JPWO2005111572A1 - Sample preparation apparatus and method - Google Patents

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Abstract

本発明は、種々のプロトコールに対応することができ且つ再現性を向上させて信頼性の高い解析結果を得ることが可能な試料調製装置等を提供することを目的とする。本発明による試料調製装置は、生体分子を含む物質から被検体試料を調製するものであって、その物質が収容される第一の容器と、第一の容器内へ注入される溶液が収容される第二の容器と、第二の容器に収容された溶液を第一の容器へ注入する分注手段と、第一の容器を移動自在に保持する移動保持手段と、移動保持手段を振とうさせて第一の容器内の物質及び溶液を撹拌する振とう手段と、振とうされた後の溶液を第一の容器から排出させて被検体試料を第三の回収する回収手段とを備える。An object of this invention is to provide the sample preparation apparatus etc. which can respond | correspond to a various protocol, can improve reproducibility, and can obtain a reliable analysis result. A sample preparation device according to the present invention prepares a specimen sample from a substance containing a biomolecule, and contains a first container in which the substance is stored and a solution to be injected into the first container. A second container, a dispensing means for injecting the solution contained in the second container into the first container, a movement holding means for holding the first container movably, and a movement holding means. A shaking means for stirring the substance and solution in the first container, and a collecting means for discharging the shaken solution from the first container and collecting the specimen sample third.

Description

本発明は、生体分子を含む担体等の物質から被検体試料を調製するための装置及び方法に関する。   The present invention relates to an apparatus and method for preparing an analyte sample from a substance such as a carrier containing a biomolecule.

ポストゲノム時代の重要な研究として、プロテオーム解析が注目されている。プロテオーム解析では、生体を構成する細胞内に含まれるタンパク質の網羅的な解析が行われ、近年、二次元電気泳動に代表されるゲル電気泳動よるタンパク質分離、及び質量分析を用いたタンパク質プロファイリングが頻繁に行われている。代表的な解析手順としては、まず、電気泳動用に調製した生体試料を、ポリアクリルアミドゲル上に分離させ、染色、画像解析を行い、その結果に基づいて各タンパク質のスポットの切り出しを行う。次に、切り出したスポットに対してゲル内タンパク質酵素消化を施した後、溶液試薬等を用い、質量分析用の被検体試料としての消化ペプチド断片を含むサンプルを回収する。それから、ペプチド断片の質量分析を実施し、データベースから予想されるペプチド断片の理論上の質量スペクトルと、実測された質量スペクトルのパターンとを、タンパク質同定用検索エンジンを用いて比較照合し、消化前のタンパク質を同定する。   Proteome analysis is attracting attention as an important research in the post-genomic era. In proteome analysis, comprehensive analysis of proteins contained in cells constituting the living body is performed, and in recent years, protein profiling using mass spectrometry and protein separation by gel electrophoresis represented by two-dimensional electrophoresis has been frequently performed. Has been done. As a typical analysis procedure, first, a biological sample prepared for electrophoresis is separated on a polyacrylamide gel, stained and image-analyzed, and a spot of each protein is cut out based on the result. Next, after subjecting the cut-out spot to in-gel protein enzyme digestion, a sample containing a digested peptide fragment as an analyte sample for mass spectrometry is collected using a solution reagent or the like. Then, mass analysis of the peptide fragment was performed, and the theoretical mass spectrum of the peptide fragment predicted from the database was compared with the pattern of the actually measured mass spectrum using a protein identification search engine. To identify proteins.

ここで、最終的に質量分析によってタンパク質同定を行う際の分析感度、同定の確度、及び再現性は、電気泳動で分離され切り出されたスポットから質量分析用の被検体試料を調製するまでの一連の処理に依るところが大きい。それに加え、多検体の試料を処理して解析のスループットを向上させる観点、及び再現性を確実に高める観点から、試料調製のための各種自動機器が開発されている。   Here, the analysis sensitivity, the accuracy of identification, and the reproducibility when finally performing protein identification by mass spectrometry are a series of steps from preparation of a sample sample for mass spectrometry from a spot separated by electrophoresis. The place depends on the processing of. In addition, various automatic instruments for sample preparation have been developed from the viewpoints of processing a large number of specimens to improve the throughput of analysis and reliably increasing reproducibility.

例えば、非特許文献１には、二次元電気泳動ゲルから回収されたタンパク質を含むゲルプラグをプレート内で酵素消化し、その後、別のプレートへペプチド分注する処理を自動で行うゲル酵素消化処理装置（製品名：Ettan Digester）が記載されている。また、非特許文献２には、サンプリング、分注、希釈、及びプレート洗浄といった一連の作業が自動化されたラボラトリーオートメーションシステム（製品名：BIOMEK（登録商標）2000）が記載されている。   For example, Non-Patent Document 1 discloses a gel enzyme digestion processing apparatus that automatically digests a gel plug containing a protein recovered from a two-dimensional electrophoresis gel in a plate and then dispenses the peptide to another plate. (Product name: Ettan Digester) is described. Non-Patent Document 2 describes a laboratory automation system (product name: BIOMEK (registered trademark) 2000) in which a series of operations such as sampling, dispensing, dilution, and plate washing are automated.

さらに、非特許文献３には、電気泳動で単離したタンパク質のインゲル酵素消化、脱塩・濃縮、及び質量分析計ターゲットプレートへのスポッティングを自動化した質量分析前処理自動化装置（製品名：MultiPROBE II）が記載されている。またさらに、非特許文献４には、電気泳動で分離したタンパクのゲル内消化を自動で行うゲル内タンパク消化自動化システム（製品名：Investigator ProGest）、質量分析用サンプル調製装置（製品名：Investigator ProMS）、サンプル調製自動化システム（製品名：Investigator ProPrep）等が記載されている。
アマシャム バイオサイエンス株式会社 『スポットピッキング＆酵素処理 ゲル酵素消化処理装置』パンフレット ベックマン・コールター株式会社 BIOMEK（登録商標）2000 ラボラトリーオートメーションシステム 株式会社パーキンエルマージャパン 『ライフサイエンス予算申請カタログ２００３→２００４』パンフレット 第２６頁下段（質量分析前処理自動化装置MultiPROBE II） ニップンテクノラクタス株式会社 『ゲル内タンパク消化自動化システム Investigator ProGest（商標）Protein Digestion Station』 パンフレット Furthermore, Non-Patent Document 3 discloses a mass spectrometry pretreatment automation device (product name: MultiPROBE II) that automates in-gel enzyme digestion, desalting / concentration, and spotting on a mass spectrometer target plate of a protein isolated by electrophoresis. ) Is described. Furthermore, Non-Patent Document 4 includes an in-gel protein digestion automation system (product name: Investigator ProGest) that automatically digests proteins separated by electrophoresis in a gel, and a sample preparation device for mass spectrometry (product name: Investigator ProMS). ), Sample preparation automation system (product name: Investigator ProPrep) and the like.
Amersham Biosciences, Inc. “Spot Picking & Enzyme Treatment Gel Enzyme Digestion Equipment” Brochure Beckman Coulter Co., Ltd. BIOMEK (registered trademark) 2000 Laboratory Automation System PerkinElmer Japan Co., Ltd. “Life Science Budget Application Catalog 2003 → 2004” Pamphlet, page 26, lower column (Mass Spectro Pretreatment Automation System MultiPROBE II) NIPPON Technolactas Co., Ltd. “Investigator ProGest (trademark) Protein Digestion Station”

しかし、従来の各種自動化装置では、質量分析用試料の回収率において不十分であり、特に、試料の性状、要求感度、プロトコールの種類によっては、質量分析用試料の調製は、熟練者の技能に頼らざるを得ないことも多々あった。この場合、質量分析用試料の回収率は、作業者の相違や作業状況の相違によって差異が生じることがある。その結果、質量分析において、そのような差異に基づく解析結果のばらつき（同定の確度の低下）、及び再現性が問題となっていた。殊に、近時、例えば、発現量が低いタンパク質を同定するための高感度微量分析を行う必要性が更に高まっており、解析結果のばらつきや再現性の問題が一層顕在化する傾向にある。   However, with various conventional automated devices, the recovery rate of the sample for mass spectrometry is inadequate. In particular, depending on the properties of the sample, the required sensitivity, and the type of protocol, the preparation of the sample for mass spectrometry is difficult for skilled workers. There were many things that I had to rely on. In this case, the recovery rate of the sample for mass spectrometry may vary depending on the worker and the working situation. As a result, in mass spectrometry, variations in analysis results based on such differences (decrease in identification accuracy) and reproducibility have been problems. In particular, recently, for example, the need for highly sensitive microanalysis for identifying proteins with low expression levels has further increased, and the problems of variation in analysis results and reproducibility tend to become more apparent.

そこで、本発明は、かかる事情に鑑みてなされたものであり、種々のプロトコールに対応することができ、かかるばらつきを十分に抑え、且つ、再現性を向上させて信頼性の高い解析結果を得ることが可能な試料調製装置及び方法を提供することを目的とする。   Therefore, the present invention has been made in view of such circumstances, can cope with various protocols, sufficiently suppress such variations, improve reproducibility, and obtain highly reliable analysis results. It is an object of the present invention to provide a sample preparation apparatus and method capable of performing the above.

上記課題を解決するために、本発明による試料調製装置は、生体分子を含む物質（例えば、電気泳動によって分離され切り出された各種タンパク質のゲルスポット等の担体に生体分子が担持された試料、その他液状又は固状の試料等；以下「生体分子含有物質」と称する場合がある）から被検体試料を調製するためのものであって、その生体分子含有物質が収容される第一の容器と、第一の容器内へ注入される溶液が収容される第二の容器と、第二の容器に収容された溶液を第一の容器へ注入する分注手段と、第一の容器を移動自在に保持する移動保持手段と、保持手段を振とうさせて第一の容器内の生体分子含有物質及び溶液を撹拌する振とう手段と、振とうされた後の溶液を第一の容器から排出させて被検体試料を第三の容器に回収する回収手段とを備える。   In order to solve the above problems, a sample preparation apparatus according to the present invention is a substance containing a biomolecule (for example, a sample in which a biomolecule is supported on a carrier such as a gel spot of various proteins separated and extracted by electrophoresis, and the like. A liquid or solid sample or the like; hereinafter referred to as a “biomolecule-containing substance”)) for preparing a specimen sample, and a first container for containing the biomolecule-containing substance; A second container for storing a solution to be injected into the first container; a dispensing means for injecting the solution stored in the second container into the first container; and the first container is movable. Moving holding means for holding, shaking means for shaking the holding means to stir the biomolecule-containing substance and solution in the first container, and discharging the shaken solution from the first container Collect the specimen sample in a third container And a yield means.

このように構成された試料調製装置においては、第一の容器に生体分子含有物質が第一の容器に収容される。一方、第二の容器には、その第一の容器内へ注入される適宜の溶液が収容される。この溶液は、分注手段によって、第二の溶液から第一の容器内へ注入される。この第一の容器は、移動保持手段によって所望の位置に移動され、その状態で保持される。   In the sample preparation device configured as described above, the biomolecule-containing substance is accommodated in the first container. On the other hand, the second container contains an appropriate solution to be injected into the first container. This solution is injected into the first container from the second solution by means of dispensing. The first container is moved to a desired position by the movement holding means and is held in that state.

適宜の位置に移動保持された第一の容器は、振とう手段によって振とうされ、これにより、第一の容器内の生体分子を含む物質と溶液とが撹拌される。このとき、移動保持手段を介して第一の容器を振とうさせるようにしてもよい。こうして、その生体分子含有物質に含まれる生体分子と溶液とが十分に混合される。よって、単に生体分子含有物質へ溶液を注入して静止した状態でインキュベーション等の処理を行う場合に比して、生体分子含有物質中の生体分子と溶液との接触頻度が増大され、化学反応や化学操作が不均一に進行してしまうことが抑制される。更には、質量分析において妨げとなる各種塩を効率的に洗浄除去することもできる。また、第一の容器を移動させて所望の位置で所望の振とう操作、更には、必要であれば他の操作が可能なので、複数の処理、すなわち、複数種類の溶液と生体分子含有物質との相互作用を順次実施するようなプロトコールにおける一連の処理を、連続して自動で処理し得る。   The first container moved and held at an appropriate position is shaken by the shaking means, whereby the substance and the solution containing the biomolecule in the first container are agitated. At this time, you may make it shake a 1st container via a movement holding means. In this way, the biomolecule contained in the biomolecule-containing substance and the solution are sufficiently mixed. Therefore, compared to simply injecting the solution into the biomolecule-containing substance and performing a treatment such as incubation in a stationary state, the contact frequency between the biomolecule in the biomolecule-containing substance and the solution is increased, and the chemical reaction or The chemical operation is prevented from proceeding unevenly. Furthermore, various salts that hinder mass spectrometry can be efficiently washed away. In addition, since the first container is moved and a desired shaking operation is performed at a desired position, and other operations are possible if necessary, a plurality of treatments, that is, a plurality of types of solutions and a biomolecule-containing substance A series of processes in a protocol in which the interactions are sequentially performed can be automatically processed continuously.

さらに、このように振とう処理が行われた後の溶液が第一の容器から排出され、生体分子含有物質中の生体分子と相互作用した溶液が、他の処理操作用の被検体試料として第三の容器に回収される。このような回収処理も、例えば、移動保持手段によって、第一の容器を適宜の所望の場所に移動せしめて実施し得るので、回収のための機構、装置等を装備し易くなる。   Further, the solution after the shaking treatment is discharged from the first container, and the solution interacting with the biomolecule in the biomolecule-containing substance is used as a specimen sample for another processing operation. Collected in three containers. Such a recovery process can also be performed by moving the first container to an appropriate desired location by the moving holding means, for example, so that it becomes easy to equip a mechanism, device, etc. for recovery.

また、第二の容器は、種類が互いに異なる複数の溶液が個別に収容されるものであると好ましい。通常のプロトコールの手順は、工程毎に種々の溶液（例えば、化学試薬、消化酵素等）を生体分子含有物質に供給して所定の条件でインキュベーションした後に、その溶液を都度回収する。そのようなプロトコールに必要な種々の溶液が第二の容器に収容されていれば、各溶液と生体分子含有物質との相互作用が、移動保持手段及び振とう手段を用いて好適に実施される。   Moreover, it is preferable that a 2nd container accommodates the several solution from which a kind mutually differs separately. In the normal protocol procedure, various solutions (for example, chemical reagents, digestive enzymes, etc.) are supplied to the biomolecule-containing substance for each step and incubated under predetermined conditions, and then the solutions are collected each time. If various solutions necessary for such a protocol are accommodated in the second container, the interaction between each solution and the biomolecule-containing substance is preferably carried out using the movement holding means and the shaking means. .

さらに、振とう手段が、溶液の種類に応じて撹拌速度が調節されるものであることがより好ましい。各溶液と生体分子含有物質との混合条件は、それらの相互作用によって好適な条件が異なる。よって、本発明による試料調製装置は、振とう手段での撹拌速度を各溶液に応じて一定の値に調節することにより、生体分子含有物質中の生体分子と溶液との相互作用が、十分に且つ再現性よく実施される。   Furthermore, it is more preferable that the shaking means is one in which the stirring speed is adjusted according to the type of the solution. The mixing conditions for each solution and the biomolecule-containing substance vary depending on their interaction. Therefore, the sample preparation apparatus according to the present invention has a sufficient interaction between the biomolecule in the biomolecule-containing substance and the solution by adjusting the stirring speed of the shaking means to a constant value according to each solution. And it is implemented with good reproducibility.

より具体的には、第一の容器が載置される領域及び第二の容器が載置される領域が連設されており、振とうが実施される領域及び被検体試料が回収される領域が、第一の容器が載置される領域及び第二の容器が載置される領域と併設されているものであると、一層好適である。こうすれば、言わば静的な処理である第二の容器から第一の容器への分注操作を行う領域（エリア）と、動的な処理である振とう操作等を行う領域とを分離できるので、プロセス管理上好ましい。   More specifically, an area where the first container is placed and an area where the second container is placed are connected in series, and an area where the shaking is performed and an area where the specimen sample is collected However, it is more preferable that the region where the first container is placed and the region where the second container is placed are provided side by side. In this way, it is possible to separate the area (area) where the dispensing operation from the second container to the first container, which is a so-called static process, and the area where the shaking operation, etc., which is a dynamic process, are performed. Therefore, it is preferable in process management.

加えて、振とうされた後の溶液を含む第一の容器内へガスを供給して第一の容器内を加圧する加圧手段を更に備えると一層好適である。また、加圧手段は、より効率的に加圧するため、加圧に際して密閉手段（例えば、シリコンゴム等の弾性体等）を備えることが好ましい。   In addition, it is more preferable to further include a pressurizing means for supplying gas into the first container containing the solution after being shaken to pressurize the inside of the first container. The pressurizing means preferably includes a sealing means (for example, an elastic body such as silicon rubber) at the time of pressurization in order to pressurize more efficiently.

また、本発明による試料調製方法は、本発明による試料調製装置を用いて有効に実施される方法であり、生体分子含有物質から被検体試料を調製するための方法であって、その生体分子含有物質を第一の容器へ収容する収容工程と、第一の容器内へ注入される溶液を第二の容器へ収容する溶液収容工程と、第二の容器に収容された溶液を第一の容器へ注入する分注工程と、第一の容器を所定の領域に移動せしめて保持する移動保持工程と、保持手段を振とうさせて第一の容器内の生体分子含有物質及び溶液を撹拌する振とう工程と、振とう工程を実施した後に、溶液を第一の容器から排出させて被検体試料を第三の容器に回収する回収工程とを備える。   Further, the sample preparation method according to the present invention is a method that is effectively carried out using the sample preparation device according to the present invention, and is a method for preparing a specimen sample from a biomolecule-containing substance, the biomolecule containing An accommodating step for accommodating the substance in the first container, a solution accommodating step for accommodating the solution injected into the first container in the second container, and the solution accommodated in the second container in the first container A dispensing step of injecting into the first container, a moving and holding step of moving and holding the first container to a predetermined region, and a shaking for stirring the holding means and stirring the biomolecule-containing substance and solution in the first container. After performing the shaking step and the shaking step, the method includes a recovery step of discharging the solution from the first container and recovering the specimen sample in the third container.

この場合、溶液収容工程においては、第二の容器として、種類が互いに異なる複数の溶液が個別に収容されるものを用いると有用である。   In this case, in the solution storage step, it is useful to use a second container in which a plurality of different types of solutions are individually stored.

さらに、回収工程においては、第一の容器にガスを供給して第一の容器内を加圧すると好適である。また、回収工程においては、加圧に際して密閉手段（例えば、シリコンゴム等の弾性体等）を用いることが好ましい。   Furthermore, in the recovery step, it is preferable to supply gas to the first container and pressurize the inside of the first container. In the recovery step, it is preferable to use a sealing means (for example, an elastic body such as silicon rubber) during pressurization.

本発明の試料調製装置及び方法によれば、第一の容器に収容した生体分子含有物質に、第二の容器から溶液を供給し、その後、移動保持手段によって第一の容器が移動保持され、さらに、所望の条件でその第一の容器が振とうされることにより十分に撹拌される。そして、その溶液が被検体試料として回収されるので、生体分子含有物質からの目的成分の抽出分離が高い効率で実施され、且つ、処理操作の再現性が極めて高められる。よって、種々のプロトコールに対応した処理を実現することができ、被検体試料が供される分析処理におけるばらつきを十分に抑え、且つ、その再現性を向上させて信頼性の高い解析結果を得ることが可能となる。   According to the sample preparation apparatus and method of the present invention, the biomolecule-containing substance contained in the first container is supplied with the solution from the second container, and then the first container is moved and held by the moving holding means. Further, the first container is sufficiently agitated by shaking under the desired conditions. And since the solution is collect | recovered as a specimen sample, extraction separation of the target component from a biomolecule containing substance is implemented with high efficiency, and the reproducibility of processing operation is extremely improved. Therefore, processing corresponding to various protocols can be realized, variation in the analytical processing in which the specimen sample is provided is sufficiently suppressed, and the reproducibility is improved to obtain a highly reliable analysis result. Is possible.

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、上下左右等の位置関係は、特に断らない限り、図面に示す位置関係に基づくものとする。また、図面の寸法比率は、図示の比率に限られるものではない。   Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. The positional relationship such as up, down, left, and right is based on the positional relationship shown in the drawings unless otherwise specified. Further, the dimensional ratios in the drawings are not limited to the illustrated ratios.

図１は、本発明による試料調製装置の好適な一実施形態を概略的に示す正面図である。また、図２は、図１におけるII−II線に沿う断平面図である。さらに、図３は、図１に示す試料調製装置の右側面図である。処理装置１００（試料調製装置）は、質量分析に供する被検体試料を調製するための前処理装置、例えば、後述するゲル内酵素消化を利用したペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）法により、二次元電気泳動によって分離されたタンパク質スポット同定用の質量分析に供する被検体試料を調製するための前処理装置である。処理装置１００は、筐体１内のベース２上に、チップ廃棄部３、チップステージ４、試薬リザーバ５，６（共に、第二の容器）が一列に配置され、それらに対して、チップ温度調節部７、バキュームマニホールド８，９が併設されたものである。   FIG. 1 is a front view schematically showing a preferred embodiment of a sample preparation apparatus according to the present invention. 2 is a cross-sectional plan view taken along line II-II in FIG. FIG. 3 is a right side view of the sample preparation device shown in FIG. The processing apparatus 100 (sample preparation apparatus) is a two-dimensional electric device that uses a pretreatment apparatus for preparing a specimen sample to be subjected to mass spectrometry, for example, a peptide mass fingerprinting (PMF) method using in-gel enzyme digestion described later. It is the pre-processing apparatus for preparing the specimen sample used for the mass spectrometry for protein spot identification isolate | separated by electrophoresis. In the processing apparatus 100, a chip disposal unit 3, a chip stage 4, reagent reservoirs 5 and 6 (both are second containers) are arranged in a row on a base 2 in a housing 1, and the chip temperature The adjusting unit 7 and the vacuum manifolds 8 and 9 are provided together.

チップステージ４は、複数のチップ４２が例えばアレイ状に配置されたチップホルダ４１が載置されるものである。チップ４２は、細長尺の略筒状をなしており、チップホルダ４１上への配置数は特に制限されないが、図示の例では、容量２００μＬのチップが８列×１２行（処理装置１００の奥行き方向に直交する方向を‘列’方向とする。以下同様。）で９６個配置される。また、試薬リザーバ５（第二の容器）は、水平断面において奥行きが広く幅狭に形成された凹部５１を有しており、その凹部５１内に適宜の試薬（溶液）が収容されるようになっている。また、試薬リザーバ５は、凹部５１内に収容された試薬を、一定の温度、例えば常温に保持する恒温槽として機能する。   The chip stage 4 is for mounting a chip holder 41 on which a plurality of chips 42 are arranged, for example, in an array. The chip 42 has an elongated and substantially cylindrical shape, and the number of chips 42 arranged on the chip holder 41 is not particularly limited. However, in the illustrated example, chips having a capacity of 200 μL are arranged in 8 columns × 12 rows (the depth of the processing apparatus 100). The direction orthogonal to the direction is the 'row' direction. In addition, the reagent reservoir 5 (second container) has a recess 51 that is wide and narrow in the horizontal cross section, and an appropriate reagent (solution) is accommodated in the recess 51. It has become. In addition, the reagent reservoir 5 functions as a thermostat that holds the reagent stored in the recess 51 at a constant temperature, for example, room temperature.

さらに、試薬リザーバ６（第二の容器）は、凹部５１と同等形状の凹部６１が処理装置１００の長手方向に複数（図示の例では１０個）設けられたものであり、各凹部６１内に互いに異なる適宜の試薬溶液（溶液）が収容されるようになっている。またさらに、試薬リザーバ６は、凹部６１，…内に収容された試薬を、例えば４℃といった低温に保持する（４℃インキュベーション）恒温槽として機能する。   Further, the reagent reservoir 6 (second container) is provided with a plurality of (in the illustrated example, 10) recesses 61 having the same shape as the recesses 51 in the longitudinal direction of the processing apparatus 100. Appropriate reagent solutions (solutions) different from each other are accommodated. Furthermore, the reagent reservoir 6 functions as a thermostat that holds the reagents contained in the recesses 61,... At a low temperature such as 4 ° C. (4 ° C. incubation).

また、一列に配置されたこれらのチップ廃棄部３、チップステージ４、及び試薬リザーバ５，６の鉛直上方には、分注ヘッド１０（分注手段）が設けられている。分注ヘッド１０は、奥行き方向にチップ４２，…と同数分（図示の例では８つ）並列配置された分注用シリンジプローブ１１を備えている。分注ヘッド１０は、それ自体が、列方向（図示矢印Ｘ方向）及び奥行き方向（図示矢印Ｙ方向）に駆動されると共に、シリンジプローブ１１が、鉛直方向（図示矢印Ｚ方向）に駆動されるようになっている。分注ヘッド１０の駆動方法は、特に制限されず、例えば、分注ヘッド１０上方に設けられた公知のガイドレールを有する一方向ステージやＸ−Ｙステージ等を利用できる。また、シリンジプローブ１１の鉛直方向の駆動方法も特に制限されず、公知のモータ装置を利用でき、或いは、分注ヘッド１０と共に可動するＸ−Ｙ−Ｚステージを用いてもよい。   A dispensing head 10 (dispensing means) is provided vertically above the chip discarding unit 3, the chip stage 4, and the reagent reservoirs 5 and 6 arranged in a row. The dispensing head 10 includes a dispensing syringe probe 11 arranged in parallel in the depth direction by the same number as the tips 42,... (Eight in the illustrated example). The dispensing head 10 itself is driven in the row direction (arrow X direction in the figure) and the depth direction (arrow Y direction in the figure), and the syringe probe 11 is driven in the vertical direction (arrow Z direction in the figure). It is like that. The driving method of the dispensing head 10 is not particularly limited, and for example, a one-way stage or an XY stage having a known guide rail provided above the dispensing head 10 can be used. Also, the driving method of the syringe probe 11 in the vertical direction is not particularly limited, and a known motor device can be used, or an XYZ stage movable with the dispensing head 10 may be used.

さらに、チップ温度調節部７、及びバキュームマニホールド８，９の装置後方には、把持振とうユニット１５が隣設されている。把持振とうユニット１５は、列方向（図示Ｘ方向）に駆動されるステージ１５１に、フィルタープレート８１（保持具）を把持可能であり且つ奥行き方向（図示Ｙ方向）に駆動されるアーム状のロボットハンド１５２（保持手段）が取り付けられたものである。また、把持振とうユニット１５は、ロボットハンド１５２に接触するＰＺＴ素子１５３を有している。これにより、ロボットハンド１５２に把持された状態のフィルタープレート８１が所定の振とう速度で振とうされる。このように、把持振とうユニット１５は、本発明の移動保持手段と振とう手段とを兼ねたものである。   Further, a grip shaker unit 15 is provided adjacent to the chip temperature control unit 7 and the vacuum manifolds 8 and 9 at the rear of the apparatus. The gripping and shaking unit 15 can hold a filter plate 81 (holding tool) on a stage 151 driven in a row direction (X direction in the drawing) and is an arm-shaped robot driven in the depth direction (Y direction in the drawing). A hand 152 (holding means) is attached. In addition, the gripping and shaking unit 15 includes a PZT element 153 that contacts the robot hand 152. As a result, the filter plate 81 held by the robot hand 152 is shaken at a predetermined shaking speed. As described above, the gripping and shaking unit 15 serves as both the movement holding means and the shaking means of the present invention.

さらに、把持振とうユニット１５には、ロボットハンド１５２で把持したフィルタープレート８１の上部全体を覆うように開閉可能で且つ遮光性を有するカバー（図示せず）が設けられている。このカバーが閉じられた状態で、フィルタープレート８１が封止且つ遮光されると共に、窒素ガス供給口２１に接続された窒素ガス源（図示せず）から供給される窒素ガスによって、その封止空間が窒素パージされるようになっている。   Further, the gripping and shaking unit 15 is provided with a cover (not shown) that can be opened and closed and covers the entire upper part of the filter plate 81 gripped by the robot hand 152. With the cover closed, the filter plate 81 is sealed and shielded from light, and the sealed space is sealed by nitrogen gas supplied from a nitrogen gas source (not shown) connected to the nitrogen gas supply port 21. Is purged with nitrogen.

ここで、フィルタープレート８１は、例えば、複数のウェル８２（第一の容器）が配置されているものが挙げられる。複数のウェル８２の配置数は、特に制限されないが、例えば、８列×１２行で９６個配置されるものが挙げられる。また、ウェル８２は、底面にフィルター８３を有することが好ましい。フィルター８３としては、例えば、ＰＶＤＦメンブレン等が挙げられる。   Here, the filter plate 81 includes, for example, a plate in which a plurality of wells 82 (first containers) are arranged. The number of arrangement of the plurality of wells 82 is not particularly limited, and for example, 96 are arranged in 8 columns × 12 rows. The well 82 preferably has a filter 83 on the bottom surface. Examples of the filter 83 include a PVDF membrane.

一方、チップ温度調節部７は、把持振とうユニット１５によって移動されてきたフィルタープレート８１が載置されるものであり、且つ、フィルタープレート８１に搭載された状態のウェル８２，…（第一の容器）の内容物を、例えば３７℃といった温度に保持する（３７℃インキュベーション）恒温槽として機能する。また、バキュームマニホールド９は、図示しない減圧排気系が接続された排気口２０に接続されており、把持振とうユニット１５によって移動されてきたフィルタープレート８１上の各ウェル８２の内容物を、いわゆる‘真空引き’によってウェル８２から回収するためのものである。さらに、バキュームマニホールド８も、図示しない減圧排気系が接続された排気口２０に接続されており、ウェル８２内の残液排出／減圧洗浄を行うものである。   On the other hand, the chip temperature adjusting unit 7 is for placing the filter plate 81 moved by the gripping and shaking unit 15 and the wells 82,. The contents of the (container) function as a thermostatic chamber that maintains a temperature such as 37 ° C. (37 ° C. incubation). Further, the vacuum manifold 9 is connected to an exhaust port 20 to which a vacuum exhaust system (not shown) is connected, and the contents of each well 82 on the filter plate 81 moved by the grip shaker unit 15 are so-called “ It is for recovering from the well 82 by “evacuation”. Further, the vacuum manifold 8 is also connected to an exhaust port 20 connected to a vacuum exhaust system (not shown), and discharges residual liquid in the well 82 and performs vacuum cleaning.

また、筐体１には、棒状の取手部Ｈが設置された前方扉１ａが設けられており、前方扉１ａを上方に押し上げた状態で、ベース２上方の空間が開放され、前方扉１ａが下方に押し下げられた状態で、ベース２上方の空間が外部から遮断される。さらに、前方扉１ａにはガラス窓Ｗ１が設けられており、またさらに、筐体１の側壁には、ガラス窓Ｗ２が設けられており、これらにより内部が視認可能とされている。   Further, the housing 1 is provided with a front door 1a in which a rod-like handle portion H is installed. In a state where the front door 1a is pushed upward, the space above the base 2 is opened, and the front door 1a is opened. The space above the base 2 is blocked from the outside while being pushed downward. Further, a glass window W1 is provided on the front door 1a, and further, a glass window W2 is provided on the side wall of the housing 1, thereby enabling the inside to be visually recognized.

また、前方扉１ａ下の前面パネル３０は、下方にせり出すように傾斜しており、非常停止ボタン３１、タッチパネル３２、バキュームマニホールド８，９内の減圧モニタ３３、等が設けられている。さらにまた、前面パネル３０と連通する側面３４には、窒素ガス圧力計３５、排熱口３６、チップ温度調節部７の温度調節器３７、及び試薬リザーバ６の温度調節器３８が設けられている。   Further, the front panel 30 below the front door 1a is inclined so as to protrude downward, and is provided with an emergency stop button 31, a touch panel 32, a decompression monitor 33 in the vacuum manifolds 8 and 9, and the like. Further, a side surface 34 communicating with the front panel 30 is provided with a nitrogen gas pressure gauge 35, a heat exhaust port 36, a temperature regulator 37 of the chip temperature regulator 7, and a temperature regulator 38 of the reagent reservoir 6. .

このように構成された処理装置１００を用いた本発明による試料調製方法の一実施形態を実施する手順の一例について、以下に説明する。この手順は、ゲル内酵素消化を利用したＰＭＦ法により、二次元電気泳動によって分離されたタンパク質スポットからペプチドを抽出し、質量分析用の被検体試料を調製する方法である。   An example of a procedure for carrying out an embodiment of the sample preparation method according to the present invention using the processing apparatus 100 configured as described above will be described below. This procedure is a method of preparing an analyte sample for mass spectrometry by extracting peptides from protein spots separated by two-dimensional electrophoresis by the PMF method using in-gel enzyme digestion.

まず、生体分子含有物質として、タンパク質スポットのゲル片を切り出し、洗浄する。具体的には、二次元電気泳動に供されたポリアクリルアミドゲル上から等電点又は分子量に偏在が極力なく且つ含有量が比較的高いタンパク質スポットを画像処理等によって複数選択する。次に、選択されたタンパク質スポットを含むゲル片を切り出す。   First, as a biomolecule-containing substance, a protein spot gel piece is cut out and washed. Specifically, a plurality of protein spots that are not unevenly distributed in isoelectric point or molecular weight and have a relatively high content are selected from a polyacrylamide gel subjected to two-dimensional electrophoresis by image processing or the like. Next, the gel piece containing the selected protein spot is cut out.

次いで、上記各ゲル片（生体分子含有物質の一例）をフィルタープレート８１の各ウェル８２内に収容する（収容工程）。このフィルタープレート８１をバキュームマニホールド８に載置する。これと並行して、以下の各試薬を準備し、試薬リザーバ５，６の適宜の位置の凹部５１，６１，…内に収容する（溶液収容工程；以下、試薬リザーバ６に収容されているものとして説明する。）。   Next, each gel piece (an example of a biomolecule-containing substance) is accommodated in each well 82 of the filter plate 81 (accommodating step). The filter plate 81 is placed on the vacuum manifold 8. In parallel with this, the following reagents are prepared and stored in the recesses 51, 61,... At appropriate positions of the reagent reservoirs 5, 6 (solution storage step; hereinafter stored in the reagent reservoir 6). To explain.)

・ｐＨを８．５に調製したＴｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ液
・還元用液
・アルキル化用液
・水／メタノール／酢酸＝４：５：１の混合液
・炭酸水素アンモニウム
・脱染色液
・アセトニトリル１００％液
・トリプシン（０．１％オクチルグリコシド、又は０．１％５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｅｎｔｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）
・アセトニトリル／水／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）＝１：１の混合液
・アセトニトリル／水／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）＝７：３の混合液・ Tris Buffer solution adjusted to pH 8.5
・ Reducing liquid ・ Alkylating liquid ・ Water / methanol / acetic acid = 4: 5: 1 mixed liquid ・ Ammonium bicarbonate ・ Destained liquid ・ Acetonitrile 100% liquid ・ Trypsin (0.1% octyl glycoside, or 0. 1% 5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside)
A mixture of acetonitrile / water / 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) = 1: 1 A mixture of acetonitrile / water / 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) = 7: 3

次に、ゲル内消化に先立って脱染色を実施する。具体的には、まず、分注ヘッド１０のシリンジプローブ１１，…が、チップホルダ４１に載置されたチップ４２上に位置するように、分注ヘッド１０を移動させる。さらに、シリンジプローブ１１，…を下方へ移動させ、各シリンジプローブ１１にチップ４２を装着させる。次に、分注ヘッド１０のシリンジプローブ１１，…が、試薬リザーバ６に収容された脱染色液に位置するように、分注ヘッド１０を初期位置から移動させる。次いで、複数のシリンジプローブ１１，…を、チップ４２の先端が脱染色液に浸漬するまで下方に移動させて停止し、適宜の量（例えば２００μＬ）を吸入した後、シリンジプローブ１１，…が鉛直方向の初期位置に来るように上方に移動させる。   Next, destaining is performed prior to in-gel digestion. Specifically, first, the dispensing head 10 is moved so that the syringe probes 11,... Of the dispensing head 10 are positioned on the tip 42 placed on the tip holder 41. Further, the syringe probes 11 are moved downward, and the tips 42 are attached to the syringe probes 11. Next, the dispensing head 10 is moved from the initial position so that the syringe probes 11,... Of the dispensing head 10 are located in the destaining liquid stored in the reagent reservoir 6. Next, the plurality of syringe probes 11,... Are moved downward until the tips of the tips 42 are immersed in the destaining solution, stopped, and after sucking an appropriate amount (for example, 200 μL), the syringe probes 11,. Move upward to reach the initial position in the direction.

それから、分注ヘッド１０のシリンジプローブ１１，…が、バキュームマニホールド８に載置されたフィルタープレート８１の各ウェル８２上に位置するように、分注ヘッド１０を移動させる。さらに、シリンジプローブ１１，…を下方へ移動させ、チップ４２の内部に吸入保持していた脱染色液をウェル８２内に注入する（分注工程）。この分注操作は、溶液が異なっても同様であり、以下の説明では詳述を省略する。   Then, the dispensing head 10 is moved so that the syringe probes 11,... Of the dispensing head 10 are positioned on the respective wells 82 of the filter plate 81 placed on the vacuum manifold 8. Further, the syringe probes 11,... Are moved downward, and the destaining solution that has been sucked and held inside the tip 42 is injected into the well 82 (dispensing step). This dispensing operation is the same even if the solutions are different, and will not be described in detail in the following description.

この分注操作を繰り返し、フィルタープレート８１上の全てのウェル８２に脱染色液を分注する。次に、フィルタープレート８１を把持振とうユニット１５で把持し、ステージ１５１とロボットハンド１５２とを駆動させて、フィルタープレート８１をチップ温度調節部７の所定位置に設置する（移動保持工程）。この把持状態のまま、ＰＺＴ素子１５３を運転し、５分間、ウェル８２内に収容されたゲル片及び脱染色液を、比較的高速な振とう速度で撹拌する（振とう工程）。以下、比較的低速な条件での振とう撹拌を「低速撹拌」といい、比較的高速な条件での振とう撹拌を「高速撹拌」という。   This dispensing operation is repeated, and the destaining solution is dispensed into all the wells 82 on the filter plate 81. Next, the filter plate 81 is gripped by the gripping and shaking unit 15, the stage 151 and the robot hand 152 are driven, and the filter plate 81 is placed at a predetermined position of the chip temperature adjusting unit 7 (moving and holding step). In this gripping state, the PZT element 153 is operated, and the gel pieces and destaining solution stored in the well 82 are stirred for 5 minutes at a relatively high shaking speed (shaking process). Hereinafter, shaking stirring under a relatively low speed condition is referred to as “low speed stirring”, and shaking stirring under a relatively high speed condition is referred to as “high speed stirring”.

振とう後、把持振とうユニット１５を駆動させ、フィルタープレート８１をバキュームマニホールド８に移載し、減圧排気系を運転してウェル８２内に残存する脱染色液を吸引排出する。それから、把持振とうユニット１５を駆動させ、フィルタープレート８１をチップ温度調整部７又はバキュームマニホールド８に移載する。   After shaking, the gripping shaking unit 15 is driven, the filter plate 81 is transferred to the vacuum manifold 8, and the vacuum exhaust system is operated to suck and discharge the destaining solution remaining in the well 82. Then, the gripping and shaking unit 15 is driven, and the filter plate 81 is transferred to the chip temperature adjusting unit 7 or the vacuum manifold 8.

以上の分注、振とう撹拌、及び吸引排出に至る操作は、他の試薬溶液に対しても同様に実行されるので、以下の説明においては、重複する内容を適宜省略する。   Since the operations up to the above dispensing, shaking and agitation and aspiration and discharge are similarly performed on other reagent solutions, the overlapping contents are appropriately omitted in the following description.

次に、脱染色液の代わりに還元用液を分注し、室温で３０分間、高速撹拌した後、残存液を吸引排出する。それに引き続き、アルキル化用液を分注し、室温で３０分間、高速撹拌した後、残存液を吸引排出する。これらの処理により、ゲル片に含まれるタンパク質を還元・アルキル化せしめる。   Next, a reducing solution is dispensed instead of the destaining solution, and after stirring at room temperature for 30 minutes, the remaining solution is sucked and discharged. Subsequently, the alkylating solution is dispensed, stirred at high speed for 30 minutes at room temperature, and then the remaining solution is sucked and discharged. By these treatments, the proteins contained in the gel pieces are reduced and alkylated.

それから、水／メタノール／酢酸混合液を分注し、３０分間高速撹拌し、残存液を吸引排出する一連の処理を４〜５回繰り返して洗浄した後、炭酸水素アンモニウムを分注し、３分間低速撹拌した後、残存液を吸引排出することにより、ゲル片を平衡化する。   Then, a water / methanol / acetic acid mixture is dispensed, stirred at high speed for 30 minutes, and a series of treatments of sucking and discharging the remaining liquid is repeated 4 to 5 times, and then ammonium bicarbonate is dispensed for 3 minutes. After stirring at low speed, the gel pieces are equilibrated by sucking and discharging the remaining liquid.

次に、還元・アルキル化され洗浄及び平衡化されたゲル片にゲル内消化を施す。具体的には、アセトニトリルを分注して、５分間高速撹拌した後、残存液を吸引排出して、ゲル片の脱水を行う。それから、トリプシンを、例えば０．５〜３μＬ程度分注し、５〜１０分程静置してゲル片を膨潤させる。   Next, the gel pieces that have been reduced, alkylated, washed and equilibrated are subjected to in-gel digestion. Specifically, acetonitrile is dispensed and stirred at high speed for 5 minutes, and then the remaining liquid is sucked and discharged to dehydrate the gel pieces. Then, trypsin is dispensed, for example, about 0.5 to 3 μL, and allowed to stand for 5 to 10 minutes to swell the gel piece.

次いで、炭酸水素アンモニウムを、例えば１０〜２０μＬ程度分注し、３７℃で５〜１２時間程度保温した後、アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ水溶液＝１：１の混合液を、例えば１００μＬ分注し、１５分間高速撹拌した後、把持振とうユニット１５を駆動させ、フィルタープレート８１をバキュームマニホールド９に移載し、減圧排気系を運転してウェル８２内の溶液（被検体試料）を回収プレート９１上のウェル９２（第三の容器）に吸引回収する（回収工程）。さらに、アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ水溶液＝７：３の混合液を、１５分間高速撹拌した後、バキュームマニホールド９にて、ウェル８２内の溶液（被検体試料）を回収プレート９１上のウェル９２に吸引回収する（回収工程）。以上により、ゲル内消化、及びそれによって生じたペプチドが回収液へ抽出される。   Next, about 10 to 20 μL of ammonium bicarbonate is dispensed, for example, and kept at 37 ° C. for about 5 to 12 hours, and then a mixture of acetonitrile / 0.1% TFA aqueous solution = 1: 1 is dispensed, for example, 100 μL. After stirring for 15 minutes at high speed, the gripping and shaking unit 15 is driven, the filter plate 81 is transferred to the vacuum manifold 9, and the vacuum exhaust system is operated to collect the solution (analyte sample) in the well 82. Aspirate and collect in the upper well 92 (third container) (collection process). Further, a mixed solution of acetonitrile / 0.1% TFA aqueous solution = 7: 3 was stirred at high speed for 15 minutes, and then the solution in the well 82 (analyte sample) was removed from the well 92 on the recovery plate 91 by the vacuum manifold 9. Collect by suction (collection process). As described above, in-gel digestion and the resulting peptide are extracted into the recovered solution.

そして、被検体試料として処理装置１００から回収されたこれらの回収液を合わせ、例えば１〜５μＬ程度になるまで遠心濃縮する。さらに、それを完全に乾燥させた後、別途調製しておいた５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ混合液（例えば５μＬ程度）に溶解し、質量分析用の試料を得る。なお、不要となったチップ４２は、チップ廃棄部３へ廃棄される。   Then, these collected liquids collected from the processing apparatus 100 as the specimen sample are combined and centrifugally concentrated to about 1 to 5 μL, for example. Furthermore, after completely drying it, it melt | dissolves in the 5% acetonitrile / 0.1% TFA liquid mixture (for example, about 5 microliters) prepared separately, and obtains the sample for mass spectrometry. Note that the chip 42 that is no longer needed is discarded to the chip discarding unit 3.

このように構成された処理装置１００及びそれを用いた本発明の試料調製方法によれば、アレイ状に多数配置されたウェル８２，…に収容されたゲル片に、プロトコールに応じた試薬溶液が分注され、把持振とうユニット１５によって、フィルタープレート８１ごとチップ温度調節部７へ移載される。そして、適宜の撹拌速度で振とう・撹拌が施される。これにより、一連の自動化処理の中で、ゲル片に含まれるタンパク質分子と試薬溶液とが十分に混合される。   According to the processing apparatus 100 configured as described above and the sample preparation method of the present invention using the processing apparatus 100, a reagent solution corresponding to the protocol is placed on the gel pieces accommodated in the wells 82,. The sample is dispensed and transferred to the chip temperature adjusting unit 7 together with the filter plate 81 by the gripping and shaking unit 15. Then, shaking and stirring are performed at an appropriate stirring speed. Thereby, the protein molecules contained in the gel piece and the reagent solution are sufficiently mixed in a series of automated processes.

よって、単にゲル片へ試薬溶液を注入して静止した状態でインキュベーション等の処理を行う場合に比して、ゲル片中のタンパク質分子と溶液との接触頻度が増大され、化学反応や化学操作が不均一に進行してしまうことを抑制でき、また、脱塩、洗浄などの操作を効率的に行うことができる。したがって、最終的にゲル片から抽出される被検体試料中の目的成分の濃度が高められると共に抽出効率の再現性を向上できる。これにより、被検体試料を用いて行われる質量分析においても、高感度、高確度、高精度、及び高い再現性を有する解析結果を得ることができる。また、自動化処理によるので、操作者の技能の差異に起因するような再現性の低下を抑止できる。   Therefore, compared with simply injecting the reagent solution into the gel piece and performing a treatment such as incubation in a stationary state, the contact frequency between the protein molecule in the gel piece and the solution is increased, and the chemical reaction and chemical operation are performed. Uneven progress can be suppressed, and operations such as desalting and washing can be performed efficiently. Therefore, the concentration of the target component in the specimen sample finally extracted from the gel piece can be increased and the reproducibility of the extraction efficiency can be improved. Thereby, even in mass spectrometry performed using a specimen sample, an analysis result having high sensitivity, high accuracy, high accuracy, and high reproducibility can be obtained. Moreover, since it is based on an automation process, it is possible to suppress a decrease in reproducibility caused by a difference in operator skills.

さらに、フィルタープレート８１が、把持振とうユニット１５のアーム状のロボットハンド１５２の先端部に保持された状態、すなわち、把持振とうユニット１５の基部よりも距離が離れた状態で振とうされるので、フィルタープレート８１内の内容物をより激しく撹拌し易くなる。よって、ゲル片に含まれるタンパク質分子と試薬溶液とが更に良く混合され、抽出効率を一層向上できる。   Further, the filter plate 81 is shaken in a state where the filter plate 81 is held at the tip of the arm-like robot hand 152 of the gripping and shaking unit 15, that is, in a state where the distance is larger than the base of the gripping and shaking unit 15. The contents in the filter plate 81 can be easily stirred more vigorously. Therefore, the protein molecules contained in the gel piece and the reagent solution are mixed better, and the extraction efficiency can be further improved.

またさらに、把持振とうユニット１５によってフィルタープレート８１をバキュームマニホールド８，９に適宜移載し、その場で、ウェル８２内の残存液の吸引排出や、被検体試料の吸引回収を実施できるので、それらのバキュームマニホールド８，９のような溶液を回収／排出洗浄するための機構の配置設計裕度を高めることができる。さらにまた、試薬リザーバ６に異なる複数種類の試薬溶液を収容しておくことできるので、工程毎に種々の試薬溶液を必要とするプロトコールを実施する際の処理性能（スループット）を向上できる。しかも、把持振とうユニット１５によって、試薬溶液の種類に応じて撹拌速度を再現性よく調節できるので、最終的な回収試料の回収効率（化学収率）及び回収量の再現性を一層高めることができる。   Furthermore, since the filter plate 81 is appropriately transferred to the vacuum manifolds 8 and 9 by the grasping and shaking unit 15, the residual liquid in the well 82 can be aspirated and discharged and the specimen sample can be aspirated and collected on the spot. It is possible to increase the layout design margin of a mechanism for collecting / discharging and cleaning the solutions such as the vacuum manifolds 8 and 9. Furthermore, since a plurality of different types of reagent solutions can be stored in the reagent reservoir 6, it is possible to improve the processing performance (throughput) when performing a protocol that requires various reagent solutions for each step. In addition, since the agitation speed can be adjusted with high reproducibility according to the type of reagent solution by the gripping and shaking unit 15, the recovery efficiency (chemical yield) of the final recovery sample and the reproducibility of the recovery amount can be further improved. it can.

加えて、筐体１内のベース２上に、チップ廃棄部３、チップステージ４、試薬リザーバ５，６（共に、第二の容器）が一列に配置され、それらに対して、チップ温度調節部７、バキュームマニホールド８，９が併設されているので、フィルタープレート８１が静置された言わば静的な処理である分注操作を行う領域（エリア）と、フィルタープレート８１を振とうさせるような言わば動的な処理である操作を行う領域とを分離でき、プロセス管理上好ましい。また、チップ温度調節部７において、窒素ガスパージを行うことにより、不活性な雰囲気下で、振とう操作を実行できるので、空気中の例えば酸素による酸化等の不都合な反応を抑制することができ、回収試料中の抽出成分の濃度等における再現性を更に確実に維持できる。   In addition, a chip disposal unit 3, a chip stage 4, and reagent reservoirs 5 and 6 (both are second containers) are arranged in a row on the base 2 in the housing 1, and the chip temperature control unit 7. Since the vacuum manifolds 8 and 9 are provided side by side, a region (area) where the filter plate 81 is left stationary, that is, a dispensing operation that is a static process, and a filter plate 81 is shaken. This is preferable in terms of process management because it can be separated from an operation area that is a dynamic process. In addition, by performing nitrogen gas purging in the chip temperature control unit 7, since a shaking operation can be executed in an inert atmosphere, it is possible to suppress inconvenient reactions such as oxidation by oxygen in the air, The reproducibility of the concentration of the extracted component in the collected sample can be more reliably maintained.

また、フィルタープレート８１を側方（横方向）からロボットハンド１５２で把持するので、フィルタープレート８１の直下方にバキュームマニホールド８，９を位置させることができ、これにより、フィルタープレート８１を下方から支える場合に比してウェル８２内の試薬溶液を回収し易くすることができる。   Further, since the filter plate 81 is gripped by the robot hand 152 from the side (lateral direction), the vacuum manifolds 8 and 9 can be positioned directly below the filter plate 81, thereby supporting the filter plate 81 from below. As compared with the case, the reagent solution in the well 82 can be easily collected.

ここで、図４は、本発明による試料調製装置の好適な他の実施形態の要部を概略的に示す右側断面図である。処理装置２００（試料調製装置）は、窒素ガス加圧ヘッド７０（加圧手段）を備えること以外は、処理装置１００と同様に構成されたものである。   Here, FIG. 4 is a right side cross-sectional view schematically showing a main part of another preferred embodiment of the sample preparation device according to the present invention. The processing apparatus 200 (sample preparation apparatus) is configured in the same manner as the processing apparatus 100 except that it includes a nitrogen gas pressurizing head 70 (pressurizing means).

窒素ガス加圧ヘッド７０は、奥行き方向（図示矢印Ｙ方向）にウェル８２，…と同数分（図示の例では一部省略しているが８つ）並列配置されたノズル７１を備えている。窒素ガス加圧ヘッド７０は、それ自体が、列方向（図２における矢印Ｘ方向）及び奥行き方向（図示矢印Ｙ方向）に駆動されると共に、ノズル７１が、鉛直方向（図示矢印Ｚ方向）に駆動されるようになっている。窒素ガス加圧ヘッド７０の駆動方法は、分注ヘッド１０と同様に特に制限されず、例えば、窒素ガス加圧ヘッド７０上方に設けられた公知のガイドレールを有する一方向ステージやＸ−Ｙステージ等を利用できる。また、ノズル７１の鉛直方向の駆動方法も特に制限されず、公知のモータ装置を利用でき、或いは、窒素ガス加圧ヘッド７０と共に可動するＸ−Ｙ−Ｚステージを使用してもよい。   The nitrogen gas pressurizing head 70 includes nozzles 71 arranged in parallel in the depth direction (the arrow Y direction in the figure) as many as the wells 82 (... Are omitted in the example shown in the figure). The nitrogen gas pressurizing head 70 itself is driven in the column direction (arrow X direction in FIG. 2) and the depth direction (arrow Y direction in the figure), and the nozzle 71 in the vertical direction (arrow Z direction in the figure). It is designed to be driven. The driving method of the nitrogen gas pressurizing head 70 is not particularly limited as in the case of the dispensing head 10. For example, a one-way stage or an XY stage having a known guide rail provided above the nitrogen gas pressurizing head 70. Etc. can be used. Also, the driving method of the nozzle 71 in the vertical direction is not particularly limited, and a known motor device can be used, or an XYZ stage movable with the nitrogen gas pressurizing head 70 may be used.

また、ノズル７１の先端部（図示下端部）には、環状溝Ｒが形成されており、その環状溝Ｒには、シリコンゴム等の弾性体で形成された環状リング７２(密閉手段)が嵌合されている。さらに、ノズル７１は、環状リング７２よりも先端の部分にテーパが形成されており、その先端がフィルタープレート８１に並置されたウェル８２の内部に挿入されるようになっている。またさらに、ノズル７１の他方端（図示上端）には、窒素ガス供給口２１（図２参照）に接続された窒素ガス供給管７３が継手７４を介して接続されている。   An annular groove R is formed at the tip (lower end in the figure) of the nozzle 71, and an annular ring 72 (sealing means) formed of an elastic body such as silicon rubber is fitted into the annular groove R. Are combined. Further, the nozzle 71 has a taper formed at the tip of the annular ring 72, and the tip is inserted into a well 82 juxtaposed on the filter plate 81. Furthermore, a nitrogen gas supply pipe 73 connected to the nitrogen gas supply port 21 (see FIG. 2) is connected to the other end (illustrated upper end) of the nozzle 71 via a joint 74.

このように構成された処理装置２００によれば、ゲル片Ｇと試薬溶液Ｌが収容されて振とう操作が施されたウェル８２を含むフィルタープレート８１をロボットハンド１５２で把持してバキュームマニホールド９上に移載させた後、窒素ガス加圧ヘッド７０のノズル７１，…が各ウェル８２上に位置するように、窒素ガス加圧ヘッド７０をバキュームマニホールド９の上方の所定位置に移動させる。それから、ノズル７１，…を下方へ移動させ、ノズル７１の先端をウェル８２内へ挿入し且つ環状リング７２をウェル８２の上端周縁に当接させてウェル８２の上部開放端を環状リング７２で封止する。   According to the processing apparatus 200 configured as described above, the filter plate 81 including the well 82 in which the gel piece G and the reagent solution L are accommodated and shaken is gripped by the robot hand 152 and the vacuum manifold 9 is placed on the vacuum manifold 9. Then, the nitrogen gas pressurizing head 70 is moved to a predetermined position above the vacuum manifold 9 so that the nozzles 71 of the nitrogen gas pressurizing head 70 are positioned on each well 82. Then, the nozzles 71 are moved downward, the tip of the nozzle 71 is inserted into the well 82, the annular ring 72 is brought into contact with the upper edge of the well 82, and the upper open end of the well 82 is sealed with the annular ring 72. Stop.

このとき、ノズル７１の環状リング７２を含む先端部をバネ等の弾性体で予め付勢しておき、環状リング７２がウェル８２の上端周縁と当接した状態で環状リング７２がウェル８２側へ所定の押付圧で押し付けられるようにすると、ウェル８２と環状リング７２との密着性ひいてはウェル８２内の密閉性がより高まるので好ましい。   At this time, the tip of the nozzle 71 including the annular ring 72 is urged in advance by an elastic body such as a spring, and the annular ring 72 moves toward the well 82 while the annular ring 72 is in contact with the upper edge of the well 82. It is preferable that the pressing is performed with a predetermined pressing pressure because the adhesion between the well 82 and the annular ring 72 and the sealing inside the well 82 are further enhanced.

この状態で、図示しない窒素ガス源から窒素ガス供給管７３を通して窒素ガス（Ｎ２）を所定圧で各ノズル７１へ供給する。ノズル７１の内部空間Ｋを流通した窒素ガスＮｇは、ノズル７１の先端からウェル８２内に送出される。これにより、窒素ガスＮｇによってウェル８２内部が加圧され、試料溶液Ｌがウェル８２の下方開放端８２ａから下方へ押し出される。そして、試料溶液Ｌは、フィルター８３を通過してバキュームマニホールド９内で回収プレート９１のウェル９２内に回収される（回収工程）。In this state, nitrogen gas (N 2 ) is supplied to each nozzle 71 at a predetermined pressure through a nitrogen gas supply pipe 73 from a nitrogen gas source (not shown). Nitrogen gas Ng flowing through the internal space K of the nozzle 71 is sent into the well 82 from the tip of the nozzle 71. Thereby, the inside of the well 82 is pressurized by the nitrogen gas Ng, and the sample solution L is pushed downward from the lower open end 82 a of the well 82. Then, the sample solution L passes through the filter 83 and is recovered in the well 92 of the recovery plate 91 in the vacuum manifold 9 (recovery step).

この際、環状リング７２によってウェル８２の上方端が封止され、ウェル８２内部が密閉状態とされるので、供給された窒素ガスＮｇの圧力がウェル８２の外部へ散逸せずにウェル８２の内圧が十分に高められる。よって、ウェル８２内に収容された試薬溶液Ｌの回収効率を更に高めることができる。したがって、窒素ガス加圧ヘッド７０を備える処理装置２００は、試料の回収効率が特に重要視されるプロテオーム解析（プロテオミクス）に特に有用である。   At this time, since the upper end of the well 82 is sealed by the annular ring 72 and the inside of the well 82 is hermetically sealed, the pressure of the supplied nitrogen gas Ng is not dissipated to the outside of the well 82 and the internal pressure of the well 82 is Is sufficiently enhanced. Therefore, the recovery efficiency of the reagent solution L stored in the well 82 can be further increased. Therefore, the processing apparatus 200 including the nitrogen gas pressurizing head 70 is particularly useful for proteomic analysis (proteomics) in which the recovery efficiency of the sample is particularly important.

なお、処理装置２００においても、上述した処理装置１００と同等の作用効果が奏されるが、重複した説明を避けるため、ここでの詳述は省略する。   Note that the processing apparatus 200 also has the same operational effects as the processing apparatus 100 described above, but detailed description thereof is omitted here to avoid redundant description.

また、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、その要旨を変更しない限度において様々な変形が可能である。例えば、処理装置１００，２００で処理される試料はゲル片に限られず、ゲル片以外の固（体）状、又は液（体）状試料でもよい。また、処理装置１００，２００は、ゲル内消化を伴う処理操作のみに限られず、生体試料を含む他の担体の種々の前処理に適用できる。さらに、フィルタープレート８１に保持されるウェル８２、及び回収プレート９１のウェル９２の数量や、試薬リザーバ６に設けられた凹部６１の員数、ベース２上のレイアウト等は図示に限定されない。またさらに、シリンジ１１とノズル７１とを共通化して一体に設けてもよく、或いはそれぞれ個別に別体のものとして設けてもよい。   The present invention is not limited to the above-described embodiment, and various modifications can be made without changing the gist thereof. For example, the sample processed by the processing apparatuses 100 and 200 is not limited to a gel piece, but may be a solid (body) or liquid (body) sample other than the gel piece. Moreover, the processing apparatuses 100 and 200 are not limited to processing operations involving in-gel digestion, and can be applied to various pretreatments of other carriers including biological samples. Furthermore, the number of the wells 82 held by the filter plate 81 and the wells 92 of the recovery plate 91, the number of the concave portions 61 provided in the reagent reservoir 6, the layout on the base 2, and the like are not limited to those illustrated. Furthermore, the syringe 11 and the nozzle 71 may be shared and provided integrally, or may be provided separately as separate bodies.

また、実施形態で説明したプロトコールに用いる各種試薬溶液の種類、それらの具体的な組成や混合割合、及び使用量はあくまでも例示であって、本発明がそれらに限定されることはない。さらにまた、試薬溶液のうちトリプシンに用いる界面活性剤として、０．１％オクチルグリコシド、又は０．１％５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｅｎｔｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅを一例として列挙したが、これらのなかでは、０．１％５−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−ｐｅｎｔｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅがより好ましい。   Moreover, the kind of various reagent solution used for the protocol demonstrated in embodiment, those specific compositions, mixing ratios, and the usage-amount are an illustration to the last, Comprising: This invention is not limited to them. Furthermore, 0.1% octyl glycoside or 0.1% 5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside was listed as an example of the surfactant used for trypsin in the reagent solution. Among these, 0.1% 5-cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside is more preferable.

以上説明した通り、本発明による試料調製装置及び方法は、第一の容器を移動自在に保持する移動保持手段と、その移動保持手段を振とうさせて第一の容器内の生体分子含有物質及び溶液を撹拌する振とう手段とを備えるので、種々のプロトコールに対応することができ、従来の試料前処理で問題となっていたばらつきを十分に抑え、且つ、再現性を向上させて信頼性の高い解析結果を得ることが可能となる。よって、生体分子を含む物質の分析及びそのための試料調製に広く利用できる。   As described above, the sample preparation apparatus and method according to the present invention includes a moving holding means for holding the first container movably, a biomolecule-containing substance in the first container by shaking the moving holding means, and Since it is equipped with a shaking means for stirring the solution, it can support various protocols, sufficiently suppress variations that have been a problem in conventional sample pretreatment, and improve reproducibility and reliability. High analysis results can be obtained. Therefore, it can be widely used for analysis of substances containing biomolecules and sample preparation therefor.

本発明による試料調製装置の好適な一実施形態を概略的に示す正面図である。1 is a front view schematically showing a preferred embodiment of a sample preparation device according to the present invention. 図１におけるII−II線に沿う断平面図である。FIG. 2 is a cross-sectional plan view taken along line II-II in FIG. 1. 図１に示す試料調製装置の右側面図である。It is a right view of the sample preparation apparatus shown in FIG. 本発明による試料調製装置の好適な他の実施形態の要部を概略的に示す右側断面図である。It is right side sectional drawing which shows roughly the principal part of other suitable embodiment of the sample preparation apparatus by this invention.

Claims (12)

生体分子を含む物質から被検体試料を調製するための装置であって、
前記物質が収容される第一の容器と、
前記第一の容器内へ注入される溶液が収容される第二の容器と、
前記第二の容器に収容された前記溶液を前記第一の容器へ注入する分注手段と、
前記第一の容器を移動自在に保持する移動保持手段と、
前記移動保持手段を振とうさせて前記第一の容器内の前記物質及び前記溶液を撹拌する振とう手段と、
前記振とうされた後の前記溶液を前記第一の容器から排出させて前記被検体試料を第三の容器に回収する回収手段と、
を備える試料調製装置。An apparatus for preparing an analyte sample from a substance containing a biomolecule,
A first container containing the substance;
A second container containing a solution to be injected into the first container;
Dispensing means for injecting the solution contained in the second container into the first container;
Moving holding means for holding the first container movably;
Shaking means for stirring the substance and the solution in the first container by shaking the moving holding means;
Recovery means for discharging the solution after the shaking from the first container and recovering the specimen sample in a third container;
A sample preparation device comprising: 前記第二の容器は、種類が互いに異なる複数の溶液が個別に収容されるものである、
請求項１記載の試料調製装置。The second container is for individually storing a plurality of different types of solutions.
The sample preparation device according to claim 1. 前記振とう手段は、前記溶液の種類に応じて撹拌速度が調節されるものである、
請求項２記載の試料調製装置。In the shaking means, the stirring speed is adjusted according to the type of the solution.
The sample preparation apparatus according to claim 2. 前記第一の容器が載置される領域及び前記第二の容器が載置される領域が連設されており、
前記振とうが実施される領域及び前記被検体試料が回収される領域が、前記第一の容器が載置される領域及び前記第二の容器が載置される領域と併設されている、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の試料調製装置。An area where the first container is placed and an area where the second container is placed are connected,
The region where the shaking is performed and the region where the specimen sample is collected are provided side by side with the region where the first container is placed and the region where the second container is placed,
The sample preparation device according to any one of claims 1 to 3. 前記振とうされた後の前記溶液を含む前記第一の容器内へガスを供給して該第一の容器内を加圧する加圧手段を更に備える、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の試料調製装置。Pressurization means for supplying gas into the first container containing the solution after being shaken to pressurize the first container;
The sample preparation device according to any one of claims 1 to 4. 前記生体分子を含む物質は、生体分子を含む担体である、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の試料調製装置。The substance containing a biomolecule is a carrier containing a biomolecule,
The sample preparation device according to any one of claims 1 to 5. 前記振とう手段は、アーム状の保持手段を有するものである、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の試料調製装置。The shaking means has arm-shaped holding means.
The sample preparation device according to any one of claims 1 to 6. 前記振とう手段は、前記第一の容器又は該第一の容器の保持具を側方から保持するものである、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の試料調製装置。The shaking means holds the first container or the holder of the first container from the side.
The sample preparation device according to any one of claims 1 to 7. 生体分子を含む物質から被検体試料を調製するための方法であって、
前記物質を第一の容器へ収容する担体収容工程と、
前記第一の容器内へ注入される溶液を第二の容器へ収容する溶液収容工程と、
前記第二の容器に収容された前記溶液を前記第一の容器へ注入する分注工程と、
前記第一の容器を所定の領域に移動せしめて保持する移動保持工程と、
前記保持手段を振とうさせて前記第一の容器内の前記物質及び前記溶液を撹拌する振とう工程と、
前記振とう工程を実施した後に、前記溶液を前記第一の容器から排出させて前記被検体試料を第三の容器に回収する回収工程と、
を備える試料調製方法。A method for preparing an analyte sample from a substance containing a biomolecule,
A carrier containing step of containing the substance in a first container;
A solution storage step of storing a solution to be injected into the first container into a second container;
A dispensing step of injecting the solution contained in the second container into the first container;
A moving and holding step of moving and holding the first container to a predetermined region;
A shaking step of shaking the holding means to stir the substance and the solution in the first container;
A recovery step of discharging the solution from the first container and recovering the analyte sample in a third container after performing the shaking step;
A sample preparation method comprising: 前記溶液収容工程においては、前記第二の容器として、種類が互いに異なる複数の溶液が個別に収容されるものを用いる、
請求項９記載の試料調製方法。In the solution storage step, as the second container, a container in which a plurality of different types of solutions are individually stored,
The sample preparation method according to claim 9. 前記回収工程においては、前記第一の容器にガスを供給して該第一の容器内を加圧する、
請求項９又は１０に記載の試料調製方法。In the recovery step, gas is supplied to the first container to pressurize the first container.
The sample preparation method according to claim 9 or 10. 前記生体分子を含む物質として生体分子を含む担体を用いる、
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の試料調製方法。

Using a carrier containing a biomolecule as the substance containing the biomolecule,
The sample preparation method according to any one of claims 9 to 11.

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