JPWO2005061707A1

JPWO2005061707A1 - Method for determining sensitivity of cancer cells to Eg5 inhibitor

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Publication number: JPWO2005061707A1
Application number: JP2005516541A
Authority: JP
Inventors: 史一篠原; 大林　正也; 正也大林; 哲郎吉田; 徹也辻田; 中井　龍一郎; 龍一郎中井; 山下　順範; 順範山下
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2004-12-24
Publication date: 2007-07-12
Also published as: WO2005061707A1

Abstract

２以上のヒト癌細胞株についてＥｇ５阻害剤に対する感受性と少なくとも１以上のヒト遺伝子の発現量とを測定し、その発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に相関のある遺伝子を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子として同定する方法。同定されたＥｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子の中から１以上の遺伝子を選択し、癌細胞における、選択した遺伝子の発現量を測定し、その発現量に応じた点数を割り当てることにより、その癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法。The sensitivity to Eg5 inhibitor and the expression level of at least one human gene are measured for two or more human cancer cell lines, and a gene having a correlation between the expression level and sensitivity to Eg5 inhibitor is determined as an Eg5 inhibitor. To identify as a gene involved in susceptibility to By selecting one or more genes from among the genes involved in sensitivity to the identified Eg5 inhibitor, measuring the expression level of the selected gene in cancer cells, and assigning a score corresponding to the expression level, the cancer A method for determining the sensitivity of a cell to an Eg5 inhibitor.

Description

本発明は、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子を同定する方法、癌患者のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法、および癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質をスクリーニングする方法に関する。 The present invention relates to a method for identifying a gene involved in the sensitivity of cancer cells to an Eg5 inhibitor, a method for determining the sensitivity of cancer patients to an Eg5 inhibitor, and a method for screening a substance that enhances the sensitivity of cancer cells to an Eg5 inhibitor About.

種々の抗癌剤による癌化学療法は、癌の治療において最も重要な方法の一つである。抗癌剤によって有効な治療を行うためには、患者における抗癌剤に対する感受性を予測し、適切な薬剤を選抜することが重要である。抗癌剤に対する感受性を決定している遺伝子を見出すことは、感受性予測のための一つの方法である。今までに多くの遺伝子が複数の抗癌剤に対する感受性の決定因子として報告されてきた。例えば、薬剤トランスポーターであるＭＤＲ１（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，５０６−５１４，１９９０）およびＭＲＰ２（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５７，３５３７−３５４７，１９９７；ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５６，４１２４−４１２９，１９９６）、薬物代謝酵素であるチトクロームＰ４５０（以下、ＣＹＰと略す）ファミリー（Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，８，１３３５−１３４７，２００２）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１５５４４−１５５４９，１９８６）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，３，３４９−３６６，２００２）などである。さらに、各々の抗癌剤に対する感受性を規定している遺伝子として例えば以下のものが報告されている。γ−グルタミルヒドロラーゼ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２，３９２３−３９２７，１９７３，）およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｃａｎｃｅｒ，５７，１９１２−１９１７，１９８６）はメトトレキセートに対する耐性因子である。また、チミジレートシンターゼ（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，６，１６５３−１６６４，１９８８）、メタロチオネイン（ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔ．Ｒｅｓ．，５７，２３３−２４９，１９９１）およびシチジンデアミナーゼ（Ｃａｎｃｅｒ，４０，５０９−５１８，１９７７）の活性増強は、それぞれ５−フルオロウラシル、シスプラチン、シトシンアラビノシドに対する抵抗性因子である。ＤＴ−ジアフォラーゼの活性増強は、マイトマイシンＣに対する感受性因子である（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５２，６９３６−６９３９，１９９２）。このように、多くの遺伝子が抗癌剤に対する感受性を決定する遺伝子として知られている。しかし、これらの既知の遺伝子だけでは抗癌剤に対する感受性を説明するには不十分であり、さらなる研究が求められている。
一方で、抗癌剤に対する感受性の予測あるいは抗癌剤に対する感受性に関与する遺伝子の予測を、ｃＤＮＡマイクロアレイやＳＮＰｓなどの解析を用いて行う試みも進んでいる。ヒト癌細胞株パネルやヒト癌のゼノグラフトでの遺伝子発現と抗癌剤に対する感受性との相関の解析も報告されている（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２４，２３６−２４４，２０００年；ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６２，５１８−５２７，２００２；ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６２，１１３９−１１４７，２００２；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８，１０７８７−１０７９２，２００１；特開２００３−６１６７８）。これらの研究で見出された遺伝子は、抗癌剤に対する感受性予測のマーカーとして使用することができる。さらに、これらの遺伝子のうちの一部は、実際に抗癌剤に対する感受性を決定している可能性がある。
紡錘体機能は細胞***時（細胞周期Ｍ期）における中心体の局在や染色体の正確な分離に必須であり、その機能の阻害は、正常な細胞***を阻害し癌細胞に細胞死を誘導することが知られている。
Ｍ期キネシンはＭ期紡錘体制御に関わる蛋白質であり、細胞周期のＭ期進行において必須の役割を担っている。これら蛋白質は、ＡＴＰ加水分解により生じたエネルギーを利用して、微小管に沿って蛋白質を移動させる機能を有しており、一般に「分子モーター」と呼ばれる機能蛋白質の一群である。Ｍ期においては、紡錘体の伸長と維持および紡錘体極と呼ばれる構造体形成に深く関わっており、さらに紡錘体微小管に沿った染色体の移動を通して、正しい細胞***の進行を制御している。
Ｅｇ５は、進化上保存されたサブファミリーを形成するＭ期キネシンの一つである。ヒト正常組織におけるＥｇ５の発現は、精巣や胸腺などに限定されることが知られており、また、癌患者組織を解析した結果より、非癌部に比べ癌部において高い発現を示すことが報告されている（ＵＳ６４１４１２１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９９，４４６５−４４７０，２００２）。
したがってＭ期キネシンＥｇ５は新規Ｍ期作用薬の標的分子として重要であり、その阻害剤は癌などの細胞増殖制御の異常が原因となる疾患の治療剤として有望と考えられる。Ｅｇ５阻害活性を示す化合物としては、モナストロール（ｍｏｎａｓｔｒｏｌ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９７１−９７４，１９９９）、キナゾリン誘導体（ＷＯ０１／９８２７８）、フェナチアジン誘導体（ＷＯ０２／０５７２４４）、トリフェニルメタン誘導体（ＷＯ０２／０５６８８０）、ジヒドロピリミジン誘導体（ＷＯ０２／０７９１４９；ＷＯ０２／０７９１６９）などが報告されている。
Ｍ期紡錘体の構成分子である微小管に作用する抗癌剤の薬剤感受性に関与する因子としては、タキサン類に属するパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）に対しては薬剤トランスポーターであるＭＤＲ１などが報告され（Ｃｕｒｒ．ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｓ，３，１−１９，２００３；ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６３，１５１５−１５１９，２００３）、ＤＮＡマイクロアレイを用いた網羅的な解析も行われている（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，６３，２２００−２２０５，２００３）。またビンカアルカロイド系に属するビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）に対しては別のトランスポーターであるＭＲＰ１などが報告されている（Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５，６７３−６８０，１９９９）。しかしながら、Ｅｇ５阻害剤の感受性の予測あるいはＥｇ５阻害剤に対する感受性に関与する遺伝子の予測を行った報告は現在までにない。
一方、抗腫瘍活性を示すチアジアゾリン誘導体が知られている（ＷＯ０３／０５１８５４）。また、白血病の治療に有効なシステイン誘導体が知られている（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１３，４１４−４１８，１９７０；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１５，１３−１６，１９７２）。Cancer chemotherapy with various anticancer agents is one of the most important methods in the treatment of cancer. In order to perform effective treatment with an anticancer drug, it is important to predict the sensitivity of the patient to the anticancer drug and select an appropriate drug. Finding genes that determine susceptibility to anticancer drugs is one way to predict susceptibility. To date, many genes have been reported as determinants of sensitivity to multiple anticancer agents. For example, drug transporters MDR1 (J. Biol. Chem., 265 , 506-514, 1990) and MRP2 (Cancer Res., 57 , 3537-3547, 1997; Cancer Res., 56 , 4124-4129, 1996). ), Cytochrome P450 (hereinafter abbreviated as CYP) family (Curr. Pharm. Des., 8 , 1335-1347, 2002), glutathione-S-transferase (J. Biol. Chem., 261 , 15544), which is a drug metabolizing enzyme. -15549, 1986), N-acetyltransferase (Pharmacogenomics, 3 , 349-366, 2002). Further, for example, the following genes have been reported as the genes defining the sensitivity to each anticancer agent. γ-glutamyl hydrolase (Biochemistry, 12 , 3923-3927, 1973) and dihydrofolate reductase (Cancer, 57 , 1912-1917, 1986) are resistance factors to methotrexate. Further, thymidylate synthase (J. Clin. Oncol., 6 , 1653-1664, 1988), metallothionein (Cancer Treat. Res., 57 , 233-249, 1991) and cytidine deaminase (Cancer, 40 , 509-518). 1977) are resistance factors to 5-fluorouracil, cisplatin, and cytosine arabinoside, respectively. Enhanced activity of DT-diaphorase is a susceptibility factor for mitomycin C (Cancer Res., 52 , 6936-6939, 1992). Thus, many genes are known as genes that determine sensitivity to anticancer agents. However, these known genes alone are insufficient to explain susceptibility to anticancer drugs and further research is needed.
On the other hand, attempts to predict sensitivity to anticancer drugs or genes involved in sensitivity to anticancer drugs using analysis of cDNA microarrays, SNPs and the like are also progressing. Analysis of the correlation between gene expression in human cancer cell line panels and human cancer xenografts and susceptibility to anticancer agents has also been reported (Nat. Genet., 24 , 236-244, 2000; Cancer Res., 62 , 518). Cancer Res., 62 , 1139-1147, 2002; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 , 10787-10792, 2001; The genes found in these studies can be used as markers for predicting susceptibility to anticancer drugs. In addition, some of these genes may actually determine susceptibility to anticancer drugs.
Spindle function is essential for centrosome localization and accurate chromosome segregation during cell division (cell cycle M phase). Inhibiting this function inhibits normal cell division and induces cell death in cancer cells. It is known to do.
M-phase kinesin is a protein involved in M-phase spindle regulation, and plays an essential role in the M-phase progression of the cell cycle. These proteins have a function of moving proteins along microtubules using energy generated by ATP hydrolysis, and are a group of functional proteins generally called “molecular motors”. In the M phase, it is deeply involved in the elongation and maintenance of the spindle and the formation of a structure called the spindle pole, and further controls the progression of correct cell division through the movement of chromosomes along the spindle microtubule.
Eg5 is one of the M phase kinesins that form an evolutionarily conserved subfamily. It is known that the expression of Eg5 in normal human tissues is limited to the testis and thymus, and from the results of analysis of cancer patient tissues, it is reported that the expression is higher in cancer parts than in non-cancerous parts (US6414121; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99 , 4465-4470, 2002).
Therefore, M-phase kinesin Eg5 is important as a target molecule for a novel M-phase agonist, and its inhibitor is considered promising as a therapeutic agent for diseases caused by abnormal cell growth control such as cancer. Examples of the compound showing Eg5 inhibitory activity include monastrol (Science, 286 , 971-974, 1999), quinazoline derivatives (WO01 / 98278), phenathiazine derivatives (WO02 / 057244), triphenylmethane derivatives (WO02 / 056880). ), Dihydropyrimidine derivatives (WO02 / 079149; WO02 / 079169) and the like have been reported.
As a factor involved in drug sensitivity of anticancer drugs acting on microtubules that are constituent molecules of M-phase spindles, MDR1 which is a drug transporter for paclitaxel belonging to taxanes has been reported (Curr. Cancer Drug Targets, 3 , 1-19, 2003; Cancer Res., 63 , 1515-1519, 2003), and comprehensive analysis using DNA microarrays has also been performed (Cancer Res., 63 , 2200-2205, 2003). In addition, another transporter such as MRP1 has been reported for vincristine belonging to the vinca alkaloid system (Clin. Cancer Res., 5 , 673-680, 1999). However, there has been no report to date of predicting the sensitivity of an Eg5 inhibitor or predicting a gene involved in sensitivity to an Eg5 inhibitor.
On the other hand, thiadiazoline derivatives exhibiting antitumor activity are known (WO03 / 051854). In addition, cysteine derivatives effective for the treatment of leukemia are known (J. Med. Chem., 13 , 414-418, 1970; J. Med. Chem., 15 , 13-16, 1972).

本発明の課題は、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子を同定する方法、およびそれらの遺伝子を利用して癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、先ず、３８細胞株よりなるヒト癌細胞株パネルにおいて、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性と１１９種類のヒト遺伝子の発現量を測定した。そして特に肺癌由来の２６株において、発現がＥｇ５阻害剤に対する感受性と相関のある１９遺伝子を選抜した。また、本発明者らは、それらの遺伝子の発現量から癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を予測する統計学的なモデルを構築し、さらに予測に用いる遺伝子の数を１１までに減少させたモデルの構築にも成功した。
このモデルを利用し、選抜された少数の遺伝子の発現を調べることで、癌患者の抗癌剤に対する感受性を判定する方法を提供することが可能になった。さらに、それらの遺伝子の発現を増加あるいは減少させることで、抗癌剤に対する感受性を増強させる方法、ならびにそれらの抗癌剤に対する感受性を増強させる物質をスクリーニングする方法を提供することが可能になった。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明は、以下の（１）から（５４）に関する。
（１）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程
（ａ）２以上のヒト癌細胞株について、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性および１以上のヒト遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で発現量を測定した遺伝子ごとに、各細胞株における該遺伝子の発現量と該細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性との相関とを解析する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で相関のあった遺伝子を選抜する工程、
を含む、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子を同定する方法。
（２）工程（ａ）で測定に用いるヒト癌細胞株が、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９からなる肺癌由来の細胞株、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＴ−２９、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１およびＷｉＤｒからなる大腸癌由来の細胞株、ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡＰａＣａ−２、ＡＳＰＣ−１およびＢｘＰＣ−３からなる膵臓癌由来の細胞株、ＳＫ−ＯＶ−３およびＯＶＣＡＲ−３からなる卵巣癌由来の細胞株からなる群から選択される全てあるいは一部の細胞株である、（１）に記載の方法。
（３）選択される細胞株が、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９からなる肺癌由来の細胞株から選択される全てあるいは一部の細胞株である、（２）に記載の方法。
（４）工程（ａ）で測定に用いるヒト癌細胞株が、１つの特定の臓器に由来する癌細胞株である（１）に記載の方法。
（５）１つの特定の臓器が肺である（４）に記載の方法。
（６）感受性の強さを測定するＥｇ５阻害剤が、一般式（Ｉ）

＜式中、
Ｒ^１およびＲ^４は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表し、
Ｒ^２は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−Ｃ（＝Ｗ）Ｒ^６［式中、Ｗは酸素原子または硫黄原子を表し、Ｒ^６は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＮＲ^７Ｒ^８（式中、Ｒ^７およびＲ^８は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ^７とＲ^８が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、−ＯＲ^９（式中、Ｒ^９は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）または−ＳＲ^１０（式中、Ｒ^１０は前記のＲ^９と同義である）を表す］、−ＮＲ^１１Ｒ^１２｛式中、Ｒ^１１およびＲ^１２は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^１３［式中、Ｒ^１３は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＮＲ^７ＡＲ^８Ａ（式中、Ｒ^７ＡおよびＲ^８Ａはそれぞれ前記のＲ^７およびＲ^８と同義である）、−ＯＲ^９Ａ（式中、Ｒ^９Ａは前記のＲ^９と同義である）または−ＳＲ^１０Ａ（式中、Ｒ^１０Ａは前記のＲ^９と同義である）を表す］を表す｝または−ＳＯ_２Ｒ^１４（式中、Ｒ^１４は前記のＲ^９と同義である）を表すか、またはＲ^１とＲ^２が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成し、
Ｒ^５は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ^４とＲ^５が一緒になって−（ＣＲ^１５ＡＲ^１５Ｂ）_ｍ１−Ｑ−（ＣＲ^１５ＣＲ^１５Ｄ）_ｍ２−｛式中、Ｑは単結合、置換もしくは非置換のフェニレンまたはシクロアルキレンを表し、ｍ１およびｍ２は同一または異なって０〜４の整数を表すが、ｍ１とｍ２は同時に０とはならず、Ｒ^１５Ａ、Ｒ^１５Ｂ、Ｒ^１５ＣおよびＲ^１５Ｄは同一または異なって、水素原子、ハロゲン、置換もしくは非置換の低級アルキル、−ＯＲ^１６［式中、Ｒ^１６は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＣＯＮＲ^７ＢＲ^８Ｂ（式中、Ｒ^７ＢおよびＲ^８Ｂは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ^７ＢとＲ^８Ｂが隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、−ＳＯ_２ＮＲ^７ＣＲ^８Ｃ（式中Ｒ^７ＣおよびＲ^８Ｃはそれぞれ前記のＲ^７ＢおよびＲ^８Ｂと同義である）または−ＣＯＲ^１７（式中、Ｒ^１７は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）を表す］、−ＮＲ^１８Ｒ^１９［式中、Ｒ^１８およびＲ^１９は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＣＯＲ^２０（式中、Ｒ^２０は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、アミノ、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノ、置換もしくは非置換のジ低級アルキルアミノまたは置換もしくは非置換のアリールアミノを表す）または−ＳＯ_２Ｒ^２１（式中、Ｒ^２１は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）を表す］または−ＣＯ_２Ｒ^２２（式中、Ｒ^２２は前記のＲ^１７と同義である）を表すか、またはＲ^１５ＡとＲ^１５ＢまたはＲ^１５ＣとＲ^１５Ｄが一緒になって酸素原子を表し、ｍ１またはｍ２が２以上の整数であるとき、それぞれのＨ^１５Ａ、Ｒ^１５Ｂ、Ｒ^１５ＣおよびＲ^１５Ｄは同一でも異なっていてもよく、隣接するふたつの炭素原子に結合するＲ^１５Ａ、Ｒ^１５Ｂ、Ｒ^１５ＣおよびＲ^１５Ｄはそれぞれ一緒になって結合を形成してもよい｝を表し、
Ｒ^３は水素原子または−Ｃ（＝Ｗ^Ａ）Ｒ^２３（式中、Ｗ^ＡおよびＲ^２３はそれぞれ前記のＷおよびＲ^６と同義である）を表す＞で表されるチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である、（１）から（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）Ｒ^１が水素原子であり、Ｒ^２が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^６Ａ（式中、Ｒ^６Ａは低級アルキルを表す）であり、Ｒ^３が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^２３Ａ（式中、Ｒ^２３Ａは低級アルキルを表す）であり、Ｒ^４が置換低級アルキルであり、Ｒ^５がフェニルである（６）に記載の方法。
（８）Ｒ^４が−（ＣＨ_２）_ｎａＮＨＳＯ_２Ｒ^ａ（式中、ｎａは１または２であり、Ｒ^ａは置換もしくは非置換の低級アルキルを表す）である（６）または（７）に記載の方法。
（９）一般式（Ｉ）で表されるチアジアゾリン誘導体が下記式（Ａ）〜（Ｃ）および（Ｅ）〜（Ｐ）で表される化合物からなる群から選択される化合物である（６）に記載の方法。

（１０）感受性の強さを測定するＥｇ５阻害剤が、一般式（ＩＩ）

（式中、Ｒ^２４は置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の芳香族複素環基を表し、Ｒ^２５およびＲ^２６は同一または異なって、水素原子、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、もしくはヒドロキシメチルを表すか、またはＲ^２５とＲ^２６が一緒になって酸素原子、硫黄原子または結合を表す）で表されるシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である、（１）から（５）のいずれか１項に記載の方法。
（１１）システイン誘導体がＬ−システイン誘導体である（１０）に記載の方法。
（１２）Ｒ^２４がフェニル、４−メチルフェニル、２−ナフチル、４−ピリジル、または１，３−ベンゾジオキソール−５−イルであり、Ｒ^２５およびＲ^２６が同一または異なって、水素原子、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、またはヒドロキシメチルである（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）感受性の強さを測定するＥｇ５阻害剤が、下記式（Ｑ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である、（１）から（５）のいずれか１項に記載の方法。

（１４）以下の（ａ）〜（ｅ）の工程
（ａ）（１）から（１３）のいずれか１項に記載の方法により同定された遺伝子から１以上の遺伝子を選択し、その発現量に応じた点数を決定する工程、
（ｂ）被験癌細胞について、工程（ａ）で選択された遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｃ）各遺伝子について、工程（ｂ）で測定した発現量に基づき、工程（ａ）で決定した点数を割り当てる工程、
（ｄ）選択された全遺伝子についての割り当てられた点数から、被験癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性の指標となる数値を求める工程、
（ｅ）あらかじめ決定した閾値と（ｄ）で得られた数値とを比較する工程、
を含む、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法。
（１５）工程（ａ）で選択する遺伝子が、以下の（ｉ）〜（ｘｉｘ）それぞれの遺伝子からなる遺伝子群から選択される１以上の遺伝子である（１４）に記載の方法。
（ｉ）チトクロームＰ４５０・ファミリー２４・サブファミリーＡ・ポリペプチド１（ＣＹＰ２４Ａ１）
（ｉｉ）レプチン受容体遺伝子関連蛋白質（ＯＢＲＧＲＰ）
（ｉｉｉ）Ｂ因子（ＢＦ）
（ｉｖ）アデニンホスホリボシルトラスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）
（ｖ）バキュロウイルスＩＡＰリピート含有蛋白質（ＢＩＲＣ３）
（ｖｉ）シーケストソーム１（ＳＱＳＴＭ１）
（ｖｉｉ）腫瘍壊死因子α誘導蛋白質２（ＴＮＦＡＩＰ２）
（ｖｉｉｉ）膜内在性蛋白質２Ｂ（ＩＴＭ２Ｂ）
（ｉｘ）ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー２（ＡＢＣＣ２）
（ｘ）アネキシンＡ３（ＡＮＸＡ３）
（ｘｉ）相同配列３含有ファミリー・メンバー３（ＦＡＭ３Ｃ）
（ｘｉｉ）ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー３（ＡＢＣＣ３）
（ｘｉｉｉ）仮想蛋白質ＢＣ００７４３６（ＢＣ００７４３６）
（ｘｉｖ）微小管関連蛋白質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）
（ｘｖ）サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）
（ｘｖｉ）ヒートショック９０ｋＤａ蛋白質１α（ＨＳＰＣＡ）
（ｘｖｉｉ）サイクリンＢ２（ＣＣＮＢ２）
（ｘｖｉｉｉ）仮想蛋白質ＦＬＪ２３２６９（ＦＬＪ２３２６９）
（ｘｉｘ）溶質キャリアー・ファミリー１２・メンバー２（ＳＬＣ１２Ａ２）
（１６）（ａ）の工程で選択される遺伝子が、ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＡＰＲＴ、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２およびＦＬＪ２３２６９である（１５）に記載の方法。
（１７）Ｅｇ５阻害剤が、（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（１４）から（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１８）Ｅｇ５阻害剤が、（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（１４）から（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１９）Ｅｇ５阻害剤が、（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（１４）から（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（２０）癌細胞が肺癌細胞である（１４）から（１９）のいずれか１項に記載の方法。
（２１）遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイにより定量することにより行う、（１）から（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２２）遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを定量的ＰＣＲにより定量することにより行う、（１）から（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２３）遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡをノーザンブロットにより定量することにより行う、（１）から（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２４）（２２）に記載の方法において使用するための、該ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、ｍＲＮＡの定量試薬。
（２５）遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質を免疫化学的方法により定量することにより行う、（１）から（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２６）遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質をＥＬＩＳＡにより定量することにより行う、（２５）に記載の方法。
（２７）遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質をウエスタンブロットにより定量することにより行う、（２５）に記載の方法。
（２８）（２５）から（２７）のいずれか１項に記載の方法において使用するための、該蛋白質に対する抗体を含む免疫測定試薬。
（２９）ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２からなる群から選択される単独又は複数の遺伝子であって、癌細胞に強制発現させることによってＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子または該遺伝子がコードする蛋白質を含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。
（３０）細胞が肺癌細胞である（２９）に記載の感受性増強薬。
（３１）Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（２９）または（３０）に記載の感受性増強薬。
（３２）Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（２９）または（３０）に記載の感受性増強薬。
（３３）Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（２９）または（３０）に記載の感受性増強薬。
（３４）細胞に試験物質を添加し、該細胞におけるＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２からなる群から選択される少なくとも１以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を添加しない場合の該遺伝子の発現量と比較して該遺伝子の発現を増加させる物質を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる候補物質として選択する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質のスクリーニング方法。
（３５）細胞が肺癌細胞である（３４）に記載のスクリーニング方法。
（３６）Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（３４）または（３５）に記載のスクリーニング方法。
（３７）Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（３４）または（３５）に記載のスクリーニング方法。
（３８）Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（３４）または（３５）に記載のスクリーニング方法。
（３９）ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３からなる群から選択される単独又は複数の遺伝子であって、癌細胞において該遺伝子の発現を抑制することで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４０）癌細胞が肺癌細胞である（３９）に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４１）Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（３９）または（４０）に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４２）Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（３９）または（４０）に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４３）Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（３９）または（４０）に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。
（４４）（３９）から（４３）のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを発現するベクター。
（４５）（３９）から（４３）のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドまたは（４４）に記載のベクターを含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。
（４６）ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３から選択されるいずれかの遺伝子であって、癌細胞において該遺伝子の発現を抑制することで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子にコードされる蛋白質に対する抗体を含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。
（４７）Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（４６）に記載の感受性増強薬。
（４８）Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（４６）に記載の感受性増強薬。
（４９）Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（４６）に記載の感受性増強薬。
（５０）細胞に試験物質を添加し、該細胞におけるＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３からなる群から選択される少なくとも１以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を添加しない場合の該遺伝子の発現量と比較して該遺伝子の発現を減少させる物質を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる候補物質として選択する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質のスクリーニング方法。
（５１）細胞が肺癌細胞である（５０）に記載のスクリーニング方法。
（５２）Ｅｇ５阻害剤が（６）から（９）のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（５０）または（５１）に記載のスクリーニング方法。
（５３）Ｅｇ５阻害剤が（１０）から（１２）のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である（５０）または（５１）に記載のスクリーニング方法。
（５４）Ｅｇ５阻害剤が（１３）に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である（５０）または（５１）に記載のスクリーニング方法。
以下、一般式（Ｉ）で表される化合物を化合物（Ｉ）といい、一般式（ＩＩ）で表される化合物を化合物（ＩＩ）という。さらに一般式（Ａ）で表される化合物を化合物Ａという。他の式番号の化合物についても同様である。
以下に本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
（Ａ）癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子を同定する方法
本発明のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関与する遺伝子の同定方法には、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程が含まれる。
（ａ）２以上のヒト癌細胞株について、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性および１以上のヒト遺伝子の発現量を測定する工程
（ｂ）工程（ａ）で発現量を測定した遺伝子ごとに、各細胞株における該遺伝子の発現量と該細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性との相関とを解析する工程
（ｃ）工程（ｂ）で相関のあった遺伝子を選抜する工程
（１）ヒト癌細胞株
本発明で測定に用いるヒト癌細胞株は、ヒト由来の癌細胞株であれば、いずれの細胞株でもよいが、細胞株の種類が多いほど、上記工程（ｂ）の相関解析の際に、得られた相関値が有意である可能性が高くなるので好ましい。具体的な細胞株のパネルとしては、肺癌由来の２６細胞株であるＡ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９、大腸癌由来の６細胞株であるＣｏｌｏ２０５、ＨＴ−２９、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１およびＷｉＤｒ、膵臓癌由来の４細胞株であるＰＡＮＣ−１、ＭＩＡＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１およびＢｘＰＣ−３、卵巣癌由来の２細胞株であるＳＫ−ＯＶ−３およびＯＶＣＡＲ−３の細胞株からなるパネルの全部あるいは一部を用いることができる。
また、臓器により、発現する遺伝子およびその遺伝子の機能の細胞に対する重要性が異なるので、癌細胞が由来する臓器によって、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性に関与する遺伝子が異なることが考えられる。したがって、測定に用いる細胞株を、１つの特定の臓器に由来する癌細胞株にすることにより、その臓器の癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性により特異的に関与する遺伝子を同定することができる。たとえば、Ｅｇ５阻害剤を肺癌の治療に用いる場合のように、肺癌細胞のＥｇ５阻害剤の感受性に関する遺伝子を特に同定したい場合、肺癌細胞株だけ、例えば、肺癌由来の２６細胞株であるＡ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９の全部あるいは一部を用いて測定を行うことにより、肺癌細胞のＥｇ５阻害剤の感受性に関する遺伝子を同定することができる。
（２）Ｅｇ５阻害剤
本発明で用いるＥｇ５阻害剤は、Ｅｇ５阻害作用を有する化合物であれば特に限定されないが、例えば、ＷＯ２００４／０９２１４７に記載の化合物（Ｉ）またはその薬理学的に許容される塩、化合物（ＩＩ）またはその薬理学的に許容される塩、ＷＯ０１／０３０７６８、ＷＯ０１／０９８２７８などに記載の化合物Ｑ（ＳＢ−７１５９９２）またはその薬理学的に許容される塩、ＷＯ０２／０５７２４４、ＷＯ０３／０９４８３９、ＷＯ０３／０９７０５３、ＷＯ０３／１０３５７５、ＷＯ０３／１０６４２６、ＷＯ０４／００６８６５、ＷＯ０４／００９０３６、ＷＯ０４／０２４０８６、ＷＯ０４／０３２８４０、ＷＯ０４／０３４９７２、ＷＯ０３／０３９４６０、ＷＯ０３／０４９５２７、ＷＯ０３／０５０１２２、ＷＯ０３／０５００６４、ＷＯ０３／０４９６７８、ＷＯ０３／０４９６７９、ＷＯ０３／０７９９７３、ＷＯ０３／０９９２１１、ＷＯ０３／１０５８５５、ＷＯ０４／０３７１７１、ＷＯ０４／０３９７７４、ＷＯ０４／０５８７００、ＷＯ０４／０５８１４８、ＷＯ０２／０７８６３９、ＷＯ０２／０７９１４９、ＷＯ０２／０７９１６９、ＷＯ０３／０９９２８６、ＷＯ０４／０７８７５８などに記載の化合物などがあげられ、好ましくは化合物（Ｉ）またはその薬理学的に許容される塩、化合物（ＩＩ）またはその薬理学的に許容される塩、化合物Ｑまたはその薬理学的に許容される塩などがあげられる。
一般式（Ｉ）および（ＩＩ）の各基の定義において、
（ｉ）低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルアミノおよびジ低級アルキルアミノの低級アルキル部分としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数１〜１０のアルキル、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどがあげられる。
ジ低級アルキルアミノの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい。
（ｉｉ）低級アルケニルとしては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜８のアルケニル、具体的にはビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニルなどがあげられる。
（ｉｉｉ）低級アルキニルとしては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜８のアルキニル、具体的にはエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニルなどがあげられる。
（ｉｖ）シクロアルキルとしては、例えば炭素数３〜８のシクロアルキル、具体的にはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどがあげられる。
（ｖ）アリール、アリールオキシおよびアリールアミノのアリール部分としては、例えばフェニル、ナフチルなどがあげられる。
（ｖｉ）複素環基としては、例えば脂肪族複素環基、芳香族複素環基などがあげられる。脂肪族複素環基としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む５員または６員の単環性脂肪族複素環基、３〜８員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む縮環性脂肪族複素環基などがあげられ、具体的にはピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペリジノ、モルホリノ、オキサゾリニル、ジオキソラニル、テトラヒドロピラニル、１−デカヒドロキシイソキノリニルなどがあげられる。芳香族複素環基としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む５員または６員の単環性芳香族複素環基、３〜８員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む縮環性芳香族複素環基などがあげられ、具体的にはフリル、チエニル、ベンゾチエニル、ピロリル、ピリジル、ピラジニル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、ピリミジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリル、イソキノリル、キナゾリニル、ピラニル、１，３−ベンゾジオキソール−５−イルなどがあげられる。
（ｖｉｉ）芳香族複素環基としては、上記（ｖｉ）であげた芳香族複素環基があげられる。
（ｖｉｉｉ）隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基としては、例えば少なくとも１個の窒素原子を含む脂肪族複素環基などがあげられる。該少なくとも１個の窒素原子を含む脂肪族複素環基は、酸素原子、硫黄原子または他の窒素原子を含んでもいてよく、例えばピロリジニル、モルホリノ、チオモルホリノ、ピラゾリジニル、ピペリジノ、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アジリジニル、アゼチジニル、ペルヒドロアゼピニル、ペルヒドロアゾシニル、スクシンイミジル、ピロリドニル、グルタルイミジル、ピペリドニルなどがあげられる。
（ｉｘ）シクロアルキレンとしては、例えば炭素数３〜８のシクロアルキレン、具体的にはシクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、シクロヘプチレン、シクロオクチレンなどがあげられる。
（ｘ）フェニレンとしては、１，４−フェニレン、１，３−フェニレンまたは１，２−フェニレンがあげられる。
（ｘｉ）ハロゲンはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を意味する。
（ｘｉｉ）置換低級アルキル、置換低級アルコキシ、置換低級アルケニル、置換低級アルキニル、置換シクロアルキル、置換低級アルキルアミノおよび置換ジ低級アルキルアミノにおける置換基としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ハロゲン、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、アジド、シクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、−ＣＯＮＲ^２７Ｒ^２８＜式中、Ｒ^２７およびＲ^２８は同一または異なって、水素原子、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルキル｛該置換低級アルキルにおける置換基としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ヒドロキシ、低級アルコキシ、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は、後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は、後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、低級アルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、ハロゲン、−ＣＯＮＲ^２９Ｒ^３０［式中、Ｒ^２９およびＲ^３０は同一または異なって、水素原子、ヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基（ａ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシ、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アリール、複素環基、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノなどがあげられる）、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は、後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）またはアラルキルオキシカルボニルを表すか、またはＲ^２９とＲ^３０が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基（該隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基は後記の隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を形成する］、−ＮＲ^３１Ｒ^３２［式中、Ｒ^３１およびＲ^３２は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基は前記置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイル（該置換低級アルカノイルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は前記置換低級アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）またはアラルキルオキシカルボニルを表すか、またはＲ^３１とＲ^３２が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基（該隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基は後記の隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を形成する］などがあげられる｝、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は、後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は、後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルコキシ（該置換低級アルコキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイル（該置換低級アルカノイルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ａ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル（該置換アリールオキシカルボニルにおける置換基は、後記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）またはアラルキルオキシカルボニルを表すか、またはＲ^２７とＲ^２８が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基（該隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基は後記の隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を形成する＞、−ＣＯ_２Ｒ^３３｛式中、Ｒ^３３は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル［該置換低級アルキルにおける置換基（ｂ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシ、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、−ＣＯＮＲ^３４Ｒ^３５（式中、Ｒ^３４およびＲ^３５はそれぞれ前記Ｒ^２９およびＲ^３０と同義である）、−ＮＲ^３６Ｒ^３７（式中、Ｒ^３６およびＲ^３７はそれぞれ前記Ｒ^３１およびＲ^３２と同義である）などがあげられる］置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｂ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｂ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｂ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）または置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を表す｝、−ＣＯＲ^３８（式中、Ｒ^３８は前記Ｒ^３３と同義である）、−ＮＲ^３９Ｒ^４０＜式中、Ｒ^３９およびＲ^４０は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル｛該置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシ、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、−Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＲ^４１（式中、ｎは１〜１５の整数を表し、Ｒ^４１は低級アルキルを表す）、−ＣＯＮＲ^４２Ｒ^４３（式中、Ｒ^４２およびＲ^４３はそれぞれ前記Ｒ^２９およびＲ^３０と同義である）、−ＳＯ_２Ｒ^４４［式中、Ｒ^４４は低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）または置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を表す］、−ＮＲ^４５Ｒ^４６（式中、Ｒ^４５およびＲ^４６はそれぞれ前記Ｒ^３１およびＲ^３２と同義である）などがあげられる｝、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイル（該置換低級アルカノイルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、−ＣＯＲ^４７｛式中、Ｒ^４７は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基は前記置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）、−ＮＲ^４８Ｒ^４９（式中、Ｒ^４８およびＲ^４９はそれぞれ前記のＲ^３１およびＲ^３２と同義である）または−ＯＲ^５０［式中、Ｒ^５０は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基は前記置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）または置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を表す］を表す｝または−ＳＯ_２Ｒ^５１（式中、Ｒ^５１は前記Ｒ^４７と同義である）を表すか、またはＲ^３９とＲ^４０が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基（該隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基は後記の隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）を形成する＞、−Ｎ^＋Ｒ^５２Ｒ^５３Ｒ^５４Ｘ⁻（式中、Ｒ^５２およびＲ^５３は同一または異なって、低級アルキルを表すか、またはＲ^５２とＲ^５３が隣接する窒素原子と一緒になって複素環基を形成し、Ｒ^５４は低級アルキルを表し、Ｘは塩素、臭素またはヨウ素の各原子を表す）、−ＯＲ^５５｛式中、Ｒ^５５は置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）または−ＣＯＲ^５６（式中、Ｒ^５６は前記Ｒ^４７と同義である）を表す｝、−ＳＲ^５７（式中、Ｒ^５７は前記Ｒ^５５と同義である）、−ＳＯ_２Ｒ^５８［式中、Ｒ^５８は置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基は前記置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｃ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換アリールにおける置換基は後記の置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は後記の置換複素環基における置換基（ｘｖ）と同義である）または−ＮＲ^５９Ｒ^６０（式中、Ｒ^５９およびＲ^６０はそれぞれ前記Ｒ^３１およびＲ^３２と同義である）を表す］−ＯＳＯ_２Ｒ^６１（式中、Ｒ^６１は前記Ｒ^５８と同義である）などがあげられる。
ここで示した低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノおよび低級アルカノイルの低級アルキル部分、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、アリール、アロイルおよびアリールオキシカルボニルのアリール部分、複素環基、隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基ならびにハロゲンは、それぞれ前記低級アルキル（ｉ）、低級アルケニル（ｉｉ）、低級アルキニル（ｉｉｉ）、シクロアルキル（ｉｖ）、アリール（ｖ）、複素環基（ｖｉ）、隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基（ｖｉｉｉ）およびハロゲン（ｘｉ）と同義である。また、ここで示したアラルキルオキシカルボニルのアラルキル部分（ｘｉｉｉ）としては、例えば炭素数７〜１５のアラルキル、具体的にはベンジル、フェネチル、ベンズヒドリル、ナフチルメチルなどがあげられる。
（ｘｉｖ）置換アリール、置換アリールオキシ、置換アリールアミノ、置換フェニレン、置換複素環基のうちの置換芳香族複素環基および置換芳香族複素環基における置換基としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、ホルミル、メチレンジオキシ、置換もしくは非置換の低級アルキル（該置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ハロゲン、オキソ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、ヒドロキシ、低級アルコキシ、アリール、複素環基などがあげられる）、置換もしくは非置換の低級アルケニル（該置換低級アルケニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキニル（該置換低級アルキニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のシクロアルキル（該置換シクロアルキルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルコキシ（該置換低級アルコキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキルチオ（該置換低級アルキルチオにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、アミノ、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノ（該置換低級アルキルアミノにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のジ低級アルキルアミノ（該置換ジ低級アルキルアミノにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイル（該置換低級アルカノイルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイルオキシ（該置換低級アルカノイルオキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイルアミノ（該置換低級アルカノイルアミノにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルカノイルチオ（該置換低級アルカノイルチオにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノカルボニル（該置換低級アルキルアミノカルボニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノカルボニルオキシ（該置換低級アルキルアミノカルボニルオキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のジ低級アルキルアミノカルボニル（該置換ジ低級アルキルアミノカルボニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル（該置換低級アルコキシカルボニルにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のジ低級アルキルアミノカルボニルオキシ（該置換ジ低級アルキルアミノカルボニルオキシにおける置換基は、前記の置換低級アルキルにおける置換基（ｄ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリール（該置換、アリールにおける置換基（ｅ）としては、同一または異なって例えば置換数１〜３の、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルコキシ、シアノ、ニトロ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノなどがあげられる）、置換もしくは非置換の複素環基（該置換複素環基における置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールスルホニル（該置換アリールスルホニルにおける置換基は前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールオキシ（該置換アリールオキシにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールアミノ（該置換アリールアミノにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアリールチオ（該置換アリールチオにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイル（該置換アロイルにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイルオキシ（該置換アロイルオキシにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイルチオ（該置換アロイルチオにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換のアロイルアミノ（該置換アロイルアミノにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環アミノ（該置換複素環アミノにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環オキシ（該置換複素環オキシにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）、置換もしくは非置換の複素環チオ（該置換複素環チオにおける置換基は、前記の置換アリールにおける置換基（ｅ）と同義である）などがあげられる。
ここで示した低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ（該ジ低級アルキルアミノの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい）、低級アルカノイル、低級アルカノイルオキシ、低級アルカノイルアミノ、低級アルカノイルチオ、低級アルキルアミノカルボニル、低級アルキルアミノカルボニルオキシ、ジ低級アルキルアミノカルボニル（該ジ低級アルキルアミノカルボニルの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい）、ジ低級アルキルアミノカルボニルオキシ（該ジ低級アルキルアミノカルボニルオキシの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい）、低級アルコキシカルボニルおよびジ低級アルキルアミノカルボニルオキシ（該ジ低級アルキルアミノカルボニルオキシの２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい）の低級アルキル部分は前記の低級アルキル（ｉ）と同義であり低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキルおよびハロゲンはそれぞれ前記の低級アルケニル（ｉｉ）、低級アルキニル（ｉｉｉ）、シクロアルキル（ｉｖ）およびハロゲン（ｘｉ）と同義である。さらにここで示したアリール、アリールスルホニル、アリールオキシ、アリールチオ、アリールアミノ、アロイル、アロイルオキシ、アロイルチオおよびアロイルアミノのアリール部分は前記のアリール（ｖ）と同義であり、複素環基、複素環アミノ、複素環オキシおよび複素環チオの複素環基部分は前記の複素環基（ｖｉ）と同義である。
（ｘｖ）置換複素環基のうちの置換脂肪族複素環基および隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基としては、前記置換アリールにおける置換基（ｘｉｖ）の定義であげた基に加え、オキソなどがあげられる。
化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱの薬理学的に許容される塩は、例えば薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩などを包含する。化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱの薬理学的に許容される酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩などの有機酸塩などがあげられ、薬理学的に許容される金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩などがあげられ、薬理学的に許容されるアンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどの塩があげられ、薬理学的に許容される有機アミン付加塩としては、例えばモルホリン、ピペリジンなどの付加塩があげられ、薬理学的に許容されるアミノ酸付加塩としては、例えばリジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの付加塩があげられる。
化合物（Ｉ）は、ＷＯ０３／０５１８５４またはＷＯ２００４／０９２１４７に記載の方法、あるいはそれに準じて製造することができる。
化合物（ＩＩ）は、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１３，４１４−４１８，１９７０またはＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１５，１３−１６，１９７２に記載の方法、あるいはそれらに準じて製造することができる。
化合物Ｑは、例えばＷＯ０３／０７０７０１に記載の方法またはそれに準じて製造することができる。
化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱの中には、位置異性体、幾何異性体、光学異性体、互変異性体などの立体異性体が存在し得るものもあるが、本発明の遺伝子を同定する方法などには、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を使用することができる。
化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱの塩を取得したいとき、化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱが塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱを適当な溶媒に溶解または懸濁し、酸または塩基を加えることにより塩を形成させて単離、精製すればよい。
また、化合物（Ｉ）、（ＩＩ）およびＱならびにその薬理学的に許容される塩は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明の遺伝子を同定する方法などに使用することができる。
化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の具体例を第１表および第２表に示す。

次に、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）のＥｇ５阻害作用について、試験例を用いて説明する。
試験例１免疫細胞化学染色によるＭ期細胞表現型解析
免疫細胞化学染色によるＭ期細胞表現型解析は文献（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，５３０３−５３１３，２０００）を参考にして実施した。ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１８５）を被験化合物とともに１７時間培養した。リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄後、−２０℃で保冷したメタノールで１分間処理し、細胞を固定化した。ＰＢＳで洗浄後、０．２％トリトン−Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を含むＰＢＳで１５分間浸透化した。ＰＢＳで洗浄後、ブロッキング溶液（１％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）で３０分間ブロッキングし、１次抗体溶液｛０．２％マウスモノクローナル抗α−チューブリン抗体〔シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社、カタログ番号Ｔ９０２６〕および０．２％ウサギ抗γ−チューブリン抗体（シグマ・アルドリッチ社、カタログ番号Ｔ３５５９）を含むブロッキング溶液｝と３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、２次抗体溶液｛０．０２５％アレクサ・フロー（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）５４６結合抗マウスＩｇＧ抗体〔モレキュラープローブズ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）社、カタログ番号Ａ−１１０３０〕、０．５％アレクサ・フロー４８８結合抗ウサギＩｇＧ抗体（モレキュラープローブズ社、カタログ番号Ａ−１１０３４）および１μｍｏｌ／ｌヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２を含むブロッキング溶液｝と３０分間反応させ、微小管、中心体および染色体を可視化した。倒立蛍光顕微鏡を用いてＭ期の細胞の表現型を観察した。被験化合物として化合物Ａまたは化合物Ｄ〔アクロス（Ａｃｒｏｓ）社〕を用いた場合、化合物Ａおよび化合物ＤによりＭ期に集積した細胞は、単星状微小管（モナストラル・マイクロチューブル・アレイ）、単極性中心体（モノポーラー・スピンドル）、環状に分布した染色体の局在、という特徴的な表現型を示した。このようなＭ期の表現型は文献に記載されたＥｇ５に対する中和抗体（Ｃｅｌｌ，８３，１１５９−１１６９，１９９５）やＥｇ５特異的阻害剤モナストロール（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９７１−９７４，１９９９）で処理した細胞と同様な表現型であった。
以上の結果から、化合物Ａおよび化合物ＤはＥｇ５を阻害することが示唆された。
試験例２Ｅｇ５の酵素活性に対する阻害試験
全長ヒトＥｇ５組換体の調製は文献（Ｃｅｌｌ，８３，１１５９−１１６９，１９９５）を参考にして実施した。ＨｉｓタグをＮ末端に融合した全長ヒトＥｇ５を発現するバキュロウイルスをスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９昆虫細胞に感染させ、培養後、培養液を遠心して細胞を回収した。回収した細胞をバッファーに懸濁し、遠心により上清を回収した。上清をニッケルアガロースカラムに通塔し、ＨｉｓタグをＮ末端に融合したＥｇ５をアフィニティー精製して部分精製標品を取得した。
Ｅｇ５のＡＴＰａｓｅ活性の測定は文献（ＥＭＢＯＪ．，１３，７５１−７５７，１９９４；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，４８８４−４８８７，１９９２）を参考にして実施した。段階的に希釈した被験化合物とともに、２５ｍｍｏｌ／ｌピペラジンＮ，Ｎ’−ビス（エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）／ＫＯＨ（ｐＨ６．８）、１ｍｍｏｌ／ｌエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）、２ｍｍｏｌ／ｌＭｇＣｌ_２、１ｍｍｏｌ／ｌジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５μｍｏｌ／ｌパクリタキセル、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２５μｇ／ｍｌチューブリン〔サイトスケルトン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）社、カタログ番号ＴＬ２３８〕、２００μｍｏｌ／ｌ２−アミノ−６−メルカプト−７−メチルプリンリボサイド（ＭＥＳＧｓｕｂｓｔｒａｔｅ、モレキュラープローブズ社、カタログ番号Ｅ−６６４６）、１Ｕ／ｍｌプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（モレキュラープローブズ社、カタログ番号Ｅ−６６４６）、１ｍｍｏｌ／ｌＡＴＰ、１２．５μｇ／ｍｌＥｇ５部分精製標品から構成される反応溶液で酵素反応を行った。酵素反応は３０℃で３０分間実施した。ＡＴＰａｓｅ活性の指標となる３６０ｎｍでの吸光度をプレートリーダー〔モレキュラーデバイス（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）社、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０ＰＣ^３８４〕で測定した。Ｅｇ５存在下、化合物非存在下での吸光度を１００％、Ｅｇ５非存在下、化合物非存在下の吸光度を０％として相対活性を計算し、ＩＣ_５０値を算出した。
被験化合物として化合物Ａまたは化合物Ｄを用いて測定した場合、化合物Ａおよび化合物Ｄは濃度依存的にＥｇ５のＡＴＰａｓｅ活性を阻害し、そのＩＣ_５０値は化合物Ａが２μｍｏｌ／ｌ、化合物Ｄは０．８μｍｏｌ／ｌであった。
以上、試験例１および試験例２の結果から、化合物Ａおよび化合物ＤはＥｇ５阻害作用を有することが示された。すなわち、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）はＥｇ５阻害剤として利用できることが示された。
（３）抗癌剤に対する感受性の測定法
本発明における、癌細胞の抗癌剤に対する感受性の測定法としては、Ｅｇ５阻害剤と（１）のヒト癌細胞を一定期間接触させた後、該細胞について、生細胞数、ＤＮＡ合成速度または総蛋白質量を測定する方法があげられる。感受性は例えば、種々の濃度のＥｇ５阻害剤について上記の測定を行い、Ｅｇ５阻害剤の濃度と測定値との相関を表す検量線を作成し、Ｅｇ５阻害剤を接触させなかった細胞について同様に測定したときの値を１００％としたときの５０％に相当する値を与えるＥｇ５阻害剤の濃度（ＧＩ_５０）、またはＧＩ_５０の濃度をｍｏｌ／ｌで表したときのその対数（ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０）もしくは−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０で表すことができる。生細胞数は、ＭＴＴ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，５５−６３，１９８３）、ＸＴＴ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４２，２５７−２６５，１９９１）などの発色反応を利用した方法で測定することができる。また、ＤＮＡ合成速度は、^３Ｈで標識したチミジンの細胞への取り込みを測定することなどにより、測定することができる。総蛋白質量は、スルフォローダミンＢアッセイ法などにより測定できる。
（４）遺伝子の発現量の測定
本発明における遺伝子の発現量の測定は、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡまたは遺伝子産物である蛋白質を定量することにより行うことができる。
（ｉ）ＲＮＡまたは蛋白質の抽出
（１）のヒト癌細胞株から以下の一般的な方法でＲＮＡまたは蛋白質を抽出できる。ＲＮＡの場合、例えばトリゾル（ＴＲＩＺＯＬ）試薬〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社〕を用いた場合、添付の操作法に従って行えばよい。蛋白質の場合、例えばＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎＨａｎｄｂｏｏｋ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（１９９６）などの成書に従って行えばよい。
（ｉｉ）ｍＲＮＡの定量
ｍＲＮＡの定量は（１）で抽出したＲＮＡを測定試料として、ＤＮＡマイクロアレイ、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲなどの技術により行うことができる。また、ＲＴ−ＰＣＲにおいて使用するための、該ＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドを含む、ＲＮＡの定量試薬も本発明の範囲に含まれる。
（ｉｉｉ）蛋白質の定量
蛋白質の定量は特異的抗体を用いた免疫化学的定量法によって行うことができる。蛋白質に対する抗体は、例えば成書Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８８）に記載の方法に従って、モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を作製することができる。また、市販の抗体が利用可能な場合は、特異性を確認の上、使用することもできる。得られた抗体を用いて、成書（例えば「酵素免疫測定法」医学書院（１９８２））に記載の方法に従って、ＥＬＩＳＡあるいはＲＩＡ、ウェスタンブロットを行い、蛋白質を定量することができる。また、上記の方法において使用するための、該蛋白質に対する抗体を含む免疫測定試薬も本発明の範囲に含まれる。
遺伝子の発現量は、上記（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の方法で測定された、一定量のＲＮＡまたは蛋白質あたりのシグナル強度またはその対数で表される。ＲＴ−ＰＣＲの一種であるリアルタイムＰＣＲでｍＲＮＡを定量した場合は、増幅反応が対数的に進行する、あるシグナル強度に達するまでの反応サイクル数（Ｃｔ値）で表すこともできる。
（５）遺伝子の選抜
本発明では、各遺伝子ごとに、各細胞株における発現量と該細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性との相関を解析し、その発現量と細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に相関のある遺伝子を選抜する。ここで行なう相関解析は、遺伝子の発現量およびＥｇ５阻害剤に対する感受性がシグナル強度の対数、Ｃｔ値、ＧＩ_５０の対数などで表される場合には、その数値は正規分布になると仮定し、例えばピアソンの相関係数（以下、単に相関係数ともいう）を計算することによって行うことができる。相関の有無は、相関係数が０であるかどうかで決定され、相関係数が０の場合は相関はなく、０でなければ相関があるといえる。また、相関係数は１から−１の間の値を取るが、相関係数の絶対値が１に近いほど相関が高く、０に近いほど相関が低いといえる。なお、得られた相関係数の有意性は、帰無仮説に基づいて標本数から求められるＰ値（母集団の相関係数が０になる確率）により検定できる。例えば、Ｐ値＜０．０５であれば、その相関係数は５％の有意水準で有意であるといえる。以上のようにして選抜される、その発現量がＥｇ５阻害剤に対する感受性と負の相関のある遺伝子、すなわちＥｇ５阻害剤に対する感受性が高い細胞ほどその発現量が低い遺伝子（以下、耐性遺伝子ともいう）の例として、以下の１２遺伝子があげられる。
（ｉ）ＣＹＰ２４Ａ１：チトクロームＰ４５０・ファミリー２４・サブファミリーＡ・ポリペプチド１（ＮＭ＿０００７８２）
（ｉｉ）ＯＢＲＧＲＰ：レプチン受容体遺伝子関連蛋白質（ＮＭ＿０１７５２６）
（ｉｉｉ）ＢＦ：Ｂ因子（ＮＭ＿００１７１０）
（ｉｖ）ＡＰＲＴ：アデニンホスホリボシルトラスフェラーゼ（ＮＭ＿０００４８５）
（ｖ）ＢＩＲＣ３：バキュロウイルスＩＡＰリピート含有蛋白質（ＮＭ＿００１１６５）
（ｖｉ）ＳＱＳＴＭ１：シーケストソーム１（ＮＭ＿００３９００）
（ｖｉｉ）ＴＮＦＡＩＰ２：腫瘍壊死因子α誘導蛋白質２（ＮＭ＿００６２９１）
（ｖｉｉｉ）ＩＴＭ２Ｂ：膜内在性蛋白質２Ｂ（ＮＭ＿０２１９９９）
（ｉｘ）ＡＢＣＣ２：ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー２（ＮＭ＿０００３９２）
（ｘ）ＡＮＸＡ３：アネキシンＡ３（ＮＭ＿００５１３９）
（ｘｉ）ＦＡＭ３Ｃ：相同配列３含有ファミリー・メンバー３（ＮＭ＿０１４８８８）
（ｘｉｉ）ＡＢＣＣ３：ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー３（ＮＭ＿００３７８６）
また、正の相関のある遺伝子、すなわちＥｇ５阻害剤に対する感受性が高い細胞ほどその発現量も高い遺伝子（以下、感受性遺伝子ともいう）の例として、以下の７遺伝子があげられる。
（ｉ）ＢＣＯ０７４３６：仮想蛋白質ＢＣ００７４３６（ＸＭ＿０３７３１７）
（ｉｉ）ＭＡＰ１Ｂ：微小管関連蛋白質１Ｂ（ＮＭ＿００５９０９）
（ｉｉｉ）ＣＣＮＢ１：サイクリンＢ１（ＮＭ＿０３１９６６）
（ｉｖ）ＨＳＰＣＡ：ヒートショック９０ｋＤａ蛋白質１α（ＢＣ０２３００６）
（ｖ）ＣＣＮＢ２：サイクリンＢ２（ＮＭ＿００４７０１）
（ｖｉｉ）ＦＬＪ２３２６９：仮想蛋白質ＦＬＪ２３２６９（ＡＫ０２６９２２）
（ｖｉｉ）ＳＬＣ１２Ａ２：溶質キャリアー・ファミリー１２・メンバー２（ＮＭ＿００１０４６）
これらの遺伝子は、かっこ内に示したＤＮＡ配列データーベースＧｅｎＢａｎｋの登録番号の配列を有する遺伝子として規定される。
あるＥｇ５阻害剤を用いて、その発現量がＥｇ５阻害剤に対する感受性と相関のある遺伝子と同定された遺伝子は、そのＥｇ５阻害剤だけでなく、他のＥｇ５阻害剤に対する感受性とも相関のある遺伝子と考えられる。
（Ｂ）癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法
本発明はさらに、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法を提供する。判定の方法としては、以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法があげられる。
（ａ）上記（Ａ）の方法により同定した遺伝子から１以上の遺伝子を選択し、その発現量に対応した点数を決定する工程
（ｂ）感受性を判定する癌細胞における該遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）各遺伝子について、工程（ｂ）で測定した発現量に基づき、工程（ａ）で決定した点数を割り当てる工程
（ｄ）選択された全遺伝子について割り当てられた点数から感受性の指標となる数値を求める工程
（ｅ）予め決定した閾値と（ｄ）で求めた数値とを比較することにより、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を判定するという工程
上記点数の決定、感受性の指標となる数値の計算、閾値との比較は、重回帰分析、判別分析、ＳＶＭ（サポートベクターマシン）法、主成分分析、自己組織化マップ法などの多変量解析の手法（ＳＡＳによる実験データの解析、竹内啓監修、東京大学出版会、１９９０などに記載）を用いることで行うことができる。
以下に、重回帰分析を用いた場合の各工程を説明する。選択した遺伝子がｎ個、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性Ｙを−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０で、各遺伝子の発現量をＣｔ値あるいはシグナル強度の対数で表した場合、重回帰分析モデルでは、遺伝子の発現量Ｘを説明変量として、以下の式１で目的変量である感受性Ｙを表すことができる。
Ｙ＝ａ_１Ｘ_１＋ａ_２Ｘ_２＋・・・・＋ａ_ｎＸ_ｎ＋ｂ（式１）
Ｙ：目的変量（感受性：−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０）
Ｘ_１、Ｘ_２、…Ｘ_ｎ：説明変量（遺伝子の発現量：Ｃｔ値あるいはシグナル強度の対数）
ａ_１、ａ_２、…ａ_ｎ：偏回帰係数
ｂ：定数項
以下、各遺伝子の発現量をＣｔ値で表した場合で説明するが、シグナル強度の対数を用いた場合もＣｔ値の代わりにシグナル強度の対数を用いて同様にして判定を行うことができる。
この式にｎ＋１種類の細胞株についての感受性Ｙ（−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０）および各遺伝子の発現量Ｘ_１、Ｘ_２、…Ｘ_ｎ（Ｃｔ値）を実測した値をそれぞれ代入することにより、ｎ＋１個の一次線形多項式を作成し、これらの一次線形多項式を解くことにより、各遺伝子についての偏回帰係数ａ_１、ａ_２、…ａ_ｎおよび定数項ｂを求めることができる。この方法で用いる遺伝子は、上記（Ａ）の方法により同定した遺伝子群から、任意に選ぶことができるが、Ｃｐ統計量、自由度調整ずみ決定係数、赤池の情報量基準などの基準用の統計量を最適化の指標として、指標が小さくなるように遺伝子を選択していくことが望ましい。このようにして、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性の予測に重要な遺伝子を選択することにより、複雑さを抑えながら、予測精度を上げること、すなわち最適化を行うことができる。重回帰分析モデルの場合、各遺伝子の点数は、上記で得られた偏回帰係数と遺伝子の発現量の積として表される。
重回帰分析モデルを最適化した場合に選択される、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性の予測に重要な遺伝子の例としては、（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に相関がある遺伝子としてあげた１９遺伝子から選択された、ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＡＰＲＴ、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２およびＦＬＪ２３２６９があげられる。
以上のようにして選択した遺伝子の、感受性を判定する癌細胞における発現量（Ｃｔ値）は、上記（Ａ）（３）に記載した方法により測定することができる。得られた各遺伝子のＣｔ値から、上述した各遺伝子の点数、すなわち上記で得られた偏回帰係数ａとそのＣｔ値の積を割り当てる。式１に基づき、割り当てられた各遺伝子の点数の合計に定数項ｂの値を加えることにより、感受性の指標となる数値−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０が求められる。したがって、−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０の閾値として、例えば、上記（Ａ）の遺伝子の選抜の際に測定した、各癌細胞の感受性の指標となる数値（−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０）の平均値など、適当なある数値を設定し、その閾値と比較することにより、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定することができる。
癌細胞として、癌患者から生検などにより取り出した癌組織由来の癌細胞を用いることにより、その癌患者の癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定することができる。その癌患者由来の癌細胞が、Ｅｇ５阻害剤に感受性が高いと判定された場合に、Ｅｇ５阻害剤を治療に用いることにより、効果的に治療を行うことができる。
（Ｃ）癌細胞の感受性を規定する遺伝子の選択
（Ａ）の方法によりＥｇ５阻害剤に対する感受性と相関があると判断された遺伝子が、実際に感受性を規定しているか、すなわち遺伝子の発現量を変化させることによりＥｇ５阻害剤に対する感受性を変化させることができるかを調べるには、以下の方法を用いることができる。
（１）遺伝子の強制発現
（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に正の相関がある遺伝子群から選ばれた遺伝子蛋白質コード領域を含むｃＤＮＡを適当な動物細胞の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを癌細胞に導入することで、該遺伝子を強制発現させその発現量を上げることができる。この癌細胞にＥｇ５阻害剤を添加しＥｇ５阻害剤に対する感受性を測定する。発現ベクターを導入しない場合と比較してＥｇ５阻害剤に対する感受性が高くなる場合には、その遺伝子は癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定する遺伝子であり、その発現量を上げることにより、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強することができる遺伝子であることがわかる。
発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２〔クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社〕、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８（Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ１〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社〕、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社）、ｐＭＳＧ〔アマシャム・バイオサイエンス（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社〕、ｐＡＭｏ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７，１９９３）などを例示することができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４，７４１３−７４１７，１９８７）などをあげることができる。
（２）遺伝子の発現抑制
（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に負の相関がある遺伝子群から選ばれた遺伝子に対応するアンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンスポリヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡの発現ベクターを癌細胞に導入することで、該遺伝子の発現を抑制し、その発現量を下げることができる。この癌細胞にＥｇ５阻害剤を添加し、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を測定する。遺伝子発現を抑制しない場合と比較してＥｇ５阻害剤に対する感受性が高くなる場合には、その遺伝子は癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定する遺伝子であり、その発現量を下げることにより、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強することができる遺伝子であることがわかる。
ｓｉＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、またはｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドの発現ベクターは下記（Ｅ）に記載に基づいて作製および癌細胞への導入を行うことができる。
（Ｄ）Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬（ｉ）
（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性の間に正の相関がある遺伝子、例えばＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２の中から選択される単独または複数の遺伝子であって、上記（Ｃ）の（１）に記載した方法により癌細胞に強制発現させることによってＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子を含有する遺伝子治療薬は、該Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として用いることができる。また、該遺伝子の強制発現の結果、癌細胞における該遺伝子がコードする蛋白質の量が増加することにより、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性が増強されると考えられるので、該遺伝子がコードする蛋白質を含有する蛋白製剤は、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として使用することができる。
上記したＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子または該遺伝子がコードする蛋白質は、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として単独で用いることが可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として用いることが望ましい。このような医薬製剤の詳細については、本明細書中の（Ｇ）に後記する。
（Ｅ）Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬（ｉｉ）
（Ａ）で選抜された発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性の間に負の相関がある遺伝子、例えばＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３の中から選択される単独または複数の遺伝子であって、癌細胞において該遺伝子の発現を抑制することで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドまたは該ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを発現するベクターは、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として使用することができる。また、その感受性の増強は、該遺伝子がコードする蛋白質の機能が関与していると考えられるので、該遺伝子がコードする蛋白質に対する抗体、好ましくは該蛋白質の機能を抑制する中和抗体を含有する薬剤は、該Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として用いることができる。
次に本発明で用いるｓｉＲＮＡについて説明する。ｓｉＲＮＡとは、ある標的遺伝子のｍＲＮＡの一部の配列とその相補的な配列を含む短い二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）により、該遺伝子の発現を抑制できるものをいう。ｓｉＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡの塩基配列から文献（ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１３，３１９１−３１９７，１９９９）の条件に基づいて適宜設計することができる。好ましくは、ｍＲＮＡの翻訳領域中の開始コドンより５０〜１００塩基下流の領域中で、ＡＡに続く１９塩基、ＧＣ含量が３０〜７０％、より好ましくは５０％前後の配列を選択する。選択した１９塩基の配列および相補的な配列それぞれの３’端にＴＴを付加した配列を有する２本のＲＮＡをＤＮＡ合成機により合成し、アニーリングすることによりｓｉＲＮＡを作製できる。また、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ１．０−Ｕ６〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社〕、ｐＳＵＰＥＲ〔オリゴエンジン（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ）社〕などのｓｉＲＮＡ発現用ベクターに上記の選択した１９塩基の配列に相当するＤＮＡを挿入することにより、該遺伝子の発現を抑制できるｓｉＲＮＡを発現するベクターを作製することができる。
また、本発明で用いるアンチセンスポリヌクレオチドとは、標的遺伝子の塩基配列中の連続した１５塩基以上の配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチドの誘導体が含まれる。ポリヌクレオチド誘導体としては、ポリヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシンで置換されたポリヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド中のリボースが２’−ｏ−プロピルリボースで置換されたポリヌクレオチド誘導体、あるいはポリヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたポリヌクレオチド誘導体などをあげることができる。
アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術（バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２，１９９２；化学，４６，６８１，１９９１；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８−３６２，１９９２；ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，８７−９１，１９９２；ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，１５２−１５８，１９９２；細胞工学，１６，１４６３（１９９７））、トリプル・ヘリックス技術（ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，１３２−１３６，１９９２）に基づき、上記のアンチセンスポリヌクレオチドを癌細胞に投与することにより、癌細胞での標的遺伝子の転写または翻訳を抑制し、その結果、標的遺伝子の発現を抑制することができる。特に標的遺伝子のポリペプチドをコードする領域の開始コドンを含む１５〜１００塩基と相補的な塩基配列が好ましい。また、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼによる分解を受けないポリヌクレオチド誘導体が好ましい。
アンチセンスポリヌクレオチドは、市販のＤＮＡ合成機、ＷＯ９３／２００９５、ＷＯ０２／１０１８５に記載した方法などを用いて製造することができる。また、（Ｃ）の（１）の遺伝子の強制発現に用いる発現ベクターのプロモーターの下流に標的遺伝子を逆向きにつなげた組換え体ベクターを作製し、この組換え体ベクターを癌細胞に導入することにより、細胞内でアンチセンスＲＮＡを発現することができる。
蛋白質に対する抗体は（Ａ）（４）（ｉｉｉ）に記載したような当業者に公知の方法により取得することができる。該蛋白質の機能を抑制する中和抗体は、該蛋白質に対する抗体と該蛋白質とを結合させて該蛋白質の機能を測定し、抗体を結合させない場合と比較して、該蛋白質の機能が抑制されるような抗体を、該蛋白質に対する抗体の中から選択することにより得ることができる。
上記した各種Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示すｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド、該ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを発現するベクターならびに抗体は、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として単独で用いることが可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として用いることが望ましい。このような医薬製剤の詳細については、本明細書中の（Ｇ）に後記する。
（Ｆ）Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質のスクリーニング方法
細胞に試験物質を投与して、（Ａ）で選抜されたその発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に正の相関がある遺伝子、例えばＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２から選択される１つ以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を投与しない場合の発現量と比較し、該遺伝子の発現量が上昇する物質を選択することにより、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質の候補物質をスクリーニングすることができる。特に、遺伝子が（Ｃ）の（１）に記載の方法で選択されたＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定する遺伝子である場合には、この方法によりＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質をスクリーニングすることができる。
また、細胞に試験物質を投与して、（Ａ）で選抜されたその発現量とＥｇ５阻害剤に対する感受性との間に負の相関がある遺伝子、例えばＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３から選択される１つ以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を投与しない場合の発現量と比較し、該遺伝子の発現量が減少する物質を選択することにより、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質の候補物質をスクリーニングすることができる。特に、遺伝子が（Ｃ）の（２）に記載の方法で選択されたＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定する遺伝子である場合には、この方法によりＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質をスクリーニングすることができる。
これらの物質がＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させることは、癌細胞にこれらの物質を投与し、そのＥｇ５阻害剤に対する感受性を測定して、物質を投与しない場合の感受性と比較することにより確認できる。
遺伝子の発現量は、細胞として、癌細胞、特に測定する遺伝子を選抜する際に用いたヒト癌細胞株パネルの中から選択した癌細胞株を用い、（Ａ）の（３）に記載した方法で、該遺伝子のｍＲＮＡや該遺伝子がコードする蛋白質量を測定することにより測定できる。あるいは、以下のようにして、発現量を測定する遺伝子の発現制御領域を含むレポーター発現細胞を作製し、該細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を、目的の遺伝子の発現量として測定することができる。レポーター発現細胞は、ヒトゲノムＤＮＡから発現量を測定する遺伝子のコード領域の上流に存在する発現制御領域を単離し、適当な動物細胞用の発現ベクターの外来遺伝子発現用のプロモーターを除いて、代わりにその発現制御領域を挿入し、その下流に適当なレポーター遺伝子に結合したベクターを細胞に導入して作製することができる。レポーター遺伝子としてはホタルルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などを用いることができる。レポーター遺伝子の発現量の測定は、ルシフェラーゼやβ−ガラクトシダーゼの酵素活性により発光または発色する基質を利用した発光量または発色量の測定、ＧＦＰの発する蛍光量の測定により行うことができる。
被験試料としては、合成化合物、天然に存在する蛋白質、人工的に合成された蛋白質、ペプチド、糖質、脂質、これらの修飾体、誘導体を、また哺乳動物（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒトなど）の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物を、更に、非ペプチド性化合物、発酵生産物、植物その他の生物の抽出物などをあげることができる。
上記した本発明のスクリーニング方法により取得される物質は、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として有用である。
（Ｇ）本発明のＥｇ５阻害剤に対する感受性増強薬の医薬製剤
本明細書中の上記（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）に記載した通りの各種の遺伝子、蛋白質、抗体および物質などはＥｇ５阻害剤に対する感受性増強薬として単独で用いることも可能ではあるが、通常は各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物または人に使用されるものである。
本発明に係わる医薬製剤は、上記の活性成分またはその薬理学的に許容される塩を単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
投与経路としては、予防または治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、例えば錠剤、注射剤などがあげられる。
経口投与に適当な例えば錠剤などは、乳糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤は好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。また、これらの非経口剤においても経口剤で例示した賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤および希釈剤、防腐剤、フレーバー類などから選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
上記の活性成分またはその薬理学的に許容される塩は、上記の目的で用いる場合、通常、全身的または局所的に、経口または非経口の形で投与される。投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度などにより異なるが、通常経口の場合、成人１人あたり、１回につき０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０５〜５００ｍｇの範囲で、１日１回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、通常成人一人当り０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜３００ｍｇを一日一回ないし数回投与するか、または１日１〜２４時間の範囲で静脈内に持続投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
また、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強のための有効成分としてＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を利用する遺伝子治療剤の場合には、該ＤＮＡまたはＲＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、上記に記載した常法に従って製剤化、処方および投与する方法、あるいは非ウイルス遺伝子移入法により投与する方法を使用することができる。
組換えウイルスベクターは、以下に記載の方法に従い作製することができる。
有効成分として使用するＤＮＡ（以下、対象ＤＮＡとも称する）の断片を調製する。該ＤＮＡ断片をウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスベクターを造成する。
ＲＮＡウイルスベクターの場合には、対象ＤＮＡに相同なＲＮＡ断片を調製し、それらをウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスを造成する。ＲＮＡ断片は、２本鎖のほか、ウイルスベクターの種類に応じて、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のどちらか一方の鎖を選択する。例えば、レトロウイルスベクターの場合は、センス鎖に相同なＲＮＡを、センスウイルスベクターの場合には、アンチセンス鎖に相同なＲＮＡを選択する。
該組換えウイルスベクターを、該ベクターに適合したパッケージング細胞に導入する。パッケージング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要な蛋白質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組換えウイルスベクターの該欠損する蛋白質を補給できる細胞であればいかなるものでもよい。例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３などを用いることができる。パッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウイルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなど、レンチウイルスベクターの場合はＨＩＶ由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆなど、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂなど、アデノ随伴ウイルスの場合はＲｅｐ（ｐ５、ｐ１９、ｐ４０）、Ｖｐ（Ｃａｐ）などの蛋白質があげられる。
ウイルスベクターとしては、上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、標的細胞で対象ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プラスミドベクターとしてはＭＦＧ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，６７３３−６７３７，１９９５）、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１８，３５８７−３５９６，１９９０）、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，８１５０−８１５７，１９９８）、ｐＡｄｅｘ１（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２３，３８１６−３８２１，１９９５）などが用いられる。プロモーターとしては、ヒト組織中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＳＲαプロモーターなどをあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
パッケージング細胞への組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７，１９８７）などをあげることができる。
また、上記組換えウイルスベクターの投与方法としては、上記の方法に加え、リポソームデリバリーを用いる直接的イン・ビボ（ｉｎｖｉｖｏ）遺伝子移入と組み合わせることにより、患者の癌組織にウイルスベクターを指向させるようにすることもできる。すなわち、適当なサイズの対象ＤＮＡを、アデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させることにより、ウイルスベクターを調製することができる。該ウイルスベクターは安定に標的細胞に到達し、エンドソームにより細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され効率的に遺伝子を発現させることができる。
本発明においては、対象ＤＮＡあるいはｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを発現するベクターは非ウイルス遺伝子移入法によっても病巣に輸送することができる。
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７，１９７３；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９，１４１４−１４２２，１９８０）、マイクロインジェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５３９９−５４０３，１９８０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，７３８０−７３８４，１９８０；Ｃｅｌｌ，２７，２２３−２３１，１９８１；Ｎａｔｕｒｅ，２９４，９２−９４，１９８１）、リポソー厶を介した膜融合−介在移入法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７，１９８７；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，９５０８−９５１４，１９８９；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１２１２６−１２１２９，１９８９；Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，３，２６７−２７５，１９９２；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１２８５−１２８８，１９９０；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８３，２００７−２０１１，１９９２）あるいは直接ＤＮＡ取り込みおよび受容体を介したＤＮＡ移入法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，１９９０；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１４３３８−１４３４２，１９９１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３６５５−３６５９，１９９０；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１６９８５−１６９８７，１９８９；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，４７４−４８５，１９９１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３４１０−３４１４，１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４２５５−４２５９，１９９１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，４０３３−４０３７，１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８８５０−８８５４，１９９１；Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，３，１４７−１５４，１９９１）などをあげることができる。
リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込みおよび発現が可能である。ＤＮＡを患者の癌組織に直接標的化するには、直接ＤＮＡ取り込み技術が好ましい。受容体を介したＤＮＡ移入は、例えば、ポリリジンを介して、蛋白質リガンドにＤＮＡ（通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる）をコンジュゲートすることによって行う。リガンドは、標的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド−ＤＮＡコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびＤＮＡ−蛋白質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。ＤＮＡの細胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。  An object of the present invention is to provide a method for identifying genes involved in the sensitivity of cancer cells to Eg5 inhibitors and a method for determining the sensitivity of cancer cells to Eg5 inhibitors using these genes.
  The present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems. First, in a human cancer cell line panel comprising 38 cell lines, the sensitivity to Eg5 inhibitors and the expression levels of 119 types of human genes were measured. In particular, in 26 strains derived from lung cancer, 19 genes whose expression was correlated with sensitivity to Eg5 inhibitors were selected. In addition, the present inventors constructed a statistical model for predicting the sensitivity of cancer cells to Eg5 inhibitors from the expression levels of these genes, and further reduced the number of genes used for prediction to 11 Was also successful.
  By using this model and examining the expression of a small number of selected genes, it has become possible to provide a method for determining the sensitivity of cancer patients to anticancer agents. Furthermore, it has become possible to provide a method for enhancing the sensitivity to anticancer agents by increasing or decreasing the expression of those genes, and a method for screening for substances that enhance the sensitivity to these anticancer agents. The present invention has been completed based on these findings.
  That is, the present invention relates to the following (1) to (54).
(1) The following steps (a) to (c)
(A) measuring two or more human cancer cell lines, the sensitivity to an Eg5 inhibitor and the expression level of one or more human genes;
(B) for each gene whose expression level was measured in step (a), analyzing the correlation between the expression level of the gene in each cell line and the sensitivity of the cell line to Eg5 inhibitor;
(C) a step of selecting genes correlated in step (b),
A method for identifying a gene involved in sensitivity of a cancer cell to an Eg5 inhibitor.
(2) The human cancer cell lines used for measurement in step (a) are A549, Calu-1, Calu-3, NCI-H23, NCI-H69, NCI-H226, NCI-H345, N417, NCI-H460, NCI. -H596, NCI-H1299, SBC-3, PC-14, PC-14 / DTX, PC-14 / CDDP, MRC-5, IMR-90, EBC-1, NCI-H292, SHP-77, NCI-H441 A cell line derived from lung cancer consisting of NCI-H838, A427, NCI-H522, Calu-6 and PC-9, a cell line derived from colon cancer consisting of Colo205, HT-29, HCT116, SW480, DLD-1 and WiDr, Pancreatic cancer-derived cells comprising PANC-1, MIA PaCa-2, ASPC-1 and BxPC-3 The method according to (1), wherein the cell line is all or part of a cell line selected from the group consisting of cell lines derived from ovarian cancer consisting of SK-OV-3 and OVCAR-3.
(3) The cell lines selected are A549, Calu-1, Calu-3, NCI-H23, NCI-H69, NCI-H226, NCI-H345, N417, NCI-H460, NCI-H596, NCI-H1299, SBC-3, PC-14, PC-14 / DTX, PC-14 / CDDP, MRC-5, IMR-90, EBC-1, NCI-H292, SHP-77, NCI-H441, NCI-H838, A427, The method according to (2), wherein the cell line is all or a part of cell lines selected from lung cancer-derived cell lines consisting of NCI-H522, Calu-6 and PC-9.
(4) The method according to (1), wherein the human cancer cell line used for measurement in step (a) is a cancer cell line derived from one specific organ.
(5) The method according to (4), wherein one specific organ is the lung.
(6) An Eg5 inhibitor that measures the strength of sensitivity is represented by the general formula (I)

<In the formula,
R¹And R⁴Are the same or different and represent a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted Represents an unsubstituted heterocyclic group,
R²Is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocycle Group, -C (= W) R⁶Wherein W represents an oxygen atom or a sulfur atom, and R⁶Is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocycle Group, -NR⁷R⁸(Wherein R⁷And R⁸Are the same or different and represent a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted Represents an unsubstituted heterocyclic group, or R⁷And R⁸Together with the adjacent nitrogen atom form a substituted or unsubstituted heterocyclic group), -OR⁹(Wherein R⁹Represents substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, or substituted or unsubstituted heterocyclic group ) Or -SR¹⁰(Wherein R¹⁰Is the above R⁹Is the same meaning as¹¹R¹²{Where R is¹¹And R¹²Are the same or different and represent a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted Unsubstituted heterocyclic group or -C (= O) R¹³[Wherein R¹³Is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocycle Group, -NR^7AR^8A(Wherein R^7AAnd R^8AEach of the above R⁷And R⁸And -OR^9A(Wherein R^9AIs the above R⁹Or -SR^10A(Wherein R^10AIs the above R⁹Represents the same) or represents —SO₂R¹⁴(Wherein R¹⁴Is the above R⁹Or R¹And R²Together with the adjacent nitrogen atom to form a substituted or unsubstituted heterocyclic group,
R⁵Represents substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, or substituted or unsubstituted heterocyclic group. Or R⁴And R⁵Together-(CR^15AR^15B)_m1-Q- (CR^15CR^15D)_m2-{Wherein Q represents a single bond, substituted or unsubstituted phenylene or cycloalkylene, and m1 and m2 are the same or different and represent an integer of 0 to 4, but m1 and m2 are not 0 at the same time, R^15A, R^15B, R^15CAnd R^15DAre the same or different and are a hydrogen atom, halogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, -OR¹⁶[Wherein R¹⁶Is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocyclic group, -CONR^7BR^8B(Wherein R^7BAnd R^8BAre the same or different and represent a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted Represents an unsubstituted heterocyclic group, or R^7BAnd R^8BTogether with the adjacent nitrogen atom form a substituted or unsubstituted heterocyclic group), -SO₂NR^7CR^8C(Where R^7CAnd R^8CEach of the above R^7BAnd R^8BOr -COR¹⁷(Wherein R¹⁷Is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, or substituted or unsubstituted heterocycle Represents a group)], -NR¹⁸R¹⁹[Wherein R¹⁸And R¹⁹Are the same or different and are a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or Unsubstituted heterocyclic group, -COR²⁰(Wherein R²⁰Is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocycle Group, substituted or unsubstituted lower alkoxy, substituted or unsubstituted aryloxy, amino, substituted or unsubstituted lower alkylamino, substituted or unsubstituted di-lower alkylamino or substituted or unsubstituted arylamino) or -SO₂R²¹(Wherein R²¹Represents substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, or substituted or unsubstituted heterocyclic group )] Or -CO₂R²²(Wherein R²²Is the above R¹⁷Or R^15AAnd R^15BOr R^15CAnd R^15DTogether represent an oxygen atom, and when m1 or m2 is an integer of 2 or more, each H^15A, R^15B, R^15CAnd R^15DMay be the same or different, and R bonded to two adjacent carbon atoms^15A, R^15B, R^15CAnd R^15DEach may form a bond together,
R³Is a hydrogen atom or -C (= W^A) R²³(Where^AAnd R²³Are W and R respectively.⁶The method according to any one of (1) to (5), which is a thiadiazoline derivative represented by> or a pharmacologically acceptable salt thereof.
(7) R¹Is a hydrogen atom and R²Is -C (= O) R^6A(Wherein R^6ARepresents lower alkyl) and R³Is -C (= O) R^23A(Wherein R^23ARepresents lower alkyl) and R⁴Is substituted lower alkyl and R⁵The method according to (6), wherein is phenyl.
(8) R⁴Is-(CH₂)_naNHSO₂R^a(In the formula, na is 1 or 2, and R^aRepresents a substituted or unsubstituted lower alkyl). (6) or (7).
(9) The thiadiazoline derivative represented by the general formula (I) is a compound selected from the group consisting of compounds represented by the following formulas (A) to (C) and (E) to (P) (6) The method described in 1.

(10) An Eg5 inhibitor that measures the strength of sensitivity is represented by the general formula (II)

(Wherein R²⁴Represents a substituted or unsubstituted aryl or a substituted or unsubstituted aromatic heterocyclic group, R²⁵And R²⁶Are the same or different and each represents a hydrogen atom, halogen, lower alkyl, lower alkoxy, hydroxy, carboxy, or hydroxymethyl, or R²⁵And R²⁶Or a pharmacologically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. .
(11) The method according to (10), wherein the cysteine derivative is an L-cysteine derivative.
(12) R²⁴Is phenyl, 4-methylphenyl, 2-naphthyl, 4-pyridyl, or 1,3-benzodioxol-5-yl;²⁵And R²⁶The method according to (10) or (11), wherein are the same or different and each is a hydrogen atom, halogen, lower alkyl, lower alkoxy, hydroxy, carboxy, or hydroxymethyl.
(13) The Eg5 inhibitor that measures the strength of sensitivity is a compound represented by the following formula (Q) or a pharmacologically acceptable salt thereof, any one of (1) to (5) The method described in 1.

(14) Steps (a) to (e) below
(A) selecting one or more genes from the genes identified by the method according to any one of (1) to (13), and determining a score according to the expression level;
(B) measuring the expression level of the gene selected in step (a) for the test cancer cell;
(C) assigning the score determined in step (a) based on the expression level measured in step (b) for each gene,
(D) obtaining a numerical value as an index of the sensitivity of the test cancer cell to the Eg5 inhibitor from the assigned score for all the selected genes;
(E) a step of comparing a predetermined threshold value with a numerical value obtained in (d);
A method for determining the sensitivity of cancer cells to an Eg5 inhibitor.
(15) The method according to (14), wherein the gene selected in step (a) is one or more genes selected from the gene group consisting of the following genes (i) to (xix):
(I) cytochrome P450 family 24 subfamily A polypeptide 1 (CYP24A1)
(Ii) Leptin receptor gene-related protein (OBRGRP)
(Iii) Factor B (BF)
(Iv) Adenine phosphoribosyl transferase (APRT)
(V) Baculovirus IAP repeat-containing protein (BIRC3)
(Vi) Sequestsome 1 (SQSTM1)
(Vii) Tumor necrosis factor α-inducing protein 2 (TNFAIP2)
(Viii) integral membrane protein 2B (ITM2B)
(Ix) ATP binding cassette subfamily C member 2 (ABCC2)
(X) Annexin A3 (ANXA3)
(Xi) Homologous sequence 3 containing family member 3 (FAM3C)
(Xii) ATP binding cassette subfamily C member 3 (ABCC3)
(Xiii) hypothetical protein BC007436 (BC007436)
(Xiv) Microtubule-related protein 1B (MAP1B)
(Xv) Cyclin B1 (CCNB1)
(Xvi) Heat shock 90 kDa protein 1α (HSPCA)
(Xvii) Cyclin B2 (CCNB2)
(Xviii) hypothetical protein FLJ23269 (FLJ23269)
(Xix) Solute Carrier Family 12 Member 2 (SLC12A2)
(16) The method according to (15), wherein the genes selected in the step (a) are CYP24A1, OBRGRP, APRT, TNFAIP2, ITM2B, ABCC2, BC007436, MAP1B, HSPCA, CCNB2 and FLJ23269.
(17) The Eg5 inhibitor is the thiadiazoline derivative according to any one of (6) to (9) or a pharmacologically acceptable salt thereof according to any one of (14) to (16) The method described.
(18) The Eg5 inhibitor is the cysteine derivative according to any one of (10) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof, according to any one of (14) to (16) The method described.
(19) The method according to any one of (14) to (16), wherein the Eg5 inhibitor is the compound according to (13) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
(20) The method according to any one of (14) to (19), wherein the cancer cells are lung cancer cells.
(21) The method according to any one of (1) to (20), wherein the expression level of the gene is measured by quantifying mRNA, which is a transcription product of the gene, using a DNA microarray.
(22) The method according to any one of (1) to (20), wherein the expression level of the gene is measured by quantifying mRNA, which is a transcription product of the gene, by quantitative PCR.
(23) The method according to any one of (1) to (20), wherein the expression level of the gene is measured by quantifying mRNA, which is a transcription product of the gene, by Northern blotting.
(24) An mRNA quantification reagent comprising an oligonucleotide complementary to the mRNA for use in the method according to (22).
(25) The method according to any one of (1) to (20), wherein the expression level of the gene is measured by quantifying a protein that is a gene product of the gene by an immunochemical method.
(26) The method according to (25), wherein the expression level of the gene is measured by quantifying the protein that is the gene product of the gene by ELISA.
(27) The method according to (25), wherein the expression level of the gene is measured by quantifying a protein that is a gene product of the gene by Western blot.
(28) An immunoassay reagent comprising an antibody against the protein for use in the method according to any one of (25) to (27).
(29) A single gene or a plurality of genes selected from the group consisting of BC007436, MAP1B, CCNB1, HSPCA, CCNB2, FLJ23269, and SLC12A2, and has an activity of enhancing sensitivity to an Eg5 inhibitor by forced expression in cancer cells. A drug for enhancing sensitivity to an Eg5 inhibitor, comprising the gene shown or a protein encoded by the gene.
(30) The sensitivity enhancer according to (29), wherein the cell is a lung cancer cell.
(31) The sensitivity enhancer according to (29) or (30), wherein the Eg5 inhibitor is the thiadiazoline derivative or a pharmacologically acceptable salt thereof according to any one of (6) to (9).
(32) The sensitivity enhancer according to (29) or (30), wherein the Eg5 inhibitor is the cysteine derivative according to any one of (10) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
(33) The sensitivity enhancer according to (29) or (30), wherein the Eg5 inhibitor is the compound according to (13) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
(34) A test substance is added to the cell, and the expression level of at least one gene selected from the group consisting of BC007436, MAP1B, CCNB1, HSPCA, CCNB2, FLJ23269 and SLC12A2 in the cell is measured, and the test substance is added A method for screening a substance that enhances sensitivity to an Eg5 inhibitor, wherein a substance that increases the expression of the gene as compared with the expression level of the gene when not used is selected as a candidate substance that enhances sensitivity to the Eg5 inhibitor.
(35) The screening method according to (34), wherein the cell is a lung cancer cell.
(36) The screening method according to (34) or (35), wherein the Eg5 inhibitor is the thiadiazoline derivative or a pharmacologically acceptable salt thereof according to any one of (6) to (9).
(37) The screening method according to (34) or (35), wherein the Eg5 inhibitor is the cysteine derivative according to any one of (10) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
(38) The screening method according to (34) or (35), wherein the Eg5 inhibitor is the compound according to (13) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
(39) A single gene or a plurality of genes selected from the group consisting of CYP24A1, OBRGRP, BF, APRT, BIRC3, SQSTM1, TNFAIP2, ITM2B, ABCC2, ANXA3, FAM3C, and ABCC3, and the expression of the gene in cancer cells. An siRNA or antisense polynucleotide that suppresses the expression of a gene exhibiting an activity that enhances sensitivity to an Eg5 inhibitor by suppressing the gene.
(40) The siRNA or antisense polynucleotide according to (39), wherein the cancer cell is a lung cancer cell.
(41) The siRNA or antisense according to (39) or (40), wherein the Eg5 inhibitor is the thiadiazoline derivative or a pharmacologically acceptable salt thereof according to any one of (6) to (9) Polynucleotide.
(42) The siRNA or antisense according to (39) or (40), wherein the Eg5 inhibitor is the cysteine derivative according to any one of (10) to (12) or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Polynucleotide.
(43) The siRNA or antisense polynucleotide according to (39) or (40), wherein the Eg5 inhibitor is the compound according to (13) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
(44) A vector for expressing the siRNA or antisense polynucleotide according to any one of (39) to (43).
(45) A sensitivity enhancer for an Eg5 inhibitor, comprising the siRNA or antisense polynucleotide according to any one of (39) to (43) or the vector according to (44).
(46) Any gene selected from CYP24A1, OBRGRP, BF, APRT, BIRC3, SQSTM1, TNFAIP2, ITM2B, ABCC2, ANXA3, FAM3C, and ABCC3, by suppressing the expression of the gene in cancer cells An agent for enhancing sensitivity to an Eg5 inhibitor, comprising an antibody against a protein encoded by a gene exhibiting an activity to enhance sensitivity to an Eg5 inhibitor.
(47) The sensitivity enhancer according to (46), wherein the Eg5 inhibitor is the thiadiazoline derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of (6) to (9).
(48) The sensitivity enhancer according to (46), wherein the Eg5 inhibitor is the cysteine derivative according to any one of (10) to (12) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
(49) The sensitivity enhancer according to (46), wherein the Eg5 inhibitor is the compound according to (13) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
(50) A test substance is added to a cell, and at least one gene selected from the group consisting of CYP24A1, OBRGRP, BF, APRT, BIRC3, SQSTM1, TNFAIP2, ITM2B, ABCC2, ANXA3, FAM3C and ABCC3 in the cell An expression level is measured, and a substance that decreases the expression of the gene as compared to the expression level of the gene when no test substance is added is selected as a candidate substance that enhances sensitivity to the Eg5 inhibitor. A screening method for substances that enhance sensitivity.
(51) The screening method according to (50), wherein the cell is a lung cancer cell.
(52) The screening method according to (50) or (51), wherein the Eg5 inhibitor is the thiadiazoline derivative or a pharmacologically acceptable salt thereof according to any one of (6) to (9).
(53) The screening method according to (50) or (51), wherein the Eg5 inhibitor is the cysteine derivative according to any one of (10) to (12) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
(54) The screening method according to (50) or (51), wherein the Eg5 inhibitor is the compound according to (13) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  Hereinafter, the compound represented by general formula (I) is referred to as compound (I), and the compound represented by general formula (II) is referred to as compound (II). Furthermore, the compound represented by the general formula (A) is referred to as Compound A. The same applies to the compounds of other formula numbers.
  Embodiments of the present invention are described in detail below.
(A) A method for identifying a gene involved in sensitivity of a cancer cell to an Eg5 inhibitor
  The method for identifying a gene involved in sensitivity to an Eg5 inhibitor of the present invention includes the following steps (a) to (c).
(A) A step of measuring sensitivity to an Eg5 inhibitor and the expression level of one or more human genes for two or more human cancer cell lines
(B) For each gene whose expression level was measured in step (a), analyzing the correlation between the expression level of the gene in each cell line and the sensitivity of the cell line to Eg5 inhibitor
(C) A step of selecting genes correlated in step (b)
(1) Human cancer cell line
  The human cancer cell line used for measurement in the present invention may be any cell line as long as it is a human-derived cancer cell line, but the more types of cell lines, the more the correlation analysis in the above step (b), Since the possibility that the obtained correlation value is significant increases, it is preferable. Specific cell line panels include 26 cell lines derived from lung cancer, A549, Calu-1, Calu-3, NCI-H23, NCI-H69, NCI-H226, NCI-H345, N417, NCI-H460, NCI-H596, NCI-H1299, SBC-3, PC-14, PC-14 / DTX, PC-14 / CDDP, MRC-5, IMR-90, EBC-1, NCI-H292, SHP-77, NCI- H441, NCI-H838, A427, NCI-H522, Calu-6 and PC-9, 6 cell lines derived from colon cancer, Colo205, HT-29, HCT116, SW480, DLD-1 and WiDr, 4 derived from pancreatic cancer Cell lines PANC-1, MIA PaCa-2, AsPC-1 and BxPC-3, derived from ovarian cancer 2 all or part of the panel of SK-OV-3 and OVCAR-3 cell lines is the cell line may be used.
  Moreover, since the importance of the gene to be expressed and the function of the gene to cells differs depending on the organ, it is considered that the gene involved in sensitivity to the Eg5 inhibitor varies depending on the organ from which the cancer cell is derived. Therefore, by making the cell line used for the measurement a cancer cell line derived from one specific organ, it is possible to identify a gene that is specifically involved in the sensitivity of the cancer cells of that organ to the Eg5 inhibitor. For example, when it is desired to specifically identify a gene relating to the sensitivity of an Eg5 inhibitor to lung cancer cells, such as when an Eg5 inhibitor is used for the treatment of lung cancer, only the lung cancer cell line, for example, A549, Calu, which is a 26 cell line derived from lung cancer -1, Calu-3, NCI-H23, NCI-H69, NCI-H226, NCI-H345, N417, NCI-H460, NCI-H596, NCI-H1299, SBC-3, PC-14, PC-14 / DTX PC-14 / CDDP, MRC-5, IMR-90, EBC-1, NCI-H292, SHP-77, NCI-H441 NCI-H838, A427, NCI-H522, Calu-6 and PC-9 To identify genes related to susceptibility to Eg5 inhibitors in lung cancer cells Rukoto can.
(2) Eg5 inhibitor
  The Eg5 inhibitor used in the present invention is not particularly limited as long as it is an Eg5 inhibitory compound. For example, compound (I) described in WO2004 / 092147 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, compound (II) Or a pharmacologically acceptable salt thereof, compound Q (SB-715992) described in WO01 / 030768, WO01 / 098278, or a pharmacologically acceptable salt thereof, WO02 / 057244, WO03 / 094839, WO03 / 097053, WO03 / 103575, WO03 / 106426, WO04 / 006865, WO04 / 009036, WO04 / 024086, WO04 / 032840, WO04 / 034972, WO03 / 039460, WO03 / 049527, WO03 / 050122, WO03 / 50064, WO03 / 049678, WO03 / 049677, WO03 / 079973, WO03 / 092911, WO03 / 105855, WO04 / 037171, WO04 / 039774, WO04 / 058700, WO04 / 05148, WO02 / 078639, WO02 / 079149, WO02 / 079169, Examples include compounds described in WO03 / 099286, WO04 / 078758 and the like, preferably compound (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof, compound (II) or a pharmacologically acceptable salt or compound thereof Q or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  In the definition of each group of general formulas (I) and (II):
  (I) Lower alkyl part of lower alkyl, lower alkoxy, lower alkylamino and di-lower alkylamino includes, for example, linear or branched alkyl having 1 to 10 carbon atoms, specifically methyl, ethyl, propyl, isopropyl Butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl and the like.
  The two lower alkyl moieties of the di-lower alkylamino may be the same or different.
  (Ii) Examples of lower alkenyl include linear or branched alkenyl having 2 to 8 carbon atoms, specifically vinyl, allyl, butenyl, pentenyl, hexenyl, heptenyl, octenyl and the like.
  (Iii) Examples of lower alkynyl include linear or branched alkynyl having 2 to 8 carbon atoms, specifically ethynyl, propynyl, butynyl, pentynyl, hexynyl, heptynyl, octynyl and the like.
  Examples of (iv) cycloalkyl include cycloalkyl having 3 to 8 carbon atoms, specifically cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl and the like.
  (V) Examples of the aryl moiety of aryl, aryloxy and arylamino include phenyl, naphthyl and the like.
  (Vi) Examples of the heterocyclic group include an aliphatic heterocyclic group and an aromatic heterocyclic group. As the aliphatic heterocyclic group, for example, a 5-membered or 6-membered monocyclic aliphatic heterocyclic group containing at least one atom selected from a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom, and a 3- to 8-membered ring are condensed. And a condensed aliphatic heterocyclic group containing at least one atom selected from a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom, such as pyrrolidinyl, imidazolidinyl, piperidinyl, and piperazinyl. , Morpholinyl, thiomorpholinyl, piperidino, morpholino, oxazolinyl, dioxolanyl, tetrahydropyranyl, 1-decahydroxyisoquinolinyl and the like. As the aromatic heterocyclic group, for example, a 5- or 6-membered monocyclic aromatic heterocyclic group containing at least one atom selected from a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom, and a 3- to 8-membered ring are condensed. And a condensed aromatic heterocyclic group containing at least one atom selected from a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom, such as furyl, thienyl, benzothienyl, Pyrrolyl, pyridyl, pyrazinyl, imidazolyl, pyrazolyl, triazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, thiadiazolyl, oxazolyl, oxadiazolyl, pyrimidinyl, indolyl, isoindolyl, benzothiazolyl, benzimidazolyl, benzotriazolyl, quinolyl, isoquinolyl, quinazolinyl, 1,3-benzolinyl, pyranyl Such as dioxol-5-yl It is below.
  (Vii) Examples of the aromatic heterocyclic group include the aromatic heterocyclic groups mentioned in (vi) above.
  (Viii) Examples of the heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom include an aliphatic heterocyclic group containing at least one nitrogen atom. The aliphatic heterocyclic group containing at least one nitrogen atom may contain an oxygen atom, sulfur atom or other nitrogen atom, such as pyrrolidinyl, morpholino, thiomorpholino, pyrazolidinyl, piperidino, piperazinyl, homopiperazinyl, aziridinyl, Examples include azetidinyl, perhydroazepinyl, perhydroazosinyl, succinimidyl, pyrrolidonyl, glutarimidyl, piperidonyl and the like.
  Examples of (ix) cycloalkylene include cycloalkylene having 3 to 8 carbon atoms, specifically cyclopropylene, cyclobutylene, cyclopentylene, cyclohexylene, cycloheptylene, cyclooctylene and the like.
  (X) Examples of phenylene include 1,4-phenylene, 1,3-phenylene, and 1,2-phenylene.
  (Xi) Halogen means each atom of fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  (Xii) Substituents in substituted lower alkyl, substituted lower alkoxy, substituted lower alkenyl, substituted lower alkynyl, substituted cycloalkyl, substituted lower alkylamino and substituted di-lower alkylamino are the same or different and have, for example, 1 to 3 substituents. , Halogen, hydroxy, oxo, nitro, azide, cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl (the substituent in the substituted aryl is as defined for the substituent (xiv) in substituted aryl described later), substituted or unsubstituted complex A cyclic group (the substituent in the substituted heterocyclic group has the same meaning as the substituent (xv) in the substituted heterocyclic group described later), -CONR²⁷R²⁸<In the formula, R²⁷And R²⁸Are the same or different, hydrogen atom, hydroxy, substituted or unsubstituted lower alkyl {substituents in the substituted lower alkyl are the same or different, for example, hydroxy, lower alkoxy, oxo, carboxy, Lower alkoxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryl (the substituent in the substituted aryl has the same meaning as the substituent (xiv) in the substituted aryl described later), a substituted or unsubstituted heterocyclic group (in the substituted heterocyclic group) The substituent is synonymous with the substituent (xv) in the substituted heterocyclic group described later), lower alkanoyl, substituted or unsubstituted aroyl (the substituent in the substituted aroyl is synonymous with the substituent (xiv) in the substituted aryl described later). ), Halogen, -CONR²⁹R³⁰[Wherein R²⁹And R³⁰Are the same or different and are a hydrogen atom, hydroxy, substituted or unsubstituted lower alkyl (the substituent (a) in the substituted lower alkyl is the same or different, for example, hydroxy, halogen, lower alkoxy having 1 to 3 substituents). , Oxo, carboxy, lower alkoxycarbonyl, aryl, heterocyclic group, amino, lower alkylamino, di-lower alkylamino, etc.), lower alkenyl, lower alkynyl, cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl (the substituted aryl) The substituent in is the same as the substituent (xiv) in the substituted aryl described later), a substituted or unsubstituted heterocyclic group (the substituent in the substituted heterocyclic group is the substituent (xv) in the substituted heterocyclic group described later). And substituted or unsubstituted aroyl (into this substituted aroyl) Kicking substituents are as defined in substituent (xiv) in later substituted aryl) or an aralkyl oxycarbonyl, or R²⁹And R³⁰Substituted or unsubstituted heterocyclic group together with the adjacent nitrogen atom (the substituent in the substituted heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom is combined with the adjacent nitrogen atom described later) The same as the substituent (xv) in the substituted heterocyclic group formed]³¹R³²[Wherein R³¹And R³²Are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl (the substituent in the substituted lower alkyl has the same meaning as the substituent (a) in the substituted lower alkyl), lower alkenyl, lower alkynyl, cycloalkyl, Substituted or unsubstituted aryl (the substituent in the substituted aryl is as defined for the substituent (xiv) in the substituted aryl described later) substituted or unsubstituted heterocyclic group (the substituent in the substituted heterocyclic group is substituted as described later) Substituted (xv) in the heterocyclic group), substituted or unsubstituted lower alkanoyl (the substituent in the substituted lower alkanoyl has the same meaning as the substituent (a) in the substituted lower alkyl), substituted Or unsubstituted aroyl (the substituent in the substituted aroyl is the substituent in the substituted lower aryl) xiv) synonymous) or an aralkyl oxycarbonyl, or R³¹And R³²Substituted or unsubstituted heterocyclic group together with the adjacent nitrogen atom (the substituent in the substituted heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom is combined with the adjacent nitrogen atom described later) A substituted or unsubstituted lower alkenyl (the substituent in the substituted lower alkenyl is the above-described substituted lower alkenyl), and the like. The same as the substituent (a) in alkyl), substituted or unsubstituted lower alkynyl (the substituent in the substituted lower alkynyl has the same meaning as the substituent (a) in the substituted lower alkyl), substituted or non-substituted Substituted cycloalkyl (the substituent in the substituted cycloalkyl has the same meaning as the substituent (a) in the substituted lower alkyl), substituted or A substituted aryl (the substituent in the substituted aryl has the same meaning as the substituent (xiv) in the substituted aryl described later), a substituted or unsubstituted heterocyclic group (the substituent in the substituted heterocyclic group is a substituted heterocyclic Substituted or unsubstituted lower alkoxy (the substituent in the substituted lower alkoxy has the same meaning as the substituent (a) in the substituted lower alkyl), substituted or unsubstituted Unsubstituted lower alkanoyl (the substituent in the substituted lower alkanoyl has the same meaning as the substituent (a) in the substituted lower alkyl), substituted or unsubstituted aroyl (the substituent in the substituted aroyl is a substituted aryl described later) The same as the substituent (xiv) in the above), a substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl Substituent in oxy-carbonyl is synonymous with substituent (xiv) in later substituted aryl) or an aralkyl oxycarbonyl, or R²⁷And R²⁸Substituted or unsubstituted heterocyclic group together with the adjacent nitrogen atom (the substituent in the substituted heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom is combined with the adjacent nitrogen atom described later) The same as the substituent (xv) in the substituted heterocyclic group formed by₂R³³{Where R is³³Is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl [substituent (b) in the substituted lower alkyl is the same or different, for example, having 1 to 3 substituents such as hydroxy, halogen, lower alkoxy, oxo, carboxy, lower alkoxy Carbonyl, substituted or unsubstituted aryl (the substituent in the substituted aryl has the same meaning as the substituent (xiv) in the substituted aryl described later), a substituted or unsubstituted heterocyclic group (the substituent in the substituted heterocyclic group is Substituent (xv) in the substituted heterocyclic group described later has the same meaning), -CONR³⁴R³⁵(Wherein R³⁴And R³⁵Are the R²⁹And R³⁰-NR), -NR³⁶R³⁷(Wherein R³⁶And R³⁷Are the R³¹And R³²Substituted or unsubstituted lower alkenyl (the substituent in the substituted lower alkenyl has the same meaning as the substituent (b) in the substituted lower alkyl), substituted or unsubstituted lower alkenyl, and the like. Alkynyl (the substituent in the substituted lower alkynyl has the same meaning as the substituent (b) in the substituted lower alkyl), substituted or unsubstituted cycloalkyl (the substituent in the substituted cycloalkyl is the substituted lower alkyl Or a substituted or unsubstituted aryl (the substituent in the substituted aryl is the same as the substituent (xiv) in the substituted aryl described later) or a substituted or unsubstituted heterocyclic group (The substituent in the substituted heterocyclic group has the same meaning as the substituent (xv) in the substituted heterocyclic group described later). Be}, - COR³⁸(Wherein R³⁸Is R³³-NR), -NR³⁹R⁴⁰<In the formula, R³⁹And R⁴⁰Are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl {the substituent (c) in the substituted lower alkyl is the same or different, for example, hydroxy, halogen, lower alkoxy, oxo having 1 to 3 substituents , Carboxy, lower alkoxycarbonyl, substituted or unsubstituted aryl (the substituent in the substituted aryl has the same meaning as the substituent (xiv) in the substituted aryl described later), a substituted or unsubstituted heterocyclic group (the substituted heterocyclic ring) The substituent in the group is the same as the substituent (xv) in the substituted heterocyclic group described later), —O (CH₂CH₂O)_nR⁴¹(In the formula, n represents an integer of 1 to 15, R⁴¹Represents lower alkyl), -CONR⁴²R⁴³(Wherein R⁴²And R⁴³Are the R²⁹And R³⁰And -SO₂R⁴⁴[Wherein R⁴⁴Is lower alkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, substituted or unsubstituted aryl (the substituent in the substituted aryl has the same meaning as the substituent (xiv) in substituted aryl described later) or a substituted or unsubstituted heterocyclic group (the And the substituent in the substituted heterocyclic group is the same as the substituent (xv) in the substituted heterocyclic group described later]⁴⁵R⁴⁶(Wherein R⁴⁵And R⁴⁶Are the R³¹And R³²Are substituted or unsubstituted lower alkenyl (the substituent in the substituted lower alkenyl is synonymous with the substituent (c) in the substituted lower alkyl), substituted or unsubstituted Lower alkynyl (the substituent in the substituted lower alkynyl has the same meaning as the substituent (c) in the substituted lower alkyl), substituted or unsubstituted cycloalkyl (the substituent in the substituted cycloalkyl is the above-described substituted lower alkynyl). Substituted or unsubstituted aryl (the substituent in the substituted aryl is synonymous with the substituent (xiv) in substituted aryl described later), substituted or unsubstituted heterocycle A group (the substituent in the substituted heterocyclic group has the same meaning as the substituent (xv) in the substituted heterocyclic group described later), Or unsubstituted lower alkanoyl (the substituent in the substituted lower alkanoyl has the same meaning as substituent (c) in the substituted lower alkyl), - COR⁴⁷{Where R is⁴⁷Is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl (the substituent in the substituted lower alkyl has the same meaning as the substituent (c) in the substituted lower alkyl), substituted or unsubstituted lower alkenyl (substitution in the substituted lower alkenyl) Group is the same as the substituent (c) in the substituted lower alkyl), substituted or unsubstituted lower alkynyl (the substituent in the substituted lower alkynyl is synonymous with the substituent (c) in the substituted lower alkyl). Substituted, unsubstituted cycloalkyl (the substituent in the substituted cycloalkyl has the same meaning as the substituent (c) in the substituted lower alkyl), substituted or unsubstituted aryl (substitution in the substituted aryl) Group is as defined for the substituent (xiv) in substituted aryl described below), substituted or non-substituted Hajime Tamaki (the substituent in the substituted heterocyclic group has the same meaning as substituent (xv) in later substituted heterocyclic group), - NR⁴⁸R⁴⁹(Wherein R⁴⁸And R⁴⁹Each of the above R³¹And R³²Or -OR⁵⁰[Wherein R⁵⁰Is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl (the substituent in the substituted lower alkyl has the same meaning as the substituent (c) in the substituted lower alkyl), lower alkenyl, lower alkynyl, cycloalkyl, substituted or unsubstituted Aryl (the substituent in the substituted aryl has the same meaning as the substituent (xiv) in the substituted aryl described later) or a substituted or unsubstituted heterocyclic group (the substituent in the substituted heterocyclic group is a substituent in the substituted heterocyclic group described later) Represents the group (synonymous with the group (xv))} or —SO₂R⁵¹(Wherein R⁵¹Is R⁴⁷Or R³⁹And R⁴⁰Substituted or unsubstituted heterocyclic group together with the adjacent nitrogen atom (the substituent in the substituted heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom is combined with the adjacent nitrogen atom described later) The same as the substituent (xv) in the substituted heterocyclic group formed by⁺R⁵²R⁵³R⁵⁴X⁻(Wherein R⁵²And R⁵³Are the same or different and represent lower alkyl or R⁵²And R⁵³Together with the adjacent nitrogen atom to form a heterocyclic group, R⁵⁴Represents lower alkyl, X represents each atom of chlorine, bromine or iodine), -OR⁵⁵{Where R is⁵⁵Is a substituted or unsubstituted lower alkyl (the substituent (c) in the substituted lower alkyl is the same as the substituent (c) in the substituted lower alkyl), a substituted or unsubstituted lower alkenyl (the substituted lower alkenyl In the above substituted lower alkyl is the same as the substituent (c) in the above substituted lower alkyl), substituted or unsubstituted lower alkynyl (the substituent in the substituted lower alkynyl is the substituent (c) in the above substituted lower alkyl). A substituted or unsubstituted cycloalkyl (the substituent in the substituted cycloalkyl has the same meaning as the substituent (c) in the substituted lower alkyl), a substituted or unsubstituted aryl (the substituted aryl). In the substituted aryl described later has the same meaning as the substituent (xiv) in Hajime Tamaki (the substituent in the substituted heterocyclic group has the same meaning as substituent (xv) in the later of the substituted heterocyclic group) or -COR⁵⁶(Wherein R⁵⁶Is R⁴⁷Represents the same meaning)}, -SR⁵⁷(Wherein R⁵⁷Is R⁵⁵And -SO₂R⁵⁸[Wherein R⁵⁸Is substituted or unsubstituted lower alkyl (the substituent in the substituted lower alkyl is the same as the substituent (c) in the substituted lower alkyl), substituted or unsubstituted lower alkenyl (the substituent in the substituted lower alkenyl is The same as the substituent (c) in the substituted lower alkyl), a substituted or unsubstituted lower alkynyl (the substituent in the substituted lower alkynyl has the same meaning as the substituent (c) in the substituted lower alkyl) Substituted or unsubstituted cycloalkyl (the substituent in the substituted cycloalkyl has the same meaning as the substituent (c) in the above substituted lower alkyl), substituted or unsubstituted aryl (the substituent in the substituted aryl is described later) The same as the substituent (xiv) in the substituted aryl, and a substituted or unsubstituted heterocycle (Substituents in the substituted heterocyclic group has the same meaning as substituent in below the substituted heterocyclic group (xv)) or -NR⁵⁹R⁶⁰(Wherein R⁵⁹And R⁶⁰Are the R³¹And R³²-OSO₂R⁶¹(Wherein R⁶¹Is R⁵⁸For example).
  Lower alkyl part of lower alkyl, lower alkoxy, lower alkoxycarbonyl, lower alkylamino, di-lower alkylamino and lower alkanoyl shown here, lower alkenyl, lower alkynyl, cycloalkyl, aryl, aroyl and aryloxy of aryloxycarbonyl, The heterocyclic group, the heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom, and the halogen are the lower alkyl (i), lower alkenyl (ii), lower alkynyl (iii), cycloalkyl (iv), aryl, respectively. It is synonymous with (v), heterocyclic group (vi), heterocyclic group (viii) formed together with an adjacent nitrogen atom, and halogen (xi). Further, examples of the aralkyl moiety (xiii) of the aralkyloxycarbonyl shown here include aralkyl having 7 to 15 carbon atoms, specifically, benzyl, phenethyl, benzhydryl, naphthylmethyl and the like.
  (Xiv) Among the substituted aryl, substituted aryloxy, substituted arylamino, substituted phenylene, and substituted heterocyclic groups, the substituted aromatic heterocyclic group and the substituted aromatic heterocyclic group may be the same or different, for example, the number of substitutions. 1 to 3, halogen, hydroxy, nitro, cyano, carboxy, formyl, methylenedioxy, substituted or unsubstituted lower alkyl (the substituent (d) in the substituted lower alkyl is the same or different, for example, the number of substitutions is 1 -3, halogen, oxo, carboxy, lower alkoxycarbonyl, amino, lower alkylamino, di-lower alkylamino, hydroxy, lower alkoxy, aryl, heterocyclic group, etc.), substituted or unsubstituted lower alkenyl The substituent in the substituted lower alkenyl is the above substituted lower alkenyl. Substituted or unsubstituted lower alkynyl (the substituent in the substituted lower alkynyl has the same meaning as the substituent (d) in the substituted lower alkyl), substituted or non-substituted. Substituted cycloalkyl (the substituent in the substituted cycloalkyl has the same meaning as the substituent (d) in the substituted lower alkyl), substituted or unsubstituted lower alkoxy (the substituent in the substituted lower alkoxy is The same as the substituent (d) in the substituted lower alkyl), the substituted or unsubstituted lower alkylthio (the substituent in the substituted lower alkylthio has the same meaning as the substituent (d) in the substituted lower alkyl), amino Substituted or unsubstituted lower alkylamino (the substituent in the substituted lower alkylamino is And the substituted or unsubstituted di-lower alkylamino (the substituent in the substituted di-lower alkylamino is the same as the substituent (d) in the substituted lower alkyl). A substituted or unsubstituted lower alkanoyl (the substituent in the substituted lower alkanoyl has the same meaning as the substituent (d) in the substituted lower alkyl), a substituted or unsubstituted lower alkanoyloxy (the substituted The substituent in the lower alkanoyloxy has the same meaning as the substituent (d) in the above substituted lower alkyl), the substituted or unsubstituted lower alkanoylamino (the substituent in the substituted lower alkanoylamino is the same as in the above substituted lower alkyl) Substituent (d) and substituted or unsubstituted lower alkanoic Ruthio (the substituent in the substituted lower alkanoylthio has the same meaning as the substituent (d) in the substituted lower alkyl), substituted or unsubstituted lower alkylaminocarbonyl (the substituent in the substituted lower alkylaminocarbonyl is The same as the substituent (d) in the substituted lower alkyl), a substituted or unsubstituted lower alkylaminocarbonyloxy (the substituent in the substituted lower alkylaminocarbonyloxy is the substituent in the substituted lower alkyl (d ), Substituted or unsubstituted di-lower alkylaminocarbonyl (the substituent in the substituted di-lower alkylaminocarbonyl has the same meaning as the substituent (d) in the substituted lower alkyl), substituted or non-substituted Substituted lower alkoxycarbonyl (the substituted lower The substituent in the xyloxycarbonyl has the same meaning as the substituent (d) in the above substituted lower alkyl), the substituted or unsubstituted dilower alkylaminocarbonyloxy (the substituent in the substituted dilower alkylaminocarbonyloxy is In the substituted lower alkyl group, and the substituted or unsubstituted aryl (the substituted, the substituent group (e) in the aryl is the same or different, for example, a halogen having 1 to 3 substituents, Hydroxy, lower alkoxy, cyano, nitro, carboxy, lower alkoxycarbonyl, amino, lower alkylamino, di-lower alkylamino and the like), a substituted or unsubstituted heterocyclic group (the substituent in the substituted heterocyclic group is The same as the substituent (e) in the above substituted aryl), and the substitution Or an unsubstituted arylsulfonyl (the substituent in the substituted arylsulfonyl has the same meaning as the substituent (e) in the substituted aryl), a substituted or unsubstituted aryloxy (the substituent in the substituted aryloxy is The same as the substituent (e) in the substituted aryl), substituted or unsubstituted arylamino (the substituent in the substituted arylamino has the same meaning as the substituent (e) in the substituted aryl), substituted or unsubstituted Unsubstituted arylthio (the substituent in the substituted arylthio has the same meaning as the substituent (e) in the substituted aryl), substituted or unsubstituted aroyl (the substituent in the substituted aroyl is a substituent in the substituted aryl) Group (e) and substituted or unsubstituted aroyloxy (the substituted a The substituent in Royloxy has the same meaning as the substituent (e) in the substituted aryl, and a substituted or unsubstituted aroylthio (the substituent in the substituted aroylthio has the same meaning as the substituent (e) in the substituted aryl. A substituted or unsubstituted aroylamino (the substituent in the substituted aroylamino has the same meaning as the substituent (e) in the substituted aryl), a substituted or unsubstituted heterocyclic amino (a substitution in the substituted heterocyclic amino) Group is synonymous with the substituent (e) in the substituted aryl), substituted or unsubstituted heterocyclic oxy (the substituent in the substituted heterocyclic oxy is synonymous with the substituent (e) in the substituted aryl. A substituted or unsubstituted heterocyclic thio (the substituent in the substituted heterocyclic thio is the above substituted aryl) Synonymous with substituent (e) is) is and the like in.
  Lower alkyl, lower alkoxy, lower alkylthio, lower alkylamino, dilower alkylamino (the two lower alkyl moieties of the dilower alkylamino may be the same or different), lower alkanoyl, lower alkanoyloxy , Lower alkanoylamino, lower alkanoylthio, lower alkylaminocarbonyl, lower alkylaminocarbonyloxy, di-lower alkylaminocarbonyl (the two lower alkyl moieties of the di-lower alkylaminocarbonyl may be the same or different), di Lower alkylaminocarbonyloxy (the two lower alkyl moieties of the di-lower alkylaminocarbonyloxy may be the same or different), lower alkoxycarbonyl and di-lower alkylaminocarbonyloxy (the di-lower alkylaminocarbonyloxy The lower alkyl moiety of the alkylaminocarbonyloxy may be the same as or different from each other) and the lower alkyl moiety is as defined above for the lower alkyl (i), and the lower alkenyl, lower alkynyl, cycloalkyl and halogen are as defined above. Synonymous with lower alkenyl (ii), lower alkynyl (iii), cycloalkyl (iv) and halogen (xi). Further, the aryl moiety of aryl, arylsulfonyl, aryloxy, arylthio, arylamino, aroyl, aroyloxy, aroylthio and aroylamino shown here has the same meaning as the above aryl (v), and is a heterocyclic group, heterocyclic amino, heterocyclic ring The heterocyclic group part of oxy and heterocyclic thio has the same meaning as the above heterocyclic group (vi).
  (Xv) The substituent in the substituted heterocyclic group formed together with the substituted aliphatic heterocyclic group and the adjacent nitrogen atom among the substituted heterocyclic groups is defined as the substituent (xiv) in the substituted aryl. In addition to the groups mentioned above, oxo and the like can be mentioned.
  The pharmacologically acceptable salts of compounds (I), (II) and Q include, for example, pharmacologically acceptable acid addition salts, metal salts, ammonium salts, organic amine addition salts, amino acid addition salts and the like. To do. Examples of pharmacologically acceptable acid addition salts of compounds (I), (II) and Q include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate and phosphate, acetate, maleate and fumarate. Examples of the pharmacologically acceptable metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt. , Aluminum salts, zinc salts and the like. Examples of pharmacologically acceptable ammonium salts include ammonium and tetramethylammonium salts. Examples of pharmacologically acceptable organic amine addition salts include: Examples include addition salts such as morpholine and piperidine. Examples of pharmacologically acceptable amino acid addition salts include lysine, glycine, phenylalanine, Ragin acid addition salts such as glutamic acid, and the like.
  Compound (I) can be produced according to the method described in WO03 / 051854 or WO2004 / 092147, or a method analogous thereto.
  Compound (II) is described in J. Org. Med. Chem. ,13, 414-418, 1970 or J.A. Med. Chem. ,15, 13-16, 1972, or in accordance with them.
  Compound Q can be produced, for example, according to the method described in WO 03/070701 or a modification thereof.
  Some compounds (I), (II) and Q may have stereoisomers such as positional isomers, geometric isomers, optical isomers and tautomers, but the gene of the present invention For example, all possible isomers and mixtures thereof can be used for the identification method and the like.
  When it is desired to obtain salts of the compounds (I), (II) and Q, when the compounds (I), (II) and Q are obtained in the form of salts, they can be purified as they are or in the free form. In some cases, the compounds (I), (II) and Q may be dissolved or suspended in a suitable solvent, and an acid or base may be added to form a salt to isolate and purify.
  In addition, compounds (I), (II) and Q and pharmacologically acceptable salts thereof may exist in the form of adducts with water or various solvents, and these adducts are also present in the present invention. It can be used for a method of identifying a gene.
  Specific examples of compounds (I) and (II) are shown in Tables 1 and 2.

  Next, the Eg5 inhibitory action of compound (I) and compound (II) will be described using test examples.
Test Example 1 M-phase cell phenotype analysis by immunocytochemical staining
  M-phase cell phenotype analysis by immunocytochemical staining is described in the literature (Oncogene,19, 5303-5313, 2000). Human lung cancer cell line A549 (ATCC number: CCL-185) was cultured with the test compound for 17 hours. After washing with a phosphate buffer solution (PBS), the cells were fixed by treatment with methanol kept at −20 ° C. for 1 minute. After washing with PBS, it was permeabilized with PBS containing 0.2% Triton-X for 15 minutes. After washing with PBS, blocking was performed with a blocking solution (PBS containing 1% fetal bovine serum) for 30 minutes, and the primary antibody solution {0.2% mouse monoclonal anti-α-tubulin antibody (Sigma-Aldrich) , Catalog number T9026] and a blocking solution containing 0.2% rabbit anti-γ-tubulin antibody (Sigma Aldrich, catalog number T3559)} for 30 minutes. After washing with PBS, the secondary antibody solution {0.025% Alexa Fluor 546-conjugated anti-mouse IgG antibody [Molecular Probes, catalog number A-11030], 0.5% Alexa The reaction was performed with a flow 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody (Molecular Probes, catalog number A-11034) and 1 μmol / l Hoechst 33342} for 30 minutes to visualize microtubules, centrosomes and chromosomes. The phenotype of M phase cells was observed using an inverted fluorescence microscope. When compound A or compound D (Acros) is used as the test compound, cells accumulated in the M phase by compound A and compound D are single stellate microtubules (monastral microtubule array), single cells. It showed characteristic phenotypes: polar centrosome (monopolar spindle) and circular distribution of chromosomes. Such M-phase phenotype is a neutralizing antibody against Eg5 (Cell,83, 1159-1169, 1995) and the Eg5-specific inhibitor monastrol (Science,286971-974, 1999).
  From the above results, it was suggested that Compound A and Compound D inhibit Eg5.
Test Example 2 Inhibition test for Eg5 enzyme activity
  Preparation of full-length human Eg5 recombinants is described in the literature (Cell,831159-1169, 1995). A baculovirus expressing full-length human Eg5 fused to the N-terminus of His tag is Spodoptera frugiperda (Spodoptera  frugiperda) Sf9 insect cells were infected and cultured, and then the culture broth was centrifuged to collect the cells. The collected cells were suspended in a buffer, and the supernatant was collected by centrifugation. The supernatant was passed through a nickel agarose column, and Eg5 fused with a His tag at the N-terminus was affinity purified to obtain a partially purified sample.
  The measurement of the ATPase activity of Eg5 has been described in the literature (EMBO J.,13, 751-757, 1994; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,894884-4887, 1992). 25 mmol / l piperazine N, N′-bis (ethanesulfonic acid) (PIPES) / KOH (pH 6.8), 1 mmol / l ethylene glycol bis (2-aminoethyl ether) tetraacetic acid with test compounds diluted in stages (EGTA), 2 mmol / l MgCl₂1 mmol / l dithiothreitol (DTT), 5 μmol / l paclitaxel, 100 μg / ml bovine serum albumin, 25 μg / ml tubulin [Cytoskeleton, Catalog No. TL238], 200 μmol / l 2-amino-6 Mercapto-7-methylpurine riboside (MESG substrate, Molecular Probes, catalog number E-6646), 1 U / ml purine nucleoside phosphorylase (Molecular Probes, catalog number E-6646), 1 mmol / l ATP, 12. Enzymatic reaction was performed with a reaction solution composed of 5 μg / ml Eg5 partially purified preparation. The enzyme reaction was performed at 30 ° C. for 30 minutes. Absorbance at 360 nm, which is an index of ATPase activity, was measured using a plate reader (Molecular Devices, SpectraMax 340PC).³⁸⁴] Was measured. The relative activity was calculated with the absorbance in the absence of the compound in the presence of Eg5 as 100%, the absorbance in the absence of Eg5 in the absence of the compound as 0%, and the relative activity was calculated.₅₀The value was calculated.
  When measured using Compound A or Compound D as the test compound, Compound A and Compound D inhibit the ATPase activity of Eg5 in a concentration-dependent manner.₅₀Values were 2 μmol / l for compound A and 0.8 μmol / l for compound D.
  As described above, from the results of Test Example 1 and Test Example 2, it was shown that Compound A and Compound D have Eg5 inhibitory action. That is, it was shown that compound (I) and compound (II) can be used as Eg5 inhibitors.
(3) Sensitivity measurement method for anticancer drugs
  In the present invention, as a method for measuring the sensitivity of cancer cells to anticancer agents, after contacting an Eg5 inhibitor and human cancer cells (1) for a certain period, the number of living cells, the rate of DNA synthesis, or the total protein mass The method of measuring is mentioned. Sensitivity is measured, for example, by measuring the above for various concentrations of Eg5 inhibitor, creating a calibration curve indicating the correlation between the concentration of Eg5 inhibitor and the measured value, and similarly measuring cells not contacted with Eg5 inhibitor Concentration of Eg5 inhibitor that gives a value equivalent to 50% when the value obtained is 100% (GI₅₀) Or GI₅₀Logarithm when the concentration of is expressed in mol / l (log₁₀GI₅₀) Or -log₁₀GI₅₀Can be expressed as The number of viable cells was determined by the MTT method (J. Immunol. Methods,65, 55-63, 1983), XTT method (J. Immunol. Methods,142, 257-265, 1991) and the like. The DNA synthesis rate is³It can be measured, for example, by measuring the incorporation of H-labeled thymidine into cells. The total protein mass can be measured by a sulfododamine B assay or the like.
(4) Measurement of gene expression level
  The gene expression level in the present invention can be measured by quantifying mRNA, which is a gene transcription product, or protein, which is a gene product.
(I) RNA or protein extraction
  RNA or protein can be extracted from the human cancer cell line of (1) by the following general method. In the case of RNA, for example, when a TRIZOL reagent (Invitrogen) is used, it may be performed according to the attached operation method. In the case of a protein, it may be performed according to a book such as The Protein Handbook, Humana Press (1996).
(Ii) Quantification of mRNA
  mRNA can be quantified by techniques such as DNA microarray, Northern blot analysis, and RT-PCR using the RNA extracted in (1) as a measurement sample. In addition, an RNA quantitative reagent containing a polynucleotide complementary to the RNA for use in RT-PCR is also included in the scope of the present invention.
(Iii) Protein quantification
  Protein quantification can be performed by immunochemical quantification using specific antibodies. As the antibody against the protein, a monoclonal antibody or a polyclonal antibody can be prepared according to the method described in the book Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988), for example. Moreover, when a commercially available antibody is available, it can also be used after confirming the specificity. Using the obtained antibody, the protein can be quantified by performing ELISA, RIA, or Western blotting according to the method described in the literature (for example, “Enzyme Immunoassay”, Medical School (1982)). Moreover, an immunoassay reagent containing an antibody against the protein for use in the above method is also included in the scope of the present invention.
  The gene expression level is represented by the signal intensity per a certain amount of RNA or protein measured by the above method (ii) or (iii) or its logarithm. When mRNA is quantified by real-time PCR, which is a kind of RT-PCR, the amplification reaction proceeds logarithmically and can also be represented by the number of reaction cycles (Ct value) until a certain signal intensity is reached.
(5) Gene selection
  In the present invention, for each gene, the correlation between the expression level in each cell line and the sensitivity of the cell line to the Eg5 inhibitor is analyzed, and there is a correlation between the expression level and the sensitivity of the cell line to the Eg5 inhibitor. Select a gene. In the correlation analysis performed here, the expression level of the gene and the sensitivity to the Eg5 inhibitor are expressed as logarithm of signal intensity, Ct value, GI₅₀Can be obtained by calculating a Pearson correlation coefficient (hereinafter also simply referred to as a correlation coefficient), for example. The presence or absence of correlation is determined by whether or not the correlation coefficient is 0. When the correlation coefficient is 0, there is no correlation, and when it is not 0, it can be said that there is a correlation. The correlation coefficient takes a value between 1 and −1. It can be said that the correlation is higher as the absolute value of the correlation coefficient is closer to 1, and the correlation is lower as it is closer to 0. The significance of the obtained correlation coefficient can be tested by the P value obtained from the number of samples based on the null hypothesis (the probability that the population correlation coefficient is zero). For example, if the P value <0.05, it can be said that the correlation coefficient is significant at a significance level of 5%. A gene that is selected as described above and whose expression level is negatively correlated with the sensitivity to the Eg5 inhibitor, that is, a gene whose expression level is lower as the cell is more sensitive to the Eg5 inhibitor (hereinafter also referred to as a resistance gene). Examples of these are the following 12 genes.
(I) CYP24A1: cytochrome P450 family 24 subfamily A polypeptide 1 (NM — 000782)
(Ii) OBRGRP: Leptin receptor gene-related protein (NM — 017526)
(Iii) BF: Factor B (NM_001710)
(Iv) APRT: adenine phosphoribosyl transferase (NM_000485)
(V) BIRC3: Baculovirus IAP repeat-containing protein (NM_001165)
(Vi) SQSTM1: Sequestome 1 (NM_003900)
(Vii) TNFAIP2: Tumor necrosis factor α-inducing protein 2 (NM — 006291)
(Viii) ITM2B: integral membrane protein 2B (NM — 021999)
(Ix) ABCC2: ATP binding cassette subfamily C member 2 (NM_000392)
(X) ANXA3: Annexin A3 (NM_005139)
(Xi) FAM3C: homologous sequence 3 containing family member 3 (NM — 014888)
(Xii) ABCC3: ATP binding cassette subfamily C member 3 (NM_003786)
  Moreover, the following 7 genes are mentioned as an example of a gene with a positive correlation, ie, a gene whose expression level is higher in a cell that is more sensitive to an Eg5 inhibitor (hereinafter also referred to as a sensitivity gene).
(I) BCO07436: hypothetical protein BC007436 (XM — 037317)
(Ii) MAP1B: Microtubule-related protein 1B (NM_005909)
(Iii) CCNB1: Cyclin B1 (NM_031966)
(Iv) HSPCA: heat shock 90 kDa protein 1α (BC023006)
(V) CCNB2: Cyclin B2 (NM_004701)
(Vii) FLJ23269: hypothetical protein FLJ23269 (AK026692)
(Vii) SLC12A2: Solute Carrier Family 12 Member 2 (NM_001046)
  These genes are defined as genes having the sequence of the registration number of the DNA sequence database GenBank shown in parentheses.
  Using a certain Eg5 inhibitor, a gene whose expression level is identified as a gene that correlates with sensitivity to an Eg5 inhibitor is not only a gene that correlates not only with that Eg5 inhibitor but also with other Eg5 inhibitors. Conceivable.
(B) Method for determining sensitivity of cancer cells to Eg5 inhibitor
  The present invention further provides a method for determining the sensitivity of cancer cells to an Eg5 inhibitor. Examples of the determination method include methods including the following steps (a) to (e).
(A) A step of selecting one or more genes from the genes identified by the method (A) and determining a score corresponding to the expression level.
(B) a step of measuring the expression level of the gene in cancer cells to determine sensitivity
(C) For each gene, assigning the score determined in step (a) based on the expression level measured in step (b)
(D) A step of obtaining a numerical value serving as a sensitivity index from the assigned points for all selected genes.
(E) A step of determining sensitivity to an Eg5 inhibitor by comparing a predetermined threshold value with the numerical value obtained in (d).
  Multi-variate analysis such as multiple regression analysis, discriminant analysis, SVM (support vector machine) method, principal component analysis, self-organizing map method, etc. This can be done by using a method (described in the analysis of experimental data by SAS, supervised by Kei Takeuchi, University of Tokyo Press, 1990).
  Below, each process at the time of using a multiple regression analysis is demonstrated. -Log of selected gene n, sensitivity Y to Eg5 inhibitor₁₀GI₅₀When the expression level of each gene is expressed as a logarithm of the Ct value or signal intensity, in the multiple regression analysis model, the expression level X of the gene is used as an explanatory variable, and the sensitivity Y that is the target variable is expressed by the following equation 1. Can do.
Y = a₁X₁+ A₂X₂+ ...... a_nX_n+ B (Formula 1)
Y: target variable (sensitivity: -log₁₀GI₅₀)
X₁, X₂... X_n: Explanatory variable (gene expression level: logarithm of Ct value or signal intensity)
a₁, A₂... a_n: Partial regression coefficient
b: Constant term
  Hereinafter, although the case where the expression level of each gene is expressed by a Ct value will be described, even when the logarithm of the signal intensity is used, the determination can be similarly performed using the logarithm of the signal intensity instead of the Ct value.
  In this equation, the sensitivity Y (−log for n + 1 cell lines)₁₀GI₅₀) And expression level X of each gene₁, X₂... X_nBy substituting the actually measured values for (Ct value), n + 1 linear linear polynomials are created, and by solving these linear linear polynomials, the partial regression coefficient a for each gene₁, A₂... a_nAnd the constant term b can be obtained. The gene used in this method can be arbitrarily selected from the gene group identified by the above method (A). However, the standard statistics such as Cp statistic, degree-of-freedom adjustment coefficient, and Akaike's information criterion are used. It is desirable to select genes so that the index becomes small, with the quantity as an index for optimization. In this way, by selecting a gene that is important for predicting sensitivity to an Eg5 inhibitor, prediction accuracy can be increased, that is, optimization can be performed while suppressing complexity. In the case of a multiple regression analysis model, the score of each gene is expressed as the product of the partial regression coefficient obtained above and the expression level of the gene.
  Examples of genes important for predicting sensitivity to Eg5 inhibitors, which are selected when the multiple regression analysis model is optimized, include a correlation between the expression level selected in (A) and sensitivity to Eg5 inhibitors. CYP24A1, OBRGRP, APRT, TNFAIP2, ITM2B, ABCC2, BC007436, MAP1B, HSPCA, CCNB2 and FLJ23269 selected from the 19 genes listed as one gene.
  The expression level (Ct value) in the cancer cell for determining the sensitivity of the gene selected as described above can be measured by the method described in the above (A) (3). From the obtained Ct value of each gene, the score of each gene described above, that is, the product of the partial regression coefficient a obtained above and its Ct value is assigned. Based on Equation 1, by adding the value of the constant term b to the total score of each assigned gene, a numerical value −log as an index of sensitivity₁₀GI₅₀Is required. Therefore, -log₁₀GI₅₀As a threshold value, for example, a numerical value (−log) that is an index of sensitivity of each cancer cell, measured at the time of selection of the gene of (A) above.₁₀GI₅₀The sensitivity of cancer cells to an Eg5 inhibitor can be determined by setting an appropriate numerical value such as an average value of) and comparing it with the threshold value.
  By using a cancer cell derived from a cancer patient by a biopsy or the like as a cancer cell, the sensitivity of the cancer cell of the cancer patient to an Eg5 inhibitor can be determined. When it is determined that the cancer cell derived from the cancer patient is highly sensitive to the Eg5 inhibitor, the Eg5 inhibitor can be used for the treatment, thereby effectively treating the cancer cell.
(C) Selection of genes that regulate cancer cell susceptibility
  The gene determined to be correlated with the sensitivity to the Eg5 inhibitor by the method (A) actually defines the sensitivity, that is, the sensitivity to the Eg5 inhibitor is changed by changing the expression level of the gene. The following method can be used to check whether or not
(1) Forced gene expression
  A cDNA containing a gene protein coding region selected from a gene group having a positive correlation between the expression level selected in (A) and sensitivity to an Eg5 inhibitor is inserted into an expression vector of an appropriate animal cell. By introducing the obtained expression vector into cancer cells, the gene can be forcibly expressed to increase the expression level. An Eg5 inhibitor is added to the cancer cells, and the sensitivity to the Eg5 inhibitor is measured. When the sensitivity to the Eg5 inhibitor is higher than when no expression vector is introduced, the gene is a gene that regulates the sensitivity of the cancer cell to the Eg5 inhibitor. By increasing the expression level, the cancer cell It can be seen that this gene can enhance the sensitivity of Eg5 to Eg5 inhibitors.
  Examples of expression vectors include pEGFP-C2 (Clontech), pAGE107 (Japanese Patent Laid-Open No. 3-22979; Cytotechnology,3133-140, 1990), pAS3-3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), pCDM8 (Nature,329, 840-842, 1987), pCMV-Tag1 (Stratagene), pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pMSG (Amersham Biosciences), pAMo (J. Biol. Chem.,268, 22782-222787, 1993).
  As a method for introducing a recombinant vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells. For example, an electroporation method (Cytotechnology,3, 133-140, 1990), calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), lipofection method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 7413-7417, 1987).
(2) Suppression of gene expression
  Expression of antisense polynucleotide, siRNA, or antisense polynucleotide or siRNA corresponding to a gene selected from a gene group having a negative correlation between the expression level selected in (A) and sensitivity to an Eg5 inhibitor By introducing the vector into cancer cells, the expression of the gene can be suppressed and the expression level can be reduced. An Eg5 inhibitor is added to the cancer cells, and the sensitivity to the Eg5 inhibitor is measured. When the sensitivity to the Eg5 inhibitor is higher than when the gene expression is not suppressed, the gene is a gene that regulates the sensitivity of the cancer cell to the Eg5 inhibitor. By reducing the expression level, the cancer cell It can be seen that this gene can enhance the sensitivity of Eg5 to Eg5 inhibitors.
  siRNA, antisense polynucleotide, or expression vector of siRNA or antisense polynucleotide can be prepared and introduced into cancer cells based on the description in (E) below.
(D) Sensitivity enhancer for Eg5 inhibitor (i)
  A gene having a positive correlation between the expression level selected in (A) and sensitivity to an Eg5 inhibitor, such as BC007436, MAP1B, CCNB1, HSPCA, CCNB2, FLJ23269 and SLC12A2 A gene therapy drug containing a gene showing an activity of enhancing the sensitivity to an Eg5 inhibitor by forced expression in cancer cells by the method described in (1) of (C) above is directed to the Eg5 inhibitor. It can be used as a sensitivity enhancer. In addition, as a result of forced expression of the gene, it is considered that the sensitivity to the Eg5 inhibitor is increased by increasing the amount of the protein encoded by the gene in cancer cells, and thus the protein encoded by the gene is contained. The protein preparation can be used as a sensitivity enhancer for Eg5 inhibitors.
  The above-mentioned gene exhibiting an activity to enhance sensitivity to an Eg5 inhibitor or a protein encoded by the gene can be used alone as a sensitivity enhancer for an Eg5 inhibitor, but is usually pharmacologically acceptable. It is desirable to use it as a pharmaceutical formulation prepared by any method well known in the pharmaceutical arts, mixed with one or more carriers. Details of such a pharmaceutical preparation will be described later in (G) of the present specification.
(E) Sensitivity enhancer for Eg5 inhibitor (ii)
    Genes having a negative correlation between the expression level selected in (A) and sensitivity to Eg5 inhibitors, such as CYP24A1, OBRGRP, BF, APRT, BIRC3, SQSTM1, TNFAIP2, ITM2B, ABCC2, ANXA3, FAM3C and ABCC3 SiRNA or antisense polynucleotide that suppresses the expression of a gene that is selected from among genes or a plurality of genes, and that suppresses the expression of the gene in cancer cells and exhibits an activity that enhances sensitivity to an Eg5 inhibitor Alternatively, a vector that expresses the siRNA or antisense polynucleotide can be used as a sensitivity enhancer for an Eg5 inhibitor. Further, since the enhancement of sensitivity is considered to involve the function of the protein encoded by the gene, it contains an antibody against the protein encoded by the gene, preferably a neutralizing antibody that suppresses the function of the protein. The drug can be used as a sensitivity enhancer for the Eg5 inhibitor.
  Next, siRNA used in the present invention will be described. siRNA is short double-stranded RNA containing a partial sequence of mRNA of a certain target gene and its complementary sequence, and can suppress the expression of the gene by RNAi (RNA interference). The sequence of siRNA is derived from the base sequence of mRNA (Genes Dev.,13, 3191-3197, 1999). Preferably, a sequence of 19 bases following AA and a GC content of 30 to 70%, more preferably around 50% is selected in a region 50 to 100 bases downstream from the initiation codon in the translation region of mRNA. A siRNA can be prepared by synthesizing and annealing two RNAs having a sequence of 19 bases selected and a sequence having TT added to the 3 'end of each complementary sequence and annealing. Further, by inserting DNA corresponding to the selected 19-base sequence into a siRNA expression vector such as pSilencer 1.0-U6 (Ambion), pSUPER (OligoEngine), etc. A vector expressing siRNA capable of suppressing the expression of the gene can be prepared.
  The antisense polynucleotide used in the present invention is a polynucleotide having a base sequence complementary to a sequence of 15 or more consecutive bases in the base sequence of the target gene. Polynucleotides include DNA, RNA, and polynucleotide derivatives. The polynucleotide derivative includes a polynucleotide derivative in which a phosphodiester bond in a polynucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and a phosphodiester bond in a polynucleotide is converted to an N3′-P5 ′ phosphoramidate bond. Polynucleotide derivatives, polynucleotide derivatives in which ribose and phosphodiester bonds in the polynucleotide are converted to peptide nucleic acid bonds, polynucleotide derivatives in which the uracil in the polynucleotide is substituted with C-5 propynyl uracil, in the polynucleotide Polynucleotide derivatives in which uracil is substituted with C-5 thiazole uracil, polynucleotide derivatives in which cytosine in the polynucleotide is substituted with C-5 propynylcytosine, cytosine in the polynucleotide is phenoxazine Polynucleotide derivative substituted with decorated cytosine, polynucleotide derivative substituted with 2'-o-propylribose in the polynucleotide, or polynucleotide substituted with 2'-methoxyethoxyribose in the polynucleotide Derivatives and the like can be mentioned.
  Antisense RNA / DNA technology (Bioscience and Industry,50, 322, 1992;46, 681, 1991; Biotechnology,9, 358-362, 1992; Trends Biotechnol. ,10, 87-91, 1992; Trends Biotechnol. ,10152-158, 1992; cell engineering,16, 1463 (1997)), triple helix technology (Trends Biotechnol.,10, 132-136, 1992), the transcription or translation of the target gene in the cancer cell is suppressed by administering the antisense polynucleotide to the cancer cell, and as a result, the expression of the target gene is suppressed. Can do. In particular, a base sequence complementary to 15 to 100 bases including the start codon of the region encoding the target gene polypeptide is preferable. Moreover, the polynucleotide derivative which does not receive degradation by deoxyribonuclease and ribonuclease is preferable.
  The antisense polynucleotide can be produced using a commercially available DNA synthesizer, a method described in WO93 / 20095, WO02 / 10185, or the like. Further, a recombinant vector in which the target gene is connected in the reverse direction is prepared downstream of the promoter of the expression vector used for forced expression of the gene of (C) (1), and this recombinant vector is introduced into cancer cells. Thus, antisense RNA can be expressed in cells.
  Antibodies against the protein can be obtained by methods known to those skilled in the art as described in (A) (4) (iii). The neutralizing antibody that suppresses the function of the protein measures the function of the protein by binding the antibody against the protein and the protein, and the function of the protein is suppressed compared to the case where the antibody is not bound. Such an antibody can be obtained by selecting from antibodies against the protein.
  The siRNA or antisense polynucleotide exhibiting the activity to enhance the sensitivity to various Eg5 inhibitors described above, the vector expressing the siRNA or antisense polynucleotide, and the antibody can be used alone as a sensitivity enhancer for the Eg5 inhibitor. However, it is usually desirable to use it as a pharmaceutical preparation prepared by any method well known in the technical field of pharmaceutics, mixed with one or more pharmaceutically acceptable carriers. Details of such a pharmaceutical preparation will be described later in (G) of the present specification.
(F) Screening method for substances that enhance sensitivity to Eg5 inhibitors
  Genes having a positive correlation between the expression level selected in (A) and sensitivity to Eg5 inhibitor, such as BC007436, MAP1B, CCNB1, HSPCA, CCNB2, FLJ23269, and SLC12A2 The expression level of one or more genes selected from the above is measured, compared with the expression level when the test substance is not administered, and the substance that increases the expression level of the gene is selected. Candidate substances for enhancement can be screened. In particular, when the gene is a gene that defines the sensitivity to the Eg5 inhibitor selected by the method described in (1) of (C), screening for a substance that enhances the sensitivity to the Eg5 inhibitor by this method Can do.
  In addition, a test substance is administered to a cell, and a gene having a negative correlation between the expression level selected in (A) and sensitivity to an Eg5 inhibitor, such as CYP24A1, OBRGRP, BF, APRT, BIRC3, SQSTM1 A substance that decreases the expression level of the gene by measuring the expression level of one or more genes selected from TNFAIP2, ITM2B, ABCC2, ANXA3, FAM3C, and ABCC3, compared with the expression level when no test substance is administered By selecting, a candidate substance for a substance that enhances sensitivity to an Eg5 inhibitor can be screened. In particular, when the gene is a gene that defines sensitivity to an Eg5 inhibitor selected by the method described in (2) of (C), screening for a substance that enhances sensitivity to the Eg5 inhibitor by this method Can do.
  The enhancement of the sensitivity of these substances to Eg5 inhibitors can be confirmed by administering these substances to cancer cells, measuring their sensitivity to Eg5 inhibitors, and comparing them with the sensitivity when no substances are administered. .
  The expression level of the gene is a method described in (3) of (A) using as a cell a cancer cell line selected from cancer cells, particularly a human cancer cell line panel used when selecting a gene to be measured. Thus, it can be measured by measuring the mRNA of the gene and the amount of protein encoded by the gene. Alternatively, a reporter-expressing cell including an expression control region of a gene whose expression level is to be measured can be prepared as follows, and the expression level of the reporter gene in the cell can be measured as the expression level of the target gene. Reporter-expressing cells are isolated from human genomic DNA by isolating the expression control region upstream of the coding region of the gene whose expression level is to be measured, excluding the promoter for expressing the foreign gene in the appropriate expression vector for animal cells. It can be prepared by inserting the expression control region and introducing a vector bound to an appropriate reporter gene downstream thereof into the cell. As the reporter gene, firefly luciferase gene, green fluorescent protein (GFP) gene, β-galactosidase gene, and the like can be used. The expression level of the reporter gene can be measured by measuring the amount of light emitted or colored using a substrate that emits light or develops color due to the enzyme activity of luciferase or β-galactosidase, or measuring the amount of fluorescence emitted by GFP.
  Test samples include synthetic compounds, naturally occurring proteins, artificially synthesized proteins, peptides, carbohydrates, lipids, modified products and derivatives thereof, and mammals (eg, mice, rats, guinea pigs, hamsters, Swine, sheep, cows, horses, dogs, cats, monkeys, humans, etc.) urine, body fluids, tissue extracts, cell culture supernatants, cell extracts, non-peptide compounds, fermentation products, plants and other Examples include biological extracts.
  The substance obtained by the screening method of the present invention described above is useful as a sensitivity enhancer for Eg5 inhibitors.
(G) A pharmaceutical preparation of a sensitivity enhancer for the Eg5 inhibitor of the present invention
  Although various genes, proteins, antibodies, substances and the like as described in (D), (E) and (F) in the present specification can be used alone as sensitivity enhancers for Eg5 inhibitors. Usually, it is desirable to provide various pharmaceutical preparations. These pharmaceutical preparations are used for animals or humans.
  The pharmaceutical preparation according to the present invention may contain the above-mentioned active ingredient or a pharmacologically acceptable salt thereof alone or as a mixture with any other active ingredient for treatment. These pharmaceutical preparations are produced by any method well known in the technical field of pharmaceutics by mixing the active ingredient together with one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  As the administration route, it is desirable to use the most effective route for prevention or treatment, and oral or parenteral such as intravenous administration can be mentioned.
  Examples of the dosage form include tablets and injections.
  For example, tablets suitable for oral administration include excipients such as lactose and mannitol, disintegrants such as starch, lubricants such as magnesium stearate, binders such as hydroxypropylcellulose, surfactants such as fatty acid esters It can be produced using a plasticizer such as glycerin as an additive.
  Formulations suitable for parenteral administration preferably comprise a sterile aqueous solution containing the active compound that is isotonic with the blood of the recipient. For example, in the case of an injection, a solution for injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of salt water and a glucose solution. In these parenterals, one kind selected from excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers and diluents, preservatives, flavors and the like exemplified in the oral preparations. Or more auxiliary components can be added.
  The active ingredient or a pharmacologically acceptable salt thereof is usually administered systemically or locally in an oral or parenteral form when used for the above purpose. The dose and frequency of administration vary depending on the administration form, patient age, body weight, nature or severity of symptoms to be treated, etc., but usually oral, 0.01 to 1000 mg per adult, The dose is preferably in the range of 0.05 to 500 mg once to several times a day. In the case of parenteral administration such as intravenous administration, usually 0.001-1000 mg, preferably 0.01-300 mg per adult is administered once to several times a day, or in the range of 1-24 hours per day. Administer intravenously. However, the dose and the number of doses vary depending on the various conditions described above.
  In the case of a gene therapy agent using a nucleic acid such as DNA or RNA as an active ingredient for enhancing sensitivity to an Eg5 inhibitor, the DNA or RNA alone or a retrovirus vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector After being inserted into a suitable vector such as the above, a method of formulating, formulating and administering according to the conventional method described above, or a method of administering by a non-viral gene transfer method can be used.
  A recombinant virus vector can be prepared according to the method described below.
  A fragment of DNA used as an active ingredient (hereinafter also referred to as target DNA) is prepared. A recombinant viral vector is constructed by inserting the DNA fragment downstream of the promoter in the viral vector.
  In the case of an RNA viral vector, a recombinant virus is constructed by preparing RNA fragments homologous to the target DNA and inserting them into the downstream of the promoter in the viral vector. In addition to the double strand, the RNA fragment selects either the sense strand or the antisense strand depending on the type of the viral vector. For example, in the case of a retroviral vector, RNA homologous to the sense strand is selected, and in the case of a sense viral vector, RNA homologous to the antisense strand is selected.
  The recombinant viral vector is introduced into packaging cells compatible with the vector. The packaging cell may be any cell as long as it can replenish the deficient protein of a recombinant viral vector lacking at least one gene encoding a protein necessary for virus packaging. For example, human kidney-derived HEK293 cells, mouse fibroblasts NIH3T3, and the like can be used. Proteins to be replenished in packaging cells include mouse retrovirus-derived gag, pol, env, etc. in the case of retrovirus vectors, and HIV-derived gag, pol, env, vpr, vpu, vif, tat in the case of lentivirus vectors. , Rev, nef, and the like, adenovirus vectors include E1A and E1B derived from adenovirus, and adeno-associated viruses include proteins such as Rep (p5, p19, p40), and Vp (Cap).
  As the viral vector, those containing a promoter at a position where the recombinant virus can be produced in the packaging cell and the target DNA can be transcribed in the target cell are used. As a plasmid vector, MFG (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,92, 6733-6737, 1995), pBabePuro (Nucleic Acids Res.,18, 3587-3596, 1990), LL-CG, CL-CG, CS-CG, CLG (J. Virol.,72, 8150-8157, 1998), pAdex1 (Nucleic Acids Res.,23, 3816-3821, 1995). Any promoter can be used as long as it can function in human tissues. For example, cytomegalovirus (CMV) IE (immediate early) gene promoter, SV40 early promoter, retrovirus promoter, metallothionein Examples include promoters, heat shock protein promoters, SRα promoters, and the like. In addition, an enhancer of human CMV IE gene may be used together with a promoter.
  Examples of methods for introducing a recombinant viral vector into packaging cells include the calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), the lipofection method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 7413-7417, 1987).
  In addition to the above method, the recombinant virus vector can be administered directly by in vivo using liposome delivery (in  vivoIn combination with gene transfer, viral vectors can also be directed to the patient's cancer tissue. That is, a virus vector is prepared by combining a target DNA of an appropriate size with a polylysine-conjugated antibody specific for adenovirus hexon protein and binding the resulting complex to an adenovirus vector. can do. The viral vector stably reaches the target cell, is taken up into the cell by the endosome, is degraded in the cell, and can efficiently express the gene.
  In the present invention, the vector expressing the target DNA or siRNA or antisense polynucleotide can be transported to the lesion also by the non-viral gene transfer method.
  Non-viral gene transfer methods known in the art include calcium phosphate coprecipitation (Virology,52456-467, 1973; Science,209, 1414-1422, 1980), microinjection method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77, 5399-5403, 1980; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77, 7380-7384, 1980; Cell,27, 223-231, 1981; Nature,294, 92-94, 1981), Membrane fusion-mediated transfer method via Liposopox (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 7413-7417, 1987; Biochemistry,289508-9514, 1989; Biol. Chem. ,H.264, 12126-12129, 1989; Hum. Gene Ther. ,3, 267-275, 1992; Science,249, 1285-1288, 1990; Circulation,83, 2007-2011, 1992) or direct DNA uptake and receptor-mediated DNA transfer (Science,247, 1465-1468, 1990; Biol. Chem. ,266, 14338-14342, 1991; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,873655-3659, 1990; Biol. Chem. ,H.264, 16985-16987, 1989; BioTechniques,11474-485, 1991; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,873410-3414, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88, 4255-4259, 1991; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87, 4033-4037, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88, 8850-8854, 1991; Hum. Gene Ther. ,3, 147-154, 1991).
  In the membrane fusion-mediated transfer method via liposomes, the liposome preparation can be directly administered to the target tissue, thereby allowing local gene uptake and expression in the tissue. Direct DNA uptake techniques are preferred for direct targeting of DNA to patient cancer tissue. Receptor-mediated DNA transfer is performed, for example, by conjugating DNA (typically in the form of a covalently closed supercoiled plasmid) to a protein ligand via polylysine. The ligand is selected based on the presence of the corresponding ligand receptor on the cell surface of the target cell or tissue. The ligand-DNA conjugate can be injected directly into the blood vessel, if desired, and can be directed to a target tissue where receptor binding and internalization of the DNA-protein complex occurs. In order to prevent intracellular destruction of DNA, adenovirus can be co-infected to disrupt endosomal function.
  The following examples further illustrate the present invention, but the present invention is not limited to the examples.

ヒト３８細胞株パネルからなるＥｇ５阻害剤に対する感受性試験
細胞株としては、第３表に示す肺癌由来細胞株２６株、大腸癌由来細胞株６株、膵臓癌由来細胞株４株、卵巣癌由来細胞株２株からなる３８種類を用いた。入手先のＡＴＣＣはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＪＣＲＢはＪＣＲＢ（ＪａｐａｎｅｓｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＲｅｓｅａｒｃｈＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）細胞バンク、西尾は国立がんセンターの西尾先生からの供与を表す。

全ての細胞株はＲＰＭＩ１６４０（日水製薬製）培地（１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む）中で、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養した。
９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、各培養細胞を０．０５ｍｌずつ分注した。炭酸ガスインキュベーター内で２４時間、３７℃で培養後、上記培地により適宜希釈した薬剤を各ウェルに０．０５ｍｌずつ加え、炭酸ガスインキュベーター内で３７℃、７２時間培養した。薬剤としては、Ｅｇ５阻害剤として化合物Ａおよび化合物Ｄ、対照とする微小管作用薬としてパクリタキセルおよびビノレルビンの４種を用いた。
各ウェルの細胞数の測定には、細胞増殖キットＩＩ〔ＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＫｉｔＩＩ、ロシュ・ダイアグノスティックス（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社〕を用いた。各ウェルにキットの発色反応試薬を５０μｌ添加後、炭酸ガスインキュベーター内で３時間、３７℃で保温した後、マイクロプレートリーダー（Ｍ−Ｓｐｍａｘ２５０、和光純薬製）により、測定波長４９０ｎｍの吸光度から対照波長６５５ｎｍの吸光度を差し引いた吸光度差を測定し、細胞数の指標とした。薬剤を添加しない場合の吸光度差に対する各薬剤濃度での吸光度差の比を算出し、細胞生存率とした。マイクロプレートリーダー付属の解析ソフトソフトマックス・プロ（ＳＯＦＴｍａｘＰＲＯ、和光純薬社）を用いて、検討した薬剤濃度とその細胞生存率から、以下に示す計算式により４−パラメーターロジスティック検量線を作成し、ＧＩ_５０値（Ｙ＝５０％のときのＸの値、単位ｍｏｌ／ｌ）を算出した。
Ｙ＝｛（Ａ−Ｄ）／（１＋（Ｘ／Ｃ）^Ｂ）｝＋Ｄ、Ｘ：薬剤濃度（ｍｏｌ／ｌ）、Ｙ：細胞生存率（％）
用いた４種の薬剤の３８細胞株のそれぞれに対する−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０の値（小数点以下２けたまで）を第４表に示す。

Susceptibility test for Eg5 inhibitor consisting of human 38 cell line panel Cell lines include 26 lung cancer-derived cell lines, 6 colon cancer-derived cell lines, 4 pancreatic cancer-derived cell lines, and ovarian cancer-derived cells shown in Table 3. 38 types consisting of 2 strains were used. The ATCC is the American Type Culture Collection, JCRB is a JCRB (Japan Collection of Research Bioresources) cell bank, and Nishio is a grant from Professor Nishio of the National Cancer Center.

All cell lines were cultured in RPMI 1640 (Nissui Pharmaceutical) medium (containing 10% fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin) at 37 ° C. in the presence of 5% CO ₂ .
0.05 ml of each cultured cell was dispensed into each well of a 96-well microtiter plate. After culturing at 37 ° C. for 24 hours in a carbon dioxide incubator, 0.05 ml of a drug appropriately diluted with the above medium was added to each well, followed by culturing at 37 ° C. for 72 hours in a carbon dioxide incubator. As the drugs, four types of compounds A and D as Eg5 inhibitors and paclitaxel and vinorelbine as microtubule agonists as controls were used.
Cell proliferation kit II [Cell Proliferation Kit II, Roche Diagnostics, Inc.] was used to measure the number of cells in each well. After adding 50 μl of the coloring reaction reagent of the kit to each well and incubating at 37 ° C. for 3 hours in a carbon dioxide incubator, the microplate reader (M-Spmax250, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was used to control the absorbance at a measurement wavelength of 490 nm. The absorbance difference obtained by subtracting the absorbance at a wavelength of 655 nm was measured and used as an index of the number of cells. The ratio of the absorbance difference at each drug concentration to the absorbance difference when no drug was added was calculated and used as the cell viability. Using the analysis software Softmax Pro (SOFTmax PRO, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) attached to the microplate reader, a 4-parameter logistic calibration curve was created using the formula shown below from the examined drug concentration and its cell viability. , GI ₅₀ value (value of X when Y = 50%, unit mol / l) was calculated.
Y = {(AD) / (1+ (X / C) ^B )} + D, X: drug concentration (mol / l), Y: cell viability (%)
Table 4 shows the values of -log ₁₀ GI ₅₀ (up to 2 digits after the decimal point) for each of the 38 cell lines of the four drugs used.

ヒト３８細胞株パネルの遺伝子発現プロファイルの取得
第３表に示したヒト３８癌細胞株について第５−１表〜第５−４表に示す１１９種類のヒト遺伝子の発現を、以下の方法に従い定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。第５−１表〜第５−４表の遺伝子名の略称は、ヒトゲノム解析機構（ＨＵＧＯ）遺伝子命名委員会（ＧｅｎｅＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）が認めた遺伝子の記号（ｇｅｎｅｓｙｍｂｏｌ）がある場合は、それを用いた。

（１）ｃＤＮＡ合成
第３表に示したヒト３８細胞株を実施例１と同様に培養し、対数増殖期に細胞を回収し、全ＲＮＡをＲＮイージー〔ＲＮｅａｓｙ、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社〕を用いて抽出した。
ｃＤＮＡ合成はＲＴ−ＰＣＲ用スーパースクリプト第１鎖合成システム（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲ、インビトロジェン社）を用い、添付のマニュアルに従い、以下のように行った。取得した全ＲＮＡ５μｇに対して１０ｍｍｏｌ／ｌｄＮＴＰｓ１μｌおよび０．５μｇ／μｌオリゴ（ｄＴ）_{１２−１８}１μｌを添加し、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理をした水で９μｌにフィルアップした。６５℃で５分間加熱変性後、氷上で急冷し１分以上静置し、１０×ＲＴバッファー２μｌ、２５ｍｍｏｌ／ｌＭｇＣｌ_２４μｌ、０．１ｍｏｌ／ｌＤＴＴ２μｌおよびリボヌクレアーゼアウト（ＲＮａｓｅＯＵＴ）１μｌを添加し、４２℃で２分間保温した。さらにスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＲＴａｓｅ）１μｌ（５０単位）を加えて４２℃で５０分間の逆転写反応を行い、７０℃で１５分間加熱し、酵素を失活させた。この後、リボヌクレアーゼＨ１μｌを添加して３７℃で２０分間の反応後、水で希釈し全量を１ｍｌとした。以下の定量的ＲＴ−ＰＣＲの反応系には、さらに５倍希釈した溶液１０μｌを用いた。
（２）定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の測定
試薬は全てＦｏｒＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲＴａＫａＲａＥｘＴａｑＲ−ＰＣＲＶｅｒｓｉｏｎ（宝酒造）を用いた。１サンプルあたり、１０×Ｒ−ＰＣＲバッファー（Ｍｇ^２＋不含）２．０μｌ、２５０ｍｍｏｌ／ｌＭｇ^２＋溶液０．２μｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌｄＮＴＰｓ０．６μｌ、１／２５００希釈サイバー・グリーン（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）Ｉ１．０μｌ、４μｍｏｌ／ｌ遺伝子特異的プライマー各１．５μｌ、ＥｘＴａｑＲ−ＰＣＲ０．２μｌ、Ｈ_２Ｏ３μｌからなる反応液を調製後、９６ウェルＰＣＲプレートに１０μｌずつ分注した。各遺伝子特異的なプライマーは第５−１〜第５−４表の配列番号に示すものを用いた。さらに鋳型として（１）で調製したｃＤＮＡ１０μｌを添加しピペッティングにより撹拌した。隙間のないようにプレートをシールし、リアルタイムＰＣＲに供した。
リアルタイムＰＣＲはＡＢＩ配列検出システム〔ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００、アプライドバイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）社〕を製品説明書に従って使用し、９５℃で５分間加熱後、９５℃で１分間（変性）、５５〜６０℃で１分間（アニーリング）、７２℃で１〜２分間（伸長）の反応サイクルを４５サイクル繰り返し、７２℃で５分間加熱する条件（アニーリング温度、伸長時間は遺伝子により異なる）でＰＣＲを行った。
得られた結果から、各遺伝子についてバックグラウンド補正後のシグナル強度が１，０００に達するサイクル数（Ｃｔ値）を求め、発現量の指標とした。このシグナル強度は増幅反応が対数的に進行し、どのようなサンプルでもプラトーに達しない条件として設定した。Ｃｔ値が小さい方が発現量が高いことを示し、Ｃｔ値差１の違いは理論的に約２倍の発現差があるものとして解釈できる。第６−１表〜第６−９表に、以上のようにして得られた３８細胞株の１１９遺伝子についてのバックグラウンド補正後のＣｔ値（小数点以下２桁まで）を、遺伝子発現プロファイルとして示した。なお、第６−７表〜第６−９表の「平均」は、各遺伝子のＣｔ値の３８細胞株間の平均値を示す。遺伝子は第５−１〜第５−４表の略称で表した。

Acquisition of gene expression profile of human 38 cell line panel Expression of 119 human genes shown in Tables 5-1 to 5-4 in the human 38 cancer cell lines shown in Table 3 was quantified according to the following method. The RT-PCR method was used. The abbreviations of the gene names in Tables 5-1 to 5-4 are the gene symbols recognized by the Gene Nomenclature Committee (HUMO) gene nomenclature committee (gene symbol). Using.

(1) cDNA synthesis The human 38 cell lines shown in Table 3 were cultured in the same manner as in Example 1. Cells were recovered in the logarithmic growth phase, and total RNA was RNeasy (RNeasy, QIAGEN). Extracted.
cDNA synthesis was performed using the superscript first strand synthesis system for RT-PCR (SuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCR, Invitrogen) according to the attached manual as follows. 1 μl of 10 mmol / l dNTPs and 1 μl of 0.5 μg / μl oligo (dT) _12-18 were added to 5 μg of the obtained total RNA, and filled up to 9 μl with water treated with diethylpyrocarbonate (DEPC). After heat denaturation at 65 ° C. for 5 minutes, rapidly cool on ice and let stand for more than 1 minute, and add 10 μL RT buffer 2 μl, 25 mmol / l MgCl _{2 4} μl, 0.1 mol / l DTT 2 μl and ribonuclease out (RNaseOUT) 1 μl. And kept at 42 ° C. for 2 minutes. Further, 1 μl (50 units) of Superscript II reverse transcriptase (Superscript II RTase) was added, and a reverse transcription reaction was performed at 42 ° C. for 50 minutes, followed by heating at 70 ° C. for 15 minutes to inactivate the enzyme. Thereafter, 1 μl of ribonuclease H was added and reacted at 37 ° C. for 20 minutes, and then diluted with water to make a total volume of 1 ml. In the following quantitative RT-PCR reaction system, 10 μl of a further 5-fold diluted solution was used.
(2) Measurement of gene expression by quantitative RT-PCR All the reagents used were For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCR Version (Takara Shuzo). Per sample, 10 × R-PCR buffer (without Mg ²⁺ ) 2.0 μl, 250 mmol / l Mg ²⁺ solution 0.2 μl, 10 mmol / l dNTPs 0.6 μl, 1/2500 diluted SYBR Green I After preparing a reaction solution consisting of 1.0 μl, 4 μmol / l gene-specific primer each 1.5 μl, ExTaq R-PCR 0.2 μl, H ₂ O 3 μl, 10 μl was dispensed into a 96-well PCR plate. Primers specific to each gene were those shown in SEQ ID NOs: Tables 5-1 to 5-4. Further, 10 μl of the cDNA prepared in (1) was added as a template and stirred by pipetting. The plate was sealed so that there was no gap, and subjected to real-time PCR.
Real-time PCR uses an ABI sequence detection system (ABI PRISM 7700, Applied Biosystems) according to product instructions, heated at 95 ° C. for 5 minutes, then 95 ° C. for 1 minute (denaturation), 55-60 ° C. The reaction cycle of 1 minute (annealing) and 1-2 minutes (extension) at 72 ° C. was repeated 45 cycles, and PCR was performed under the conditions of heating at 72 ° C. for 5 minutes (annealing temperature and extension time differ depending on the gene).
From the obtained results, the number of cycles (Ct value) at which the signal intensity after background correction reached 1,000 for each gene was determined and used as an index of expression level. This signal intensity was set as a condition where the amplification reaction proceeded logarithmically and no plateau was reached in any sample. A smaller Ct value indicates a higher expression level, and a difference in Ct value difference of 1 can be interpreted as a theoretical expression difference of about twice. Tables 6-1 to 6-9 show the Ct values (up to 2 digits after the decimal point) after background correction for the 119 genes of the 38 cell lines obtained as described above as gene expression profiles. It was. The “average” in Tables 6-7 to 6-9 indicates the average value among 38 cell lines of the Ct value of each gene. Genes are represented by abbreviations in Tables 5-1 to 5-4.

遺伝子発現プロファイルとＥｇ５阻害剤に対する感受性の相関解析
Ｅｇ５阻害剤に対する感受性に関係する遺伝子群を探索するため、実施例１で得られたＥｇ５阻害剤に対する感受性のデータと実施例２で得られた遺伝子発現プロファイルのデータを統合し、その相関解析を行った。同じ組織由来の細胞株毎に解析することが重要であると考え、肺癌由来２６細胞株についての、実施例２の第６−１表〜第６−６表に示した１１９遺伝子の発現プロファイルと実施例１の第４表に示したＥｇ５阻害剤を含む４種の薬剤に対する感受性のデータを用いて、以下に示す計算式で計算されるピアソンの相関係数ｒの計算を行った。

ここで、ｘ_ｉは細胞ｉにおける遺伝子ｘのバックグラウンド補正後のＣｔ値（Ｃｔ_ｘ）であり、遺伝子ｘの発現量を示す。ｙ_ｉは細胞ｉにおける薬剤ｙのＧＩ_５０値（ＧＩ_５０ｙ）の対数に−１を掛けたもの（−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０ｙ）であり、細胞ｉの薬剤ｙに対する感受性を示す。ｘ_ｍは遺伝子ｘの発現量（Ｃｔ_ｘ）の細胞株間の平均値を示し、ｙ_ｍは薬剤ｙに対する感受性（−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０ｙ）の細胞株間の平均値を示す。各遺伝子の発現量と各薬剤に対する感受性との相関係数ｒを第７−１表〜第７−３表に示す。各遺伝子は第５−１表〜第５−４表の略称で示した。

相関係数ｒは−１から１までの値をとりうるが、０から離れ、１に近いほど遺伝子ｘの発現量と薬剤ｙに対する感受性に正の相関が、−１に近いほど負の相関があることを示す。Ｅｇ５阻害剤に対する感受性に関与する遺伝子として、その発現量と化合物Ａに対する感受性との相関係数ｒの絶対値が０．３３以上（ｒが「−０．３３と等しいかより小さい」かまたは「０．３３と等しいかより大きい」）を示す遺伝子１９種を選抜した。第８表に、このようにして選抜された１９遺伝子の各薬剤における相関係数を示した。感受性・耐性の欄は、化合物Ａにおける相関係数ｒが負の数で、化合物Ａに対する感受性が低い、つまり耐性が高い細胞株ほど発現量が高い遺伝子には「耐性」を、化合物Ａにおける相関係数ｒが正の数で、化合物Ａに対する感受性が高いほど、発現量が高い遺伝子には「感受性」を記載した。

第８表に示す通り、７種の遺伝子が感受性遺伝子（感受性の高い細胞株で高発現している遺伝子）、１２種の遺伝子が耐性遺伝子（感受性の低い細胞株で高発現している遺伝子）として選抜された。これら全ての遺伝子が、化合物Ｄにおいても相関係数の値の符号が一致しており、うち１７種（感受性７種中６種、耐性１２種中１１種）については、化合物Ｄにおいても相関係数の絶対値が０．３３以上であった。以上の結果と、化合物Ａと化合物Ｄの構造に共通性はないことを考え合せると、第８表に示した選抜された１９遺伝子は、Ｅｇ５阻害剤という共通の作用機構を有する化合物群の薬剤感受性に一般的に関与する遺伝子であると考えられる。一方、Ｅｇ５阻害活性を有さないパクリタキセルおよびビノレルビンについてはＢＩＲＣ３のみが共通に高い相関係数の絶対値を示したのみであり、Ｅｇ５阻害剤とは異なる薬剤感受性決定機構が存在することが示唆された。
これら遺伝子のうち、耐性遺伝子であるＢＩＲＣ３は細胞死を抑制する遺伝子として知られ、感受性遺伝子であるＣＣＮＢ１、ＣＣＮＢ２は細胞周期に関係する遺伝子である。また、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３といった薬剤トランスポーター遺伝子、乳癌での高発現が報告されているチトクロームＰ４５０ファミリーに属するＣＹＰ２４Ａ１が含まれていた。
これらの遺伝子群はＥｇ５阻害剤に対する感受性予測のマーカーとして利用できるものを含む他、あるものは実際にＥｇ５阻害剤に対する感受性を規定していると考えられる。Correlation analysis of gene expression profile and sensitivity to Eg5 inhibitor Sensitivity data for Eg5 inhibitor obtained in Example 1 and gene obtained in Example 2 to search for gene groups related to sensitivity to Eg5 inhibitor The expression profile data was integrated and the correlation analysis was performed. It is thought that it is important to analyze each cell line derived from the same tissue, and the expression profile of the 119 gene shown in Tables 6-1 to 6-6 in Example 2 for the 26 cell lines derived from lung cancer The Pearson correlation coefficient r calculated by the following formula was calculated using the sensitivity data for the four drugs including the Eg5 inhibitor shown in Table 4 of Example 1.

Here, x _i is the Ct value (Ct _x ) after the background correction of the gene x in the cell i, and indicates the expression level of the gene x. y _i is the logarithm of the GI ₅₀ value (GI ₅₀ y) of drug y in cell i multiplied by −1 (−log ₁₀ GI ₅₀ y), and indicates the sensitivity of cell i to drug y. x _m denotes the mean value of the cell lines the expression level of gene _x (Ct x), _{y m} denotes the average value of the cell lines sensitive _(-log 10 _{GI 50} y) to the drug y. The correlation coefficient r between the expression level of each gene and the sensitivity to each drug is shown in Tables 7-1 to 7-3. Each gene is indicated by an abbreviation in Tables 5-1 to 5-4.

The correlation coefficient r can take a value from −1 to 1, but the closer to 1 and the closer to 1, the more positive the correlation between the expression level of the gene x and the sensitivity to the drug y, and the closer to −1 the negative the correlation. Indicates that there is. As a gene involved in sensitivity to an Eg5 inhibitor, the absolute value of the correlation coefficient r between the expression level and the sensitivity to Compound A is 0.33 or more (r is “equal or smaller than −0.33” or “ Nineteen genes showing "equal to or greater than 0.33") were selected. Table 8 shows the correlation coefficient for each drug of 19 genes selected in this way. In the column of sensitivity / resistance, the correlation coefficient r in compound A is a negative number, and the sensitivity to compound A is low, that is, the gene whose expression level is higher in a cell line with higher resistance is expressed as “resistance”. A gene whose expression level is higher as the relationship number r is a positive number and the sensitivity to the compound A is higher is described as “sensitivity”.

As shown in Table 8, 7 genes are sensitive genes (genes that are highly expressed in sensitive cell lines), and 12 genes are resistant genes (genes that are highly expressed in less sensitive cell lines). Was selected as. All of these genes have the same correlation coefficient value in Compound D, and 17 of them (6 out of 7 sensitive types and 11 out of 12 resistant types) are also correlated in Compound D. The absolute value of the number was 0.33 or more. Considering the above results and the fact that there is no commonality between the structures of Compound A and Compound D, the selected 19 genes shown in Table 8 are drugs of the group of compounds having a common mechanism of action as Eg5 inhibitors. It is considered to be a gene generally involved in susceptibility. On the other hand, for paclitaxel and vinorelbine which do not have Eg5 inhibitory activity, only BIRC3 showed only a high absolute value of the correlation coefficient, suggesting that there is a drug sensitivity determination mechanism different from that of Eg5 inhibitor. It was.
Among these genes, the resistance gene BIRC3 is known as a gene that suppresses cell death, and the sensitivity genes CCNB1 and CCNB2 are genes related to the cell cycle. Also included were drug transporter genes such as ABCC2 and ABCC3, and CYP24A1 belonging to the cytochrome P450 family that has been reported to be highly expressed in breast cancer.
These gene groups include those that can be used as markers for predicting susceptibility to Eg5 inhibitors, and some may actually define susceptibility to Eg5 inhibitors.

Ｅｇ５感受性相関遺伝子による感受性予測モデルの構築
（１）統計モデルの適用
Ｅｇ５阻害剤に対する感受性に相関する遺伝子の発現量と肺癌由来細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性の関係から統計モデルを構築し、遺伝子発現量から感受性を予測するモデルとした。統計モデルとしては重回帰モデルを用いた。一般的な重回帰モデル式を式１として示す。式１に、（ｎ＋１）個の標本の説明変量と目的変量それぞれの実際の値を導入した（ｎ＋１）個の一次線形多項式を解くことにより各項の偏回帰係数ａ_１、ａ_２、…ａ_ｎおよび定数項ｂを決定することができる。得られた偏回帰係数ａ_１、ａ_２、…ａ_ｎおよび定数項ｂを用いた式１に、説明変量の値Ｘ_１、Ｘ_２、…Ｘ_ｎを代入することにより、目的変量の予測値Ｙを計算することができる。
Ｙ＝ａ_１Ｘ_１＋ａ_２Ｘ_２＋・・・・＋ａ_ｎＸ_ｎ＋ｂ（式１）
Ｙ：目的変量
Ｘ_１、Ｘ_２、…Ｘ_ｎ：説明変量
ａ_１、ａ_２、…ａ_ｎ：偏回帰係数
ｂ：定数項
上記の重回帰モデル式の目的変量に肺癌細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性、説明変量にＥｇ５阻害剤に対する感受性と相関する遺伝子の発現量を適用することで感受性予測モデルとした。具体的には、遺伝子の発現量としてはＣｔ値を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性としては、−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０値を用いた。
（２）肺癌由来細胞における感受性相関遺伝子による感受性予測モデルの構築と評価
（ｉ）初期モデルの構築
実施例３で選抜された肺由来細胞株の感受性に相関する１９遺伝子（第８表）の、肺癌２０細胞株Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９におけるＣｔ値と、同じ肺癌２０細胞株の−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０値を（１）の重回帰モデルに適用した。得られる２０個の一次線形多項式を解くことにより各偏回帰係数項および定数項を決定した。第９表に、決定された各遺伝子の偏回帰係数を示した。なお、定数項ｂの値は０であった。得られた式を初期重回帰モデルＡとした。遺伝子ｉに割り当てられる点数は、ｉ項の偏回帰係数ａ_ｉと遺伝子ｉのＣｔ値（Ｃｔ_ｉ）の積ａ_ｉＣｔ_ｉで表される。ある細胞について、上記の１９遺伝子それぞれの点数ａ_１Ｃｔ_１、ａ_２Ｃｔ_２、…ａ_１９Ｃｔ_１９の合計とｂの値から、該細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性の予測値−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０を計算できる。

（ｉｉ）最適化モデルの構築
（ｉ）で構築された初期モデルは、説明変量の数が１９個と多いため、複雑である。この初期モデルに対し、重回帰モデルを最適化することにより目的変量の予測に重要な説明変量を選択し、モデルの複雑さを抑えながら、予測精度を上げることができる。モデルの最適化の指標としては、Ｃｐ統計量（「すぐわかる統計用語」石村貞夫著、東京図書）用いた。具体的には統計解析ソフト「Ｓ−Ｐｌｕｓ２０００」（（株）数理システム）上でステップワイズ線形回帰法（Ｓ＿ＰＬＵＳ２０００ユーザーズガイド）を実行することで、初期モデルに対し説明変量を１つずつ除いた場合のモデルについての各偏回帰係数項を決定し、その結果からＣｐ統計量を計算し、Ｃｐ統計量の値がより小さいモデルをよりすぐれたモデルとして選択することを繰り返すことにより、モデルの最適化を行った。これにより、説明変量の数を８少なくした、１１遺伝子からなる肺癌最適化モデルＡ’が構築された。最適化モデルＡ’で選択された説明変量となる遺伝子と偏回帰係数の値を第１０表に示す。なお、定数項ｂの値は０であった。

（ｉｉｉ）モデルの評価
実施例１の肺癌細胞株中、モデル構築に用いなかった６細胞株（Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、Ｎ４１７、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４およびＳＨＰ−７７）の遺伝子発現量を、（ｉｉ）で構築した最適化モデルＡ’に適用することで６細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性の予測値を計算し、残差（実測値−予測値）を見ることで本最適化モデルＡ’の評価を行った。最適化モデルＡ’で決定した各１１遺伝子の偏回帰係数ａと、実施例２で測定した各遺伝子の発現量（Ｃｔ値）から各遺伝子の点数（ａとＣｔの積）を計算し、これらの点数から感受性（−Ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０値）の予測値を計算した（第１１表）。この予測値と実施例１の第４表に示した−Ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０値の実測値を比較したところ、６株中４株（Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、Ｎ４１７およびＳＢＣ−３）で−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０値の残差の絶対値が０．３以下で、また６株の残差の絶対値の平均＝０．２２であり、残差の少ない良い予測値が得られていた（第１１表）。したがって、本最適化モデルＡ’が肺癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性予測に有効であることが示された。

（３）他の癌種への応用
実施例１のヒト３８細胞株中、肺癌以外の他の癌腫１２細胞株（大腸癌６株：ＣＯＬＯ２０５、ＨＴ−２９、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１およびＷｉＤｒ、すい臓癌４株：ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３、卵巣癌２株：ＳＫ−ＯＶ−３およびＯＶＣＡＲ−３）の遺伝子発現量を実施例４（２）で構築した肺癌最適化モデルＡ’に適用することで１２細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性の予測値を計算し、残差を見ることで本最適化モデルＡ’の評価を行った。肺癌最適化モデルＡ’で決定した各１１遺伝子の偏回帰係数ａと、実施例２で測定した各遺伝子の発現量（Ｃｔ値）から各遺伝子の点数（ａとＣｔの積）を計算し、これらの点数から感受性（−Ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０値）の予測値を計算した。この予測値と実施例１の第４表に示した−Ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０値の実測値を比較したところ、１２株中７株で−ｌｏｇ_１０ＧＩ_５０値の残差の絶対値が０．３以下で、また１２株の残差の絶対値の平均＝０．２８であり、肺癌細胞株に近い予測精度が得られていた（第１２−１表および第１２−２表）。したがって、肺癌を基に作成された本モデルが肺癌のみならず、他の癌腫のＥｇ５阻害剤に対する感受性予測にも有効であることが示された。

Construction of sensitivity prediction model using Eg5 sensitivity correlation gene (1) Application of statistical model A statistical model is constructed from the relationship between the expression level of a gene correlated with sensitivity to Eg5 inhibitors and the sensitivity of lung cancer-derived cell lines to Eg5 inhibitors. A model for predicting sensitivity from the expression level was used. A multiple regression model was used as the statistical model. A general multiple regression model formula is shown as Formula 1. Equation (1) linear regression polynomials a ₁ , a ₂ ,... A are obtained by solving (n + 1) linear linear polynomials that introduce the actual values of the explanatory variables and the objective variables of (n + 1) samples in Equation 1. _n and the constant term b can be determined. The resulting partial regression coefficients _a _1, a 2, ... in the equation 1 using _{a n} and a constant term b, the value of the independent variables _X _1, X 2, by substituting ... _{X n,} the predicted value of the objective variable Y can be calculated.
_{_{_{_{Y = a 1 X 1 + a}}}} 2 X 2 + ···· + a n X n + b ( Equation 1)
Y: objective variable X ₁ , X ₂ ,... X _n : explanatory variable a ₁ , a ₂ ,... A _n : partial regression coefficient b: constant term Eg5 inhibitor of lung cancer cell line as objective variable of the above multiple regression model formula A sensitivity prediction model was obtained by applying the expression level of a gene correlated with the sensitivity to Eg5 inhibitor to the sensitivity and explanatory variables. Specifically, the Ct value was used as the gene expression level, and the -log ₁₀ GI ₅₀ value was used as the sensitivity to the Eg5 inhibitor.
(2) Construction and Evaluation of Sensitivity Prediction Model Using Sensitivity Correlation Genes in Lung Cancer-Derived Cells (i) Construction of Initial Model 19 genes (Table 8) correlated with the sensitivity of lung-derived cell lines selected in Example 3 Lung cancer 20 cell lines A549, NCI-H23, NCI-H69, NCI-H226, NCI-H345, NCI-H460, NCI-H596, NCI-H1299, PC-14 / DTX, PC-14 / CDDP, MRC-5, The Ct value in IMR-90, EBC-1, NCI-H292, NCI-H441, NCI-H838, A427, NCI-H522, Calu-6 and PC-9, and the -log ₁₀ GI ₅₀ value of the same lung cancer 20 cell line Was applied to the multiple regression model of (1). Each partial regression coefficient term and constant term were determined by solving the 20 linear linear polynomials obtained. Table 9 shows the partial regression coefficients of the determined genes. The value of the constant term b was 0. The obtained formula was used as the initial multiple regression model A. The number of points assigned to the gene i is represented by the product a _i Ct _i of the partial regression coefficient a _i of the i term and the Ct value (Ct _i ) of the gene i. For a cell, the above-mentioned 19 genes each number _{_{_{_{a 1 Ct 1, a 2 Ct}}}} 2, ... from the value of the sum b of a 19 _{Ct 19,} the predicted value of the sensitivity to Eg5 inhibitors of the cell _-log 10 _{GI 50} Can be calculated.

(Ii) Construction of Optimization Model The initial model constructed in (i) is complicated because there are as many as 19 explanatory variables. By optimizing the multiple regression model for this initial model, explanatory variables that are important for predicting the objective variable can be selected, and the prediction accuracy can be improved while suppressing the complexity of the model. As an index for model optimization, Cp statistics ("Statistical terms that can be easily understood" by Sadao Ishimura, Tokyo Book) were used. Specifically, by executing the stepwise linear regression method (S_PLUS2000 User's Guide) on statistical analysis software “S-Plus2000” (Mathematical System Co., Ltd.), one explanatory variable is removed from the initial model one by one. By optimizing the model by determining each partial regression coefficient term for the model, calculating the Cp statistic from the results, and selecting the model with the smaller Cp statistic value as the better model. went. As a result, a lung cancer optimization model A ′ consisting of 11 genes with 8 explanatory variables reduced by 8 was constructed. Table 10 shows the genes that are explanatory variables selected in the optimization model A ′ and the values of the partial regression coefficients. The value of the constant term b was 0.

(Iii) Evaluation of model Gene expression of 6 cell lines (Calu-1, Calu-3, N417, SBC-3, PC-14 and SHP-77) not used for model construction among the lung cancer cell lines of Example 1 By applying the amount to the optimization model A ′ constructed in (ii), the predicted value of the sensitivity of 6 cell lines to Eg5 inhibitor is calculated, and the optimum is obtained by looking at the residual (actual value−predicted value). The model A ′ was evaluated. The score (the product of a and Ct) of each gene is calculated from the partial regression coefficient a of each 11 gene determined by the optimization model A ′ and the expression level (Ct value) of each gene measured in Example 2. The predicted value of sensitivity (-Log ₁₀ GI ₅₀ value) was calculated from the score (Table 11). When this predicted value was compared with the actual value of -Log ₁₀ GI ₅₀ value shown in Table 4 of Example 1, it was found that 4 out of 6 strains (Calu-1, Calu-3, N417 and SBC-3) were- The absolute value of the residual of the log ₁₀ GI ₅₀ value was 0.3 or less, and the average of the absolute values of the residuals of the 6 strains was 0.22. Table 11). Therefore, it was shown that this optimization model A ′ is effective in predicting the sensitivity of lung cancer cells to Eg5 inhibitors.

(3) Application to other cancer types Among the 38 human cell lines of Example 1, other 12 cancer cell lines other than lung cancer (6 colorectal cancer lines: COLO205, HT-29, HCT116, SW480, DLD-1 and WiDr) In Example 4 (2), the gene expression levels of pancreatic cancer strain 4: PANC-1, MIA PaCa-2, AsPC-1, BxPC-3, ovarian cancer strain 2: SK-OV-3 and OVCAR-3) By applying to the constructed lung cancer optimization model A ′, the predicted value of the sensitivity of 12 cell lines to the Eg5 inhibitor was calculated, and the optimization model A ′ was evaluated by looking at the residual. From the partial regression coefficient a of each 11 genes determined in the lung cancer optimization model A ′ and the expression level (Ct value) of each gene measured in Example 2, the score of each gene (product of a and Ct) is calculated, The predicted value of sensitivity (-Log ₁₀ GI ₅₀ value) was calculated from these scores. When this predicted value was compared with the actual value of -Log ₁₀ GI ₅₀ value shown in Table 4 of Example 1, the absolute value of the residual of -log ₁₀ GI ₅₀ value was 0.3 in 7 of 12 strains. Below, the average of the absolute values of the residuals of the 12 strains was 0.28, and the prediction accuracy close to that of the lung cancer cell lines was obtained (Tables 12-1 and 12-2). Therefore, it was shown that this model created based on lung cancer is effective not only for lung cancer but also for predicting the sensitivity of other carcinomas to Eg5 inhibitors.

選抜されたＥｇ５感受性関与遺伝子のヒト臨床癌組織における発現
実施例３で示した遺伝子発現プロファイルと感受性の相関解析の実験結果から選抜された１９遺伝子中の１４遺伝子（ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３Ｃ、ＡＢＣＣ３、ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２およびＦＬＪ２３２６９）およびポジティブコントロールとしてハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤについて、ヒト癌組織における発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した。
クロンテック社市販の同一患者に由来する癌および正常組織のｃＤＮＡ〔ＭａｔｃｈｅｄｃＤＮＡＰａｉｒｓ、ヒト卵巣１〜５、Ａ〜Ｅ（計１０サンプル）、ヒト***４、Ａ〜Ｅ（計６サンプル）〕を用いて解析を行った。リアルタイムＰＣＲ法は実施例２に示した方法で行った。コントロールとして、鋳型をいれずに代わりに水を用いたものも行った。
結果は実施例１と同様にして求めたＣｔ値で示した。卵巣ｃＤＮＡの結果を第１３表に、***ｃＤＮＡの結果を第１４表に示す。各遺伝子の上段は、正常組織での発現量、下段は癌組織での発現量を示す。

ＡＢＣＣ２を除く１３種の遺伝子群では調べた卵巣癌、乳癌組織のほぼ全てにおいて４０以下のＣｔ値を示した。このことは、これらの癌組織で調べた遺伝子が発現していることを意味している。
今回の解析結果より、１４種中１３種の遺伝子で癌組織での発現が認められた。従って、今回選択された第８表に示した１９遺伝子のヒト癌組織での発現を調べることで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性の予測に利用できると考えられる。Expression of selected Eg5 susceptibility-related genes in human clinical cancer tissues 14 genes (CYP24A1, OBRGRP, BF, APRT, BIRC3, TNFAIP2, ITM2B, ABCC2, ANXA3, FAM3C, ABCC3, BC007436, MAP1B, CCNB1, HSPCA, CCNB2, and FLJ23269) and GAPD, which is a housekeeping gene as a positive control, were expressed in human cancer tissues by real-time RT-PCR. Analyzed.
Using cancer and normal tissue cDNAs (Matched cDNA Pairs, human ovaries 1 to 5, A to E (total 10 samples), human breast 4, A to E (total 6 samples)) derived from the same patient commercially available from Clontech Analysis. The real-time PCR method was performed by the method shown in Example 2. As a control, water was used instead of a mold.
The results are shown as Ct values obtained in the same manner as in Example 1. The results of ovarian cDNA are shown in Table 13, and the results of breast cDNA are shown in Table 14. The upper part of each gene shows the expression level in normal tissues, and the lower part shows the expression level in cancer tissues.

The 13 gene groups excluding ABCC2 showed Ct values of 40 or less in almost all ovarian cancer and breast cancer tissues examined. This means that the genes examined in these cancer tissues are expressed.
From the results of this analysis, 13 out of 14 genes were expressed in cancer tissues. Therefore, by examining the expression of the 19 genes shown in Table 8 selected this time in human cancer tissues, it can be used to predict sensitivity to Eg5 inhibitors.

本発明により、癌患者より取り出された癌細胞および癌細胞株における、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を予測する遺伝子を選抜することができ、それらの遺伝子を用いた癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性の判定が可能となる。また、それらの遺伝子を用いて、あるいはそれら遺伝子の発現を制御することにより、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強することが可能となる。その結果、Ｅｇ５阻害剤による癌の治療を効果的に行うことができる。 According to the present invention, it is possible to select genes that predict sensitivity to Eg5 inhibitors in cancer cells and cancer cell lines extracted from cancer patients, and determination of sensitivity of cancer cells to Eg5 inhibitors using these genes. Is possible. Moreover, it becomes possible to enhance the sensitivity of cancer cells to Eg5 inhibitors by using these genes or by controlling the expression of these genes. As a result, cancer can be effectively treated with an Eg5 inhibitor.

配列番号１−発明者：篠原史一；大林正也；吉田哲郎
発明者：辻田徹也；中井龍一郎
発明者：山下順範SEQ ID NO: 1-Inventor: Fumiichi Shinohara; Masaya Obayashi; Tetsuro Yoshida
Inventor: Tetsuya Hamada; Ryuichiro Nakai
Inventor: Junnori Yamashita

Claims

以下の（ａ）〜（ｃ）の工程
（ａ）２以上のヒト癌細胞株について、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性および１以上のヒト遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で発現量を測定した遺伝子ごとに、各細胞株における該遺伝子の発現量と該細胞株のＥｇ５阻害剤に対する感受性との相関とを解析する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で相関のあった遺伝子を選抜する工程、
を含む、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性に関わる遺伝子を同定する方法。Steps (a) to (c) below: (a) measuring two or more human cancer cell lines, the sensitivity to an Eg5 inhibitor and the expression level of one or more human genes;
(B) for each gene whose expression level was measured in step (a), analyzing the correlation between the expression level of the gene in each cell line and the sensitivity of the cell line to Eg5 inhibitor;
(C) a step of selecting genes correlated in step (b),
A method for identifying a gene involved in sensitivity of a cancer cell to an Eg5 inhibitor.

工程（ａ）で測定に用いるヒト癌細胞株が、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９からなる肺癌由来の細胞株、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＴ−２９、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＤＬＤ−１およびＷｉＤｒからなる大腸癌由来の細胞株、ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１およびＢｘＰＣ−３からなる膵臓癌由来の細胞株、ＳＫ−ＯＶ−３およびＯＶＣＡＲ−３からなる卵巣癌由来の細胞株からなる群から選択される全てあるいは一部の細胞株である、請求項１に記載の方法。Human cancer cell lines used for measurement in step (a) are A549, Calu-1, Calu-3, NCI-H23, NCI-H69, NCI-H226, NCI-H345, N417, NCI-H460, NCI-H596, NCI-H1299, SBC-3, PC-14, PC-14 / DTX, PC-14 / CDDP, MRC-5, IMR-90, EBC-1, NCI-H292, SHP-77, NCI-H441, NCI- A cell line derived from lung cancer consisting of H838, A427, NCI-H522, Calu-6 and PC-9, a cell line derived from colon cancer consisting of Colo205, HT-29, HCT116, SW480, DLD-1 and WiDr, PANC-1 A cell line derived from pancreatic cancer consisting of MIA PaCa-2, AsPC-1 and BxPC-3, S Is all or part of the cell lines selected from -ov-3 and the group consisting of cell lines derived from ovarian cancer consisting of OVCAR-3, The method of claim 1.

選択される細胞株が、Ａ５４９、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３４５、Ｎ４１７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＳＢＣ−３、ＰＣ−１４、ＰＣ−１４／ＤＴＸ、ＰＣ−１４／ＣＤＤＰ、ＭＲＣ−５、ＩＭＲ−９０、ＥＢＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ８３８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ｃａｌｕ−６およびＰＣ−９からなる肺癌由来の細胞株から選択される全てあるいは一部の細胞株である、請求項２に記載の方法。The selected cell lines are A549, Calu-1, Calu-3, NCI-H23, NCI-H69, NCI-H226, NCI-H345, N417, NCI-H460, NCI-H596, NCI-H1299, SBC-3. PC-14, PC-14 / DTX, PC-14 / CDDP, MRC-5, IMR-90, EBC-1, NCI-H292, SHP-77, NCI-H441, NCI-H838, A427, NCI-H522 The method according to claim 2, wherein the cell line is all or a part of cell lines selected from lung cancer-derived cell lines comprising Calu-6 and PC-9.

工程（ａ）で測定に用いるヒト癌細胞株が、１つの特定の臓器に由来する癌細胞株である請求項１に記載の方法。The method according to claim 1, wherein the human cancer cell line used for the measurement in step (a) is a cancer cell line derived from one specific organ.

１つの特定の臓器が肺である請求項４に記載の方法。The method of claim 4, wherein one particular organ is the lung.

感受性の強さを測定するＥｇ５阻害剤が、一般式（Ｉ）

＜式中、
Ｒ^１およびＲ^４は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表し、
Ｒ^２は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−Ｃ（＝Ｗ）Ｒ^６［式中、Ｗは酸素原子または硫黄原子を表し、Ｒ^６は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＮＲ^７Ｒ^８（式中、Ｒ^７およびＲ^８は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ^７とＲ^８が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、−ＯＲ^９（式中、Ｒ^９は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）または−ＳＲ^１０（式中、Ｒ^１０は前記のＲ^９と同義である）を表す］、−ＮＲ^１１Ｒ^１２｛式中、Ｒ^１１およびＲ^１２は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^１３［式中、Ｒ^１３は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＮＲ^７ＡＲ^８Ａ（式中、Ｒ^７ＡおよびＲ^８Ａはそれぞれ前記のＲ^７およびＲ^８と同義である）、−ＯＲ^９Ａ（式中、Ｒ^９Ａは前記のＲ^９と同義である）または−ＳＲ^１０Ａ（式中、Ｒ^１０Ａは前記のＲ^９と同義である）を表す］を表す｝または−ＳＯ_２Ｒ^１４（式中、Ｒ^１４は前記のＲ^９と同義である）を表すか、またはＲ^１とＲ^２が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成し、
Ｒ^５は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ^４とＲ^５が一緒になって−（ＣＲ^１５ＡＲ^１５Ｂ）_ｍ１−Ｑ−（ＣＲ^１５ＣＲ^１５Ｄ）_ｍ２−｛式中、Ｑは単結合、置換もしくは非置換のフェニレンまたはシクロアルキレンを表し、ｍ１およびｍ２は同一または異なって０〜４の整数を表すが、ｍ１とｍ２は同時に０とはならず、Ｒ^１５Ａ、Ｒ^１５Ｂ、Ｒ^１５ＣおよびＲ^１５Ｄは同一または異なって、水素原子、ハロゲン、置換もしくは非置換の低級アルキル、−ＯＲ^１６［式中、Ｒ^１６は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＣＯＮＲ^７ＢＲ^８Ｂ（式中、Ｒ^７ＢおよびＲ^８Ｂは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表すか、またはＲ^７ＢとＲ^８Ｂが隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、−ＳＯ_２ＮＲ^７ＣＲ^８Ｃ（式中Ｒ^７ＣおよびＲ^８Ｃはそれぞれ前記のＲ^７ＢおよびＲ^８Ｂと同義である）または−ＣＯＲ^１７（式中、Ｒ^１７は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）を表す］、−ＮＲ^１８Ｒ^１９［式中、Ｒ^１８およびＲ^１９は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、−ＣＯＲ^２０（式中、Ｒ^２０は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換の複素環基、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、アミノ、置換もしくは非置換の低級アルキルアミノ、置換もしくは非置換のジ低級アルキルアミノまたは置換もしくは非置換のアリールアミノを表す）または−ＳＯ_２Ｒ^２１（式中、Ｒ^２１は置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の複素環基を表す）を表す］または−ＣＯ_２Ｒ^２２（式中、Ｒ^２２は前記のＲ^１７と同義である）を表すか、またはＲ^１５ＡＲ^１５ＢまたはＲ^１５ＣとＲ^１５Ｄが一緒になって酸素原子を表し、ｍ１またはｍ２が２以上の整数であるとき、それぞれのＲ^１５Ａ、Ｒ^１５Ｂ、Ｒ^１５ＣおよびＲ^１５Ｄは同一でも異なっていてもよく、隣接するふたつの炭素原子に結合するＲ^１５Ａ、Ｒ^１５Ｂ、Ｒ^１５ＣおよびＲ^１５Ｄはそれぞれ一緒になって結合を形成してもよい｝を表し、
Ｒ^３は水素原子または−Ｃ（＝Ｗ^Ａ）Ｒ^２３（式中、Ｗ^ＡおよびＲ^２３はそれぞれ前記のＷおよびＲ^６と同義である）を表す＞で表されるチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。An Eg5 inhibitor that measures the strength of sensitivity is represented by the general formula (I)

<In the formula,
R ¹ and R ⁴ are the same or different and each represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted An aryl or a substituted or unsubstituted heterocyclic group of
R ² is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted A heterocyclic group, —C (═W) R ⁶ , wherein W represents an oxygen atom or a sulfur atom, R ⁶ represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl, a substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or Unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocyclic group, —NR ⁷ R ⁸ (wherein R ⁷ and R ⁸ are the same or different, Hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkyl Represents nyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl or substituted or unsubstituted heterocyclic group, or R ⁷ and R ⁸ together with the adjacent nitrogen atom are substituted or unsubstituted -OR ⁹ (wherein R ⁹ is substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, Represents substituted or unsubstituted aryl or a substituted or unsubstituted heterocyclic group) or —SR ¹⁰ (wherein R ¹⁰ has the same meaning as R ⁹ described above), —NR ¹¹ R ¹² {wherein , R ¹¹ and R ¹² are the same or different, a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted if The unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl or substituted or unsubstituted heterocyclic group, or -C (= O) R 13 ^[wherein, R ¹³ is a hydrogen atom, a substituted Or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocyclic group, —NR ^7A R ^8A (wherein R ^7A and R ^8A are as defined above for R ⁷ and R ⁸ ), -OR ^9A (wherein R ^9A is as defined for R ⁹ above) or -SR ^10A (wherein ^{wherein, R 10A} during} or _-SO 2 ^{R 14} (wherein represents a] representing the a is) synonymous with said ^{R ^9,} ^{R 14} has the same meaning as above ^{R 9} The representative or R ¹ and R ² together with the adjacent nitrogen atom to form a substituted or unsubstituted heterocyclic group,
R ⁵ represents substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, or substituted or unsubstituted heterocyclic group Or R ⁴ and R ^{5 taken} together — (CR ^15A R ^15B ) _m1 -Q— (CR ^15C R ^15D ) _m2 — {wherein Q is a single bond, substituted or unsubstituted phenylene or Represents cycloalkylene, and m1 and m2 are the same or different and each represents an integer of 0 to 4, m1 and m2 are not 0 simultaneously, and R ^15A , R ^15B , R ^15C and R ^15D are the same or different; hydrogen atom, halogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, in ^{-OR 16} ^{[wherein, R 16} is a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted location Lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocyclic group, in ^-CONR 7B ^{R 8B} ^{(wherein, R 7B} and ^{R 8B} of Are the same or different and represent a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted Represents an unsubstituted heterocyclic group, or R ^7B and R ^8B together with the adjacent nitrogen atom form a substituted or unsubstituted heterocyclic group), —SO ₂ NR ^7C R ^8C (wherein R ^7C and R ^8C are as defined above for R ^7B and R ^8B , respectively, or —COR ¹⁷ (wherein , R ¹⁷ is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted -NR ¹⁸ R ¹⁹ , wherein R ¹⁸ and R ¹⁹ are the same or different and represent a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl, a substituted or unsubstituted lower alkenyl, Substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocyclic group, —COR ²⁰ (wherein R ²⁰ represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted Lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl Substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocyclic group, substituted or unsubstituted lower alkoxy, substituted or unsubstituted aryloxy, amino, substituted or unsubstituted lower alkyl Represents amino, substituted or unsubstituted di-lower alkylamino or substituted or unsubstituted arylamino) or —SO ₂ R ²¹ (wherein R ²¹ represents substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl) , substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, represents a represents) a substituted or unsubstituted aryl or substituted or unsubstituted heterocyclic group or -CO 2 _R 22 ^(wherein, R ²² or represents a a) synonymous with said ^{R 17} or ^R 15A ^{R 15B,} Other represents an oxygen atom ^{R 15C} and ^{R 15D} together, when m1 or m2 is 2 or more integer, each of ^{^R ^15A,} ^R ^15B, ^R ^15C and ^{R 15D} may be the same or different Each of R ^15A , R ^15B , R ^15C and R ^15D bonded to two adjacent carbon atoms may together form a bond}
R ³ represents a hydrogen atom or —C (═W ^A ) R ²³ (wherein W ^A and R ²³ have the same meanings as W and R ⁶ , respectively)> 6. A process according to any one of claims 1 to 5 which is a pharmaceutically acceptable salt.

Ｒ^１が水素原子であり、Ｒ^２が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^６Ａ（式中、Ｒ^６Ａは低級アルキルを表す）であり、Ｒ^３が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^２３Ａ（式中、Ｒ^２３Ａは低級アルキルを表す）であり、Ｒ^４が置換低級アルキルであり、Ｒ^５がフェニルである請求項６に記載の方法。R ¹ is a hydrogen atom, (in the ^{formula, R 6A} represents a lower alkyl) ^{R 2} is -C (= ^{O) R 6A} is, in ^{R 3} is -C (= ^{O) R 23A} (wherein, R ^23A represents lower alkyl), R ⁴ is substituted lower alkyl, and R ⁵ is phenyl.

Ｒ^４が−（ＣＨ_２）_ｎａＮＨＳＯ_２Ｒ^ａ（式中、ｎａは１または２であり、Ｒ^ａは置換もしくは非置換の低級アルキルを表す）である請求項６または７に記載の方法。The method according to claim 6 or 7, wherein R ⁴ is-(CH ₂ ) _na NHSO ₂ R ^a , wherein na is 1 or 2, and ^Ra represents a substituted or unsubstituted lower alkyl.

一般式（Ｉ）で表されるチアジアゾリン誘導体が下記式（Ａ）〜（Ｃ）および（Ｅ）〜（Ｐ）で表される化合物からなる群から選択される化合物である請求項６に記載の方法。

The thiadiazoline derivative represented by the general formula (I) is a compound selected from the group consisting of compounds represented by the following formulas (A) to (C) and (E) to (P). Method.

感受性の強さを測定するＥｇ５阻害剤が、一般式（ＩＩ）

（式中、Ｒ^２４は置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換の芳香族複素環基を表し、Ｒ^２５およびＲ^２６は同一または異なって、水素原子、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、もしくはヒドロキシメチルを表すか、またはＲ^２５とＲ^２６が一緒になって酸素原子、硫黄原子または結合を表す）で表されるシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。An Eg5 inhibitor that measures the strength of sensitivity is represented by the general formula (II)

(Wherein R ²⁴ represents a substituted or unsubstituted aryl group or a substituted or unsubstituted aromatic heterocyclic group, and R ²⁵ and R ²⁶ are the same or different and represent a hydrogen atom, halogen, lower alkyl, lower alkoxy, hydroxy , Carboxy or hydroxymethyl, or R ²⁵ and R ²⁶ together represent an oxygen atom, a sulfur atom or a bond) or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 6. A method according to any one of claims 1 to 5.

システイン誘導体がＬ−システイン誘導体である請求項１０に記載の方法。The method according to claim 10, wherein the cysteine derivative is an L-cysteine derivative.

Ｒ^２４がフェニル、４−メチルフェニル、２−ナフチル、４−ピリジル、または１，３−ベンゾジオキソール−５−イルであり、Ｒ^２５およびＲ^２６が同一または異なって、水素原子、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、またはヒドロキシメチルである請求項１０または１１に記載の方法。R ²⁴ is phenyl, 4-methylphenyl, 2-naphthyl, 4-pyridyl, or 1,3-benzodioxol-5-yl, R ²⁵ and R ²⁶ are the same or different, and a hydrogen atom, halogen, The method according to claim 10 or 11, which is lower alkyl, lower alkoxy, hydroxy, carboxy, or hydroxymethyl.

感受性の強さを測定するＥｇ５阻害剤が、下記式（Ｑ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。

The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the Eg5 inhibitor that measures the strength of sensitivity is a compound represented by the following formula (Q) or a pharmacologically acceptable salt thereof.

以下の（ａ）〜（ｅ）の工程
（ａ）請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法により同定された遺伝子から１以上の遺伝子を選択し、その発現量に応じた点数を決定する工程、
（ｂ）被験癌細胞について、工程（ａ）で選択された遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｃ）各遺伝子について、工程（ｂ）で測定した発現量に基づき、工程（ａ）で決定した点数を割り当てる工程、
（ｄ）選択された全遺伝子についての割り当てられた点数から、被験癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性の指標となる数値を求める工程、
（ｅ）あらかじめ決定した閾値と（ｄ）で得られた数値とを比較する工程、
を含む、癌細胞のＥｇ５阻害剤に対する感受性を判定する方法。The following steps (a) to (e) (a) selecting one or more genes from the genes identified by the method according to any one of claims 1 to 13, and assigning a score according to the expression level: The process of determining,
(B) measuring the expression level of the gene selected in step (a) for the test cancer cell;
(C) assigning the score determined in step (a) based on the expression level measured in step (b) for each gene,
(D) obtaining a numerical value as an index of the sensitivity of the test cancer cell to the Eg5 inhibitor from the assigned score for all the selected genes;
(E) a step of comparing a predetermined threshold value with a numerical value obtained in (d);
A method for determining the sensitivity of cancer cells to an Eg5 inhibitor.

工程（ａ）で選択する遺伝子が、以下の（ｉ）〜（ｘｉｘ）それぞれの遺伝子からなる遺伝子群から選択される１以上の遺伝子である請求項１４に記載の方法。
（ｉ）チトクロームＰ４５０・ファミリー２４・サブファミリーＡ・ポリペプチド１（ＣＹＰ２４Ａ１）
（ｉｉ）レプチン受容体遺伝子関連蛋白質（ＯＢＲＧＲＰ）
（ｉｉｉ）Ｂ因子（ＢＦ）
（ｉｖ）アデニンホスホリボシルトラスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）
（ｖ）バキュロウイルスＩＡＰリピート含有蛋白質（ＢＩＲＣ３）
（ｖｉ）シーケストソーム１（ＳＱＳＴＭ１）
（ｖｉｉ）腫瘍壊死因子α誘導蛋白質２（ＴＮＦＡＩＰ２）
（ｖｉｉｉ）膜内在性蛋白質２Ｂ（ＩＴＭ２Ｂ）
（ｉｘ）ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー２（ＡＢＣＣ２）
（ｘ）アネキシンＡ３（ＡＮＸＡ３）
（ｘｉ）相同配列３含有ファミリー・メンバー３（ＦＡＭ３Ｃ）
（ｘｉｉ）ＡＴＰ結合カセット・サブファミリーＣ・メンバー３（ＡＢＣＣ３）
（ｘｉｉｉ）仮想蛋白質ＢＣ００７４３６（ＢＣ００７４３６）
（ｘｉｖ）微小管関連蛋白質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）
（ｘｖ）サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）
（ｘｖｉ）ヒートショック９０ｋＤａ蛋白質１α（ＨＳＰＣＡ）
（ｘｖｉｉ）サイクリンＢ２（ＣＣＮＢ２）
（ｘｖｉｉｉ）仮想蛋白質ＦＬＪ２３２６９（ＦＬＪ２３２６９）
（ｘｉｘ）溶質キャリアー・ファミリー１２・メンバー２（ＳＬＣ１２Ａ２）The method according to claim 14, wherein the gene selected in step (a) is one or more genes selected from the gene group consisting of the following genes (i) to (xix).
(I) cytochrome P450 family 24 subfamily A polypeptide 1 (CYP24A1)
(Ii) Leptin receptor gene-related protein (OBRGRP)
(Iii) Factor B (BF)
(Iv) Adenine phosphoribosyl transferase (APRT)
(V) Baculovirus IAP repeat-containing protein (BIRC3)
(Vi) Sequestsome 1 (SQSTM1)
(Vii) Tumor necrosis factor α-inducing protein 2 (TNFAIP2)
(Viii) integral membrane protein 2B (ITM2B)
(Ix) ATP binding cassette subfamily C member 2 (ABCC2)
(X) Annexin A3 (ANXA3)
(Xi) Homologous sequence 3 containing family member 3 (FAM3C)
(Xii) ATP binding cassette subfamily C member 3 (ABCC3)
(Xiii) hypothetical protein BC007436 (BC007436)
(Xiv) Microtubule-related protein 1B (MAP1B)
(Xv) Cyclin B1 (CCNB1)
(Xvi) Heat shock 90 kDa protein 1α (HSPCA)
(Xvii) Cyclin B2 (CCNB2)
(Xviii) hypothetical protein FLJ23269 (FLJ23269)
(Xix) Solute Carrier Family 12 Member 2 (SLC12A2)

（ａ）の工程で選択される遺伝子が、ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＡＰＲＴ、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２およびＦＬＪ２３２６９である請求項１５に記載の方法。The method according to claim 15, wherein the genes selected in the step (a) are CYP24A1, OBRGRP, APRT, TNFAIP2, ITM2B, ABCC2, BC007436, MAP1B, HSPCA, CCNB2 and FLJ23269.

Ｅｇ５阻害剤が、請求項６から９のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。The method according to any one of claims 14 to 16, wherein the Eg5 inhibitor is the thiadiazoline derivative according to any one of claims 6 to 9 or a pharmacologically acceptable salt thereof.

Ｅｇ５阻害剤が、請求項１０から１２のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。The method according to any one of claims 14 to 16, wherein the Eg5 inhibitor is the cysteine derivative according to any one of claims 10 to 12 or a pharmacologically acceptable salt thereof.

Ｅｇ５阻害剤が、請求項１３に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。The method according to any one of claims 14 to 16, wherein the Eg5 inhibitor is the compound according to claim 13 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

癌細胞が肺癌細胞である請求項１４から１９のいずれか１項に記載の方法。The method according to any one of claims 14 to 19, wherein the cancer cells are lung cancer cells.

遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイにより定量することにより行う、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。21. The method according to any one of claims 1 to 20, wherein the expression level of the gene is measured by quantifying mRNA, which is a transcription product of the gene, using a DNA microarray.

遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを定量的ＰＣＲにより定量することにより行う、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。The method according to any one of claims 1 to 20, wherein the expression level of the gene is measured by quantifying mRNA, which is a transcription product of the gene, by quantitative PCR.

遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡをノーザンブロットにより定量することにより行う、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。The method according to any one of claims 1 to 20, wherein the expression level of the gene is measured by quantifying mRNA, which is a transcription product of the gene, by Northern blotting.

請求項２２に記載の方法において使用するための、該ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、ｍＲＮＡの定量試薬。23. An mRNA quantitative reagent comprising an oligonucleotide complementary to the mRNA for use in the method of claim 22.

遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質を免疫化学的方法により定量することにより行う、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。The method according to any one of claims 1 to 20, wherein the expression level of the gene is measured by quantifying a protein that is a gene product of the gene by an immunochemical method.

遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質をＥＬＩＳＡにより定量することにより行う、請求項２５に記載の方法。The method according to claim 25, wherein the expression level of the gene is measured by quantifying a protein that is a gene product of the gene by ELISA.

遺伝子の発現量の測定を、該遺伝子の遺伝子産物である蛋白質をウエスタンブロットにより定量することにより行う、請求項２５に記載の方法。The method according to claim 25, wherein the expression level of the gene is measured by quantifying a protein that is a gene product of the gene by Western blotting.

請求項２５から２７のいずれか１項に記載の方法において使用するための、該蛋白質に対する抗体を含む免疫測定試薬。An immunoassay reagent comprising an antibody against the protein for use in the method according to any one of claims 25 to 27.

ＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２からなる群から選択される単独又は複数の遺伝子であって、癌細胞に強制発現させることによってＥｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子または該遺伝子がコードする蛋白質を含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。BC007436, MAP1B, CCNB1, HSPCA, CCNB2, FLJ23269 and SLC12A2 are one or more genes selected from the group consisting of a gene that exhibits an activity to enhance sensitivity to an Eg5 inhibitor by forced expression in cancer cells or A drug for enhancing sensitivity to an Eg5 inhibitor, comprising a protein encoded by the gene.

細胞が肺癌細胞である請求項２９に記載の感受性増強薬。30. The sensitivity enhancer according to claim 29, wherein the cell is a lung cancer cell.

Ｅｇ５阻害剤が請求項６から９のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項２９または３０に記載の感受性増強薬。31. The sensitivity enhancer according to claim 29 or 30, wherein the Eg5 inhibitor is the thiadiazoline derivative according to any one of claims 6 to 9 or a pharmacologically acceptable salt thereof.

Ｅｇ５阻害剤が請求項１０から１２のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項２９または３０に記載の感受性増強薬。31. The sensitivity enhancer according to claim 29 or 30, wherein the Eg5 inhibitor is the cysteine derivative according to any one of claims 10 to 12 or a pharmacologically acceptable salt thereof.

Ｅｇ５阻害剤が請求項１３に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項２９または３０に記載の感受性増強薬。The sensitivity enhancer according to claim 29 or 30, wherein the Eg5 inhibitor is the compound according to claim 13 or a pharmacologically acceptable salt thereof.

細胞に試験物質を添加し、該細胞におけるＢＣ００７４３６、ＭＡＰ１Ｂ、ＣＣＮＢ１、ＨＳＰＣＡ、ＣＣＮＢ２、ＦＬＪ２３２６９およびＳＬＣ１２Ａ２からなる群から選択される少なくとも１以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を添加しない場合の該遺伝子の発現量と比較して該遺伝子の発現を増加させる物質を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる候補物質として選択する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質のスクリーニング方法。When a test substance is added to a cell, the expression level of at least one gene selected from the group consisting of BC007436, MAP1B, CCNB1, HSPCA, CCNB2, FLJ23269 and SLC12A2 is measured in the cell, and no test substance is added A method for screening a substance that enhances sensitivity to an Eg5 inhibitor, wherein a substance that increases the expression of the gene compared to the expression level of the gene is selected as a candidate substance that enhances sensitivity to the Eg5 inhibitor.

細胞が肺癌細胞である請求項３４に記載のスクリーニング方法。The screening method according to claim 34, wherein the cells are lung cancer cells.

Ｅｇ５阻害剤が請求項６から９のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項３４または３５に記載のスクリーニング方法。36. The screening method according to claim 34 or 35, wherein the Eg5 inhibitor is the thiadiazoline derivative according to any one of claims 6 to 9 or a pharmacologically acceptable salt thereof.

Ｅｇ５阻害剤が請求項１０から１２のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項３４または３５に記載のスクリーニング方法。36. The screening method according to claim 34 or 35, wherein the Eg5 inhibitor is the cysteine derivative according to any one of claims 10 to 12 or a pharmacologically acceptable salt thereof.

Ｅｇ５阻害剤が請求項１３に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項３４または３５に記載のスクリーニング方法。The screening method according to claim 34 or 35, wherein the Eg5 inhibitor is the compound according to claim 13 or a pharmacologically acceptable salt thereof.

ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３からなる群から選択される単独又は複数の遺伝子であって、癌細胞において該遺伝子の発現を抑制することで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。A single gene or a plurality of genes selected from the group consisting of CYP24A1, OBRGRP, BF, APRT, BIRC3, SQSTM1, TNFAIP2, ITM2B, ABCC2, ANXA3, FAM3C and ABCC3, and suppress the expression of the gene in cancer cells An siRNA or antisense polynucleotide that suppresses the expression of a gene exhibiting an activity that enhances sensitivity to an Eg5 inhibitor.

癌細胞が肺癌細胞である請求項３９に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。40. The siRNA or antisense polynucleotide according to claim 39, wherein the cancer cell is a lung cancer cell.

Ｅｇ５阻害剤が請求項６から９のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項３９または４０に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。The siRNA or antisense polynucleotide according to claim 39 or 40, wherein the Eg5 inhibitor is the thiadiazoline derivative according to any one of claims 6 to 9 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Ｅｇ５阻害剤が請求項１０から１２のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項３９または４０に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。41. The siRNA or antisense polynucleotide according to claim 39 or 40, wherein the Eg5 inhibitor is the cysteine derivative according to any one of claims 10 to 12 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Ｅｇ５阻害剤が請求項１３に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項３９または４０に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチド。The siRNA or antisense polynucleotide according to claim 39 or 40, wherein the Eg5 inhibitor is the compound according to claim 13 or a pharmacologically acceptable salt thereof.

請求項３９から４３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを発現するベクター。44. A vector for expressing the siRNA or antisense polynucleotide according to any one of claims 39 to 43.

請求項３９から４３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスポリヌクレオチドまたは請求項４４に記載のベクターを含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。45. A sensitivity enhancer for an Eg5 inhibitor, comprising the siRNA or antisense polynucleotide according to any one of claims 39 to 43 or the vector according to claim 44.

ＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３から選択されるいずれかの遺伝子であって、癌細胞において該遺伝子の発現を抑制することで、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる活性を示す遺伝子にコードされる蛋白質に対する抗体を含有する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性増強薬。Any gene selected from CYP24A1, OBRGRP, BF, APRT, BIRC3, SQSTM1, TNFAIP2, ITM2B, ABCC2, ANXA3, FAM3C, and ABCC3, and suppresses the expression of the gene in cancer cells, thereby inhibiting Eg5 An agent for enhancing sensitivity to an Eg5 inhibitor, comprising an antibody against a protein encoded by a gene exhibiting an activity that enhances sensitivity to the agent.

Ｅｇ５阻害剤が請求項６から９のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項４６に記載の感受性増強薬。47. The sensitivity enhancer according to claim 46, wherein the Eg5 inhibitor is the thiadiazoline derivative according to any one of claims 6 to 9 or a pharmacologically acceptable salt thereof.

Ｅｇ５阻害剤が請求項１０から１２のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項４６に記載の感受性増強薬。47. The sensitivity enhancer according to claim 46, wherein the Eg5 inhibitor is the cysteine derivative according to any one of claims 10 to 12 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Ｅｇ５阻害剤が請求項１３に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項４６に記載の感受性増強薬。The sensitivity enhancer according to claim 46, wherein the Eg5 inhibitor is the compound according to claim 13 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

細胞に試験物質を添加し、該細胞におけるＣＹＰ２４Ａ１、ＯＢＲＧＲＰ、ＢＦ、ＡＰＲＴ、ＢＩＲＣ３、ＳＱＳＴＭ１、ＴＮＦＡＩＰ２、ＩＴＭ２Ｂ、ＡＢＣＣ２、ＡＮＸＡ３、ＦＡＭ３ＣおよびＡＢＣＣ３からなる群から選択される少なくとも１以上の遺伝子の発現量を測定し、試験物質を添加しない場合の該遺伝子の発現量と比較して該遺伝子の発現を減少させる物質を、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる候補物質として選択する、Ｅｇ５阻害剤に対する感受性を増強させる物質のスクリーニング方法。A test substance is added to a cell, and the expression level of at least one gene selected from the group consisting of CYP24A1, OBRGRP, BF, APRT, BIRC3, SQSTM1, TNFAIP2, ITM2B, ABCC2, ANXA3, FAM3C, and ABCC3 is expressed in the cell. Measure and select a substance that decreases the expression of the gene as compared to the expression level of the gene when no test substance is added, as a candidate substance that enhances the sensitivity to the Eg5 inhibitor, enhancing the sensitivity to the Eg5 inhibitor Screening method for substances to be caused.

細胞が肺癌細胞である請求項５０に記載のスクリーニング方法。The screening method according to claim 50, wherein the cells are lung cancer cells.

Ｅｇ５阻害剤が請求項６から９のいずれか１項に記載のチアジアゾリン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項５０または５１に記載のスクリーニング方法。The screening method according to claim 50 or 51, wherein the Eg5 inhibitor is the thiadiazoline derivative according to any one of claims 6 to 9 or a pharmacologically acceptable salt thereof.

Ｅｇ５阻害剤が請求項１０から１２のいずれか１項に記載のシステイン誘導体またはその薬理学的に許容される塩である請求項５０または５１に記載のスクリーニング方法。The screening method according to claim 50 or 51, wherein the Eg5 inhibitor is the cysteine derivative according to any one of claims 10 to 12 or a pharmacologically acceptable salt thereof.

Ｅｇ５阻害剤が請求項１３に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項５０または５１に記載のスクリーニング方法。The screening method according to claim 50 or 51, wherein the Eg5 inhibitor is the compound according to claim 13 or a pharmacologically acceptable salt thereof.