JPWO2005083062A1

JPWO2005083062A1 - Cell vaccine

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Publication number: JPWO2005083062A1
Application number: JP2006519367A
Authority: JP
Inventors: 安史金田; 和也平岡
Original assignee: GenomIdea Inc
Current assignee: GenomIdea Inc
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2005-02-23
Publication date: 2008-01-17
Also published as: WO2005083062A1

Abstract

所望の疾患、障害または状態（特に癌）を、容易に処置または予防するための方法、医薬（特に、ワクチン）、システムなどを提供することを課題とする。本発明は、不活化ＨＶＪなどのウイルスによる細胞融合技術および／またはアジュバントを用いた有効な疾患（例えば、癌）の予防ワクチンを提供し、特に、癌転移および再発の抑制を可能にした。従って、本発明は、抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞との融合細胞およびその関連技術を提供する。It is an object of the present invention to provide a method, a medicine (particularly a vaccine), a system and the like for easily treating or preventing a desired disease, disorder or condition (particularly cancer). The present invention provides an effective disease (for example, cancer) preventive vaccine using cell fusion technology and / or an adjuvant with a virus such as inactivated HVJ, and particularly enables suppression of cancer metastasis and recurrence. Accordingly, the present invention provides a fusion cell of an antigen-presenting cell and at least one immunoreactive donor cell and related techniques.

Description

本発明は、細胞を用いた新規ワクチンに関する。より詳細には、ウイルスにより融合させた細胞を用いた細胞ワクチン（例えば、抗癌ワクチン）に関する。 The present invention relates to a novel vaccine using cells. More specifically, the present invention relates to a cell vaccine (for example, an anticancer vaccine) using cells fused with a virus.

ワクチンは、体内の免疫反応を利用した疾患の予防および処置のための方法であり、従来より広く使用されている。 A vaccine is a method for the prevention and treatment of diseases utilizing the immune response in the body, and has been widely used conventionally.

従来は、タンパク質またはそれを含む組成物（または、病原体またはその不活性体全体）を抗原またはワクチンとして投与する方法が行われてきている。しかし、このような方法では、抗原抗体反応を特定する必要があることから、煩雑な試験を必要とする。 Conventionally, a method of administering a protein or a composition containing the protein (or a pathogen or the whole inactive form thereof) as an antigen or a vaccine has been performed. However, such a method requires a complicated test because it is necessary to specify an antigen-antibody reaction.

癌の転移の抑制や再発の防止に最も適した遺伝子治療法は免疫遺伝子治療であるが、その効果は世界的にまだ十分に上がっていない。その原因の１つは導入法であり、特に樹状細胞などの抗原提示細胞への導入効率の低さ、標的遺伝子導入の不十分さに起因している。もう１つは腫瘍免疫を治療に十分な程度に増強できないことにある。 The most suitable gene therapy for suppressing cancer metastasis and preventing recurrence is immune gene therapy, but its effect has not been sufficiently improved worldwide. One of the causes is the introduction method, which is caused particularly by low introduction efficiency to antigen-presenting cells such as dendritic cells and insufficient introduction of target genes. Another is that tumor immunity cannot be enhanced to a degree sufficient for treatment.

樹状細胞と癌細胞の融合により癌抗原の提示がなされ腫瘍免疫を誘導できる報告はすでに存在する（特許文献１）が、この方法では、癌の治療も予防も完全ではない。従って、より強力な予防または治療法の登場が待たれている。
特表２００３−５１９４８６号 There is already a report that can induce tumor immunity by presenting a cancer antigen by fusing dendritic cells and cancer cells (Patent Document 1). However, this method is neither complete in the treatment nor prevention of cancer. Therefore, the emergence of more powerful prevention or treatment is awaited.
Special table 2003-519486

本発明は、上記情況にかんがみ、所望の疾患、障害または状態を、容易に処置または予防するための方法、医薬、システムなどを提供することを課題とする。 In view of the above circumstances, an object of the present invention is to provide a method, a medicine, a system and the like for easily treating or preventing a desired disease, disorder or condition.

本発明者らは、この課題を実現するために遺伝子導入ベクター、遺伝子発現方法などの開発を行ってきた。その結果、不活化ＨＶＪなどのウイルスによる細胞融合技術および／またはアジュバントを用いた有効な疾患（例えば、癌）の予防ワクチンの開発に成功し、特に、癌転移および再発の抑制を可能にした。具体的には、好ましい実施形態において、強力な細胞融合活性を持つ不活化ＨＶＪを用いて樹状細胞とＸ線照射癌細胞との融合による腫瘍免疫の誘導とさらにアジュバントとしてＣｐＧを併用した腫瘍免疫の増強による癌ワクチンを用いることによって、特に好ましい効果が達成された。従来の融合技術で融合された細胞は、本発明の不活化ＨＶＪなどのウイルスによって融合された細胞とは、構造上も異なることが予測される。特に、抗原提示能に大きな相違が見られていることから、機能に直接関連する構造上の相違があるようである。 The present inventors have developed gene transfer vectors, gene expression methods and the like in order to realize this problem. As a result, we have succeeded in developing an effective disease (eg, cancer) preventive vaccine using cell fusion technology and / or an adjuvant with a virus such as inactivated HVJ, and in particular, it has been possible to suppress cancer metastasis and recurrence. Specifically, in a preferred embodiment, induction of tumor immunity by fusion of dendritic cells and X-irradiated cancer cells using inactivated HVJ having strong cell fusion activity, and further tumor immunity combined with CpG as an adjuvant Particularly favorable effects have been achieved by using cancer vaccines with enhanced levels. Cells fused by conventional fusion techniques are expected to be structurally different from cells fused by viruses such as the inactivated HVJ of the present invention. In particular, there appears to be a structural difference that is directly related to function, due to the large differences in antigen presenting ability.

本発明の主たる技術としては、以下の２つが挙げられる。 The following two are mentioned as the main techniques of the present invention.

その第一として、ＨＶＪのようなウイルスを用いた細胞融合技術の使用がある。従来、樹状細胞と癌細胞の融合により癌抗原の提示がなされ腫瘍免疫を誘導できる報告はすでに存在するが、細胞融合法としてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ；エレクトロフュージョンともいう）法が用いられてきた。しかし、これらの方法では、十分な治療または予防効果を発揮することができていない。従来、不活化ＨＶＪのようなウイルスを用いた細胞融合技術はこの目的のために用いられたことはないが、既存の方法で報告されている効率に劣ることないばかりか、より優れた治療または予防効果を発揮し、その上、さらに再現性よく細胞融合を起こすことができ、また生体組織中でも融合を起こすことができることから、投与前に融合する必要はないというメリットもある。 The first is the use of cell fusion technology using viruses such as HVJ. Conventionally, there have already been reports that tumor antigens can be presented by fusing dendritic cells and cancer cells and tumor immunity can be induced. As cell fusion methods, polyethylene glycol (PEG) and electroporation (also referred to as electrofusion) are also known. ) Method has been used. However, these methods have not been able to exert a sufficient therapeutic or preventive effect. Traditionally, cell fusion techniques using viruses such as inactivated HVJ have never been used for this purpose, but not only inferior to the efficiency reported by existing methods, but also better treatment or In addition to exerting a preventive effect, it is possible to cause cell fusion with high reproducibility, and also to cause fusion in living tissues, so there is an advantage that it is not necessary to fuse before administration.

本発明はまた、第二として、融合細胞ワクチンとともにアジュバントとしてＣｐＧなどを投与することによる腫瘍免疫誘導の増強を提供する。この組み合わせは今のところ報告されていない。ＣｐＧ以外のアジュバントももちろん使用可能である。 The present invention also secondly provides enhancement of tumor immunity induction by administering CpG or the like as an adjuvant together with a fusion cell vaccine. This combination has not been reported so far. Of course, adjuvants other than CpG can also be used.

従って、本発明は、以下を提供する。
（１）抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞との融合細胞。
（２）上記抗原提示細胞は、自己細胞である、項目１に記載の融合細胞。
（３）上記抗原提示細胞は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ；ＤＣ）、Ｂ細胞、マクロファージ細胞またはそれらの前駆細胞である、項目１に記載の融合細胞。
（４）上記抗原提示細胞は、樹状細胞またはその前駆細胞である、項目１に記載の融合細胞。
（５）上記免疫反応性供給細胞は、正常細胞、癌細胞または異種細胞である、項目１に記載の融合細胞。
（６）上記免疫反応性供給細胞は、癌細胞である、項目１に記載の融合細胞。
（７）上記免疫反応性供給細胞は、メラノーマ細胞、腎癌細胞、大腸癌細胞、肝がん細胞、肺癌細胞、子宮頸癌細胞、膵癌細胞、脳腫瘍細胞および舌癌細胞から選択される癌細胞を含む、項目１に記載の融合細胞。
（８）上記免疫反応性供給細胞は、不活化されたことを特徴とする、項目１に記載の融合細胞。
（９）上記免疫反応性供給細胞は、Ｘ線照射を受けたことを特徴とする、項目１に記載の融合細胞。
（１０）上記免疫反応性供給細胞は、自己細胞である、項目１に記載の融合細胞。
（１１）上記免疫反応性供給細胞は、腫瘍特異的抗原を提示するかまたはその能力を有する、項目１に記載の融合細胞。
（１２）上記融合細胞は、ウイルスまたはその一部によって融合される、項目１に記載の融合細胞。
（１３）上記融合細胞は、不活化ウイルスまたはその一部によって融合される、項目１に記載の融合細胞。
（１４）上記融合細胞は、不活化ＨＶＪまたはその一部によって融合される、項目１に記載の融合細胞。
（１５）上記ウイルスは、アルキル化剤または紫外線によって不活化される、項目１に記載の融合細胞。
（１６）上記抗原提示細胞の細胞表面マーカーを有する、項目１に記載の融合細胞。
（１７）上記抗原提示細胞に由来する、ＣＤ１、ＣＤ１１ｃ（インテグリンαＸ）、ＣＤ４０、ＣＤ５８（ＬＦＡ−３）、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１２３（抗ＩＬ−３Ｒａ）、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ１４８、ＣＤ１５７，ＣＤ８０、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを有する、項目１に記載の融合細胞。
（１８）細胞表面マーカーとして、少なくともＣＤ１１ｃを含む、項目１に記載の融合細胞。
（１９）上記免疫反応性供給細胞の細胞表面マーカーを有する、項目１に記載の融合細胞。
（２０）上記免疫反応性供給細胞に由来する、オンコジーン産物、胚性タンパク質、ウイルスタンパク質、組織特異的抗原、変異した腫瘍サプレッサータンパク質およびイディオタイプエピトープからなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを有する、項目１に記載の融合細胞。このような細胞表面マーカーとしては以下が挙げられる。

（２１）抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞との融合細胞を含む、薬学的組成物。
（２２）上記融合細胞は、上記薬学的組成物において含まれる細胞中少なくとも６％を構成する、項目２１に記載の薬学的組成物。
（２３）上記融合細胞は、上記薬学的組成物において含まれる細胞中少なくとも１０％を構成する、項目２１に記載の薬学的組成物。
（２４）上記融合細胞は、上記薬学的組成物において含まれる細胞中少なくとも２０％を構成する、項目２１に記載の薬学的組成物。
（２５）上記融合細胞は、上記薬学的組成物において含まれる細胞中少なくとも２５％を構成する、項目２１に記載の薬学的組成物。
（２６）上記融合細胞は、項目２〜２０のいずれか１項に記載の特徴を有する、項目２１に記載の薬学的組成物。
（２７）さらに、アジュバントを含む、項目２１に記載の薬学的組成物。
（２８）上記アジュバントは、水酸化アルミニウムゲル、明礬、ＣｐＧ、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、百日咳加熱死菌、リポ多糖、ムラミルペプチドおよびデンプンベントナイトからなる群より選択される、項目２６に記載の薬学的組成物。
（２９）上記アジュバントは、ＣｐＧを含む、項目２６に記載の薬学的組成物。
（３０）抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞と、アジュバントとを含む、薬学的組成物。
（３１）上記アジュバントは、水酸化アルミニウムゲル、明礬、ＣｐＧ、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、百日咳加熱死菌、リポ多糖、ムラミルペプチドおよびデンプンベントナイトからなる群より選択される、項目３０に記載の薬学的組成物。
（３２）抗原提示細胞と、
少なくとも１種の免疫反応性供給細胞と、
ウイルスまたはその一部と、
を含む、上記免疫反応性供給細胞に起因する疾患を処置または予防するためのキット。
（３３）上記抗原提示細胞は、自己細胞である、項目３２に記載のキット。
（３４）上記抗原提示細胞は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ；ＤＣ）、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、またはそれらの前駆細胞である、項目３２に記載のキット。
（３５）上記抗原提示細胞は、樹状細胞またはその前駆細胞である、項目３２に記載のキット。
（３６）上記抗原提示細胞は、ＣＤ１、ＣＤ１１ｃ（インテグリンαＸ）、ＣＤ４０、ＣＤ５８（ＬＦＡ−３）、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１２３（抗ＩＬ−３Ｒａ）、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ１４８、ＣＤ１５７，ＣＤ８０、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを有する、項目３２に記載のキット。
（３７）上記抗原提示細胞は、細胞表面マーカーとして、少なくともＣＤ１１ｃを含む、項目３２に記載のキット。
（３８）上記免疫反応性供給細胞は、正常細胞、癌細胞または異種細胞である、項目３２に記載のキット。
（３９）上記免疫反応性供給細胞は、癌細胞である、項目３２に記載のキット。
（４０）上記免疫反応性供給細胞は、メラノーマ細胞、腎癌細胞、大腸癌細胞、肝がん細胞、肺癌細胞、子宮頸癌細胞、膵癌細胞、脳腫瘍細胞および舌癌細胞から選択される癌細胞を含む、項目３２に記載のキット。
（４１）上記免疫反応性供給細胞と、上記抗原提示細胞とは、上記ウイルスまたはその一部によって融合されて提供される、項目３２に記載のキット。
（４２）上記免疫反応性供給細胞は、不活化されたことを特徴とする、項目３２に記載のキット。
（４３）上記免疫反応性供給細胞は、Ｘ線照射を受けたことを特徴とする、項目３２に記載のキット。
（４４）上記免疫反応性供給細胞は、自己細胞である、項目３２に記載のキット。
（４５）上記免疫反応性供給細胞は、腫瘍特異的抗原を提示するかまたはその能力を有する、項目３２に記載のキット。
（４６）上記免疫反応性供給細胞は、オンコジーン産物、胚性タンパク質、ウイルスタンパク質、組織特異的抗原、変異した腫瘍サプレッサータンパク質およびイディオタイプエピトープからなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを有する、項目３２に記載のキット。
（４７）上記ウイルスは、不活化ウイルスを含む、項目３２に記載のキット。
（４８）上記ウイルスは、不活化ＨＶＪを含む、項目３２に記載のキット。
（４９）上記ウイルスは、アルキル化剤または紫外線によって不活化される、項目３２に記載のキット。
（５０）上記ウイルスまたはその一部を、上記免疫反応性供給細胞と、上記抗原提示細胞とを融合することを指示する指示書をさらに備える、項目３２に記載のキット。
（５１）以下の工程：
Ａ）抗原提示細胞および少なくとも１種の免疫反応性供給細胞を提供する工程；および
Ｂ）上記抗原提示細胞と上記少なくとも１種の免疫反応性供給細胞と、ウイルスまたはその一部とを混合する工程、
を包含する、融合細胞の製造方法。
（５２）上記融合細胞が、上記免疫反応性供給細胞および上記抗原提示細胞の細胞表面マーカーを有することを確認する工程をさらに包含する、項目５１に記載の方法。
（５３）上記免疫反応性供給細胞を不活化する工程をさらに包含する、項目５１に記載の方法。
（５４）さらなる細胞融合工程を包含する、項目５１に記載の方法。
（５５）上記細胞融合工程は、ポリエチレングリコール方法およびエレクトロフュージョンからなる群より選択される方法を含む、項目５４に記載の方法。
（５６）抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞との融合細胞を、患者に投与する工程、を包含する、上記免疫反応性供給細胞に起因する疾患、障害または状態を、処置または予防するための方法。
（５７）上記免疫反応性供給細胞は、正常細胞、癌細胞または異種細胞を含む、項目５６に記載の方法。
（５８）上記免疫反応性供給細胞の抗原は未知である、項目５６に記載の方法。
（５９）上記患者は、哺乳動物を含む、項目５６に記載の方法。
（６０）上記患者は、ヒトを含む、項目５６に記載の方法。
（６１）上記疾患、障害または状態は、癌、感染症および自己免疫疾患からなる群より選択される状態を含む、項目５６に記載の方法。
（６２）上記疾患、障害または状態は、癌を含む、項目５６に記載の方法。
（６３）上記疾患、障害または状態の予防のためである、項目５６に記載の方法。
（６４）上記疾患、障害または状態の再発を防止するためである、項目５６に記載の方法。
（６５）アジュバントがさらに投与される、項目５６に記載の方法。
（６６）上記アジュバントは、水酸化アルミニウムゲル、明礬、ＣｐＧ、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、百日咳加熱死菌、リポ多糖、ムラミルペプチドおよびデンプンベントナイトからなる群より選択される、項目５６に記載の方法。
（６７）癌の転移を予防するためである、項目５６に記載の方法。
（６８）以下の工程：
Ａ）疾患、障害または状態を同定する工程；
Ｂ）上記疾患、障害または状態に関連する、免疫反応性供給細胞を同定する工程；
Ｃ）抗原提示細胞と、上記免疫反応性供給細胞の少なくとも１種との融合細胞を提供する工程；および
Ｄ）上記融合細胞を患者に投与する工程、
を包含する、上記免疫反応性供給細胞に起因する疾患、障害または状態を、処置または予防するための方法。
（６９）抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞との融合細胞の、上記免疫反応性供給細胞に起因する疾患、障害または状態を、処置または予防するための医薬を製造する方法における、使用。Accordingly, the present invention provides the following.
(1) A fusion cell of an antigen-presenting cell and at least one immunoreactive donor cell.
(2) The fused cell according to item 1, wherein the antigen-presenting cell is an autologous cell.
(3) The fusion cell according to item 1, wherein the antigen-presenting cell is a dendritic cell (DC), a B cell, a macrophage cell or a precursor cell thereof.
(4) The fusion cell according to item 1, wherein the antigen-presenting cell is a dendritic cell or a precursor cell thereof.
(5) The fused cell according to item 1, wherein the immunoreactive supply cell is a normal cell, a cancer cell or a heterologous cell.
(6) The fused cell according to item 1, wherein the immunoreactive supply cell is a cancer cell.
(7) The immunoreactive supply cell is a cancer cell selected from melanoma cells, kidney cancer cells, colon cancer cells, liver cancer cells, lung cancer cells, cervical cancer cells, pancreatic cancer cells, brain tumor cells and tongue cancer cells. The fused cell according to item 1, comprising:
(8) The fused cell according to item 1, wherein the immunoreactive supply cell is inactivated.
(9) The fused cell according to item 1, wherein the immunoreactive supply cell is subjected to X-ray irradiation.
(10) The fused cell according to item 1, wherein the immunoreactive supply cell is an autologous cell.
(11) The fusion cell according to item 1, wherein the immunoreactive donor cell presents or has the ability of a tumor-specific antigen.
(12) The fused cell according to item 1, wherein the fused cell is fused by a virus or a part thereof.
(13) The fused cell according to item 1, wherein the fused cell is fused by an inactivated virus or a part thereof.
(14) The fused cell according to item 1, wherein the fused cell is fused by inactivated HVJ or a part thereof.
(15) The fused cell according to item 1, wherein the virus is inactivated by an alkylating agent or ultraviolet rays.
(16) The fused cell according to item 1, comprising a cell surface marker of the antigen-presenting cell.
(17) CD1, CD11c (integrin αX), CD40, CD58 (LFA-3), CD86, HLA-DR, CD123 (anti-IL-3Ra), CD21, CD23, CD148, CD157, derived from the antigen-presenting cells Item 2. The fused cell according to item 1, comprising at least one cell surface marker selected from the group consisting of CD80, MHC class I and MHC class II.
(18) The fused cell according to item 1, comprising at least CD11c as a cell surface marker.
(19) The fused cell according to item 1, comprising a cell surface marker of the immunoreactive supply cell.
(20) At least one cell surface marker selected from the group consisting of an oncogene product, an embryonic protein, a viral protein, a tissue-specific antigen, a mutated tumor suppressor protein and an idiotype epitope derived from the immunoreactive donor cell. The fused cell according to item 1, which has Examples of such cell surface markers include:

(21) A pharmaceutical composition comprising a fusion cell of an antigen-presenting cell and at least one immunoreactive donor cell.
(22) The pharmaceutical composition according to item 21, wherein the fused cells constitute at least 6% of the cells contained in the pharmaceutical composition.
(23) The pharmaceutical composition according to item 21, wherein the fused cells constitute at least 10% of the cells contained in the pharmaceutical composition.
(24) The pharmaceutical composition according to item 21, wherein the fused cells constitute at least 20% of the cells contained in the pharmaceutical composition.
(25) The pharmaceutical composition according to item 21, wherein the fused cell constitutes at least 25% of the cells contained in the pharmaceutical composition.
(26) The pharmaceutical composition according to item 21, wherein the fused cell has the characteristics according to any one of items 2 to 20.
(27) The pharmaceutical composition according to item 21, further comprising an adjuvant.
(28) In the item 26, the adjuvant is selected from the group consisting of aluminum hydroxide gel, alum, CpG, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, pertussis heat-killed bacteria, lipopolysaccharide, muramyl peptide, and starch bentonite. A pharmaceutical composition as described.
(29) The pharmaceutical composition according to item 26, wherein the adjuvant comprises CpG.
(30) A pharmaceutical composition comprising antigen-presenting cells, at least one immunoreactive donor cell, and an adjuvant.
(31) In the item 30, the adjuvant is selected from the group consisting of aluminum hydroxide gel, alum, CpG, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, pertussis heat-killed bacteria, lipopolysaccharide, muramyl peptide and starch bentonite A pharmaceutical composition as described.
(32) an antigen-presenting cell;
At least one immunoreactive donor cell;
A virus or part of it,
A kit for treating or preventing a disease caused by the immunoreactive donor cell.
(33) The kit according to item 32, wherein the antigen-presenting cell is an autologous cell.
(34) The kit according to item 32, wherein the antigen-presenting cell is a dendritic cell (DC), a B cell, a macrophage cell, or a precursor cell thereof.
(35) The kit according to item 32, wherein the antigen-presenting cell is a dendritic cell or a precursor cell thereof.
(36) The antigen-presenting cells are CD1, CD11c (integrin αX), CD40, CD58 (LFA-3), CD86, HLA-DR, CD123 (anti-IL-3Ra), CD21, CD23, CD148, CD157, CD80, The kit of item 32, having at least one cell surface marker selected from the group consisting of MHC class I and MHC class II.
(37) The kit according to item 32, wherein the antigen-presenting cell contains at least CD11c as a cell surface marker.
(38) The kit according to item 32, wherein the immunoreactive supply cells are normal cells, cancer cells, or heterologous cells.
(39) The kit according to item 32, wherein the immunoreactive supply cells are cancer cells.
(40) The immunoreactive donor cell is a cancer cell selected from melanoma cells, renal cancer cells, colon cancer cells, liver cancer cells, lung cancer cells, cervical cancer cells, pancreatic cancer cells, brain tumor cells and tongue cancer cells. The kit according to item 32, comprising:
(41) The kit according to item 32, wherein the immunoreactive supply cell and the antigen-presenting cell are provided by being fused with the virus or a part thereof.
(42) The kit according to item 32, wherein the immunoreactive supply cell is inactivated.
(43) The kit according to item 32, wherein the immunoreactive supply cells have been subjected to X-ray irradiation.
(44) A kit according to item 32, wherein the immunoreactive supply cells are autologous cells.
(45) The kit according to item 32, wherein the immunoreactive donor cell presents or has the ability of a tumor-specific antigen.
(46) The immunoreactive donor cell has at least one cell surface marker selected from the group consisting of an oncogene product, an embryonic protein, a viral protein, a tissue-specific antigen, a mutated tumor suppressor protein, and an idiotype epitope. The kit according to Item 32.
(47) The kit according to item 32, wherein the virus comprises an inactivated virus.
(48) The kit according to Item 32, wherein the virus comprises inactivated HVJ.
(49) The kit according to item 32, wherein the virus is inactivated by an alkylating agent or ultraviolet rays.
(50) The kit according to item 32, further comprising an instruction for instructing the virus or a part thereof to fuse the immunoreactive supply cell and the antigen-presenting cell.
(51) The following steps:
A) providing an antigen presenting cell and at least one immunoreactive donor cell; and B) mixing the antigen presenting cell, the at least one immunoreactive donor cell, and a virus or a part thereof. ,
A method for producing a fused cell, comprising:
(52) A method according to item 51, further comprising the step of confirming that the fused cell has a cell surface marker of the immunoreactive donor cell and the antigen-presenting cell.
(53) A method according to item 51, further comprising a step of inactivating the immunoreactive donor cell.
(54) A method according to item 51, further comprising a cell fusion step.
(55) A method according to item 54, wherein the cell fusion step includes a method selected from the group consisting of a polyethylene glycol method and electrofusion.
(56) treating a disease, disorder or condition caused by the immunoreactive donor cell, comprising a step of administering a fusion cell of an antigen-presenting cell and at least one immunoreactive donor cell to a patient. Or a way to prevent.
(57) A method according to item 56, wherein the immunoreactive supply cell comprises a normal cell, a cancer cell or a heterologous cell.
(58) A method according to item 56, wherein the antigen of the immunoreactive supply cell is unknown.
(59) A method according to item 56, wherein the patient includes a mammal.
(60) A method according to item 56, wherein the patient includes a human.
(61) A method according to item 56, wherein the disease, disorder or condition comprises a condition selected from the group consisting of cancer, infectious diseases and autoimmune diseases.
(62) A method according to item 56, wherein the disease, disorder or condition includes cancer.
(63) A method according to item 56, which is for prevention of the disease, disorder or condition.
(64) A method according to item 56, which is for preventing recurrence of the disease, disorder or condition.
(65) A method according to item 56, wherein an adjuvant is further administered.
(66) Item 56 is selected from the group consisting of aluminum hydroxide gel, alum, CpG, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, pertussis heat-killed bacteria, lipopolysaccharide, muramyl peptide, and starch bentonite The method described.
(67) A method according to item 56, which is for preventing cancer metastasis.
(68) The following steps:
A) identifying a disease, disorder or condition;
B) identifying an immunoreactive donor cell associated with the disease, disorder or condition;
C) providing a fused cell of the antigen-presenting cell and at least one of the immunoreactive donor cells; and D) administering the fused cell to a patient;
A method for treating or preventing a disease, disorder or condition resulting from the immunoreactive donor cell.
(69) A method for producing a medicament for treating or preventing a disease, disorder or condition caused by an immunoreactive donor cell, comprising a fusion cell of an antigen-presenting cell and at least one immunoreactive donor cell In use.

以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。 Preferred embodiments of the present invention will be shown below, but those skilled in the art can appropriately implement the embodiments and the like from the description of the present invention and well-known and common techniques in the field, and the effects and effects of the present invention can be easily achieved. It should be recognized to understand.

本発明は、以下のような効果を達成する。例えば、この組み合わせ効果は従来の癌治療の問題点を以下の理由で克服できると考えられる。 The present invention achieves the following effects. For example, it is considered that this combination effect can overcome the problems of conventional cancer treatment for the following reasons.

第一に、免疫反応性供給細胞（例えば、癌細胞）側の問題として、従来技術では、多くの免疫反応性供給細胞でＭＨＣクラスＩが欠如していることがしばしばあり、抗原の提示ができず、樹状細胞に癌抗原が認識されないことがあった。しかし、抗原提示細胞と免疫反応性供給細胞との融合により抗原提示の効率が上昇した。 First, as a problem on the side of immunoreactive donor cells (for example, cancer cells), in the prior art, many immunoreactive donor cells often lack MHC class I and can present antigens. In some cases, dendritic cells did not recognize cancer antigens. However, the efficiency of antigen presentation increased due to the fusion of antigen-presenting cells and immunoreactive donor cells.

第二に、抗原提示細胞側の問題として、例えば、成熟樹状細胞が未刺激の（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞に抗原提示できないことから、Ｔ細胞の成熟がおこらなかった。本発明では、ＣｐＧのようなアジュバンド効果によって未刺激のＴ細胞を刺激してＴｈ１へのシフトをおこし抗腫瘍免疫の増強が起こり、さらにそのメモリーが長期に残るという効果が奏される。 Second, as a problem on the antigen-presenting cell side, for example, mature dendritic cells cannot present antigen to naive T cells, and thus T cells did not mature. In the present invention, an unstimulated T cell is stimulated by an adjuvant effect such as CpG to cause a shift to Th1 to enhance anti-tumor immunity, and the memory remains for a long time.

これらの総合的な効果として癌に対する細胞傷害性Ｔ細胞が活性化されて腫瘍などの疾患、障害の抑制が長期にわたって可能になった。 As a comprehensive effect, cytotoxic T cells against cancer are activated, and it becomes possible to suppress diseases and disorders such as tumors over a long period of time.

また、技術的に困難で、高コストであることが多い抗原の精製の必要性を回避した。特に、抗原を特定することがないことから、その応用性は、広範囲に及ぶ。 It also avoided the need for antigen purification, which is technically difficult and often costly. In particular, since the antigen is not specified, its applicability is wide-ranging.

加えて、既存の治療方法（例えば外科的手術、化学療法、放射線療法）に比べて副作用、再発の危険性が低く、種類を問わず適用しうるという効果も存在する。 In addition, compared with existing treatment methods (for example, surgical operation, chemotherapy, radiotherapy), there is a low risk of side effects and recurrence, and there is an effect that it can be applied regardless of the type.

本発明は、患者自身の抗原提示細胞および免疫反応性供給細胞とを用いることが可能であることから、深刻な副作用等の問題がなく、安全に適用することができる。また、現在開発中の遺伝子療法に比べて、外来の核酸（ＤＮＡ）、ウイルスなどを利用しないことからも副作用の虞がないなどの効果を奏する。 Since the present invention can use the patient's own antigen-presenting cells and immunoreactive supply cells, it can be safely applied without problems such as serious side effects. In addition, compared to gene therapy currently under development, the use of foreign nucleic acids (DNA), viruses, and the like has the effect that there is no risk of side effects.

［図１Ａ］図１Ａは、融合細胞の細胞分布を示す。左上の２つのパネルのうち、ＦＬ２（左上のパネルの左側）は、ＣＤ１１ｃ陽性（樹状細胞）を示し、ＦＬ１（左上のパネルの右側）は、ｇｐ１００陽性（メラノーマ細胞＝Ｂ１６）を示す。示されるようにほとんどが、それぞれのマーカー陽性であることが確認される。その後、ＨＶＪ５００ＨＡＵで融合すると、右上のパネルに示すように、融合が起こる。このうち、ＵＲが融合が起こった細胞であって、双方の性質を保持する理想的な細胞を示す。このように、２０％を超える効率の細胞融合が生じた。右下には、ＵＬ、ＵＲおよびＬＲにおける染色の様子を示す。二重に染色されるＵＲは、真ん中に示されるようにほぼ均一に染色される。ＵＬはほとんど樹状細胞であり、ＵＲはほとんど融合細胞であり（二重染色）、ＬＲはほとんどＢ１６細胞であった。
［図１Ｂ］図１Ｂは、ＨＡＵの値を０〜１０００までに変動させたときの結果を示す。右から１０００ＨＡＵ、５００ＨＡＵ、１００ＨＡＵおよび０ＨＡＵ（単なる混合物）を示す。下のＦＡＣＳのパネルの右上には、融合細胞の割合を示す。
［図１Ｃ］樹状細胞、メラノーマ細胞および融合細胞における二重染色の比較を示す。
［図２Ａ］ＴＮＦαの分泌を示す。Ｍｉｘは、単なる混合物を示し、ＦＣは融合細胞を示し、Ｍｉｘ＋ＣｐＧは、混合物にアジュバントＣｐＧを加えたものを示し、ＦＣ＋ＣｐＧは融合細胞にアジュバントＣｐＧを加えたものを示し、ＦＣＬｎｏｎＣｐＧは融合細胞にアジュバントでない非ＣｐＧオリゴヌクレオチドを加えたものを示す。図に示されるように、融合細胞の添加およびＣｐＧの添加により有意にＴＮＦ−αの分泌が促進された。
［図２Ｂ］ＩＬ−１２ｐ４０の分泌を示す。Ｍｉｘは、単なる混合物を示し、ＦＣは融合細胞を示し、Ｍｉｘ＋ＣｐＧは、混合物にアジュバントＣｐＧを加えたものを示し、ＦＣ＋ＣｐＧは融合細胞にアジュバントＣｐＧを加えたものを示し、ＦＣ＋ＬｎｏｎＣｐＧは融合細胞にアジュバントでない非ＣｐＧオリゴヌクレオチドを加えたものを示す。図に示されるように、融合細胞の添加およびＣｐＧの添加により有意にＩＬ−１２ｐ４０の分泌が促進された。
［図３Ａ］インターフェロンγの分泌を示す。ＰＢＳはコントロールを示し、ＣｐＧはＣｐＧのみを示し、Ｍｉｘは、単なる混合物を示し、ＦＣは融合細胞を示し、Ｍｉｘ＋ＣｐＧは、混合物にアジュバントＣｐＧを加えたものを示し、ＦＣ＋ＣｐＧは融合細胞にアジュバントＣｐＧを加えたものを示す。図に示されるように、融合細胞の添加およびＣｐＧの添加により有意にインターフェロンγの分泌が促進された。
［図３Ｂ］^５１Ｃｒ比放出のＥ／Ｔ（エフェクター細胞／標的細胞）比を示す（Ｂ１６細胞）。ＰＢＳは、コントロールを示し、ＣｐＧはＣｐＧのみを示し、Ｍｉｘは混合物を示し、ＦＣは融合細胞を示し、Ｍｉｘ＋ＣｐＧは、混合物にアジュバントＣｐＧを加えたものを示し、ＦＣ＋ＣｐＧは融合細胞にアジュバントＣｐＧを加えたものを示す。
［図３Ｃ］^５１Ｃｒ比放出のＥ／Ｔ（エフェクター細胞／標的細胞）比を示す（ＥＬ細胞）。ＰＢＳは、コントロールを示し、ＣｐＧはＣｐＧのみを示し、Ｍｉｘは混合物を示し、ＦＣは融合細胞を示し、Ｍｉｘ＋ＣｐＧは、混合物にアジュバントＣｐＧを加えたものを示し、ＦＣ＋ＣｐＧは融合細胞にアジュバントＣｐＧを加えたものを示す。
［図４Ａ］腫瘍体積の推移を示す。Ｂ１６細胞の接種後の体積の推移である。ＰＢＳは、コントロールを示し、ＣｐＧはＣｐＧのみを示し、Ｍｉｘは混合物を示し、ＦＣは融合細胞を示し、Ｍｉｘ＋ＣｐＧは、混合物にアジュバントＣｐＧを加えたものを示し、ＦＣ＋ＣｐＧは融合細胞にアジュバントＣｐＧを加えたものを示す。
［図４Ｂ］生存率の推移を示す。Ｂ１６細胞の接種後の生存率を示す。ＰＢＳは、コントロールを示し、ＣｐＧはＣｐＧのみを示し、Ｍｉｘは混合物を示し、ＦＣは融合細胞を示し、Ｍｉｘ＋ＣｐＧは、混合物にアジュバントＣｐＧを加えたものを示し、ＦＣ＋ＣｐＧは融合細胞にアジュバントＣｐＧを加えたものを示す。融合細胞およびそれにＣｐＧを加えた群では、有意に生存率が改善した。
［図４Ｃ］腫瘍のないマウスの割合の推移を示す。Ｂ１６細胞の接種後の生存率を示す。ＰＢＳは、コントロールを示し、ＣｐＧはＣｐＧのみを示し、Ｍｉｘは混合物を示し、ＦＣは融合細胞を示し、Ｍｉｘ＋ＣｐＧは、混合物にアジュバントＣｐＧを加えたものを示し、ＦＣ＋ＣｐＧは融合細胞にアジュバントＣｐＧを加えたものを示す。融合細胞およびＣｐＧの併用群（融合細胞および混合細胞）では、有意に生存率が改善した。
［図５Ａ］実施例４におけるインターフェロンγの分泌を示す。ＰＢＳはコントロールを示し、ＣｐＧはアジュバントのみを示し、Ｍｉｘは、単なる混合物を示し、ＦＣは融合細胞を示し、Ｍｉｘ＋ＣｐＧは、混合物にアジュバントＣｐＧを加えたものを示し、ＦＣ＋ＣｐＧは融合細胞にアジュバントＣｐＧを加えたものを示す。図に示されるように、融合細胞の添加およびＣｐＧの添加により有意にインターフェロンγの分泌が促進された。
［図５Ｂ］^５１Ｃｒ比放出のＥ／Ｔ（エフェクター細胞／標的細胞）比を示す（ＲＥＮＣＡ細胞）。ＰＢＳは、コントロールを示し、ＣｐＧはＣｐＧのみを示し、Ｍｉｘは混合物を示し、ＦＣは融合細胞を示し、Ｍｉｘ＋ＣｐＧは、混合物にアジュバントＣｐＧを加えたものを示し、ＦＣ＋ＣｐＧは融合細胞にアジュバントＣｐＧを加えたものを示す。
［図５Ｃ］^５１Ｃｒ比放出のＥ／Ｔ（エフェクター細胞／標的細胞）比を示す（ＣＴ２６細胞）。ＰＢＳは、コントロールを示し、ＣｐＧはＣｐＧのみを示し、Ｍｉｘは混合物を示し、ＦＣは融合細胞を示し、Ｍｉｘ＋ＣｐＧは、混合物にアジュバントＣｐＧを加えたものを示し、ＦＣ＋ＣｐＧは融合細胞にアジュバントＣｐＧを加えたものを示す。
［図５Ｄ］腫瘍のないマウスの割合の推移を示す。ＲＥＮＣＡ細胞の接種後の生存率を示す。ＰＢＳは、コントロールを示し、ＣｐＧはＣｐＧのみを示し、Ｍｉｘは混合物を示し、ＦＣは融合細胞を示し、Ｍｉｘ＋ＣｐＧは、混合物にアジュバントＣｐＧを加えたものを示し、ＦＣ＋ＣｐＧは融合細胞にアジュバントＣｐＧを加えたものを示す。腫瘍マーカーの不明なＲＥＮＣＡ細胞であっても、融合細胞およびＣｐＧの併用群（融合細胞および混合細胞）では、有意に生存率が改善した。
［図６］肺転移からの保護率を示す。胚転移からの保護効果においてもまた、融合細胞の効果が観察され、融合細胞とＣｐＧとの組み合わせが最も効果的であった。各点は、個々の個体を示し、バーは平均を示す。
配列表の説明FIG. 1A shows the cell distribution of fused cells. Of the two upper left panels, FL2 (left side of the upper left panel) indicates CD11c positive (dendritic cells), and FL1 (right side of the upper left panel) indicates gp100 positive (melanoma cells = B16). As shown, most are confirmed to be positive for each marker. Subsequently, when fusion is performed with HVJ 500HAU, fusion occurs as shown in the upper right panel. Among these, UR is a cell in which fusion has occurred and represents an ideal cell that retains both properties. Thus, cell fusion with an efficiency of over 20% occurred. In the lower right, the state of staining in UL, UR and LR is shown. The double-stained UR is stained almost uniformly as shown in the middle. UL was mostly dendritic cells, UR was mostly fused cells (double staining), and LR was mostly B16 cells.
FIG. 1B shows the results when the value of HAU is varied from 0 to 1000. From the right, 1000 HAU, 500 HAU, 100 HAU and 0 HAU (simple mixture) are shown. The percentage of fused cells is shown in the upper right of the lower FACS panel.
FIG. 1C shows a comparison of double staining in dendritic cells, melanoma cells and fusion cells.
FIG. 2A shows TNFα secretion. Mix indicates mere mixture, FC indicates fusion cells, Mix + CpG indicates mixture plus adjuvant CpG, FC + CpG indicates fusion cells plus adjuvant CpG, FCLnonCpG is not an adjuvant to fusion cells A non-CpG oligonucleotide is added. As shown in the figure, the addition of fusion cells and the addition of CpG significantly promoted TNF-α secretion.
FIG. 2B shows IL-12p40 secretion. Mix indicates just a mixture, FC indicates a fused cell, Mix + CpG indicates a mixture plus adjuvant CpG, FC + CpG indicates a fused cell plus adjuvant CpG, FC + LnonCpG is not an adjuvant to the fused cell A non-CpG oligonucleotide is added. As shown in the figure, the addition of fusion cells and the addition of CpG significantly promoted the secretion of IL-12p40.
FIG. 3A shows the secretion of interferon γ. PBS indicates a control, CpG indicates only CpG, Mix indicates a simple mixture, FC indicates a fused cell, Mix + CpG indicates a mixture plus adjuvant CpG, FC + CpG indicates an adjuvant CpG in the fused cell Shows what was added. As shown in the figure, the addition of fusion cells and the addition of CpG significantly promoted the secretion of interferon γ.
[FIG. 3B] E / T (effector cell / target cell) ratio of ⁵¹ Cr ratio release is shown (B16 cell). PBS indicates control, CpG indicates CpG only, Mix indicates mixture, FC indicates fusion cells, Mix + CpG indicates mixture plus adjuvant CpG, FC + CpG adds adjuvant CpG to fusion cells Indicates
[FIG. 3C] E / T (effector cell / target cell) ratio of ⁵¹ Cr ratio release is shown (EL cell). PBS indicates control, CpG indicates CpG only, Mix indicates mixture, FC indicates fusion cells, Mix + CpG indicates mixture plus adjuvant CpG, FC + CpG adds adjuvant CpG to fusion cells Indicates
FIG. 4A shows the change in tumor volume. It is transition of the volume after inoculation of B16 cell. PBS indicates control, CpG indicates CpG only, Mix indicates mixture, FC indicates fusion cells, Mix + CpG indicates mixture plus adjuvant CpG, FC + CpG adds adjuvant CpG to fusion cells Indicates
FIG. 4B shows the change in survival rate. The survival rate after inoculation of B16 cells is shown. PBS indicates control, CpG indicates CpG only, Mix indicates mixture, FC indicates fusion cells, Mix + CpG indicates mixture plus adjuvant CpG, FC + CpG adds adjuvant CpG to fusion cells Indicates The survival rate was significantly improved in the fused cells and the group to which CpG was added.
FIG. 4C shows the change in the proportion of mice without tumor. The survival rate after inoculation of B16 cells is shown. PBS indicates control, CpG indicates CpG only, Mix indicates mixture, FC indicates fusion cells, Mix + CpG indicates mixture plus adjuvant CpG, FC + CpG adds adjuvant CpG to fusion cells Indicates In the combination group of fused cells and CpG (fused cells and mixed cells), the survival rate was significantly improved.
FIG. 5A shows the secretion of interferon γ in Example 4. PBS indicates control, CpG indicates adjuvant only, Mix indicates mere mixture, FC indicates fused cells, Mix + CpG indicates the mixture plus adjuvant CpG, FC + CpG indicates adjuvant CpG in the fused cells Shows what was added. As shown in the figure, the addition of fusion cells and the addition of CpG significantly promoted the secretion of interferon γ.
FIG. 5B shows the E / T (effector cell / target cell) ratio of ⁵¹ Cr ratio release (RENCA cells). PBS indicates control, CpG indicates CpG only, Mix indicates mixture, FC indicates fusion cells, Mix + CpG indicates mixture plus adjuvant CpG, FC + CpG adds adjuvant CpG to fusion cells Indicates
FIG. 5C shows E / T (effector cell / target cell) ratio of ⁵¹ Cr ratio release (CT26 cells). PBS indicates control, CpG indicates CpG only, Mix indicates mixture, FC indicates fusion cells, Mix + CpG indicates mixture plus adjuvant CpG, FC + CpG adds adjuvant CpG to fusion cells Indicates
FIG. 5D shows the change in the proportion of mice without tumor. The survival rate after inoculation of RENCA cells is shown. PBS indicates control, CpG indicates CpG only, Mix indicates mixture, FC indicates fusion cells, Mix + CpG indicates mixture plus adjuvant CpG, FC + CpG adds adjuvant CpG to fusion cells Indicates Even in the case of RENCA cells with unknown tumor markers, the survival rate was significantly improved in the combined group of fused cells and CpG (fused cells and mixed cells).
FIG. 6 shows the protection rate from lung metastasis. Also in the protective effect from embryo transfer, the effect of fused cells was observed, and the combination of fused cells and CpG was most effective. Each point represents an individual individual and the bar represents the average.
Description of sequence listing

配列番号１は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ１６６８）を示す。
配列番号２は、ＧｐＧオリゴヌクレオチド（ＧｐＧ１６６８）を示す。SEQ ID NO: 1 shows a CpG oligonucleotide (CpG1668).
SEQ ID NO: 2 shows a GpG oligonucleotide (GpG1668).

以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により記載する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。 The invention will now be described by way of example, with reference to the accompanying drawings, where appropriate. Throughout this specification, it should be understood that the singular forms also include the plural concept unless specifically stated otherwise. Thus, singular articles (eg, corresponding articles and adjectives in other languages, such as “a”, “an”, “the” in the case of English) are subject to the plural concept unless otherwise stated. Should also be understood to include. In addition, it is to be understood that the terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified. Thus, unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。 The embodiments provided below are provided for a better understanding of the present invention, and it is understood that the scope of the present invention should not be limited to the following description. Therefore, it is obvious that those skilled in the art can make appropriate modifications within the scope of the present invention with reference to the description in the present specification.

（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、遺伝子工学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．ｅｔａｌ．（１９８９）．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒおよびその３ｒｄＥｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔａｌ．（１９９５）．ＰＣＲＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄａｎｎｕａｌｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔａｌ．（１９９９）．ＰＣＲＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＧｅｎｏｍｉｃｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。本発明の遺伝子ワクチンは、当該分野において公知の技術を用いて実施することができる。そのようなワクチンの作製は、本明細書において他の場所において詳述される分子生物学的手法、生化学的手法および遺伝子工学的手法を応用することによって実施することができる。(General technology)
Molecular biological techniques, genetic engineering techniques, biochemical techniques, and microbiological techniques used in this specification are well known and commonly used in the art, and are described in, for example, Sambrook J. et al. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and its 3rd Ed. (2001); Ausubel, F .; M.M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F .; M.M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F .; M.M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F .; M.M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods From Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M .; A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F .; M.M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annulupdates; J. et al. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, “Experimental Methods for Gene Transfer & Expression Analysis”, Yodosha, 1997, etc., which are related in this specification (may be all) Is incorporated by reference. The gene vaccine of the present invention can be implemented using techniques known in the art. The production of such a vaccine can be performed by applying molecular biological techniques, biochemical techniques and genetic engineering techniques detailed elsewhere herein.

人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｕｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｔｈｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔａｌ．（１９９４）．ＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９６）．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。 For DNA synthesis technology and nucleic acid chemistry for producing artificially synthesized genes, see, for example, Gait, M. et al. J. et al. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M .; J. et al. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F .; (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R .; L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman &Hall; Shabarova, Z. et al. et al. (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G .; M.M. et al. (1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G .; T.A. (1996). Bioconjugate eTechniques, Academic Press, etc., which are incorporated herein by reference in the relevant part.

以下に本発明において使用される定義、基本的技術などを説明する。 Hereinafter, definitions and basic techniques used in the present invention will be described.

（細胞融合）
本明細書において「細胞融合」とは、隣接細胞が融合して隔壁が消失した結果、複数の細胞がそれより少ない個数の細胞になることをいう。代表的に、細胞が融合すると、多核化が起こる。生殖細胞の受精時などの自然においてもおこり得るが、通常、細胞工学上の手段として提供される。２種の相異なる細胞を化学的または物理的に融合させ、融合細胞だけを増殖させる選択培地を用いて培養することによって生産することができる。１９５７年岡田善雄らは、紫外線で感染力を失活させたＨＶＪ（センダイウイルス）によって細胞融合が誘導されることを発見した．細胞融合作用をもつウイルスには、このほかパラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルスといったパラミクソウイルスが主に知られている。化学物質によっても細胞融合は可能で、リゾレシチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００、グリセロールオレイン酸エステルなどが用いられる。化学薬剤を用いる方法は、ウイルスの受容体をもたない動物細胞や植物細胞のプロトプラストの融合が可能であり、ウイルスゲノムによる影響がないなどの点で優れているとされている。物理的手法としては、電気刺激を利用した細胞融合（電気融合）が行われる。(Cell fusion)
In the present specification, “cell fusion” means that a plurality of cells become a smaller number of cells as a result of fusion of adjacent cells and disappearance of the septum. Typically, multinucleation occurs when cells fuse. Although it can occur in nature, such as when fertilizing fertilized cells, it is usually provided as a means for cell engineering. It can be produced by chemically or physically fusing two different cells and culturing using a selective medium that allows only the fused cells to grow. In 1957, Yoshio Okada et al. Found that cell fusion was induced by HVJ (Sendai virus) whose infectivity was inactivated by ultraviolet rays. In addition, paramyxoviruses such as parainfluenza virus and Newcastle disease virus are mainly known as viruses having a cell fusion action. Cell fusion is also possible with chemical substances, and lysolecithin, polyethylene glycol (PEG) 6000, glycerol oleate and the like are used. The method using a chemical agent is said to be excellent in that it can be fused with protoplasts of animal cells and plant cells that do not have a viral receptor and is not affected by the viral genome. As a physical method, cell fusion (electrofusion) using electrical stimulation is performed.

本明細書において「ウイルス」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをゲノムとして有する、感染細胞内だけで増殖する感染性の微小構造体をいう。ウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびヘパドナウイルス科からなる群より選択される科に属するウイルスが挙げられる。本明細書において好ましくは、使用されるウイルスは、オルトミクソウイルス科のインフルエンザウイルスまたはセンダイウイルスであり得る。本明細書においてより好ましくは、使用されるウイルスは、センダイウイルスである。 As used herein, “virus” refers to an infectious microstructure that has either DNA or RNA as a genome and that grows only in infected cells. Viruses include retroviridae, togaviridae, coronaviridae, flaviviridae, paramyxoviridae, orthomyxoviridae, bunyaviridae, rhabdoviridae, poxviridae, herpesviridae, baculoviridae and hepa A virus belonging to a family selected from the group consisting of the family Donnaviridae. Preferably, the virus used herein may be an orthomyxoviridae influenza virus or a Sendai virus. More preferably herein, the virus used is Sendai virus.

本明細書において「センダイウイルス」または「ＨＶＪ」（ＨｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇｖｉｒｕｓｏｆＪａｐａｎ）とは、互換的に用いられ、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属する、細胞融合作用を有するウイルスをいう。Ｍ．Ｋｕｒｏｙａら（１９５３）がセンダイウイルスとして報告した。ゲノムは，約１５５００塩基長のマイナス鎖ＲＮＡである。センダイウイルスのウイルス粒子にはエンベロープがあり、直径１５０〜３００ｎｍの多形性を示す。センダイウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼを有する。熱に不安定で，ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、溶血性も示す。発育鶏卵および／または各種動物の腎臓由来培養細胞の細胞質中で増殖する。センダイウイルスは、株細胞に感染させた場合は持続感染を起こしやすい。種々の細胞を融合する能力をもつことから、細胞のヘテロカリオン形成、雑種細胞の作製などの細胞融合に広く利用されている。 In this specification, “Sendai virus” or “HVJ” (Hemagglutinating virus of Japan) is used interchangeably and refers to a virus having a cell fusion action belonging to the genus Paramyxovirus belonging to the Paramyxoviridae family. M.M. Kuroya et al. (1953) reported it as Sendai virus. The genome is a minus-strand RNA having a length of about 15500 bases. Sendai virus particles have an envelope and show polymorphism with a diameter of 150 to 300 nm. Sendai virus has RNA polymerase. It is unstable to heat, agglutinates almost all types of red blood cells, and is hemolytic. It grows in the cytoplasm of cultured chicken eggs and / or kidney-derived cultured cells of various animals. Sendai virus is susceptible to persistent infection when strain cells are infected. Since it has the ability to fuse various cells, it is widely used for cell fusion such as heterokaryon formation of cells and preparation of hybrid cells.

本明細書において「ウイルスの一部」とは、ウイルスの全部ではないが、ウイルスが有する細胞融合能力を保持する部分（例えば、エンベロープ、コアなど）をいう。そのような能力は、任意の細胞を複数用意し、試験されるべき部分を提供したときに、細胞が融合するかどうかを判定することによって判断することができる。 In the present specification, the “part of the virus” refers to a part (for example, envelope, core, etc.) that retains the cell fusion ability of the virus, but not all of the virus. Such ability can be determined by preparing a plurality of arbitrary cells and determining whether the cells fuse when they provide the portion to be tested.

本明細書において「（ウイルス）エンベロープ」とは、センダイウイルスなどの特定のウイルスに存在するヌクレオキャプシドの周囲を取り囲む脂質二重層を基本とする膜構造をいう。エンベロープは、通常、細胞から出芽によって成熟するウイルスにみられる。エンベロープは、概してウイルス遺伝子によりコードされたスパイクタンパク質からなる小突起構造物と宿主由来の脂質とからなる。本明細書において使用される細胞融合技術には、このエンベロープを使用しても良い。 In the present specification, the “(virus) envelope” refers to a membrane structure based on a lipid bilayer surrounding a nucleocapsid present in a specific virus such as Sendai virus. The envelope is usually found in viruses that mature from cells by budding. The envelope is generally composed of microprojection structures consisting of spike proteins encoded by viral genes and host-derived lipids. This envelope may be used in the cell fusion technique used herein.

本明細書において「不活化」とは、ウイルス（例えば、センダイウイルス）について言及されるとき、ゲノムが不活化されることをいう。不活化されたウイルスは、複製欠損である。不活化されたウイルスは、細胞融合能を通常保持するが、ウイルスが有していた病原性は消失していることが好ましい。不活化は、例えば、紫外線照射、Ｘ線照射、電子線照射、γ線照射、アルキル化剤での処理によって達成される。 As used herein, “inactivation” refers to inactivation of a genome when referring to a virus (eg, Sendai virus). Inactivated viruses are replication defective. The inactivated virus usually retains cell fusion ability, but it is preferable that the pathogenicity of the virus has disappeared. Inactivation is achieved, for example, by ultraviolet irradiation, X-ray irradiation, electron beam irradiation, γ-ray irradiation, or treatment with an alkylating agent.

本明細書において「アルキル化」とは、有機化合物の水素原子をアルキル基で置換する作用を有すことをいい、「アルキル化剤」（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇａｇｅｎｔ）とは、アルキル基を与える化合物をいう。アルキル化剤としては、例えば、ハロゲン化アルキル，硫酸ジアルキル、スルホン酸アルキル、アルキル亜鉛などの有機金属化合物が挙げられる。好ましいアルキル化剤としては、β−プロピオラクトン、ブチロラクトン、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化プロピル、臭化メチル、臭化エチル、臭化プロピル、ジメチル硫酸、ジエチル硫酸などが挙げられるがそれらに限定されない。 As used herein, “alkylation” refers to the action of substituting a hydrogen atom of an organic compound with an alkyl group, and “alkylating agent” refers to a compound that provides an alkyl group. Examples of the alkylating agent include organic metal compounds such as alkyl halides, dialkyl sulfates, alkyl sulfonates, and alkyl zincs. Preferred alkylating agents include β-propiolactone, butyrolactone, methyl iodide, ethyl iodide, propyl iodide, methyl bromide, ethyl bromide, propyl bromide, dimethyl sulfate, diethyl sulfate and the like. It is not limited to.

本明細書において「抗原提示細胞」（ＡＰＣともいう）は、抗原を細胞表面に提示することができる細胞をいう。ヘルパーＴ細胞が抗原などの種々の細胞***誘起物質に応答して増殖・分化する際の応答に必要な非リンパ系の共存細胞が代表例である。細胞表面に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩＩ分子を発現しており、その分子の微小な溝に抗原（異物蛋白質の分解物，すなわち十数個のアミノ酸残基からなるペプチド）をはさみこんだ形でＴ細胞に提示する。生体内では、主に樹状細胞、表皮のランゲルハンス細胞がこの機能を担っており、この他、活性化したマクロファージ、Ｂ細胞なども同様の機能を有することから、本発明では、このような任意の抗原提示細胞を用いることができることが理解される。抗原提示細胞は単にＴ細胞に抗原を提示するだけでなく、Ｔ細胞との間に細胞表面分子（例えば、Ｂ７およびＣＤ２８）を介した相互作用を行い、サイトカインによる刺激も与えることが知られる。 As used herein, “antigen-presenting cell” (also referred to as APC) refers to a cell capable of presenting an antigen on the cell surface. A typical example is non-lymphoid coexisting cells required for the response when helper T cells proliferate and differentiate in response to various mitogenic substances such as antigens. A major histocompatibility complex (MHC) class II molecule is expressed on the cell surface, and an antigen (a foreign protein degradation product, ie, a peptide consisting of more than a dozen amino acid residues) is placed in the minute groove of the molecule. Presented to T cells in a sandwiched form. In vivo, mainly dendritic cells and Langerhans cells of the epidermis are responsible for this function, and in addition, activated macrophages, B cells and the like have similar functions. It is understood that any antigen presenting cell can be used. It is known that antigen-presenting cells not only present antigens to T cells, but also interact with T cells via cell surface molecules (eg, B7 and CD28), and also provide cytokine stimulation.

本明細書において「樹状細胞」（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ）とは、ＤＣとも略され、ンパ系組織などの種々の組織において各組織細胞間隙に樹枝状突起を出している細胞をいう。結合組織を形成せず，食作用をもたないか非常に低い点が、マクロファージなどと異なる。骨髄の造血幹細胞に由来し、細胞表面にクラスＩおよびクラスＩＩの組織適合性抗原を発現し、免疫応答の開始時におけるＴ細胞活性化に重要な役割を果たす。表皮のランゲルハンス細胞も樹状細胞の一種とされ、本明細書においては、特に言及しない限り、樹状細胞は、このランゲルハンス細胞も含む。本明細書では、樹状細胞の前駆細胞もまた、使用されることが理解される。 In the present specification, “dendritic cell” is also abbreviated as DC, and refers to a cell that has dendrites in various tissue cell gaps in various tissues such as a proteinaceous tissue. It differs from macrophages and the like in that it does not form connective tissue and has no or very low phagocytosis. It is derived from bone marrow hematopoietic stem cells and expresses class I and class II histocompatibility antigens on the cell surface and plays an important role in T cell activation at the start of the immune response. The Langerhans cells of the epidermis are also a kind of dendritic cells. In the present specification, unless otherwise specified, dendritic cells also include the Langerhans cells. It is understood herein that dendritic cell progenitor cells are also used.

本明細書において「前駆細胞」とは、ある細胞について言及するとき、その細胞に分化する能力を有する細胞をいう。従って、樹状細胞の前駆細胞は、分化すると、樹状細胞になり得ることが理解される。 As used herein, “progenitor cell” refers to a cell having the ability to differentiate into a certain cell. Thus, it is understood that dendritic cell progenitor cells can become dendritic cells upon differentiation.

本明細書において「免疫反応性供給細胞」とは、免疫系を有するある生体に存在するときに、その生体に対して免疫反応を惹起することができる細胞をいう。従って、通常、免疫反応性供給細胞は、ある生体にとって抗原となる物質を有するかまたは発現することができる。免疫反応性供給細胞は、代表的には、例えば、新生物（癌など）感染性の細胞（例えば、ウイルス、細菌、原虫、リケッチア、クラミジア、真菌、寄生虫など）、自己免疫疾患を惹起するかまたは関連する細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。 As used herein, “immunoreactive donor cell” refers to a cell that is capable of eliciting an immune response against a living body when present in a living body having an immune system. Thus, usually, immunoreactive donor cells can have or express a substance that is an antigen for a given organism. Immunoreactive donor cells typically elicit, for example, neoplastic (such as cancer) infectious cells (such as viruses, bacteria, protozoa, rickettsia, chlamydia, fungi, parasites), autoimmune diseases. Or related cells and the like.

本明細書において、「正常細胞」とは、疾患状態になく、疾患を起こす（例えば、病因となる）細胞以外の任意の細胞をいう。従って、正常細胞は、正常な宿主に普遍的に存在する。他方、疾患状態にある細胞は、「罹患細胞」と称することがある。 As used herein, “normal cell” refers to any cell other than a cell that is not in a disease state and causes disease (eg, causes etiology). Thus, normal cells are universally present in normal hosts. On the other hand, cells in a disease state may be referred to as “affected cells”.

本明細書において「癌」または「がん」は、互換可能に用いられ、異型性が強く、増殖が正常細胞より速く、周囲組織に破壊性に浸潤し得あるいは転移をおこし得る悪性腫瘍またはそのような悪性腫瘍が存在する状態をいう。本発明においては、癌は固形癌および造血器腫瘍を含むがそれらに限定されない。 In the present specification, "cancer" or "cancer" is used interchangeably, and is a malignant tumor or its malignant tumor that has strong atypia, can grow faster than normal cells, and can invade surrounding tissues destructively or metastasize. This refers to a state in which such a malignant tumor exists. In the present invention, cancer includes, but is not limited to, solid cancer and hematopoietic tumor.

本明細書において「固形癌」は、固形の形状がある癌をいい、白血病などの造血器腫瘍とは対峙する概念である。そのような固形癌としては、例えば、乳癌、肝癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、子宮頸部癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、悪性リンパ腫、食道癌、脳腫瘍、骨腫瘍が挙げられるがそれらに限定されない。本発明が特に意図する癌としては、例えば、肺癌、メラノーマ、胃癌などが挙げられるがそれらに限定されない。 In the present specification, “solid cancer” refers to cancer having a solid shape, and is a concept confronting hematopoietic tumors such as leukemia. Examples of such solid cancers include breast cancer, liver cancer, stomach cancer, lung cancer, head and neck cancer, cervical cancer, prostate cancer, retinoblastoma, malignant lymphoma, esophageal cancer, brain tumor, and bone tumor. It is not limited to. Examples of the cancer specifically intended by the present invention include, but are not limited to, lung cancer, melanoma, and gastric cancer.

本明細書において、「癌細胞」とは、癌の状態にある細胞をいう。本明細書において、癌細胞としては、例えば、メラノーマ、肺癌、胃癌、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺癌、リンパ腫、肉腫、肝癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、胸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、大腸癌（結腸直腸癌）、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、膀胱癌、子宮頸部癌、皮膚癌、乳癌、食道癌、腎腫、脳腫瘍などの細胞を挙げることができるがそれらに限定されない。 In the present specification, “cancer cell” refers to a cell in a cancerous state. In this specification, examples of cancer cells include melanoma, lung cancer, gastric cancer, adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, adenosquamous carcinoma, thymic carcinoma, lymphoma, sarcoma, liver cancer, non-Hodgkin lymphoma, Hodgkin lymphoma, leukemia, uterine cancer , Breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, colon cancer (colorectal cancer), multiple myeloma, neuroblastoma, bladder cancer, cervical cancer, skin cancer, breast cancer, esophageal cancer, nephroma, Examples include cells such as brain tumors, but are not limited thereto.

本明細書において「細胞表面マーカー」とは、「細胞表面抗原」とも称され、ある細胞の表面に特徴的に発現するタンパク質またはペプチドをいう。例えば、抗原提示細胞の細胞表面マーカーとしては、ＣＤ１、ＣＤ１１ｃ（インテグリンαＸ）、ＣＤ４０、ＣＤ５８（ＬＦＡ−３）、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１２３（抗ＩＬ−３Ｒａ）、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ１４８、ＣＤ１５７，ＣＤ８０、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩなどを挙げることができるがそれらに限定されない。別の代表例としては、例えば、細胞系マーカーとして、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６などを挙げることができるがそれらに限定されない。 As used herein, “cell surface marker” is also referred to as “cell surface antigen” and refers to a protein or peptide that is characteristically expressed on the surface of a certain cell. For example, cell surface markers for antigen presenting cells include CD1, CD11c (integrin αX), CD40, CD58 (LFA-3), CD86, HLA-DR, CD123 (anti-IL-3Ra), CD21, CD23, CD148, CD157. , CD80, MHC class I and MHC class II, but not limited thereto. Other representative examples include, but are not limited to, cell line markers such as CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56, and the like.

本明細書において「腫瘍特異的抗原」とは、ある腫瘍に特異的に発現する任意の抗原をいう。従って、腫瘍特異的抗原は、細胞表面マーカーの一種といえる。そのような抗原は、本明細書の表Ａに例示される。 As used herein, “tumor-specific antigen” refers to any antigen that is specifically expressed in a tumor. Therefore, tumor-specific antigens can be said to be a kind of cell surface marker. Such antigens are exemplified in Table A herein.

本明細書において「不活化」とは、免疫反応性供給細胞（例えば、癌細胞）について言及されるとき、その免疫反応性供給細胞の病原性が不活化されることをいう。不活化された免疫反応性供給細胞は、毒性となる因子が不活化または除去されていることが好ましい。不活化された免疫反応性供給細胞は、ワクチンとして使用されるとき、疾患を惹起しないことから好ましい。このような不活化は、例えば、紫外線照射、Ｘ線照射、電子線照射、γ線照射、アルキル化剤での処理によって達成される。 As used herein, “inactivation” refers to inactivation of the pathogenicity of an immunoreactive donor cell when referring to an immunoreactive donor cell (eg, a cancer cell). The inactivated immunoreactive donor cells are preferably inactivated or removed of toxic factors. Inactivated immunoreactive donor cells are preferred because they do not cause disease when used as a vaccine. Such inactivation is achieved by, for example, ultraviolet irradiation, X-ray irradiation, electron beam irradiation, γ-ray irradiation, or treatment with an alkylating agent.

本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる。抗原提示細胞としては、免疫系を有する任意の動物の細胞が用いられる。免疫反応性供給細胞としては、免疫系を有する動物に悪影響を与え得る任意の細胞が使用され得る。 The cells used in the present invention may be cells derived from any organism (for example, any kind of multicellular organisms (eg, animals (eg, vertebrates, invertebrates), plants (eg, monocotyledonous plants, dicotyledonous plants, etc.)). ) Etc.)). Preferably, cells derived from vertebrates (eg, eelfish, lamprey, cartilaginous fish, teleosts, amphibians, reptiles, birds, mammals, etc.) are used, more preferably mammals (eg, single pores, Marsupial, rodent, winged, winged, carnivorous, carnivorous, long-nosed, odd-hoofed, cloven-hoofed, rodent, scale, sea cattle, cetacean, primate , Rodents, rabbit eyes, etc.). More preferably, cells derived from primates (eg, chimpanzee, Japanese monkey, human) are used. Most preferably, human-derived cells are used. As antigen-presenting cells, cells of any animal having an immune system are used. As the immunoreactive donor cell, any cell that can adversely affect an animal having an immune system can be used.

本明細書において「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。 In the present specification, the “amino acid” may be natural or non-natural as long as it satisfies the object of the present invention. “Derivative amino acid” or “amino acid analog” refers to an amino acid that is different from a naturally occurring amino acid but has the same function as the original amino acid. Such derivative amino acids and amino acid analogs are well known in the art.

本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。本明細書において「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明では、遺伝子産物が発現される限り、どのようなアナログを使用してもよい。好ましくは、天然型のヌクレオチドを含む遺伝子ワクチンが使用される。天然型のものは、ペプチドに翻訳される可能性が高いからである。 In the present specification, the “nucleotide” may be natural or non-natural. As used herein, “derivative nucleotide” or “nucleotide analog” refers to a nucleotide having a function different from that of a naturally occurring nucleotide but similar to that of the original nucleotide. Such derivative nucleotides and nucleotide analogs are well known in the art. Examples of such derivative nucleotides and nucleotide analogs include, but are not limited to, phosphorothioate, phosphoramidate, methyl phosphonate, chiral methyl phosphonate, 2-O-methyl ribonucleotide, peptide-nucleic acid (PNA). . In the present invention, any analog may be used as long as the gene product is expressed. Preferably, a genetic vaccine containing natural nucleotides is used. This is because the natural type is highly likely to be translated into a peptide.

本発明は、臨床または非臨床への適用に有用である。本発明の融合細胞の調製方法は、迅速であり、しかも有効性が高いという効果を奏する。本発明の融合細胞は、免疫系を利用して疾患を治療または予防する治療レジメ（例えば、癌治療・癌予防など）において特に有用である。本発明の融合細胞はまた、従来のハイブリドーマのように、モノクローナル抗体の調製において有用である。また他の態様において、本発明の融合細胞は、免疫応答に必要とされるアクセサリー成分を欠いている抗原提示細胞、および患者の移植を予定された器官由来の細胞を含む。これらの細胞は、移植細胞に対する寛容を誘導するために使用され得る。寛容を誘導した後は、それによって移植拒絶反応の発生が減少する。本発明の融合細胞を作製し、本発明の方法を実施するためのキットも提供される。 The present invention is useful for clinical or non-clinical applications. The method for preparing a fused cell of the present invention has an effect that it is rapid and highly effective. The fusion cell of the present invention is particularly useful in a therapeutic regimen for treating or preventing a disease using the immune system (eg, cancer treatment / cancer prevention). The fused cells of the present invention are also useful in the preparation of monoclonal antibodies, as are conventional hybridomas. In yet another embodiment, the fusion cells of the present invention comprise antigen presenting cells lacking accessory components required for an immune response, and cells from an organ intended for patient transplantation. These cells can be used to induce tolerance to transplanted cells. After induction of tolerance, it reduces the incidence of transplant rejection. Kits for producing the fused cells of the present invention and for carrying out the methods of the present invention are also provided.

（抗原および抗体）
本明細書において「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）_２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。(Antigens and antibodies)
As used herein, “antibody” refers to polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, human antibodies, humanized antibodies, multispecific antibodies, chimeric antibodies, and anti-idiotype antibodies, and fragments thereof such as F (ab ′) ₂ and Fab. Includes fragments, as well as other recombinantly produced conjugates. In addition, such antibodies may be covalently linked or recombinantly fused to enzymes such as alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, alpha galactosidase, and the like.

本明細書において「中和抗体」とは、酵素、毒素、細菌、ウイルスなどの生物学的活性を中和する抗体をいう。本発明では特に、抗原に関連する生物学的活性を中和する抗体をいう。 As used herein, “neutralizing antibody” refers to an antibody that neutralizes biological activities of enzymes, toxins, bacteria, viruses and the like. In the present invention, in particular, it refers to an antibody that neutralizes the biological activity associated with an antigen.

本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。 As used herein, “antigen” refers to any substrate that can be specifically bound by an antibody molecule. As used herein, “immunogen” refers to an antigen capable of initiating lymphocyte activation that produces an antigen-specific immune response.

本明細書において「エピトープ」とは、抗原を決定する構造を構成する基のことをいう。従って、エピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。本発明では、エピトープを決定する必要は全くない。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。 As used herein, “epitope” refers to a group constituting a structure that determines an antigen. Thus, an epitope is required for a set of amino acid residues involved in recognition by a particular immunoglobulin, or in the case of T cells, for recognition by T cell receptor proteins and / or major histocompatibility complex (MHC) receptors. A set of amino acid residues is included. The term is also used interchangeably with “antigenic determinant” or “antigenic determinant site”. In the present invention, there is no need to determine the epitope. In the immune system field, in vivo or in vitro, an epitope is a molecular feature (eg, primary peptide structure, secondary peptide structure or tertiary peptide structure and charge) and is recognized by an immunoglobulin, T cell receptor or HLA molecule. Form a site. An epitope comprising a peptide can comprise more than two amino acids in a spatial conformation unique to the epitope. In general, an epitope consists of at least 5 such amino acids, typically consisting of at least 6, 7, 8, 9, or 10 such amino acids. Longer epitope lengths are generally preferred because they are more similar to the antigenicity of the original peptide, but may not necessarily be so when considering conformation. Methods for determining the spatial conformation of amino acids are known in the art and include, for example, X-ray crystallography and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, identification of epitopes in a given protein is readily accomplished using techniques well known in the art. See, for example, Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998 (a general method for rapidly synthesizing peptides to determine the location of immunogenic epitopes in a given antigen); US Pat. No. 4,708,871 (identifying epitopes of antigen and See Procedure for Chemical Synthesis); and Geysen et al. (1986) Molecular Immunology 23: 709 (a technique for identifying peptides with high affinity for a given antibody). Antibodies that recognize the same epitope can be identified in a simple immunoassay. Thus, methods for determining epitopes comprising peptides are well known in the art, and once such epitopes are provided with the primary sequence of a nucleic acid or amino acid, those skilled in the art will use such well known techniques. Can be determined.

従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。 Thus, for use as an epitope comprising a peptide, a sequence of at least 3 amino acids in length is required, preferably this sequence is at least 4 amino acids, more preferably 5 amino acids, 6 amino acids, 7 amino acids, 8 A sequence of amino acids 9 amino acids 10 amino acids 15 amino acids 20 amino acids 25 amino acids long may be required.

（ウイルスの不活化）
ウイルスの不活化が必要な場合、代表的には、以下に記載するように、紫外線照射またはアルキル化剤処理などにより行う。(Virus inactivation)
When it is necessary to inactivate a virus, it is typically carried out by ultraviolet irradiation or treatment with an alkylating agent as described below.

紫外線照射法：ウイルス（例えば、ＨＶＪ）懸濁液１ｍｌを３０ｍｍ径のシャーレにとり、９９または１９８ミリジュール／ｃｍ^２を照射した。ガンマー線照射も利用可能である（５〜２０グレイ）が完全な不活化がおこらない。Ultraviolet irradiation method: 1 ml of a virus (for example, HVJ) suspension was placed in a petri dish having a diameter of 30 mm and irradiated with 99 or 198 millijoules / cm ² . Gamma radiation can also be used (5-20 gray), but complete inactivation does not occur.

アルキル化剤による処理：使用直前に、１０ｍＭＫＨ_２ＰＯ中に０．０１％ β−プロピオラクトンの調製をした。作業中は低温下に保ち素早く作業を行う。Treatment with alkylating agent: 0.01% β-propiolactone was prepared in 10 mM KH ₂ PO immediately before use. During work, keep the temperature low and work quickly.

精製直後のウイルス（例えば、ＨＶＪ）の懸濁液に最終０．０１％になるようにβ−プロピオラクトンを添加し、氷上で６０分間でインキュベートした。その後２時間、３７℃でインキュベートした。エッペンドルフチューブにチューブあたり１０，０００ＨＡＵ分ずつ分注し、１５，０００ｒｐｍ，１５分遠心し、沈澱を−２０℃で保存する。 Β-propiolactone was added to a suspension of virus (eg, HVJ) immediately after purification to a final concentration of 0.01% and incubated on ice for 60 minutes. Thereafter, it was incubated at 37 ° C. for 2 hours. Dispense 10,000 HAU per tube into an Eppendorf tube, centrifuge at 15,000 rpm for 15 minutes, and store the precipitate at -20 ° C.

エンベロープに加えて、これらの薬学的組成物および医薬は、賦形剤または薬学的に使用できる製剤を調製するために、エンベロープのプロセシングを促進する他の化合物を含む、適切な、薬学的に受容可能なキャリアーを含み得る。処方および投与のための技術のさらなる詳細は、例えば、日本薬局方の最新版および最新追補、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’ＳＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥＳ」（ＭａａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最終版に記載されている。 In addition to the envelope, these pharmaceutical compositions and medicaments are suitable, pharmaceutically acceptable, including excipients or other compounds that facilitate the processing of the envelope to prepare pharmaceutically usable formulations. Possible carriers may be included. Further details of techniques for formulation and administration are described, for example, in the latest edition of the Japanese Pharmacopoeia latest edition and latest supplement, “REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES” (Maack Publishing Co., Easton, PA).

（アジュバント）
本明細書において「アジュバント」とは、投与された免疫原と混合するとき、免疫応答を増加するか、あるいはそうでなければ変更する物質である。アジュバントは、例えば、鉱物、細菌、植物、合成または宿主の産生物に場合に応じて分類される。(Adjuvant)
As used herein, an “adjuvant” is a substance that increases or otherwise alters the immune response when mixed with an administered immunogen. Adjuvants are classified according to the case, for example, mineral, bacterial, plant, synthetic or host products.

アジュバントは、ハプテンのエピトープの免疫原性を増強する物質であり、より好ましい実施形態では、変調させるか、または効力のある無毒のアジュバントが使用される。アジュバントは通常のワクチンとともに使用して、より早い、より効力のある、あるいはより延長した応答を誘発するために要求される。このようなアジュバントは、また、抗原の供給が限定されるか、あるいは産生にコストがかかる場合において有用である。 An adjuvant is a substance that enhances the immunogenicity of a hapten epitope, and in a more preferred embodiment, a modulating or potent non-toxic adjuvant is used. Adjuvants are required for use with conventional vaccines to elicit an earlier, more potent or prolonged response. Such adjuvants are also useful when the supply of antigen is limited or production is costly.

アジュバントとしては、例えば、鉱物、バクテリア、植物、合成または宿主の産生物に場合に応じて分類される。
第一のクラスは、鉱物のアジュバント、例えば、アルミニウム化合物である。アジュバントとしてアルミニウム化合物の最初の使用は１９２６年に記載された。その時以来、アルミニウム化合物とともに沈澱させた抗原あるいは予め形成されたアルミニウム化合物と混合されまたはそれに吸着された抗原が、動物およびヒトにおける免疫応答の増強するために使用されている。アルミニウム化合物および同様なアジュバントは次のメカニズムを通して働くようである。アルミニウムは、抗原に物理的に結合して粒子を形成し、注射後組織の中に抗原の貯蔵所を形成する。抗原の分泌を遅くさせ、こうして抗原と抗原を表す細胞、例えば、マクロファージまたは濾胞−樹状細胞との間の相互作用の時間を延長する。さらに、免疫能力細胞を注射区域に取り付け、そして活性化する。アルミニウム粒子はウサギの領域的リンパ節において免疫化後７日に実証され、そして他の有意の機能が節それら自体におけるＴ細胞含有領域に抗原を向けることがあり得る。アジュバントの効力は排出するリンパ節の情報と相関関係を有することが示された。多数の研究はアルミニウムとともに投与された抗原が体液の免疫性の増加に導くことを確証したが、細胞仲介免疫性は、遅延型過敏性により測定して、わずかに増加するだけあるように思われる。アルミニウムは、また、補体の経路を活性化するとして記載された。このメカニズムは局所的炎症性の応答ならびに免疫グロブリンの多糖および毛細胆管の記憶において役割を演じ得る。Adjuvants are classified according to the case, for example, minerals, bacteria, plants, synthetic or host products.
The first class is mineral adjuvants such as aluminum compounds. The first use of an aluminum compound as an adjuvant was described in 1926. Since then, antigens precipitated with aluminum compounds or antigens mixed with or adsorbed to preformed aluminum compounds have been used to enhance immune responses in animals and humans. Aluminum compounds and similar adjuvants appear to work through the following mechanism. Aluminum physically binds to the antigen to form particles and forms a reservoir for the antigen in the tissue after injection. It slows the secretion of the antigen, thus prolonging the time of interaction between the antigen and the cell representing the antigen, for example macrophages or follicle-dendritic cells. In addition, immune competent cells are attached to the injection area and activated. Aluminum particles are demonstrated 7 days after immunization in rabbit regional lymph nodes, and other significant functions may direct antigens to T cell-containing regions in the nodes themselves. Adjuvant efficacy has been shown to correlate with draining lymph node information. Numerous studies have confirmed that antigens administered with aluminum lead to increased immunity of body fluids, but cell-mediated immunity appears to be only slightly increased as measured by delayed-type hypersensitivity . Aluminum has also been described as activating the complement pathway. This mechanism may play a role in local inflammatory responses and memory of immunoglobulin polysaccharides and capillaries.

アルミニウム化合物は現在ヒトにおいて使用されているほぼ唯一の安全なアジュバントである。しかし、アルミニウムを含有するワクチンは時々局所的反応を引き起こす。アレルギーの発現は通常臨床的問題でないが、アルミニウム化合物は、また、好酸球をＴ細胞依存性メカニズムを経て注射領域に引き付けて、注射した場合抗原のプライミング後ＩｇＥの応答を誘発し、そしてＩｇＥの応答についてヘルパー機能をもつ担体特異的細胞の集団を誘発するといわれている。さらに、アルミニウムを含有するワクチンは凍結乾燥することができず、こうして冷蔵した輸送および貯蔵を必要とし、汚染の危険を生ずる。しかも、アルミニウム化合物は疾患からの持続した保護を誘発するとき常に成功するというわけではない。 Aluminum compounds are almost the only safe adjuvant currently used in humans. However, vaccines containing aluminum sometimes cause local reactions. Although allergic manifestations are usually not a clinical problem, aluminum compounds also attract eosinophils to the injection area via a T cell-dependent mechanism, eliciting an IgE response after priming of the antigen when injected, and IgE It is said that it induces a population of carrier-specific cells having a helper function in response to the above. Furthermore, aluminum containing vaccines cannot be lyophilized, thus requiring refrigerated transport and storage, creating a risk of contamination. Moreover, aluminum compounds are not always successful when inducing sustained protection from disease.

アジュバントの他の大きい群はバクテリア由来クラスである。バクテリア由来のアジュバントは精製されそして合成され（例えば、ムラニルジペプチド、リピドＡ）および宿主仲介因子はクローニングされている（インターロイキン１およびインターロイキン２）。最近、ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、リポ多糖およびフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）が実験室レベルで使用されつつある。 Another large group of adjuvants is the bacteria-derived class. Bacteria-derived adjuvants have been purified and synthesized (eg, muranyl dipeptide, lipid A) and host mediators have been cloned (interleukin 1 and interleukin 2). Recently, Bordetella pertussis, lipopolysaccharide and Freund's complete adjuvant (FCA) are being used at the laboratory level.

他の物質もまた、アジュバントとして種々使用されてきている。それらは植物産生物、例えば、サポニン、動物産生物、例えば、キチンおよび多数の合成化学物質を包含する。 Other substances have also been used in various ways as adjuvants. They include plant products such as saponins, animal products such as chitin and numerous synthetic chemicals.

本明細書では、オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ）もまたアジュバントとして使用される。このオリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ）の調製方法は、上述の核酸分子の調製方法に準ずることができ、当該分野において周知の方法を用いることができる。そのようなものの例示としては、シグマ・アルドリッチジャパン（株）、ヤマサ醤油、Ｆｌｕｋａなどからが入手可能であるキットを用いることができる。 Herein, oligonucleotides (eg, CpG) are also used as adjuvants. The preparation method of this oligonucleotide (for example, CpG) can follow the preparation method of the above-mentioned nucleic acid molecule, and can use a well-known method in the said field | area. As an example of such a thing, the kit which can be obtained from Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd., Yamasa soy sauce, Fluka etc. can be used.

（医薬）
本発明は、医薬として提供され得る。本発明は、ワクチンとして投与され得るか、あるいは、治療剤として投与され得る。(Medicine)
The present invention can be provided as a medicament. The present invention can be administered as a vaccine or can be administered as a therapeutic agent.

本明細書において「ワクチン」とは、身体中に投与されて、活性な免疫を生成する、通常感染性因子または感染因子のある部分またはそのような因子または部分を生成することができる因子（例えば、遺伝子配列など）を含む組成物（例えば、懸濁液または溶液）をいう。ワクチンを構成する抗原性部分は、微生物（例えば、ウイルスまたは細菌など）または微生物から精製された天然の産生物、合成生成物または遺伝子操作したタンパク質、ペプチド、多糖または同様な産生物、あるいはそのようなタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子であり得る。ワクチンは、中和抗体を生起することによって、その効果を発現する。本明細書において医薬として利用され得るワクチンとしては、例えば、癌、後天性免疫不全症候群などのためのワクチンが挙げられるがそれらに限定されない。これらワクチンは、本発明の医薬において細胞またはそれを含む組成物という形態で存在し得る。ワクチン接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）により生物（ヒト・家畜・媒介動物）の体内に能動的につくられる免疫（体液性免疫、細胞性免疫、または両者）が病原体の感染、伝播、流行などを阻止する。 As used herein, a “vaccine” is usually an infectious agent or a part of an infectious agent that is administered into the body to generate active immunity or an agent that can generate such an agent or part (eg, , Gene sequence, etc.) (eg, suspension or solution). The antigenic part that constitutes a vaccine can be a microorganism (eg, a virus or a bacterium) or a natural product purified from a microorganism, a synthetic product or a genetically engineered protein, peptide, polysaccharide or similar product, or such It can be a nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence encoding a particular protein. Vaccines develop their effects by raising neutralizing antibodies. Examples of vaccines that can be used as a medicament in the present specification include, but are not limited to, vaccines for cancer, acquired immune deficiency syndrome, and the like. These vaccines may be present in the form of cells or compositions containing them in the medicament of the present invention. Immunity (humoral immunity, cellular immunity, or both) that is actively created in the body of an organism (human, livestock, vector) by vaccination prevents infection, transmission, epidemic, etc. of pathogens.

本明細書において「遺伝子ワクチン」とは、ワクチンのうち、投与される患者において発現され、その発現物がワクチンの作用を有するような因子（代表的には、核酸分子）を含む組成物（例えば、懸濁液または溶液など）をいう。代表的な遺伝子ワクチンは、抗原性を有する遺伝子産物をコードする核酸配列を含む核酸分子（例えば、ベクター、プラスミド、ＮａｋｅｄＤＮＡなど）であり得る。 As used herein, the term “gene vaccine” refers to a composition comprising a factor (typically a nucleic acid molecule) that is expressed in a patient to be administered and whose expression has the action of a vaccine (typically, a nucleic acid molecule). , Suspension or solution). A typical genetic vaccine can be a nucleic acid molecule (eg, vector, plasmid, Naked DNA, etc.) that includes a nucleic acid sequence that encodes a gene product having antigenicity.

本明細書において「細胞ワクチン」とは、ワクチンのうち、細胞の形態で投与されるものをいう。ここで使用される細胞は、どのような形態のものでもよいが、本発明では、融合細胞が用いられる。 As used herein, “cell vaccine” refers to a vaccine administered in the form of cells. The cells used here may be in any form, but in the present invention, fused cells are used.

本明細書においてワクチンの免疫学的な効果は、当該分野において公知の任意の方法を用いて確認することができる。そのような方法としては、例えば、ＣＴＬ前駆細胞頻度分析、ＥＬＩＳＰＯＴ法、テトラマー法、リアルタイムＰＣＲ法などが挙げられるがそれらに限定されない。例示的な説明として、ＣＴＬ前駆細胞頻度分析では、末梢血リンパ球または抗原ペプチドおよびＩＬ−２存在下で培養したリンパ球を限界希釈し、ＩＬ−２とフィーダー細胞との共存下で培養し、増殖したウェルをワクチンまたはその候補で刺激し、ＩＦＮ−γ産生の有無をＥＬＩＳＡなどで測定する。ここで陽性ウェルをポアソン分析に従ってＣＴＬ前駆細胞の頻度を算出し、ワクチンの効力を評価することができる。ここで、陽性の細胞数が抗原特異的ＣＴＬ数であり、その数が多いほどワクチンとして効力が高いといえる。 In this specification, the immunological effect of a vaccine can be confirmed using any method known in the art. Examples of such methods include, but are not limited to, CTL progenitor cell frequency analysis, ELISPOT method, tetramer method, and real-time PCR method. As an illustrative explanation, in CTL progenitor cell frequency analysis, peripheral blood lymphocytes or antigenic peptides and lymphocytes cultured in the presence of IL-2 are limiting diluted and cultured in the presence of IL-2 and feeder cells, The grown well is stimulated with a vaccine or a candidate thereof, and the presence or absence of IFN-γ production is measured by ELISA or the like. Here, the frequency of CTL progenitor cells can be calculated according to Poisson analysis for positive wells, and the efficacy of the vaccine can be evaluated. Here, the number of positive cells is the number of antigen-specific CTLs, and the greater the number, the higher the efficacy as a vaccine.

本発明のワクチンが医薬として使用される場合、そのような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。例えば、本発明の薬学的組成物および医薬は、任意の無菌生体適合性薬学的キャリアー（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、それらに限定されない）中で投与され得る。これらの分子のいずれも、適切な賦形剤、アジュバント、および／または薬学的に受容可能なキャリアーと混合する薬学的組成物中にて、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。本発明のある実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアーは薬学的に不活性である。 When the vaccine of the present invention is used as a medicine, such a composition may further contain a pharmaceutically acceptable carrier and the like. Examples of the pharmaceutically acceptable carrier contained in the medicament of the present invention include any substance known in the art. For example, the pharmaceutical compositions and medicaments of the invention are administered in any sterile biocompatible pharmaceutical carrier, including but not limited to saline, buffered saline, dextrose, and water. obtain. Any of these molecules can be administered to a patient alone or in combination with other drugs in a pharmaceutical composition mixed with suitable excipients, adjuvants, and / or pharmaceutically acceptable carriers. obtain. In certain embodiments of the invention, the pharmaceutically acceptable carrier is pharmaceutically inert.

本発明がワクチンとして提供される場合、好ましくは、疾患罹患の際に免疫学的により好ましい免疫応答のできる免疫システムが達成されるような、あらゆる組成物をも含むことができる。通常、ワクチンは免疫決定要因（例えば、抗原、細胞など）と、この免疫決定要因の応答を、迅速強化するような作用を呈するアジュバントとを含み、免疫決定要因はアジュバントと組み合わせて用いるのが好適である。免疫賦活剤は、通常用いられる、例えば、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）複合体アジュバントや、フロイント非複合体アジュバント等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のワクチンは、アジュバントを用いなくとも効能を有する。 Where the present invention is provided as a vaccine, it can preferably include any composition that achieves an immune system that is capable of an immunologically more favorable immune response when suffering from a disease. Usually, a vaccine includes an immune determinant (eg, antigen, cell, etc.) and an adjuvant that acts to rapidly enhance the response of the immune determinant, and the immunodeterminant is preferably used in combination with an adjuvant. It is. Examples of the immunostimulant include, but are not limited to, Freund complex adjuvant and Freund non-complex adjuvant, which are usually used. The vaccine of the present invention is effective even without an adjuvant.

本発明の組成物、ワクチンなどで用いられ得る薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、ワクチン、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。 Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the compositions, vaccines, etc. of the present invention include, for example, antioxidants, preservatives, colorants, flavors, and diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, These include but are not limited to fillers, bulking agents, buffering agents, delivery vehicles, diluents, excipients and / or pharmaceutical adjuvants. Typically, the medicament of the present invention is administered in the form of a composition comprising a vaccine, or a variant or derivative thereof, together with one or more physiologically acceptable carriers, excipients or diluents. For example, a suitable vehicle can be water for injection, physiological solution, or artificial cerebrospinal fluid, which can be supplemented with other materials common to compositions for parenteral delivery. .

本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性である。そのような非毒性および不活性のキャリアとしては、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。 Acceptable carriers, excipients or stabilizers used herein are non-toxic to the recipient and are preferably inert at the dosages and concentrations used. Such non-toxic and inert carriers include, for example, phosphate, citrate, or other organic acids; ascorbic acid, α-tocopherol; low molecular weight polypeptides; proteins (eg, serum albumin, gelatin or Immunoglobulins); hydrophilic polymers (eg polyvinylpyrrolidone); amino acids (eg glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine); monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (including glucose, mannose or dextrin); (Eg, EDTA); sugar alcohols (eg, mannitol or sorbitol); salt-forming counterions (eg, sodium); and / or non-ionic surface active agents (eg, Tween, pluroni). ) Or polyethylene glycol (PEG)) but the like are not limited thereto.

細胞ワクチンに適切な例示的キャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。 Exemplary carriers suitable for cellular vaccines include neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin. Preferably, the product is formulated as a lyophilizer using a suitable excipient (eg, sucrose). Other standard carriers, diluents and excipients may be included as desired. Other exemplary compositions include pH 7.0-8.5 Tris buffer or pH 4.0-5.5 acetate buffer, which may further include sorbitol or a suitable substitute thereof. .

本発明は、医薬組成物として提供される他に、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等などとしても提供され得、そしてこれらについても公知の調製法により製造することができることが理解される。 In addition to being provided as a pharmaceutical composition, the present invention can also be provided as an animal drug composition, quasi-drug, aquatic drug composition, food composition, cosmetic composition, and the like. It is understood that it can be produced by a preparation method.

本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）を用いた水溶液の形態で調製され保存され得る。 The medicament of the present invention may be a physiologically acceptable carrier, excipient or stabilizer (Japanese Pharmacopoeia 14th edition or its latest edition, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, AR, as required). Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990, etc.) and can be prepared and stored in the form of an aqueous solution.

経口投与のための薬学的組成物は、投与に適した投与形において当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、薬学的組成物が患者による摂取に適した液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。本発明では、細胞自体の投与が目的とされることから、経口投与ではなく、非経口投与で投与することが好ましい。 Pharmaceutical compositions for oral administration can be formulated using pharmaceutically acceptable carriers well known in the art in dosage forms suitable for administration. Such carriers allow the pharmaceutical composition to be formulated into liquids, gels, syrups, slurries, suspensions, etc. suitable for consumption by the patient. In the present invention, since cells are intended for administration, it is preferable to administer them parenterally rather than orally.

非経口投与用の薬学的製剤は活性成分（例えば、ワクチン）の水溶液または懸濁物を含む。注射のために、本発明の薬学的組成物は水溶液、好ましくはハンクスの溶液、リンゲル溶液、または緩衝化生理食塩水のような生理学的に適合する緩衝液中に処方され得る。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストラン）を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油状注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪酸、あるいはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。所望により、懸濁物は、高濃度溶液の製剤を可能にする安定化剤または化合物の溶解度を増加させる適切な薬剤または試薬を含有し得る。 Pharmaceutical formulations for parenteral administration include aqueous solutions or suspensions of the active ingredients (eg, vaccines). For injection, the pharmaceutical compositions of the invention may be formulated in aqueous solutions, preferably in physiologically compatible buffers such as Hank's solution, Ringer's solution, or buffered saline. Aqueous injection suspensions may contain substances that increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, or dextran. In addition, suspensions of the active compounds can be prepared as appropriate oily injection suspensions. Suitable lipophilic solvents or vehicles include fatty acids such as sesame oil, or synthetic fatty acid esters such as ethyl oleate or triglycerides, or liposomes. If desired, the suspension may contain stabilizers or suitable agents or reagents that increase the solubility of the compounds that allow for the formulation of highly concentrated solutions.

本発明の融合細胞、組成物、キットおよび医薬などはまた、生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸・乳酸の共重合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレートからなる群より選択される少なくとも１つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、α−ヒロドキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸など）およびヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸など）からなる群より選択される１種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸など）、無水マレイン酸系共重合体（例えば、スチレン−マレイン酸共重合体など）のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−体、Ｌ−体、ＤＬ−体のいずれでも用いることが可能である。 The fused cells, compositions, kits, medicaments, etc. of the present invention may also include biocompatible materials. This biocompatible material is, for example, a group consisting of silicone, collagen, gelatin, glycolic acid / lactic acid copolymer, ethylene vinyl acetic acid copolymer, polyurethane, polyethylene, polytetrafluoroethylene, polypropylene, polyacrylate, and polymethacrylate. It may include at least one more selected. Silicone is preferred because it is easy to mold. Examples of biodegradable polymers include collagen, gelatin, α-hydroxycarboxylic acids (eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, etc.), hydroxydicarboxylic acids (eg, malic acid, etc.) and hydroxytricarboxylic acids (eg, , Citric acid, etc.) from one or more selected from the group consisting of polymers, copolymers or mixtures thereof, poly-α-cyanoacrylates, polyamino acids (for example, Poly-γ-benzyl-L-glutamic acid and the like), and polyanhydrides of maleic anhydride copolymers (for example, styrene-maleic acid copolymer and the like). The form of polymerization may be random, block, or graft. When α-hydroxycarboxylic acids, hydroxydicarboxylic acids, and hydroxytricarboxylic acids have an optically active center in the molecule, D-form, L-form, and DL-form Any of these can be used.

本発明の薬学的組成物は、細胞調製に関して当該分野で公知の様式と同様の様式（例えば、混合、溶解など）で製造され得る。 The pharmaceutical compositions of the invention can be manufactured in a manner similar to that known in the art for cell preparation (eg, mixing, lysis, etc.).

本発明の薬学的組成物は、本発明の細胞ワクチンが意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。「予防有効量」、「治療有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果（例えば、予防、治療、再発防止など）を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、治療有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。予防有効量は、予防されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。再発防止有効量は、再発防止するのに十分な量である。所定の適用のための有効量（例えば、治療有効量）を確認する１つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。 The pharmaceutical composition of the present invention includes a composition in which the cellular vaccine of the present invention is contained in an amount effective to achieve the intended purpose. “Prophylactically effective amount”, “therapeutically effective amount” or “pharmacologically effective amount” is a term well recognized by those skilled in the art, and the intended pharmacological result (eg, prevention, treatment, prevention of recurrence, etc.) The amount of drug effective to produce. Accordingly, a therapeutically effective amount is an amount sufficient to reduce symptoms of the disease to be treated. A prophylactically effective amount is an amount sufficient to reduce the symptoms of the disease to be prevented. An effective amount for preventing recurrence is an amount sufficient to prevent recurrence. One useful assay to ascertain an effective amount (eg, a therapeutically effective amount) for a given application is to measure the extent of recovery of the target disease. The amount actually administered will depend on the individual to whom the treatment is to be applied, and is preferably an amount optimized to achieve the desired effect without significant side effects. The determination of an effective dose is well within the ability of those skilled in the art.

いずれのワクチンについても、有効用量は、中和抗体測定、または任意の適切な動物モデルのいずれかにおいて、最初に見積もられ得る。動物モデルはまた、所望の濃度範囲および投与経路を達成するために用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。 For any vaccine, an effective dose can be estimated initially either in neutralizing antibody measurements or in any appropriate animal model. The animal model is also used to achieve a desired concentration range and route of administration. Such information can then be used to determine useful doses and routes for administration in humans.

治療有効量、予防有効量などおよび毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＥＤ_５０、集団の５０％において治療的に有効な用量；およびＬＤ_５０、集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率ＥＤ_５０／ＬＤ_５０として表され得る。大きな治療係数を呈する薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用する細胞の種類等により適宜選択される。Therapeutically effective amount, prophylactically effective amount and the like and toxicity are standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals (eg ED ₅₀ , therapeutically effective dose in 50% of the population; and LD ₅₀ , 50% of the population. The dose that is lethal to). The dose ratio between therapeutic and toxic effects is the therapeutic index, and it can be expressed as ratio ED 50 _/ LD _50. Pharmaceutical compositions that exhibit large therapeutic indices are preferred. Data obtained from cell culture assays and animal experiments are used to formulate a range of quantities for human use. The dosage of such compounds lies preferably within a range of circulating concentrations that include the ED ₅₀ with little or no toxicity. This dose will vary within this range depending on the mode of administration used, the sensitivity of the patient, and the route of administration. As an example, the dose is appropriately selected depending on the age and other patient conditions, the type of disease, the type of cells used, and the like.

ヒトで使用する場合、融合細胞を生産する際に、６×１０^６細胞あたり、少なくとも１００ＨＡＵ相当の、好ましくは少なくとも５００ＨＡＵ相当の、より好ましくは１０００ＨＡＵ相当のウイルスまたはエンベロープベクターが使用され得る。この場合、融合されるべき細胞の比率は、等価が好ましいが、それに限定されず、代表的には、１：１００〜１００：１内の範囲が使用され得る。好ましくは、１：１０〜１０：１内の範囲が使用され、より好ましくは１：３〜３：１内の範囲が使用され得る。さらに好ましくは、１：２〜２：１または約１：１などを採用することもできる。When used in humans, a virus or envelope vector equivalent to at least 100 HAU, preferably at least 500 HAU, more preferably 1000 HAU, can be used per 6 × 10 ⁶ cells when producing fusion cells. In this case, the ratio of cells to be fused is preferably equivalent, but is not limited thereto, and typically a range of 1: 100 to 100: 1 can be used. Preferably, a range within 1:10 to 10: 1 is used, more preferably a range within 1: 3 to 3: 1 may be used. More preferably, 1: 2 to 2: 1, or about 1: 1 can be employed.

本明細書において「ＨＡＵ」とは、ニワトリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をいう。１ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当する（Ｏｋａｄａ，Ｙ．ら、ＢｉｋｅｎＪｏｕｒｎａｌ４，２０９−２１３、１９６１）。上記の量は、例えば、１回から数回に分けて使用することができる。 As used herein, “HAU” refers to the activity of a virus capable of aggregating 0.5% of chicken erythrocytes. 1 HAU corresponds to approximately 24 million virus particles (Okada, Y. et al., Biken Journal 4, 209-213, 1961). The above amount can be used, for example, in one to several times.

正確な用量は、治療されるべき患者を考慮して、個々の臨床医によって選択される。用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度（例えば、腫瘍のサイズおよび位置；患者の年齢、体重、および性別；投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性／応答）が挙げられる。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、持続作用性薬学的組成物は、３〜４日毎に、毎週、または２週間に１回、投与され得る。特定の用量および送達の方法に関するガイダンスは当該分野で公知の文献に提供されている。 The exact dose is chosen by the individual clinician in view of the patient to be treated. Dosage and administration are adjusted to provide sufficient levels of the active moiety or to maintain the desired effect. Additional factors that may be considered include the severity of the disease state (eg, tumor size and location; patient age, weight, and gender; food restriction time and frequency of administration, drug combination, response sensitivity, and resistance to therapy. / Response). Depending on the half-life and clearance rate of the particular formulation, sustained action pharmaceutical compositions can be administered every 3-4 days, weekly, or once every two weeks. Guidance on specific doses and methods of delivery is provided in literature known in the art.

１つの実施形態において、本発明の融合細胞、組成物、キットおよび医薬などは、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。 In one embodiment, the fusion cells, compositions, kits, medicaments, etc. of the present invention can be provided in sustained release form. The sustained-release form can be any form known in the art as long as it can be used in the present invention. As such a form, for example, it may be a preparation such as a rod form (pellet form, cylinder form, needle form, etc.), a tablet form, a disc form, a spherical form, or a sheet form. Methods for preparing sustained release forms are known in the art and are described, for example, in the Japanese Pharmacopeia, the US Pharmacopeia and pharmacopoeia in other countries. Examples of the method for producing a sustained-release agent (sustained administration agent) include a method utilizing dissociation of a drug from a complex, a method of making an aqueous suspension injection, a method of making an oily injection or an oily suspension injection. And an emulsion injection solution (o / w type, w / o type emulsion injection solution, etc.).

本発明の組成物および医薬は、通常は医師の監督のもとで実施されるが、その国の監督官庁および法律が許容する場合は、医師の監督なしに実施することができる。 The compositions and medicaments of the present invention are usually performed under the supervision of a physician, but may be practiced without the supervision of a physician if the national supervisory authority and law permit.

本発明に係るワクチンは、種々のアジュバントを含む乳濁液としてもよい。アジュバントの例としては、フロイントのアジュバント（完全または不完全）、アジュバント６５（落下生油、マンナイドモノオレエートおよびアルミニウムモノステアレートを含む）、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはミョウバンなどの鉱物ゲル、オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ）などが挙げられる。 The vaccine according to the present invention may be an emulsion containing various adjuvants. Examples of adjuvants include Freund's adjuvant (complete or incomplete), adjuvant 65 (including falling raw oil, mannide monooleate and aluminum monostearate), and minerals such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate or alum Examples thereof include gels and oligonucleotides (CpG).

アジュバントを加える実施携帯において本発明に係るワクチンには、上記アジュバントの他に例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を含有させてもよい。 In addition to the above adjuvant, the vaccine according to the present invention in which the adjuvant is added includes, for example, diluents, fragrances, preservatives, excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers, etc. One or two or more pharmaceutical additives selected from the above may be contained.

本発明の薬学的組成物および医薬の投与は、経口または非経口により達成される。非経口送達の方法としては、局所、動脈内（例えば、頚動脈を介する）、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内の投与が挙げられる。本発明は、処置部位に到達する経路であれば、どのような経路でもよい。本発明に係るワクチンの投与経路は、特に限定されないが、非経口的に投与することが好ましい。例示されるべき非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。 Administration of the pharmaceutical compositions and medicaments of the present invention is accomplished orally or parenterally. Parenteral delivery methods include topical, intraarterial (eg, via the carotid artery), intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal, or intranasal administration. It is done. The present invention may be any route as long as it reaches the treatment site. The administration route of the vaccine according to the present invention is not particularly limited, but is preferably administered parenterally. Parenteral administration to be exemplified includes, for example, intravenous, intraarterial, subcutaneous, intradermal, intramuscular or intraperitoneal administration.

本発明に係るワクチンの１回の投与量は、投与の目的により、また感染が初感染か再感染かにより、さらに患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。再感染により惹起される疾患の治療を目的とする場合、本発明に係るワクチンの投与量は、体重１ｋｇあたり約０．０１ｎｇ〜１０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１ｎｇ〜１ｍｇ程度であり得る。細胞数で計数する場合、１０^６細胞〜１０^８細胞、好ましくは５×１０^６細胞〜５×１０^７細胞などを挙げることができるが、それらに限定されない。The single dose of the vaccine according to the present invention depends on the purpose of administration, whether the infection is a primary infection or a reinfection, and depending on various conditions such as the age and weight of the patient, symptoms and the severity of the disease. It is possible to select appropriately. For the purpose of treating diseases caused by reinfection, the dose of the vaccine according to the present invention may be about 0.01 ng to 10 mg, more preferably about 0.1 ng to 1 mg, per kg body weight. When counting by the number of cells, 10 ⁶ cells to 10 ⁸ cells, preferably 5 × 10 ⁶ cells to 5 × 10 ⁷ cells and the like can be mentioned, but not limited thereto.

本発明に係るワクチンの投与回数は、上記のような種々の条件により異なるので、一概には言えないが、日単位から週単位の間隔で繰り返して投与するのが好ましい。中でも、約１〜４週間程度の間隔で、数回、好ましくは約１〜２回程度投与するのが好ましい。疾患症候学または抗体価を用いる基本的な検査により疾患の状態をモニターしながら投与回数（投与時間）を決定するのがより好ましい。 Since the number of administrations of the vaccine according to the present invention varies depending on the various conditions as described above, it cannot be generally stated, but it is preferable to administer the vaccine repeatedly at intervals of daily to weekly. Among them, it is preferable to administer several times, preferably about 1-2 times, at an interval of about 1-4 weeks. More preferably, the number of administrations (administration time) is determined while monitoring the disease state by disease symptomatology or basic tests using antibody titers.

（免疫反応性）
本明細書において、融合細胞は、免疫反応性供給細胞を使用する。免疫反応性供給細胞とは、免疫反応性を、宿主に供給することができる任意の細胞をいう。従って、抗原となり得る細胞表面マーカーを有するかまたは有すると予想される任意の細胞が免疫反応性供給細胞の範囲内に入る。そのような細胞表面マーカーは、この場合、抗原である。(Immunoreactivity)
As used herein, fusion cells use immunoreactive donor cells. An immunoreactive donor cell refers to any cell that can supply immunoreactivity to a host. Thus, any cell that has or is expected to have a cell surface marker that can be an antigen falls within the scope of immunoreactive donor cells. Such a cell surface marker is in this case an antigen.

本明細書において細胞表面マーカーは、通常、細胞の表面に存在するか、存在し得るペプチドまたはその改変体もしくは複合体（例えば、糖ペプチド）であることから、Ｔ細胞による特異的認識を惹起することができるアミノ酸配列（例えば、エピトープ）をいい、通常、少なくとも約５アミノ酸、好ましくは少なくとも約８アミノ酸長を有するペプチドであることが多い。このような配列は、Ｔ細胞レセプターによって認識されるものであり、近年研究が進展しており、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ＝ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）による認識によって同定され得る。ＣＴＬには、ＣＤ８陽性およびＣＤ４陽性の少なくとも２種類が知られており、ＣＤ８陽性ＣＴＬは、クラスＩ拘束性に、ＣＤ４陽性ＣＴＬはクラスＩＩ拘束性に抗原ペプチド（例えば、癌抗原としてはＭＡＧＥ、ｇｐ１００、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ＮＹ−ＥＳ０−１が挙げられる）を認識するといわれている。細胞表面マーカーは、例えば、癌細胞に取り込まれる場合、小胞体（ＥＲ）に運ばれ、そこでＨＬＡクラスＩ分子に結合性を示すペプチドはクラスＩ分子と複合体を形成する。この複合体は、細胞表面に表出するといわれている。クラスＩ分子との結合において、重要であるとされる部位は、このペプチド中の２番目のアミノ酸と、９番目（場合により８番目または１０番目であり得る）のアミノ酸である。ここで、２番目のアミノ酸は、ＨＬＡの型に依存する。例えば、ＨＬＡ−Ａ２４の場合は、２番目のアミノ酸は、チロシン（Ｙ）またはフェニルアラニン（Ｆ）であることが多く、ＨＬＡ−Ａ２の場合はロイシン（Ｌ）である。この特徴的な配列は、ＨＬＡの型に応じて適宜決定することができる。また、９番目（または８番目もしくは１０番目）のアミノ酸は、ＨＬＡ−Ａ２４の場合は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）またはフェニルアラニン（Ｆ）であることが多く、ＨＬＡ−Ａ２４の場合は、ロイシン（Ｌ）またはバリン（Ｖ）である。このように細胞表面マーカーは、目的とする患者のＨＬＡ型に依存して変動し得る。このような細胞表面マーカーは、いったん複合体を形成すると、ＣＴＬのＴ細胞レセプターにより認識され、Ｔ細胞による分解の発端となる。 In the present specification, the cell surface marker is usually a peptide present on the surface of a cell, or a peptide or a variant or complex thereof (for example, glycopeptide), and thus causes specific recognition by T cells. An amino acid sequence that can be (eg, an epitope), usually a peptide having a length of at least about 5 amino acids, preferably at least about 8 amino acids. Such sequences are recognized by T cell receptors, and research has been progressing in recent years, and can be identified by recognition by CD8 positive cytotoxic T cells (CTL = cytotoxic T-lymphocytes). There are at least two types of CTLs known as CD8 positive and CD4 positive. CD8 positive CTL is class I-restricted and CD4 positive CTL is class II-restricted antigen peptide (for example, MAGE, gp100, Tyrosinase, NY-ES0-1). For example, when cell surface markers are taken up by cancer cells, they are transported to the endoplasmic reticulum (ER), where peptides that bind to HLA class I molecules form complexes with class I molecules. This complex is said to be expressed on the cell surface. The sites considered important for binding to class I molecules are the second amino acid and the ninth (possibly eighth or tenth) amino acid in the peptide. Here, the second amino acid depends on the type of HLA. For example, in the case of HLA-A24, the second amino acid is often tyrosine (Y) or phenylalanine (F), and in the case of HLA-A2, it is leucine (L). This characteristic sequence can be appropriately determined depending on the type of HLA. In the case of HLA-A24, the ninth (or eighth or tenth) amino acid is often leucine (L), isoleucine (I) or phenylalanine (F), and in the case of HLA-A24, Leucine (L) or valine (V). Thus, cell surface markers can vary depending on the HLA type of the intended patient. Such cell surface markers, once formed into a complex, are recognized by the CTL T cell receptor and are the origin of degradation by T cells.

本明細書では、細胞表面マーカーは、同定されていることが好ましいが、同定されていなくてもよい。同定されていなくても、別の方法で、融合細胞であることが確認できれば、そのような融合細胞は、治療効果または予防効果を発揮することが本発明により確認されたからである。特に、癌細胞の場合、腫瘍特異的マーカーが同定されてなくても、治療効果を達成することができたことから、本発明の有用性は高いといえる。 As used herein, cell surface markers are preferably identified, but need not be identified. Even if not identified, if the fusion cell can be confirmed by another method, it is confirmed by the present invention that such a fusion cell exhibits a therapeutic effect or a preventive effect. In particular, in the case of cancer cells, it can be said that the present invention is highly useful because a therapeutic effect can be achieved even if a tumor-specific marker has not been identified.

このような細胞表面マーカーは、当該分野において公知の方法を用いて同定することができる。そのような方法としては、例えば、ｃＤＮＡ発現クローニング法、ＳＥＲＥＸ法などが挙げられるがそれらに限定されない。癌細胞の細胞表面マーカーを同定する場合は、例えば、癌細胞から調製してきたｃＤＮＡライブラリー由来のサンプルをＣＯＳ−７細胞にＨＬＡｃＤＮＡとともに一過的に発現させ、その発現が最大となる２日目に癌特異的ＣＴＬと混合培養を一晩行い、上清中のインターフェロンγ量を例えばＥＬＩＳＡなどの測定法によって測定することによって同定することができる。ここで陽性プールをスクリーニングすることによって細胞表面マーカーを有するクローンを同定し、それによりそのコード配列をも同定することができる。 Such cell surface markers can be identified using methods known in the art. Examples of such methods include, but are not limited to, cDNA expression cloning method and SEREX method. When identifying cell surface markers of cancer cells, for example, a sample derived from a cDNA library prepared from cancer cells is transiently expressed in COS-7 cells together with HLA cDNA, and the expression is maximized for 2 days. Eyes can be identified by performing mixed culture with cancer-specific CTL overnight and measuring the amount of interferon γ in the supernatant by a measuring method such as ELISA. Here, a positive pool can be screened to identify a clone having a cell surface marker, thereby identifying its coding sequence.

ＳＥＲＥＸ法では、患者の血清中に存在するＩｇＧ抗体を利用してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。この方法では、標的細胞（例えば、癌細胞）由来のファージライブラリーを大腸菌に発現させ、大腸菌の産生するタンパク質をフィルターに転写し、患者血清とハイブリダイズさせ、抗ＩｇＧ抗体で検出して抗体と反応したプラークから目的の遺伝子をクローニングすることができる。 In the SEREX method, a cDNA library is screened using IgG antibodies present in the serum of a patient. In this method, a phage library derived from a target cell (for example, a cancer cell) is expressed in E. coli, the protein produced by E. coli is transferred to a filter, hybridized with patient serum, and detected with an anti-IgG antibody. The gene of interest can be cloned from the reacted plaque.

メラノーマ、肺癌等の癌細胞に関する細胞上の細胞表面マーカーの同定については、（１）病原体（腫瘍を含む）を認識するＴ細胞（腫瘍反応性Ｔ細胞）を用いる方法と、（２）（腫瘍を含む）抗原の候補となる分子に対するＴ細胞を誘導する方法に大別される。しかし、現在のところ、このように同定されたキラーＴ細胞認識エピトープで免疫しても生体内では有効にキラーＴ細胞を誘導するには至っていない。その原因として、これらのエピトープで免疫しても、キラーＴ細胞を誘導するための必須の課程である、細胞内酵素であるプロテアーゼによるそれらのエピトープ抗原の処理が起こらないからである。 For identification of cell surface markers on cells related to cancer cells such as melanoma and lung cancer, (1) a method using T cells (tumor reactive T cells) recognizing pathogens (including tumors), and (2) (tumor And a method for inducing T cells against a molecule that is a candidate for an antigen. However, at present, even when immunized with the killer T cell recognition epitope thus identified, killer T cells have not been effectively induced in vivo. This is because even when immunized with these epitopes, treatment of those epitope antigens by protease, an intracellular enzyme, which is an essential process for inducing killer T cells, does not occur.

本明細書において「癌抗原」とは、正常細胞が癌化するに伴って新たに発現するようになる抗原分子をいう。そのような癌抗原としては、例えば、以下のようなものが挙げられるがそれらに限定されない：
（１）癌ウイルス由来抗原（例えば、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡ型腫瘍ウイルスに由来するＴ抗原など）。ヒト、マウスのＲＮＡ型腫瘍ウイルスでは、ウイルスのエンベロープタンパク質が細胞表面に発現される。；
（２）癌特異移植抗原（ｔｕｍｏｒｓｐｅｃｉｆｉｃｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ，ＴＳＴＡ）；この抗原は、同系の癌細胞に対して特異的免疫応答が成立する結果、その癌細胞が拒絶される場合、その標的抗原となるものが該当する。遺伝子変異により、癌細胞内に変異タンパク質が作られると、他の細胞内正常タンパク質と同様に、ペプチド断片として細胞内で、主要組織適合抗原遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子と会合し癌細胞表面に発現されるようになる。；
（３）癌関連抗原（ｔｕｍｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ＝ＴＡＡ）。癌細胞に必ずしも特異的でないが，癌化に伴って特徴的な発現を示す抗原。例えば、肝癌におけるα−フェトプロテイン、腸癌などにおける胎児性癌抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ＝ＣＥＡ）などが該当する。これらは、元来は正常の胎児だけに存在するタンパク質であり、成人の組織には認められない。しかし、これらのタンパク質は、癌化に伴って再発現を示すので癌胎児抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌａｎｔｉｇｅｎ）と呼ばれる。As used herein, “cancer antigen” refers to an antigen molecule that is newly expressed as normal cells become cancerous. Such cancer antigens include, but are not limited to, for example:
(1) Cancer virus-derived antigens (for example, T antigens derived from DNA-type tumor viruses such as adenovirus, polyoma virus, SV40, etc.). In human and mouse RNA-type tumor viruses, viral envelope proteins are expressed on the cell surface. ;
(2) Cancer-specific transplantation antigen (TSTA); this antigen becomes a target antigen when a cancer cell is rejected as a result of the establishment of a specific immune response against a syngeneic cancer cell The thing corresponds. When a mutant protein is produced in a cancer cell by gene mutation, it is associated with a major histocompatibility gene complex (MHC) molecule in the cell as a peptide fragment in the same manner as other normal intracellular proteins. To be expressed. ;
(3) Cancer-associated antigen (TAA). An antigen that is not necessarily specific for cancer cells, but shows characteristic expression with canceration. For example, α-fetoprotein in liver cancer, fetal cancer antigen (carcinoembryonic antigen = CEA) in intestinal cancer, and the like are applicable. These are proteins that originally exist only in normal fetuses and are not found in adult tissues. However, these proteins are called oncofetal antigens because they re-express with canceration.

本明細書において使用される場合、癌抗原としては、どのような形態のものであっても用いることができるが、特に、癌関連抗原と呼ばれる形態のものが好ましく用いられる。ＭＨＣとの会合によって、癌細胞の表面に発現されるようになるからである。 As used herein, the cancer antigen can be used in any form, but in particular, a form called a cancer-associated antigen is preferably used. This is because it is expressed on the surface of cancer cells by association with MHC.

代表的な細胞表面マーカーとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない。以下の表では、１文字表示を採用する。

Exemplary cell surface markers include, but are not limited to, the following. In the following table, a one-character display is adopted.

他に列挙すべき細胞表面マーカー、腫瘍特異的マーカーなどの例示としては、例えば、表Ｂに示されるオンコジーン産物、胚性タンパク質、ウイルスタンパク質、組織特異的抗原、変異した腫瘍サプレッサータンパク質およびイディオタイプエピトープなどが挙げられる。

Other examples of cell surface markers to be listed, tumor specific markers, etc. include, for example, oncogene products, embryonic proteins, viral proteins, tissue specific antigens, mutated tumor suppressor proteins and idiotype epitopes shown in Table B. Etc.

これらのマーカーは、抗体によって同定され得る。これらの多くは、その遺伝子配列が既知であることから、ＰＣＲなどによって増幅することが容易である。 These markers can be identified by antibodies. Many of these are easy to amplify by PCR or the like because their gene sequences are known.

（治療・予防）
本明細書において「予防」（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）とは、ある疾患または障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状態が起こらないように処置することをいう。(Treatment / prevention)
As used herein, “prophylaxis” or “prevention” refers to treating a disease or disorder so that such a condition does not occur before such a condition is triggered.

本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。 As used herein, “treatment” refers to preventing a disease or disorder from deteriorating, preferably maintaining the status quo, more preferably reducing, when a certain disease or disorder becomes such a condition. Preferably, it means that it is reduced.

本明細書において「再発防止」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった後、回復または治癒した後、再度発症することを防止するための手段をいう。 As used herein, “prevention of recurrence” refers to a means for preventing a disease or disorder from developing again after becoming such a condition, recovered or cured.

このような治療活性または予防活性は、本発明のワクチンについて判定されるとき、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、そして次いでインビボで試験される。例えば、本発明の遺伝子ワクチンの、治療有用性または予防有用性を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織試料に対するワクチンの特異的結合の効果が挙げられる。そのような試験は、当業者に公知である技術（例えば、ＥＬＩＳＡなどの免疫学的アッセイ）を利用して決定され得る。インビボ試験としては、例えば、中和抗体を惹起する能力があるかどうかを試験する方法が挙げられるがそれらに限定されない。 Such therapeutic or prophylactic activity is preferably tested in vitro prior to use in humans and then in vivo as determined for the vaccines of the invention. For example, in vitro assays to demonstrate the therapeutic or prophylactic utility of the genetic vaccines of the present invention include the effect of specific binding of the vaccine to cell lines or patient tissue samples. Such tests can be determined utilizing techniques known to those skilled in the art (eg, immunological assays such as ELISA). In vivo tests include, but are not limited to, methods that test for the ability to elicit neutralizing antibodies, for example.

本明細書において「患者」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「被検体」または「被験体」ともいわれる。患者は好ましくは、ヒトであり得る。 As used herein, “patient” refers to an organism to which the treatment of the present invention is applied, and is also referred to as “subject” or “subject”. The patient may preferably be a human.

本発明は、患者への有効量の本発明の遺伝子ワクチンの投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、本発明の遺伝子ワクチンは実質的に精製されたものであり得る（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない状態が挙げられる）。 The present invention provides methods of treatment, inhibition and prevention by administration of an effective amount of the gene vaccine of the present invention to a patient. In a preferred aspect, the genetic vaccines of the present invention can be substantially purified (eg, include a condition that is substantially free of substances that limit its effectiveness or cause undesirable side effects).

本発明が対象とする動物は、免疫系または類似の系を有するものであれば、どの生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）であり、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得る。例示的な患者としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）が対象とされる。最も好ましくはヒトが対象とされる。 The animal targeted by the present invention may be any organism (eg, animal (eg, vertebrate, invertebrate)) as long as it has an immune system or a similar system. Preferably, it is a vertebrate (for example, larvae, lampreys, cartilaginous fish, teleosts, amphibians, reptiles, birds, mammals, etc.), more preferably mammals (for example, single holes, marsupials, Rodents, crustaceans, wings, carnivores, carnivores, long noses, odd hoofs, even hoofs, rodents, scales, sea cattle, cetaceans, primates, rodents , Rabbit eyes, etc.). Exemplary patients include, but are not limited to, animals such as cows, pigs, horses, chickens, cats, dogs and the like. More preferably, primates (eg, chimpanzees, Japanese monkeys, humans) are targeted. Most preferably, humans are targeted.

予防および治療に関して様々な送達系が公知であり、本発明では任意の投与経路が企図される。本発明の組成物などを投与するために用いられ得る技術としては、例えば、水溶液、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなどが挙げられる。従って、本発明のワクチンは、経口的または非経口的に投与され得る。そのような投与方法としては、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与（鼻腔内、膣内、気道下、口腔内、直腸粘膜および腸粘膜など）、患部への局所投与、皮膚投与など）が挙げられる。全身投与されるとき、本発明において使用されるワクチンは、発熱物質を含まないことが好ましい。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。導入方法としては、経口剤としての投与、吸入（例えば、肺）、シリンジ、カテーテル、チューブを用いた注入、針無し注射、遺伝子銃などが挙げられるがそれらに限定されない。この場合、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。 Various delivery systems are known for prevention and treatment, and any route of administration is contemplated by the present invention. Examples of techniques that can be used to administer the composition of the present invention include aqueous solutions, liposomes, microparticles, and microcapsules. Therefore, the vaccine of the present invention can be administered orally or parenterally. Such administration methods include oral administration, parenteral administration (eg, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, mucosal administration (intranasal, intravaginal, sub-respiratory, buccal, rectal mucosa and Intestinal mucosa), topical administration to the affected area, and skin administration). When administered systemically, the vaccine used in the present invention preferably does not contain pyrogens. Such a pharmaceutically acceptable composition can be easily prepared by those skilled in the art by considering pH, isotonicity, stability and the like. Formulations for such administration can be provided in any dosage form. Examples of such a pharmaceutical form include a liquid, an injection, and a sustained release agent. Examples of the introduction method include, but are not limited to, administration as an oral agent, inhalation (for example, lung), injection using a syringe, catheter, tube, needleless injection, gene gun, and the like. In this case, it can be administered together with other biologically active agents.

本発明の予防方法において使用されるワクチンの量は、使用目的、対象疾患（種類など）、患者の年齢、体重、既往歴などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を患者（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、既往歴、および経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与、あるいは毎年流行前に１回の頻度などが挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましく、少なくとも約１週間の間隔をあけて追加免疫をすることが有利である。より好ましくは、追加免疫の間隔は少なくとも約３週間であり得る。本発明のワクチンなどの投与量は、患者の年齢、体重、症状または投与方法などにより異なり、特に限定されない。 The amount of the vaccine used in the prevention method of the present invention can be easily determined by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, target disease (type, etc.), patient age, weight, medical history, and the like. The frequency with which the treatment method of the present invention is applied to a patient (or patient) also takes into account the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.), the patient's age, weight, medical history, course, etc. A person skilled in the art can easily determine. Examples of the frequency include administration every day to once every several months (for example, once a week to once a month), or once every year before the epidemic. It is preferable to administer once a week to once a month while monitoring the course, and it is advantageous to boost immunization at intervals of at least about 1 week. More preferably, the booster interval may be at least about 3 weeks. The dosage of the vaccine of the present invention varies depending on the age, body weight, symptoms or administration method of the patient and is not particularly limited.

本発明におけるワクチンの投与は、どのような手法を用いて行ってもよいが、好ましくは、針無し注射を用いることが有利である。患者に過度の負担を与えることなく投与を行えるからである。 Administration of the vaccine in the present invention may be performed by any method, but it is advantageous to use needleless injection. This is because administration can be performed without undue burden on the patient.

ここで本発明における針無注射器とは、注射針を用いずに、ガス圧または弾性部材の弾力によりピストンを移動させて薬液を皮膚に噴射し、薬剤成分を皮下、より好ましくは皮下の細胞内に投与する医療機器を意味する。 Here, the needleless syringe in the present invention means that the drug component is injected subcutaneously, more preferably subcutaneously, into the skin by moving the piston by the gas pressure or the elasticity of the elastic member without spraying the needle, and spraying the drug solution onto the skin. Means a medical device to be administered.

具体的には例えば、シマジェット^ＴＭ（島津製作所製）、メディ・ジェクタービジョン（Ｍｅｄｉ−ＪｅｃｔｏｒＶｉｓｉｏｎ）^ＴＭ、（Ｅｌｉｔｅｍｅｄｉｃａｌ社製）、ペンジェット（ＰｅｎＪｅｔ）^ＴＭ（ＰｅｎＪｅｔ社製）などが市販されている。このような針無し注射については、

などを参照することができる。Specifically, for example, SHIMAJET ^TM (manufactured by Shimadzu Corporation), Medi-Jector Vision ^TM (manufactured by Elitemedical), PenJet ^TM (manufactured by PenJet) and the like are commercially available. . For such needleless injections,

Etc. can be referred to.

なお遺伝子銃（パーティクルガン）とは、ＤＮＡを被覆した金やタングステン等の高密度粒子をヘリウム等のガス圧を利用して加速し、ｉｎｖｉｖｏ遺伝子導入が可能な医療／実験機器である。遺伝子銃の利点は、少量のＤＮＡでも効率良く細胞導入できることと、異なる操作者でも安定した結果が得られることである。
具体的には、例えば米国Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のＨｅｌｉｏｓＧｅｎｅＧｕｎなどが市販されており、利用することができる。（下記、参照）

または

The gene gun (particle gun) is a medical / experimental device capable of in vivo gene introduction by accelerating high-density particles such as gold or tungsten coated with DNA using a gas pressure such as helium. The advantage of the gene gun is that cells can be introduced efficiently even with a small amount of DNA, and that stable results can be obtained even by different operators.
Specifically, for example, HeliosGene Gun manufactured by Bio-Rad, Inc. in the US is commercially available and can be used. (See below)

Or

本発明の方法による予防処置の終了の判断は、市販のアッセイもしくは機器使用によって惹起される抗体を確認することによって行うことができる。 The end of the preventive treatment according to the method of the present invention can be determined by confirming antibodies elicited by a commercially available assay or instrument use.

本発明はまた、本発明のワクチンを含む容器を備える薬学的パッケージまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。 The present invention also provides a pharmaceutical package or kit comprising a container comprising the vaccine of the present invention. A notice of the form prescribed by a government agency that regulates the manufacture, use or sale of a pharmaceutical or biological product may optionally be attached to such containers, which may be made, used or sold for administration to humans. Represents approval by government agencies.

（サイトカイン、増殖因子、細胞生理活性物質類）
本明細書において「細胞生理活性物質」または「生理活性物質」（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｓｕｂｓｔａｎｃｅ）とは、細胞または組織に作用する物質をいう。そのような作用としては、例えば、その細胞または組織の制御、変化などが挙げられるがそれに限定されない。生理活性物質には、サイトカインおよび増殖因子が含まれる。生理活性物質は、天然に存在するものであっても、合成されたものでもよい。好ましくは、生理活性物質は、細胞が産生するものまたはそれと同様の作用を有するものであるが改変された作用を持つものであってもよい。本明細書では、生理活性物質は、ワクチン接種によって惹起されることから、ワクチン接種の効果の指標として用いられるほか、ワクチン接種とともに、ワクチンの予防または治療の効果を増強するためにも用いられ得る。(Cytokine, growth factor, cell biologically active substances)
As used herein, “cell physiologically active substance” or “physiologically active substance” refers to a substance that acts on cells or tissues. Examples of such action include, but are not limited to, control and change of the cell or tissue. Bioactive substances include cytokines and growth factors. The physiologically active substance may be naturally occurring or synthesized. Preferably, the physiologically active substance may be one produced by a cell or one having a similar action, but one having a modified action. In the present specification, since the physiologically active substance is caused by vaccination, it can be used as an index of the effect of vaccination and can be used together with vaccination to enhance the effect of vaccine prevention or treatment. .

本明細書において使用される「サイトカイン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制禦作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用などを有する。 As used herein, “cytokine” is defined in the same manner as the broadest meaning used in the art, and refers to a physiologically active substance produced from a cell and acting on the same or different cells. Cytokines are generally proteins or polypeptides, and have a suppressive action on the immune response, regulation of the endocrine system, regulation of the nervous system, antitumor action, antiviral action, regulation of cell proliferation, regulation of cell differentiation, etc. .

本明細書において用いられる「増殖因子」または「細胞増殖因子」とは、本明細書では互換的に用いられ、細胞の増殖を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。 As used herein, “growth factor” or “cell growth factor” is used interchangeably herein and refers to a substance that promotes or regulates cell growth. Growth factors are also referred to as growth factors or growth factors. Growth factors can be added to the medium in cell or tissue culture to replace the action of serum macromolecules. Many growth factors have been found to function as regulators of the differentiation state in addition to cell growth.

サイトカインには、代表的には、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦαなど）、インターフェロン類（例えば、インターフェロンγ）が含まれる。増殖因子としては、代表的には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような増殖活性を有するものが挙げられる。 Cytokines typically include interleukins, chemokines, hematopoietic factors such as colony stimulating factor, tumor necrosis factor (such as TNFα), and interferons (eg, interferon γ). Typical growth factors include platelet-derived growth factor (PDGF), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial growth factor (VEGF). Those having a proliferative activity such as

本発明における好ましい例示的サイトカインとしては、限定されないが、特に、免疫細胞の分化、増殖および活性化を誘導することができるものが使用され、例えば、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン６、インターロイキン７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ等の成長因子（ＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）等が挙げられるが、これらに限定されない。 Preferred exemplary cytokines in the present invention include, but are not limited to, those that can induce differentiation, proliferation and activation of immune cells, such as interleukin 1, interleukin 2, interleukin 4, Growth of interleukin 6, interleukin 7, IL-12, IL-15, IL-18, interferon α, interferon β, interferon γ, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), HGF, VEGF, FGF, etc. Examples include, but are not limited to, factor (GF), tumor necrosis factor (TNF), tumor necrosis factor α (TNF-α), tumor necrosis factor β (TNF-β), and the like.

サイトカインおよび増殖因子などの生理活性物質は一般に、機能重複現象（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）があることから、他の名称および機能（例えば、細胞殺傷能力、シグナル伝達能力など）で知られるサイトカインまたは増殖因子であっても、本発明に使用される生理活性物質の活性を有する限り、本発明において使用され得る。また、サイトカインまたは増殖因子は、補助的に使用される場合、本明細書における好ましい活性（例えば、所望の病原体を殺傷する能力）を有してさえいれば、本発明のワクチンまたは医薬の好ましい実施形態において使用することができる。 Physiologically active substances such as cytokines and growth factors are generally cytokines or growth factors known by other names and functions (eg, cell killing ability, signal transduction ability, etc.) due to redundancies. However, as long as it has the activity of the physiologically active substance used in the present invention, it can be used in the present invention. In addition, cytokines or growth factors, when used in an adjunct, are preferred implementations of the vaccines or medicaments of the invention provided they have the preferred activity herein (eg, the ability to kill the desired pathogen). Can be used in form.

（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。(Description of Preferred Embodiment)
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. The embodiments provided below are provided for a better understanding of the present invention, and it is understood that the scope of the present invention should not be limited to the following description. Therefore, it is obvious that those skilled in the art can make appropriate modifications within the scope of the present invention with reference to the description in the present specification.

（融合細胞）
１つの局面において、本発明は、抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞との融合細胞を提供する。この融合細胞は、ウイルスまたはその一部で融合されており、従来のＰＥＧ、エレクトロポレーションなどの技術のみを用いた場合とは、融合効率が高い（例えば、１０％以上、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは２５％以上）、再現性が良い、細胞毒性が低いなどという点で明確に異なる。(Fusion cell)
In one aspect, the present invention provides a fusion cell of an antigen presenting cell and at least one immunoreactive donor cell. This fused cell is fused with a virus or a part thereof, and has a higher fusion efficiency (for example, 10% or more, preferably 20% or more) compared to the case where only conventional techniques such as PEG and electroporation are used. And more preferably 25% or more), which is clearly different in terms of good reproducibility and low cytotoxicity.

ここで、使用される抗原提示細胞および免疫反応性供給細胞は、融合され得る限り、任意の細胞を用いることができる。 Here, any cells can be used as the antigen-presenting cells and immunoreactive donor cells as long as they can be fused.

本発明において使用される免疫反応性供給細胞は、免疫反応性を、投与されるべき宿主に対して与えることができる限り、どのような細胞でも使用することができる。そのような免疫反応性供給細胞としては、例えば、正常細胞、癌細胞、異種細胞、自己細胞などを挙げることができるがそれらに限定されない。正常細胞が使用されるときは、通常、ハイブリドーマの代用としての利用が企図される。癌細胞、異種細胞などが使用されるときは、それらに起因する疾患の予防または処置のために利用することが企図される。自己細胞を使用する場合は、例えば、自己免疫疾患（例えば、アレルギーなど）の治療に応用することも可能である。 The immunoreactive donor cell used in the present invention can be any cell as long as it can confer immunoreactivity to the host to be administered. Examples of such immunoreactive supply cells include, but are not limited to, normal cells, cancer cells, heterologous cells, and autologous cells. When normal cells are used, they are usually intended for use as a hybridoma substitute. When cancer cells, heterologous cells, and the like are used, they are intended for use in preventing or treating diseases caused by them. When using autologous cells, for example, it can be applied to the treatment of autoimmune diseases (for example, allergies).

好ましい実施形態では、本発明において使用される免疫反応性供給細胞は、癌細胞である。癌細胞としては、融合される限り、どのような細胞でも使用され、例えば、メラノーマ細胞、肺癌、胃癌、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺癌、リンパ腫、肉腫、肝癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、胸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、大腸癌（結腸直腸癌）、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、膀胱癌、子宮頸部癌、皮膚癌、乳癌、食道癌、腎腫、脳腫瘍、舌癌、肉腫、中皮腫などの細胞などを挙げることができる。本発明の融合細胞は、従来のワクチンでは、特定されることが必要であった腫瘍マーカーを特定する必要なしに、癌を処置または予防することができるようになったという効果を奏する。 In a preferred embodiment, the immunoreactive donor cell used in the present invention is a cancer cell. Any cell can be used as long as it is fused, such as melanoma cells, lung cancer, stomach cancer, adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, adenosquamous cell carcinoma, thymic cancer, lymphoma, sarcoma, liver cancer, non-Hodgkin Lymphoma, Hodgkin lymphoma, leukemia, uterine cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, colon cancer (colorectal cancer), multiple myeloma, neuroblastoma, bladder cancer, cervical cancer, skin cancer And cells such as breast cancer, esophageal cancer, nephroma, brain tumor, tongue cancer, sarcoma, and mesothelioma. The fusion cell of the present invention has an effect that cancer can be treated or prevented without the need to specify a tumor marker that had to be specified in the conventional vaccine.

本発明の融合細胞は、ウイルスまたはその一部によって融合される。このような融合細胞は、融合されるべき細胞（例えば、１種以上の抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）および１種以上の免疫反応性供給細胞（例えば、癌細胞））を提供して、ウイルスまたはその一部（例えば、エンベロープ）と混合することによって、作製することができる。 The fused cell of the present invention is fused by a virus or a part thereof. Such fused cells provide cells to be fused (eg, one or more antigen presenting cells (eg, dendritic cells) and one or more immunoreactive donor cells (eg, cancer cells)). Can be made by mixing with a virus or part thereof (eg, an envelope).

好ましい実施形態では、融合細胞を作製するときに使用されるウイルスは、不活化ウイルスである。不活化することによって、治療または予防の際に、安全なワクチンを提供することができるからである。不活化ウイルスは、通常、複製能を有しない。従って、ウイルスが不活化したかどうかは、複製能を調べることによって確認することができる。 In a preferred embodiment, the virus used when making the fused cell is an inactivated virus. This is because inactivation can provide a safe vaccine during treatment or prevention. Inactivated viruses usually do not have replication capacity. Therefore, whether or not the virus has been inactivated can be confirmed by examining the replication ability.

好ましい実施形態では、上記ウイルスの不活化は、アルキル化剤または紫外線照射によってなされる。本発明において使用されるアルキル化剤としては、任意のアルキル化剤を使用することができる。本発明において使用され得る好ましいアルキル化剤としては、β−プロピオラクトン、ブチロラクトン、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化プロピル、臭化メチル、臭化エチル、臭化プロピル、ジメチル硫酸、ジエチル硫酸などが挙げられるがそれらに限定されない。 In a preferred embodiment, the virus is inactivated by an alkylating agent or UV irradiation. Any alkylating agent can be used as the alkylating agent used in the present invention. Preferred alkylating agents that can be used in the present invention include β-propiolactone, butyrolactone, methyl iodide, ethyl iodide, propyl iodide, methyl bromide, ethyl bromide, propyl bromide, dimethyl sulfate, diethyl sulfate. However, it is not limited to them.

本発明の融合細胞のために使用される免疫反応性供給細胞は、不活化されていることが好ましい。免疫反応性供給細胞は、通常、病原性を持つ細胞が使用されることから、そのような病原性が不活化されていることがワクチン投与のために望ましいからである。そのような不活化には、どのような手段を用いても良く、通常、病原性を消失させる手段（例えば、γ線照射、Ｘ線照射など）であれば、どのようなものでも使用することができる。好ましくは、免疫反応性供給細胞としては、Ｘ線照射を受けた細胞が使用される。 The immunoreactive donor cell used for the fusion cell of the present invention is preferably inactivated. This is because immunoreactive donor cells are usually cells that have pathogenicity, and it is desirable for vaccine administration that such pathogenicity is inactivated. Any means may be used for such inactivation, and usually any means that eliminates pathogenicity (for example, γ-ray irradiation, X-ray irradiation, etc.) should be used. Can do. Preferably, cells that have been subjected to X-ray irradiation are used as immunoreactive donor cells.

好ましい実施形態では、抗原提示細胞は、投与されるべき宿主の自己細胞であることが好ましい。免疫拒絶反応が生じないからであり、その宿主中で抗原を提示する能力が通常保持されるからである。ただし、抗原を提示することができ、免疫拒絶反応が生じない限り、どのような抗原提示細胞でも用いることができることが理解されるべきである。あるいは、免疫拒絶反応が生じないような処置を施すことによっても、同様の効果を生じることができる。 In preferred embodiments, the antigen presenting cells are preferably host autologous cells to be administered. This is because immune rejection does not occur, and the ability to present an antigen in the host is usually retained. However, it should be understood that any antigen-presenting cell can be used as long as it can present an antigen and no immune rejection occurs. Alternatively, the same effect can be produced by performing a treatment that does not cause immune rejection.

好ましい実施形態では、免疫反応性供給細胞は、自己細胞である。この場合、免疫反応性供給細胞は、癌細胞、自己免疫疾患の原因細胞などであり得る。あるいは、自己の抗体産生のために利用される場合もまた、自己細胞が用いられる。あるいは、免疫反応性供給細胞は、同様の癌であることが知られている場合は、同種異系細胞を用いても良い。免疫反応性供給細胞が細菌などの自己以外の病原体である場合は、異種細胞を用いることになる。 In a preferred embodiment, the immunoreactive donor cell is an autologous cell. In this case, the immunoreactive donor cell can be a cancer cell, a causative cell of an autoimmune disease, and the like. Alternatively, autologous cells are also used when used for autologous antibody production. Alternatively, if the immunoreactive donor cell is known to be a similar cancer, allogeneic cells may be used. If the immunoreactive donor cell is a pathogen other than self, such as a bacterium, heterologous cells will be used.

本発明において用いられる抗原提示細胞としては、例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞またはそれらの前駆細胞であり得るがそれらに限定されない。好ましくは、樹状細胞またはその前駆細胞が融合細胞の原料として用いられる。より好ましくは、樹状細胞が用いられる。抗原提示能に優れていることが知られているからである。 Antigen-presenting cells used in the present invention can be, for example, dendritic cells, B cells, macrophage cells, or precursor cells thereof, but are not limited thereto. Preferably, dendritic cells or progenitor cells thereof are used as a raw material for fused cells. More preferably, dendritic cells are used. This is because it is known that the antigen presenting ability is excellent.

本発明において用いられる免疫反応性供給細胞としては、例えば、腫瘍特異的抗原を提示するかまたはその能力を有する細胞が用いられ得るがそれに限定されない。腫瘍特異的抗原は、公知のものであっても未知のものであってもよく、同定されていないものであってもよい。 Examples of the immunoreactive donor cell used in the present invention include, but are not limited to, cells that present or have a tumor-specific antigen. Tumor-specific antigens may be known or unknown and may be unidentified.

本発明の融合細胞は、融合前の細胞の特徴を有することが好ましい。そのような特徴の代表例としては、例えば、細胞表面マーカーの存在が挙げられるがそれらに限定されない。細胞の特徴としては、例えば、抗原提示細胞であれば、抗原提示能などが挙げられる。あるいは、免疫反応性供給細胞であれば、そのような免疫反応性の供給能力が挙げられるがそれらに限定されない。そのような免疫反応性の供給能力は、細胞表面マーカー（特に、病原性に関連する）の提示であり得る。 The fused cell of the present invention preferably has the characteristics of the cell before fusion. Representative examples of such features include, but are not limited to, the presence of cell surface markers. Examples of the characteristics of the cells include antigen-presenting ability in the case of antigen-presenting cells. Alternatively, the immunoreactive supply cells include, but are not limited to, such immunoreactive supply capability. Such immunoreactive delivery ability may be the presentation of cell surface markers, particularly those associated with virulence.

従って、好ましい実施形態では、本発明の融合細胞は、抗原提示細胞の細胞表面マーカーを有する。そのような細胞表面マーカーとしては、例えば、抗原提示細胞に由来する、ＣＤ１、ＣＤ１１ｃ（インテグリンαＸ）、ＣＤ４０、ＣＤ５８（ＬＦＡ−３）、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１２３（抗ＩＬ−３Ｒａ）、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ１４８、ＣＤ１５７，ＣＤ８０、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩなどを挙げることができるがそれらに限定されない。好ましくは、ＣＤ１１ｃが使用される。樹状細胞に特異的であるからである。このような細胞表面マーカーは、少なくとも１つを同定することで十分であるが、好ましくは複数のマーカーで同定しても良い。マーカーの同定には、蛍光発色セルソーター（ＦＡＣＳ）、磁気ビーズなどを用いることができる。このような、細胞表面マーカーの陰性、弱陽性、陽性および強陽性は、好ましくはＦＡＣＳまたは磁気ビーズを用いた技術において採用される発現強度に基づき得る。ＦＡＣＳまたは磁気ビーズは、当該分野において周知の技法に基づき、本明細書において例示されるような手順を用いて行うことができる。したがって、陽性の程度を感度よく判断することができる因子が好ましく、そのような因子としては、たとえば、特異性が高いモノクローナル抗体、特異的リガンドまたはその改変体もしくはフラグメントなどが挙げられるがそれらに限定されない。 Therefore, in a preferred embodiment, the fusion cell of the present invention has a cell surface marker of an antigen presenting cell. Examples of such cell surface markers include CD1, CD11c (integrin αX), CD40, CD58 (LFA-3), CD86, HLA-DR, CD123 (anti-IL-3Ra), CD21, which are derived from antigen-presenting cells. , CD23, CD148, CD157, CD80, MHC class I, and MHC class II, but are not limited thereto. Preferably, CD11c is used. This is because it is specific to dendritic cells. It is sufficient to identify at least one such cell surface marker, but a plurality of markers may be preferably identified. For identification of the marker, a fluorescent color cell sorter (FACS), magnetic beads, or the like can be used. Such negative, weak positive, positive and strong positive of cell surface markers can preferably be based on expression intensity employed in techniques using FACS or magnetic beads. FACS or magnetic beads can be performed using procedures as exemplified herein, based on techniques well known in the art. Therefore, a factor that can judge the degree of positivity with high sensitivity is preferable. Examples of such a factor include, but are not limited to, a monoclonal antibody with high specificity, a specific ligand, or a variant or fragment thereof. Not.

このような特異的因子を用いたＦＡＣＳによる分析の具体的な手順としては、以下が挙げられるがそれに限定されない。 Specific procedures for analysis by FACS using such specific factors include, but are not limited to, the following.

（１）試料となる細胞をたとえば骨髄など（大腿骨、脛骨など）から採取し、ＰＢＳなどの緩衝液中に浮遊させ、ナイロンフィルターなどのフィルター（たとえば、７０μｍ）を通して、細胞塊、筋肉などの混入した組織を除去する。 (1) Sample cells are collected from, for example, bone marrow (femur, tibia, etc.), suspended in a buffer solution such as PBS, and passed through a filter (eg, 70 μm) such as a nylon filter to collect cell mass, muscle, etc. Remove contaminated tissue.

（２）細胞数を計数する。通常１×１０^７個〜１×１０^８個の試料細胞を得る。(2) Count the number of cells. Usually 1 × 10 ⁷ to 1 × 10 ⁸ sample cells are obtained.

（３）細胞濃度をＰＢＳ（０．１モルリン酸緩衝液１０００ｍｌ中にＮａＣｌ９ｇを溶解する）で１×１０^７／ｍｌに調整し、５ｍｌのフィコールなどの密度勾配遠心分離のための媒体に重層する。(3) Adjust the cell concentration to 1 × 10 ⁷ / ml with PBS (dissolve 9 g of NaCl in 1000 ml of 0.1 molar phosphate buffer) and overlay the medium for density gradient centrifugation such as 5 ml of Ficoll. .

（４）室温、４００×ｇ、２０分間遠心分離を行う。 (4) Centrifuge at 400 × g for 20 minutes at room temperature.

（５）境界面の細胞を回収して、例えば、ＳＭ（染色媒体＝５％ＦＢＳ、０．０５％ＮａＮ_３を含むＰＢＳ）に懸濁する。(5) Cells at the interface are collected and suspended in, for example, SM (staining medium = PBS containing 0.05% FBS, 0.05% NaN ₃ ).

（６）細胞数を数える。フィコールでの分離の場合、細胞数の約半数が回収される。 (6) Count the number of cells. In the case of Ficoll separation, about half of the number of cells is recovered.

（枯渇が必要な場合、以下を行う）
（Ａ）陰性であるべき細胞表面マーカーに対する抗体を加えて、氷上で３０分間反応させる。(If depletion is required, do the following)
(A) Add antibody against cell surface marker to be negative and react on ice for 30 minutes.

（Ｂ）ＳＭで２回洗浄し、１００μｌのＳＭに再浮遊させる。 (B) Wash twice with SM and resuspend in 100 μl SM.

（Ｃ）必要量のストレプトアビジン化したＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍ−２８０、Ｄｙｎａｌ，ノルウェー）（５−６ビーズ／細胞）をとり、マグネットスタンドを使用してＳＭで洗浄する。洗浄後のＤｙｎａｂｅａｄｓをＳＭで再浮遊させる。 (C) Take the required amount of streptavidinated Dynabeads (M-280, Dynal, Norway) (5-6 beads / cell) and wash with SM using a magnet stand. After washing, Dynabeads are resuspended in SM.

（Ｄ）氷上で３０分間反応させる。 (D) React for 30 minutes on ice.

（Ｅ）７ｍｌのＳＭを加えた後、マグネットスタンドを用いて陰性選択（ビーズと結合した細胞を除去する）を行う。 (E) After adding 7 ml of SM, negative selection (removing cells bound to beads) is performed using a magnetic stand.

（Ｆ）細胞数を数える。枯渇後には約５〜１０％の細胞が残る。 (F) Count cells. Approximately 5-10% of cells remain after depletion.

（７）遠心分離（４℃、４００×ｇ、５分間）後、細胞ペレットの状態で陽性であるべき細胞表面マーカーに対する抗体、および必要に応じて陰性であるべき抗体（上記参照、ビオチン化される。最初に用いた量の５〜１０％の量）を加える。陽性であるべき抗体は、例えば、ＰＥ、ＡＰＣ、ＦＩＴＣなどで標識される。 (7) After centrifugation (4 ° C., 400 × g, 5 minutes), antibodies against cell surface markers that should be positive in the cell pellet state, and antibodies that should be negative if necessary (see above, biotinylated Add 5-10% of the amount originally used). The antibody to be positive is labeled with, for example, PE, APC, FITC and the like.

（８）氷上でのインキュベーション後、細胞を洗浄しストレプトアビジン−ＴｅｘａｓＲｅｄを加える。 (8) After incubation on ice, the cells are washed and streptavidin-Texas Red is added.

（９）氷上でのインキュベーション後、細胞を洗浄し５×１０^５／ｍｌを目安に細胞を浮遊液を調整する。(9) After incubation on ice, the cells are washed, and the suspension of cells is adjusted with 5 × 10 ⁵ / ml as a guide.

（１０）ＦＡＣＳ（例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）などの２レーザーを装着したフローサイトメトリーを利用）による分析および／またはソーティングを行う。 (10) Analysis and / or sorting by FACS (for example, using flow cytometry equipped with two lasers such as FACS Vantage (Becton Dickinson)).

本発明の融合細胞は、免疫反応性供給細胞の細胞表面マーカーを有することが好ましい。このような細胞表面マーカーは、免疫反応性供給細胞が有するべき抗原を提供することから、融合細胞が有すべき抗原提示能によって抗原として提示され、ワクチン効果が発揮される。そのような細胞表面マーカーとしては、例えば、免疫反応性供給細胞に由来する、オンコジーン産物、胚性タンパク質、ウイルスタンパク質、組織特異的抗原、変異した腫瘍サプレッサータンパク質およびイディオタイプエピトープ、あるいは、表Ａおよび表Ｂに記載されるものが使用され得る。例示的な実施形態において、メラノーマの場合、ｇｐ１００を使用することができる。 The fused cells of the present invention preferably have a cell surface marker for immunoreactive donor cells. Since such a cell surface marker provides an antigen to be possessed by the immunoreactive donor cell, it is presented as an antigen by the antigen presenting ability that the fused cell should have, and a vaccine effect is exerted. Such cell surface markers include, for example, oncogene products, embryonic proteins, viral proteins, tissue specific antigens, mutated tumor suppressor proteins and idiotype epitopes derived from immunoreactive donor cells, or Table A and Those listed in Table B can be used. In an exemplary embodiment, gp100 can be used for melanoma.

（薬学的組成物）
別の局面において、本発明は、抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞との融合細胞を含む、薬学的組成物を提供する。このような融合細胞は、上記（融合細胞）において説明される任意の形態を採ることができる。(Pharmaceutical composition)
In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a fusion cell of an antigen presenting cell and at least one immunoreactive donor cell. Such fused cells can take any form described above (fused cells).

好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物中において含まれる細胞中、含まれる融合細胞は、少なくとも６％を構成することが望ましい。このような割合で融合細胞が含まれる薬学的組成物は、従来存在しなかった。本発明は、このような高率で融合細胞を含むことにより、予防および／または治療効果を達成したという点で着目されるべきである。含まれるべき融合細胞は、好ましくは、本発明の薬学的組成物において含まれる細胞中少なくとも１０％を構成し、より好ましくは、本発明の薬学的組成物において含まれる細胞中少なくとも２０％を構成し、さらに好ましくは、本発明の薬学的組成物において含まれる細胞中少なくとも２５％を構成する。 In a preferred embodiment, it is desirable that the fused cells contained make up at least 6% of the cells contained in the pharmaceutical composition of the invention. A pharmaceutical composition containing such fused cells at such a ratio has not existed in the past. The present invention should be noted in that the prevention and / or treatment effect is achieved by including the fused cells at such a high rate. The fusion cells to be included preferably constitute at least 10% of the cells contained in the pharmaceutical composition of the invention, more preferably at least 20% of the cells contained in the pharmaceutical composition of the invention. More preferably, it constitutes at least 25% of the cells contained in the pharmaceutical composition of the present invention.

好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、アジュバントをさらに含む。このようなアジュバントを含むことによって、本発明は、ワクチン効果をさらに増強する。このようなワクチン効果の増強は、細胞ワクチンにおいては報告されておらず、驚くべき効果であると同時にその有用性が着目されるべきである。本発明において使用され得るアジュバントとしては、例えば、鉱物アジュバント（例えば、水酸化アルミニウムゲル、明礬）、ＣｐＧ、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、百日咳加熱死菌、リポ多糖、ムラミルペプチドおよびデンプンベントナイトなどを挙げることができるがそれらに限定されない。１つの好ましい実施形態では、上記アジュバントとしては、ＣｐＧが使用され得る。ＣｐＧの利用については、ＡｄａＧ，ＲａｍｓｈａｗＩ．、ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＥｍｅｒｇＤｒｕｇｓ．２００３Ｍａｙ；８（１）：２７−３５；ＶｅｒｔｈｅｌｙｉＤ，ＫｌｉｎｍａｎＤＭ、ＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ．２００３Ｏｃｔ；１０９（１）：６４−７１などを参照することができる。このような文献は、本明細書において参考として援用される。 In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention further comprises an adjuvant. By including such an adjuvant, the present invention further enhances the vaccine effect. Such enhancement of vaccine effect has not been reported in cellular vaccines, and it should be noted that its usefulness is at the same time surprising. Adjuvants that can be used in the present invention include, for example, mineral adjuvants (eg, aluminum hydroxide gel, alum), CpG, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, pertussis heat-killed bacteria, lipopolysaccharide, muramyl peptide and starch bentonite However, it is not limited to them. In one preferred embodiment, CpG may be used as the adjuvant. For the use of CpG, see Ada G, Ramshaw I .; , Expert Opin Emerg Drugs. 2003 May; 8 (1): 27-35; Verthelii D, Klinman DM, Clin Immunol. 2003 Oct; 109 (1): 64-71. Such documents are incorporated herein by reference.

別の局面では、本発明の薬学的組成物は、抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞と、アジュバントとを含む。このような場合、これら３成分は、混合物として提供され得る。アジュバント効果は、抗原提示細胞と免疫反応性供給細胞とが融合されていなくても発揮されることが本発明において見出されたからである。このような形態において、使用されるアジュバントとしては、鉱物アジュバント（例えば、水酸化アルミニウムゲル、明礬）、ＣｐＧ、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、百日咳加熱死菌、リポ多糖、ムラミルペプチドおよびデンプンベントナイトなどを挙げることができるがそれらに限定されない。 In another aspect, the pharmaceutical composition of the invention comprises an antigen presenting cell, at least one immunoreactive donor cell, and an adjuvant. In such cases, these three components can be provided as a mixture. This is because it has been found in the present invention that the adjuvant effect is exhibited even if the antigen-presenting cell and the immunoreactive supply cell are not fused. In such a form, adjuvants used include mineral adjuvants (eg, aluminum hydroxide gel, alum), CpG, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, pertussis heat-killed bacteria, lipopolysaccharide, muramyl peptide and starch. Although bentonite etc. can be mentioned, it is not limited to them.

（予防・治療キット）
別の局面において、本発明は、抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞と、ウイルスまたはその一部と、を含む、該免疫反応性供給細胞に起因する疾患を処置または予防するためのキットを提供する。(Prevention / treatment kit)
In another aspect, the present invention treats or prevents a disease caused by an immunoreactive donor cell, comprising an antigen-presenting cell, at least one immunoreactive donor cell, and a virus or a portion thereof. Providing a kit for

ここで、本発明のキットにおいて、使用されるべき、ウイルスまたはその一部、抗原提示細胞および免疫反応性供給細胞は、本明細書において（融合細胞）の項において説明される任意の形態で使用され得ることが理解される。 Here, in the kit of the present invention, the virus or a part thereof, the antigen-presenting cell and the immunoreactive supply cell to be used are used in any form described in the section of (fusion cell) in the present specification. It is understood that it can be done.

好ましい実施形態では、本発明のキットは、ウイルスまたはその一部を、免疫反応性供給細胞と、抗原提示細胞とを融合することを指示する指示書をさらに備える。そのような融合の方法としては、例えば、免疫反応性供給細胞と抗原提示細胞とを混合し、その混合物にウイルスまたはその一部を加えるか、あるいは、それら混合物を宿主内に投与し、その後、ウイルスまたはその一部を同様に投与することなどが挙げられるがそれらに限定されない。本発明では、必ずしも、体外で最初に融合させる必要がないことが特徴であり、本発明のキットでは、必ずしも、免疫反応性供給細胞と抗原提示細胞とは融合されていることは必要ではないことが理解される。従って、本発明において使用されるウイルスは、不活化されていることが好ましい。ウイルスは、しばしば、病原性を有するからである。不活化は、どのような手段でも達成され得るが、アルキル化剤の使用または紫外線などの照射によって行われ得る。 In a preferred embodiment, the kit of the present invention further comprises instructions for instructing to fuse the virus or part thereof with an immunoreactive donor cell and an antigen presenting cell. Such fusion methods include, for example, mixing immunoreactive donor cells and antigen-presenting cells and adding the virus or part thereof to the mixture, or administering the mixture into a host, and then Examples include, but are not limited to, administration of a virus or a part thereof in the same manner. The present invention is characterized by the fact that it is not always necessary to first fuse outside the body, and the kit of the present invention does not necessarily require that the immunoreactive supply cell and the antigen-presenting cell are fused. Is understood. Therefore, the virus used in the present invention is preferably inactivated. Viruses are often pathogenic. Inactivation can be accomplished by any means, but can be accomplished by use of an alkylating agent or irradiation such as ultraviolet light.

好ましい実施形態では、本発明のキットにおいて用いられるウイルスは、不活化ＨＶＪであることが好ましい。細胞融合能が優れており、しかも融合された細胞が優れた予防および／または治療能力を発揮することが本発明において判明したからである。 In a preferred embodiment, the virus used in the kit of the present invention is preferably inactivated HVJ. This is because it has been found in the present invention that the cell fusion ability is excellent and the fused cells exhibit excellent prevention and / or treatment ability.

本発明のキットでは、ウイルスは、不活化されていない状態で提供される場合、好ましい実施形態では、上記指示書は、不活化することを指示することをさらに含む。あるいは、不活化因子がさらに備えられ得る。そのような不活化因子としては、例えば、アルキル化剤あるいは、照射源（例えば、Ｘ線、紫外線などを照射することができる線源）が挙げられるがそれらに限定されない。 In the kit of the present invention, when the virus is provided in an uninactivated state, in a preferred embodiment, the instructions further comprise instructing to inactivate. Alternatively, an inactivation factor can be further provided. Examples of such an inactivating factor include, but are not limited to, an alkylating agent or an irradiation source (for example, a radiation source capable of irradiating X-rays, ultraviolet rays, etc.).

（融合細胞の製造方法）
別の局面において、本発明はさらに、以下の工程：Ａ）抗原提示細胞および少なくとも１種の免疫反応性供給細胞を提供する工程；およびＢ）該抗原提示細胞と該少なくとも１種の免疫反応性供給細胞と、ウイルスまたはその一部とを混合する工程、を包含する、融合細胞の製造方法を提供する。ここで、細胞の提供は、任意の方法で行うことができる。例えば、自己由来細胞の場合は、その細胞が由来する宿主から入手することができる。ヒトが対象の場合は、事前にインフォームドコンセントをとることが好ましい。動物の場合もまた、動物愛護精神ののっとった手法で入手することが好ましい。細胞種およびウイルスとしては、上記（融合細胞）において記載される任意の形態を採ることができることが理解される。(Method for producing fused cells)
In another aspect, the present invention further comprises the following steps: A) providing an antigen presenting cell and at least one immunoreactive donor cell; and B) the antigen presenting cell and the at least one immunoreactive. There is provided a method for producing a fused cell comprising the step of mixing a feeder cell with a virus or a part thereof. Here, provision of a cell can be performed by arbitrary methods. For example, in the case of an autologous cell, it can be obtained from the host from which the cell is derived. In the case of human subjects, it is preferable to obtain informed consent in advance. In the case of animals as well, it is preferable to obtain them by a method based on an animal welfare spirit. It is understood that the cell type and virus can take any form described above (fused cells).

好ましい実施形態では、本発明の方法は、免疫反応性供給細胞を不活化する工程をさらに包含する。細胞の不活化は、本明細書において（融合細胞）の項において説明される任意の技術および他の当該分野において公知の技術を用いて行うことができることが理解される。不活化工程を導入することによって、免疫反応性供給細胞に由来する任意の病原性が排除されることが期待される。 In a preferred embodiment, the method of the invention further comprises inactivating the immunoreactive donor cell. It is understood that cell inactivation can be performed using any of the techniques described herein in the (Fused cells) section and other techniques known in the art. By introducing an inactivation step, it is expected that any pathogenicity derived from immunoreactive donor cells will be eliminated.

好ましい実施形態では、本発明の方法は、本発明の融合細胞が、免疫反応性供給細胞および抗原提示細胞の細胞表面マーカーを有することを確認する工程をさらに包含する。このような確認工程によって、本発明の方法において作製された融合細胞が、所望の性質を有していることが確認され得る。ただし、本発明の方法は、このような細胞表面マーカーの確認のみならず、他の手法を用いても確認することができることが理解される。 In a preferred embodiment, the method of the invention further comprises the step of confirming that the fusion cells of the invention have cell surface markers of immunoreactive donor cells and antigen presenting cells. By such a confirmation step, it can be confirmed that the fused cell produced in the method of the present invention has a desired property. However, it is understood that the method of the present invention can be confirmed not only by confirming such cell surface markers but also by using other methods.

別の実施形態において、本発明はまた、ウイルスまたはその一部を使用する細胞融合に加え、さらなる細胞融合工程を包含してもよい。そのようなさらなる融合工程に使用される技術は、ウイルスまたはその一部を使用するのみならず、他の技術、例えば、ポリエチレングリコール方法、エレクトロフユージョンなどを用いても良いことが理解される。 In another embodiment, the present invention may also include additional cell fusion steps in addition to cell fusion using viruses or parts thereof. It will be appreciated that the techniques used for such further fusion steps may use not only viruses or parts thereof, but other techniques such as polyethylene glycol methods, electrofusion, and the like.

（予防・処置のための方法）
別の局面において、本発明は、抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞との融合細胞を、患者に投与する工程、を包含する、該免疫反応性供給細胞に起因する疾患、障害または状態を、処置または予防するための方法を提供する。ここで、使用され得る抗原提示細胞、免疫反応性供給細胞などは、本明細書において（融合細胞）などの項で説明される任意の形態をとることができることが理解される。(Methods for prevention and treatment)
In another aspect, the present invention relates to a disease caused by an immunoreactive donor cell, comprising the step of administering a fusion cell of an antigen-presenting cell and at least one immunoreactive donor cell to a patient. Methods are provided for treating or preventing a disorder or condition. Here, it is understood that the antigen-presenting cells, immunoreactive donor cells, and the like that can be used can take any form described in the section of this specification (fused cells) and the like.

本発明が対象とする患者は、免疫系を有する任意の動物であることが理解されるが、好ましくは、患者は、哺乳動物を含み、より好ましくは、患者は、ヒトを含むことが理解される。 It is understood that the patient to which the present invention is directed is any animal having an immune system, but preferably the patient comprises a mammal, more preferably the patient comprises a human. The

１つの実施形態において、免疫反応性供給細胞に起因する疾患、障害または状態としては、癌（例えば、メラノーマ、肺癌、胃癌、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺癌、リンパ腫、肉腫、肝癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、胸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、大腸癌（結腸直腸癌）、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、膀胱癌、子宮頸部癌、皮膚癌、乳癌、食道癌、腎腫、脳腫瘍など）、感染症（例えば、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物（原生動物、原虫、リーシュマニア、トキソプラズマなど）に起因する疾患）、自己免疫疾患（例えば、膠原病、アレルギー（花粉症など）、慢性関節リウマチなど）などを挙げることができるがそれらに限定されない。好ましくは、本発明が対象とする疾患は、癌を含む。 In one embodiment, the disease, disorder or condition resulting from immunoreactive donor cells includes cancer (eg, melanoma, lung cancer, stomach cancer, adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, adenosquamous cell carcinoma, thymic carcinoma, lymphoma, sarcoma). , Liver cancer, non-Hodgkin lymphoma, Hodgkin lymphoma, leukemia, uterine cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer (colorectal cancer), multiple myeloma, neuroblastoma, bladder cancer, cervix Cancer, skin cancer, breast cancer, esophageal cancer, nephroma, brain tumor, etc.), infectious diseases (eg, diseases caused by viruses, bacteria, fungi, parasites (protozoa, protozoa, leishmania, toxoplasma, etc.)), self Examples include, but are not limited to, immune diseases (eg, collagen disease, allergies (eg, hay fever), rheumatoid arthritis, etc.). Preferably, the disease targeted by the present invention includes cancer.

好ましい実施形態では、本発明の方法は、免疫反応性供給細胞に起因する疾患、障害または状態の予防のために提供される。本発明の方法が提供する融合細胞がワクチンとして作用することから、予防作用が期待されるからである。あるいは、本発明の方法は、そのような疾患、障害または状態の再発を防止するために提供される。 In a preferred embodiment, the methods of the invention are provided for the prevention of diseases, disorders or conditions resulting from immunoreactive donor cells. This is because the fusion cell provided by the method of the present invention acts as a vaccine, so that a preventive action is expected. Alternatively, the methods of the invention are provided to prevent the recurrence of such diseases, disorders or conditions.

好ましい実施形態では、本発明の方法は、アジュバント（例えば、明礬、ＣｐＧ、水酸化アルミニウムゲル、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、百日咳加熱死菌、リポ多糖、ムラミルペプチドおよびデンプンベントナイト）を投与する工程をさらに包含する。このようなアジュバントは、本明細書において（薬学的組成物）中などの項において説明される任意の形態を採りえることが理解される。アジュバントの投与は、上記融合細胞または他の細胞の投与の前、同時または後であり得る。好ましくは、ほぼ同時である。アジュバント効果は、細胞ワクチンが投与されるときに発揮されるからである。 In a preferred embodiment, the method of the invention administers an adjuvant (eg, alum, CpG, aluminum hydroxide gel, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, pertussis heat killed, lipopolysaccharide, muramyl peptide and starch bentonite). Further comprising the step of: It is understood that such adjuvants can take any form described herein, such as in (pharmaceutical composition). Administration of the adjuvant can be before, simultaneously with, or after administration of the fused cells or other cells. Preferably, they are almost simultaneous. This is because the adjuvant effect is exhibited when the cell vaccine is administered.

本発明の方法において使用される免疫反応性供給細胞の抗原は未知であってもよい。未知であっても、本発明の方法を用いることによって、予防および治療効果が発揮されることが本発明によって初めて達成されたからである。 The antigen of the immunoreactive donor cell used in the method of the present invention may be unknown. This is because, even if unknown, by using the method of the present invention, the present invention has achieved for the first time a preventive and therapeutic effect.

別の実施形態において、本発明の方法は、癌の転移を予防するために提供される。本発明の癌の予防および治療効果は、癌の転移を予防するためにも有用であるからである。 In another embodiment, the methods of the invention are provided for preventing cancer metastasis. This is because the cancer preventive and therapeutic effects of the present invention are also useful for preventing cancer metastasis.

予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、既往歴などを考慮して、当業者が容易に決定することができる（例えば、「ワクチンハンドブック」、国立予防衛生研究所学友会編（１９９４）；「予防接種の手引き第８版」、木村三生夫、平山宗宏、堺春美編、近代出版（２０００）；「生物学的製剤基準」、細菌製剤恊会編（１９９３）など）を参照のこと）。 A prophylactically, therapeutically or prognostically effective amount can be determined by one of ordinary skill in the art using techniques well known in the art, taking into account various parameters and can be determined using, for example, use It can be easily determined by those skilled in the art in consideration of the purpose, target disease (type, severity, etc.), patient age, weight, medical history, etc. (eg, “Vaccine Handbook”, National Institute of Preventive Health) Alumni Association (1994); “Inoculation Guide 8th Edition”, Mitsuo Kimura, Munehiro Hirayama, Harumi Hagiyama, Modern Publishing (2000); “Biological Formulation Standards”, Bacterial Formulation Association (1993) ) Etc.)).

別の局面において、本発明は、以下の工程：Ａ）疾患、障害または状態を同定する工程；Ｂ）該疾患、障害または状態に関連する、免疫反応性供給細胞を同定する工程；Ｃ）抗原提示細胞と、該免疫反応性供給細胞の少なくとも１種との融合細胞を提供する工程；およびＤ）該融合細胞を患者に投与する工程、を包含する、該免疫反応性供給細胞に起因する疾患、障害または状態を、処置または予防するための方法を提供する。ここで、疾患、障害または状態の同定は、当該分野において公知の任意の方法で行うことができる。そのような疾患などの同定は、例えば、標準的な医学書（例えば、ＭｅｒｃｋＭａｎｕａｌ最新版）などを参酌することができる。そのような疾患、障害または状態に関連する細胞の同定もまた、当該分野において公知の任意の方法で行うことができる。そのような細胞の同定は、例えば、標準的な医学書（例えば、ＭｅｒｃｋＭａｎｕａｌ最新版）などを参酌することができる。本発明のこの方法において、融合細胞の提供および投与もまた、本明細書において他の場所（例えば、（融合細胞）の節など）に記載される任意の形態をとることができることが理解される。 In another aspect, the invention provides the following steps: A) identifying a disease, disorder or condition; B) identifying an immunoreactive donor cell associated with the disease, disorder or condition; C) an antigen Providing a fused cell of the presenting cell and at least one of the immunoreactive donor cells; and D) administering the fused cell to a patient, a disease caused by the immunoreactive donor cell Provide a method for treating or preventing a disorder or condition. Here, identification of a disease, disorder or condition can be performed by any method known in the art. For identification of such diseases, for example, a standard medical book (for example, Merck Manual latest edition) can be referred to. Identification of cells associated with such diseases, disorders or conditions can also be performed by any method known in the art. For identification of such cells, for example, a standard medical book (for example, Merck Manual latest edition) can be referred to. In this method of the invention, it is understood that the provision and administration of fusion cells can also take any form described elsewhere herein, such as the section (Fusion Cells). .

（使用）
別の局面において、本発明は、抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞との融合細胞の、該免疫反応性供給細胞に起因する疾患、障害または状態を、処置または予防するための医薬を製造する方法における、使用を提供する。ここで使用されるべき細胞、ウイルス、他の成分は、本明細書において（融合細胞）、（薬学的組成物）において説明される任意の形態を採るべきことが理解される。また、疾患、障害および状態もまた、本明細書において（予防・治療キット）、（予防・処置のための方法）などにおいて説明される任意の形態を採るべきことが理解される。(use)
In another aspect, the present invention treats or prevents a disease, disorder or condition caused by an immunoreactive donor cell of a fusion cell of an antigen-presenting cell and at least one immunoreactive donor cell. Use in a method of manufacturing a medicament of the present invention is provided. It is understood that the cells, viruses, and other components to be used herein should take any form described herein (fusion cells), (pharmaceutical compositions). It is also understood that diseases, disorders and conditions should also take any form described herein (Prophylactic / Therapeutic Kit), (Method for Prophylactic / Treatment) and the like.

本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。 References such as scientific literature, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety to the same extent as if each was specifically described.

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。 As mentioned above, although this invention has been illustrated using preferable embodiment of this invention, this invention should not be limited and limited to this embodiment. It is understood that the scope of the present invention should be construed only by the claims. It is understood that those skilled in the art can implement an equivalent range based on the description of the present invention and the common general technical knowledge from the description of specific preferred embodiments of the present invention. Patents, patent applications, and documents cited herein should be incorporated by reference in their entirety, as if the contents themselves were specifically described herein. Understood.

以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、和光純薬、Ｓｉｇｍａ，Ｐｒｏｍｅｇａから市販されているものを使用した。マウスなどは、日本チャールズリバーなどから入手した。 Hereinafter, although an example explains the composition of the present invention in detail, the present invention is not limited to this. The reagents used in the following were those commercially available from Wako Pure Chemicals, Sigma, Promega, unless otherwise specified. Mice were obtained from Charles River Japan.

（実施例１：融合細胞の作製）
マウス樹状細胞とマウスメラノーマＢ１６ＢＬ６（Ｘ線照射）とを、ＨＶＪ（紫外線で不活化）で融合した。約２０％の融合細胞が得られた。Ａ，Ｂはそれぞれの細胞の脂質を蛍光色素でラベルして樹状細胞と癌細胞の融合像を確認した。Ｃはそれぞれの表面抗原を認識する抗体を用いて二重染色した（図１Ａ〜図１Ｃ）。その手順を以下に示す。(Example 1: Preparation of fusion cells)
Mouse dendritic cells and mouse melanoma B16BL6 (X-ray irradiation) were fused with HVJ (inactivated by UV light). About 20% of fused cells were obtained. A and B confirmed the fusion image of dendritic cells and cancer cells by labeling the lipid of each cell with a fluorescent dye. C was double-stained with antibodies that recognize the respective surface antigens (FIGS. 1A-1C). The procedure is shown below.

ＨＶＪ（Ｚ種）を、ニワトリ卵の漿尿膜液から遠心分離することによって精製し、力価を公知の技術を用いて決定した。ＨＶＪの種ウイルスを、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅ）の受精卵を使って増殖させ分離・精製したＨＶＪ（Ｚ種）を細胞保存用チューブに分注し、１０％ＤＭＳＯを加えて液体窒素中に保存し、調製した。 HVJ (Z species) was purified by centrifuging from chicken egg chorioallantoic fluid and titers determined using known techniques. HVJ (species Z), which has been propagated using SPF (Specific pathogen free) fertilized eggs, separated and purified, is dispensed into a cell storage tube, and 10% DMSO is added and stored in liquid nitrogen And prepared.

受精直後のニワトリ卵を入荷し、インキュベーター（ＳＨＯＷＡ−ＦＵＲＡＮＫＩＰ−０３型；約３００鶏卵収容）に入れ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で１０〜１４日飼育した。暗室内で、検卵器（電球の光が口径約１．５ｃｍの窓を通して出るようになっているもの）を用いて、胚の生存および気室と漿尿膜を確認し、漿尿膜の約５ｍｍ上方に鉛筆でウイルス注入箇所の印をつけた（太い血管を除いた場所を選定する）。ポリペプトン溶液（１％ポリペプトン、０．２％ＮａＣｌを混合し、１ＭＮａＯＨでｐＨ７．２に調整してオートクレーブ滅菌し、２℃〜６℃保存したもの）で種ウイルス（液体窒素から取り出したもの）を５００倍に希釈し、２℃〜６℃に置いた。卵をイソジンおよびアルコールで消毒し、ウイルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希釈した種ウイルス０．１ｍｌを２６ゲージの針付き１ｍｌシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入した。溶かしたパラフィン（融点５０〜５２℃）をパスツールピペットを用いて孔の上に置きこれをふさいだ。卵をインキュベーターに入れ、３４〜３６．５℃、湿度４０％以上の条件で３日飼育した。次に、接種卵を一晩２℃〜６℃に置いた。翌日卵の気室部分をピンセットで割り、１８ゲージの針を付けた１０ｍｌシリンジを漿尿膜の中に入れて、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、２℃〜６℃に保存した。 Chicken eggs immediately after fertilization were received, placed in an incubator (SHOWA-FURANKIP-03 type; containing about 300 chicken eggs), and bred for 10 to 14 days under conditions of 36.5 ° C. and humidity of 40% or more. In the dark room, using an ophthalmoscope (light bulb light exits through a window with a diameter of about 1.5 cm), check the survival of the embryo and the air chamber and chorioallantoic membrane. The virus injection point was marked with a pencil approximately 5 mm above (select a place excluding a thick blood vessel). Seed virus (taken from liquid nitrogen) with polypeptone solution (mixed with 1% polypeptone, 0.2% NaCl, adjusted to pH 7.2 with 1M NaOH, autoclaved and stored at 2 ° C to 6 ° C) Was diluted 500 times and placed at 2-6 ° C. Eggs were sterilized with isodine and alcohol, a small hole was drilled through the virus injection site, and 0.1 ml of diluted seed virus was injected into the chorioallantoic cavity using a 1 ml syringe with a 26 gauge needle. Dissolved paraffin (melting point: 50-52 ° C.) was placed on the hole using a Pasteur pipette to close it. The eggs were placed in an incubator and bred for 3 days under conditions of 34 to 36.5 ° C. and humidity of 40% or more. The inoculated eggs were then placed overnight at 2-6 ° C. On the next day, the air chamber portion of the egg was split with tweezers, a 10 ml syringe with an 18 gauge needle was placed in the chorioallantoic membrane, the chorioallantoic fluid was aspirated, collected in a sterile bottle, and stored at 2 ° C to 6 ° C. .

ＨＶＪの濃縮を必要に応じて行った。上記工程で得たＨＶＪ含有漿尿液（ＨＶＪ含有のニワトリ卵の漿尿液を集め２℃〜６℃にて保存）の約１００ｍｌを広口の駒込ピペットで約５０ｍｌの遠心チューブ２本に入れ、低速遠心機で３，０００ｒｐｍ、１０分、２℃〜６℃で遠心し（ブレーキはオフ）、卵の組織片を除去した。 Concentration of HVJ was performed as needed. About 100 ml of the HVJ-containing chorioallantoic fluid obtained in the above step (collecting HVJ-containing chicken egg chorioallantoic fluid and storing at 2 ° C. to 6 ° C.) is put into two about 50 ml centrifuge tubes with a wide-mouthed Komagome pipette, Centrifugation was performed at 3,000 rpm for 10 minutes at 2 ° C. to 6 ° C. in a low speed centrifuge (brake off), and the egg tissue pieces were removed.

遠心後、上清を３５ｍｌ遠心チューブ４本（高速遠心用）に分注し、アングルローターで２７，０００ｇ、３０分遠心した（アクセル、ブレーキはオン）。上清を除き、沈澱にＢＳＳ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭＮａＣｌ、５．４ｍＭＫＣｌ；オートクレーブし、２℃〜６℃保存）（ＢＳＳのかわりにＰＢＳでも可能）をチューブ当たり約５ｍｌ加え、そのまま２℃〜６℃で一晩静置した。広口の駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈澱をほぐし、１本のチューブに集め、同様にアングルローターで２７，０００ｇ、３０分遠心した。上清を除き、沈澱にＢＳＳを約１０ｍｌ加え、同様に２℃〜６℃で一晩静置した。広口の駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈澱をほぐし、低速遠心機で３，０００ｒｐｍ、１０分、２℃〜６℃で遠心し（ブレーキはオフ）、除ききれなかった組織片やウイルスの凝集塊をのぞいた。上清を新しい滅菌済みチューブに入れ、ＨＶＪ濃縮液として２℃〜６℃で保存した。 After centrifugation, the supernatant was dispensed into four 35 ml centrifuge tubes (for high-speed centrifugation), and centrifuged at 27,000 g for 30 minutes using an angle rotor (accelerator and brake on). The supernatant was removed, and BSS (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl; autoclaved and stored at 2 ° C. to 6 ° C.) (PBS instead of BSS) could be added to the precipitate. 5 ml was added and allowed to stand at 2 ° C. to 6 ° C. overnight. The precipitate was loosened by gently pipetting with a wide-mouthed Komagome pipette, collected in one tube, and similarly centrifuged at 27,000 g for 30 minutes with an angle rotor. The supernatant was removed, and about 10 ml of BSS was added to the precipitate, which was then allowed to stand overnight at 2 ° C to 6 ° C. Pipette gently with a wide-mouthed Komagome pipette to loosen the precipitate, then centrifuge at 3,000 rpm for 10 minutes at 2 ° C to 6 ° C (brake off) with a low-speed centrifuge to break away tissue fragments and viruses that could not be removed I looked into the lump. The supernatant was placed in a new sterilized tube and stored as HVJ concentrate at 2-6 ° C.

このＨＶＪ濃縮液０．１ｍｌにＢＳＳを０．９ｍｌ加え、分光光度計で５４０ｎｍの吸光度を測定し、ウイルス力価を赤血球凝集活性（ＨＡＵ）に換算した。５４０ｎｍの吸光度１がほぼ１５，０００ＨＡＵに相当した。ＨＡＵは融合活性とほぼ比例するようである。 0.9 ml of BSS was added to 0.1 ml of this HVJ concentrated solution, the absorbance at 540 nm was measured with a spectrophotometer, and the virus titer was converted to hemagglutination activity (HAU). Absorbance 1 at 540 nm corresponded to approximately 15,000 HAU. HAU appears to be approximately proportional to fusion activity.

（ウイルスの不活化）
ウイルスを、紫外線照射によって不活化した（９９ｍＪ／ｃｍ^２）。不活化は、使用直前に行ったが、使用直前に行わなくても良い。(Virus inactivation)
The virus was inactivated by ultraviolet irradiation (99 mJ / cm ² ). Inactivation was performed immediately before use, but may not be performed immediately before use.

（使用した細胞株）
使用した細胞株（免疫反応性供給細胞）は以下のとおりである：
Ｂ１６ＢＬ６メラノーマ（Ｈ−２^ｂ）（ＣＲＬ−６３２２）；
ＥＬ４Ｔ細胞リンパ腫（Ｈ−２^ｂ）（ＴＩＢ−３９）；
ＲＥＮＣＡ腎細胞癌腫（Ｈ−２^ｄ）（ＣＣＬ−１４２）；および
ＣＴ２６結腸腺癌（Ｈ−２^ｄ）（ＣＲＬ−２６３８）。これらは、すべて、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。(Cell line used)
The cell lines used (immunoreactive donor cells) are as follows:
B16BL6 melanoma ^{(H-2 b) (CRL} -6322);
EL4 T cell lymphoma ^{(H-2 b) (TIB} -39);
RENCA renal cell carcinoma (H-2 ^d ) (CCL-142); and CT26 colon adenocarcinoma (H-2 ^d ) (CRL-2638). These were all purchased from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD).

抗原提示細胞としては、骨髄由来のマウス樹状細胞（ＤＣ）を使用した。この細胞は、マウス脛骨および大腿骨の骨髄から分離した。分離後、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％熱非働化ウシ胎仔血清、５０μＭ２−メルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍｌ組み換えマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；Ｇｅｎｚｙｍｅ−Ｔｅｃｈｎｅ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含む）に移し、培養した。樹状細胞を、融合１日前にリポポリサッカリド（ＬＰＳ）を用いて成熟させた。融合効率を上げるために、樹状細胞および癌細胞に、蛍光でそれぞれ赤および緑色の標識を付した。蛍光標識としては、ＰＫＨ２６およびＰＫＨ６７ａをそれぞれ用いた。標識の仕方は、製造業者（Ｚｙｎａｘｉｓ、Ｐｈｏｅｎｉｘｖｉｌｌｅ、ＰｉｋｅＭａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）の指示書に従った。あるいは、樹状細胞およびＢ１６ＢＬ６細胞を、それぞれ、ＣＤ１１ｃに特異的なフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合体化マウス抗マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびｇｐ１００に特異的なフィコエリトリン（ＰＥ）結合体化マウスモノクローナル抗体（ＢＤＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）で標識した。次いで、腫瘍細胞に、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ（ＮｏｒｄｉｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて１００Ｇｙの線量でγ線照射した。細胞融合は、癌細胞と樹状細胞との比率を１：２にして行った。融合は、上述のように調製したＨＶＪを用いて行った。 Bone marrow-derived mouse dendritic cells (DC) were used as antigen-presenting cells. The cells were isolated from mouse tibia and femur bone marrow. After separation, transfer to RPMI1640 medium (containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 50 μM 2-mercaptoethanol, 10 ng / ml recombinant mouse granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF; Genzyme-Techne, Minneapolis, MN)) And cultured. Dendritic cells were matured with lipopolysaccharide (LPS) one day prior to fusion. In order to increase the fusion efficiency, dendritic cells and cancer cells were labeled with fluorescent red and green, respectively. As fluorescent labels, PKH26 and PKH67a were used, respectively. The labeling method followed the manufacturer's instructions (Zynaxis, Phoenixville, Pike Malvern, PA). Alternatively, dendritic cells and B16BL6 cells were isolated from CD11c specific fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated mouse anti-mouse monoclonal antibody (mAb) and gp100 specific phycoerythrin (PE) conjugated mouse monoclonal, respectively. Labeled with antibody (BD Phar Mingen, San Diego, CA). The tumor cells were then gamma-irradiated at a dose of 100 Gy using Gammacell (Nordion International, Ontario, Canada). Cell fusion was performed with a ratio of cancer cells to dendritic cells of 1: 2. Fusion was performed using HVJ prepared as described above.

手短に述べると、樹状細胞（４×１０^６細胞）を、２ｍＭＣａＣｌ_２を含む緩衝化生理食塩水（ＢＳＳ；１０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ７．５，１３７ｍＭＮａＣｌ，５．４ｍＭＫＣｌ）２５０μｌ中に懸濁した。γ線照射した癌細胞（２×１０^６細胞）を、２ｍＭＣａＣｌ_２を含む２５０μｌのＢＳＳに懸濁し、種々の量のＨＶＪ（０〜１，０００ＨＡＵ）（５００μｌＢＳＳ中）と２ｍｌチューブ中に混合した。０℃で５分間インキュベートした後、この混合物を３７℃で１５分間、水浴中で振とうしながら（１２０ｒｐｍ）インキュベートして、細胞融合を誘導した。１，２００ｒｐｍで３分間、４℃での遠心分離後、融合産物を、１．５ｍｌのＢＳＳで２回洗浄して、遊離ＨＶＪを取り除いた。その後、この融合産物を５％ＣＯ_２中で３７℃で一晩培養した。融合後２４時間の培養後、融合産物を採集し、そしてこれをＦＡＣＳｃａｎを用いて融合効率を評価した。Briefly, dendritic cells (4 × 10 ⁶ cells) were suspended in 250 μl of buffered saline (BSS; 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl) containing ₂ mM CaCl _2. It became cloudy. Gamma-irradiated cancer cells (2 × 10 ⁶ cells) are suspended in 250 μl BSS containing ₂ mM CaCl ₂ and mixed with various amounts of HVJ (0 to 1,000 HAU) (in 500 μl BSS) in a 2 ml tube. did. After incubating at 0 ° C. for 5 minutes, the mixture was incubated at 37 ° C. for 15 minutes with shaking (120 rpm) in a water bath to induce cell fusion. After centrifugation at 1,200 rpm for 3 minutes at 4 ° C., the fusion product was washed twice with 1.5 ml BSS to remove free HVJ. The fusion product was then incubated overnight at 37 ° C. in 5% CO ₂ . After culturing for 24 hours after fusion, the fusion product was collected and evaluated for fusion efficiency using FACScan.

図１Ａ〜図１Ｃに示されるように、本発明の方法を用いた場合、融合効率は、ＨＡＵに比例し、２５％もの効率も達成され得ることが判明した。 As shown in FIGS. 1A-1C, it has been found that when using the method of the present invention, the fusion efficiency is proportional to HAU and as much as 25% can be achieved.

（実施例２：融合細胞のサイトカイン分泌）
次に、実施例１で作製した融合細胞を２４時間培養し、その培養上清中のサイトカインをＥＬＩＳＡ法で測定した。(Example 2: Cytokine secretion of fused cells)
Next, the fused cells prepared in Example 1 were cultured for 24 hours, and cytokines in the culture supernatant were measured by ELISA.

以下に、その測定法を示す。 The measurement method is shown below.

ＯＨＡＵ（すなわち、単なる混合物）および５００ＨＡＵ（すなわち、融合細胞）のＨＶＪを用いて作製した融合産物を２４時間、１０μｇ／ｍｌのＣｐＧオリゴヌクレオチドのあるなしでインキュベートした後、上清を細胞培養物から採集して、−８０℃で保存した。
上清中のＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０およびインターフェロン（ＩＦＮ）−γの濃度を、製造業者の指示書に従って、マウスサイトカインに関してＥＬＩＳＡ発色キット（Ｇｅｎｚｙｍｅ−Ｔｅｃｈｎｅ）を用いて測定した。ホスホロチオエート改変ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ１６６８；５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’（配列番号１））および非ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＧｐＧ１６６８；５’−ＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’（配列番号２））（ＶｉｃａｒｉＡＰ２００２ＪＥｘｐＭｅｄ）（ＫｒｉｅｇＡＭ，１９９５Ｎａｔｕｒｅ）を、北海道システムサイエンス（ＨｏｋｋａｉｄｏＳｙｓｔｅｍＳｃｉｅｎｃｅ）（Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ）から入手した。After incubating the fusion products made with OHAU (ie, just a mixture) and 500 HAU (ie, fused cells) HVJ for 24 hours with or without 10 μg / ml CpG oligonucleotide, the supernatant was removed from the cell culture. It was collected and stored at -80 ° C.
The concentrations of TNF-α, IL-12p40 and interferon (IFN) -γ in the supernatant were measured using an ELISA chromogenic kit (Genzyme-Techne) for mouse cytokines according to the manufacturer's instructions. Phosphorothioate modified CpG oligonucleotides (CpG1668; 5′-TCCATGACGTCTCTGGATGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 1)) and non-CpG oligonucleotides (GpG1668; 5′-TCCATGAGGTTCCCTGATGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 2)) (Vicari AP 2002M Jp) (Krieg AM, 1995 Nature) was obtained from Hokkai System Science (Sapporo, Japan).

ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０とも融合細胞を用いる方がそれぞれの細胞の混合物よりもサイトカインを強く分泌した（図２Ａ〜図２Ｂに示す）。ここでＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いるとその分泌が増強された。非ＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた場合は、分泌の増強は顕著ではなかった。 Both TNF-α and IL-12p40 secreted cytokines more strongly than the mixture of cells using fusion cells (shown in FIGS. 2A to 2B). Here, when the CpG oligonucleotide was used, its secretion was enhanced. When non-CpG oligonucleotides were used, the increase in secretion was not significant.

（実施例３：インターフェロンγおよび細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の測定）
次に、本発明の融合細胞のインターフェロンγの分泌および細胞傷害性Ｔ細胞に対する影響を観察した。融合細胞をマウス皮内に接種し、２週後に脾臓リンパ球を取り出しインターフェロンγの分泌（Ａ），メラノーマに対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）（Ｂ）を測定した。その手順を以下に示す。(Example 3: Measurement of interferon γ and cytotoxic T cells (CTL))
Next, the influence of the fusion cells of the present invention on the secretion of interferon γ and cytotoxic T cells was observed. The fused cells were inoculated into the mouse skin, and spleen lymphocytes were taken out after 2 weeks, and secretion of interferon γ (A) and cytotoxic T cells (CTL) (B) against melanoma were measured. The procedure is shown below.

実施例１に示すように作製した樹状細胞とγ線照射した癌細胞との混合細胞（ＯＨＡＵのＨＶＪを使用）または融合細胞（５００ＨＡＵのＨＶＪを用いた場合）を１２時間インキュベートした後、６×１０^６細胞を採集し、そしてこれを１００μｌのＰＢＳ中に懸濁した。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの使用の際には、１００μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドを、１００μｌのＰＢＳ中に溶解し、ついで１００μｌのＰＢＳと混合した（ＣｐＧ単独）か、または１００μｌのＰＢＳ中の６×１０^６細胞の懸濁物と混合し（すなわち、混合物＋ＣｐＧおよび融合細胞＋ＣｐＧ）、その後すぐにマウスに注射した。マウス（１０匹／群）に１週間間隔で２回注射した。ここで、これらのワクチン接種は、１回あたり、総量２００μｌのＰＢＳを、尾部の基部付近の両側後側腹部の皮膚内（ｉｄ）注射することによって行った（１００μｌ／各側腹部あたり）。融合産物中の細胞数を、樹状細胞−癌細胞融合物において使用される細胞数あたりで記載した。After incubating a mixed cell (using OHAU HVJ) or a fusion cell (using 500 HAU HVJ) of dendritic cells and gamma-irradiated cancer cells as shown in Example 1 for 6 hours, 6 X10 ⁶ cells were harvested and suspended in 100 μl of PBS. When using CpG oligonucleotides, 100 μg CpG oligonucleotide was dissolved in 100 μl PBS and then mixed with 100 μl PBS (CpG alone) or 6 × 10 ⁶ cells in 100 μl PBS. The mice were mixed with the suspension (ie, mixture + CpG and fusion cell + CpG) and then immediately injected into mice. Mice (10 / group) were injected twice at weekly intervals. Here, these vaccinations were carried out by injecting a total volume of 200 μl of PBS into each skin (id) in both posterior abdominal regions near the base of the tail (100 μl / per flank). The number of cells in the fusion product was listed per number of cells used in the dendritic cell-cancer cell fusion.

（Ｂ）
２回目の免疫後１０日で、脾臓細胞を各マウス群からプールした（３匹／群）。細胞（５×１０^６細胞／ウェル）をマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処置した癌細胞とともに、２０：１の比率で、２ｍｌのＴ細胞培養培地（ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％の熱非働化ＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μＭ２−メルカプトエタノールを含む）中で、５％ＣＯ_２中で、２４ウェル中において同時培養した。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を、５日目に採集し、これを標準的な４時間^５１Ｃｒ放出アッセイ中でエフェクター細胞として使用して、標的となる癌細胞に対してエフェクター細胞の細胞傷害性活性を試験した。手短には、標的となる癌細胞（１×１０^６細胞）を、２００μｌのＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳを補充）中で１００μ Ｃｉの^５１Ｃｒ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＢｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅＥｎｇｌａｎｄ）で３７℃で９０分間にわたり標識した。標識された標的細胞（１×１０^４細胞／ウェル）を、４時間にわたり、３７℃で９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｔ細胞培地２００μｌを充填し、種々のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比率で細胞が導入される）中でエフェクター細胞とインキュベートした。ついで、このプレートを遠心分離し、そして上清の放射能をＭｉｃｒｏＢｅｔａＴｒｉｌｕｘＳｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎＣｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて測定し、計数した。最大または自然の放出を、それぞれ、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００または培地単独でインキュベートしたサンプルからのカウントと定義した。細胞傷害性活性を、以下の式で算出した。
^５１Ｃｒの比放出の割合＝（放出の実験値−自然の放出）×１００／（最大放出−自然の放出）(B)
Ten days after the second immunization, spleen cells were pooled from each group of mice (3 / group). Cells (5 × 10 ⁶ cells / well) with cancer cells treated with mitomycin C (MMC) at a ratio of 20: 1 in 2 ml T cell culture medium (RPMI 1640 medium with 10% heat inactivated FBS, 100 units / well). co-cultured in 24 wells in 5% CO ₂ in ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 50 μM 2-mercaptoethanol). Cytotoxic T lymphocytes (CTL) were collected on day 5 and used as effector cells in a standard 4 hour ⁵¹ Cr release assay to produce effector cell cells against target cancer cells. Toxic activity was tested. Briefly, target cancer cells (1 × 10 ⁶ cells) were labeled with 100 μCi ⁵¹ Cr (Amersham Bioscience, Buckinghamshire England) for 90 minutes at 37 ° C. in 200 μl RPMI 1640 (supplemented with 10% FBS). did. Labeled target cells (1 × 10 ⁴ cells / well) are loaded into 96-well microtiter plates (200 μl T cell medium at 37 ° C. for 4 hours and cells at various effector / target (E / T) ratios. Were introduced) into the effector cells. The plate was then centrifuged and the supernatant radioactivity was measured and counted using a MicroBeta Trilux Scintillation Counter (Wallac, Gaitherburg, MD). Maximum or spontaneous release was defined as a count from a sample incubated with 2% Triton X-100 or medium alone, respectively. Cytotoxic activity was calculated by the following formula.
Ratio of specific release of ⁵¹ Cr = (experimental value of release−spontaneous release) × 100 / (maximum release−spontaneous release)

アッセイを、二連で行った。すべてのアッセイの自然の放出は、最大放出の２０％未満であった。 The assay was performed in duplicate. The spontaneous release of all assays was less than 20% of the maximum release.

結果を図３Ａ〜図３Ｃに示す。非融合群に比べて強いＣＴＬ誘導をみた。さらに腫瘍免疫を強めるためにアジュバンドとしてＣｐＧを用いたがこれによってさらに強いインターフェロンγの分泌とＣＴＬ誘導をおこした。 The results are shown in FIGS. 3A to 3C. Strong CTL induction was seen compared to the non-fusion group. In order to further enhance tumor immunity, CpG was used as an adjuvant, which caused stronger secretion of interferon γ and induction of CTL.

（実施例４：腫瘍増殖抑制能）
実施例１で作製した融合細胞とＣｐＧ投与を１週間隔で２回行ってから１０日後に１０万個のメラノーマ細胞を反体側の皮内に接種し腫瘍の増殖を調べた。(Example 4: Tumor growth inhibitory ability)
Ten days after the administration of the fused cells prepared in Example 1 and CpG twice at weekly intervals, 100,000 melanoma cells were inoculated intradermally and examined for tumor growth.

その手順を以下に示す。２回目のワクチン接種の後１０日で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０^５細胞のＢ１６ＢＬ６を皮下（ｓｃ）注射することによってチャレンジした。ＢＡＬＢ／ｃマウスには、１×１０^５細胞のＲＥＮＣＡ細胞を２回のワクチン接種した部位とは異なるが近位の背中の部位に注射した。腫瘍接種によるチャレンジの後、マウスを、毎日モニターし、そして癌の発生率は、腫瘍の長さが３ｍｍを超えたときに陽性とみなした。腫瘍サイズは、盲検法により１日おきにノギスで測定した。腫瘍の体積は、以下の式で算出した。The procedure is shown below. Ten days after the second vaccination, C57BL / 6 mice were challenged by subcutaneous (sc) injection of 1 × 10 ⁵ cells of B16BL6. BALB / c mice were injected with 1 × 10 ⁵ RENCA cells at the site of the proximal back, different from the two vaccinated sites. After challenge by tumor inoculation, mice were monitored daily and the incidence of cancer was considered positive when the tumor length exceeded 3 mm. Tumor size was measured with a vernier caliper every other day in a blinded manner. Tumor volume was calculated by the following formula.

腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長さ×幅^２／２。Tumor volume ^(mm 3) = length × width ^2/2.

マウスは、潰瘍化した場合またはサイズが４０００ｍｍ^３を超えた場合に安楽死させた。腫瘍接種後６０日後、腫瘍のないＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＢＡＬＢ／ｃマウスに、再度、５×１０^４細胞のＥＬ４または１×１０^５細胞のＲＥＮＣＡ細胞、および５×１０^４ＣＴ２６細胞をそれぞれ背中に皮下注射によりチャレンジして、インビボでのワクチン接種の腫瘍特異性を明確にした。その詳細は、以下の表１に示す。Mice were euthanized when ulcerated or when the size exceeded 4000 mm ³ . Sixty days after tumor inoculation, tumor-free C57BL / 6 mice or BALB / c mice were again backed with 5 × 10 ⁴ cells EL4 or 1 × 10 ⁵ RENCA cells and 5 × 10 ⁴ CT26 cells, respectively. Challenged by subcutaneous injection to clarify the tumor specificity of vaccination in vivo. The details are shown in Table 1 below.

表１は、腫瘍拒絶マウスの対する腫瘍の再接種実験を示す。２つの異なる腫瘍モデルにおける第一の腫瘍チャレンジに対して腫瘍がなかったマウスに対して、再度、同じ腫瘍細胞または別の同系腫瘍細胞でチャレンジした。マウスを、１×１０^５細胞のＢ１６ＢＬ６細胞またはＲＥＮＣＡ細胞で、あるいは５×１０^４細胞のＥＬ４細胞またはＣＴ２６細胞で皮下チャレンジした。６０日目の腫瘍のないマウスの数の比は、腫瘍細胞で一回目にチャレンジされたマウスまたは再度チャレンジされたマウスの数であり、そしてその割合を上記表に示す。融合細胞およびＣｐＧでの免疫によって、同じ細胞（Ｂ１６ＢＬ６およびＲＥＮＣＡ）での再度のチャレンジに対して完全な保護を与えたが、別の同系腫瘍細胞（ＥＬ４およびＣＴ２６）では、完全ではなかった。融合細胞での免疫単独でも、同じ腫瘍細胞（ＲＥＮＣＡ）での再度の腫瘍チャレンジに対して保護を与えたが、完全ではなかった。これらの実験を再度２回繰り返したところ、ほとんど同じ結果を与えた。

Table 1 shows tumor re-inoculation experiments for tumor-rejected mice. Mice that had no tumor for the first tumor challenge in two different tumor models were again challenged with the same or another syngeneic tumor cell. Mice were challenged subcutaneously with 1 × 10 ⁵ B16BL6 cells or RENCA cells, or 5 × 10 ⁴ EL4 cells or CT26 cells. The ratio of the number of tumor-free mice on day 60 is the number of mice challenged or re-challenged with tumor cells the first time, and the percentage is shown in the table above. Immunization with fusion cells and CpG gave complete protection against re-challenge with the same cells (B16BL6 and RENCA), but not with other syngeneic tumor cells (EL4 and CT26). Immunization with fusion cells alone provided protection against recurrent tumor challenge with the same tumor cells (RENCA), but was not complete. These experiments were repeated twice again, giving almost the same results.

図４にその結果を示す。腫瘍体積を図４Ａに示す。図４Ｂに示すマウス生存率でも図４Ｃに示す腫瘍なしマウスの割合で、融合細胞の効果が観察され、融合細胞とＣｐＧとの組み合わせが最も効果的であった。 FIG. 4 shows the result. Tumor volume is shown in FIG. 4A. In the mouse survival rate shown in FIG. 4B, the effect of the fusion cell was observed in the ratio of the tumor-free mouse shown in FIG. 4C, and the combination of the fusion cell and CpG was most effective.

図５Ａ〜図５Ｄにさらなる結果を示す。メラノーマは腫瘍関連抗原が既知だが、腫瘍関連抗原が未同定の腎癌細胞（ＲＥＮＣＡ）を用いてワクチン効果を見たところ、融合細胞の効果が観察され、融合細胞とＣｐＧの併用が最も効果的であった。 Further results are shown in FIGS. 5A-5D. Melanoma has a known tumor-associated antigen, but when the vaccine effect was observed using renal cancer cells (RENCA) for which the tumor-associated antigen was not identified, the effect of the fused cell was observed, and the combined use of the fused cell and CpG was most effective. Met.

（実施例５：自然転移モデルにおける効果）
次に、本発明のワクチンによる癌の転移の抑制効果を実証した。ワクチン接種後にメラノーマの自然転移モデルを作製し、転移抑制効果を観察した。その手順を以下に示す。(Example 5: Effect in natural transition model)
Next, the suppressive effect of cancer metastasis by the vaccine of the present invention was demonstrated. After vaccination, a model of natural metastasis of melanoma was prepared and the effect of inhibiting metastasis was observed. The procedure is shown below.

２回目のワクチン接種後１０日で、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８マウス／群）に、５０μｌのＰＢＳ中に懸濁した５×１０^５細胞のＢ１６ＢＬ６細胞を右の後足蹠に皮下（ｓｃ）注射して、原発性腫瘍増殖を開始させた。Ten days after the second vaccination, C57BL / 6 mice (8 mice / group) were injected subcutaneously (sc) with 5 × 10 ⁵ B16BL6 cells suspended in 50 μl PBS into the right hind footpad. To initiate primary tumor growth.

腫瘍接種後２１日目に、１０ｍｍを超えたことを測定した後、原発性腫瘍を、右の臀部関節離開により外科的に取り除き、そのとき、局所的に排出性の膝窩および鼠径部のリンパ節を取り除いた。すべてのマウスを、手術後２１日で安楽死させ、そして肺をボーインズ溶液（Ｓｉｇｍａ）で固定した。肺転移の数を、解剖顕微鏡を用いて計数した。 After measuring over 10 mm on day 21 after tumor inoculation, the primary tumor was surgically removed by dissection of the right groin joint, at which time locally draining popliteal and inguinal lymph Removed the knot. All mice were euthanized 21 days after surgery and the lungs were fixed with Boynes solution (Sigma). The number of lung metastases was counted using a dissecting microscope.

結果を図６に示す。融合細胞を用いることによって、転移が有意に抑制された。また、融合細胞とＣｐＧの併用により肺転移がより効率的に抑制された。 The results are shown in FIG. Metastasis was significantly suppressed by using fused cells. Moreover, lung metastasis was more efficiently suppressed by the combined use of fused cells and CpG.

（実施例６：他の疾患モデルでの実証＝癌以外のモデル）
次に、癌以外の疾患モデルで、本発明が効果があるかどうかを確認する。細胞に病原ウイルス（例えば、ＨＩＶ）または病原細菌（例えば、結核菌）を感染させる。この細胞をγ線照射して殺傷する。殺傷された細胞と、樹状細胞とを、ＨＶＪで融合させ、ＣｐＧを用いて免疫を活性化させる。手順は、原則として、実施例１に従う。このようにして、ウイルス感染または細菌感染に対して有効なワクチンを作製することができる。このようにして作製した融合細胞を実施例２〜５に記載のような手順により効果を確認する。細菌およびウイルスでも同様に細胞ワクチン作製に使用することができることが理解される。(Example 6: Demonstration in other disease models = model other than cancer)
Next, it is confirmed whether the present invention is effective in disease models other than cancer. Cells are infected with pathogenic viruses (eg, HIV) or pathogenic bacteria (eg, Mycobacterium tuberculosis). These cells are killed by gamma irradiation. The killed cells and dendritic cells are fused with HVJ and immunity is activated using CpG. The procedure is in principle according to Example 1. In this way, an effective vaccine against viral or bacterial infection can be made. The effect is confirmed by the procedure as described in Examples 2 to 5 for the fused cells thus prepared. It will be appreciated that bacteria and viruses can be used to make cellular vaccines as well.

（実施例７：他の抗原提示細胞での実証＝マクロファージの場合）
他の抗原提示細胞としてマクロファージを用いて、同様のワクチン効果があるかどうかを確認する。マクロファージは、ＨＶＪで融合されることが知られていることから、実施例１に示される手順に従い、樹状細胞に代えてマクロファージを用いて融合細胞を作製する。このようにして作製した融合細胞を実施例２〜５に記載のような手順により効果を確認する。マクロファージでも同様に細胞ワクチン作製に使用することができることが理解される。(Example 7: Demonstration with other antigen-presenting cells = macrophages)
Macrophages are used as other antigen-presenting cells to confirm whether there is a similar vaccine effect. Since macrophages are known to be fused with HVJ, fused cells are prepared using macrophages instead of dendritic cells according to the procedure shown in Example 1. The effect is confirmed by the procedure as described in Examples 2 to 5 for the fused cells thus prepared. It will be appreciated that macrophages can be used for cell vaccine production as well.

（比較例１：ポリエチレングリコールおよびエレクトロポレーションでの融合細胞）
比較対照として、ポリエチレングリコールおよびエレクトロポレーションを用いて融合細胞を作製した。(Comparative Example 1: Fusion cells by polyethylene glycol and electroporation)
As a comparative control, fused cells were prepared using polyethylene glycol and electroporation.

ポリエチレングリコールを用いて特許文献１に記載のように樹状細胞とメラノーマ細胞とを（実施例１に記載のように調製）融合させた。しかし、融合効率は５％未満であった。治療効果は観察されなかった。 Dendritic cells and melanoma cells were fused (prepared as described in Example 1) using polyethylene glycol as described in US Pat. However, the fusion efficiency was less than 5%. No therapeutic effect was observed.

エレクトロポレーション法では、条件設定が困難である。これまでに生存率が２０％を以上となったことはない。従って、治療効果は満足いくものでないことが予期される。 It is difficult to set conditions in the electroporation method. To date, the survival rate has never exceeded 20%. Therefore, it is expected that the therapeutic effect is not satisfactory.

本発明は、抗原を特定せずに、その抗原に関連する疾患を処置または予防することができるという有用性を有する。従って、本発明は、そのような処置または予防に使用することができるワクチンおよび関連する有用性を提供する。 The present invention has the utility that a disease associated with an antigen can be treated or prevented without specifying the antigen. Thus, the present invention provides vaccines and related utilities that can be used for such treatment or prevention.

Claims

抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞との融合細胞。A fusion cell of an antigen presenting cell and at least one immunoreactive donor cell.

前記抗原提示細胞は、自己細胞である、請求項１に記載の融合細胞。The fusion cell according to claim 1, wherein the antigen-presenting cell is an autologous cell.

前記抗原提示細胞は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ；ＤＣ）、Ｂ細胞、マクロファージ細胞またはそれらの前駆細胞である、請求項１に記載の融合細胞。The fusion cell according to claim 1, wherein the antigen-presenting cell is a dendritic cell (DC), a B cell, a macrophage cell, or a progenitor cell thereof.

前記抗原提示細胞は、樹状細胞またはその前駆細胞である、請求項１に記載の融合細胞。The fusion cell according to claim 1, wherein the antigen-presenting cell is a dendritic cell or a precursor cell thereof.

前記免疫反応性供給細胞は、正常細胞、癌細胞または異種細胞である、請求項１に記載の融合細胞。The fusion cell according to claim 1, wherein the immunoreactive donor cell is a normal cell, a cancer cell or a heterologous cell.

前記免疫反応性供給細胞は、癌細胞である、請求項１に記載の融合細胞。The fusion cell according to claim 1, wherein the immunoreactive donor cell is a cancer cell.

前記免疫反応性供給細胞は、メラノーマ細胞、腎癌細胞、大腸癌細胞、肝がん細胞、肺癌細胞、子宮頸癌細胞、膵癌細胞、脳腫瘍細胞および舌癌細胞から選択される癌細胞を含む、請求項１に記載の融合細胞。The immunoreactive donor cells include cancer cells selected from melanoma cells, renal cancer cells, colon cancer cells, liver cancer cells, lung cancer cells, cervical cancer cells, pancreatic cancer cells, brain tumor cells and tongue cancer cells, The fused cell according to claim 1.

前記免疫反応性供給細胞は、不活化されたことを特徴とする、請求項１に記載の融合細胞。The fused cell according to claim 1, wherein the immunoreactive donor cell is inactivated.

前記免疫反応性供給細胞は、Ｘ線照射を受けたことを特徴とする、請求項１に記載の融合細胞。The fused cell according to claim 1, wherein the immunoreactive donor cell has received X-ray irradiation.

前記免疫反応性供給細胞は、自己細胞である、請求項１に記載の融合細胞。The fusion cell of claim 1, wherein the immunoreactive donor cell is an autologous cell.

前記免疫反応性供給細胞は、腫瘍特異的抗原を提示するかまたはその能力を有する、請求項１に記載の融合細胞。2. The fused cell of claim 1, wherein the immunoreactive donor cell presents or has the ability to present a tumor specific antigen.

前記融合細胞は、ウイルスまたはその一部によって融合される、請求項１に記載の融合細胞。The fused cell according to claim 1, wherein the fused cell is fused by a virus or a part thereof.

前記融合細胞は、不活化ウイルスまたはその一部によって融合される、請求項１に記載の融合細胞。The fused cell according to claim 1, wherein the fused cell is fused by an inactivated virus or a part thereof.

前記融合細胞は、不活化ＨＶＪまたはその一部によって融合される、請求項１に記載の融合細胞。The fused cell according to claim 1, wherein the fused cell is fused by inactivated HVJ or a part thereof.

前記ウイルスは、アルキル化剤または紫外線によって不活化される、請求項１に記載の融合細胞。The fused cell according to claim 1, wherein the virus is inactivated by an alkylating agent or ultraviolet light.

前記抗原提示細胞の細胞表面マーカーを有する、請求項１に記載の融合細胞。The fused cell according to claim 1, which has a cell surface marker of the antigen-presenting cell.

前記抗原提示細胞に由来する、ＣＤ１、ＣＤ１１ｃ（インテグリンαＸ）、ＣＤ４０、ＣＤ５８（ＬＦＡ−３）、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１２３（抗ＩＬ−３Ｒａ）、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ１４８、ＣＤ１５７，ＣＤ８０、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを有する、請求項１に記載の融合細胞。CD1, CD11c (integrin αX), CD40, CD58 (LFA-3), CD86, HLA-DR, CD123 (anti-IL-3Ra), CD21, CD23, CD148, CD157, CD80, MHC derived from the antigen-presenting cells The fused cell of claim 1 having at least one cell surface marker selected from the group consisting of class I and MHC class II.

細胞表面マーカーとして、少なくともＣＤ１１ｃを含む、請求項１に記載の融合細胞。The fused cell according to claim 1, comprising at least CD11c as a cell surface marker.

前記免疫反応性供給細胞の細胞表面マーカーを有する、請求項１に記載の融合細胞。The fused cell according to claim 1, which has a cell surface marker of the immunoreactive donor cell.

前記免疫反応性供給細胞に由来する、オンコジーン産物、胚性タンパク質、ウイルスタンパク質、組織特異的抗原、変異した腫瘍サプレッサータンパク質およびイディオタイプエピトープからなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを有する、請求項１に記載の融合細胞。Having at least one cell surface marker selected from the group consisting of an oncogene product, an embryonic protein, a viral protein, a tissue-specific antigen, a mutated tumor suppressor protein and an idiotype epitope derived from said immunoreactive donor cell, The fused cell according to claim 1.

抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞との融合細胞を含む、薬学的組成物。A pharmaceutical composition comprising a fusion cell of an antigen presenting cell and at least one immunoreactive donor cell.

前記融合細胞は、前記薬学的組成物において含まれる細胞中少なくとも６％を構成する、請求項２１に記載の薬学的組成物。The pharmaceutical composition according to claim 21, wherein the fused cells constitute at least 6% of the cells contained in the pharmaceutical composition.

前記融合細胞は、前記薬学的組成物において含まれる細胞中少なくとも１０％を構成する、請求項２１に記載の薬学的組成物。The pharmaceutical composition according to claim 21, wherein the fused cells constitute at least 10% of the cells contained in the pharmaceutical composition.

前記融合細胞は、前記薬学的組成物において含まれる細胞中少なくとも２０％を構成する、請求項２１に記載の薬学的組成物。The pharmaceutical composition according to claim 21, wherein the fused cells constitute at least 20% of the cells contained in the pharmaceutical composition.

前記融合細胞は、前記薬学的組成物において含まれる細胞中少なくとも２５％を構成する、請求項２１に記載の薬学的組成物。The pharmaceutical composition according to claim 21, wherein the fused cells constitute at least 25% of the cells contained in the pharmaceutical composition.

前記融合細胞は、請求項２〜２０のいずれか１項に記載の特徴を有する、請求項２１に記載の薬学的組成物。22. The pharmaceutical composition according to claim 21, wherein the fused cell has the characteristics of any one of claims 2-20.

さらに、アジュバントを含む、請求項２１に記載の薬学的組成物。The pharmaceutical composition according to claim 21, further comprising an adjuvant.

前記アジュバントは、水酸化アルミニウムゲル、明礬、ＣｐＧ、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、百日咳加熱死菌、リポ多糖、ムラミルペプチドおよびデンプンベントナイトからなる群より選択される、請求項２６に記載の薬学的組成物。27. The adjuvant of claim 26, wherein the adjuvant is selected from the group consisting of aluminum hydroxide gel, alum, CpG, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, pertussis heat killed bacteria, lipopolysaccharide, muramyl peptide and starch bentonite. Pharmaceutical composition.

前記アジュバントは、ＣｐＧを含む、請求項２６に記載の薬学的組成物。27. The pharmaceutical composition of claim 26, wherein the adjuvant comprises CpG.

抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞と、アジュバントとを含む、薬学的組成物。A pharmaceutical composition comprising antigen presenting cells, at least one immunoreactive donor cell, and an adjuvant.

前記アジュバントは、水酸化アルミニウムゲル、明礬、ＣｐＧ、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、百日咳加熱死菌、リポ多糖、ムラミルペプチドおよびデンプンベントナイトからなる群より選択される、請求項３０に記載の薬学的組成物。31. The adjuvant of claim 30, wherein the adjuvant is selected from the group consisting of aluminum hydroxide gel, alum, CpG, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, pertussis heat killed bacteria, lipopolysaccharide, muramyl peptide and starch bentonite. Pharmaceutical composition.

抗原提示細胞と、
少なくとも１種の免疫反応性供給細胞と、
ウイルスまたはその一部と、
を含む、該免疫反応性供給細胞に起因する疾患を処置または予防するためのキット。Antigen-presenting cells;
At least one immunoreactive donor cell;
A virus or part of it,
A kit for treating or preventing a disease caused by the immunoreactive donor cell.

前記抗原提示細胞は、自己細胞である、請求項３２に記載のキット。The kit according to claim 32, wherein the antigen-presenting cell is an autologous cell.

前記抗原提示細胞は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ；ＤＣ）、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、またはそれらの前駆細胞である、請求項３２に記載のキット。The kit according to claim 32, wherein the antigen-presenting cell is a dendritic cell (DC), a B cell, a macrophage cell, or a progenitor cell thereof.

前記抗原提示細胞は、樹状細胞またはその前駆細胞である、請求項３２に記載のキット。The kit according to claim 32, wherein the antigen-presenting cell is a dendritic cell or a precursor cell thereof.

前記抗原提示細胞は、ＣＤ１、ＣＤ１１ｃ（インテグリンαＸ）、ＣＤ４０、ＣＤ５８（ＬＦＡ−３）、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１２３（抗ＩＬ−３Ｒａ）、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ１４８、ＣＤ１５７，ＣＤ８０、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩからなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを有する、請求項３２に記載のキット。The antigen-presenting cells are CD1, CD11c (integrin αX), CD40, CD58 (LFA-3), CD86, HLA-DR, CD123 (anti-IL-3Ra), CD21, CD23, CD148, CD157, CD80, MHC class I 35. The kit of claim 32, having at least one cell surface marker selected from the group consisting of: and MHC class II.

前記抗原提示細胞は、細胞表面マーカーとして、少なくともＣＤ１１ｃを含む、請求項３２に記載のキット。The kit according to claim 32, wherein the antigen-presenting cell contains at least CD11c as a cell surface marker.

前記免疫反応性供給細胞は、正常細胞、癌細胞または異種細胞である、請求項３２に記載のキット。33. The kit of claim 32, wherein the immunoreactive donor cell is a normal cell, a cancer cell or a heterologous cell.

前記免疫反応性供給細胞は、癌細胞である、請求項３２に記載のキット。33. The kit of claim 32, wherein the immunoreactive donor cell is a cancer cell.

前記免疫反応性供給細胞は、メラノーマ細胞、腎癌細胞、大腸癌細胞、肝がん細胞、肺癌細胞、子宮頸癌細胞、膵癌細胞、脳腫瘍細胞および舌癌細胞から選択される癌細胞を含む、請求項３２に記載のキット。The immunoreactive donor cells include cancer cells selected from melanoma cells, renal cancer cells, colon cancer cells, liver cancer cells, lung cancer cells, cervical cancer cells, pancreatic cancer cells, brain tumor cells and tongue cancer cells, The kit according to claim 32.

前記免疫反応性供給細胞と、前記抗原提示細胞とは、前記ウイルスまたはその一部によって融合されて提供される、請求項３２に記載のキット。The kit according to claim 32, wherein the immunoreactive donor cell and the antigen-presenting cell are provided fused with the virus or a part thereof.

前記免疫反応性供給細胞は、不活化されたことを特徴とする、請求項３２に記載のキット。The kit according to claim 32, wherein the immunoreactive donor cells are inactivated.

前記免疫反応性供給細胞は、Ｘ線照射を受けたことを特徴とする、請求項３２に記載のキット。The kit according to claim 32, wherein the immunoreactive supply cells have been subjected to X-ray irradiation.

前記免疫反応性供給細胞は、自己細胞である、請求項３２に記載のキット。33. The kit of claim 32, wherein the immunoreactive donor cell is an autologous cell.

前記免疫反応性供給細胞は、腫瘍特異的抗原を提示するかまたはその能力を有する、請求項３２に記載のキット。33. The kit of claim 32, wherein the immunoreactive donor cell presents or has the ability to present a tumor specific antigen.

前記免疫反応性供給細胞は、オンコジーン産物、胚性タンパク質、ウイルスタンパク質、組織特異的抗原、変異した腫瘍サプレッサータンパク質およびイディオタイプエピトープからなる群より選択される少なくとも１つの細胞表面マーカーを有する、請求項３２に記載のキット。The immunoreactive donor cell has at least one cell surface marker selected from the group consisting of an oncogene product, an embryonic protein, a viral protein, a tissue-specific antigen, a mutated tumor suppressor protein and an idiotype epitope. The kit according to 32.

前記ウイルスは、不活化ウイルスを含む、請求項３２に記載のキット。The kit of claim 32, wherein the virus comprises an inactivated virus.

前記ウイルスは、不活化ＨＶＪを含む、請求項３２に記載のキット。33. The kit of claim 32, wherein the virus comprises inactivated HVJ.

前記ウイルスは、アルキル化剤または紫外線によって不活化される、請求項３２に記載のキット。33. The kit of claim 32, wherein the virus is inactivated by an alkylating agent or ultraviolet light.

前記ウイルスまたはその一部を、前記免疫反応性供給細胞と、前記抗原提示細胞と融合することを指示する指示書をさらに備える、請求項３２に記載のキット。33. The kit of claim 32, further comprising instructions for instructing the virus or part thereof to fuse with the immunoreactive donor cells and the antigen presenting cells.

以下の工程：
Ａ）抗原提示細胞および少なくとも１種の免疫反応性供給細胞を提供する工程；および
Ｂ）該抗原提示細胞と該少なくとも１種の免疫反応性供給細胞と、ウイルスまたはその一部とを混合する工程、
を包含する、融合細胞の製造方法。The following steps:
A) providing an antigen presenting cell and at least one immunoreactive donor cell; and B) mixing the antigen presenting cell, the at least one immunoreactive donor cell, and a virus or a part thereof. ,
A method for producing a fused cell, comprising:

前記融合細胞が、前記免疫反応性供給細胞および前記抗原提示細胞の細胞表面マーカーを有することを確認する工程をさらに包含する、請求項５１に記載の方法。52. The method of claim 51 further comprising the step of confirming that the fused cell has a cell surface marker of the immunoreactive donor cell and the antigen presenting cell.

前記免疫反応性供給細胞を不活化する工程をさらに包含する、請求項５１に記載の方法。52. The method of claim 51, further comprising inactivating the immunoreactive donor cell.

さらなる細胞融合工程を包含する、請求項５１に記載の方法。52. The method of claim 51, comprising a further cell fusion step.

前記細胞融合工程は、ポリエチレングリコール方法およびエレクトロフュージョンからなる群より選択される方法を含む、請求項５４に記載の方法。55. The method of claim 54, wherein the cell fusion step comprises a method selected from the group consisting of a polyethylene glycol method and electrofusion.

抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞との融合細胞を、患者に投与する工程、を包含する、該免疫反応性供給細胞に起因する疾患、障害または状態を、処置または予防するための方法。Treating or preventing a disease, disorder or condition resulting from the immunoreactive donor cell comprising the step of administering to the patient a fusion cell of the antigen presenting cell and at least one immunoreactive donor cell Way for.

前記免疫反応性供給細胞は、正常細胞、癌細胞または異種細胞を含む、請求項５６に記載の方法。57. The method of claim 56, wherein the immunoreactive donor cell comprises a normal cell, a cancer cell or a heterologous cell.

前記免疫反応性供給細胞の抗原は未知である、請求項５６に記載の方法。57. The method of claim 56, wherein the antigen of the immunoreactive donor cell is unknown.

前記患者は、哺乳動物を含む、請求項５６に記載の方法。57. The method of claim 56, wherein the patient comprises a mammal.

前記患者は、ヒトを含む、請求項５６に記載の方法。57. The method of claim 56, wherein the patient comprises a human.

前記疾患、障害または状態は、癌、感染症および自己免疫疾患からなる群より選択される状態を含む、請求項５６に記載の方法。57. The method of claim 56, wherein the disease, disorder or condition comprises a condition selected from the group consisting of cancer, infectious diseases and autoimmune diseases.

前記疾患、障害または状態は、癌を含む、請求項５６に記載の方法。57. The method of claim 56, wherein the disease, disorder or condition comprises cancer.

前記疾患、障害または状態の予防のためである、請求項５６に記載の方法。57. The method of claim 56, for prevention of the disease, disorder or condition.

前記疾患、障害または状態の再発を防止するためである、請求項５６に記載の方法。57. The method of claim 56, for preventing recurrence of the disease, disorder or condition.

アジュバントがさらに投与される、請求項５６に記載の方法。57. The method of claim 56, wherein an adjuvant is further administered.

前記アジュバントは、水酸化アルミニウムゲル、明礬、ＣｐＧ、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、百日咳加熱死菌、リポ多糖、ムラミルペプチドおよびデンプンベントナイトからなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。57. The adjuvant of claim 56, wherein the adjuvant is selected from the group consisting of aluminum hydroxide gel, alum, CpG, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, pertussis heat killed bacteria, lipopolysaccharide, muramyl peptide, and starch bentonite. Method.

癌の転移を予防するためである、請求項５６に記載の方法。57. The method of claim 56, for preventing cancer metastasis.

以下の工程：
Ａ）疾患、障害または状態を同定する工程；
Ｂ）該疾患、障害または状態に関連する、免疫反応性供給細胞を同定する工程；
Ｃ）抗原提示細胞と、該免疫反応性供給細胞の少なくとも１種との融合細胞を提供する工程；および
Ｄ）該融合細胞を患者に投与する工程、
を包含する、該免疫反応性供給細胞に起因する疾患、障害または状態を、処置または予防するための方法。The following steps:
A) identifying a disease, disorder or condition;
B) identifying an immunoreactive donor cell associated with the disease, disorder or condition;
C) providing a fused cell of the antigen-presenting cell and at least one of the immunoreactive donor cells; and D) administering the fused cell to a patient;
A method for treating or preventing a disease, disorder or condition caused by said immunoreactive donor cell.

抗原提示細胞と、少なくとも１種の免疫反応性供給細胞との融合細胞の、該免疫反応性供給細胞に起因する疾患、障害または状態を、処置または予防するための医薬を製造する方法における、使用。Use of a fusion cell of an antigen-presenting cell and at least one immunoreactive donor cell in a method for producing a medicament for treating or preventing a disease, disorder or condition caused by the immunoreactive donor cell .