JPWO2004032966A1 - 細胞増殖抑制剤 - Google Patents

Abstract

アミノ酸トランスポーターＡＴＢ０，＋の阻害剤の一つと考えられるＩ，−２−フェニルグリシンを被検物質として、ヒト大腸癌株および乳癌株に対しての細胞増殖試験を行い、濃度依存的な細胞増殖抑制効果を見出した。このことはＡＴＢ０，＋の活性を阻害することにより、細胞増殖を抑制しうることを示すものである。癌細胞などの増殖抑制剤の開発において、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ０，＋の活性の抑制は重要な指標となると考えられる。

Description

本発明は、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０．＋阻害物質を有効成分とする細胞増殖抑制剤に関する。

哺乳動物は、生体外から栄養源を取り込む必要性があり、細胞には多くの輸送タンパク質が存在することが知られている。アミノ酸の輸送を行っているのはアミノ酸トランスポーター（アミノ酸輸送タンパク質）であり、現在までに多数のアミノ酸トランスポーターが見出されている（非特許文献１参照）。
アミノ酸トランスポーターは天然アミノ酸だけでなく、Ｌ−α−メチルドーパ、ＮＯＳ阻害剤などの薬剤の輸送にも関与していることが報告されている（非特許文献２及び３参照）。
ＡＴＢ^０，＋は、小腸、肺および乳腺に発現するアミノ酸輸送体である。機能的には、ＡＴＢ^０，＋は、Ｎａ^＋およびＣｌ⁻駆動型中性および塩基性アミノ酸輸送システムである。これは、腸管におけるアミノ酸の吸収において重要な役割を果たしている（非特許文献１参照）。ヒトＡＴＢ^０，＋のクローニングが最近報告されている（非特許文献４参照）。現時点で、ＡＴＢ^０，＋の輸送機能は、基質としてのアミノ酸についてのみ研究されている。その輸送機能は非常に集積力が強く、Ｎａ^＋およびＣｌ⁻の膜内外濃度勾配ならびに、膜電位差によりエネルギー供給されている。ＡＴＢ^０，＋は、アミノ酸（例えば、グリシンおよびプロリン）、神経伝達物質（例えば、モノアミンおよびＧＡＢＡ）、ならびに浸透圧調節物質（ｏｓｍｏｌｙｔｅ）（例えば、タウリンおよびベタイン）のような様々な化合物に対するＮａ^＋およびＣｌ⁻駆動型輸送体の遺伝子ファミリーに属する。構造的に、ＡＴＢ^０，＋は、ＧＡＢＡ輸送体およびベタイン輸送体に非常に密に関連している。
ＡＴＢ^０，＋は、アミノ酸６４２個からなる１２回膜貫通型タンパクである（非特許文献４）。また、ヒト−マウス間でのアミノ酸レベルでの相同性は８８％であり、ＴＭ３−４の細胞外領域における相同性は７７％である。ＡＴＢ^０，＋の生理機能は、中性および塩基性アミノ酸（非特許文献４および５参照）や、Ｄ−アミノ酸（非特許文献６）、カルニチン（非特許文献７）等を２分子のナトリウムイオンおよび１分子の塩素イオンとの共輸送により細胞内に運搬し、消化管における栄養物質の効率的な吸収や、細胞内への物質の効率的な取り込みに関与していると考えられている。
また、抗原のＡＴＢ^０，＋の遺伝子およびタンパク質に関しては、ＰＣＴ出願（特許文献１）が存在し該出願ではＡＴＢ^０，＋はグリシントランスポーターとして記載されている。
ヒトにおいてＡＴＢ^０，＋は以下の臓器で発現している。Ｍａｓｔｅｒ ｂｌｏｔ（ｍＲＮＡ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；肺、気管、唾液腺（高）、乳腺、胃、下垂体（低）、大腸、子宮、精巣、前立腺（更に低い）（非特許文献４）。
また、マウスにおいてＡＴＢ^０，＋は以下の臓器で発現している。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ；大腸（高）、肺（低）（非特許文献５および８参照）。免疫染色；大腸（非特許文献６参照）、肺、気管（全て管腔側）（Ｍａｇｅｒ，ｉｎ ＰｈａｒｍａＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ２００１，Ｉｎｔｅｒｌａｋｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにて発表）。
しかしながら、ＡＴＢ^０，＋の癌細胞増殖への関与は不明であり、ＡＴＢ^０，＋の機能を阻害することにより癌細胞の増殖に影響を与えるか否かの議論は行われていなかった。
〔特許文献１〕国際公開第２０００／１４２２１号パンフレット
〔非特許文献１〕Ｇａｎａｐａｔｈｙ，Ｖ．ら著，Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｅｄ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｋ．Ｅ．ａｎｄ Ｄｏｎｏｗｉｔｚ，Ｍ．，２００１年，Ｖｏｌ．５０，ｐ．３７９−４１２
〔非特許文献２〕Ｏｓｉｅｃｋａら著，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９８７年，Ｖｏｌ．２４２，ｐ．４４３−４４９
〔非特許文献３〕Ｈａｔａｎａｋａら著，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９９年，Ｖｏｌ．１６，ｐ．１７７０−１７７４
〔非特許文献４〕Ｓｌｏａｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｍａｇｅｒ，Ｓ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９年，Ｖｏｌ．２７４，ｐ．２３７４０−２３７４５
〔非特許文献５〕Ｈａｔａｎａｋａら著，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００１年，Ｖｏｌ．１０７，ｐ．１０３５−１０４３
〔非特許文献６〕Ｈａｔａｎａｋａら著，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００２年，Ｖｏｌ．２９１，ｐ．２９１−２９５
〔非特許文献７〕Ｎａｋａｎｉｓｈｉら著，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００１年，Ｖｏｌ．５３２（２），ｐ．２９７−３０４
〔非特許文献８〕Ｕｇａｗａら著，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００１年，Ｖｏｌ．２８１，Ｇ３６５−Ｇ３７０

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質を有効成分とする細胞増殖抑制剤、特に大腸癌などの癌細胞増殖抑制剤を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。Ｌ−２−フェニルグリシン（ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）は、強いＡＴＢ^０，＋活性を示すイヌ小腸刷子縁膜で、類似のＬ−アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）およびＬ−ファニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）に比べ強いアフィニティーを示すことから、ＡＴＢ^０，＋に特異性の強い競合的阻害剤であると考えられる（Ｈａｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．）。本発明者らは、ＡＴＢ^０，＋の阻害剤の一つと考えられるＬ−２−フェニルグリシンを被検物質として、ヒト大腸癌株ＳＷ６０、ＨＴ−２９および乳癌株ＭＣＦ−７に対しての細胞増殖試験を行った。その結果、ＳＷ６０においてはＬ−２−フェニルグリシンによる細胞増殖抑制が認められなかった。一方、ＨＴ−２９及びＭＣＦ−７においてはＬ−２−フェニルグリシン濃度依存的な細胞増殖抑制が認められた。ＲＴ−ＰＣＲの結果から、ＭＣＦ−７およびＨＴ−２９ではＡＴＢ^０，＋の発現が高く、ＳＷ６０においてはＡＴＢ^０，＋は検出限界以下であった。以上より、Ｌ−２−フェニルグリシンによる細胞増殖抑制は、非特異的細胞毒性ではなくＡＴＢ^０，＋の機能阻害によることが示唆された。
上記の如く本発明者らは、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋の活性を阻害することにより、細胞増殖を抑制することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。本発明者らによって見出された知見により、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋を標的として、細胞増殖抑制剤を開発することが可能となった。即ち、本発明者らによって見出された知見は、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋の活性を阻害することにより、細胞増殖を抑制しうることを示すものである。癌細胞などの増殖抑制剤の開発において、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋の活性の抑制は重要な指標となるものと考えられる。本発明の細胞増殖抑制剤は、癌（例えば、大腸癌、乳癌等）の増殖の抑制に利用されることが大いに期待される。
本発明は、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質を有効成分とする細胞増殖抑制剤に関し、より具体的には、
〔１〕 アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質を有効成分とする細胞増殖抑制剤、
〔２〕 アミノ酸トランスポーターがＮａ^＋およびＣｌ⁻駆動型アミノ酸トランスポーターである、〔１〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔３〕 アミノ酸トランスポーターがＡＴＢ^０，＋である、〔１〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔４〕 アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質が、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に結合することによりアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋の輸送機能を阻害する物質である、〔１〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔５〕 アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質が、Ｌ−アミノ酸、ＮＯＳ阻害剤、フェニルグリシン誘導体、カルチニン、Ｄ−アミノ酸、もしくはアミノ酸を基礎とするプロドラッグからなる群、あるいは、これらの誘導体化合物群より選択される、〔１〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔６〕 アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質がアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に結合する抗体である、〔１〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔７〕 アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に結合する抗体が、細胞傷害活性を有する抗体である、〔６〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔８〕 細胞傷害活性が抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）である、〔７〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔９〕 補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）を有する抗体である、〔７〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔１０〕 アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質がアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋の発現を抑制する物質である、〔１〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔１１〕 癌細胞の増殖を抑制する、〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤、
〔１２〕 癌細胞が大腸癌細胞、膵臓癌細胞または乳癌細胞である、〔１１〕に記載の細胞増殖抑制剤、
を提供するものである。
本発明は、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質を有効成分とする細胞増殖抑制剤を提供する。本発明の細胞増殖抑制剤の標的となるアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋は、Ｎａ^＋およびＣｌ⁻駆動型アミノ酸トランスポーターであり、中性または塩基性アミノ酸（Ｓｌｏａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，ｐ２３７４０−２３７４５，１９９９，Ｈａｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０７，ｐ１０３５−１０４３，２００１）や、Ｄ−アミノ酸（Ｈａｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２９１，ｐ２９１−２９５，２００２）、カルニチン（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３２，２，ｐ２９７−３０４，２００１）等を２分子のナトリウムイオンおよび１分子の塩素イオンとの共輸送により細胞内に運搬し、消化管における栄養物質の効率的な吸収や、細胞内への物質の効率的な取り込みに関与しているものと考えられている。
アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋タンパク質のアミノ酸配列および該タンパク質をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．１５１９７８）の塩基配列は既に公知である。
本発明のアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質は、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋を介した輸送を阻害し、細胞の増殖を抑制するもの、あるいはアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に結合し、細胞傷害活性により細胞の増殖を抑制するものであれば、特に限定されない。アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋を介した輸送を阻害する物質としては、例えば、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に結合してアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋の輸送機能を阻害する物質、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋の発現を抑制する物質などが挙げられるが、好ましいのはアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に結合してアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋の輸送機能を阻害する物質である。
本発明におけるアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質としては、例えば、合成低分子化合物、抗体、タンパク質、ペプチド、天然化合物等が挙げられるが、具体的には、ＮＯＳ阻害剤、フェニルグリシン、カルニチン（Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ）、Ｄ−アミノ酸、もしくはアミノ酸を基礎とするプロドラッグ（Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｒｕｇｓ）、あるいは、これらの誘導体等を例示することができる。
本発明におけるＮＯＳ阻害剤としては、好ましくは中性または塩基性Ｌ−α−アミノ酸構造を基本構造とするＮＯＳ阻害剤であり、より好ましくはＬ−アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）、Ｌ−リジン（ｌｙｓｉｎ）、Ｌ−シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）、またはＬ−オルニシン（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）を基本構造とするＮＯＳ阻害剤であり、さらに好ましくはアルギニン、リジン、シトルリン、オルニシン、Ｌ−ＮＮＡ（Ｎ^Ｇ−ｎｉｔｒｏ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ）、Ｌ−ＮＡＭＥ（Ｎ^Ｇ−ｎｉｔｒｏ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、Ｌ−ＮＭＭＨＡ（Ｎ^Ｇ−ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｈｏｍｏａｒｇｉｎｉｎｅ）、Ｌ−ＮＤＭＡ（Ｎ^Ｇ，Ｎ^Ｇ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ）、Ｌ−ＮＭＥＡ（Ｎ^Ｇ−ｍｏｎｏｅｔｈｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ）、Ｌ−ＮＭＭＡ（Ｎ^Ｇ−ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ）、Ｌ−ＮＡＢＥ（Ｎ^Ｇ−Ｌ−ｎｉｔｒｏ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒ）、Ｌ−ＮＩＬ（Ｌ−Ｎ^６−（１−ｉｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｌｙｓｉｎｅ）、Ｌ−ＴＣ（Ｌ−ｔｈｉｏｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）、Ｌ−ＭＴＣ（Ｓ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｔｈｉｏｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）、Ｌ−ＮＩＯ（Ｌ−Ｎ^５−（１−ｉｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、ＧＧＡ（α−ｇｕａｎｉｄｉｎｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ）、またはカナバニン（ｃａｎａｖａｎｉｎｅ）である。
また、本発明のフェニルグリシンもしくはその誘導体としては、通常、フェニルグリシン構造を有するドラッグもしくはプロドラッグであり、好ましくはフリーのαアミノ酸およびαカルボキシル基を有するフェニルグリシン誘導体（生理的なｐＨにおいて酸性化合物ではない）、もしくは３−または４−カルボキシフェニルグリシンを含む３−または４−カルボキシルエステルプロドラッグであり、さらに好ましくはＬ−２−フェニルグリシンである。
また、本発明のカルニチンもしくはその誘導体としては、好ましくはカルニチンもしくはそのアシルエステルであり、より好ましくは、カルニチン、アセチルカルニチン、プロピオニルカルニチンである。
また、本発明におけるＤ−アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）としては、好ましくはＤ−アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、Ｄ−セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、Ｄ−メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、Ｄ−ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、Ｄ−トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、Ｄ−スレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、Ｄ−ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、Ｄ−フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、Ｄ−グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、またはこれらの誘導体であり、より好ましくはＤ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、またはこれらの誘導体であり、さらに好ましくはＤ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファンである。
また、本発明におけるアミノ酸を基礎とするプロドラッグとしては、好ましくはアミノ酸官能基（Ｄ−またはＬ−アミノ酸を含む）を有するプロドラッグであり、より好ましくはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸を有するβ−カルボキシルエステルプロドラッグもしくはγ−カルボキシルエステルプロドラッグ、または、中性もしくは塩基性アミノ酸を有するα−カルボキシルエステルプロドラッグである。
本発明において、上記化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
また本発明の好ましい態様におけるアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質としては、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋タンパク質に対する抗体である。該抗体は、通常、ＡＴＢ^０，＋タンパク質を認識して結合する。
本発明の細胞増殖抑制剤に含有される抗体はアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋と結合する限り特に制限はない。好ましくはアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋と特異的に結合する抗体であり、さらに好ましくは細胞傷害活性を有する抗体である。
本発明における細胞傷害活性とは、例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）活性などを挙げることができる。本発明において、ＣＤＣ活性とは補体系による細胞傷害活性を意味し、ＡＤＣＣ活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。
抗アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋抗体がＡＤＣＣ活性を有するか否か、又はＣＤＣ活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ７．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９３）等）。
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製を行う。
（１）エフェクター細胞の調製
ＣＢＡ／Ｎマウスなどから脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で脾臓細胞を分離する。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を５×１０^６／ｍｌに調製し、エフェクター細胞を調製する。
（２）補体溶液の調製
Ｂａｂｙ Ｒａｂｂｉｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製）を１０％ＦＢＳ含有培地（ＧＩＢＣＯ社製）にて１０倍希釈し、補体溶液を調製する。
（３）標的細胞の調製
膵臓癌細胞株（ＡｓＰＣ−１、Ｃａｐａｎ−２等）を０．２ｍＣｉの^５１Ｃｒ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｒｏｍａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とともに、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて１時間培養することにより放射性標識する。放射性標識後、細胞を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて３回洗浄し、細胞濃度を２×１０^５／ｍｌに調製して、標的細胞を調製する。
次いで、ＡＤＣＣ活性、又はＣＤＣ活性の測定を行う。ＡＤＣＣ活性の測定の場合は、９６ウェルＵ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、抗アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、エフェクター細胞１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または１０μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンター（ＣＯＢＲＡＩＩＡＵＴＯ−ＧＭＭＡ、ＭＯＤＥＬ Ｄ５００５、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）で放射活性を測定する。細胞傷害活性（％）は（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００により求めることができる。Ａは各試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは１％ＮＰ−４０（半井社製）を加えた試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｃは標的細胞のみを含む試料の放射活性（ｃｐｍ）を示す。
一方、ＣＤＣ活性の測定の場合は、９６ウェル平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、抗アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、補体溶液１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または３μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はＡＤＣＣ活性の測定と同様にして求めることができる。
本発明の細胞増殖抑制剤の有効成分として使用される抗体は、抗原（アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋タンパク質またはその部分ペプチド）と結合する限り特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。
抗原の調製は公知の方法、例えばバキュロウイルスを用いた方法（ＷＯ９８／４６７７７など）等に準じて行うことができる。
ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／１２２２７，ＷＯ ９２／０３９１８，ＷＯ ９４／０２６０２，ＷＯ ９４／２５５８５，ＷＯ ９６／３４０９６，ＷＯ ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ ９２／０１０４７，ＷＯ ９２／２０７９１，ＷＯ ９３／０６２１３，ＷＯ ９３／１１２３６，ＷＯ ９３／１９１７２，ＷＯ ９５／０１４３８，ＷＯ ９５／１５３８８を参考にすることができる。
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ，ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ，（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
また、本発明の抗体は、抗体変異体であってもよい。本発明において、抗体変異体とは、１またそれ以上のアミノ酸残基が改変された、抗体のアミノ酸配列バリアントを指す。どのように改変されたアミノ酸バリアントであれ、元となった抗体と同じ結合特異性を有すれば、本発明における「抗体変異体」に含まれる。このような変異体は、抗体の重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性または類似性を有するアミノ酸配列と１００％よりも少ない配列相同性、または類似性を有する。
また、本発明の上記抗体はアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋タンパク質と結合し、該タンパク質の機能を阻害するかぎり、抗体の断片またはその修飾物であってもよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、またはＨ鎖もしくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、これらＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、またはＨ鎖もしくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、をコードする遺伝子を発現ベクターに導入後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６，Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９，Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えば１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
さらに、本発明で使用される抗体は二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体はアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋を認識し、他方の抗原結合部位が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質を認識してもよい。この場合、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋を発現している細胞に直接細胞傷害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に傷害を与え、腫瘍細胞の増殖を抑制することが可能である。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
特定の分子が本発明のアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に結合するか否かは、当業者においては公知の方法により測定することができる。公知の方法としては、例えば、免疫沈降法、ウエストウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、蛍光免疫法、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法、などが挙げられる。
このようなアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋への結合活性を指標に、本発明の細胞増殖抑制剤の候補化合物をスクリーニングすることが可能である。具体的には、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に被検試料を接触させ、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋と被検試料との結合を検出し、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に結合する化合物を選択すればよい。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製もしくは粗精製タンパク質（抗体を含む）、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。アミノ酸トランスポーターは、例えば、精製したタンパク質として、担体に結合させた形態として、他のタンパク質との融合タンパク質として、細胞膜上に発現させた形態として、膜画分として被検試料に接触させることができる。このようにして得られたアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に結合する化合物から、本発明の細胞増殖抑制剤の有力な候補を選択するために、これら化合物がアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋の輸送機能を阻害するか否かを検出することが有用である。特定の分子がアミノ酸トランスポーターの輸送機能を阻害しているか否かは、公知の方法、例えば、放射性物質（^１４Ｃなど）、蛍光物質などでアミノ酸などの基質を標識し、該基質がアミノ酸トランスポーター発現細胞に取り込まれた量を測定すること等により判断することができる。
本発明の細胞増殖抑制剤の有効成分としては、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^{０， ＋}の発現を抑制する物質を使用することもできる。このような物質としては、例えば、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはアミノ酸トランスポーターのＤＮＡまたはｍＲＮＡ中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができ、例えば、メチルホスホネート型やエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体またはホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
本発明の細胞増殖抑制剤の標的となる細胞としては特に制限はないが、好ましくは大腸癌、乳癌、膵臓癌等の癌細胞であり、特に好ましくは大腸癌細胞または乳癌細胞である。
本発明の細胞増殖抑制剤は、細胞増殖に起因する疾患、特に大腸癌あるいは乳癌等の癌の治療、予防を目的として使用される。
アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋は上述のように、血管側の細胞膜では発現していないことから、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質（例えば、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に結合する抗体）は、正常組織のアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋機能を阻害することなく、例えば、大腸癌等の癌細胞に対して、特異的に作用するものと考えられる。また、大腸癌等の癌細胞におけるアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋の異常は、生理的機能から推察すると、癌細胞増殖に伴うタンパク質合成に必要なアミノ酸の取り込み亢進に関与しているものと考えられる。従って、本発明の細胞増殖抑制剤は、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質による栄養遮断を薬効とする新規抗癌剤となるものと考えられる。また、本発明の好ましい態様における、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に結合する抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤は、該抗体がＡＴＢ^０，＋に特異的に結合し腫瘍細胞に対して傷害性を持つ細胞を活性化させる作用（抗体依存性細胞傷害活性；ＡＤＣＣ活性）、あるいは補体タンパク質による細胞破壊作用（補体依存性細胞傷害活性；ＣＤＣ活性）による殺作用を薬効とする新規抗癌剤となるものと期待される。
本発明の薬剤の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
上記薬剤の剤型の種類としては、例えば経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。
本発明の細胞増殖抑制剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の治療薬はこれらの投与量に制限されるものではない。また、発明の治療薬は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ）、医薬的に許容される担体や添加物を供に含むものであってもよい。

図１は、各種癌細胞株におけるアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋の発現状態を示す写真である。写真左は、Ｄ１プライマーとＤ２プライマーの組み合わせでＰＣＲを行った場合、写真右は、Ｄ５プライマーとＤ６プライマーの組みあわせでＰＣＲを行った場合の写真である。ウェル番号と細胞株の対応は以下のようになっている（表１）。

尚、ＴＣＰ１はウェル１に、ＴＣＰ２はウェル２にそれぞれ対応する。Ｎは鋳型ＤＮＡを加えなかった場合、Ｇはヒト染色体ＤＮＡを加えた場合をそれぞれ表わす。
図２は、Ｌ−２−フェニルグリシンの各種癌細胞株に対する細胞増殖抑制効果を示す図である。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕 ヒトＡＴＢ^０，＋ ＲＴ−ＰＣＲ解析
（１−１）全ＲＮＡの調製
次のヒト癌細胞株より、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）、あるいはＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、それぞれのメーカー推奨の標準的な方法に従いｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。
・肺癌細胞株：Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ５２２
・大腸癌：ＨＴ−２９、ＬＳ １７４Ｔ、ＣＯＬＯ ２０５、ＬｏＶｏ、ＳＷ６２０
・乳癌細胞株：ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＺＲ−７５−１、ＢＴ−４７４
・前立腺癌細胞株：ＤＵ−１４５、ＰＣ−３、ＬＮＣａｐ．ＦＧＣ、２２Ｒｖ１
・白血病細胞株：ＢＡＬＬ−１、Ｐ３９／ＴＳＵ、ＫＵ８１２、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＪＯＫ−１
・リンフォーマ細胞株：Ｄａｕｄｉ、ＥＢ−３、Ｒａｍｏｓ、Ｐ３ＨＲ−１
・膵臓癌細胞株：ＢｘＰＣ−３、Ｃａｐａｎ−１、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ−１、ＡｓＰＣ−１
（１−２）ＲＴ−ＰＣＲ解析
上記の全ＲＮＡより、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰ^ＴＭＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、メーカー推奨の標準的な方法に従い、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。逆転写反応のプライマーとしてはオリゴｄＴ（１２〜１８ｍｅｒ）を用いた。このｃＤＮＡの一部を鋳型とし、ヒトＡＴＢ^０，＋遺伝子に特異的なプライマーを用いて、以下の条件によりＰＣＲ解析を行った。
＜反応液組成＞
・ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ社） ０．３μＬ
・ＴａｑＳｔａｒｔ^ＴＭＡｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社） ０．３μＬ
・１０ｘ ＥｘＴａｑバッファー（ＴａＫａＲａ社） ３μＬ
・２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ＴａＫａＲａ社） ２．４μＬ
・２０μＭプライマー 各０．６μＬ
・鋳型ｃＤＮＡ ３μＬ
／全量 ３０μＬ
＜反応条件＞
・９４℃、２分→（９４℃、３０秒→６８℃、２分）ｘ３５サイクル→７２℃、５分
＜プライマー＞

ＰＣＲの結果を図１に示した。大腸癌細胞５株（レーン５−９）のうち、２株（ＨＴ−２９、ＬＳ１７４Ｔ）で強い発現が認められた。また、Ｌｏｖｏ細胞でも中程度の発現が認められた。乳癌細胞４株（レーン１０−１３）では、全ての細胞でＡＴＢ^０，＋の発現が認められ、そのうちＭＣＦ７とＢＴ−４７４で強い発現が認められた。膵臓癌細胞５株（レーン２７−３１）のうち、２株（ＢｘＰＣ−３、Ｃａｐａｎ−１）で強い発現が認められた。癌はｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓであるにもかかわらず、図１のように大腸癌、乳癌、膵臓癌では４０％以上の細胞株にＡＴＢ^０，＋が高発現しており、臨床でも同様に４０％以上の大腸癌、乳癌、膵臓癌患者の腫瘍部位にＡＴＢ^０，＋が高発現している可能性が示唆された。
〔実施例２〕 Ｌ−２−Ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅのヒト大腸癌株ＳＷ６０、ＨＴ２９および乳癌株ＭＣＦ−７に対する細胞増殖抑制作用
Ｌ−２−フェニルグリシン（ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）は強いＡＴＢ^０，＋活性を示すイヌ小腸刷子縁膜で類似のＬ−アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）およびＬ−フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）に比べ強いアフィニティーを示すことから、ＡＴＢ^０，＋に特異性の強い競合的阻害剤であると考えられる（Ｈａｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）。Ｌ−２−フェニルグリシンを０％ＦＢＳを含む培地で溶解し、２０ｍＭ Ｌ−２−フェニルグリシン溶液を調製した。培地としてはＳＷ６０、ＨＴ２９にはＩＭＤＭを、ＭＣＦ−７にはＲＰＭＩを用いた。また、この溶液を培地で希釈して２、０．２、０．０２ならびに０．００２ｍＭ Ｌ−２−フェニルグリシン溶液を調製した。
ヒト大腸癌株ＳＷ６０、ＨＴ２９および乳癌株ＭＣＦ−７を培地でそれぞれ４×１０^６、１．６×１０^６、１．６×１０^６細胞／ｍＬに調製した。この懸濁液２５μＬ／ｗｅｌｌ（それぞれ１×１０^５、４×１０^４、４×１０^４細胞）にあらかじめ１２％ＦＢＳを含む培地２５μＬ／ｗｅｌｌを添加しておいた９６ｗｅｌｌプレートに蒔き、５０μＬのＬ−２−Ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ溶液を添加した。５％ＣＯ_２インキュベーターで培養し、培養４日目に生細胞数をＭＴＳ ａｓｓａｙで定量化した。
図２に細胞増殖試験結果を示した。ＳＷ６０においてはＬ−２−Ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅによる細胞増殖抑制が認められなかった。一方、ＨＴ２９およびＭＣＦ−７においては濃度依存的な細胞増殖抑制が認められた。ＨＴ２９における細胞増殖抑制は１０μＭ Ｌ−２−Ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ存在下で約１０％を示し、平衡に達した。ＭＣＦ−７における細胞増殖抑制は１ｍＭ Ｌ−２−Ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ存在下で約１０％であった。
ＲＴ−ＰＣＲの結果から、ＭＣＦ−７およびＨＴ２９ではＡＴＢ^０，＋の発現が高く、ＳＷ６０においてはＡＴＢ^０，＋は検出限界以下であった（図１）。以上より、Ｌ−２−ファニルグリシンによる細胞増殖抑制は、非特異的細胞毒性ではなくＡＴＢ^０，＋の機能阻害によると考えられた。

産業上の利用の可能性

本発明により、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋の活性を阻害する物質は細胞増殖を抑制する効果があることが見出された。これによりアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋を標的として、細胞増殖抑制剤を開発することが可能となった。このような細胞増殖抑制剤は、癌（例えば、大腸癌等）の増殖の抑制に利用されることが大いに期待される。

【配列表】

Claims (12)

1. アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質を有効成分とする細胞増殖抑制剤。
2. アミノ酸トランスポーターがＮａ^＋およびＣｌ⁻駆動型アミノ酸トランスポーターである、請求項１に記載の細胞増殖抑制剤。
3. アミノ酸トランスポーターがＡＴＢ^０，＋である、請求項１に記載の細胞増殖抑制剤。
4. アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質が、アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に結合することによりアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋の輸送機能を阻害する物質である、請求項１に記載の細胞増殖抑制剤。
5. アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質が、Ｌ−アミノ酸、ＮＯＳ阻害剤、フェニルグリシン誘導体、カルチニン、Ｄ−アミノ酸、もしくはアミノ酸を基礎とするプロドラッグからなる群、あるいは、これらの誘導体化合物群より選択される、請求項１に記載の細胞増殖抑制剤。
6. アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質がアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に結合する抗体である、請求項１に記載の細胞増殖抑制剤。
7. アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋に結合する抗体が、細胞傷害活性を有する抗体である、請求項６に記載の細胞増殖抑制剤。
8. 細胞傷害活性が抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）である、請求項７に記載の細胞増殖抑制剤。
9. 補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）を有する抗体である、請求項７に記載の細胞増殖抑制剤。
10. アミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋阻害物質がアミノ酸トランスポーターＡＴＢ^０，＋の発現を抑制する物質である、請求項１に記載の細胞増殖抑制剤。
11. 癌細胞の増殖を抑制する、請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
12. 癌細胞が大腸癌細胞、膵臓癌細胞または乳癌細胞である、請求項１１に記載の細胞増殖抑制剤。

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