JPWO2006030792A1 - 非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎患者の病態をより正確に反映した病態モデル動物を提供することを目的として、高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させた動物に、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与して作製される非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物を提供する。
Description
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物、その作製方法、及びその動物を用いる薬物スクリーニング方法に関する。
従来、非アルコール性脂肪肝(アルコール摂取を原因としない脂肪肝)は、身体に悪影響を与えるものではなく、治療の必要のない状態と考えられていた。しかし、近年、非アルコール性脂肪肝の中に、酸化ストレス等の刺激によって肝炎に進展し、更に肝臓の線維化を引き起こして肝硬変又は肝癌に発展するものがあることが分かってきた。現在では、非アルコール性脂肪肝から進展した肝炎は、非アルコール性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis:NASH)と呼ばれ、治療の対象となっている。
非アルコール性脂肪性肝炎治療薬の開発を目的とするスクリーニングテストや薬理試験においては、健常動物でなく、非アルコール性脂肪性肝炎患者の病態をできるだけ多く具備する病態モデル動物を用いるのが好ましい。そのような病態モデル動物としては、現在、MCD(methionine- and choline-deficient)ダイエットを摂取させることによって作製されるマウス(以下「MCDモデル」という。)が知られている(非特許文献1)。
MCDモデルは、脂肪性肝炎の発症、血中におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)の増加、肝臓におけるトリグリセリド(TG)の増加、肝臓における炎症性サイトカイン(腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターロイキン−1β(IL−1β)等)のmRNAの増加といった、非アルコール性脂肪性肝炎に特徴的な所見が認められる点で、優れた非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物と考えられている。
Rinella, M. E. et al., J. Hepatology, 40: 47-51 (2004)
Rinella, M. E. et al., J. Hepatology, 40: 47-51 (2004)
しかしながら、多くの非アルコール性脂肪性肝炎患者では体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を示すのに対し、MCDモデルではそれらの値がいずれも正常値よりも低く、この点で、MCDモデルは非アルコール性脂肪性肝炎患者の実際の病態を正確に反映するものではない。
そこで、本発明は、MCDモデルの上記問題点を克服し、非アルコール性脂肪性肝炎患者の実際の病態をより正確に反映した病態モデル動物、その作製方法、及び非アルコール性脂肪性肝炎治療薬の開発のためのより有効な薬物スクリーニング方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明は、高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させた動物に、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与して作製される非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物を提供する。
このような非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物は、体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を示す点で、非アルコール性脂肪性肝炎患者の実際の病態をより正確に反映した病態モデル動物となる。
上記高脂肪食としては、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有する食餌であって、当該食餌の全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが30%以上の食餌が好ましく、また、上記テトラサイクリン系抗生物質は、血中ALT濃度、血中AST濃度、肝臓TG量、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続投与するのがよい。
非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物としては、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有する食餌であって、当該食餌の全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが30%以上の高脂肪食を、血中ALT濃度、血中AST濃度、肝臓TG量、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続的に摂取させて作製される動物も採用することができる。このような病態モデル動物もまた、体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を示す点で、非アルコール性脂肪性肝炎患者の実際の病態をより正確に反映したものとなる。また、高脂肪食の摂取期間によっては、肝臓の線維化を伴う、より進行した非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物となる。
上述のように、非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物は、高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させた動物に、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与することにより、作製することができる。この場合において、高脂肪食としては、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有する食餌であって、当該食餌の全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが30%以上の食餌がよく、また、テトラサイクリン系抗生物質は、血中ALT濃度、血中AST濃度、肝臓TG量、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続投与するのが好ましい。
本発明によれば、MCDモデルの問題点を克服し、非アルコール性脂肪性肝炎患者の実際の病態をより正確に反映した病態モデル動物、その作製方法、及び非アルコール性脂肪性肝炎治療薬の開発のためのより有効な薬物スクリーニング方法を提供することが可能となる。
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。
本発明の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物(以下「NASH病態モデル動物」という。)を作製するために用いられる動物としては、ヒトの疾患の病態モデル動物として一般的に用いられている、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、サル等が挙げられるが、これらの中ではマウスが好ましい。雄は性周期によるホルモン量の変化がなく、病態のばらつきを抑えることができることから、動物は雄であることが好ましい。
NASH病態モデル動物を作製するには、まず、このような動物に対して、高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させる。摂取させる高脂肪食としては、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有しており、その全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが30%以上のものがよい。脂肪由来のカロリーの下限は45%が好ましく、60%がより好ましい。一方、上限は80%が好ましく、70%がより好ましい。
なお、高脂肪食を摂取させた結果、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重が増加したかどうかは、t検定により判断することができる。ここで、t検定における有意水準は、1%又は5%であり、好ましくは1%である。
NASH病態モデル動物は、上述のようにして有意に体重が増加した動物に対して、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与して作製される。ここで、「連続投与」するとは、投与を複数回、好ましくは等間隔をもって行うことを意味する。連続投与されるテトラサイクリン系抗生物質としては、例えば、テトラサイクリン(TC)、オキシテトラサイクリン(OTC)、メタサイクリン(MTC)、ドキシサイクリン(DOXY)、ミノサイクリン(MINO)、及びこれらの塩(塩酸塩等)が挙げられる。
テトラサイクリン系抗生物質の投与は、血中ALT濃度、血中AST濃度、肝臓TG量、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで続けるのが好ましく、また、血中ALT濃度、血中AST濃度、肝臓TG量、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなり、かつ、肝臓の病理組織学的検査において脂肪肝の存在及び炎症細胞の浸潤が認められるまで続けるのがより好ましい。ここで、上記の値が同種の健常動物に比べて有意に高いかどうかは、有意水準を1%又は5%(好ましくは1%)としたt検定により判断することができる。
なお、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有する食餌であって、当該食餌の全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが30%以上の高脂肪食を、血中ALT濃度、血中AST濃度、肝臓TG量、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで、ある程度の期間連続的に摂取させれば、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与しなくても、NASH病態モデル動物を作製することができる。ここで、「連続的に摂取」するとは、摂取を複数回行うことを意味する。
高脂肪食を摂取させた後、テトラサイクリン系抗生物質を投与することによりNASH病態モデル動物を作製する場合、テトラサイクリン系抗生物質投与前の高脂肪食摂取期間は、脂肪肝が形成されるのに十分な期間であればよく、例えば、マウスでは、好ましくは6〜10週間であり、より好ましくは7〜9週間である。高脂肪食は、テトラサイクリン系抗生物質の投与中も摂取させるのが好ましい。
高脂肪食を摂取させた後、テトラサイクリン系抗生物質を投与することによりNASH病態モデル動物を作製する場合、テトラサイクリン系抗生物質の投与量及び投与期間は、マウスでは、好ましくは20〜100mg/kg/日、7〜14日間であり、より好ましくは20〜40mg/kg/日、9〜11日間である。20mg/kg/日、7日間未満では、脂肪肝が肝炎に進展しないことがあり、他方、100mg/kg/日、15日間を超えると、体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度のいずれかが正常値よりも低くなる可能性がある。テトラサイクリン系抗生物質の投与方法は、好ましくは腹腔内投与又は皮下投与である。ここで、テトラサイクリン系抗生物質は、薬理学的に許容される塩の形態で投与してもよい。
高脂肪食を連続的に摂取させることによりNASH病態モデル動物を作製する場合、高脂肪食の摂取期間は、脂肪性肝炎を発症させるのに十分な期間であればよく、マウスでは、好ましくは20週間以上であり、より好ましくは40週間以上である。20週間未満では、脂肪性肝炎が十分に発症しない可能性がある。また、肝臓の線維化が生じているNASH病態モデル動物を作製するには、マウスでは、40週間以上高脂肪食を摂取させるのが好ましい。肝臓の線維化が生じていることは、例えば、肝臓I型コラーゲン(α1)mRNA量又は肝臓α−SMA(smooth muscle actin)mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高いことをもって確認することができる。ここで、「I型コラーゲン(α1)」はI型コラーゲンのα1鎖を表す。
上述したNASH病態モデル動物を用いて、非アルコール性脂肪性肝炎用薬物のスクリーニングが可能になる。すなわち、NASH病態モデル動物に非アルコール性脂肪性肝炎用候補薬物を投与するステップを備える、非アルコール性脂肪性肝炎用薬物のスクリーニング方法が提供される。このスクリーニング方法においては、候補薬物を投与するステップの後に、候補薬物が非アルコール性脂肪性肝炎用薬物として有効かどうかを判定するステップを設けることができ、このステップでは、例えば、血中ALT濃度、血中AST濃度、肝臓TG量、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなっていないことをもって、非アルコール性脂肪性肝炎用薬物としての有効性を判断することができる。また、肝臓の病理組織学的検査において炎症細胞の浸潤が認められなくなったことをもって、非アルコール性脂肪性肝炎用薬物としての有効性を判断することもできる。
本発明のNASH病態モデル動物、及びこれを用いる薬物スクリーニング方法は、医薬品の開発を目的とするスクリーニングテストや薬理試験において、公知の病態モデル動物、及びこれを用いる薬物スクリーニング方法と同様に用いることができる。
以下、実施例及び比較例に基づいて、本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
以下の実施例及び比較例では、病態モデル動物作製のための動物として、C57BL/6J系の雄マウス(日本クレア社)を用いた。また、高脂肪食(以下「HFD」という。)としては、D12492(脂肪含有量:60kcal%)(リサーチダイエット社)を用いた。対照餌としては、マウスの通常の飼育に用いられるCE−2(日本クレア社)を用いた。テトラサイクリン系抗生物質としては塩酸テトラサイクリン(シグマ社)を用いた。塩酸テトラサイクリンの投与は、0.5%生理食塩水を用いて調製した塩酸テトラサイクリンの0、10、30及び100mg/10mL溶液の注射によって行った。ここで、「塩酸テトラサイクリンの0mg/10mL溶液」とは、0.5%生理食塩水を意味する。
(実施例1及び比較例1)
マウス(6週齢)29匹を、HFDを摂取させる群(以下、「HFD群」という。)15匹と対照餌を摂取させる群(以下、「対照群」という。)14匹とに分けた。HFD群(15匹)及び対照群(14匹)に関する以下の実験を、それぞれ実施例1及び比較例1とする。
マウス(6週齢)29匹を、HFDを摂取させる群(以下、「HFD群」という。)15匹と対照餌を摂取させる群(以下、「対照群」という。)14匹とに分けた。HFD群(15匹)及び対照群(14匹)に関する以下の実験を、それぞれ実施例1及び比較例1とする。
HFD又は対照餌の給餌、及び塩酸テトラサイクリンの腹腔内投与:
まず、HFD群及び対照群のマウスにそれぞれHFD及び対照餌を8週間自由摂取させた。その後、体重及び体脂肪率が群間で均等になるように、HFD群を3群(5匹×3)に、対照群を3群(5匹×2、4匹×1)に分け、HFD群及び対照群のいずれにも塩酸テトラサイクリン0、10及び30mg/kg/日を10日間腹腔内投与した(以下、塩酸テトラサイクリン0、10及び30mg/kg/日を投与した群をそれぞれ「TC0群」、「TC10群」及び「TC30群」という)。HFD又は対照餌は、塩酸テトラサイクリン投与期間中もマウスに自由摂取させた。
まず、HFD群及び対照群のマウスにそれぞれHFD及び対照餌を8週間自由摂取させた。その後、体重及び体脂肪率が群間で均等になるように、HFD群を3群(5匹×3)に、対照群を3群(5匹×2、4匹×1)に分け、HFD群及び対照群のいずれにも塩酸テトラサイクリン0、10及び30mg/kg/日を10日間腹腔内投与した(以下、塩酸テトラサイクリン0、10及び30mg/kg/日を投与した群をそれぞれ「TC0群」、「TC10群」及び「TC30群」という)。HFD又は対照餌は、塩酸テトラサイクリン投与期間中もマウスに自由摂取させた。
体重の測定:
マウスの体重を、塩酸テトラサイクリン投与開始の4日前、投与開始後1、3、5、7、10及び11日目に測定した。図1は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスにおける体重の推移を示す折れ線グラフである。図1より、体重では、HFD群のマウスが塩酸テトラサイクリン投与開始時に通常のマウス(対照群のうちのTC0群のマウス)より有意に高い値を示し、この値が投与期間中もほぼ維持されたことが分かる。なお、図1において、「日数」は、塩酸テトラサイクリン投与開始後の経過日数を表す。
マウスの体重を、塩酸テトラサイクリン投与開始の4日前、投与開始後1、3、5、7、10及び11日目に測定した。図1は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスにおける体重の推移を示す折れ線グラフである。図1より、体重では、HFD群のマウスが塩酸テトラサイクリン投与開始時に通常のマウス(対照群のうちのTC0群のマウス)より有意に高い値を示し、この値が投与期間中もほぼ維持されたことが分かる。なお、図1において、「日数」は、塩酸テトラサイクリン投与開始後の経過日数を表す。
採血及び解剖:
塩酸テトラサイクリン投与終了日翌日(投与開始後11日目)に、マウスにイソフルランを吸入させて麻酔し、尾部をピンセットでつまんで痛覚が消失したことを確認した後、開腹して腹部大静脈よりヘパリン入りシリンジで採血した。採取した血液を4℃、7500rpmで10分間遠心し、血漿を分離した。得られた血漿は凍結保存した。採血後、速やかに胸郭を切開して十分に放血した後、肝臓を摘出した。肝臓の一葉は凍結保存した。また、肝臓の一部(約50mg)を切り取り、液体窒素中で凍結保存した。更に、肝臓の中間葉を10%中性緩衝ホルマリン液で固定した。
塩酸テトラサイクリン投与終了日翌日(投与開始後11日目)に、マウスにイソフルランを吸入させて麻酔し、尾部をピンセットでつまんで痛覚が消失したことを確認した後、開腹して腹部大静脈よりヘパリン入りシリンジで採血した。採取した血液を4℃、7500rpmで10分間遠心し、血漿を分離した。得られた血漿は凍結保存した。採血後、速やかに胸郭を切開して十分に放血した後、肝臓を摘出した。肝臓の一葉は凍結保存した。また、肝臓の一部(約50mg)を切り取り、液体窒素中で凍結保存した。更に、肝臓の中間葉を10%中性緩衝ホルマリン液で固定した。
血漿ALT濃度、血漿AST濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度の測定:
凍結保存していた血漿を用いて、血漿ALT濃度、血漿AST濃度及び血漿グルコース濃度を日立自動分析装置7070(日立ハイテクノロジーズ社)で、血漿インスリン濃度をインスリン測定キット(生化学工業社)で測定した。図2は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスの血漿ALT濃度を示す棒グラフである。図3は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスの血漿AST濃度を示す棒グラフである。図2及び3より、血漿ALT濃度及び血漿AST濃度では、HFD群のうち、TC30群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる。図4は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。図5は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスの血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。図4及び5より、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度では、HFD群のマウスが通常のマウスと同程度の値か、それより高い値を示したことが分かる。
凍結保存していた血漿を用いて、血漿ALT濃度、血漿AST濃度及び血漿グルコース濃度を日立自動分析装置7070(日立ハイテクノロジーズ社)で、血漿インスリン濃度をインスリン測定キット(生化学工業社)で測定した。図2は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスの血漿ALT濃度を示す棒グラフである。図3は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスの血漿AST濃度を示す棒グラフである。図2及び3より、血漿ALT濃度及び血漿AST濃度では、HFD群のうち、TC30群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる。図4は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。図5は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスの血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。図4及び5より、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度では、HFD群のマウスが通常のマウスと同程度の値か、それより高い値を示したことが分かる。
肝臓TG量の測定:
凍結保存していた肝臓の一葉をホモジネートとし、このホモジネートの一部から Folch の試薬で脂質画分を抽出した後、これを窒素ガスで乾固し、デタミナーL TGII(協和メデックス社)でTG量を測定した。図6は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスの肝臓TG量を示す棒グラフである。図6より、肝臓TG量では、HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示し、中でもTC30群のマウスが著しく高い値を示したことが分かる。
凍結保存していた肝臓の一葉をホモジネートとし、このホモジネートの一部から Folch の試薬で脂質画分を抽出した後、これを窒素ガスで乾固し、デタミナーL TGII(協和メデックス社)でTG量を測定した。図6は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスの肝臓TG量を示す棒グラフである。図6より、肝臓TG量では、HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示し、中でもTC30群のマウスが著しく高い値を示したことが分かる。
肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量の測定:
液体窒素中で凍結保存していた肝臓の一部から ISOGEN(ニッポンジーン社)でRNAを抽出した後、アプライドバイオシステムズ社のリアルタイム定量PCR試薬でcDNAを合成し、18S rRNAを内部標準として、ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System(アプライドバイオシステムズ社)でTNFα mRNA量及びIL−1β mRNA量を測定した。図7は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスの肝臓TNFα mRNA量を示す棒グラフである。図8は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスの肝臓IL−1β mRNA量を示す棒グラフである。図7及び8より、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量では、HFD群のうち、TC10群及びTC30群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる。
液体窒素中で凍結保存していた肝臓の一部から ISOGEN(ニッポンジーン社)でRNAを抽出した後、アプライドバイオシステムズ社のリアルタイム定量PCR試薬でcDNAを合成し、18S rRNAを内部標準として、ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System(アプライドバイオシステムズ社)でTNFα mRNA量及びIL−1β mRNA量を測定した。図7は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスの肝臓TNFα mRNA量を示す棒グラフである。図8は、HFD又は対照餌を8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間腹腔内投与したマウスの肝臓IL−1β mRNA量を示す棒グラフである。図7及び8より、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量では、HFD群のうち、TC10群及びTC30群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる。
肝臓の病理組織学的検査:
ホルマリン液で固定した肝臓の中間葉からパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色及びオイルレッドO染色(脂肪染色)を行って、病理組織学的検査を行った。図9は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリン30mg/kg/日を10日間腹腔内投与したマウスの肝臓中間葉の切片に対するヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。図10は、図9の黒枠で示された部分を拡大した光学顕微鏡写真に対応する図である。図11は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリン30mg/kg/日を10日間腹腔内投与したマウスの肝臓中間葉の切片に対するオイルレッドO染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。図9〜11より、HFD群のうち、TC30群のマウスにおいて、脂肪肝の存在及び炎症細胞の浸潤が認められたことが分かる。
ホルマリン液で固定した肝臓の中間葉からパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色及びオイルレッドO染色(脂肪染色)を行って、病理組織学的検査を行った。図9は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリン30mg/kg/日を10日間腹腔内投与したマウスの肝臓中間葉の切片に対するヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。図10は、図9の黒枠で示された部分を拡大した光学顕微鏡写真に対応する図である。図11は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリン30mg/kg/日を10日間腹腔内投与したマウスの肝臓中間葉の切片に対するオイルレッドO染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。図9〜11より、HFD群のうち、TC30群のマウスにおいて、脂肪肝の存在及び炎症細胞の浸潤が認められたことが分かる。
実施例1及び比較例1により、マウスに高脂肪食を8週間摂取させた後、塩酸テトラサイクリン30mg/kg/日を10日間腹腔内投与することによって、体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を示すNASH病態モデル動物が作製されることが示された。
(実施例2)
HFDの給餌、及び塩酸テトラサイクリンの皮下投与:
マウス(7週齢)20匹にHFDを8週間自由摂取させた。その後、体重及び体脂肪率が群間で均等になるように4群(5匹×4)に分け、塩酸テトラサイクリン0、30、60及び100mg/kg/日を10日間皮下投与した(以下、塩酸テトラサイクリン0、30、60及び100mg/kg/日を投与した群をそれぞれ「TC0群」、「TC30群」、「TC60群」及び「TC100群」という)。HFDは、塩酸テトラサイクリン投与期間中もマウスに自由摂取させた。
HFDの給餌、及び塩酸テトラサイクリンの皮下投与:
マウス(7週齢)20匹にHFDを8週間自由摂取させた。その後、体重及び体脂肪率が群間で均等になるように4群(5匹×4)に分け、塩酸テトラサイクリン0、30、60及び100mg/kg/日を10日間皮下投与した(以下、塩酸テトラサイクリン0、30、60及び100mg/kg/日を投与した群をそれぞれ「TC0群」、「TC30群」、「TC60群」及び「TC100群」という)。HFDは、塩酸テトラサイクリン投与期間中もマウスに自由摂取させた。
体重の測定:
マウスの体重を、塩酸テトラサイクリン投与開始の3日前に測定し、更に投与開始日翌日から11日目まで毎日測定した。図12は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスにおける体重の推移を示す折れ線グラフである。図12より、いずれの群のマウスも塩酸テトラサイクリン投与開始時に通常のマウスより有意に高い値を示したこと、及び体重は塩酸テトラサイクリンの投与量及び投与日数に応じて減少したが、いずれの群のマウスも塩酸テトラサイクリン投与終了時に通常のマウスと同程度か、それより高い値を示したことが分かる(図1参照)。なお、図12において、「日数」は、塩酸テトラサイクリン投与開始後の経過日数を表す。
マウスの体重を、塩酸テトラサイクリン投与開始の3日前に測定し、更に投与開始日翌日から11日目まで毎日測定した。図12は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスにおける体重の推移を示す折れ線グラフである。図12より、いずれの群のマウスも塩酸テトラサイクリン投与開始時に通常のマウスより有意に高い値を示したこと、及び体重は塩酸テトラサイクリンの投与量及び投与日数に応じて減少したが、いずれの群のマウスも塩酸テトラサイクリン投与終了時に通常のマウスと同程度か、それより高い値を示したことが分かる(図1参照)。なお、図12において、「日数」は、塩酸テトラサイクリン投与開始後の経過日数を表す。
採血及び解剖:
採血及び解剖を、実施例1と同様に行った。
採血及び解剖を、実施例1と同様に行った。
血漿ALT濃度、血漿AST濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度の測定:
血漿ALT濃度、血漿AST濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度を、実施例1と同様に測定した。図13は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスの血漿ALT濃度を示す棒グラフである。図14は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスの血漿AST濃度を示す棒グラフである。図13及び14より、血漿ALT濃度及び血漿AST濃度では、TC30群、TC60群及びTC100群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる(図2及び3参照)。図15は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。図15より、血漿インスリン濃度では、TC0群、TC30群及びTC60群のマウスが通常のマウスより高い値を示し、TC100群のマウスが通常のマウスと同程度の値を示したことが分かる(図4参照)。図16は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスの血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。図16より、血漿グルコース濃度では、いずれの群のマウスも通常のマウスより高い値を示したことが分かる(図5参照)。
血漿ALT濃度、血漿AST濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度を、実施例1と同様に測定した。図13は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスの血漿ALT濃度を示す棒グラフである。図14は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスの血漿AST濃度を示す棒グラフである。図13及び14より、血漿ALT濃度及び血漿AST濃度では、TC30群、TC60群及びTC100群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる(図2及び3参照)。図15は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。図15より、血漿インスリン濃度では、TC0群、TC30群及びTC60群のマウスが通常のマウスより高い値を示し、TC100群のマウスが通常のマウスと同程度の値を示したことが分かる(図4参照)。図16は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスの血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。図16より、血漿グルコース濃度では、いずれの群のマウスも通常のマウスより高い値を示したことが分かる(図5参照)。
肝臓TG量の測定:
肝臓TG量を、実施例1と同様に測定した。図17は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスの肝臓TG量を示す棒グラフである。図17より、肝臓TG量では、いずれの群のマウスも通常のマウスより有意に高い値を示し、中でもTC30群のマウスが著しく高い値を示したことが分かる(図6参照)。
肝臓TG量を、実施例1と同様に測定した。図17は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスの肝臓TG量を示す棒グラフである。図17より、肝臓TG量では、いずれの群のマウスも通常のマウスより有意に高い値を示し、中でもTC30群のマウスが著しく高い値を示したことが分かる(図6参照)。
肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量の測定:
肝臓TNFαmRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量を、実施例1と同様に測定した。図18は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスの肝臓TNFα mRNA量を示す棒グラフである。図19は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスの肝臓IL−1β mRNA量を示す棒グラフである。図18及び19より、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量では、TC30群、TC60群及びTC100群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示し、中でもTC30群のマウスがいずれのmRNA量においても著しく高い値を示したことが分かる(図7及び8参照)。
肝臓TNFαmRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量を、実施例1と同様に測定した。図18は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスの肝臓TNFα mRNA量を示す棒グラフである。図19は、HFDを8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与したマウスの肝臓IL−1β mRNA量を示す棒グラフである。図18及び19より、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量では、TC30群、TC60群及びTC100群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示し、中でもTC30群のマウスがいずれのmRNA量においても著しく高い値を示したことが分かる(図7及び8参照)。
肝臓の病理組織学的検査:
肝臓の病理組織学的検査を、実施例1と同様に行った。TC30群、TC60群及びTC100群のマウスにおいて、脂肪肝の存在及び炎症細胞の浸潤が認められた。
肝臓の病理組織学的検査を、実施例1と同様に行った。TC30群、TC60群及びTC100群のマウスにおいて、脂肪肝の存在及び炎症細胞の浸潤が認められた。
実施例2により、マウスに高脂肪食を8週間摂取させた後、塩酸テトラサイクリンを10日間皮下投与することによって、体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を示すNASH病態モデル動物が作製されることが示された。
(実施例3及び比較例2)
マウス(7週齢)12匹をHFD群6匹と対照群6匹とに分けた。HFD群(6匹)及び対照群(6匹)に関する以下の実験を、それぞれ実施例3及び比較例2とする。
マウス(7週齢)12匹をHFD群6匹と対照群6匹とに分けた。HFD群(6匹)及び対照群(6匹)に関する以下の実験を、それぞれ実施例3及び比較例2とする。
HFD又は対照餌の給餌:
HFD群及び対照群のマウスには、それぞれHFD及び対照餌を50週間自由摂取させた。
HFD群及び対照群のマウスには、それぞれHFD及び対照餌を50週間自由摂取させた。
体重の測定:
マウスの体重を、HFD又は対照餌の給餌を終了した後、採血前(麻酔前)に測定した。図20は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの体重を示す棒グラフである。図20より、体重では、HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる(図1参照)。
マウスの体重を、HFD又は対照餌の給餌を終了した後、採血前(麻酔前)に測定した。図20は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの体重を示す棒グラフである。図20より、体重では、HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる(図1参照)。
採血及び解剖:
採血及び解剖を、HFD又は対照餌の給餌を終了した直後に、実施例1と同様に行った。
採血及び解剖を、HFD又は対照餌の給餌を終了した直後に、実施例1と同様に行った。
血漿ALT濃度、血漿AST濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度の測定:
血漿ALT濃度、血漿AST濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度を、実施例1と同様に測定した。図21は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの血漿ALT濃度を示す棒グラフである。図22は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの血漿AST濃度を示す棒グラフである。図21及び22より、血漿ALT濃度及び血漿AST濃度では、HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる(図2及び3参照)。図23は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。図23より、血漿インスリン濃度では、HFD群のマウスが通常のマウスより高い値を示したことが分かる(図4参照)。図24は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。図24より、血漿グルコース濃度では、HFD群のマウスが通常のマウスと同程度の値を示したことが分かる(図5参照)。
血漿ALT濃度、血漿AST濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度を、実施例1と同様に測定した。図21は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの血漿ALT濃度を示す棒グラフである。図22は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの血漿AST濃度を示す棒グラフである。図21及び22より、血漿ALT濃度及び血漿AST濃度では、HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる(図2及び3参照)。図23は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。図23より、血漿インスリン濃度では、HFD群のマウスが通常のマウスより高い値を示したことが分かる(図4参照)。図24は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。図24より、血漿グルコース濃度では、HFD群のマウスが通常のマウスと同程度の値を示したことが分かる(図5参照)。
肝臓TG量の測定:
肝臓TG量を、実施例1と同様に測定した。図25は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの肝臓TG量を示す棒グラフである。図25より、肝臓TG量では、HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる(図6参照)。
肝臓TG量を、実施例1と同様に測定した。図25は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの肝臓TG量を示す棒グラフである。図25より、肝臓TG量では、HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる(図6参照)。
肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量の測定:
肝臓TNFαmRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量を、実施例1と同様に測定した。図26は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの肝臓TNFα mRNA量を示す棒グラフである。図27は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの肝臓IL−1β mRNA量を示す棒グラフである。図26及び27より、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量では、HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる(図7及び8参照)。
肝臓TNFαmRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量を、実施例1と同様に測定した。図26は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの肝臓TNFα mRNA量を示す棒グラフである。図27は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの肝臓IL−1β mRNA量を示す棒グラフである。図26及び27より、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量では、HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる(図7及び8参照)。
肝臓の病理組織学的検査:
肝臓の病理組織学的検査を、実施例1と同様に行った。図28は、HFDを50週間摂取させたマウスの肝臓中間葉の切片に対するヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。図29は、対照餌を50週間摂取させたマウスの肝臓中間葉の切片に対するヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。図28及び29より、HFD群のマウスにおいて、脂肪肝の存在及び炎症細胞の浸潤が認められたことが分かる。
肝臓の病理組織学的検査を、実施例1と同様に行った。図28は、HFDを50週間摂取させたマウスの肝臓中間葉の切片に対するヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。図29は、対照餌を50週間摂取させたマウスの肝臓中間葉の切片に対するヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。図28及び29より、HFD群のマウスにおいて、脂肪肝の存在及び炎症細胞の浸潤が認められたことが分かる。
肝臓I型コラーゲン(α1)mRNA量及び肝臓α−SMA mRNA量の測定:
肝臓の線維化が生じているかどうかを、肝臓I型コラーゲン(α1)mRNA量及び肝臓α−SMA mRNA量を指標として確認した。
肝臓I型コラーゲン(α1)mRNA量及び肝臓α−SMA mRNA量の測定は、実施例1における肝臓TNFαmRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量の測定と同様の方法で行った。図30は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの肝臓I型コラーゲン(α1)mRNA量を示す棒グラフである。図31は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの肝臓α−SMA mRNA量を示す棒グラフである。図30及び31より、肝臓I型コラーゲン(α1)mRNA量及び肝臓α−SMA mRNA量では、HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる。そして、そのことから、HFD群のマウスでは、通常のマウスと異なり、肝臓の線維化が生じていたことが分かる。
肝臓の線維化が生じているかどうかを、肝臓I型コラーゲン(α1)mRNA量及び肝臓α−SMA mRNA量を指標として確認した。
肝臓I型コラーゲン(α1)mRNA量及び肝臓α−SMA mRNA量の測定は、実施例1における肝臓TNFαmRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量の測定と同様の方法で行った。図30は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの肝臓I型コラーゲン(α1)mRNA量を示す棒グラフである。図31は、HFD又は対照餌を50週間摂取させたマウスの肝臓α−SMA mRNA量を示す棒グラフである。図30及び31より、肝臓I型コラーゲン(α1)mRNA量及び肝臓α−SMA mRNA量では、HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる。そして、そのことから、HFD群のマウスでは、通常のマウスと異なり、肝臓の線維化が生じていたことが分かる。
実施例3及び比較例2により、マウスに高脂肪食を50週間摂取させることによって、体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を示し、かつ肝臓の線維化が生じているNASH病態モデル動物が作製されることが示された。
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎治療薬の開発に利用することができる。
Claims (8)
- 高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させた動物に、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与して作製される非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物。
- 前記高脂肪食は、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有し、全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが30%以上の高脂肪食である、請求項1記載の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物。
- 前記テトラサイクリン系抗生物質を、
血中ALT濃度、血中AST濃度、肝臓TG量、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続投与して作製される、請求項1又は2記載の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物。 - 少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有し、全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが30%以上の高脂肪食を、
血中ALT濃度、血中AST濃度、肝臓TG量、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続的に摂取させて作製される非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物。 - 高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させた動物に、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与する、非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物の作製方法。
- 前記高脂肪食は、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有し、全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが30%以上の高脂肪食である、請求項5記載の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物の作製方法。
- 前記テトラサイクリン系抗生物質を、
血中ALT濃度、血中AST濃度、肝臓TG量、肝臓TNFα mRNA量及び肝臓IL−1β mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続投与する、請求項5又は6記載の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物の作製方法。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物に候補薬物を投与するステップを備える、非アルコール性脂肪性肝炎用薬物のスクリーニング方法。
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