JPWO2005007848A1 - 腸内細菌科の細菌を用いたl−ヒスチジンの製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明のさらなる目的は、トランスアルドラーゼ活性が増強するように改変された、腸内細菌科のL−ヒスチジン生産菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、エシェリヒア属に属する前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、トランスアルドラーゼ活性が、トランスアルドラーゼ遺伝子の発現量の増加により増強した前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、トランスアルドラーゼ活性が、トランスアルドラーゼ遺伝子のコピー数の増加により、または、該遺伝子の発現が増強するように該遺伝子の発現制御配列が改変されたことにより増加した前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌をトランスアルドラーゼ遺伝子を有するマルチコピーベクターで形質転換することにより前記コピー数が増加した前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記トランスアルドラーゼ遺伝子がエシェリヒア属細菌に由来するものである前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記トランスアルドラーゼ遺伝子は、
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質、からなる群から選ばれるタンパク質をコードする前記細菌を提供することである。
(8)前記トランスアルドラーゼ遺伝子は、
(a)配列番号1のヌクレオチド1〜954のヌクレオチド配列を含むDNA、及び
(b)配列番号1のヌクレオチド1〜954のヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA、からなる群から選ばれる、前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記ストリンジェントな条件は、60℃、かつ1×SSCおよび0.1%SDSに相当する塩濃度で洗浄が行われる条件である、前記細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌を培地に培養し、該培養液中に蓄積したL−ヒスチジンを回収することとを含む、L−ヒスチジンの製造法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌は、ヒスチジン生合成遺伝子の発現が増強された、前記方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、トランスアルドラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科のL−ヒスチジン生産菌であって、同トランスアルドラーゼは、配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号2のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有し、かつトランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選ばれる細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記相同性が90%以上である細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、トランスアルドラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科のL−ヒスチジン生産菌であって、同トランスアルドラーゼは、
(a)配列番号1のヌクレオチド1〜954のヌクレオチド配列を含むDNA、及び
(b)配列番号1のヌクレオチド1〜954のヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA、からなる群から選ばれるヌクレオチド配列によってコードされる細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ヒスチジン生合成遺伝子の発現が増強された前記細菌を提供することである。
本発明の細菌は、腸内細菌科のL−ヒスチジン生産菌であり、同細菌中で本発明のタンパク質の活性を増強することによって同細菌のL−ヒスチジン産生が向上している。具体的には、本発明の細菌は、エシェリヒア属に属するL−ヒスチジン生産菌であり、同細菌中で本発明のタンパク質、すなわちトランスアルドラーゼの活性を増強することによって同細菌のL−ヒスチジン産生が向上している。より具体的には、本発明の細菌は、talB遺伝子を含む染色体またはプラスミドDNAを保持し、かつ、talB遺伝子の過剰発現によってL−ヒスチジン生産能が増強されている。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質。
上記のようなトランスアルドラーゼの改変は、トランスアルドラーゼ活性が維持されるような保存的変異である。置換は、アミノ酸配列中の少なくとも1残基が除去され、そこに他の残基が挿入される変化である。トランスアルドラーゼタンパク質の元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸としては、Alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからasn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。
上記のようなトランスアルドラーゼの改変は、公知のトランスアルドラーゼの構造に関する知見(例えば、Methods Enzymol.2002;354:197−201、Eur J Biochem.2001 Apr;268(8):2408−15、FEBS Lett.1998 Dec 18;441(2):247−50、Protein Sci.1997 Jan;6(1):119−24、Structure.1996 Jun 15;4(6):715−24)を参考にすることができる。
培養に使用される培地は、培地が、炭素源および窒素源およびミネラル類、及び必要に応じて微生物が生育に必要とする適当量の栄養を含む限り、合成培地であっても天然培地であってもよい。
炭素源には、グルコースおよびスクロースのような種々の炭水化物、および種々の有機酸が含まれる。使用する微生物の同化の様式によっては、エタノールおよびグリセロール等のアルコールを使用してもよい。
窒素源としては、アンモニアおよび硫酸アンモニウムのような種々のアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、および発酵微生物の消化物のような天然の窒素源が使用される。
ミネラル類としては、リン酸2カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウムなどが使用される。必要に応じて、さらなる栄養が培地に添加され得る。例えば、微生物が生育にプロリンを必要とする場合(プロリン栄養要求性)、培養のため十分量のプロリンが培地に添加され得る。
エシェリヒア・コリK−12株の全ヌクレオチド配列は、既に決定されている(Science,277,1453−1474,1997)。報告されたヌクレオチド配列に基づいて、配列番号3(プライマー1)および配列番号4(プライマー2)に示すプライマーを合成した。プライマー1は、talB遺伝子の開始コドンの74〜54bp上流の配列であり、5’末端に導入された制限酵素BglII認識部位を持つ。プライマー2は、talB遺伝子の終止コドンの82〜104bp下流の配列と相補的な配列であり、5’末端に導入された制限酵素Xbal認識部位を持つ。
ヒスチジン産生エシェリヒア・コリ80株を、プラスミドpMW−PR−talBによる形質転換の親株として使用した。80株は、ロシア特許第2119536号に記載されており、1999年10月15日に、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム(Russia,117545,Moscow,1 Dorozhny proezd,1)に、VKPM B−7270の受託番号で寄託され、2004年7月12日にブダペスト条約に基づき国際寄託に移管されている。
〔発酵培地の成分(pH6.0)(g/L)〕
グルコース 100.0
豆濃 0.2(TNとして)
(大豆加水分解物)
L−プロリン 1.0
(NH4)2SO4 25.0
KH2PO4 2.0
MgSO4x7H2O 1.0
FeSO4x7H2O 0.01
MnSO4 0.01
チアミン 0.001
ベタイン 2.0
CaCO3 60.0
ストレプトマイシン 1.0
Claims (15)
- トランスアルドラーゼ活性が増強するように改変された、腸内細菌科のL−ヒスチジン生産菌。
- エシェリヒア属に属する請求項1に記載の細菌。
- トランスアルドラーゼ活性が、トランスアルドラーゼ遺伝子の発現量の増加により増強した請求項1に記載の細菌。
- トランスアルドラーゼ活性が、トランスアルドラーゼ遺伝子のコピー数の増加により、または、該遺伝子の発現が増強するように該遺伝子の発現制御配列が改変されたことにより増加した、請求項3に記載の細菌。
- 前記細菌をトランスアルドラーゼ遺伝子を有するマルチコピーベクターで形質転換することにより前記コピー数が増加した請求項4に記載の細菌。
- 前記トランスアルドラーゼ遺伝子がエシェリヒア属細菌に由来するものである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の細菌。
- 前記トランスアルドラーゼ遺伝子は、
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質、からなる群から選ばれるタンパク質をコードする請求項6に記載の細菌。 - 前記トランスアルドラーゼ遺伝子は、
(a)配列番号1のヌクレオチド1〜954のヌクレオチド配列を含むDNA、及び
(b)配列番号1のヌクレオチド1〜954のヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA、からなる群から選ばれる、請求項6に記載の細菌。 - 前記ストリンジェントな条件は、60℃、かつ1×SSCおよび0.1%SDSに相当する塩濃度で洗浄が行われる条件である、請求項8に記載の細菌。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の細菌を培地に培養し、該培養液中に蓄積したL−ヒスチジンを回収することとを含む、L−ヒスチジンの製造法。
- 前記細菌は、ヒスチジン生合成遺伝子の発現が増強された、請求項10に記載の方法。
- トランスアルドラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科のL−ヒスチジン生産菌であって、同トランスアルドラーゼは、配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、配列番号2のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有し、かつトランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質からなる群から選ばれる細菌。
- 前記相同性が90%以上である請求項12に記載の細菌。
- トランスアルドラーゼ活性が増強するように改変された腸内細菌科のL−ヒスチジン生産菌であって、同トランスアルドラーゼは、
(a)配列番号1のヌクレオチド1〜954のヌクレオチド配列を含むDNA、及び
(b)配列番号1のヌクレオチド1〜954のヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA、からなる群から選ばれるヌクレオチド配列によってコードされる細菌。 - ヒスチジン生合成遺伝子の発現が増強された、請求項12〜14のいずれか一項に記載の細菌。
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