JPWO2005080977A1 - Skin irritation evaluation method - Google Patents

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Abstract

本発明は皮膚に適用する物質の皮膚に対する刺激性を予測するための、簡便な皮膚刺激性評価試験方法を提供し、この方法は皮膚構成培養細胞と被検体を接触させ、培養液中のサブスタンスＰ量を測定することを特徴とする、当該被検体の皮膚刺激感を予測するための、刺激性評価方法である。The present invention provides a simple skin irritation evaluation test method for predicting skin irritation of a substance to be applied to the skin, and this method comprises contacting a skin-constituting cultured cell with a subject, and a substance in the culture solution. A method for evaluating irritation for predicting a skin irritation feeling of the subject, characterized by measuring a P amount.

Description

本発明は、防腐剤、界面活性剤または有機酸などの外用剤に用いられる成分並びに外用剤の皮膚に対する刺激性を皮膚構成細胞を用いて予測する方法に関する。   The present invention relates to a component used in an external preparation such as a preservative, a surfactant or an organic acid, and a method for predicting irritation to the skin of the external preparation using skin constituent cells.

近年、敏感肌を訴える人が増加しており、敏感肌用の低刺激性化粧品や医薬品、医薬部外品が多数上市されている。現代生活における敏感肌の原因として、生活様式の変化(冷暖房による生活環境の乾燥化、食生活の変化など)、紫外線などの環境因子、また内面的な要因であるストレス等が考えられている。しかしながら敏感肌といっても、医療現場や化粧品業界で明確な定義付けがされているわけではなく、低刺激性化粧品や医薬品、医薬部外品については各供給者が独自に判断し、宣伝、販売しているのが実情である。   In recent years, an increasing number of people complain of sensitive skin, and many hypoallergenic cosmetics, pharmaceuticals and quasi-drugs for sensitive skin are on the market. Possible causes of sensitive skin in modern life include changes in lifestyle (drying of the living environment due to cooling and heating, changes in eating habits, etc.), environmental factors such as ultraviolet rays, and internal factors such as stress. However, even sensitive skin is not clearly defined in the medical field or in the cosmetics industry. For hypoallergenic cosmetics, pharmaceuticals, and quasi-drugs, each supplier makes their own judgments, The fact is that it sells.

従って、低刺激性商品として市販されているものであっても、刺激性が同程度であるとも言えず、消費者が望む刺激レベルの商品を選択できないのが現状である。   Therefore, even if the product is commercially available as a hypoallergenic product, it cannot be said that the stimuli are comparable, and it is not possible to select a product with the stimulation level desired by the consumer.

皮膚刺激には、スティンギング刺激と皮膚一次刺激と呼ばれるものがある。スティンギング刺激は、化粧料等の外用剤を皮膚に塗布した際に感じる「ヒリヒリ」、「ピリピリ」、「つっぱり感」や「かゆみ」といった感覚を皮膚に引き起こす刺激の総称で、この感覚は塗布後数分以内に生じ、炎症性の症状を伴わず、一過性に消失する。一方、皮膚一次刺激は、皮膚に炎症反応を引き起こす刺激で、この反応は塗布後数時間以内に生じ、通常紅斑や浮腫といった炎症性の症状を伴う。   Skin irritation includes so-called stinging irritation and primary skin irritation. Stinging stimulation is a general term for stimuli that cause the skin to feel tingling, tingling, tension, and itching when an external preparation such as cosmetics is applied to the skin. It occurs within minutes, and disappears transiently without inflammatory symptoms. On the other hand, primary skin irritation is an irritation that causes an inflammatory reaction in the skin. This reaction occurs within a few hours after application and is usually accompanied by inflammatory symptoms such as erythema and edema.

皮膚一次刺激は、モルモット、ウサギ、ヒトなどを対象とした皮膚パッチ試験等で確認できる。これに対して、スティンギング刺激は感覚刺激であるため、実験動物による評価は困難であり、刺激感評価はもっぱらヒトの感覚に基いて行われている。スティンギング刺激を評価するために行う試験をスティンギング試験といい、特に化粧料等の外用剤の刺激性を確認するために有用な試験であり、化粧料や外用剤の開発において汎用されている。しかし、これまでのスティンギング試験は被験者の主観的な感覚をスコアにするため、個人の感受性の違いや、季節による影響、さらに人種差等、種々の理由により客観性を欠き、十分に満足できるものではなかった。さらに、被験者の特定の部位に試験物質を塗布して測定する試験であるため、被験者数により１回の試験人数が制限されてしまうという欠点があった。従って、低刺激性についての統一的な判断基準となり得る客観的な評価を提供する、簡便なスティンギング試験に対する必要性が存在していた。   Primary skin irritation can be confirmed by a skin patch test for guinea pigs, rabbits, humans, and the like. On the other hand, since the sting stimulus is a sensory stimulus, it is difficult to evaluate by a laboratory animal, and the stimulus feeling evaluation is performed based on human senses. The test that is performed to evaluate stinging stimulation is called stinging test. It is a test that is especially useful for confirming the irritation of external preparations such as cosmetics, and is widely used in the development of cosmetics and external preparations. . However, the conventional sting test is based on the subjective sensation of the subject, so it is sufficiently satisfactory because it lacks objectivity due to various reasons such as differences in individual sensitivities, seasonal effects, and race differences. It was not a thing. Furthermore, since the test is performed by applying a test substance to a specific part of the subject, the number of subjects per test is limited by the number of subjects. Thus, there was a need for a simple stinging test that provides an objective assessment that can be a unified criterion for hypoallergenicity.

サブスタンスＰ(SP)は11個のアミノ酸からなる神経ペプチドで、一次知覚神経の神経伝達物質であり、主として痛覚情報伝達物質として知られている。サブスタンスＰは末梢神経に含有されており、神経終末から遊離され、放出されたサブスタンスＰは血管拡張や血漿蛋白の漏出をもたらしたり、紅斑や浮腫を形成したり、肥満細胞の脱顆粒を促進して、ヒスタミンやロイコトリエンなどを遊離させ、一次刺激を引き起こす要因ともなる。末梢神経は、主として真皮内において交感神経、および無髄知覚神経（Ｃ繊維）がネットワークを形成し、特に血管、毛嚢および汗腺周囲に存在している。この末梢神経の一部は、真皮から表皮に伸び、神経終末は基底層、有棘層などの表皮の各層にも見出されている。そして、これらの神経終末が、表皮細胞の構成細胞である表皮ケラチノサイト、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞と接着することも知られている（非特許文献１参照）。また、表皮ケラチノサイトが自らサブスタンスＰを産生し、オートクライン的に自身のサブスタンスP産生を亢進させることが報告されている（非特許文献２参照）が、その生理的な意義についてはほとんど知られていない。   Substance P (SP) is a neuropeptide consisting of 11 amino acids, is a neurotransmitter of primary sensory nerves, and is mainly known as a pain signal transmitter. Substance P is contained in peripheral nerves, released from nerve endings, and released Substance P causes vasodilation and plasma protein leakage, forms erythema and edema, and promotes degranulation of mast cells. In addition, histamine, leukotriene, etc. are liberated, causing primary stimulation. In the peripheral nerves, sympathetic nerves and unmyelinated sensory nerves (C fibers) form a network mainly in the dermis, and particularly exist around blood vessels, hair follicles and sweat glands. A part of this peripheral nerve extends from the dermis to the epidermis, and nerve endings are also found in each layer of the epidermis such as the basal layer and the spiny layer. It is also known that these nerve endings adhere to epidermal keratinocytes, melanocytes, and Langerhans cells, which are constituent cells of epidermal cells (see Non-Patent Document 1). In addition, it has been reported that epidermal keratinocytes themselves produce substance P and autocrinely enhance their own substance P production (see Non-Patent Document 2), but their physiological significance is almost known. Absent.

ところで、敏感肌の状態に共通する生理病理学的パターンが、皮膚におけるタキキニン、特にサブスタンスＰの放出能力の高さに関連していることが報告されている。さらに、サブスタンスＰアンタゴニストの使用により、敏感肌に対する予防および／または治療効果を得ることが出来ることや、表皮および真皮の神経終末から生じるタキキニンの放出原因となるカプサイシンを患者の皮膚に塗布する事により皮膚が敏感であるか否かを決定するための試験方法が知られている（特許文献１参照）。   By the way, it has been reported that a physiopathological pattern common to the state of sensitive skin is related to the high release ability of tachykinin, particularly substance P, in the skin. Furthermore, by using substance P antagonists, it is possible to obtain preventive and / or therapeutic effects on sensitive skin, and by applying capsaicin, which causes the release of tachykinins from the nerve endings of the epidermis and dermis, to the patient's skin. A test method for determining whether the skin is sensitive is known (see Patent Document 1).

また、一次刺激の評価方法であるパッチテストに代わる３次元的組織培養物を用いた被検体の刺激性試験評価方法が知られている（特許文献２参照）。   In addition, there is known a test method for evaluating the stimulus of a subject using a three-dimensional tissue culture instead of the patch test, which is a primary stimulus evaluation method (see Patent Document 2).

しかしながら、スティンギング試験（刺激感評価試験）の代替方法となる培養細胞を用いた試験方法は未だ知られていない。   However, a test method using cultured cells, which is an alternative method of the sting test (stimulation evaluation test), is not yet known.

特開平11-180879号公報Japanese Patent Laid-Open No. 11-180879 特開2003-240779号公報JP2003-240779 Nature 1993(363),159-163Nature 1993 (363), 159-163 Biochemical and Biophysical Research Communications 1999(263), 327-333Biochemical and Biophysical Research Communications 1999 (263), 327-333

本発明の目的は、皮膚に適用する物質の皮膚に対する刺激感を予測するための、簡便な皮膚刺激性評価試験方法を提供することにある。   An object of the present invention is to provide a simple skin irritation evaluation test method for predicting a skin irritation feeling of a substance applied to the skin.

かかる実情に鑑み、本発明者らは上記目的を達成するために検討を重ね、その過程で皮膚構成細胞から放出される神経ペプチド量、特にサブスタンスＰ量が被検体のスティンギング刺激性を予測するための指標となりうることを見出し、本発明を完成するに至った。   In view of such circumstances, the present inventors have repeatedly studied to achieve the above object, and the amount of neuropeptide released from the skin constituent cells in the process, particularly the amount of substance P predicts stinging irritation of the subject. As a result, the present invention has been completed.

従って、本発明は、皮膚構成培養細胞と被検体を接触させ、サブスタンスＰ量を測定することを特徴とする、当該被検体の皮膚刺激感を予測するための、刺激性評価方法を提供するものである。   Accordingly, the present invention provides an irritation evaluation method for predicting skin irritation of a subject, characterized in that the cultured skin cells are contacted with the subject and the substance P amount is measured. It is.

本発明の皮膚刺激性評価法(以下、「評価法」ともいう)は皮膚構成細胞から放出されたサブスタンスＰ量を指標に、簡便でかつ高感度に皮膚に対する刺激感を予測評価する全く新しい評価方法であり、スティンギング試験のin vitroでの代替試験方法を提供するものである。この試験方法ではヒトの感覚ではなく、皮膚培養細胞や皮膚組織を使用するため、客観的な結果を得ることができ再現性が高く、しかも容易に実施する事ができる。さらに、皮膚培養細胞や皮膚組織を使用するので、被験者を試験実施に必要な数だけ確保する必要がなく、試験回数が制限されることなく簡便にいつでも試験することができる。   The skin irritation evaluation method of the present invention (hereinafter also referred to as “evaluation method”) is a completely new evaluation that predicts and evaluates irritation to the skin easily and with high sensitivity using the amount of substance P released from skin constituent cells as an index. This method provides an in vitro alternative test method for the sting test. Since this test method uses skin cultured cells and skin tissue instead of human sensations, objective results can be obtained, high reproducibility, and easy implementation. Furthermore, since skin culture cells and skin tissue are used, it is not necessary to secure the number of subjects required for the test, and the test can be easily performed at any time without limiting the number of tests.

本発明の一つの態様では、まず、皮膚構成細胞を、例えば培養シャーレや培養プレートに入れ、さらに、栄養培養液を適量加え、通常用いる培養条件で培養する。次いで、培養液に被検体を添加する。添加後、設定された時間に培養上清を採取し、その培養上清中のサブスタンスＰの量を測定する。適当なスティンギング陽性対照を用いて被験体と同様に皮膚構成細胞を処理し、培養上清中のサブスタンスＰを測定する。次いで、サブスタンスＰの量を、スティンギング陽性対照を用いた場合と被検体を用いた場合で比較し、被検体の刺激性を評価する。本評価方法を行うことで、スティンギング刺激に関連する被検体のスクリーニングを的確かつ簡便に行うことが可能であり、スティンギング刺激陽性物質や製剤（特に外用剤）のスクリーニング方法として使用可能である。   In one embodiment of the present invention, first, skin constituent cells are placed in, for example, a culture dish or a culture plate, and an appropriate amount of a nutrient culture solution is added, followed by culturing under commonly used culture conditions. Next, the specimen is added to the culture solution. After the addition, the culture supernatant is collected at a set time, and the amount of substance P in the culture supernatant is measured. Skin constituent cells are treated in the same manner as the subject using an appropriate sting positive control, and the substance P in the culture supernatant is measured. Next, the amount of substance P is compared between the case where the stinging positive control is used and the case where the subject is used, and the irritation of the subject is evaluated. By performing this evaluation method, it is possible to accurately and easily screen specimens related to stinging stimulation, and it can be used as a screening method for stinging stimulation positive substances and preparations (especially external preparations). .

また、本発明の方法は、ヒトを用いたスティンギング刺激性評価方法によるスティンギング試験を行う前の一次スクリーニング方法として用いることもできる。前述したように、ヒトを被験者として用いるスティンギング刺激性評価方法は被験者数等の問題によりその試験回数が限られる。それゆえ、予め明らかに刺激陽性の被検体をインビボでの実験被検体から除外するための一次スクリーニング方法として、本発明の方法を用いることができる。これにより、安全性をより確実にした低刺激性製品の効率よい開発が可能となる。   The method of the present invention can also be used as a primary screening method before performing a sting test by a stinging irritation evaluation method using humans. As described above, the stinging stimulus evaluation method using a human as a subject has a limited number of tests due to problems such as the number of subjects. Therefore, the method of the present invention can be used as a primary screening method for excluding previously positively stimulated specimens from in vivo experimental specimens. This enables efficient development of hypoallergenic products that ensure safety.

本発明により評価できる被検体としては、広く皮膚に対して適用する物質や組成物であれば特に制限されないが、種々の防腐剤、香料、界面活性剤、色素、可溶化剤、ゲル化剤、増粘剤、乳化剤、油脂類、アミノ酸類、糖類、水溶性高分子、有機酸、基剤成分およびこれらを含有する組成物が挙げられる。ここで、界面活性剤としては、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤のいずれも挙げられる。また、当該組成物としては、種々の外用剤、例えば、化粧料、薬用外用剤、各種洗浄剤（洗剤、石鹸、頭髪用洗浄剤、液体洗浄剤）等が挙げられる。これらの被検体は精製水またはエタノールなどの適当な溶媒に溶解して用いることができる。添加する溶媒の量は細胞に対して毒性を示さない量であればよく、溶媒の種類によっても異なるが、培養液の20％以下、好ましくは10％以下の添加量が好ましい。   The analyte that can be evaluated according to the present invention is not particularly limited as long as it is a substance or composition that is widely applied to the skin, but various preservatives, fragrances, surfactants, pigments, solubilizers, gelling agents, Examples include thickeners, emulsifiers, fats and oils, amino acids, saccharides, water-soluble polymers, organic acids, base components, and compositions containing these. Here, examples of the surfactant include cationic surfactants, anionic surfactants, nonionic surfactants, and amphoteric surfactants. Examples of the composition include various external preparations such as cosmetics, external pharmaceutical preparations, and various cleaning agents (detergents, soaps, hair cleaning agents, liquid cleaning agents). These analytes can be used after being dissolved in a suitable solvent such as purified water or ethanol. The amount of the solvent to be added may be an amount that does not show toxicity to cells, and varies depending on the type of the solvent, but an addition amount of 20% or less, preferably 10% or less of the culture solution is preferable.

本発明で用いる皮膚構成細胞としては、皮膚を構成する細胞であればよく、表皮ケラチノサイト（表皮角化細胞）、皮膚線維芽細胞、ランゲルハンス細胞、メラノサイト、毛母細胞、毛乳頭細胞等が挙げられる。特に、外界からの刺激を受けやすい、皮膚の表皮部分を構成する細胞である皮膚表皮構成細胞（例えば、表皮ケラチノサイト、ランゲルハンス細胞、メラノサイト等）が好ましく、表皮ケラチノサイトが特に好ましい。皮膚構成細胞は、１種類でも良いし、複数を混ぜて使用してもよい。評価に用いる場合、皮膚構成細胞は、単層培養細胞でも多層培養細胞でもよく、また、複数の皮膚構成細胞からなる３次元培養皮膚でもよい。皮膚構成細胞は、ヒトやウサギ等の動物より採取されたものを用いることができるが、スティンギング試験の評価対象がヒトであることから、ヒト由来の細胞が好ましい。皮膚構成細胞としては、培養された細胞を用いることができ、また、皮膚組織から常法により調製してもよい。さらに、培養細胞として樹立している細胞を用いる事が好ましい。そのような培養細胞は当業者に既知の方法で樹立することができ、あるいは、市販品から入手可能である。表皮ケラチノサイトは培養細胞として市販されているものもあり、それらを容易に入手し得る。例えば、ヒト表皮ケラチノサイトの初代培養細胞や二次培養細胞、HaCaT keratinocyte株等が使用できる。市販の表皮ケラチノサイト培養細胞としては、例えば、Epidercell NHEK(F)、Epidercell NHEK(B) (ともに、クラボウ社製）などを用いることができる。また、３次元培養皮膚（モデル）の例として、TESTSKINTM（東洋紡）が挙げられる。The skin constituent cells used in the present invention may be cells constituting the skin, and include epidermal keratinocytes (epidermal keratinocytes), skin fibroblasts, Langerhans cells, melanocytes, hair matrix cells, hair papilla cells and the like. . In particular, skin epidermis constituent cells (for example, epidermis keratinocytes, Langerhans cells, melanocytes, etc.) that are susceptible to external stimuli and constituting the epidermis part of the skin are preferred, and epidermis keratinocytes are particularly preferred. One type of skin constituent cells may be used, or a plurality of cells may be used in combination. When used for evaluation, the skin constituent cells may be monolayer cultured cells or multilayer cultured cells, and may be three-dimensional cultured skin composed of a plurality of skin constituent cells. As the skin constituent cells, those collected from animals such as humans and rabbits can be used, but human-derived cells are preferred because the evaluation target of the sting test is human. As the skin constituent cells, cultured cells can be used, and they may be prepared from skin tissue by a conventional method. Furthermore, it is preferable to use established cells as cultured cells. Such cultured cells can be established by methods known to those skilled in the art or are commercially available. Some epidermal keratinocytes are commercially available as cultured cells and can be easily obtained. For example, primary and secondary cultured cells of human epidermal keratinocytes, HaCaT keratinocyte strains, etc. can be used. As commercially available epidermal keratinocyte cultured cells, for example, Epidercell NHEK (F), Epidercell NHEK (B) (both manufactured by Kurabo Industries, Inc.) and the like can be used. An example of the three-dimensional cultured skin (model) is TESTSKIN ™ (Toyobo).

試験に使用する皮膚構成細胞は通常の培養条件で適当な培地を用いて培養し、被検体の接触前までは生存しているものを用いることができ、サブコンフルエントとなったものを用いることが好ましい。培地としては、一般的に使用されている基本培地(塩類、アミノ酸、糖、ビタミンおよびその他の微量必須栄養素を混合した等浸透圧性pH平衡溶液)に適当な補助試薬(インスリン、上皮成長因子、ハイドロコーチゾン、ウシ脳下垂体抽出液など)または血清を加えたものを使用できる。市販の表皮ケラチノサイト培養液としては、KG-2(クラボウ社製)、K-110(極東製薬製)、EpiLifeTM(Cascade社製)等が使用できる。また、皮膚線維芽細胞を用いる場合には、培養細胞としてFibro cell(クラボウ社製)を、培地としてMedium 106S(クラボウ社製)を用いることができる。なお、市販の細胞や皮膚モデルを使用する場合には、原則として該細胞や皮膚モデルの使用説明書の指示に従えばよい。The skin constituent cells used in the test can be cultured in an appropriate culture medium under normal culture conditions, and can be used until they are in contact with the subject, and can be subconfluent. preferable. As a medium, an appropriate auxiliary reagent (insulin, epidermal growth factor, hydrolysate) is used in a commonly used basic medium (isoosmotic pH equilibration solution mixed with salts, amino acids, sugars, vitamins, and other trace essential nutrients). Cortisone, bovine pituitary extract, etc.) or serum can be used. As a commercially available epidermal keratinocyte culture solution, KG-2 (manufactured by Kurabo Industries), K-110 (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical), EpiLife ™ (manufactured by Cascade) and the like can be used. When skin fibroblasts are used, Fibro cell (manufactured by Kurabo Industries) can be used as the cultured cells, and Medium 106S (manufactured by Kurabo Industries) can be used as the culture medium. In addition, when using a commercially available cell or skin model, what is necessary is just to follow the instruction | indication of the instruction manual of this cell or skin model in principle.

被検体による皮膚構成細胞の処理は、例えば皮膚構成細胞を培養している培養液中に当該被検体を添加して培養することにより行うのが好ましい。培養液としては、細胞が生存できる液であればよく、培地、等張化された緩衝液、生理食塩水などを用いることができる。スティンギング刺激は塗布後数分以内に生じる刺激であるため、被検体と皮膚構成細胞の処理時間は0.5〜60分、好ましくは１〜30分、さらに好ましくは１〜10分、最も好ましくは１〜５分あればよい。ただし、場合により、上記よりも長時間または短時間処理することによっても本発明を実施することは可能である。
処理条件は細胞が死滅せず、培養液中にサブスタンスＰが放出される条件であれば、特に限定されないが、処理時の培養は、通常、室温から約40℃の範囲の温度、好ましくは約35〜40℃、３〜７％ CO2条件下、特に、37℃、５％CO2条件下が好ましい。処理後、直ちに培養上清を採取し、サブスタンスＰ量を測定する。The treatment of the skin constituent cells by the subject is preferably performed, for example, by adding the subject to the culture medium in which the skin constituent cells are cultured and culturing. The culture solution may be any solution that allows cells to survive, and a medium, isotonic buffer solution, physiological saline, and the like can be used. Since stinging stimulation occurs within a few minutes after application, the treatment time of the subject and the skin constituent cells is 0.5 to 60 minutes, preferably 1 to 30 minutes, more preferably 1 to 10 minutes, most preferably 1. There should be ~ 5 minutes. However, in some cases, the present invention can be carried out by processing for a longer time or a shorter time than the above.
The treatment conditions are not particularly limited as long as the cells do not die and substance P is released into the culture medium. The culture during the treatment is usually performed at a temperature in the range of room temperature to about 40 ° C., preferably about 35~40 ℃, 3~7% CO 2 conditions, in particular, 37 ℃, 5% CO 2 conditions are preferred. Immediately after the treatment, the culture supernatant is collected and the substance P amount is measured.

添加される被検体の濃度は、使用目的や被検体の種類により異なるが、通常、最終濃度として0.000001〜10重量％であることが好ましく、特に0.001〜１重量％が好ましい。一般的にいかなる化合物も高濃度であれば、細胞に対して毒性を含む何らかの作用を示すため、10重量％以上の濃度は好ましくない。また0.000001重量％未満の低濃度の場合は、使用される可能性が低く、また、製剤化も難しいため好ましくない。   The concentration of the analyte to be added varies depending on the purpose of use and the type of the analyte, but usually, the final concentration is preferably 0.000001 to 10% by weight, particularly preferably 0.001 to 1% by weight. In general, if any compound has a high concentration, a concentration of 10% by weight or more is not preferable because it exhibits some effect including toxicity to cells. A low concentration of less than 0.000001% by weight is not preferred because it is unlikely to be used and it is difficult to formulate it.

本発明においては、現在、化粧品や各種洗浄剤に用いられている化合物について、各種濃度で培養液中のサブスタンスＰ量について検討した結果、特に化合物の濃度が0.01〜１重量％の範囲におけるサブスタンスＰ量と、スティンギング刺激試験における刺激感評価とがよく相関することが明らかになった。従って、被検体として用いる化合物は、0.01〜１重量％の濃度範囲で試験することが特に好ましい。しかし、この濃度範囲は被検体として用いる化合物、試験に用いる皮膚構成細胞、目的製品の種類などに依存して変動し、限定的なものでない。   In the present invention, as a result of examining the amount of substance P in the culture solution at various concentrations for compounds currently used in cosmetics and various detergents, substance P in the range of 0.01 to 1% by weight of the compound in particular. It was clarified that the amount and the stimulation evaluation in the stinging stimulation test correlated well. Therefore, the compound used as the analyte is particularly preferably tested in a concentration range of 0.01 to 1% by weight. However, this concentration range varies depending on the compound used as the subject, the skin constituent cells used in the test, the type of the target product, and the like, and is not limited.

サブスタンスＰ量はサブスタンスＰのmRNA量や蛋白質量で表すことができるが、蛋白質を測定する方が再現性もよく、容易に測定できる。以降、サブスタンスＰ量と表した場合には、特に限定しない限り、サブスタンスＰそのものの量(蛋白質量)を測定している。サブスタンスＰ量を測定する場合、培養細胞等の処理が終了した後、直ちに培養上清を採取し、速やかに測定を開始することが好ましい。上清の採取から１時間以内、好ましくは数十分以内、より好ましくは３０分以内、さらに好ましくは1０分以内、なお好ましくは５分以内、特に好ましくは数分〜数秒以内に測定を開始する。操作に要する時間を考慮すると、通常、0.5分〜１時間以内、好ましくは、１〜30分以内、さらにより好ましくは、１〜10分以内、最も好ましくは、１〜５分以内に培養上清中のサブスタンスＰ量の測定を開始すればよい。測定方法としては特に制限されず、通常用いられる一般的な測定方法が使用される。   The amount of substance P can be expressed by the amount of mRNA or the amount of protein of substance P, but the protein is more reproducible and can be easily measured. Hereinafter, when expressed as the amount of substance P, the amount of substance P itself (protein mass) is measured unless specifically limited. When measuring the substance P amount, it is preferable to immediately collect the culture supernatant immediately after the treatment of the cultured cells and the like, and to start the measurement immediately. The measurement is started within 1 hour, preferably within tens of minutes, more preferably within 30 minutes, more preferably within 10 minutes, still more preferably within 5 minutes, particularly preferably within minutes to seconds after the supernatant is collected. . In consideration of the time required for the operation, the culture supernatant is usually within 0.5 minutes to 1 hour, preferably within 1 to 30 minutes, even more preferably within 1 to 10 minutes, and most preferably within 1 to 5 minutes. The measurement of the substance P amount in the medium may be started. The measurement method is not particularly limited, and a commonly used general measurement method is used.

サブスタンスＰ量は培養液上清中の量を直接測定してもよいが、例えば、ELISA法またはイムノクロマトグラフィー法などの抗体を用いることにより間接的に測定することもできる。サブスタンスＰを直接測定する方法としては、高速液体クロマトグラフィー等が挙げられるが、これに限定するわけではない。間接的に測定する方法としては、抗サブスタンスＰ抗体を用いた免疫学的測定方法が好ましく、通常使用される競合法やサンドイッチアッセイ法等が使用できるが、これに限定するわけではない。標識抗体としては、直接標識（金コロイド、蛍光物質などの標識）や酵素標識した抗体を用いることができる。測定に用いる抗体は市販されているものを用いるか、当業者に公知の方法で作製することができる。抗サブスタンスＰ抗体としては、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体を用いることができ、市販品として、サンタクルズ社またはザイメット社などから入手できる。また、サブスタンスＰ量測定キットとしては、市販のものを使用することができ、サブスタンスＰ ELISA(R&D Systems Inc.)、Substance P, EIA Kit(Cayman Chemical Company)やSubstance P, EIA High Sensitivity Kit (Peninsula Laboratories, Inc.)等が挙げられる。競合法を使用したELISA法によるサブスタンスＰ量の測定方法を例に挙げると、培養上清とサブスタンスＰ標準溶液を、適当量の抗ウサギポリクローナル抗体（ヤギ）をコートした96 Wellプレートに添加後、アルカリフォスファターゼ標識したサブスタンスＰ溶液を添加し、さらに抗サブスタンスＰポリクローナル抗体（ウサギ）を添加して室温で反応させる。２時間反応後、界面活性剤入りの洗浄液でプレートを十分に洗浄し、基質（pNPP:p-nitrophenyl phosphate）溶液を加え、室温で１時間反応後、TSP（trisodium phosphate）を加え反応を停止させた後、吸光度（405nm）を測定し、サブスタンスＰ標準溶液より得られた結果から作製した検量線を用いてサブスタンスＰ量を算出する。   The amount of substance P may be directly measured in the culture supernatant, but can also be indirectly measured by using an antibody such as ELISA or immunochromatography. Examples of the method for directly measuring substance P include high performance liquid chromatography and the like, but are not limited thereto. As an indirect measurement method, an immunological measurement method using an anti-substance P antibody is preferable, and a commonly used competition method or sandwich assay method can be used, but it is not limited thereto. As the labeled antibody, direct labeling (gold colloid, fluorescent substance labeling) or enzyme labeled antibody can be used. A commercially available antibody can be used for the measurement or can be prepared by a method known to those skilled in the art. As an anti-substance P antibody, a monoclonal antibody or a polyclonal antibody can be used, and it can be obtained as a commercial product from Santa Cruz or Zymet. Moreover, as a substance P amount measuring kit, a commercially available thing can be used, Substance P ELISA (R & D Systems Inc.), Substance P, EIA Kit (Cayman Chemical Company), Substance P, EIA High Sensitivity Kit (Peninsula). Laboratories, Inc.). As an example of a method for measuring substance P amount by ELISA using a competitive method, a culture supernatant and a substance P standard solution are added to a 96 well plate coated with an appropriate amount of anti-rabbit polyclonal antibody (goat), A substance P solution labeled with alkaline phosphatase is added, and an anti-substance P polyclonal antibody (rabbit) is further added and allowed to react at room temperature. After the reaction for 2 hours, the plate is thoroughly washed with a detergent-containing washing solution, a substrate (pNPP: p-nitrophenyl phosphate) solution is added, and after 1 hour of reaction at room temperature, the reaction is stopped by adding TSP (trisodium phosphate). Thereafter, the absorbance (405 nm) is measured, and the substance P amount is calculated using a calibration curve prepared from the results obtained from the substance P standard solution.

本発明の評価方法の具体的な態様の一例として、スティンギングを引き起こすことが知られている化合物を陽性対照として用いた試験系と、被検体を用いた試験系とで培地中のサブスタンスＰ量を比較する方法が挙げられる。この場合、被検体を用いた試験系の培地中のサブスタンスＰ量が、陽性対照を用いた試験系の培地中のサブスタンスＰ量と同等またはそれ以上であれば、被検体は皮膚に対するスティンギング刺激性を有すると判断される。しかし、場合によっては、被検体を用いた試験系の培地中のサブスタンスＰ量が、陽性対照を用いた試験系の培地中のサブスタンスＰ量の90％以上、80％以上、７0％以上、６0％以上、または50％以上で、被検体が皮膚に対してスティンギング刺激を有すると判断することもできる。この判断基準は試験目的、用いる陽性対照等に応じて、適宜、選択される。また、陽性対照としては、フェノキシエタノール、メチルパラベン、乳酸等を用いることができるが、試験目的、用いる培養細胞等に応じて、適宜、選択することができる。   As an example of a specific embodiment of the evaluation method of the present invention, the amount of substance P in the medium in a test system using a compound known to cause sting as a positive control and a test system using a test sample The method of comparing these is mentioned. In this case, if the amount of substance P in the medium of the test system using the subject is equal to or greater than the amount of substance P in the medium of the test system using the positive control, the subject is stinging stimulating to the skin. It is judged to have sex. However, in some cases, the amount of substance P in the medium of the test system using the subject is 90% or more, 80% or more, 70% or more, 60% of the substance P amount in the medium of the test system using the positive control. It can also be determined that the subject has a stinging stimulus to the skin at a percentage of 50% or more, or 50% or more. This criterion is appropriately selected according to the purpose of the test, the positive control used, and the like. As a positive control, phenoxyethanol, methylparaben, lactic acid, or the like can be used, and can be appropriately selected depending on the purpose of the test, the cultured cells to be used, and the like.

また、本発明の他の態様として、上記のような陽性対照を用いることなく、被検体を評価することができる。例えば、被検体を皮膚構成培養細胞等と接触させ、培地中に検出される細胞由来のサブスタンスＰ量を指標として、被験体のスティンギング刺激を評価することが可能である。この方法では、上記と同様にして皮膚構成培養細胞等を処理し、培養上清を採取し、上清中のサブスタンスＰ量を測定する。この態様に使用しうる細胞や皮膚モデル、培養条件、サブスタンスＰの測定および評価法等は実質上、前記と同様である。具体例として、正常ヒト表皮ケラチノサイトを用いる評価方法の場合、好ましくは、培養上清採取から５分後に該上清中に検出されたサブスタンスＰ量が約2.5pg/１×105細胞以上である場合にスティンギング刺激偽陽性、約10pg/１×105細胞以上である場合にスティンギング刺激陽性と判断できる。この態様の評価法は、ヒトでのスティンギング試験の前の一次スクリーニングとして特に有用である。カットオフ値は希望に応じて適宜設定できる。As another aspect of the present invention, a subject can be evaluated without using the positive control as described above. For example, the subject can be brought into contact with cultured skin cells and the like, and the stinging stimulus of the subject can be evaluated using the amount of cell-derived substance P detected in the medium as an index. In this method, cultured skin cells and the like are treated in the same manner as described above, the culture supernatant is collected, and the amount of substance P in the supernatant is measured. Cells and skin models, culture conditions, substance P measurement and evaluation methods, and the like that can be used in this embodiment are substantially the same as described above. As a specific example, in the case of the evaluation method using normal human epidermal keratinocytes, the amount of substance P detected in the supernatant after 5 minutes from the collection of the culture supernatant is preferably about 2.5 pg / 1 × 10 5 cells or more. In the case of stinging stimulus false positive, it can be judged as stinging stimulus positive when it is about 10 pg / 1 × 10 5 cells or more. The evaluation method of this embodiment is particularly useful as a primary screening before a human sting test. The cut-off value can be appropriately set as desired.

このようにして、本評価方法により、被検体による皮膚構成細胞におけるサブスタンスＰの放出量を指標とするスティンギング刺激の陽性物質または陽性製剤のスクリーニング方法が提供される。本発明の評価方法は従来の感覚的な判断手法に依存するものではなく、各被検体について客観的かつ定量的な評価を与えることができ、簡便なスクリーニング方法として有用である。   In this way, the present evaluation method provides a screening method for a positive substance or positive preparation for stinging stimulation using the amount of substance P released from skin constituent cells by the subject as an index. The evaluation method of the present invention does not depend on a conventional sensory judgment method, and can provide an objective and quantitative evaluation for each subject, which is useful as a simple screening method.

また、本発明は、被検体の皮膚刺激性を予測するための測定キットを提供する。このキットは、スティンギング刺激陽性物質と接触するとサブスタンスＰを放出する皮膚構成培養細胞等、およびサブスタンスＰの量を測定するための試薬を含む。サブスタンスＰの量を測定するための試薬としては、抗サブスタンスＰ抗体、標識化抗サブスタンスＰ抗体、標識化サブスタンスＰ（溶液）、対照標準として用いるための既知量のサブスタンスＰ等が挙げられるが、これらに限定されしない。さらに、陽性対照品として、フェノキシエタノール、メチルパラベン、乳酸等のスティンギング刺激陽性物質、好ましくはメチルパラベンを含むこともできる。具体的には、キット構成物として、表皮ケラチノサイトを播種した培養器、表皮ケラチノサイト用培養液、サブスタンスＰ量測定用試薬を含む。このサブスタンスＰ量測定用試薬は、例えば、サブスタンスＰ量測定用ELISA試薬である。さらに、このキットは陽性対照としてメチルパラベンを含んでも良い。本キットは、例えば、表皮ケラチノサイトを96Wellプレートに適当量播種して調製したプレートに、被検体を分散あるいは溶解させた培養液を添加して細胞を刺激し、一定時間後に培地上清中のサブスタンスＰ量をサブスタンスＰ量測定用ELISA試薬を用いて測定することで使用できる。
本発明の他の態様（比較対照を使用しない評価方法）に関する測定キットも上記に準じて構成することができるが、そのようなキットの構築方法は当業者に既知である。The present invention also provides a measurement kit for predicting skin irritation of a subject. This kit includes a skin-constituting cultured cell that releases substance P when it comes into contact with a stinging stimulus-positive substance, and a reagent for measuring the amount of substance P. Examples of the reagent for measuring the amount of substance P include anti-substance P antibody, labeled anti-substance P antibody, labeled substance P (solution), known amount of substance P for use as a reference standard, and the like. It is not limited to these. Further, as a positive control product, a stinging stimulus positive substance such as phenoxyethanol, methylparaben, and lactic acid, preferably methylparaben may be included. Specifically, the kit composition includes an incubator seeded with epidermal keratinocytes, a culture solution for epidermal keratinocytes, and a substance for measuring substance P amount. This substance P amount measuring reagent is, for example, a substance P amount measuring ELISA reagent. In addition, the kit may contain methyl paraben as a positive control. For example, this kit stimulates cells by adding a culture solution in which a specimen is dispersed or dissolved to a plate prepared by inoculating an appropriate amount of epidermal keratinocytes on a 96-well plate. After a certain period of time, the substance in the medium supernatant is stimulated. It can be used by measuring the amount of P using an ELISA reagent for substance P amount measurement.
Measurement kits relating to other embodiments of the present invention (evaluation methods that do not use comparative controls) can also be constructed in accordance with the above, but methods for constructing such kits are known to those skilled in the art.

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

実施例１ サブスタンスＰ量の測定およびその量とスティンギング刺激との相関
サブスタンスＰ量はELISA法により測定した。2×105cells/wellとなるよう、正常ヒト表皮ケラチノサイト（Epidercell NHEK(B)）を24Wellプレートに播種し、表皮ケラチノサイト用培地KG-２（クラボウ社製）１mlを用いて37℃、５％ CO2下で培養した。サブコンフルエントとなった時点で培地交換し、ウェル内で所定の最終濃度になるように調製した各被検体試料を10μlずつ添加した。その５分後および10分後に培養上清を回収した。回収した培養上清中のサブスタンスＰをサブスタンスＰ ELISA（R&D Systems Inc.製）により定量した。その後、通常の方法により各ウェルの細胞数を測定した。その結果を表１に示す。被検体として、フェノキシエタノールおよびメチルパラベンを用いた。フェノキシエタノールおよびメチルパラベンの刺激はスティンギング刺激であることが知られている。Example 1 Measurement of substance P amount and correlation between the amount and sting stimulus The substance P amount was measured by ELISA. Normal human epidermal keratinocytes (Epidercell NHEK (B)) are seeded on a 24-well plate so that the concentration is 2 × 10 5 cells / well. CO 2 and cultured under. When the medium became subconfluent, the medium was changed, and 10 μl of each specimen sample prepared so as to have a predetermined final concentration in the well was added. The culture supernatant was collected 5 minutes and 10 minutes later. Substance P in the collected culture supernatant was quantified by substance P ELISA (manufactured by R & D Systems Inc.). Thereafter, the number of cells in each well was measured by an ordinary method. The results are shown in Table 1. As the specimen, phenoxyethanol and methylparaben were used. Stimulation of phenoxyethanol and methylparaben is known to be a stinging stimulus.

スティンギング刺激の評価
敏感肌の専用パネラー10人に対して、目尻から小鼻にかけての頬部に水を加えて所定の最終濃度に調整した各被検体試料を0.1ｍｌ塗布し、塗布直後、2.5分後、5分後に以下の評価基準に従って評点を求め、その３回の平均評点で評価を行った。評価基準は次の通りである。
評点 0・・・全く刺激を感じない
評点 1・・・少し感じる
評点 2・・・感じる
評点 3・・・非常に感じるEvaluation of stinging stimulus To 10 panelists with sensitive skin, apply 0.1 ml of each specimen adjusted to the final concentration by adding water to the cheeks from the corner of the eye to the nose, 2.5 minutes after application Then, after 5 minutes, a score was obtained according to the following evaluation criteria, and the evaluation was performed with the average score of the three times. The evaluation criteria are as follows.
Grade 0… I don't feel any stimulation Grade 1… I feel a little Grade 2… Is felt Grade 3… I feel very much

Figure 2005080977
Figure 2005080977

この結果から、サブスタンスＰ量とスティンギング刺激に相関が認められ、表皮ケラチノサイトを培養細胞とし、サブスタンスＰ量を指標とする本評価方法は、スティンギング試験の代替方法として有用であることがわかった。   From this result, it was found that there was a correlation between substance P amount and stinging stimulus, and this evaluation method using epidermal keratinocytes as cultured cells and using substance P amount as an index is useful as an alternative method of sting test. .

本評価法は、培養液中の皮膚構成細胞から放出されるサブスタンスＰ量を指標として、被検体の有する皮膚刺激感を予測する方法であり、皮膚トラブルを引き起こす可能性がある成分や組成物をin vitroで簡便に選別できるため、特に外用剤の開発に有用である。さらに、本発明によれば、防腐剤、界面活性剤または有機酸およびこれらを含有する化粧料等の外用剤の皮膚刺激性をin vitroで高感度に評価することができる。

This evaluation method is a method for predicting the skin irritation of a subject using the amount of substance P released from the skin constituent cells in the culture medium as an index. Components and compositions that may cause skin troubles are estimated. Since it can be easily selected in vitro, it is particularly useful for the development of external preparations. Furthermore, according to the present invention, it is possible to evaluate the skin irritation of a preservative, a surfactant or an organic acid and an external preparation such as a cosmetic containing these in vitro with high sensitivity.

Claims (10)

皮膚構成細胞と被検体を接触させ、サブスタンスＰ量を測定することを特徴とする、当該被検体の皮膚刺激感を予測するための、刺激性評価方法。   A method for evaluating irritation for predicting a skin irritation feeling of a subject, comprising contacting a skin constituent cell with the subject and measuring a substance P amount. 皮膚刺激感がスティンギング刺激性であることを特徴とする、請求項１に記載の刺激性評価方法。   The method for evaluating irritation according to claim 1, wherein the skin irritation is sting irritation. (１)皮膚構成細胞を有する培養液に被検体を添加する工程、(２)この状態で皮膚構成細胞を培養する工程、(３)培養上清中のサブスタンスＰ量を測定する工程、(４)サブスタンスＰの測定値より被検体の皮膚刺激感を予測する工程、からなることを特徴とする、請求項１または２に記載の刺激性評価方法。   (1) a step of adding a specimen to a culture solution having skin constituent cells, (2) a step of culturing skin constituent cells in this state, (3) a step of measuring the amount of substance P in the culture supernatant, (4 3. The method for evaluating irritation according to claim 1 or 2, comprising the step of predicting skin irritation of the subject from the measured value of substance P. 皮膚構成細胞が、皮膚表皮構成細胞である請求項１〜３のいずれかに記載の刺激性評価方法。   The irritation evaluation method according to any one of claims 1 to 3, wherein the skin constituent cells are skin epidermis constituent cells. サブスタンスＰ量の測定が免疫学的測定方法により行われる請求項１〜４のいずれかに記載の刺激性評価方法。   The method for evaluating irritation according to any one of claims 1 to 4, wherein the substance P amount is measured by an immunological measurement method. 被検体の皮膚刺激感を予測する工程が、スティンギング刺激性であることが公知である化合物を陽性対照として用いた試験系との比較により行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の刺激性評価方法。   The process of predicting skin irritation of a subject is performed by comparison with a test system using a compound that is known to be stinging irritant as a positive control. Irritation evaluation method. 皮膚構成細胞およびサブスタンスＰ量の測定試薬からなる、被検体の皮膚刺激感を予測するための測定キット。   A measurement kit for predicting skin irritation of a subject, comprising a reagent for measuring skin constituent cells and substance P amount. キット構成物として、表皮ケラチノサイトを播種した培養器、表皮ケラチノサイト用培養液、サブスタンスＰ量測定用試薬を含む、請求項７に記載の測定キット。   The measurement kit according to claim 7, comprising a culture device seeded with epidermal keratinocytes, a culture solution for epidermal keratinocytes, and a substance for measuring substance P amount as kit components. サブスタンスＰ量測定用試薬がサブスタンスＰ量測定用ELISA試薬である、請求項７または８に記載の測定キット。   The measurement kit according to claim 7 or 8, wherein the substance P amount measurement reagent is a substance P amount measurement ELISA reagent. さらに、キット構成物として、スティンギング刺激性であることが公知である化合物を陽性対照として含む、請求項７〜９のいずれかに記載のキット。

The kit according to any one of claims 7 to 9, further comprising, as a positive control, a compound that is known to be sting stimulating as a kit component.

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