads, cells expressing the recombinant protein (the gene product of the gene of the molecule to be expressed) are concentrated.
4) Select the cells concentrated by the beads, clone the cells by the limiting dilution method or the like, and select a stable cell line.

本発明の抗原提示細胞の具体例として、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株等があげられる。ここで、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株とは、ＭＨＣクラスＩ分子を発現している乳がん由来の腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に、ＣＤ８０（Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８０）をコードする遺伝子を導入し、ＣＤ８０分子を細胞表面で高発現するように改変した細胞株をいう。前記ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、例えば、ＡＴＣＣ等から入手することができる。そのほか、本発明の抗原提示細胞に使用できる腫瘍細胞由来細胞株としては、例えば、腎がん由来のＴＵＨＲ１０ＴＫＢ細胞株、胃がん由来のＪＲ−ｓｔ細胞株等があげられる。  Specific examples of the antigen-presenting cell of the present invention include the MDA-CD80 cell line. Here, the MDA-CD80 cell line refers to a tumor cell line MDA-MB-231 derived from breast cancer that expresses MHC class I molecules by introducing a gene encoding CD80 (Cluster Differentiation 80). A cell line modified to be highly expressed on the cell surface. The MDA-MB-231 cell line can be obtained from ATCC, for example. In addition, examples of the tumor cell-derived cell line that can be used for the antigen-presenting cell of the present invention include TUHR10TKB cell line derived from renal cancer, JR-st cell line derived from stomach cancer, and the like.

前記Ｔ細胞共刺激因子としては、例えば、ＣＤ８０（Ｂ７．１）分子やＣＤ８６（Ｂ７．２）分子等があげられる。これらの分子は、リンパ球の免疫機能を活性化するシグナルを伝達する分子の一つであり、リンパ球表面にあるＣＤ２８分子と結合することにより、リンパ球が活性化し、ＣＴＬが誘導される。本発明の抗原提示細胞では、ＣＤ８０分子及びＣＤ８６分子のいずれかが発現していればよく、好ましくは、ＣＤ８０分子である。ＣＤ８０分子とＣＤ８６分子とが同時に発現していてもよい。  Examples of the T cell costimulator include CD80 (B7.1) molecule and CD86 (B7.2) molecule. These molecules are one of the molecules that transmit signals that activate the immune function of lymphocytes. By binding to CD28 molecules on the lymphocyte surface, lymphocytes are activated and CTLs are induced. In the antigen-presenting cell of the present invention, it is sufficient that either CD80 molecule or CD86 molecule is expressed, preferably CD80 molecule. CD80 molecule and CD86 molecule may be expressed simultaneously.

前記被検タンパク質をコードする遺伝子をベクターにより前記抗原提示細胞に導入する場合、被検タンパク質をコードする遺伝子に加え、ユビキチンをコードする遺伝子を発現可能に導入することが好ましく、より好ましくは、前記被検タンパク質とユビキチンとの融合タンパク質をコードする遺伝子を発現可能に導入することが好ましい。こうすることで抗原提示経路への移行が促進され、抗原提示能が向上し、それに伴いＣＴＬの誘導能が向上する。その結果、高感度にＣＴＬの誘導能を評価すること、すなわち、高感度なエピトープペプチドの存在の検出が可能となる。  When the gene encoding the test protein is introduced into the antigen-presenting cell by a vector, in addition to the gene encoding the test protein, it is preferable to introduce a gene encoding ubiquitin so that it can be expressed, more preferably, It is preferable to introduce a gene encoding a fusion protein of a test protein and ubiquitin so that it can be expressed. By doing so, the transition to the antigen presentation pathway is promoted, the antigen presentation ability is improved, and the induction ability of CTL is improved accordingly. As a result, it is possible to evaluate the induction ability of CTL with high sensitivity, that is, to detect the presence of a highly sensitive epitope peptide.

ここで、ユビキチンとは、７６アミノ酸残基からなるタンパク質であって、標的タンパク質に結合して分解の目印となるものである。ユビキチンが結合したタンパク質には、さらにユビキチンの付加が起こり、ポリユビキチン鎖が付加された標的タンパク質となる。これが分解のシグナルとなり、前記標的タンパク質は、細胞内のプロテアソームによって速やかに分解される。  Here, ubiquitin is a protein consisting of 76 amino acid residues, which binds to a target protein and serves as a marker for degradation. Ubiquitin is further added to the protein to which ubiquitin is bound, and the target protein is added with a polyubiquitin chain. This becomes a signal for degradation, and the target protein is rapidly degraded by intracellular proteasomes.

前記ベクターを前記抗原提示細胞に導入する方法としては、特に制限されず、一般的な手法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）デキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等があげられるが、導入効率の高さの点からは、リポフェクション法が好ましい。リポフェクション法とは、脂質二重膜の小胞であるリポソームと導入するＤＮＡとの複合体を形成させ、貪食や膜融合により目的の遺伝子を細胞内に導入する方法である。  A method for introducing the vector into the antigen-presenting cell is not particularly limited, and a general method can be used. For example, a calcium phosphate method, a lipofection method, a DEAE (dimethylaminoethyl) dextran method, an electroporation method, a microinjection method and the like can be mentioned. From the viewpoint of high introduction efficiency, the lipofection method is preferable. The lipofection method is a method of forming a complex between a liposome, which is a lipid bilayer vesicle, and a DNA to be introduced, and introducing a target gene into the cell by phagocytosis or membrane fusion.

（２．共培養工程）
次に、被検タンパク質をコードする遺伝子が導入された抗原提示細胞と、リンパ球とを共培養する。(2. Co-culture process)
Next, antigen-presenting cells into which a gene encoding a test protein has been introduced and lymphocytes are co-cultured.

前記ベクターを導入した後、抗原提示細胞を培養し、抗原提示を行わせる。培養期間としては、例えば、２４時間〜４８時間が好ましい。それより長時間の培養の場合、ＣＴＬの誘導能が低下する場合があるからである。以下、抗原提示させた抗原提示細胞を、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（刺激細胞）ともいう。  After the introduction of the vector, antigen-presenting cells are cultured and antigen presentation is performed. The culture period is preferably 24 hours to 48 hours, for example. This is because, in the case of culturing longer than that, the inducing ability of CTL may decrease. Hereinafter, the antigen-presenting cell on which antigen is presented is also referred to as a stimulator cell (stimulator cell).

本発明の評価方法では、導入した遺伝子を安定して発現する細胞株を得ずとも一過性の遺伝子導入による発現によりＣＴＬの誘導を検出することができるため、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞の準備期間の大幅な短縮が可能となる。一過性の発現株では抗原タンパク質の発現量が少ないことが問題となる場合があるが、例えば、前述のとおり、ユビキチンとの融合タンパク質とする等すれば、前記問題を解決できる。  In the evaluation method of the present invention, since the induction of CTL can be detected by the expression by transient gene introduction without obtaining a cell line that stably expresses the introduced gene, the preparation period of the stimulator cell is greatly increased. Shortening is possible. In transient expression strains, there may be a problem that the expression level of the antigen protein is small. For example, as described above, the above problem can be solved by using a fusion protein with ubiquitin.

前記リンパ球としては、種々のものを使用できるが、ヒトリンパ球を用いることが好ましい。また、前記リンパ球としては、本発明の抗原提示細胞と少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ分子を共有するリンパ球が好ましく、より好ましくは、ＭＨＣクラスＩ分子が一致するリンパ球である。リンパ球を採取する方法としては、特に制限されず、例えば、血液から密度遠心勾配法により末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ、以下、ＰＢＭＣともいう。）を回収方法等があげられる。以下、前記ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞との共培養に使用するリンパ球を、ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞（反応細胞）ともいう。  Although various lymphocytes can be used, it is preferable to use human lymphocytes. The lymphocyte is preferably a lymphocyte that shares at least one MHC class I molecule with the antigen-presenting cell of the present invention, and more preferably a lymphocyte that matches the MHC class I molecule. The method for collecting lymphocytes is not particularly limited, and examples thereof include a method for recovering peripheral blood mononuclear cells (hereinafter also referred to as PBMC) from blood by density centrifugation gradient method. Hereinafter, the lymphocytes used for the co-culture with the stimulator cells are also referred to as responder cells (reactive cells).

前記共培養において、前記ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞と前記ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞とを混合して培養する。その混合する比率は、特に制限されないが、例えば、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞：ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞＝１：４程度が好ましい。  In the co-culture, the stimulator cells and the responder cells are mixed and cultured. The mixing ratio is not particularly limited, but for example, it is preferable that the stimulator cell: responder cell is about 1: 4.

混合した細胞を培養する培養条件としては、温度条件は、例えば、３４℃〜３８℃であって、好ましくは、３７℃であり、ＣＯ２条件は、例えば、２〜１０％ＣＯ２存在下であって、好ましくは、５％ＣＯ２存在下である。As the culture conditions for culturing the mixed cells, the temperature condition is, for example, 34 ° C. to 38 ° C., preferably 37 ° C., and the CO 2 condition is, for example, in the presence of 2 to 10% CO 2 . Preferably, it is in the presence of 5% CO 2 .

前記共培養の培養期間としては、５日間〜７日間程度の培養が好ましい。５日間以上の培養であれば、ＣＴＬの誘導が可能となり、また、新たな刺激を加えずに長期間培養すると細胞が死んでしまう場合があるからである。  The culture period of the co-culture is preferably about 5 to 7 days. This is because CTL can be induced by culturing for 5 days or more, and cells may die if cultured for a long time without applying a new stimulus.

前記共培養の培地としては、ＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン社製）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン社製）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン社製）、ＴＩＬ（株式会社免疫生物研究所製）、表皮角化細胞培地（コージンバイオ株式会社製）、イスコフ培地（インビトロジェン社製）等、細胞培養に使用される市販の培地を使用できる。また、必要に応じて、５〜２０％のウシ血清、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ、以下、ＦＣＳともいう。）、ヒト血漿等を添加してもよい。また、必要に応じて、種々のサイトカインを添加してもよい。  Examples of the co-culture medium include AIM-V medium (Invitrogen), RPMI-1640 medium (Invitrogen), Dulbecco's modified Eagle medium (Invitrogen), TIL (Immuno-Biological Laboratories), epidermis Commercially available media used for cell culture, such as keratinocyte medium (manufactured by Kojin Bio Inc.) and Iskov medium (manufactured by Invitrogen), can be used. If necessary, 5-20% bovine serum, fetal calf serum (hereinafter also referred to as FCS), human plasma and the like may be added. Moreover, you may add various cytokine as needed.

（３．ＣＴＬ誘導効率測定工程）
最後に、細胞を回収し、特異的なＣＴＬ誘導能の有無を確認する。確認する方法としては、特に制限されず、従来公知の方法を適用できるが、例えば、抗原エピトープペプチド配列が分かっている場合は、ＭＨＣクラスＩ／抗原ペプチド複合体の４量体であるテトラマーを用いたＣＴＬの定量法を適用できる。また、抗原エピトープペプチド配列が分かっていない場合には、ＥＬＩＳＰＯＴ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ａｓｓａｙ）や、細胞内サイトカイン（インターフェロンγ）を測定する方法等を適用できる。(3. CTL induction efficiency measurement process)
Finally, the cells are collected, and the presence or absence of specific CTL inducing ability is confirmed. The confirmation method is not particularly limited, and a conventionally known method can be applied. For example, when the antigen epitope peptide sequence is known, a tetramer that is a tetramer of MHC class I / antigen peptide complex is used. CTL quantification methods can be applied. In addition, when the antigen epitope peptide sequence is not known, an ELISPOT method (Enzyme-Linked Immunospot Assay), a method for measuring intracellular cytokine (interferon γ), or the like can be applied.

以上のようにして本発明の評価方法を行うことで、被検タンパク質中に特異的なＣＴＬ誘導能を有する抗原エピトープペプチドが存在するか否かを確認でき、また、その誘導能を評価できる。  By performing the evaluation method of the present invention as described above, it can be confirmed whether or not an antigen epitope peptide having a specific CTL inducing ability exists in the test protein, and the inducing ability can be evaluated.

本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法は、被検タンパク質の中から、本発明の評価方法により、ＣＴＬを特異的に誘導する抗原エピトープペプチドを含むタンパク質（以下、抗原タンパク質ともいう。）を同定する工程を含むスクリーニング方法である。このような方法であれば、例えば、様々ながん細胞由来タンパク質やウイルスタンパク質の中から、抗原エピトープペプチドを含むタンパク質を容易に探索できる。また、同定された前記タンパク質は、例えば、後述のように、新たな抗原エピトープペプチド同定のための絞込み対象とすることができる。  The antigen protein screening method of the present invention is a step of identifying a protein containing an antigen epitope peptide that specifically induces CTL (hereinafter also referred to as an antigen protein) from test proteins by the evaluation method of the present invention. A screening method comprising With such a method, for example, a protein containing an antigen epitope peptide can be easily searched from various cancer cell-derived proteins and viral proteins. Further, the identified protein can be targeted for narrowing down for identification of a new antigen epitope peptide, for example, as described later.

本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法は、前記（Ａ）工程及び前記（Ｂ）工程の少なくとも一方を含むスクリーニング方法である。本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法において、前記被検タンパク質としては、公知の抗原タンパク質であってもよく、本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法により同定された新規な抗原タンパク質であってもよい。前記被検タンパク質としては、後者の抗原タンパク質が好ましい。  The antigen epitope peptide screening method of the present invention is a screening method comprising at least one of the step (A) and the step (B). In the antigen epitope peptide screening method of the present invention, the test protein may be a known antigen protein or a novel antigen protein identified by the antigen protein screening method of the present invention. As the test protein, the latter antigen protein is preferable.

前記（Ａ）工程は、例えば、本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法により同定された抗原タンパク質、又は抗原エピトープペプチドが未知である公知の抗原タンパク質の一部からなる様々な部分ペプチドを被検タンパク質（以下、被検部分ペプチドともいう。）として本発明の評価方法を行い、前記被検部分ペプチドから抗原エピトープペプチドを含む部分ペプチドを同定する工程である。このような方法を、前記抗原提示細胞に導入する前記被検部分ペプチドの長さや切断箇所を変えて行うことで、前記抗原エピトープペプチドの絞込みが可能となり、最終的に、前記抗原エピトープペプチドが同定できる。抗原エピトープペプチドのアミノ酸残基数は、一般的には、９〜１１残基である。  In the step (A), for example, an antigen protein identified by the antigen protein screening method of the present invention, or various partial peptides consisting of a part of a known antigen protein whose antigen epitope peptide is unknown are tested proteins ( Hereinafter, it is also referred to as a test partial peptide.) Is a step of performing the evaluation method of the present invention and identifying a partial peptide containing an antigen epitope peptide from the test partial peptide. By performing such a method by changing the length or cleavage position of the test partial peptide introduced into the antigen-presenting cell, it becomes possible to narrow down the antigen epitope peptide, and finally the antigen epitope peptide is identified. it can. The number of amino acid residues of the antigen epitope peptide is generally 9 to 11 residues.

前記（Ｂ）工程は、例えば、本発明の抗原タンパク質のスクリーニング方法により同定された抗原タンパク質に基づき、様々な被検部分ペプチドを合成し、この合成した被検部分ペプチドを本発明の抗原提示細胞と接触させた後、又は接触させながら、リンパ球と共培養し、前記リンパ球における特異的なＣＴＬの誘導効率を調べ、前記被検部分ペプチドから抗原エピトープペプチドを同定する工程である。被検部分ペプチドの長さや切断箇所を変えて行うことで、前記抗原エピトープペプチドの絞込みが可能となり、最終的に、前記抗原エピトープペプチドが同定できる。抗原エピトープペプチドのアミノ酸残基数は、一般的には、９〜１１残基である。  In the step (B), for example, various test partial peptides are synthesized based on the antigen protein identified by the antigen protein screening method of the present invention, and the synthesized test partial peptides are synthesized as the antigen-presenting cells of the present invention. In this step, co-cultured with lymphocytes after or while contacting with lymphocytes, examining the induction efficiency of specific CTL in the lymphocytes, and identifying the antigen epitope peptide from the test partial peptide. By changing the length and cutting position of the test partial peptide, the antigen epitope peptide can be narrowed down, and finally, the antigen epitope peptide can be identified. The number of amino acid residues of the antigen epitope peptide is generally 9 to 11 residues.

本発明のキットは、本発明のＣＴＬ誘導能評価方法に用いる評価キットであって、本発明の抗原提示細胞を含むことを特徴とする。また、本発明のキットは、別の態様として、本発明の抗原タンパク質及び／又は抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法に用いるスクリーニングキットであって、本発明の抗原提示細胞を含むことを特徴とする。従来、ＣＴＬの誘導能を評価するためには、その度、抗原提示細胞を調製する必要があり、このようなキット化は困難である。しかし、本発明の抗原提示細胞を用いれば、キット化が可能となり、これにより、簡便で精度が優れたＣＴＬの誘導能評価方法並びに抗原タンパク質及び／又は抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法が可能となる。また、本発明のキットは、前記本発明の抗原提示細胞の他に、培養用の培地や試薬等、適宜必要なものを含めることができる。  The kit of the present invention is an evaluation kit used for the CTL inducibility evaluation method of the present invention, and includes the antigen-presenting cell of the present invention. Moreover, the kit of this invention is a screening kit used for the screening method of the antigen protein and / or antigen epitope peptide of this invention as another aspect, Comprising: The antigen presenting cell of this invention is included, It is characterized by the above-mentioned. Conventionally, in order to evaluate the inducing ability of CTL, it is necessary to prepare antigen-presenting cells each time, and it is difficult to make such a kit. However, use of the antigen-presenting cell of the present invention makes it possible to form a kit, thereby enabling a simple and highly accurate method for evaluating the ability to induce CTLs and a method for screening antigen proteins and / or antigen epitope peptides. In addition to the antigen-presenting cells of the present invention, the kit of the present invention can include necessary culture media and reagents as appropriate.

本発明のＣＴＬ誘導能を有する抗原エピトープペプチドの製造方法は、本発明の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法により抗原エピトープペプチドを同定する工程を含み、その他の工程については、特に制限されない。本発明の製造方法は、さらに、前記タンパク質から同定された抗原エピトープペプチドを分離する工程や、前記同定された抗原エピトープペプチドを合成する工程を含むことが好ましい。  The method for producing an antigen epitope peptide having the ability to induce CTLs of the present invention includes a step of identifying an antigen epitope peptide by the method for screening an antigen epitope peptide of the present invention, and the other steps are not particularly limited. Preferably, the production method of the present invention further includes a step of separating the identified antigen epitope peptide from the protein and a step of synthesizing the identified antigen epitope peptide.

以下に、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明がこれらに限定されないことは、言うまでもない。
実施例１Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, it goes without saying that the present invention is not limited thereto.
Example 1

＜ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株の樹立＞
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株をヒトＣＤ８０分子を恒常的に発現するように改変した細胞株であるＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株の樹立は、下記方法で行った。<Establishment of MDA-CD80 cell line>
Establishment of the MDA-CD80 cell line, which is a cell line obtained by modifying the MDA-MB-231 cell line so as to constitutively express human CD80 molecules, was performed by the following method.

ＣＤ８０分子を発現している細胞から抽出したＲＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲ法により鋳型となるｃＤＮＡ断片を調製し、下記２種類の合成オリゴＤＮＡからなるプライマーＣＤ８０：Ｆ及びｈＢ７−１：Ｒを使用して、ＰＣＲ法によりＣＤ８０遺伝子断片を増幅した。下記プライマー塩基配列における下線部は、ベクターに挿入するための制限酵素サイトの配列（ＨｉｎｄＩＩＩ；ＣＤ８０：Ｆ、ＸｂａＩ；ｈＢ７−１：Ｒ）を示す。  Using RNA extracted from cells expressing CD80 molecules, a cDNA fragment as a template was prepared by RT-PCR, and primers CD80: F and hB7-1: R comprising the following two types of synthetic oligo DNAs were prepared. The CD80 gene fragment was amplified by PCR method. The underlined part in the following primer base sequence indicates the sequence of a restriction enzyme site (HindIII; CD80: F, XbaI; hB7-1: R) for insertion into the vector.

Figure 2006040920
Figure 2006040920

ＰＣＲは、ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて、最初に９４℃で３分間反応し、次に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を１サイクルとして３０サイクル反応し、最後に、７２℃で５分間反応するという反応条件で行った。前記ＰＣＲ法で特異的に増幅されたＤＮＡ断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動により切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで処理し、プラスミドｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロジェン社製）のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｂａＩ部位との間に挿入し、ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＣＤ８０を得た。挿入されたヒトＣＤ８０ｃＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサーで確認したところ、文献［Ｆｒｅｅｍａｎ Ｇ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１４３ ２７１４−２７２２（１９８９）］で報告されたヒトＣＤ８０のｃＤＮＡ塩基配列と完全に一致した。  PCR is performed using LATaq DNA polymerase (manufactured by Takara) at 94 ° C for 3 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. The reaction was carried out under the reaction conditions of finally reacting at 72 ° C. for 5 minutes. The DNA fragment specifically amplified by the PCR method was excised by 1.5% agarose gel electrophoresis, treated with restriction enzymes HindIII and XbaI, and HindIII and XbaI sites of plasmid pRC / CMV (Invitrogen) To obtain pRc / CMV-CD80. When the nucleotide sequence of the inserted human CD80 cDNA was confirmed with a DNA sequencer, the literature [Freeman G. et al. J. et al. et al. (J. Immunol.) 143 2714-2722 (1989)], which completely matched the cDNA base sequence of human CD80.

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、直径３５ｍｍのシャーレを用い、１０％ＦＣＳ（ＣＥＬＬｅｃｔ Ｇｏｌｄ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＩＣｓＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、４〜６時間培養した。この細胞に６μｇの前記ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＣＤ８０をリポフェクション法で導入した。導入４８時間後、一過的にＣＤ８０分子を発現していることをフローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＸＬ／ＭＣＬ、ベックマン・コールター社製）を用いたフローサイトメトリー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、以下、ＦＡＣＳともいう。）で確認した。同時に、培地を前記培地に抗生物質Ｇ４１８を添加した培地に換えて、プラスミドが染色体に組み込まれた細胞を選択した。さらに、選択された細胞を限界希釈法によって単一細胞からクローニングし、ヒトＣＤ８０分子を安定に発現する細胞株ＭＤＡ−ＣＤ８０を得た。  MDA-MB-231 cells were cultured in RPMI 1640 medium containing 10% FCS (CELLect Gold Fetal Bovine Serum, manufactured by ICsN Biomedicals, Inc.) using a petri dish having a diameter of 35 mm for 4 to 6 hours. 6 μg of the pRc / CMV-CD80 was introduced into the cells by the lipofection method. 48 hours after introduction, it was confirmed that the CD80 molecule was transiently expressed by flow cytometry using a flow cytometer (EPICS XL / MCL, manufactured by Beckman Coulter) (Fluorescence-Activated Cell Sorter, hereinafter referred to as FACS). I confirmed.) At the same time, the medium was changed to the medium in which the antibiotic G418 was added to the medium, and cells in which the plasmid was integrated into the chromosome were selected. Furthermore, the selected cells were cloned from single cells by the limiting dilution method to obtain a cell line MDA-CD80 that stably expresses human CD80 molecules.

前記ＭＤＡ−ＣＤ８０が、ＣＤ８０分子を発現していることを、抗ＣＤ８０抗体を用いたＦＡＣＳ及び前記ＭＤＡ−ＣＤ８０から抽出したｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。その結果の一例を、図１及び図２に示す。図１において、縦軸が細胞数、横軸が１つの細胞における蛍光の強さ（ＣＤ８０分子の発現頻度）を表す。また、白い山は、コントロール（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の細胞、黒い山は、ＭＤＡ−ＣＤ８０の細胞の結果を表す。同図に示すとおり、ＦＡＣＳにより、前記ＭＤＡ−ＣＤ８０上にＣＤ８０分子が発現していることが確認された。また、図２において、レーンａは、マーカーであり、レーンｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１であり、レーンｃは、ＭＤＡ−ＣＤ８０である。同図に示すとおり、前記ＭＤＡ−ＣＤ８０（レーンｃ）では、その親細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１（レーンｂ）よりもＣＤ８０のｍＲＮＡが高発現していることが確認された。  The MDA-CD80 was confirmed to express a CD80 molecule by FACS using an anti-CD80 antibody and RT-PCR using mRNA extracted from the MDA-CD80. An example of the result is shown in FIGS. In FIG. 1, the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the intensity of fluorescence (expression frequency of CD80 molecule) in one cell. In addition, white mountains represent the results of control (MDA-MB-231) cells, and black mountains represent the results of MDA-CD80 cells. As shown in the figure, it was confirmed by FACS that a CD80 molecule was expressed on the MDA-CD80. In FIG. 2, lane a is a marker, lane b is MDA-MB-231, and lane c is MDA-CD80. As shown in the figure, it was confirmed that in the MDA-CD80 (lane c), CD80 mRNA was expressed at a higher level than the parent cell MDA-MB-231 (lane b).

＜ＢＭＬＦ１遺伝子導入によるＣＴＬの誘導＞
ＢＭＬＦ１を発現している細胞から抽出したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。前記ＢＭＬＦ１とは、ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）由来のタンパク質である。作製したｃＤＮＡライブラリーからＢＭＬＦ１遺伝子断片を選択し、取得したＢＭＬＦ１断片をＰＣＲ法により増幅した。増幅された遺伝子断片は、１，３１７ｂｐであった。<Induction of CTL by BMLF1 gene introduction>
RT-PCR method using RNA extracted from cells expressing BMLF1 was performed to prepare a cDNA library. The BMLF1 is a protein derived from EBV (Epstein-Barr Virus). A BMLF1 gene fragment was selected from the prepared cDNA library, and the obtained BMLF1 fragment was amplified by the PCR method. The amplified gene fragment was 1,317 bp.

ｐＴｒａｃｅｒＴＭ−ＳＶ４０（商品名、インビトロジェン社製、以下、ｐＴｒａｃｅｒともいう。）と、ユビキチン遺伝子（以下、Ｕｂともいう。）とを、制限酵素ＡｆｌＩＩ及びＫｐｎＩで切断し、ｐＴｒａｃｅｒの制限酵素切断部位の間に、Ｕｂを挿入して、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂを作製した。pTracer ™ -SV40 (trade name, manufactured by Invitrogen, hereinafter also referred to as pTracer) and a ubiquitin gene (hereinafter also referred to as Ub) are cleaved with restriction enzymes AflII and KpnI, and the restriction enzyme cleavage site of pTracer is cleaved. In between, Ub was inserted to prepare pTracer-Ub.

前記ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂと、前記ＢＭＬＦ１断片とを、制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで切断し、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂの制限酵素切断部位の間に、ＢＭＬＦ１を挿入し、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を作製した。  The pTracer-Ub and the BMLF1 fragment were cleaved with restriction enzymes KpnI and NotI, and BMLF1 was inserted between the restriction enzyme cleavage sites of pTracer-Ub to prepare pTracer-Ub-BMLF1.

Ｕｂを導入しない場合のため、前記ｐＴｒａｃｅｒと、前記ＢＭＬＦ１断片とを、制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで切断し、ｐＴｒａｃｅｒの制限酵素切断部位の間に、ＢＭＬＦ１を挿入し、ｐＴｒａｃｅｒ−ＢＭＬＦ１を作製した。  In order not to introduce Ub, the pTracer and the BMLF1 fragment were cleaved with restriction enzymes KpnI and NotI, and BMLF1 was inserted between the restriction enzyme cleavage sites of pTracer to prepare pTracer-BMLF1.

１×１０６細胞のＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株を、６ウェルプレート（住友ベークライト社製）にて、４〜１２時間培養した後、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１（４μｇ）をリポフェクション法により前記ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞に導入した。After culturing 1 × 10 6 MDA-CD80 cell line in a 6-well plate (Sumitomo Bakelite) for 4 to 12 hours, pTracer-Ub-BMLF1 (4 μg) was added to the MDA-CD80 cells by lipofection. Introduced.

２４時間後、ＦＡＣＳによりＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；緑色蛍光タンパク質）の発現量を測定することで導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ；トランスフェクション）効率を確認した。  After 24 hours, the transfection efficiency was confirmed by measuring the expression level of GFP (Green Fluorescent Protein; green fluorescent protein) by FACS.

ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を導入したＭＤＡ−ＣＤ８０細胞を、１×１０６細胞あたり１００μｇのマイトマイシン（マイトマイシン注用２ｍｇ、協和発酵工業株式会社製）を使用して３０分間処理し、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞とした。MDA-CD80 cells into which pTracer-Ub-BMLF1 was introduced were treated with 100 μg of mitomycin (2 mg for mitomycin injection, manufactured by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) per 1 × 10 6 cells for 30 minutes to obtain stimulator cells.

他方、血液から血球遠心分離剤（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ ＰｏＣ ＡＳ製）を用いた遠心分離法により、ＰＢＭＣを調製し、ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞とした。  On the other hand, PBMCs were prepared from blood by a centrifugation method using a blood cell centrifuge (Lymphoprep, manufactured by AXIS-SHIELD PoC AS) and used as responder cells.

前記ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（５×１０５細胞）と、前記ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞（２×１０６細胞）とを混合して３７℃、５％ＣＯ２条件下で、７日間培養した。この際、ＩＬ−２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、ＣＨＩＲＯＮ（カイロン）社製）を１００Ｕ／ｍｌとなるように添加した。培地は、１０％ＦＣＳ添加ＡＩＭ−Ｖ培地を使用した。The stimulator cells (5 × 10 5 cells) and the responder cells (2 × 10 6 cells) were mixed and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 7 days. At this time, IL-2 (PROLEUKIN, manufactured by CHIRON) was added to 100 U / ml. As the medium, AIM-V medium supplemented with 10% FCS was used.

７日間の培養後、細胞を回収し、１００μｌあたり５×１０５細胞となるようにＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、リン酸バッファー、ダルベッコＰＢＳ（−）、日水製薬株式会社製）に懸濁した。After culturing for 7 days, the cells were collected and suspended in PBS (phosphate buffered saline, phosphate buffer, Dulbecco PBS (−), manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) so that 5 × 10 5 cells per 100 μl were obtained.

前記細胞懸濁液に、５μｌのａｎｔｉ−ＣＤ８０−ＦＩＴＣ（ＣＤ８α、ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社製）と、５μｌのＢＭＬＦ１特異的Ｔ−ｓｅｌｅｃｔ ＭＨＣ ｃｌａｓｓＩ ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥ（Ｔ−ｓｅｌｅｃｔ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ ＥＢＶ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ−ＰＥ、株式会社医学生物学研究所製）とを添加し、室温にて１５分間反応させた。  To the cell suspension, 5 μl of anti-CD80-FITC (CD8α, manufactured by IMMUNOTECH) and 5 μl of BMLF1-specific T-select MHC class I tetramer-PE (T-select HLA-A * 0201 EBV Tetramer-GLCTLVAML- PE, manufactured by Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.) was added and reacted at room temperature for 15 minutes.

細胞をＰＢＳで洗浄し、再びＰＢＳで懸濁した後、ＣＤ８を発現し（ＣＤ８−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）かつＢＭＬＦ１を認識することができる（ｔｅｔｒａｍｅｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞集団をＦＡＣＳで測定した。ＣＤ８を発現し、かつ、テトラマーに結合できるものが、ＢＭＬＦ１に対する特異的なＣＴＬである。  After the cells were washed with PBS and suspended again in PBS, the cell population expressing CD8 (CD8-positive) and recognizing BMLF1 (tetramer-positive) was measured by FACS. Those that express CD8 and can bind to tetramers are CTLs specific for BMLF1.

前記ＦＡＣＳ測定の結果の一例を図３Ａ〜Ｃに示す。図３Ａは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒのみを導入したＭｏｃｋ処理の結果の一例であり、図３Ｂは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒ−ＢＭＬＦ１を導入した結果の一例であり、図３Ｃは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を導入した結果の一例である。図３Ａ〜Ｃの右図において、横軸が、ＦＩＴＣ−ＣＤ８のシグナルを示し、縦軸が、ＰＥ−Ｔｅｔｒａｍｅｒのシグナルを示す。図３Ａ及び図３Ｂに示すとおり、ＭＤＡ−ＣＤ８０にウイルス由来の全長タンパク質をコードした遺伝子を導入することで抗原提示させ、特異的なＣＴＬを誘導できることが確認された。また、図３Ｃに示すとおり、ユビキチンと抗原ペプチドとの融合遺伝子を導入した場合には、導入しなかった場合（図３Ｂ）と比較して、特異的なＣＴＬ誘導・検出効率が、３倍以上向上することが確認された。
実施例２An example of the result of the FACS measurement is shown in FIGS. 3A is an example of the result of Mock processing in which only pTracer is introduced into MDA-CD80, FIG. 3B is an example of the result of introduction of pTracer-BMLF1 into MDA-CD80, and FIG. It is an example of the result of introducing pTracer-Ub-BMLF1. 3A to 3C, the horizontal axis represents the FITC-CD8 signal, and the vertical axis represents the PE-Tetramer signal. As shown in FIG. 3A and FIG. 3B, it was confirmed that a specific CTL can be induced by introducing an antigen into MDA-CD80 by introducing a gene encoding a full-length protein derived from a virus. In addition, as shown in FIG. 3C, when a fusion gene of ubiquitin and an antigen peptide is introduced, the specific CTL induction / detection efficiency is 3 times or more compared to the case where it is not introduced (FIG. 3B). It was confirmed to improve.
Example 2

＜Ｍａｒｔ１遺伝子導入によるＣＴＬの誘導＞
１×１０６細胞のＭＤＡ−ＣＤ８０細胞株（実施例１で作製したもの）を６ウェルプレートにて４〜１２時間培養した。<Induction of CTL by introduction of Mart1 gene>
A 1 × 10 6 cell MDA-CD80 cell line (prepared in Example 1) was cultured in a 6-well plate for 4 to 12 hours.

Ｍａｒｔ１を発現している細胞から抽出したＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。前記Ｍａｒｔ１とは、メラノーマ（悪性黒色腫）の抗原タンパク質である。  RT-PCR was performed using RNA extracted from cells expressing Mart1 to prepare a cDNA library. The Mart1 is an antigen protein of melanoma (malignant melanoma).

作製した前記ｃＤＮＡライブラリーからＭａｒｔ１遺伝子断片を選択し、取得したＭａｒｔ１遺伝子断片をＰＣＲ法により増幅した。増幅された遺伝子断片は、３５７ｂｐであった。  A Mart1 gene fragment was selected from the prepared cDNA library, and the obtained Mart1 gene fragment was amplified by PCR. The amplified gene fragment was 357 bp.

前記ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂと、前記Ｍａｒｔ１遺伝子断片とを、制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｐｅＩで切断し、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂの制限酵素切断部位の間にＭａｒｔ１を挿入し、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−Ｍａｒｔ１を作製した。  The pTracer-Ub and the Mart1 gene fragment were cleaved with restriction enzymes KpnI and SpeI, and Mart1 was inserted between the restriction enzyme cleavage sites of pTracer-Ub to prepare pTracer-Ub-Mart1.

Ｕｂを導入しない場合のため、前記ｐＴｒａｃｅｒと、前記Ｍａｒｔ１遺伝子断片とを、制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｐｅＩで切断し、ｐＴｒａｃｅｒの制限酵素切断部位の間にＭａｒｔ１を挿入し、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｍａｒｔ１を作製した。  In order not to introduce Ub, the pTracer and the Mart1 gene fragment were cleaved with restriction enzymes KpnI and SpeI, and Mart1 was inserted between the restriction enzyme cleavage sites of pTracer to prepare pTracer-Mart1.

前記ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−Ｍａｒｔ１を、実施例１と同様のリポフェクション法により、ＭＤＡ−ＣＤ８０細胞に導入し、２４時間後、ＦＡＣＳによりＧＦＰの発現量を測定することでトランスフェクション効率を確認した。  The pTracer-Ub-Mart1 was introduced into MDA-CD80 cells by the lipofection method similar to Example 1, and 24 hours later, the expression level of GFP was measured by FACS to confirm transfection efficiency.

ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−Ｍａｒｔ１を導入したＭＤＡ−ＣＤ８０細胞を、１×１０６細胞あたり１００μｇのマイトマイシンを使用して３０分間処理し、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞とした。MDA-CD80 cells into which pTracer-Ub-Mart1 was introduced were treated with 100 μg of mitomycin per 1 × 10 6 cells for 30 minutes to obtain stimulator cells.

他方、血液から血球遠心分離剤（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ ＰｏＣ ＡＳ製）を用いた遠心分離法により、ＰＢＭＣを調製し、ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞とした。  On the other hand, PBMCs were prepared from blood by a centrifugation method using a blood cell centrifuge (Lymphoprep, manufactured by AXIS-SHIELD PoC AS) and used as responder cells.

前記ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（５×１０５細胞）と、前記ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞（２×１０６細胞）とを混合して３７℃、５％ＣＯ２条件下で、７日間培養した。この際、ＩＬ−２を１００Ｕ／ｍｌとなるように添加した。培地は、１０％ＦＣＳ添加ＡＩＭ−Ｖ培地を使用した。The stimulator cells (5 × 10 5 cells) and the responder cells (2 × 10 6 cells) were mixed and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 7 days. At this time, IL-2 was added to 100 U / ml. As the medium, AIM-V medium supplemented with 10% FCS was used.

７日間の培養後、細胞を回収し、１００μｌあたり５×１０５細胞となるようにＰＢＳに懸濁した。After culturing for 7 days, the cells were collected and suspended in PBS to 5 × 10 5 cells per 100 μl.

前記細胞懸濁液に、５μｌのａｎｔｉ−ＣＤ８０−ＦＩＴＣと、５μｌのＭａｒｔ１特異的Ｔ−ｓｅｌｅｃｔ ＭＨＣ ｃｌａｓｓＩ ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＰＥ（Ｔ−ｓｅｌｅｃｔ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ Ｍａｒｔ１ Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ−ＰＥ、株式会社医学生物学研究所製）とを添加し、室温にて１５分間反応させた。  To the cell suspension, 5 μl of anti-CD80-FITC and 5 μl of Mart1 specific T-select MHC class I tetramer-PE (T-select HLA-A * 0201 Mart1 Teramer-ELAGIGILTV-PE, Medical Biology Co., Ltd.) And made to react at room temperature for 15 minutes.

細胞をＰＢＳで洗浄し、再びＰＢＳで懸濁した後、ＣＤ８を発現し（ＣＤ８−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）かつＭａｒｔ１を認識することができる（ｔｅｔｒａｍｅｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞集団をＦＡＣＳで測定した。ＣＤ８を発現し、かつ、テトラマーに結合できるものが、Ｍａｒｔ１に対する特異的なＣＴＬである。  After the cells were washed with PBS and suspended again in PBS, the cell population expressing CD8 (CD8-positive) and recognizing Mart1 (tetramer-positive) was measured by FACS. Those that express CD8 and can bind to tetramers are specific CTLs for Mart1.

前記ＦＡＣＳ測定の結果の一例を図４Ａ〜Ｃに示す。図４Ａは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒのみを導入したＭｏｃｋ処理の結果の一例であり、図４Ｂは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒ−Ｍａｒｔ１を導入した結果の一例であり、図４Ｃは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−Ｍａｒｔ１を導入した結果の一例である。図４Ａ〜Ｃの右図において、横軸が、ＦＩＴＣ−ＣＤ８のシグナルを示し、縦軸が、ＰＥ−Ｔｅｔｒａｍｅｒのシグナルを示す。図４Ａ及び図４Ｂに示すとおり、ＭＤＡ−ＣＤ８０に腫瘍細胞由来の全長タンパク質をコードした遺伝子を導入することで抗原提示させ、特異的なＣＴＬを誘導できることが確認された。また、図４Ｃに示すとおり、ユビキチンと抗原ペプチドとの融合遺伝子を導入した場合には、導入しなかった場合（図４Ｂ）と比較して、特異的なＣＴＬ誘導・検出効率が、２．７倍向上することが確認された。
実施例３An example of the result of the FACS measurement is shown in FIGS. FIG. 4A is an example of the result of Mock processing in which only pTracer is introduced into MDA-CD80, FIG. 4B is an example of the result of introduction of pTracer-Mart1 into MDA-CD80, and FIG. It is an example of the result of introducing pTracer-Ub-Mart1. 4A to 4C, the horizontal axis indicates the FITC-CD8 signal, and the vertical axis indicates the PE-Tetramer signal. As shown in FIGS. 4A and 4B, it was confirmed that by introducing a gene encoding a full-length protein derived from tumor cells into MDA-CD80, antigens were presented and specific CTLs could be induced. As shown in FIG. 4C, when a fusion gene of ubiquitin and an antigen peptide is introduced, the specific CTL induction / detection efficiency is 2.7 compared to the case where the fusion gene is not introduced (FIG. 4B). It was confirmed that the improvement was doubled.
Example 3

＜細胞内サイトカイン（インターフェロンγ）の測定によるＣＴＬ誘導能評価＞
ＢＭＬＦ１遺伝子をＭＤＡ−ＣＤ８０細胞に導入してＣＴＬを誘導し、誘導されたＣＴＬが産生するインターフェロンγ（以下、ＩＦＮ−γともいう。）を測定することで、ＢＭＬＦ１のＣＴＬ誘導能を評価した。<Evaluation of CTL inducibility by measurement of intracellular cytokine (interferon γ)>
The BMLF1 gene was introduced into MDA-CD80 cells to induce CTL, and the interferon γ produced by the induced CTL (hereinafter also referred to as IFN-γ) was measured to evaluate the CTL induction ability of BMLF1.

実施例１と同様にしてｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１及びｐＴｒａｃｅｒをＭＤＡ−ＣＤ８０に導入してｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞を調製し、また、実施例１と同様にしてｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞を調製した。  In the same manner as in Example 1, pTracer-Ub-BMLF1 and pTracer were introduced into MDA-CD80 to prepare stimulator cells, and in the same manner as in Example 1, responder cells were prepared.

前記ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（５×１０５細胞）と、前記ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞（２×１０６細胞）とを混合して３７℃、５％ＣＯ２条件下で、７日間培養した。この際、ＩＬ−２を１００Ｕ／ｍｌとなるように添加した。培地は、１０％ＦＣＳ添加ＡＩＭ−Ｖ培地を使用した。ここで、前記ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞は、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を導入したＭＤＡ−ＣＤ８０及びｐＴｒａｃｅｒを導入したＭＤＡ−ＣＤ８０である。The stimulator cells (5 × 10 5 cells) and the responder cells (2 × 10 6 cells) were mixed and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 7 days. At this time, IL-2 was added to 100 U / ml. As the medium, AIM-V medium supplemented with 10% FCS was used. Here, the stimulator cells are MDA-CD80 introduced with pTracer-Ub-BMLF1 and MDA-CD80 introduced with pTracer.

７日間の培養後、ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞を回収し、ＰＢＳ（−）で洗浄した。ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞は、前述のとおり、事前にマイトマイシン処理してあるため、７日間の培養後には、回収した細胞群には、ほぼｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞のみが残っていることになる。  After 7 days of culture, responder cells were collected and washed with PBS (−). As described above, the stimulator cells are treated with mitomycin in advance, and therefore, after the cultivation for 7 days, only the responder cells remain in the collected cell group.

前記１回目のｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞の刺激により誘導されたＣＴＬは、ＩＦＮ−γを誘導するが、７日間の培養の間にＩＦＮ−γ産生量が減少してしまう。ＩＦＮ−γの産生量を検出しやすくするため、２回目の刺激を行った。１回目の刺激ですでにＣＴＬの誘導が行われているため２回目の刺激は短時間でもよい。また、下記の２回目刺激には、エピトープペプチドをパルスしたＭＤＡ−ＣＤ８０を使用しているが、エピトープペプチドが未知である場合には、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞として、例えば、ユビキチン−抗原タンパク質の融合タンパク質をｐＴｒａｃｅｒ等により導入したＭＤＡ−ＣＤ８０を用いることができる。  CTL induced by the first stimulation of stimulator cells induces IFN-γ, but the amount of IFN-γ produced decreases during 7 days of culture. In order to facilitate the detection of the amount of IFN-γ produced, a second stimulation was performed. Since the CTL is already induced by the first stimulation, the second stimulation may be performed for a short time. In addition, MDA-CD80 pulsed with an epitope peptide is used for the second stimulation described below. When the epitope peptide is unknown, for example, a ubiquitin-antigen protein fusion protein is used as a pTracer cell as a stimulator cell. MDA-CD80 introduced by the above can be used.

回収したｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞（２×１０５細胞）を、１００μｌの１０％ＦＣＳ添加ＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁した。また、２回目のｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞として、エピトープペプチドをパルスしたＭＤＡ−ＣＤ８０（１×１０５細胞）を１００μｌの１０％ＦＣＳ添加ＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁して調製した。The collected responder cells (2 × 10 5 cells) were suspended in 100 μl of AIM-V medium supplemented with 10% FCS. In addition, MDA-CD80 (1 × 10 5 cells) pulsed with an epitope peptide was suspended in 100 μl of 10% FCS-added AIM-V medium as a second-time stimulator cell.

前記ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ細胞と前記ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞とを、９６ウェル丸底プレート（住友ベークライト社製）において混合し、５０Ｕｎｉｔ／ｍｌのＩＬ−２と、４０μｇ／ｍｌのＢｅｆｅｌｄｉｎＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）とを添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、４〜６時間培養した。前記ＢｅｆｅｌｄｉｎＡは、サイトカインの細胞外への放出を阻害する試薬である。そのため、細胞内で産生されたＩＦＮ−γは、細胞内に蓄積されることとなる。The responder cell and the stimulator cell are mixed in a 96-well round bottom plate (manufactured by Sumitomo Bakelite), and 50 Unit / ml IL-2 and 40 μg / ml Befeldin A (manufactured by Sigma Chemicals) are added. The cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 4 to 6 hours. The Befeldin A is a reagent that inhibits the release of cytokines to the outside of cells. Therefore, IFN-γ produced in the cell is accumulated in the cell.

細胞を回収し、ＰＢＳ（−）で洗浄し、１００μｌのＰＢＳ（−）に懸濁し、５μｌのＡｎｔｉ−ＣＤ８ＦＩＴＣと５μｌのＡｎｔｉ−ＣＤ３−ＰＣ５とをそれぞれ加え、室温で１５分間反応させた。  The cells were collected, washed with PBS (−), suspended in 100 μl of PBS (−), 5 μl of Anti-CD8FITC and 5 μl of Anti-CD3-PC5 were added thereto, and reacted at room temperature for 15 minutes.

１００μｌのＩｎｔｒａＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ１（細胞膜透過処理試薬、ベックマン・コールター社製）を添加した。前記ＩｎｔｒａＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ１は、細胞を固定するための薬品である。サンプルをボルテックスにかけてよく混合し、室温・暗所で１５分間静置した。細胞を回収し、ＰＢＳ（−）で洗浄し、１００μｌのＰＢＳ（−）に懸濁した。その後、１００μｌのＩｎｔｒａＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ２（細胞膜透過処理試薬、ベックマン・コールター社製）を添加し、室温・暗所で５分間静置した。前記ＩｎｔｒａＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ２は、固定された細胞表面に穴をあけ、抗体が細胞内のＩＦＮ−γと反応できるようにするための試薬である。  100 μl of IntraPrep Reagent 1 (a cell membrane permeabilization reagent, manufactured by Beckman Coulter, Inc.) was added. The IntraPrep Reagent 1 is a drug for fixing cells. The sample was vortexed and mixed well, and allowed to stand at room temperature in the dark for 15 minutes. Cells were harvested, washed with PBS (−) and suspended in 100 μl PBS (−). Thereafter, 100 μl of IntraPrep Reagent 2 (cell membrane permeabilization reagent, manufactured by Beckman Coulter, Inc.) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature in the dark for 5 minutes. The IntraPrep Reagent 2 is a reagent for making a hole in a fixed cell surface so that the antibody can react with intracellular IFN-γ.

５μｌのＡｎｔｉ−ＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ（ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社製）を添加し、室温・暗所で１５分間反応させた。細胞を回収し、ＰＢＳ（−）で洗浄し、ＦＡＣＳによりＣＤ３陽性かつＣＤ８陽性かつＩＦＮ−γ陽性細胞を測定した。  5 μl of Anti-IFN-γ-FITC (IMMUNOTECH) was added and allowed to react for 15 minutes at room temperature in the dark. Cells were collected, washed with PBS (−), and CD3 positive, CD8 positive and IFN-γ positive cells were measured by FACS.

その結果の一例を図５Ａ〜Ｂに示す。図５Ａは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒのみを導入したＭｏｃｋ処理の結果の一例であり、図５Ｂは、ＭＤＡ−ＣＤ８０にｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を導入した結果の一例である。図５Ａ〜Ｂにおいて、横軸が、ＦＩＴＣ−ＣＤ８のシグナルを示し、縦軸が、ＩＦＮ−γのシグナルを示す。図５Ａ及び図５Ｂに示すとおり、ｐＴｒａｃｅｒ−Ｕｂ−ＢＭＬＦ１を導入したＭＤＡ−ＣＤ８０を１回目の刺激に用いた場合、産生されるＩＦＮ−γ量が、ｐＴｒａｃｅｒのみを導入した場合と比較して高くなっていることが確認された。すなわち、ＢＭＬＦ１遺伝子を導入したことにより、抗原提示が行われ、特異的なＣＴＬが誘導されたことが確認された。  An example of the result is shown in FIGS. FIG. 5A is an example of the result of Mock processing in which only pTracer is introduced into MDA-CD80, and FIG. 5B is an example of the result of introduction of pTracer-Ub-BMLF1 into MDA-CD80. 5A and 5B, the horizontal axis represents the FITC-CD8 signal, and the vertical axis represents the IFN-γ signal. As shown in FIG. 5A and FIG. 5B, when MDA-CD80 introduced with pTracer-Ub-BMLF1 was used for the first stimulation, the amount of IFN-γ produced was higher than when only pTracer was introduced. It was confirmed that That is, it was confirmed that by introducing the BMLF1 gene, antigen presentation was performed and specific CTL was induced.

以上説明したように、本発明によれば、迅速かつ簡便に特異的なＣＴＬ誘導能評価が可能であるから、抗原タンパク質及び抗原エピトープペプチドのスクリーニングが迅速かつ簡便にできる。したがって、本発明は、例えば、新規抗原エピトープペプチド探索の分野であり、また、がんや感染症等の治療／予防に関する免疫細胞療法を含む医療分野に有用である。  As described above, according to the present invention, specific CTL inducibility can be evaluated quickly and easily, and thus screening of antigen proteins and antigen epitope peptides can be performed quickly and easily. Therefore, the present invention is useful, for example, in the field of searching for novel antigen epitope peptides, and in the medical field including immune cell therapy related to the treatment / prevention of cancer and infectious diseases.

配列番号１ プライマー ＣＤ８０：Ｆ
配列番号２ プライマー ｈＢ７−１：ＲSequence number 1 primer CD80: F
Sequence number 2 primer hB7-1: R

Claims (21)

タンパク質における特異的なＣＴＬ誘導能の評価方法であって、
被検タンパク質をコードする遺伝子を、抗原提示細胞に、前記タンパク質が発現可能に導入する工程と、
前記遺伝子が導入された前記抗原提示細胞をリンパ球と共培養する工程と、
前記リンパ球におけるＣＴＬの誘導効率を調べる工程とを含み、
前記抗原提示細胞として、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立された細胞株に由来する細胞を使用する評価方法。A method for evaluating a specific CTL inducing ability in a protein,
Introducing a gene encoding a test protein into an antigen-presenting cell so that the protein can be expressed;
Co-culturing the antigen-presenting cells into which the gene has been introduced with lymphocytes;
Examining the induction efficiency of CTL in the lymphocytes,
As the antigen-presenting cell, an established cell that expresses a T cell costimulatory factor and an MHC class I molecule and can present all or part of the protein expressed in the cell on the MHC class I molecule. Evaluation method using cells derived from a strain. 前記Ｔ細胞共刺激因子が、ＣＤ８０である請求項１記載の評価方法。The evaluation method according to claim 1, wherein the T cell costimulatory factor is CD80. 前記遺伝子を導入する工程において、前記タンパク質に加え、ユビキチンをコードする遺伝子を発現可能に導入する請求項１記載の評価方法。The evaluation method according to claim 1, wherein, in the step of introducing the gene, a gene encoding ubiquitin is introduced in an expressible manner in addition to the protein. 前記遺伝子を導入する工程において、前記タンパク質をコードする遺伝子に代えて、前記タンパク質とユビキチンとの融合タンパク質をコードする遺伝子を発現可能に導入する請求項１記載の評価方法。The evaluation method according to claim 1, wherein, in the step of introducing the gene, a gene encoding a fusion protein of the protein and ubiquitin is introduced so as to be expressed instead of the gene encoding the protein. 前記遺伝子の導入が、一過性の遺伝子導入である請求項１記載の評価方法。The evaluation method according to claim 1, wherein the gene introduction is a transient gene introduction. 前記タンパク質が、がん細胞由来又はウイルス由来である請求項１記載の評価方法。The evaluation method according to claim 1, wherein the protein is derived from a cancer cell or a virus. 前記抗原提示細胞が、付着性細胞である請求項１記載の評価方法。The evaluation method according to claim 1, wherein the antigen-presenting cell is an adherent cell. 前記抗原提示細胞が、腫瘍細胞由来細胞株に由来する細胞である請求項１記載の評価方法。The evaluation method according to claim 1, wherein the antigen-presenting cell is a cell derived from a tumor cell-derived cell line. 前記腫瘍細胞由来細胞株が、乳がん由来細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１である請求項８記載の評価方法。The evaluation method according to claim 8, wherein the tumor cell-derived cell line is a breast cancer-derived cell line MDA-MB-231. ＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質のスクリーニング方法であって、請求項１記載の評価方法により、被検タンパク質の特異的なＣＴＬ誘導能を評価し、特異的なＣＴＬ誘導能を有するタンパク質を同定する工程を含むスクリーニング方法。A method for screening a protein capable of specifically inducing CTL, wherein the test method evaluates the specific CTL inducing ability of a test protein and identifies a protein having a specific CTL inducing ability by the evaluation method according to claim 1 A screening method comprising the step of: ＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質中の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法であって、下記（Ａ）及び（Ｂ）の少なくとも一方の工程を含むスクリーニング方法。
（Ａ）被検タンパク質をコードする遺伝子を前記抗原提示細胞に前記タンパク質が発現可能に導入する工程に代えて、前記タンパク質の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記抗原提示細胞に発現可能に導入する工程を有する請求項１記載の評価方法により、前記部分ペプチドのＣＴＬ誘導能を評価し、特異的なＣＴＬ誘導能を有する抗原エピトープペプチドを同定する工程。
（Ｂ）被検タンパク質をコードする遺伝子を前記抗原提示細胞に前記タンパク質が発現可能に導入する工程及び前記遺伝子が導入された前記抗原提示細胞をリンパ球と共培養する工程の前記両工程に代えて、前記タンパク質の部分ペプチドを、前記抗原提示細胞と接触させた後、又は接触させながらリンパ球と共培養する工程を有する請求項１記載の評価方法により、前記部分ペプチドのＣＴＬ誘導能を評価し、特異的なＣＴＬ誘導能を有する抗原エピトープペプチドを同定する工程。A screening method for an antigen epitope peptide in a protein capable of specifically inducing CTL, comprising at least one of the following steps (A) and (B):
(A) Instead of the step of introducing a gene encoding a test protein into the antigen-presenting cell so that the protein can be expressed, a polynucleotide encoding a partial peptide of the protein is introduced into the antigen-presenting cell so that the protein can be expressed. The process of evaluating the CTL inducibility of the said partial peptide by the evaluation method of Claim 1 which has a process, and identifying the antigen epitope peptide which has specific CTL inducibility.
(B) In place of both steps of introducing a gene encoding a test protein into the antigen-presenting cell so that the protein can be expressed and co-culturing the antigen-presenting cell into which the gene has been introduced with lymphocytes The CTL inducing ability of the partial peptide is evaluated by the evaluation method according to claim 1, further comprising a step of co-culturing the partial peptide of the protein with the lymphocyte after or after contacting with the antigen-presenting cell. And identifying an antigenic epitope peptide having a specific CTL inducing ability. 前記被検タンパク質として、請求項１０記載の方法により同定されたタンパク質を使用する請求項１１記載のスクリーニング方法。The screening method according to claim 11, wherein a protein identified by the method according to claim 10 is used as the test protein. 前記部分ペプチドが、アミノ酸残基数９〜１１からなるペプチドである請求項１１記載のスクリーニング方法。The screening method according to claim 11, wherein the partial peptide is a peptide consisting of 9 to 11 amino acid residues. 請求項１記載のタンパク質における特異的なＣＴＬ誘導能の評価方法に用いる抗原提示細胞であって、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立された細胞株に由来する抗原提示細胞。An antigen-presenting cell used in the method for evaluating a specific CTL inducing ability of the protein according to claim 1, wherein the cell expresses a T cell costimulatory factor and an MHC class I molecule, and is expressed in the cell. An antigen-presenting cell derived from an established cell line capable of presenting all or part of the antigen on the MHC class I molecule. 請求項１０記載のＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質のスクリーニング方法に用いる抗原提示細胞であって、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立された細胞株に由来する抗原提示細胞。11. An antigen-presenting cell for use in the method for screening a protein capable of specifically inducing CTL according to claim 10, wherein the protein expresses a T cell costimulatory factor and an MHC class I molecule, and is expressed in the cell. An antigen-presenting cell derived from an established cell line capable of presenting all or part of the antigen on the MHC class I molecule. 請求項１１記載のＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質中の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法に用いる抗原提示細胞であって、Ｔ細胞共刺激因子及びＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ、細胞内で発現される前記タンパク質の全部若しくは一部を前記ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原提示できる確立された細胞株に由来する抗原提示細胞。An antigen-presenting cell for use in a method for screening an antigen epitope peptide in a protein capable of specifically inducing CTL according to claim 11, wherein the cell presents a T cell costimulatory factor and an MHC class I molecule, Antigen presenting cells derived from an established cell line capable of presenting all or part of the expressed protein on the MHC class I molecule. 請求項１記載のタンパク質における特異的なＣＴＬ誘導能の評価方法に用いる評価キットであって、請求項１４記載の抗原提示細胞を含むキット。An evaluation kit for use in a method for evaluating a specific CTL inducing ability of the protein according to claim 1, comprising the antigen-presenting cell according to claim 14. 請求項１０記載のＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質のスクリーニング方法に用いるスクリーニングキットであって、請求項１５記載の抗原提示細胞を含むキット。A screening kit for use in a method for screening a protein capable of specifically inducing the CTL according to claim 10, comprising the antigen-presenting cell according to claim 15. 請求項１１記載のＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質中の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法に用いるスクリーニングキットであって、請求項１６記載の抗原提示細胞を含むキット。A screening kit for use in a method for screening an antigen epitope peptide in a protein capable of specifically inducing the CTL according to claim 11, comprising the antigen-presenting cell according to claim 16. 特異的なＣＴＬ誘導能を有する抗原エピトープペプチドの製造方法であって、請求項１１記載のＣＴＬを特異的に誘導可能なタンパク質中の抗原エピトープペプチドのスクリーニング方法により、前記タンパク質の抗原エピトープペプチドを同定する工程を含む製造方法。A method for producing an antigen epitope peptide having a specific ability to induce CTL, wherein the antigen epitope peptide of the protein is identified by the method for screening an antigen epitope peptide in a protein capable of specifically inducing CTL according to claim 11. The manufacturing method including the process to do. さらに、前記タンパク質から同定された抗原エピトープペプチドを分離する工程及び前記同定された抗原エピトープペプチドを合成する工程の少なくとも一方の工程を含む請求項２０記載の製造方法。21. The production method according to claim 20, further comprising at least one of a step of separating the identified antigen epitope peptide from the protein and a step of synthesizing the identified antigen epitope peptide.
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