JPWO2003084998A1 - Megsin neutralizing monoclonal antibody - Google Patents

Abstract

メグシンの活性を中和するモノクローナル抗体が提供された。このモノクローナル抗体は、たとえば、メグシンの反応性ループ領域に結合し、メグシンのプロテアーゼ阻害作用を中和する。更に本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその可変領域を有効成分とする、メサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療および／または予防のための組成物を提供する。Monoclonal antibodies that neutralize the activity of megsin were provided. This monoclonal antibody, for example, binds to the reactive loop region of megsin and neutralizes the protease inhibitory action of megsin. Furthermore, the present invention provides a composition for treating and / or preventing mesangial proliferative glomerulonephritis comprising the monoclonal antibody of the present invention or a variable region thereof as an active ingredient.

Description

技術分野
本発明は、特定のセルピン（セリンプロテアーゼインヒビター）、すなわちメグシン（Ｍｅｇｓｉｎ）の反応性ループ領域に対して選択的に結合するモノクローナル抗体とその製造法、および該モノクローナル抗体を用いるメサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療、および／または予防のための組成物の治療、および／または予防のための組成物に関する。
背景技術
腎不全は、腎疾患患者が最終的に至る病態である。その原因や経歴は一様ではなく、薬物中毒、感染症、悪性腫瘍、糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの本来腎臓以外の病変により、腎障害が発症し、腎不全に至る場合も数多くみられる。
腎臓の血液濾過作用や解毒作用が全く機能しない末期腎不全においては、腎移植が唯一の治療手段であるが、我が国においては、移植腎の供給体制が十分に整備されているとは言い難い。また、移植療法自体に対する社会的認知も進んでいない。我が国の腎移植例は、年間７００余症例に過ぎず、この数値はここ数年増加していない。ゆえに腎代用療法としては透析療法が唯一の治療法であるのが現状である。
現在、我が国の末期腎不全透析患者は推定約２１万人を数え、人口あたりの患者数では世界第一位である。一人当たりの平均的な治療費は年間約６００万円を必要とし、医療保険制度を圧迫する大きな原因のひとつとされている。また、毎週２〜３日、１日４〜６時間を透析治療のために拘束されることから、患者本人の社会復帰も難しい。
さらに、近年の人口の高齢化に伴い透析患者年齢も上昇しつつある。このため、腎疾患を早期に治療し、腎不全への進展を防ぐ薬剤の必要性が認識されている。しかし、腎疾患領域は、創薬のための標的分子などの情報研究基盤に乏しく、有効な医薬品が誕生しないのが現状である。
メサンギウム細胞は腎臓以外では見られない臓器特異的な細胞で、腎糸球体の構造や機能保持に重要な役割を担っていることはよく知られている。また糸球体障害時にはメサンギウム細胞自身の増殖やメサンギサム細胞から分泌される細胞外マトリックスの増加などが認められることから、疾患の発症および進展にも深く関与する細胞であると推測されている。これらのことから糸球体障害の分子メカニズムを解明するには、まずメサンギウム細胞の生物学的特性を解明することが不可欠と考えられる。しかし、メサンギウム細胞に関する遺伝子レベルの特異性は明らかにされていなかった。
ヒトの生体内には約６０兆個もの細胞が存在し、これらは同一のゲノムＤＮＡを有しているが、個々の細胞、ひいては臓器が異なった生物学的性質を有するのは各細胞や臓器に特異的に発現する遺伝子によるものと考えられている。本発明者らは、メサンギウム細胞に発現する遺伝子群のプロファイルを明らかにすれば、メサンギウム細胞に特異的な高発現遺伝子群を検出することが可能であると考えた。そして、その中から糸球体腎炎の状態に関与する遺伝子群を決定することもでき、糸球体障害の分子メカニズムを解明する糸口も見つかり、それに基づいた新しい糸球体腎炎の治療法の開発も可能になると考えた。
そこで、本発明者らは、メサンギウム細胞の遺伝子発現パターンを明らかにし、その細胞特性を遺伝子レベルで解析することを試みた。
まず本発明者らは、メサンギウム細胞に発現する遺伝子を定量的に解析することを目的として、培養ヒトメサンギウム細胞からｍＲＮＡを抽出して、３’−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃＤＮＡライブラリーを作製した。そして、クローンに挿入された遺伝子断片の大規模ＤＮＡ配列決定およびデータベース解析を施行した［Ｙａｓｕｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，５３：１５４−１５８，１９９８］。
その結果、メサンギウム細胞で特に強く発現する遺伝子として、メグシンと命名した全長２，２４９ｂｐからなる遺伝子を単離した。そして、メグシンの全長ｃＤＮＡクローンがコードする３８０個のアミノ酸からなる新規タンパク質であるメグシンタンパク質を単離、取得することに成功した。更に、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアミノ酸配列データベースを用いてＦＡＳＴＡプログラムによるアミノ酸ホモロジー検索を行った。そして、メグシンタンパク質のアミノ酸配列中にセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン：ＳＥＲＰＩＮ）スーパーファミリー［Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．：Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１０：２０，１９８５；Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５２：５２７，１９８７；Ｋｒｕｉｔｈｏｆ，Ｅ．Ｋ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ，８６，４００７，１９９５；Ｐｏｔｅｍｐａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１５９５７，１９９４；Ｒｅｍｏｌｄ−Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｅ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３１５：１０５，１９９３］の生理活性中心部位として重要な反応性ループ領域（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｌｏｏｐ ｓｉｔｅ）内のコンセンサス配列（ＥＥＧＴＥＡＡＡＡＴ／配列番号：２）に類似の配列（ＥＥＧＴＥＡＴＡＡＴ／配列番号：３）が存在していることを見出した。すなわち、メグシンは、セルピンの構造的特徴を有し、他のセルピンと同様に活性部位である反応性ループ領域（Ｐ１７−Ｐ５’：ＥＥＧＴＥＡＴＡＡＴＧＳＮＩＶＥＫＱＬＰＱＳ／配列番号：１）が存在する［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２：８２８−８３６，１９９８］。
これらのことより、ヒトメグシンタンパク質が、セルピンに属するタンパク質であることを明らかにした［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２０：８２８−８３６，１９９８］。そしてこれらの知見を特許出願した（ＷＯ ９９／１５６５２）。
セルピンには、アンチトロンビンやプラスミノーゲン活性化因子阻害物質（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＰＡＩ）、オボアルブミン等が知られている。これらのセルピン分子は互いに高い相同性を有し、三次元構造も極めてよく似ている。セルピンは、それぞれ対象とするセリンプロテアーゼと複合体を形成し、酵素活性を阻害することが知られている。プロテアーゼの活性部位に結合するのは、セルピンの柔軟な反応性ループ領域（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｌｏｏｐ ｓｉｔｅ）である。
複合体からセルピンが解離する際に、そのポリペプチド鎖がプロテアーゼによりループの中央で切断され、やがて分子が分解される。セルピンには活性状態と切断された状態の他に、ポリペプチド鎖は完全だが機能的には不活性で、プロテアーゼに結合しないという伏在的な状態がある。現在では、セルピンのこれら３種類の状態すべてについて、Ｘ線結晶解析により構造が決定されている［Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８：８９５１，１９８９；Ｂａｕｍａｎｎ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１８：５９５，１９９１；Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１：７５６０，１９９２；Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．，９：２２５，１９９１；Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３５５：２７０，１９９２；Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２９：２４９，１９９３］。
セルピン型折りたたみは、部分的にαヘリックスで覆われた３つの逆平行βシートＡ、Ｂ、Ｃが作る密な構造からなる。切断されていないオボアルブミンの構造はセルピンの基準形であると考えられ、シートＡが５本のストランドを含む。柔軟なループは、βシートＡのストランド５の端から始まり、続いてαヘリックスが分子の外側にあり、さらにβシートＣの端にあるストランド（β１６）が続き、βシートに含まれるストランド（β１７）の開始点に達する。ループ中央のαヘリックス領域にセルピンが分断される部位があり、ここは分子の外側にハンドルのように突き出ている。
活性型アンチトロンビンの柔軟なループ領域は、オボアルブミンと同じく一般的な位置にあるが、ループの始まりに近いいくつかの残基が、βシートＡのβ５とβ１５の間に６番目の短いβストランドを形成している。そのうえ、分子の主要部分から出ているループにはαヘリックスがなく、そのままトロンビンの活性部位に挿入できる。
すなわち、活性状態のセルピンでは、セリンプロテアーゼの活性部位と結合できるように、ループ領域は、セルピン分子の主要部分から突き出した形となっている（図１（ａ））。
α１アンチトリプシンの切断型では、ループ領域の始まりから切断部位までの半分は完全なβストランドを形成し、それがβシートＡのストランドβ５とβ１５の間に差し込まれている。
つまり、プロテアーゼ阻害の結果、セルピン分子は、活性部位であるループ領域の突出部で切断される。切断状態のセルピンでは、ループ領域のＮ末端部がβストランド５と１５の間に入り込み、βシートの中央で長いβストランドを形成している（図１（ｂ））。
ループ領域の後半部は活性型アンチトロンビンの場合とほぼ同じ位置を占めている。分断によって生じた２つの新しい末端（活性型ではつながっていた）はそれぞれ分子の両端にあって、約７０Å離れている。
最後に、ＰＡＩの伏在状態では、α１アンチトリプシンの切断型と同じくβシートＡにβストランドが加わっているが、柔軟なループ領域の残り部分は分子の外部でループを構成してβシートＢのβストランドにつながっており、βシートＣの端のストランドはない。
この最も安定で活性を持たない伏在状態では、切断された状態と同じくループ領域のＮ末端部分がβシート中に差し込まれたβストランドの形をとる。残りの残基は、βシートの反対側の端でループを形成する（図１（ｃ））［Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２：２５７−２７０，１９９４］。
すなわち、セルピンの活性部位であるループ領域は、「活性型」、「切断された状態」、および「伏在状態」の３種類の形態をとり得る。
活性型から伏在型への転換が起こると、ループは長いβストランドに変わりβシートの中央に挿入される。既に構成されている安定なβシートにβストランドを挿入するような大きな構造変化を起こすには、βシート中の隣り合ったストランドがまず離れなければならない。このことは、密な構造をとるために分子内部につくられた多数の疎水的な接触を組み換えるだけでなく、多数の水素結合が切れることを意味している。新たに形成される水素結合や充填のための接触は、余分なβストランドが挿入されてからつくり直さなければならない。β構造に起こるこのような大きな変化は、セルピンの構造決定以前にはまったく予想もされなかったし、これ以外の系ではまだ観察されていない［Ｂｒａｎｄｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９９］。
発明の開示
本発明の目的は、メサンギウム細胞に関連する疾病の治療等に有効なメグシン中和抗体を提供することである。また、本発明は、メグシンの反応性ループ領域に対して選択的に結合するモノクローナル抗体とその製造法、および該モノクローナル抗体を用いるメサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療、および／または予防のための組成物の提供を課題とする。
メグシンは、セリンプロテアーゼインヒビター（ＳＥＲＰＩＮ）の構造的特徴を有し、他のセルピンと同様に活性部位である反応性ループ領域（Ｐ１７−Ｐ５’：ＥＥＧＴＥＡＴＡＡＴＧＳＮＩＶＥＫＱＬＰＱＳ／配列番号：１）が存在する［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２：８２８，１９９８］。
一方、メグシンのトランスジェニックマウスが進行性のメサンギウム基質の拡大、メサンギウム細胞の増殖、および免疫複合体沈着物の増加を示すことから、そのセルピン活性により腎炎が惹起されている可能性が強く示唆される［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０９，５８５，２００２］。
メグシンがセルピンスーパーファミリーに属する糸球体高発現遺伝子であることから、この遺伝子が糸球体における機能遺伝子で、糸球体腎炎の発症／進展に関連性を有すると考えられる。そしてメグシンタンパク質がセルピンスーパーファミリーに特有のｒｅａｃｔｉｖｅ ｌｏｏｐ ｓｉｔｅを有することから、ある種のセリンプロテアーゼに対する抑制因子として働くことが考えられる。
プロテアーゼ活性はプロテアーゼとそれに対する抑制因子間の活性のバランスによって一定に保たれており、その変動は組織／細胞の機能や病態に著しく影響を及ぼすことが知られている。事実、糸球体硬化時には、細胞外マトリックス蛋白のプロテアーゼによる分解能低下がみられる。また別の例として、セルピンの一種であるＰＡＩ−１（メグシンタンパク質とのアミノ酸相同性は２７．７％）の高発現マウスでは野生マウスに比し、ブレオマイシン反応性線維症が高率に誘発されるが、逆にＰＡＩ−１欠損マウスでは線維症が起こりにくいという研究結果も報告されている［Ｅｉｔｓｍａｎ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：２３２，１９９６］。
さらに近年、セルピンはセリンプロテアーゼ活性を抑制するのみならず、血液凝固、線維素溶解、炎症反応、細胞分化／増殖、アポトーシスにも関与し、その生理機構や病態生理学的意義が多岐にわたることが報告されている［Ｋｒｕｉｔｈｏｆ，Ｅ．Ｋ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ，８６，Ｉ：４００７，１９９５；Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｆ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，７４：１７２，１９９５；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１５３７３，１９９７；Ｂｉｒｄ，Ｐ．Ｉ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒ．，２４：６３，１９９８；Ｐｏｔｅｍｐａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１５９５７，１９９４］。
更に、様々な組織および細胞をノーザンブロットおよび逆転写ポリメラーゼ連鎖反応で分析したところ、メグシンは、ヒト繊維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、ケラチノサイトでは発現が弱く、メサンギウム細胞で特に強く発現していることが判った。即ち、メグシン遺伝子の発現はメサンギウム細胞に特異性を有する。これらの知見はさらにｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２：８２８，１９９８；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１０：２６０６，１９９９］およびメグシン抗体を用いた免疫組織化学法［Ｉｎａｇｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８６：１０９８，２００１］により確認された。
また、ＩｇＡ腎症患者や糖尿病性腎症患者と健常人とで腎臓組織中のメグシンの発現量を比較すると、ＩｇＡ腎症患者や糖尿病性腎症患者においてメグシンの発現量が有意に多い［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２：８２８，１９９８；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１０：２６０６，１９９９］。また、ラットを用いた実験的メサンギウム増殖性糸球体腎炎モデル（Ｔｈｙ−１腎炎モデル）において、同様なメグシン発現量の上昇が認められた［Ｎａｎｇａｋｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，６０：６４１，２００１］。このことからメグシンの発現がメサンギウム細胞の機能異常に伴い変化し、疾患の発症／進展に深く関与していることが明らかになった。
メサンギウムの機能におけるメグシンの役割をさらに理解するために、我々はマウスゲノムでヒトメグシンのｃＤＮＡを過剰発現させた。２系統のメグシントランスジェニックマウスが得られ、それらは、進行性のメサンギウム基質の拡大、メサンギウム細胞の増殖、および免疫複合体沈着物の増加を示した［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０９，５８５，２００２、ＷＯ ０１／２４６２８］。これらの知見は、メグシンが、メサンギウムの機能に生物学的に重要な影響を及ぼすことを示している。興味深いことに、メグシンの単一遺伝子操作は、実験的およびヒト糸球体腎炎に存在する初期的なメサンギウム病変を発生させることができる。このように、動物個体においても、メグシンはメサンギウム増殖性糸球体腎炎の発症に関与することが報告されている。
従って、メグシンに対し、その作用を中和し得る活性を有する物質、とりわけ特異性に優れた中和抗体（モノクローナル抗体）を見出し、特定することは、メサンギウム細胞の生物学的性質の解明、メサンギウム細胞に関連する疾患の原因の究明、ひいては、メサンギウム細胞に関連する疾病の治療、診断等に有効である。
本発明者らは、組換えメグシンを用いて、メグシンに対し中和活性を有する抗体を精査した結果、特定の領域を認識するモノクローナル抗体が、メグシンの活性を中和しうることを見出し、本発明を完成した。メグシンに対するモノクローナル抗体は知られていたが（ＷＯ ００／５７１８９）、メグシンの反応性ループ領域（Ｐ１７−Ｐ５’：ＥＥＧＴＥＡＴＡＡＴＧＳＮＩＶＥＫＱＬＰＱＳ／配列番号：１）内のエピトープと特異的に結合する抗体についての知見は確認されていなかった。また、メグシンの作用を中和する抗体も知られていなかった。本発明によるモノクローナル抗体は、メグシンとメグシンに対するリガンドの一つであるプラスミンとの反応を中和することができる。すなわち、本発明は以下のモノクローナル抗体、ならびにその用途に関する。
〔１〕メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体。
〔２〕配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体。
〔３〕請求項１または請求項２に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
〔４〕ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４９として寄託されたハイブリドーマＭＳ１８ａ。
〔５〕ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４９として寄託されたハイブリドーマＭＳ１８ａが産生するモノクローナル抗体。
〔６〕ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４９として寄託されたハイブリドーマＭＳ１８ａを培養し、培養物に含まれるイムノグロブリンを回収する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
〔７〕次の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分の有効量を含有するメサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療、および／または予防のための組成物。
（ａ）メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｂ）配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｃ）ハイブリドーマＭＳ１８ａ株により産生されるモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｄ）（ａ）−（ｃ）のいずれかに記載の可変領域を構成する相補性決定領域を含む抗体またはその可変領域
〔８〕次の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分をメグシンに接触させる工程を含む、メグシンの活性中和方法。
（ａ）メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｂ）配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｃ）ハイブリドーマＭＳ１８ａ株により産生されるモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｄ）（ａ）−（ｃ）のいずれかに記載の可変領域を構成する相補性決定領域を含む抗体またはその可変領域
〔９〕次の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分を有効成分として含有する、メグメグシンの活性中和剤。
（ａ）メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｂ）配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｃ）ハイブリドーマＭＳ１８ａ株により産生されるモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｄ）（ａ）−（ｃ）のいずれかに記載の可変領域を構成する相補性決定領域を含む抗体またはその可変領域
あるいは本発明は、上記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分の有効量を投与する工程を含む、メサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療、および／または予防のための方法に関する。更に本発明は、上記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分の、メサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療、および／または予防のための組成物の製造における使用に関する。
本発明は、メグシンの作用を中和するモノクローナル抗体を提供する。本発明において、メグシンの作用の中和とは、メグシンのセルピン活性の中和作用を意味する。またセルピン活性とは、セリンプロテアーゼのプロテアーゼ活性に対する阻害作用である。本発明において、中和とは、セルピン活性の完全な抑制のみならず、部分的な抑制を含む。
モノクローナル抗体がメグシンの作用を中和することは、たとえば実施例２に記載の方法によって確認することができる。すなわち、セリンプロテアーゼとしてプラスミンを用い、そのプロテアーゼ活性のメグシンによる阻害における、モノクローナル抗体の抑制効果を指標として、その中和活性を確認することができる。プロテアーゼ活性は、たとえば蛍光基質の消化を観察することにより測定することができる。
本発明者らは、メグシンの反応性ループ領域を認識するモノクローナル抗体が、メグシンの中和作用を有することを見出した。すなわち本発明は、メグシンの反応性ループ領域を認識するモノクローナル抗体に関する。メグシンの反応性ループ領域とは、メグシンのアミノ酸配列中、特に配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる領域を言う。したがって本発明のモノクローナル抗体は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体である。中でもアミノ酸配列ＮＩＶＥＫＱ（配列番号：４）を認識するモノクローナル抗体は、メグシンのセルピン活性を効果的に抑制することができる望ましいモノクローナル抗体である。
モノクローナル抗体が、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドによって構成されるエピトープを認識することは、エピトープマッピングによって確認することができる。たとえば実施例３においては、様々なアミノ酸配列からなるペプチドを用いて、モノクローナル抗体が認識するエピトープを特定している。
メグシンに対するモノクローナル抗体は、ヒトのメグシンまたはそのドメインペプチドを免疫原として、公知の方法によって得ることができる。モノクローナル抗体の取得方法は、後に具体的に述べる。得られたモノクローナル抗体を、上記のような評価方法に基づいて選択することによって、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、たとえばハイブリドーマＭｓ１８ａ細胞を示すことができる。ハイブリドーマＭｓ１８ａは、メグシンの反応性ループを構成するアミノ酸配列中、ＮＩＶＥＫＱ（配列番号：４）を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。ハイブリドーマＭｓ１８ａが産生するモノクローナル抗体Ｍｓ１８ａは、メグシンの中和活性を有する。
ハイブリドーマＭｓ１８ａは、２００２年４月１日付け（原奇託日）で日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所内特許生物寄託センターに対して、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４９として寄託されている。
このハイブリドーマＭｓ１８ａ細胞株が産生するモノクローナル抗体のアイソタイプは、Ｈ鎖はＩｇＧ１、Ｌ鎖はκであった。本発明はまた、上記抗体のクラススイッチ変異体、例えば、アイソタイプＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａおよびその他の免疫グロブリンサブクラスに属する変異体等を包合し、その様な変異体は、Ｍａｒｔｉｎらの方法により作成することができる（Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，１４５：１１１８，１９９１）。
メグシンに対するモノクローナル抗体の作製には、免疫原性抗原として使用できるメグシンが必要である。抗原としてのメグシンは、培養細胞、例えばメグシン産生細胞を用いて得ることができる。メグシン産生細胞としては、例えばヒト腎由来細胞等が挙げられる。このメグシン産生細胞は、当該分野で知られた、あるいはそれらと実質的に同様な培地や培養方法を用いて培養し、培養上清中に産生されるメグシンを例えばイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはポリクローナル抗体を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、組換えメグシンも用いることができる。具体的には、メグシンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片を含む組換えベクターにより宿主細胞を形質転換した後、この形質転換宿主を培養して、メグシンのアミノ酸配列を含むポリペプチドを製造し、該ポリペプチドを免疫原として使用するものである。メグシンのｃＤＮＡを含む組換えベクターは、通常の遺伝子組換え手法により、例えばプラスミドベクターに挿入することによって作製される。ベクターとしては、プラスミドやファージの他に、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス等のウィルスも使用できる。
宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌、放線菌等の原核生物、ならびに各種細胞、例えば動物細胞、ＣＨＯ細胞等の市販の細胞株ならびに酵母、植物細胞、昆虫細胞等の真核生物を用いることができる。また、原核生物に使用できるプロモーターとしては、例えばトリプトファン合成酵素オペロン、ラクトースオペロン等を用いることができる。真核生物に使用できるプロモーターとしては、例えば、ウィルスプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼに対するプロモーター、解糖系酵素に対するプロモーター等がある。また、マルチクローニングサイト、プロモーター、耐性遺伝子、複製開始点、ターミネーター、リポソーム結合部位等を有する市販のベクターあるいはプラスミドも使用することができる。耐性遺伝子には、テトラサイクリン、アンピシリン、ネオマイシンに対するもの等がある。この様にして調製されたメグシンは、更に免疫原性コンジュゲートとしてもよいが、そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できる。
このように、抗原は、各種原料、例えば培養細胞、培養組織、形質転換細胞等の抗原産生原料から従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法等の塩析、セファデックス等によるゲル濾過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外濾過法、アフィニティークロマトグラフィー法および高速液体クロマトグラフィー法等により精製して得ることができる。
さらに、メグシンは、それを断片化したもの、あるいはクローニングされ、配列決定されたｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選び、ポリペプチドをデザインして化学合成し、得られたポリペプチド断片であってもよく、その断片を適当な縮合剤を介して種々の担体蛋白質類と結合させてハプテン−蛋白質の免疫コンジュゲートとし、これを用いて特定の配列のみを認識できるモノクローナル抗体をデザインすることもできる。デザインされるポリペプチドには予めシステイン残基等を付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易にできるようにすることができる。
本発明ではメグシンに特異的に結合する少なくとも１種のモノクローナル抗体を提供する。本発明にかかるモノクローナル抗体は、組換えメグシンを免疫原として動物を免役した後、ミエローマ細胞と抗体産生細胞との細胞融合、ハイブリドーマの選択およびモノクローン化、モノクローナル抗体の製造、必要に応じて腹水化といった工程で作製できる。
動物の免疫は、例えば次のように行う。公知の方法［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２０：８２８，１９９８］に従って精製したヒトメグシンタンパク質をラット、マウスなどの哺乳類動物に免疫する。哺乳類動物は細胞融合する際の相手の永久増殖性細胞と同系統の動物を用いるのが好ましい。動物の週令は、例えばマウスでは８〜１０週令が好適である。性は雌雄何れでも構わない。
免疫動物として、イムノグロブリン遺伝子をヒトの遺伝子に組み換えたトランスジェニック動物を用いることにより、ヒトのイムノグロブリンを産生させることもできる。イムノグロブリン遺伝子をヒトの遺伝子に組み換えたトランスジェニック動物を用いて、目的とする反応性を有する抗体を得る方法は公知である。このようにして得ることができるイムノグロブリンは、動物から得られたものながら、完全にヒトのイムノグロブリン分子である。
免疫の方法は、精製したヒトメグシンタンパク質を適当なアジュバント（例えばフロイント完全アジュバントまたは水酸化アルミニウムゲル−百日咳菌ワクチンなど）と混合しエマルジョンとした後、動物の皮下、腹腔内、静脈内などに投与する。以後、この免疫操作を１〜２週間間隔で２〜５回行う。最終免疫は、０．５〜２μｇのヒトメグシンタンパク質を動物の腹腔内に投与することにより行う。
このようにして免疫した動物の体液からは、ポリクローナル抗体が得られる。各免疫操作後３〜７日後に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を測定し、抗体価が充分上昇したとき、抗体または抗体産生細胞を採取する。メグシンに対する抗体価は、ＥＬＩＳＡ等の手法によって測定することができる。抗体価を測定するためのＥＬＩＳＡは、メグシンをコートしたプレートに血清を加え、更に免疫動物のＩｇＧに対する標識抗体を加えることにより実施することができる。
抗原と共に用いられるアジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビアジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカゲル等が挙げられる。免疫は、例えばＢａｌｂ／ｃマウス、ＦＩマウス等のマウスをはじめとする動物を使用することができる。
上記のようにヒトメグシンタンパク質で免疫した動物から抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞は、脾臓、リンパ節、末梢血などから得ることができるが、特に脾臓が好ましい。例えば、最終免疫の３〜４日後に脾臓を無菌的に摘出し、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地（日水製薬製）中で細断し、ピンセットで解し、１，２００ｒｐｍ×５分間の条件で遠心分離させた後、上清を除き、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理して赤血球を除去し、さらにＭＥＭ培地で３回洗浄して細胞融合用脾臓細胞を得る。
細胞融合前には、まず使用される腫瘍細胞株の調製をしておく必要がある。細胞融合前に使用される腫瘍細胞株は、たとえば免疫グロブリンを産生しない細胞株から選択することができる。融合される相手方の永久増殖性細胞には、永久増殖性を有する任意の細胞を用いることができるが、一般的には骨髄腫細胞（ミエローマ）が用いられる。永久増殖性細胞は抗体産生細胞と同種の動物由来のものを用いるのが望ましい。
例えばマウスの場合、８−アザグアニン耐性マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）由来骨腫瘍細胞株として次のような細胞株が知られている。
Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１：１，１９７８］
Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１，１９７６］
ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９，１９７８］
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３：１５４８，１９７９］
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５］
これらの永久増殖性細胞株は、８−アザグアニン培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０^−５Ｍ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）およびウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＣＬＳ製）（１０％）を加えた正常培地に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍＬ）を加えた培地）で継代培養し、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０^７個以上の細胞数を確保する。
抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は例えば次のように行う。上記で得られた抗体産生細胞および永久増殖性細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数が５〜１０：１の比になるように混合する。１，２００ｒｐｍ×５分間遠心分離した後、上清を除き、沈殿した細胞群をよく解した後、攪拌しながら３７℃に保ちつつ、細胞融合剤としてポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）１〜４ｇ、ＭＥＭ培地１〜４ｍＬおよび細胞融合促進剤としてジメチルスルホキシド０．５〜１．０ｍＬの混液０．１〜１．０ｍＬ／１０^８個細胞を加えて細胞融合を起こさせる。
その後、１０分毎にＭＥＭ培地３ｍＬを数回添加し、ＭＥＭ培地を全量が５０ｍＬになるように加えて希釈し、細胞融合を停止させる。次に、遠心分離（１，５００ｒｐｍ×５分間）して上清を除去し、緩やかに細胞を解した後、正常培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地、１０％ＦＣＳ）１００ｍＬを加え、メスピペットによるピペッティングで緩やかに細胞を懸濁する。
この懸濁液を９６ウエルの培養用プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で３〜５日間培養する。培養プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌのＨＡＴ培地（正常培地にヒポキサンチン（１０^−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０^−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０^−７Ｍ）を添加した培地）を加え、さらに３日間培養する。以後３日間毎に培養上清の半容量を除去し、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で約２週間培養する。
融合細胞がコロニー状に生育しているのが認められるウエルについて、上清の半容量を除去し、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）を同量加え、４日間培養する。培養上清の一部を採取し、前述のＥＬＩＳＡによりメグシンタンパク質に対する抗体価を測定する。
より具体的には、例えばメグシンタンパク質抗原を直接又は担体と共に吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体を加え、標識を測定することによって抗体価を測定することができる。固相には、マイクロプレート等が用いられる。また抗免疫グロブリン抗体としては、細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる。
その他、標識抗体に代えて、プロテインＡを加え、固相に結合した抗メグシンタンパク質モノクローナル抗体を検出することもできる。更に、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したメグシンタンパク質を加えることによって、抗体価を測定することもできる。
メグシンタンパク質に反応する抗体の産生が観察されたウエルにつき、限界希釈法によりクローニングを４回繰り返し、安定したメグシンタンパク質の抗体価を示すものを抗メグシンタンパク質モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
上記のようにして得られたハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで培養することによりモノクローナル抗体を産生させる。所望のモノクローナル抗体を、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の適当な培地中で培養し、その培養上清から得ることができる。ハイブリドーマのｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養は、好ましくは無血清培地中で行われ、至適量の抗体をその上清に与える。
ｉｎ ｖｉｖｏで培養する場合、任意の動物にハイブリドーマを移植する。移植のための宿主動物は、細胞融合に用いた脾臓細胞を採取した動物と同種の動物を使用するのが好ましい。例えば、プリスタン処理をした８〜１０週令のＢａｌｂ／ｃ雌マウスに上記で得られた抗メグシンタンパク質モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞の２〜４×１０^６個／匹腹腔内投与する。プリスタン処理は、たとえば２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン−プリスタン−０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育することにより行われる。
２〜３週間でマウスの腹腔内にモノクローナル抗体を高濃度に含んだ腹水が貯留し腹部が肥大してくる。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ×５分間）して固形分を除去し、ＩｇＧを精製する。
腹水や培養上清を５０％硫酸アンモニウムを用いて塩析し、ＰＢＳで１〜２週間透析する。この透析画分をプロテインＡセファロースカラムに通し、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得る。このモノクローナル抗体は、メグシンとメグシンに対するリガンドの一つであるプラスミンとの反応を中和することができる
抗体のアイソタイプは、市販のキット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ製、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ等）を用いるか、またはオクタロニィ（二重免疫拡散）法（免疫学実験入門，生物化学実験法１５，学会出版センター刊，７４頁，１９８１年）により決定した。タンパク質量は、フォーリン法および２８０ｎｍにおける吸光度（１．４（ＯＤ_２８０）イムノグロブリン１ｍｇ／ｍＬ）により算出する。
大量のモノクローナル抗体を得るにはハイブリドーマの腹水化を利用することができる。この場合、ミエローマ細胞由来の動物と同系の組織適合性のある動物の腹腔内に各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、あるいはヌードマウスなどに各ハイブリドーマを移植し、腹水中に産生されたモノクローナル抗体を得ることができる。
動物は、ハイブリドーマを移植する前にプリスタンなどの鉱物油を腹腔内に投与しておくことができる。腹水液はそのままあるいは常法により精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックス等によるゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、透析、限外濾過法、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー法等により精製することができる。
上記のようにして得られたモノクローナル抗体の特性は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）等により明らかにすることができる。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトメグシンの反応性ループ領域と特異的に結合し、メグシンとメグシンに対するリガンドの一つであるプラスミンとの反応を中和することができる。したがって本発明のモノクローナル抗体は、メグシンの活性中和方法、あるいは活性中和剤として有用である。すなわち本発明は、次の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分をメグシンに接触させる工程を含む、メグシンの活性中和方法を提供する。あるいは本発明は次の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分を有効成分として含有するメグシンの活性中和剤に関する。
（ａ）メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｂ）配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｃ）ハイブリドーマＭＳ１８ａ株により産生されるモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｄ）（ａ）−（ｃ）のいずれかに記載の可変領域を構成する相補性決定領域を含む抗体またはその可変領域
メグシンがメサンギムウム細胞の増殖を誘導する作用を有することは既に述べたとおりである。本発明のモノクローナル抗体はメグシンの活性を中和することから、メグシンによってもたらされている病態を改善する作用が期待できる。このため、本発明のモノクローナル抗体をヒト化した抗体は、メサンギウム細胞が増殖する疾患において、その治療に有効であると考えられる。このようなヒト化抗体は、通常、薬理学的に許容される１種あるいはそれ以上の担体と混合し、公知の製剤学的手法により製造された医薬組成物として提供するのが好ましい。
本発明のモノクローナル抗体をメグシンに関連する疾患の治療目的でヒトに投与する場合、ヒトに対する抗原性を最小限にする方法を採ることもできる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体を公知の方法でキメラ抗体もしくはヒト化抗体とすることにより実施でき、本発明のモノクローナル抗体には、これらのヒトに対する抗原性を少なくした抗体も含まれる。
１９７５年にＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎが細胞融合とクローニング技術によるモノクローナル抗体の産生法（ハイブリドーマ法）を報告して以来、ハイブリドーマ細胞を培養することによって標的に対する高い特異性と親和性を持つ均一な抗体（モノクローナル抗体）が大量に得られるようになった［Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５］。１９８０年にはマウスモノクローナル抗体を用いたリンパ腫の治療が報告された［Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４０：３１４７−３１５４，１９８０］。
しかしながら、このような抗体はマウス由来の異種血清であったため、ヒト体内では異物として認識され、体内においてマウス由来のモノクローナル抗体に対する抗体（ヒト抗マウス抗体：Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＨＡＭＡ）が産生される。その結果、マウス抗体のエフェクター機能（補体依存性の細胞障害活性：ＣＤＣ、抗体依存性の細胞障害活性：ＡＤＣＣ）がヒト体内では減弱し、有効濃度の維持が困難となるという問題点があった。
また、抗体投与を繰り返すとアナフィラキシーなどのショック症状を呈する危険性があり、反復投与が困難であるという問題点も知られている［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２：８８１，１９８４；Ｂｌｏｏｄ，６５：１３４９，１９８５；Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８０：９３２，１９８８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１２４２，１９８５；Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２６：１０１１，１９８５；Ｂｌｏｏｄ，６５：１３４９，１９８５；Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８０：９３７，１９８８；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：１５３０，１９８５；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６：６４８９，１９８６］。
しかし、近年の遺伝子組換え技術の目覚ましい進歩に伴い、これらの問題は解決されつつある。まず、抗体の免疫原性を改良するため、マウス抗体のＦｃ部分を含むＨ鎖、Ｌ鎖の定常領域をヒト抗体と置換したヒト型キメラ抗体が創製された。キメラ抗体とはマウス抗体とヒト抗体のキメラ分子をいう。
ヒト型キメラ抗体は、抗体可変領域（Ｖ領域）がヒト以外の動物抗体由来で抗体定常領域（Ｃ領域）がヒト抗体由来である抗体である［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１，１９８４］。ヒト抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変領域（Ｖ領域）を切り出し、ヒト由来の抗体定常領域（Ｃ領域）遺伝子と結合してキメラ遺伝子を作製する。
このキメラ遺伝子を宿主細胞で発現させれば、ヒト・マウス・モノクローナル抗体が産生できる。キメラ抗体はヒトに対する抗原性が少ないため、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体に対する抗体はほとんど惹起されず、血中半減期が６倍延長することが報告されている［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：４２２０，１９８９］。
キメラ抗体よりもさらに免疫原性を低下させるため、可変領域中の抗原結合領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ、相補性決定領域）の遺伝子配列のみをヒト抗体のＣＤＲ部位に移植（ＣＤＲグラフティング）し、抗体分子のＣＤＲを除いた全分子をヒト化したヒト化抗体が作製された［Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２，１９８６］。ヒト化抗体はヒト・マウス・キメラ抗体よりマウスの抗体部分が少ないため、抗原性は一層少なく安全性が高い。サルを用いた実験では、マウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が４〜５倍伸びることが報告されている［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：１３５２，１９９１］。
上記に示した方法等を用いることにより、本発明の抗体をヒト化することができ、ヒトに投与する場合には非常に有用である。
また本発明において、抗体の可変領域とは、抗体の抗原との結合に必要な領域と定義される。したがって、酵素的な消化によって得ることができるＦａｂなどの抗体断片のみならず、抗原結合領域をコードするＤＮＡを単離し、適当な宿主ベクター系で発現させることによって得ることができる抗体断片も可変領域に含まれる。更に本発明の抗体可変領域は、重鎖と軽鎖の抗原結合領域を１本のペプチド鎖に連結させたｓｃＦｖを含む。
本発明の医薬組成物の投与方法として、経口投与、静脈内投与以外に、経粘膜投与、経皮投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸内投与等が適宜選択でき、その投与方法に応じて、種々の製剤として用いることができる。以下に、各製剤について記載するが、本発明において用いられる剤型はこれらに限定されるものではなく、医薬製剤分野において通常用いられる各種製剤として用いることができる。
＜全身投与製剤＞
メサンギウム増殖性糸球体腎炎に対する治療および／または予防のために用いる場合には、ヒト化抗体の経口投与量は、０．１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇの範囲が好ましく、より好ましくは、１μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇである。
経口投与を行う場合の剤型として、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤等があり、適宜選択することができる。また、それら製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。また、口腔内局所投与を行う場合の剤型として、咀嚼剤、舌下剤、バッカル剤、トローチ剤、軟膏剤、貼布剤、液剤等があり、適宜選択することができる。また、それら製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。
上記の各剤型について、公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の技術を採用することができる。本明細書に言うＤＤＳ製剤とは、徐放化製剤、局所適用製剤（トローチ、バッカル錠、舌下錠等）、薬物放出制御製剤、腸溶性製剤および胃溶性製剤等、投与経路、バイオアベイラビリティー、副作用等を勘案した上で、最適の製剤形態にした製剤を言う。
ＤＤＳの構成要素には基本的に薬物、薬物放出モジュール、被包体および治療プログラムから成り、各々の構成要素について、特に放出を停止させた時に速やかに血中濃度が低下する半減期の短い薬物が好ましく、投与部位の生体組織と反応しない被包体が好ましく、さらに、設定された期間において最良の薬物濃度を維持する治療プログラムを有するのが好ましい。薬物放出モジュールは基本的に薬物貯蔵庫、放出制御部、エネルギー源および放出孔または放出表面を有している。これら基本的構成要素は全て揃っている必要はなく、適宜追加あるいは削除等を行い、最良の形態を選択することができる。
ＤＤＳに使用できる材料としては、高分子、シクロデキストリン誘導体、レシチン等がある。高分子には不溶性高分子（シリコン、エチレン・酢酸ビニル共重合体、エチレン・ビニルアルコール共重合体、エチルセルロース、セルロースアセテート等）、水溶性高分子およびヒドロキシルゲル形成高分子（ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート架橋体、ポリアクリル架橋体、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、水溶性セルロース誘導体、架橋ポロキサマー、キチン、キトサン等）、徐溶解性高分子（エチルセルロース、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体の部分エステル等）、胃溶性高分子（ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースナトリウム、マクロゴール、ポリビニルピロリドン、メタアクリル酸ジメチルアミノエチル・メタアクリル酸メチルコポリマー等）、腸溶性高分子（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、酢酸フタルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、アクリル酸系ポリマー等）、生分解性高分子（熱凝固または架橋アルブミン、架橋ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ポリシアノアクリレート、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリβヒドロキシ酢酸、ポリカプロラクトン等）があり、剤型によって適宜選択することができる。
特に、シリコン、エチレン・酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体の部分エステルは薬物の放出制御に使用でき、セルロースアセテートは浸透圧ポンプの材料として使用でき、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースは徐放性製剤の膜素材として使用でき、ポリアクリル架橋体は口腔粘膜あるいは眼粘膜付着剤として使用できる。
また、製剤中にはその剤形（経口投与剤、注射剤、座剤等の公知の剤形）に応じて、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤等の添加剤を加えて製造することができる。
これら各添加剤について、それぞれ具体例を挙げて例示するが、これらに特に限定されるものではない。溶剤としては、精製水、注射用水、生理食塩液、ラッカセイ油、エタノール、グリセリン等を挙げることができる。賦形剤としては、デンプン類、乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、タルク、酸化チタン、トレハロース、キシリトール等を挙げることができる。
コーティング剤としては、白糖、ゼラチン、酢酸フタル酸セルロースおよび上記記載した高分子等を挙げることができる。基剤としては、ワセリン、植物油、マクロゴール、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性基剤等を挙げることができる。
結合剤としては、デンプンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴム等の天然高分子化合物、ポリビニルピロリドン等の合成高分子化合物、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチ等を挙げることができる。
滑沢剤としては、ステアリン酸およびその塩類、タルク、ワックス類、小麦デンプン、マクロゴール、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。崩壊剤としては、デンプンおよびその誘導体、寒天、ゼラチン末、炭酸水素ナトリウム、セルロースおよびその誘導体、カルメロースカルシウム、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースおよびその塩類ならびにその架橋体、低置換型ヒドロキシプロピルセルロース等を挙げることができる。
溶解補助剤としては、シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。懸濁化剤としては、アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、モノステアリン酸アルミニウム、クエン酸、各種界面活性剤等を挙げることができる。粘稠剤としては、カルメロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。
乳化剤としては、アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、各種界面活性剤、レシチン等を挙げることができる。安定剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸、トコフェロール、キレート剤、不活性ガス、還元性物質等を挙げることができる。
緩衝剤としては、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、ホウ酸等を挙げることができる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等を挙げることができる。無痛化剤としては、塩酸プロカイン、リドカイン、ベンジルアルコール等を挙げることができる。
保存剤としては、安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、逆性石けん、ベンジルアルコール、フェノール、チロメサール等を挙げることができる。矯味剤としては、白糖、サッカリン、カンゾウエキス、ソルビトール、キシリトール、グリセリン等を挙げることができる。芳香剤としては、トウヒチンキ、ローズ油等を挙げることができる。着色剤としては、水溶性食用色素、レーキ色素等を挙げることができる。
上記したように、医薬品を徐放化製剤、腸溶性製剤または薬物放出制御製剤等のＤＤＳ製剤化することにより、薬物の有効血中濃度の持続化、バイオアベイラビリティーの向上等の効果が期待できる。しかし、ヒト化抗体は生体内で失活化または分解され、その結果、所望の効果が低下または消失する可能性がある。従って、ＤＤＳを失活化または分解する物質を阻害する物質をメサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療および／または予防のための医薬組成物と併用することにより、成分の効果をさらに持続化させ得る。これらは製剤中に配合してもよく、または別々に投与してもよい。当業者は適切に、ＤＤＳを失活化または分解する物質を同定し、これを阻害する物質を選択し、配合あるいは併用することができる。
製剤中には、上記以外の添加物として通常の組成物に使用されている成分を用いることができ、これらの成分の添加量は、本発明の効果を妨げない範囲で通常量とすることができる。
その他本発明のモノクローナル抗体は、免疫染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫沈降、イムノブロット、イムノアッセイ、例えば競合型または非競合型イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ラテックス凝集法、蛋白精製、アフィニティーカラム等にも使用することができる。ＥＬＩＳＡ法による場合は好ましくはサンドイッチ型アッセイがよい。なお、イムノアッセイには、免疫組織学的検討、イムノブロット、免疫沈降等の免疫反応を利用した方法全てを含有する。
本発明のモノクローナル抗体は、イムノアッセイに用いるために標識抗体とすることができる。抗体を標識化するものとして、酵素、酵素基質、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、放射性物質等を用いることができる。標識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応等を利用することができる。
本発明のモノクローナル抗体を使用するイムノアッセイは、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液、非流体試料等を検体または試料とすることができる。たとえば生体由来の試料、具体的には、血液、血漿、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、尿、その他体液、細胞培養液、組織培養液、組織ホモジネート、生検試料、細胞、組織、脳組織、脳由来細胞系、神経細胞系、神経由来細胞系、乳腺由来細胞系、乳腺組織、卵巣由来細胞系、卵巣組織、癌細胞系、癌組織等が挙げられる。
従って、本発明は、この様なハイブリドーマ細胞系、イムノアッセイおよび検査キットをも提供する。さらに、本発明はメグシンを特異的に認識するモノクローナル抗体、この抗体を用いることを特徴とするメグシンの検出ならびに定量のためのイムノアッセイ、およびこのイムノアッセイを実施するための検査キットを提供する。
また、本発明により得られたモノクローナル抗体は、メグシンに対する特異性が高く、メグシンの検出ならびに定量において、非常に有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
〔実施例１〕
ａ．免疫原の調製（組換えメグシン）
公知の方法［Ｉｎａｇｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８６：１０９８−１１０６，２００１］に準じ、ヒトのメグシンｃＤＮＡをトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養上清から組換えヒトメグシンを得た。
培養上清２Ｌに１００ｍＬの１Ｍ酢酸ナトリウムを加えてｐＨ４．５に調整した後、５０ｍＭ酢酸ナトリウムを加え、２倍に希釈した。希釈液をイオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ １６／１０ ＳＰ ＸＬ：アマシャム・バイオサイエンス製）に供した（溶出条件：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、ＮａＣｌ ０〜１Ｍリニアグラジエント；溶出容積：２０×カラムベッドボリューム）。溶出液をゲル濾過によりバッファー交換を行い（ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．８））、続いてハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＴ−１：Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に供した（溶出条件：２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．８）、リン酸カリウム２０〜４００ｍＭリニアグラジエント；溶出容積：３０×カラムベッドボリューム）。溶出液を再度ゲル濾過によりバッファー交換を行い（ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＭｏｎｏＳ ＨＲ５／５：アマシャム・バイオサイエンス製）に供した（溶出条件：５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ＮａＣｌ ５０〜１００ｍＭリニアグラジエント；溶出容積：４０×カラムベッドボリューム）。溶出液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ １０（ミリポア製）を用いて遠心濃縮し（３，０００ｇ）、ダルベッコＰＢＳ（−）緩衝液（日水製薬製）にバッファー交換した。遠心濃縮とバッファー交換を３回繰り返し、精製組換えメグシンを得た。クロマトグラフィー装置は、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ｓ（アマシャム・バイオサイエンス製）を用い、操作は全て４℃で行った。
ｂ．免疫処置
８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス３匹に対し、免疫用抗原溶液をフロイント完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製）と１：１で混和しエマルジョン化したものを、メグシンタンパク質が約５０μｇ／匹となるよう皮下注射した。以後、ほぼ２週間毎に、免疫用抗原溶液をフロイント不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製）と１：１で混和しエマルジョン化したものをメグシンタンパク質が約５０μｇ／匹となるよう調製し、２回皮下注射し追加免疫を行った。２回目の追加免疫の３日後に眼底静脈より採血し、血清中の抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。高い抗体価を有していたマウスについて、２回目の追加免疫の２週間後免疫用抗原溶液をフロイント不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製）と１：１で混和しエマルジョン化したものをメグシンタンパク質が約５０μｇ／匹となるよう調製、皮下注射にて追加免疫し、その３日後に免疫したマウスの脾臓細胞を細胞融合に用いた。
ｃ．ＥＬＩＳＡ法（直接固相法）
免疫用抗原と同様の方法で調製したメグシンタンパク質のタンパク質溶液をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに４℃、一夜吸着させた。洗浄液（０．０５％ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬製）を含むＰＢＳ）で３回洗浄後、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエース（雪印乳業製）でブロッキングを行った。その後洗浄し、上記ｂで得られた血清を抗体希釈液（１０倍希釈したブロックエースを含むＰＢＳ）で５０００倍に希釈し、１００μＬ／ウェルずつ加え、室温で２時間反応させた。
プレートを洗浄後、５０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識マウスＩｇＧ抗体（ケミコン製）を１００μＬ／ウェルずつ加え、室温で２時間反応させた。Ｏ−フェニレンジアミン（ナカライテスク製）を基質反応液（０．２μＬ／ｍＬ過酸化水素水（和光純薬製）を含むクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ５．０））に０．４ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、基質溶液を調製した。洗浄液で５回プレートを洗浄し、該基質溶液を１００μＬ／ウェルとなるように加えた。該基質溶液と３０分間反応させた後、１００μＬ／ウェルの２Ｎの硫酸を加え反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
ｄ．細胞融合、ハイブリドーマの作製
上記ＥＬＩＳＡ法の結果によりメグシンタンパク質に対する抗体価の上昇が認められたマウス３匹から最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、常法により脾細胞を調製した。細胞融合時の親株は、事前に２０μｇ／ｍｌの８−アザグアニンを含む培地で選択し、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株であることを確認したＢａｌｂ／ｃマウス由来ミエローマＳＰ２細胞株を用いた。ＳＰ２細胞２×１０^７個と脾細胞１×１０^８個をあわせ、ポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００；Ｍｅｒｃｋ製）を細胞融合促進剤として使用し、常法に従い細胞融合を行った。
融合後の細胞は脾細胞換算で３．０×１０^８個／ｍＬになるようにエスクロン培地（三光純薬製）にヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを加えた培地（ＨＡＴ培地）に懸濁し、９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）に１００μＬ／ウェルずつ分注した。該融合細胞をＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）で３〜５日毎に半量ずつ培地交換を行いながら培養した。ＨＡＴ培地で培養可能なハイブリドーマのみ選択培養した。
ｅ．ハイブリドーマのスクリーニング
コロニー形成の確認されたウェルについて、培養上清中のメグシンタンパク質に対する抗体の有無を確認するために、ｃ．で示したのと同じＥＬＩＳＡ法でスクリーニングを行い、メグシンタンパク質に対して強く反応するコロニーを選択し、クローニングに供した。
ｆ．ハイブリドーマのクローニング
メグシンタンパク質に対して結合する抗体を産生するハイブリドーマについて限界希釈法によるクローニングを３回繰り返し行い、メグシンタンパク質に対して特異的に結合する抗体を産生し、且つ安定した増殖能を有するハイブリドーマＭＳ１８ａ細胞株が得られた。これらの各ハイブリドーマ細胞は、２００２年４月１日付け（原寄託日）で日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号 中央第６に所在の行政独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに対して、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４９（生命研条寄第８３４９号）として寄託された。
ｇ．モノクローナル抗体のタイピング
上記で得られたハイブリドーマＭＳ１８ａ細胞株の培養上清０．５ｍＬを用いてＭｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ製）を用いてアイソタイプを調べた。ハイブリドーマＭＳ１８ａ細胞株が産生するモノクローナル抗体のアイソタイプは、Ｈ鎖はＩｇＧ１、Ｌ鎖はκであった。
ｈ．モノクローナル抗体（ＭＳ１８ａ）の調製と精製
８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスに０．５ｍｌ／匹のプリスタンを腹腔内投与し、その１０日後に上記ｄのクローニングで得られたハイブリドーマＭＳ１８ａ細胞株を１匹あたり約１０^７細胞数／０．５ｍＬ／匹で腹腔内に注入した。１０日後頃からマウスの腹部肥大を認めたため、開腹して腹水を採取した。採取した腹水は、１０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離し、その上清を３７℃、３０分間放置した後、４℃で一晩静置した。１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離後、得られた上清をアフィニティーカラムＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（アマシャム・バイオサイエンス製）を用いてモノクローナル抗体（ＭＳ１８ａ）を精製した。この抗体溶液の２６０、２８０、３２０ｎｍにおける吸光度を測定し、Ｗｅｒｂｕｌｇ−Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ法により抗体濃度を測定した。
ｉ．ウエスタンブロッティング法によるメグシンタンパク質との反応性の確認
免疫用抗原と同様の方法で調製したメグシンタンパク質のタンパク質溶液をＰＢＳで４０ｎｇ／レーンに調整し、等量の２×ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（第一化学製）と混合し、沸騰浴中で５分間加熱したものをサンプル溶液とした。該サンプル溶液をＳＤＳ電気泳動装置（第一化学製）およびトリス−グリシン緩衝液（第一化学社製）を用いて１０−２０％ポリアクリルアミドゲル（第一化学製）で電気泳動した。
一方、泳動中、ブロット用に３ＭＭ濾紙（Ｗｈａｔｔｍａｎ製）を緩衝液Ａ（第一化学製）に２枚、緩衝液Ｂ（第一化学製）に１枚、緩衝液Ｃ（第一化学製）に３枚浸した。またポリビニリデンジフルオライド膜（ＰＶＤＦ膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）をメタノールに浸した後、精製水に浸し水になじませた。タンパク質のＰＶＤＦ膜への転写は、電気泳動後ゲルを装置から取り出し、ブロッター（ファルマシア製）に陽極側から緩衝液Ａに浸した２枚の濾紙、緩衝液Ｂに浸した１枚の濾紙、ＰＶＤＦ膜、ゲル、および緩衝液Ｃに浸した３枚の濾紙を記載の順に置き、８０ｍＶで１．５時間で行った。転写後、ＰＶＤＦ膜をブロックエース（雪印乳業製）で室温で１時間振とうする事でブロッキングした。
その後、該膜をモノクローナル抗体ＭＳ１８ａを抗体希釈液で希釈したものと４℃で一晩反応させた。その後、アルカリフォスファターゼ標識マウスＩｇＧ抗体を加え、室温で１時間反応後、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ溶液で発色させた。結果を図２に示す。
レーン１はメグシンタンパク質のリガンドのひとつであるプラスミン、レーン２はメグシンタンパク質、レーン３はメグシンタンパク質とプラスミン混合物を示す。（ａ）は中和活性を有さないモノクローナル抗体との反応結果、（ｂ）は本発明のモノクローナル抗体ＭＳ１８ａとの反応結果である。
（ａ）のレーン３ではプラスミン−メグシンタンパク質複合体のバンドが確認されるのに対し、モノクローナル抗体ＭＳ１８ａでは認められなかった。このことは、モノクローナル抗体ＭＳ１８ａがメグシンタンパク質単独とは反応するが、メグシンタンパク質とメグシンタンパク質のリガンドのひとつであるプラスミンとの複合体とは反応しないことを示した。
〔実施例２〕メグシンタンパク質のプラスミン酵素活性阻害作用に対する中和活性
メグシンとメグシンリガンドの一つであるプラスミンとの反応に対する中和活性を指標にして、モノクローナル抗体ＭＳ１８ａのメグシンタンパク質のプラスミン酵素活性阻害作用に対する中和活性を検討した。比較のためにメグシンの活性に影響を与えないことが確認されているモノクローナル抗体を用いた。
免疫用抗原と同様の方法で調製したメグシンタンパク質のタンパク質溶液を緩衝液Ｐ（０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８））で０．５ｍｇ／ｍＬに調整し、９６ウェルブラックマイクロプレート（ＮＵＮＣ製）に１μＬ／ウェル加え、実施例１のｈ．で精製したＭＳ１８ａ抗体１ｍｇ／ｍＬを２：１、１：１および１：２（モル比）になるように混和し、ＰＢＳを加え、全量４μＬ／ウェルとした。室温、１時間反応後、ｂｕｆｆｅｒＰで３９μｇ／ｍＬに調製したプラスミン（ＳＩＧＭＡ製）溶液を１μＬ／ウェル加え混和し、さらに、３７℃、３０分間反応させた。基質溶液（０．５２６ｍＭ Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ（ペプチド研究所製）を含むｂｕｆｆｅｒＰ）を９５μＬ／ウェル加え、室温、１時間反応させた後、蛍光強度（Ｅｘ ３８０ｎｍ、Ｅｍ ４６０ｎｍ）を測定した。
なお、プラスミンのみ、プラスミンとメグシン、プラスミンとＭＳ１８ａおよびプラスミンとメグシンとＭＳ１８ａの蛍光強度から基質溶液のみ（ブランク）の蛍光強度を引いたものを、それぞれＦＰ、ＦＰＭｅｇ、ＦＰ１８、およびＦＰＭｅｇ１８とし、下記のようにして中和活性を求めた。図３に示すように、モノクローナル抗体ＭＳ１８ａはメグシンタンパク質のプラスミン酵素活性阻害作用を中和した。
ＩＭｅｇ＝（１−ＦＰＭｅｇ／ＦＰ）×１００
Ｉ１８＝（１−ＦＰＭｅｇ１８／ＦＰ１８）×１００
中和活性（％）＝（１−Ｉ１８／ＩＭｅｇ）×１００
〔実施例３〕ＭＳ１８ａ抗体エピトープマッピング
ａ．ＥＬＩＳＡ法による検討
免疫用抗原と同様の方法で調製したメグシンタンパク質のタンパク質溶液をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに４℃、一夜吸着させた。洗浄液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）で３回洗浄後、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエースでブロッキングを行った。別にメグシンタンパク質の反応性ループ領域（Ｐ１７−Ｐ５’：ＥＥＧＴＥＡＴＡＡＴＧＳＮＩＶＥＫＱＬＰＱＳ／配列番号：１）の切断部位（Ｐ１−Ｐ１’）を中心にして、９〜１７残基のペプチドを常法により合成した（表１）。
これらのペプチド各２００μｇ／ｍＬと上記ｈ．で精製した１μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体ＭＳ１８ａを１：１で混合し室温、３０分反応後、反応液１００μＬ／ウェルずつ加え、室温で、２時間反応させた。プレートを洗浄後、５０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識マウスＩｇＧ抗体（ケミコン製）を１００μＬ／ウェルずつ加え、室温で２時間反応させた。
ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（ＳＩＧＭＡ １０４ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔａｂｌｅｔｓ）を基質反応液（０．５ｍＭ塩化マグネシウムを含む９．６％ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．７））に２ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、基質溶液を調製した。洗浄液で５回プレートを洗浄し、該基質溶液を１００μＬ／ウェルとなるように加えた。該基質溶液と３０分間反応させた後、１００μＬの３ＮのＮａＯＨを加え反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ペプチド無添加およびエピトープに無関係のペプチドを加えたものを対照とした。高い吸光度は、抗体がペプチドと反応していないことを示している。結果を表１に示す。

ｂ．モノクローナル抗体ＭＳ１８ａのメグシン阻害活性による抗体エピトープおよび中和活性の検討
表１で示したペプチドのうち、吸光度に大きな変化が認められたＭ１０７〜Ｍ１１２のペプチドのうち、Ｍ１０７、Ｍ１０８、Ｍ１１１およびＭ１１２をＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに調整し、９６ウエルブラックマイクロプレート（ＮＵＮＣ製）に１．５μＬ／ウエル加え、プロテインＡで精製したモノクローナル抗体ＭＳ１８ａ（１ｍｇ／ｍＬ、１．５μＬ／ウエル）と混和した。室温で１時間反応後、精製メグシンタンパク質のタンパク質溶液をｂｕｆｆｅｒ Ｐで０．５ｍｇ／ｍＬに調整し、１μＬ／ウエル加えて混和した。室温で１時間反応後、ｂｕｆｆｅｒＰで３９μｇ／ｍＬに調製したプラスミン（ＳＩＧＭＡ製）溶液を１μＬ／ウエル加え混和し、さらに３７℃で３０分間反応させた。
基質溶液（０．５２６ｍＭのＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ（ペプチド研究所製）を含むｂｕｆｆｅｒＰ）を９５μＬ／ウエル加えて室温で１時間反応後、蛍光強度（Ｅｘ ３８０ｎｍ、Ｅｍ ４６０ｎｍ）を測定した。なお、プラスミンのみ、プラスミン＋メグシン、プラスミン＋モノクローナル抗体ＭＳ１８ａ、およびプラスミン＋メグシン＋モノクローナル抗体ＭＳ１８ａの蛍光強度から基質溶液のみ（ブランク）の蛍光強度を引いたものを、それぞれＦＰ、ＦＰＭｅｇ、ＦＰ１８、およびＦＰＭｅｇ１８とし、実施例２と同様にして中和活性を求めた（図４）。
表１および図４からＭ１０７およびＭ１１２との反応では中和活性が低下した。これは抗体がメグシンと反応せず、ペプチドと反応したことを示している。Ｍ１０７およびＭ１１２に共通するエピトープはＮＩＶＥＫＱ（配列番号：４）である。そこで、ペプチドＮＩＶＥＫＱ（配列番号：４）についてＭ１０７、Ｍ１０８、Ｍ１１１およびＭ１１２と同様に操作したところ、中和活性は低下した。故に本発明のモノクローナル抗体ＭＳ１８ａが認識するエピトープはＮＩＶＥＫＱ（配列番号：４）であることが判った。
〔実施例４〕モノクローナル抗体ＭＳ１８ａの特異性
本発明のモノクローナル抗体ＭＳ１８ａのメグシンタンパク質に対する特異性を確認するために、セルピンのひとつであるＰＡＩ−１とモノクローナル抗体ＭＳ１８ａの反応性について検討した。
０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で０．２ｍｇ／ｍＬに調整したＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ製）を９６ウェルマイクロプレート（ＮＵＮＣ製）に２μＬ／ウェル加え、０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で５ｍｇ／ｍＬに調整したＰＡＩ−１抗体（Ｂｉｏｐｏｏｌ製）６μＬまたは０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で４ｍｇ／ｍＬに調整したモノクローナル抗体ＭＳ１８ａ ７μＬを混和した。室温、１時間反応後、０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で０．１ｍｇ／ｍＬに調整したｔ−ＰＡ（Ｂｉｏｐｏｏｌ製）溶液０．９μＬを加え混和し、さらに、３７℃、３０分間反応させた。合成基質溶液（１．２５ｍＭ Ｈ−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン二塩酸塩（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ製）２００μＬを加え、室温で反応させ、吸光度（４０５ｎｍ）にてｔ−ＰＡ酵素活性を経時的に測定した。結果を図５に示す。
ＰＡＩ−１にモノクローナル抗体ＭＳ１８ａを加えた試料は発色が認められなかった。即ち、ＰＡＩ−１抗体はＰＡＩ−１のｔ−ＰＡ活性阻害能を中和するが、モノクローナル抗体ＭＳ１８ａはＰＡＩ−１に対して中和活性を示さず、ＰＡＩ−１がｔ−ＰＡと反応したことが示された。
〔実施例５〕中和活性を持たない抗メグシンモノクローナル抗体ＭＳ４４ｂ及び４Ｆ３のエピトープマッピング
（１）以下に示す大腸菌発現断片化メグシンを作製した。

（２）ウエスタンブロティング
（１）で作製した断片化メグシンを電気泳動し、ウエスタンブロットを行い、モノクローナル抗体ＭＳ４４ｂ及び４Ｆ３に反応するバンドを確認した。結果は表２に示した。表中、○はモノクローナル抗体が反応したバンドが観察されたことを、×は観察されなかったことを示す。

（３）プレートを用いたＥＬＩＳＡ
断片化大腸菌メグシンのデータを元にペプチドを合成し、プレート（コバリンクＮＨモジュール、ヌンク製）に固相化し、以下のようにＥＬＩＳＡを行った。
合成ペプチドをアミンカップリング法にてプレートに固相した。洗浄液で２回洗浄後、ＰＢＳで４倍希釈したブロックエースを加え、ブロッキングする。プレートに希釈した抗体１００μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で２時間反応させる。さらに洗浄液で４回洗浄後、ＴＭＢを１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で３０分反応させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果は表３に示した。

（４）競合法を用いたＥＬＩＳＡ
メグシンを９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートに固相する。洗浄液で２回洗浄後、ＰＢＳで４倍希釈したブロックエースを加えブロッキングする。洗浄液で４回洗浄後、抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）とペプチド（２μｇ／ｍＬ）を混合し、各ウエルに１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で２時間反応させる。４回洗浄後、プレートに希釈した抗マウスＩｇＧ抗体１００μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で２時間反応させた。さらに、洗浄液で４回洗浄後、ＴＭＢを加え室温で３０分反応後、２Ｎ硫酸を加え反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果は表４に示した。

（５）ｂｉａｃｏｒｅ（商標）による測定
ＣＭ５チップにアミンカップリング法にてペプチドを固相し、ｂｉａｃｏｒｅによって抗体との反応性を測定した。結果は表５に示した。

上記の結果よりモノクローナル抗体４Ｆ３は２４５−２６０、モノクローナル抗体ＭＳ４４ｂは２９１−３０５の範囲にエピトープが存在することが判った。中和活性を有する本発明のモノクローナル抗体が配列番号：４に記載のアミノ酸配列（メグシンのアミノ酸配列における３４３−３４８に相当）をエピトープとして認識するのに対して、中和活性を有しないモノクローナル抗体は、２４５−２６０あるいは２９１−３０５などの、配列番号：４以外の領域をエピトープとして認識していることが確認された。
産業上の利用の可能性
本発明により、メグシンの活性を中和するモノクローナル抗体が提供された。また本発明により、メグシンの反応性ループ領域に結合する抗体が、メグシンの活性を中和し得ることが確認された。メグシンは、糸球体において、メサンギウム基質の拡大、メサンギウム細胞の増殖、免疫複合体の沈着の原因となる分子である。これらの病変は、ヒトのメサンギウム増殖性糸球体腎炎に特徴的な病理像である。メサンギウム基質の拡大は、メサンギウム増殖性の腎炎をはじめとする多くの腎臓障害における重要な病変である。したがって、メグシンの活性を中和するモノクローナル抗体は、メサンギウム基質の拡大を伴う疾患の治療において有用である。
また本発明は、メグシンの活性を中和するモノクローナル抗体、その可変領域、あるいはその相補性決定領域を含む抗体可変領域を有効成分として含有する、メサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療および／または予防のための組成物を提供する。既に述べたように、メグシンは、メサンギウム増殖性糸球体腎炎を引き起こす。したがって、メグシンを中和する抗体は、メサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療または予防に有用である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、セルピンの活性部位である反応性ループ領域の、３種類の状態における構造の違いを示す模式図。（ａ）：活性型、（ｂ）：切断された状態、（ｃ）：伏在状態を表す。
図２は、本発明のモノクローナル抗体ＭＳ１８ａによるウエスタンブロット法の結果を示す染色像の写真。
図３は、本発明のモノクローナル抗体ＭＳ１８ａによる、メグシンタンパク質のプラスミン酵素活性阻害作用に対する中和活性を示す。図中、縦軸はモノクローナル抗体によって中和された酵素活性の割合（％）を、横軸はモノクローナル抗体の種類とメグシンとの混合比を示す。
図４は、メグシンの反応性ループ領域ペプチドがモノクローナル抗体ＭＳ１８ａ中和活性に及ぼす影響を示す。図中、縦軸はモノクローナル抗体によって中和された酵素活性の割合（％）を、横軸はモノクローナル抗体の吸収に用いた合成ペプチドの種類を示す。
図５は、モノクローナル抗体ＭＳ１８ａとＰＡＩ−１の反応性を示す。（■）はｔ−ＰＡのみ、（●）はｔ−ＰＡ＋ＰＡＩ−１＋ＰＡＩ−１抗体、（▲）はｔ−ＰＡ＋ＰＡＩ−１、（◆）はｔ−ＰＡ＋ＰＡＩ−１＋モノクローナル抗体ＭＳ１８ａの吸光度の経時変化（ＯＤ）を示す。 Technical field
The present invention relates to a monoclonal antibody that selectively binds to a specific serpin (serine protease inhibitor), ie, the reactive loop region of Megsin, a method for producing the same, and mesangial proliferative glomerulonephritis using the monoclonal antibody. The present invention relates to a composition for the treatment and / or prophylaxis of treatment and / or prevention.
Background art
Renal failure is a condition that ultimately leads to patients with kidney disease. The cause and history are not uniform, and there are many cases in which renal damage develops due to lesions other than the original kidney such as drug addiction, infection, malignant tumor, diabetes, systemic lupus erythematosus (SLE), etc., leading to renal failure. It is done.
Renal transplantation is the only treatment for end-stage renal failure where the blood filtration and detoxification of the kidneys do not function at all. However, in Japan, it is difficult to say that the system for supplying transplanted kidneys is sufficiently established. In addition, social recognition of transplantation therapy itself has not progressed. The number of kidney transplant cases in Japan is only 700 cases per year, and this figure has not increased in recent years. Therefore, dialysis is the only treatment for renal replacement therapy.
At present, the number of end-stage renal failure dialysis patients in Japan is estimated to be approximately 210,000, and the number of patients per population is the top in the world. The average treatment cost per person requires about 6 million yen per year, which is one of the major causes of pressure on the medical insurance system. In addition, since 2-3 days a week and 4-6 hours a day are restrained for dialysis treatment, it is difficult for the patient to return to society.
Furthermore, with the recent aging of the population, the age of dialysis patients is also increasing. For this reason, the need for drugs that treat kidney disease early and prevent progression to renal failure is recognized. However, in the renal disease field, there is a lack of information research bases such as target molecules for drug discovery, and no effective pharmaceuticals are currently born.
It is well known that mesangial cells are organ-specific cells that are not found outside the kidney and play an important role in maintaining the structure and function of the glomeruli. In addition, mesangial cells themselves proliferate and increase extracellular matrix secreted from mesangial cells at the time of glomerular injury, so it is presumed that they are deeply involved in the onset and progression of diseases. In order to elucidate the molecular mechanism of glomerular injury, it is essential to elucidate the biological characteristics of mesangial cells. However, the gene-level specificity for mesangial cells has not been revealed.
There are about 60 trillion cells in the human body, and these cells have the same genomic DNA, but individual cells and thus organs have different biological properties. It is thought to be due to genes that are specifically expressed in The present inventors considered that it is possible to detect a highly expressed gene group specific to mesangial cells by clarifying the profile of the gene group expressed in mesangial cells. It is also possible to determine the genes involved in glomerulonephritis from among them, and to find clues to elucidate the molecular mechanism of glomerular injury, and to develop new therapeutic methods for glomerulonephritis based on it. I thought.
Therefore, the present inventors have clarified the gene expression pattern of mesangial cells and attempted to analyze the cell characteristics at the gene level.
First, for the purpose of quantitatively analyzing genes expressed in mesangial cells, the present inventors extracted mRNA from cultured human mesangial cells to prepare a 3'-directed cDNA library. Large-scale DNA sequencing and database analysis of gene fragments inserted into clones were performed [Yasuda, Y. et al. et al. : Kidney Int. 53: 154-158, 1998].
As a result, a gene consisting of 2,249 bp in total length named megsin was isolated as a gene that is particularly strongly expressed in mesangial cells. The inventors succeeded in isolating and obtaining megsin protein, which is a novel protein consisting of 380 amino acids encoded by the full-length cDNA clone of megsin. Furthermore, the amino acid homology search by the FASTA program was performed using the SwissProt amino acid sequence database. And, in the amino acid sequence of megsin protein, serine protease inhibitor (SERPIN) superfamily [Carrell, R. et al. W. et al. : Trends Biochem. Sci. , 10:20, 1985; W. et al. : Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52: 527, 1987; Kruithof, E .; K. O. et al. : Blood, 86, 4007, 1995; Potempa, J. et al. et al. : J. Biol. Chem. 269: 15957, 1994; Remold-O'Donnell, E .; FEBS Lett. , 315: 105, 1993], there is a sequence (EEGTEATAAAT / SEQ ID NO: 3) similar to the consensus sequence (EEGTEAAAAT / SEQ ID NO: 2) within the reactive loop site important as a bioactive central site. I found out. That is, megsin has the structural features of serpin, and there is a reactive loop region (P17-P5 ': EEGTEATAATAGSSNIVEKQLPQS / SEQ ID NO: 1) that is an active site like other serpins [Miyata, T. et al. et al. : J. Clin. Invest. , 102: 828-836, 1998].
From these, it was clarified that the human megsin protein belongs to serpin [Miyata, T. et al. et al. : J. Clin. Invest. 120: 828-836, 1998]. A patent application was filed for these findings (WO 99/15652).
As for serpin, antithrombin, plasminogen activator inhibitor (PAI), ovalbumin, and the like are known. These serpin molecules are highly homologous to each other and have very similar three-dimensional structures. Each serpin is known to form a complex with the target serine protease and inhibit the enzyme activity. Bound to the active site of the protease is the flexible reactive loop site of serpin.
When serpin is dissociated from the complex, the polypeptide chain is cleaved at the center of the loop by the protease, and the molecule is eventually degraded. In addition to the active and cleaved states, serpins have a latent state in which the polypeptide chain is complete but functionally inactive and does not bind to proteases. Currently, the structure of all three states of serpin has been determined by X-ray crystallography [Huber, R., et al. et al. : Biochem. 28: 8951 1989; Baumann, U., et al. et al. : J. Mol. Biol. 218: 595, 1991; Schulze, A .; J. et al. et al. : Biochem. 31: 7560, 1992; Goldsmith, E .; J. et al. et al. : Proteins Struct. Funct. Genet. 9: 225, 1991; Goldsmith, E .; J. et al. et al. : Nature (London), 355: 270, 1992; Schreuder, H .; et al. : J. Mol. Biol. 229: 249, 1993].
The serpin type fold consists of a dense structure made by three antiparallel β sheets A, B, C partially covered with α helix. The structure of the uncut ovalbumin is considered to be the standard form of serpin, and sheet A contains 5 strands. The flexible loop begins at the end of strand 5 of β sheet A, followed by the α helix on the outside of the molecule, followed by the strand (β16) at the end of β sheet C, and the strand contained in the β sheet (β17 ) Reaches the starting point. There is a site where the serpin is split in the α-helix region in the center of the loop, which protrudes like a handle outside the molecule.
The flexible loop region of active antithrombin is in the same general position as ovalbumin, but several residues near the beginning of the loop are the sixth short β between β5 and β15 of β-sheet A. A strand is formed. In addition, the loop emanating from the main part of the molecule has no α helix and can be inserted directly into the active site of thrombin.
That is, in the active state of serpin, the loop region protrudes from the main part of the serpin molecule so that it can bind to the active site of serine protease (FIG. 1 (a)).
In the truncated form of α1 antitrypsin, half from the beginning of the loop region to the cleavage site forms a complete β-strand, which is inserted between strands β5 and β15 of β-sheet A.
That is, as a result of protease inhibition, the serpin molecule is cleaved at the protruding portion of the loop region that is the active site. In the cut serpin, the N-terminal part of the loop region enters between β strands 5 and 15 to form a long β strand at the center of the β sheet (FIG. 1B).
The latter half of the loop region occupies almost the same position as in the case of active antithrombin. The two new ends (linked in the active form) resulting from the split are at each end of the molecule and are about 70 cm apart.
Lastly, in the sacrificial state of PAI, β-strand is added to β-sheet A in the same manner as the cut form of α1-antitrypsin, but the remaining part of the flexible loop region forms a loop outside the molecule to form β-sheet B There is no strand at the end of β sheet C.
In the most stable and inactive saphenous state, it takes the form of a β strand in which the N-terminal portion of the loop region is inserted into the β sheet as in the cut state. The remaining residues form a loop at the opposite end of the β sheet (FIG. 1 (c)) [Carrel, R .; W. et al. : Structure, 2: 257-270, 1994].
That is, the loop region that is the active site of serpin can take three types of forms: “active type”, “cut state”, and “spotted state”.
When the conversion from active to sacrificial occurs, the loop turns into a long β-strand and is inserted in the center of the β-sheet. In order to cause a large structural change such as inserting a β-strand into a stable β-sheet that has already been constructed, adjacent strands in the β-sheet must first be separated. This means that not only recombination of a large number of hydrophobic contacts made inside the molecule to form a dense structure, but also a number of hydrogen bonds are broken. Newly formed hydrogen bonds and filling contacts must be recreated after the extra β strand is inserted. Such large changes in the β structure were not anticipated at all prior to the determination of the serpin structure and have not yet been observed in other systems [Branden, C. et al. et al. : Introduction to Protein Structure Second Edition, 1999].
Disclosure of the invention
An object of the present invention is to provide a megsin neutralizing antibody that is effective in the treatment of diseases associated with mesangial cells. The present invention also relates to a monoclonal antibody that selectively binds to the reactive loop region of megsin, a method for producing the same, and a composition for the treatment and / or prevention of mesangial proliferative glomerulonephritis using the monoclonal antibody. The issue is to provide goods.
Megsin has the structural characteristics of a serine protease inhibitor (SERPIN) and, like other serpins, there is a reactive loop region (P17-P5 ′: EEGTEATAATGSSNIVEKQLPQS / SEQ ID NO: 1) that is an active site [Miyata, T. T. et al. et al. : J. Clin. Invest. , 102: 828, 1998].
On the other hand, the transgenic mice of megsin show progressive expansion of mesangial matrix, proliferation of mesangial cells, and increase of immune complex deposits, strongly suggesting that serpin activity may cause nephritis. [Miyata, T .; et al. : J. Clin. Invest. 109, 585, 2002].
Since megsin is a glomerular highly expressed gene belonging to the serpin superfamily, this gene is a functional gene in the glomerulus and is considered to be related to the onset / progression of glomerulonephritis. And since megsin protein has the reactive loop site peculiar to a serpin superfamily, it is thought that it acts as a suppressor with respect to a certain serine protease.
It is known that the protease activity is kept constant by the balance of the activity between the protease and its inhibitory factor, and its variation significantly affects the function / pathology of the tissue / cell. In fact, at the time of glomerulosclerosis, the resolution of extracellular matrix proteins is reduced by proteases. As another example, bleomycin-responsive fibrosis is induced at a higher rate in mice with high expression of PAI-1 (amino acid homology with megsin protein 27.7%), which is a serpin, compared to wild mice. However, research results have also been reported that fibrosis is less likely to occur in PAI-1-deficient mice [Eitsman, D. et al. T.A. et al. : J. Clin. Invest. 97: 232, 1996].
In recent years, serpin not only inhibits serine protease activity but also participates in blood coagulation, fibrinolysis, inflammatory reaction, cell differentiation / proliferation, and apoptosis, and reports that its physiological mechanism and pathophysiological significance are diverse. [Kruithof, E .; K. O. et al. : Blood, 86, I: 4007, 1995; Bachmann, F .; Thromb. Haemostasis, 74: 172, 1995; Tsujimoto, M .; et al. : J. Biol. Chem. 272: 15373, 1997; Bird, P .; I. Results Probl. Cell. Differ. 24:63, 1998; Potempa, J. et al. et al. : J. Biol. Chem. , 269: 15957, 1994].
Furthermore, when various tissues and cells were analyzed by Northern blot and reverse transcription polymerase chain reaction, megsin was weakly expressed in human fibroblasts, smooth muscle cells, endothelial cells and keratinocytes, and was particularly strongly expressed in mesangial cells. I found out. That is, the expression of the megsin gene has specificity for mesangial cells. These findings are further demonstrated by in situ hybridization [Miyata, T .; et al. : J. Clin. Invest. 102: 828, 1998; Suzuki, D .; et al. : J. Am. Soc. Nephrol. , 10: 2606, 1999] and immunohistochemistry using megsin antibody [Inagi, R .; et al. : Biochem. Biophys. Res. Commun. , 286: 1098, 2001].
In addition, when the expression level of megsin in kidney tissue is compared between IgA nephropathy patients and diabetic nephropathy patients and healthy individuals, the expression level of megsin is significantly higher in patients with IgA nephropathy and diabetic nephropathy [Miyata , T. et al. : J. Clin. Invest. 102: 828, 1998; Suzuki, D .; et al. : J. Am. Soc. Nephrol. , 10: 2606, 1999]. Further, in the experimental mesangial proliferative glomerulonephritis model (Thy-1 nephritis model) using rats, a similar increase in megsin expression was observed [Nangaku, M. et al. et al. : Kidney Int. , 60: 641, 2001]. This reveals that megsin expression changes with dysfunction of mesangial cells and is deeply involved in the onset / progression of the disease.
To better understand the role of megsin in mesangial function, we overexpressed human megsin cDNA in the mouse genome. Two strains of megsin transgenic mice were obtained, which showed progressive mesangial matrix expansion, mesangial cell proliferation, and increased immune complex deposits [Miyata, T. et al. et al. : J. Clin. Invest. 109, 585, 2002, WO 01/24628]. These findings indicate that megsin has a biologically important effect on mesangial function. Interestingly, single genetic manipulation of megsin can generate early mesangial lesions present in experimental and human glomerulonephritis. Thus, it has been reported that megsin is also involved in the development of mesangial proliferative glomerulonephritis in animal individuals.
Therefore, the discovery and identification of a substance having an activity capable of neutralizing its action against megsin, in particular, a neutralizing antibody (monoclonal antibody) excellent in specificity, is to elucidate the biological properties of mesangial cells, mesangial It is effective in investigating the causes of cell-related diseases and, in turn, treating and diagnosing diseases related to mesangial cells.
As a result of scrutinizing an antibody having neutralizing activity against megsin using recombinant megsin, the present inventors have found that a monoclonal antibody that recognizes a specific region can neutralize the activity of megsin. Completed the invention. Monoclonal antibodies against megsin were known (WO 00/57189), but the knowledge about antibodies that specifically bind to epitopes within the reactive loop region of megsin (P17-P5 ′: EEGTEATAATGSNIVEKQLPQS / SEQ ID NO: 1) It was not confirmed. In addition, an antibody that neutralizes the action of megsin has not been known. The monoclonal antibody according to the present invention can neutralize the reaction between megsin and plasmin, which is one of the ligands for megsin. That is, the present invention relates to the following monoclonal antibodies and uses thereof.
[1] A monoclonal antibody having megsin neutralizing activity.
[2] A monoclonal antibody that recognizes an epitope constituted by a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
[3] A hybridoma cell line producing the monoclonal antibody according to claim 1 or 2.
[4] Hybridoma MS18a deposited as FERM BP-8349.
[5] A monoclonal antibody produced by the hybridoma MS18a deposited as FERM BP-8349.
[6] A method for producing a monoclonal antibody, comprising culturing a hybridoma MS18a deposited as FERM BP-8349 and recovering the immunoglobulin contained in the culture.
[7] A composition for treating and / or preventing mesangial proliferative glomerulonephritis comprising an effective amount of any of the following components (a) to (d):
(A) monoclonal antibody having megsin neutralizing activity or variable region thereof
(B) a monoclonal antibody that recognizes an epitope composed of a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or a variable region thereof
(C) Monoclonal antibody produced by hybridoma MS18a strain or variable region thereof
(D) an antibody comprising a complementarity determining region constituting the variable region according to any one of (a) to (c) or a variable region thereof
[8] A method for neutralizing megsin activity, comprising a step of bringing the component according to any one of (a) to (d) below into contact with megsin.
(A) monoclonal antibody having megsin neutralizing activity or variable region thereof
(B) a monoclonal antibody that recognizes an epitope composed of a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or a variable region thereof
(C) Monoclonal antibody produced by hybridoma MS18a strain or variable region thereof
(D) an antibody comprising a complementarity determining region constituting the variable region according to any one of (a) to (c) or a variable region thereof
[9] An active neutralizing agent for megmegsin, containing as an active ingredient any of the following components (a) to (d):
(A) monoclonal antibody having megsin neutralizing activity or variable region thereof
(B) a monoclonal antibody that recognizes an epitope composed of a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or a variable region thereof
(C) Monoclonal antibody produced by hybridoma MS18a strain or variable region thereof
(D) an antibody comprising a complementarity determining region constituting the variable region according to any one of (a) to (c) or a variable region thereof
Alternatively, the present invention relates to a method for the treatment and / or prevention of mesangial proliferative glomerulonephritis, which comprises the step of administering an effective amount of the component described in any of the above (a) to (d). Furthermore, the present invention relates to the use of the component described in any of (a) to (d) above in the manufacture of a composition for the treatment and / or prevention of mesangial proliferative glomerulonephritis.
The present invention provides monoclonal antibodies that neutralize the action of megsin. In the present invention, neutralizing the action of megsin means neutralizing action of the serpin activity of megsin. Serpin activity is an inhibitory action on the protease activity of serine protease. In the present invention, neutralization includes not only complete suppression of serpin activity but also partial suppression.
It can be confirmed, for example, by the method described in Example 2 that the monoclonal antibody neutralizes the action of megsin. That is, plasmin is used as a serine protease, and its neutralizing activity can be confirmed using the inhibitory effect of the monoclonal antibody in inhibiting the protease activity by megsin as an index. Protease activity can be measured, for example, by observing digestion of a fluorescent substrate.
The present inventors have found that a monoclonal antibody that recognizes the reactive loop region of megsin has a neutralizing action of megsin. That is, the present invention relates to a monoclonal antibody that recognizes the reactive loop region of megsin. The reactive loop region of megsin refers to a region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence of megsin. Therefore, the monoclonal antibody of the present invention is a monoclonal antibody that recognizes an epitope constituted by a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Among these, a monoclonal antibody that recognizes the amino acid sequence NIVEKQ (SEQ ID NO: 4) is a desirable monoclonal antibody that can effectively suppress the serpin activity of megsin.
It can be confirmed by epitope mapping that the monoclonal antibody recognizes an epitope composed of a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. For example, in Example 3, the epitope which a monoclonal antibody recognizes is specified using the peptide which consists of various amino acid sequences.
A monoclonal antibody against megsin can be obtained by a known method using human megsin or its domain peptide as an immunogen. The method for obtaining the monoclonal antibody will be specifically described later. The monoclonal antibody of the present invention can be obtained by selecting the obtained monoclonal antibody based on the evaluation method as described above.
As a hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention, for example, a hybridoma Ms18a cell can be shown. The hybridoma Ms18a is a hybridoma that produces a monoclonal antibody that recognizes NIVEKQ (SEQ ID NO: 4) in the amino acid sequence constituting the reactive loop of megsin. The monoclonal antibody Ms18a produced by the hybridoma Ms18a has a megsin neutralizing activity.
Hybridoma Ms18a was issued on April 1, 2002 (original date) to the Patent Organism Depositary Center of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, located in 1-1-6 Higashi 1-1-1 Tsukuba City, Ibaraki, Japan. The deposit number is FERM BP-8349.
The isotype of the monoclonal antibody produced by this hybridoma Ms18a cell line was IgG1 for the H chain and κ for the L chain. The present invention also encompasses class switch variants of the above antibodies, such as variants belonging to isotypes IgG3, IgG1, IgG2b, IgG2a and other immunoglobulin subclasses, such variants are described in the Martin et al. (Martin, C. et al .: J. Immunol. Methods., 145: 1118, 1991).
Production of monoclonal antibodies against megsin requires megsin that can be used as an immunogenic antigen. Megsin as an antigen can be obtained using cultured cells such as megsin-producing cells. Examples of megsin-producing cells include human kidney-derived cells. The megsin-producing cells are cultured using a medium or culture method known in the art or substantially similar to them, and the megsin produced in the culture supernatant is subjected to, for example, ion exchange chromatography and / or polyclonal. It can be purified by affinity chromatography using antibodies.
Recombinant megsin can also be used. Specifically, after transforming a host cell with a recombinant vector containing a gene fragment containing a base sequence encoding the amino acid sequence of megsin, the transformed host is cultured to obtain a polypeptide containing the amino acid sequence of megsin. It is produced and the polypeptide is used as an immunogen. A recombinant vector containing megsin cDNA is prepared by a conventional gene recombination technique, for example, by inserting it into a plasmid vector. As a vector, viruses such as vaccinia virus and baculovirus can be used in addition to plasmids and phages.
As the host, for example, prokaryotes such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes, etc., and commercially available cell lines such as various cells such as animal cells and CHO cells, and eukaryotes such as yeast, plant cells, and insect cells may be used. it can. Examples of promoters that can be used in prokaryotes include tryptophan synthase operon and lactose operon. Examples of promoters that can be used in eukaryotes include viral promoters, promoters for alcohol dehydrogenase, promoters for glycolytic enzymes, and the like. Commercially available vectors or plasmids having a multicloning site, promoter, resistance gene, replication origin, terminator, liposome binding site and the like can also be used. Resistance genes include those for tetracycline, ampicillin, neomycin and the like. The megsin thus prepared may be further used as an immunogenic conjugate, but can be used as it is for immunization of an animal by mixing it with an appropriate adjuvant.
As described above, antigens are obtained from various raw materials such as cultured cells, cultured tissues, transformed cells, and other conventionally known methods, for example, salting out such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography using Sephadex, It can be obtained by purification by ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, dye gel chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, affinity chromatography, high performance liquid chromatography and the like.
Furthermore, megsin can be obtained by fragmenting it or selecting a characteristic sequence region based on the amino acid sequence deduced from the cloned and sequenced cDNA sequence, designing the polypeptide and chemically synthesizing it. Monoclonal fragments that can be combined with various carrier proteins via an appropriate condensing agent to form hapten-protein immunoconjugates that can be used to recognize only specific sequences. Antibodies can also be designed. A cysteine residue or the like can be added in advance to the designed polypeptide to facilitate the preparation of an immunogenic conjugate.
The present invention provides at least one monoclonal antibody that specifically binds to megsin. The monoclonal antibody according to the present invention, after immunizing an animal with recombinant megsin as an immunogen, cell fusion between myeloma cells and antibody-producing cells, selection and monocloning of hybridomas, production of monoclonal antibodies, and ascites as needed It can be produced by a process such as
The animal is immunized as follows, for example. Known methods [Miyata, T .; et al. : J. Clin. Invest. , 120: 828, 1998] to immunize mammals such as rats and mice with the purified human megsin protein. It is preferable to use an animal of the same strain as the partner's permanent proliferating cell for cell fusion. The animal age is preferably 8 to 10 weeks for mice, for example. Sex may be either male or female.
As an immunized animal, a human immunoglobulin can be produced by using a transgenic animal in which an immunoglobulin gene is recombined with a human gene. A method for obtaining an antibody having the desired reactivity by using a transgenic animal in which an immunoglobulin gene is recombined with a human gene is known. The immunoglobulins that can be obtained in this way are fully human immunoglobulin molecules, although they are obtained from animals.
The immunization method involves mixing purified human megsin protein with an appropriate adjuvant (for example, Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel-pertussis vaccine, etc.) to give an emulsion, and then subcutaneously, intraperitoneally, intravenously, etc. Administer. Thereafter, this immunization is performed 2 to 5 times at intervals of 1 to 2 weeks. The final immunization is performed by administering 0.5 to 2 μg of human megsin protein into the peritoneal cavity of the animal.
Polyclonal antibodies are obtained from the body fluids of animals immunized in this way. Three to seven days after each immunization, blood is collected from the fundus venous plexus, and the antibody titer of the serum is measured. When the antibody titer sufficiently rises, the antibody or antibody-producing cells are collected. The antibody titer against megsin can be measured by a technique such as ELISA. ELISA for measuring antibody titer can be performed by adding serum to a plate coated with megsin and further adding a labeled antibody against IgG of the immunized animal.
Examples of the adjuvant used together with the antigen include Freund's complete adjuvant, livi adjuvant, pertussis vaccine, BCG, liposome, aluminum hydroxide, silica gel and the like. For immunization, animals such as mice such as Balb / c mice and FI mice can be used.
Antibody-producing cells are collected from animals immunized with human megsin protein as described above. Antibody-producing cells can be obtained from the spleen, lymph nodes, peripheral blood, etc., and the spleen is particularly preferable. For example, 3 to 4 days after the final immunization, the spleen is aseptically removed, shredded in Minimal Essential Medium (MEM) medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), disassembled with tweezers, and conditions of 1,200 rpm × 5 minutes After centrifuging, remove the supernatant, treat with Tris-HCl buffer (pH 7.65) for 1-2 minutes to remove erythrocytes, and then wash 3 times with MEM medium to remove spleen cells for cell fusion. obtain.
Before cell fusion, it is necessary to prepare the tumor cell line to be used first. The tumor cell line used prior to cell fusion can be selected from, for example, cell lines that do not produce immunoglobulins. As the permanent proliferating cell to be fused, any cell having permanent proliferation can be used, but in general, myeloma cells (myeloma) are used. Permanently proliferating cells are preferably derived from the same animal species as the antibody-producing cells.
For example, in the case of mice, the following cell lines are known as bone tumor cell lines derived from 8-azaguanine resistant mice (Balb / c).
P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current. Topics in Microbiol, Immunol. , 81: 1, 1978]
P3 / NS1 / 1-Ag4-1 (NS-1) [Eur. J. et al. Immunol. , 6: 511, 1976]
SP2 / 0-Ag14 (SP-2) [Nature, 276: 269, 1978]
P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunol. 123: 1548, 1979].
P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256: 495, 1975]
These permanently proliferating cell lines were prepared using 8-azaguanine medium (RPMI-1640 medium with glutamine (1.5 mM), 2-mercaptoethanol (5 × 10 5^-5M), gentamicin (10 μg / mL) and fetal bovine serum (FCS, manufactured by CLS) (10%) in a normal medium, and further subcultured with 8-azaguanine (15 μg / mL)) Passage to normal medium 3-4 days before cell fusion, 2 × 10 on the day of fusion⁷Secure the number of cells.
Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed, for example, as follows. The antibody-producing cells and the permanently proliferating cells obtained above are thoroughly washed with MEM medium or PBS, and mixed so that the number of cells is 5 to 10: 1. After centrifuging at 1,200 rpm × 5 minutes, the supernatant was removed, the precipitated cell group was thoroughly dissolved, and then maintained at 37 ° C. with stirring, and polyethylene glycol-1000 (PEG-1000) 1 to 1 as a cell fusion agent. 4 g, a mixed solution of MEM medium 1 to 4 mL and dimethyl sulfoxide 0.5 to 1.0 mL as a cell fusion promoter 0.1 to 1.0 mL / 10⁸Individual cells are added to cause cell fusion.
Thereafter, 3 mL of MEM medium is added several times every 10 minutes, and MEM medium is added and diluted to a total volume of 50 mL to stop cell fusion. Next, the supernatant is removed by centrifugation (1,500 rpm × 5 minutes), and the cells are gently lysed. Then, 100 mL of normal medium (RPMI-1640 medium, 10% FCS) is added, and pipetting with a pipette. Gently suspend the cells.
This suspension was dispensed at 100 μL / well into a 96-well culture plate, and 5% CO 2 was added.₂Incubate in an incubator at 37 ° C for 3-5 days. 100 μL / well of HAT medium (hypoxanthine (10^-4M), thymidine (1.5 × 10^-5M) and aminopterin (4 × 10^-7Medium) supplemented with M) is added and further cultured for 3 days. After that, remove half volume of the culture supernatant every 3 days, add a new amount of HAT medium and add 5% CO2.₂Incubate in an incubator at 37 ° C for about 2 weeks.
For wells in which fused cells are observed to grow in colonies, a half volume of the supernatant is removed, and the same amount of HT medium (HAT medium minus aminopterin) is added and cultured for 4 days. A part of the culture supernatant is collected, and the antibody titer against megsin protein is measured by the above-mentioned ELISA.
More specifically, for example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase on which megsin protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier, and then an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme is added to measure the label. By doing so, the antibody titer can be measured. A microplate or the like is used for the solid phase. As the anti-immunoglobulin antibody, when the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used.
In addition, instead of the labeled antibody, protein A can be added to detect the anti-megsin protein monoclonal antibody bound to the solid phase. Furthermore, the antibody titer can also be measured by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase on which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed and adding megsin protein labeled with a radioactive substance or an enzyme.
For wells in which the production of antibodies reacting with megsin protein was observed, cloning was repeated four times by limiting dilution, and those showing stable megsin protein antibody titers were selected as anti-megsin protein monoclonal antibody-producing hybridoma strains. .
The hybridoma obtained as described above is cultured in vitro and in vivo to produce a monoclonal antibody. A desired monoclonal antibody can be cultured in an appropriate medium such as an FCS-containing MEM medium or RPMI-1640 medium, and obtained from the culture supernatant. The in vitro culture of the hybridoma is preferably performed in a serum-free medium, and an optimal amount of antibody is given to the supernatant.
When culturing in vivo, hybridomas are transplanted into any animal. The host animal for transplantation is preferably an animal of the same kind as the animal from which the spleen cells used for cell fusion were collected. For example, 2 to 4 × 10 6 of anti-megsin protein monoclonal antibody-producing hybridoma cells obtained above in 8-10 week old Balb / c female mice treated with pristane.⁶Individuals / mouse are administered intraperitoneally. The pristane treatment is performed, for example, by intraperitoneally administering 2,6,10,14-tetramethylpentadecane-pristan-0.5 mL and rearing for 2 weeks.
In 2 to 3 weeks, ascites containing a high concentration of monoclonal antibody accumulates in the abdominal cavity of the mouse, and the abdomen becomes enlarged. Ascites is collected from the mouse, centrifuged (3,000 rpm × 5 minutes) to remove solids, and IgG is purified.
Ascites fluid and culture supernatant are salted out with 50% ammonium sulfate and dialyzed against PBS for 1-2 weeks. This dialysis fraction is passed through a protein A sepharose column, and the IgG fraction is collected to obtain a purified monoclonal antibody. This monoclonal antibody can neutralize the reaction between megsin and plasmin, one of the ligands for megsin.
For the antibody isotype, a commercially available kit (Gibco BRL, Mouse Antibody Isotyping Kit, etc.) is used, or an octalony (double immunodiffusion) method (introduction to immunological experiments, biochemical experimental methods 15, published by the Society Publishing Center, 74 Page, 1981). The amount of protein was determined by the foreign method and absorbance at 280 nm (1.4 (OD₂₈₀) Immunoglobulin 1 mg / mL).
Hybridoma ascites can be used to obtain large amounts of monoclonal antibodies. In this case, monoclonal antibodies produced in the ascites by transplanting each hybridoma into the abdominal cavity of an animal having the same tissue compatibility as that of an animal derived from myeloma cells, and proliferating, or transplanting each hybridoma into a nude mouse or the like. Can be obtained.
The animal can be administered intraperitoneally with a mineral oil such as pristane prior to transplanting the hybridoma. Ascites fluid can be purified as it is or by a conventional method. For example, it can be purified by salting out such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration using Sephadex, etc., ion exchange chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, affinity chromatography, high performance liquid chromatography and the like.
The characteristics of the monoclonal antibody obtained as described above can be clarified by, for example, an enzyme immunoassay (ELISA method) or the like.
The monoclonal antibody of the present invention specifically binds to the reactive loop region of human megsin and can neutralize the reaction between megsin and plasmin, which is one of the ligands for megsin. Therefore, the monoclonal antibody of the present invention is useful as a method for neutralizing megsin activity or as an activity neutralizing agent. That is, the present invention provides a method for neutralizing megsin activity, which comprises the step of bringing the components described in any of the following (a) to (d) into contact with megsin. Or this invention relates to the active neutralizing agent of megsin which contains the component in any one of following (a)-(d) as an active ingredient.
(A) monoclonal antibody having megsin neutralizing activity or variable region thereof
(B) a monoclonal antibody that recognizes an epitope composed of a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or a variable region thereof
(C) Monoclonal antibody produced by hybridoma MS18a strain or variable region thereof
(D) an antibody comprising a complementarity determining region constituting the variable region according to any one of (a) to (c) or a variable region thereof
As described above, megsin has an effect of inducing proliferation of mesangial cells. Since the monoclonal antibody of the present invention neutralizes the activity of megsin, it can be expected to improve the pathology caused by megsin. Therefore, an antibody obtained by humanizing the monoclonal antibody of the present invention is considered to be effective for the treatment of a disease in which mesangial cells proliferate. Such a humanized antibody is usually preferably mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers and provided as a pharmaceutical composition produced by a known pharmaceutical method.
When the monoclonal antibody of the present invention is administered to a human for the purpose of treating a disease associated with megsin, a method for minimizing the antigenicity against the human may be employed. That is, the monoclonal antibody of the present invention can be carried out by making it into a chimeric antibody or a humanized antibody by a known method, and the monoclonal antibody of the present invention includes antibodies having reduced antigenicity against these humans.
Since 1975 Kohler and Milstein reported on the production of monoclonal antibodies by cell fusion and cloning technology (hybridoma method), culturing hybridoma cells to produce homogeneous antibodies with high specificity and affinity for the target (monoclonal) Antibody) can be obtained in large quantities [Kohler, G. et al. et al. : Nature, 256: 495-497, 1975]. In 1980, treatment of lymphoma using mouse monoclonal antibodies was reported [Nadler, L., et al. M.M. et al. : Cancer Res. , 40: 3147-3154, 1980].
However, since such an antibody is a mouse-derived heterologous serum, it is recognized as a foreign substance in the human body, and an antibody against a mouse-derived monoclonal antibody (human anti-mouse antibody: HAMA) is produced in the body. The As a result, the effector function of mouse antibodies (complement-dependent cytotoxicity: CDC, antibody-dependent cytotoxicity: ADCC) is attenuated in the human body, making it difficult to maintain effective concentrations. It was.
In addition, there is a risk that repeated administration of antibodies has a risk of exhibiting shock symptoms such as anaphylaxis, making repeated administration difficult [J. Clin. Oncol. 2: 881, 1984; Blood, 65: 1349, 1985; Natl. Cancer Inst. , 80: 932, 1988; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 1242, 1985; Nucl. Med. 26: 1011, 1985; Blood, 65: 1349, 1985; Natl. Cancer Inst. 80: 937, 1988; Immunol. 135: 1530, 1985; Cancer Res. 46: 6489, 1986].
However, these problems are being solved with the remarkable progress of gene recombination technology in recent years. First, in order to improve the immunogenicity of an antibody, a human chimeric antibody was created in which the constant regions of the H and L chains containing the Fc portion of a mouse antibody were replaced with human antibodies. A chimeric antibody refers to a chimeric molecule of a mouse antibody and a human antibody.
A human chimeric antibody is an antibody in which the antibody variable region (V region) is derived from a non-human animal antibody and the antibody constant region (C region) is derived from a human antibody [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851, 1984]. A mouse is immunized with a human antigen, and an antibody variable region (V region) that binds to the antigen is excised from the mouse monoclonal antibody gene, and then combined with a human-derived antibody constant region (C region) gene to produce a chimeric gene.
If this chimeric gene is expressed in a host cell, human, mouse and monoclonal antibodies can be produced. Since chimeric antibodies have low antigenicity to humans, when administered to humans, antibodies against monoclonal antibodies derived from animals other than humans are hardly elicited, and it has been reported that the blood half-life is prolonged 6-fold [Proc . Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4220, 1989].
In order to further reduce the immunogenicity of the chimeric antibody, only the gene sequence of the antigen binding region (Complementary determining region: CDR, complementarity determining region) in the variable region is transplanted to the CDR region of the human antibody (CDR grafting). A humanized antibody was prepared by humanizing all molecules except the CDR of the antibody molecule [Nature, 321: 522, 1986]. Since humanized antibodies have less mouse antibody parts than human, mouse, and chimeric antibodies, they are less antigenic and safer. In experiments using monkeys, it has been reported that the immunogenicity is reduced compared to mouse antibodies, and the blood half-life is increased 4 to 5 times [J. Immunol. 147: 1352, 1991].
By using the method described above, the antibody of the present invention can be humanized and is very useful when administered to humans.
In the present invention, the variable region of an antibody is defined as a region necessary for binding to an antibody antigen. Therefore, not only antibody fragments such as Fab that can be obtained by enzymatic digestion, but also antibody fragments that can be obtained by isolating DNA encoding the antigen-binding region and expressing it in an appropriate host vector system are variable regions. include. Furthermore, the antibody variable region of the present invention comprises scFv in which the heavy and light chain antigen-binding regions are linked to one peptide chain.
As an administration method of the pharmaceutical composition of the present invention, in addition to oral administration and intravenous administration, transmucosal administration, transdermal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intrarectal administration and the like can be appropriately selected, and depending on the administration method Can be used as various preparations. Hereinafter, each formulation is described, but the dosage form used in the present invention is not limited to these, and can be used as various formulations usually used in the pharmaceutical formulation field.
<Systemic preparation>
When used for the treatment and / or prevention of mesangial proliferative glomerulonephritis, the oral dose of the humanized antibody is preferably in the range of 0.1 μg / kg to 100 μg / kg, more preferably 1 μg / kg. -10 μg / kg.
The dosage forms for oral administration include powders, granules, capsules, pills, tablets, elixirs, suspensions, emulsions and syrups, which can be selected as appropriate. Moreover, modifications such as sustained release, stabilization, easy disintegration, poor disintegration, enteric solubility, easy absorption, etc. can be applied to these preparations. In addition, dosage forms for local oral administration include chewing agents, sublingual agents, buccal agents, lozenges, ointments, patch agents, liquid agents, and the like, which can be selected as appropriate. Moreover, modifications such as sustained release, stabilization, easy disintegration, poor disintegration, enteric solubility, easy absorption, etc. can be applied to these preparations.
For each of the above dosage forms, a known drug delivery system (DDS) technique can be employed. The DDS preparations referred to in this specification include sustained release preparations, topical preparations (troches, buccal tablets, sublingual tablets, etc.), drug release control preparations, enteric preparations and gastric preparations, etc., administration routes, bioavailability In addition, it refers to a preparation in an optimal preparation form in consideration of side effects and the like.
DDS components basically consist of a drug, a drug release module, an encapsulant and a treatment program, and each component has a short half-life whose blood concentration quickly decreases, particularly when the release is stopped. Preferably, the encapsulant does not react with the living tissue at the administration site, and preferably has a treatment program that maintains the best drug concentration for a set period of time. The drug release module basically comprises a drug reservoir, a release control, an energy source and a release hole or release surface. It is not necessary to have all these basic components, and the best mode can be selected by adding or deleting as appropriate.
Materials that can be used for DDS include polymers, cyclodextrin derivatives, lecithin and the like. Insoluble polymers (silicon, ethylene / vinyl acetate copolymer, ethylene / vinyl alcohol copolymer, ethyl cellulose, cellulose acetate, etc.), water-soluble polymers and hydroxyl gel-forming polymers (polyacrylamide, polyhydroxyethyl) Methacrylate cross-linked product, polyacrylic cross-linked product, polyvinyl alcohol, polyethylene oxide, water-soluble cellulose derivative, cross-linked poloxamer, chitin, chitosan, etc.), slow-dissolving polymer (ethyl cellulose, methyl vinyl ether / maleic anhydride copolymer partial ester, etc.) ), Gastric polymer (hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylcellulose, carmellose sodium, macrogol, polyvinylpyrrolidone, dimethylaminoethyl methacrylate, methacrylic acid) Methyl copolymers), enteric polymers (hydroxypropylmethylcellulose phthalate, phthalcellulose acetate, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, carboxymethylethylcellulose, acrylic acid polymers, etc.), biodegradable polymers (thermally coagulated or crosslinked albumin, crosslinked) Gelatin, collagen, fibrin, polycyanoacrylate, polyglycolic acid, polylactic acid, polyβhydroxyacetic acid, polycaprolactone, etc.), and can be appropriately selected depending on the dosage form.
In particular, silicon, ethylene / vinyl acetate copolymer, ethylene-vinyl alcohol copolymer, methyl vinyl ether / maleic anhydride copolymer partial ester can be used for drug release control, and cellulose acetate is used as a material for osmotic pump. Ethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylcellulose, and methylcellulose can be used as membrane materials for sustained-release preparations, and polyacrylic crosslinked products can be used as oral mucosa or ocular mucosa adhesives.
In addition, depending on the dosage form (known dosage forms such as orally administered drugs, injections, suppositories, etc.) in the formulation, solvents, excipients, coating agents, bases, binders, lubricants, disintegration Additives such as agents, solubilizers, suspending agents, thickeners, emulsifiers, stabilizers, buffering agents, tonicity agents, soothing agents, preservatives, flavoring agents, fragrances, coloring agents, etc. Can be manufactured.
Each of these additives is exemplified with specific examples, but is not particularly limited thereto. Examples of the solvent include purified water, water for injection, physiological saline, peanut oil, ethanol, glycerin and the like. Examples of the excipient include starches, lactose, glucose, sucrose, crystalline cellulose, calcium sulfate, calcium carbonate, talc, titanium oxide, trehalose, xylitol and the like.
Examples of the coating agent include sucrose, gelatin, cellulose acetate phthalate, and the polymers described above. Examples of the base include petrolatum, vegetable oil, macrogol, oil-in-water emulsion base, and water-in-oil emulsion base.
Examples of the binder include starch and derivatives thereof, cellulose and derivatives thereof, natural polymer compounds such as gelatin, sodium alginate, tragacanth and gum arabic, synthetic polymer compounds such as polyvinylpyrrolidone, dextrin, hydroxypropyl starch and the like. it can.
Examples of the lubricant include stearic acid and salts thereof, talc, waxes, wheat starch, macrogol, hydrogenated vegetable oil, sucrose fatty acid ester, polyethylene glycol and the like. Disintegrators include starch and derivatives thereof, agar, gelatin powder, sodium bicarbonate, cellulose and derivatives thereof, carmellose calcium, hydroxypropyl starch, carboxymethylcellulose and salts thereof, and cross-linked products thereof, low-substituted hydroxypropylcellulose, and the like. Can be mentioned.
Examples of the solubilizer include cyclodextrin, ethanol, propylene glycol, polyethylene glycol and the like. Examples of the suspending agent include gum arabic, tragacanth, sodium alginate, aluminum monostearate, citric acid, and various surfactants. Examples of the thickener include carmellose sodium, polyvinyl pyrrolidone, methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, polyvinyl alcohol, tragacanth, gum arabic, sodium alginate and the like.
Examples of the emulsifier include gum arabic, cholesterol, tragacanth, methylcellulose, various surfactants, lecithin and the like. Examples of the stabilizer include sodium bisulfite, ascorbic acid, tocopherol, a chelating agent, an inert gas, and a reducing substance.
Examples of the buffer include sodium hydrogen phosphate, sodium acetate, boric acid and the like. Examples of isotonic agents include sodium chloride and glucose. Examples of soothing agents include procaine hydrochloride, lidocaine, benzyl alcohol and the like.
Examples of the preservative include benzoic acid and its salts, paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, reverse soap, benzyl alcohol, phenol, thimerosal, and the like. Examples of the corrigent include sucrose, saccharin, licorice extract, sorbitol, xylitol, glycerin and the like. Examples of fragrances include spruce tincture and rose oil. Examples of the colorant include water-soluble food dyes and lake dyes.
As described above, by making pharmaceutical products into DDS preparations such as sustained release preparations, enteric preparations or drug release control preparations, effects such as sustained effective drug concentration in the blood and improved bioavailability can be expected. . However, humanized antibodies can be inactivated or degraded in vivo, resulting in a decrease or disappearance of the desired effect. Therefore, the effect of an ingredient can be further sustained by using a substance that inhibits a substance that inactivates or degrades DDS in combination with a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of mesangial proliferative glomerulonephritis. These may be formulated into the formulation or may be administered separately. A person skilled in the art can appropriately identify a substance that inactivates or degrades DDS, selects a substance that inhibits the substance, and combines or uses it together.
In the preparation, components that are used in normal compositions can be used as additives other than those described above, and the amount of these components to be added should be a normal amount within a range that does not interfere with the effects of the present invention. it can.
Other monoclonal antibodies of the present invention can be used for immunostaining such as tissue or cell staining, immunoprecipitation, immunoblot, immunoassay such as competitive or noncompetitive immunoassay, radioimmunoassay, ELISA, latex agglutination, protein purification, affinity column, etc. Can also be used. When using the ELISA method, a sandwich type assay is preferable. The immunoassay includes all methods utilizing an immune reaction such as immunohistological examination, immunoblot, and immunoprecipitation.
The monoclonal antibody of the present invention can be a labeled antibody for use in an immunoassay. Enzymes, enzyme substrates, coenzymes, enzyme precursors, apoenzymes, fluorescent substances, dye substances, chemiluminescent compounds, luminescent substances, chromogenic substances, magnetic substances, metal particles, radioactive substances, etc. are used for labeling antibodies. be able to. For labeling, a reaction between a thiol group and a maleimide group, a reaction between a pyridyl disulfide group and a thiol group, a reaction between an amino group and an aldehyde group can be used.
The immunoassay using the monoclonal antibody of the present invention can use any form of solution, colloidal solution, non-fluid sample, etc. as a specimen or sample. For example, a sample derived from a living body, specifically, blood, plasma, joint fluid, cerebrospinal fluid, saliva, amniotic fluid, urine, other body fluids, cell culture fluid, tissue culture fluid, tissue homogenate, biopsy sample, cell, tissue, Examples include brain tissue, brain-derived cell line, nerve cell line, nerve-derived cell line, breast-derived cell line, breast tissue, ovary-derived cell line, ovarian tissue, cancer cell line, and cancer tissue.
Accordingly, the present invention also provides such hybridoma cell lines, immunoassays and test kits. Furthermore, the present invention provides a monoclonal antibody that specifically recognizes megsin, an immunoassay for detecting and quantifying megsin characterized by using this antibody, and a test kit for carrying out this immunoassay.
In addition, the monoclonal antibody obtained by the present invention has high specificity for megsin and is very useful in the detection and quantification of megsin.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples.
[Example 1]
a. Preparation of immunogen (recombinant megsin)
Known methods [Inagi, R .; et al. : Biochem. Biophys. Res. Commun. 286: 1098-1106, 2001], recombinant human megsin was obtained from the culture supernatant of Chinese hamster ovary (CHO) cells transfected with human megsin cDNA.
100 mL of 1M sodium acetate was added to 2 L of the culture supernatant to adjust the pH to 4.5, and then 50 mM sodium acetate was added to dilute it twice. The diluted solution was subjected to ion exchange chromatography (HiPrep 16/10 SP XL: manufactured by Amersham Biosciences) (elution condition: 50 mM sodium acetate (pH 4.5), NaCl 0 to 1 M linear gradient; elution volume: 20 × column) Bed volume). The eluate was subjected to buffer exchange by gel filtration (HiPrep 26/10 Desalting, 20 mM potassium phosphate (pH 6.8)), and then subjected to hydroxyapatite chromatography (HT-1: Bio-Rad) (elution conditions). : 20 mM potassium phosphate (pH 6.8), potassium phosphate 20-400 mM linear gradient; elution volume: 30 x column bed volume). The eluate was again subjected to buffer exchange by gel filtration (HiPrep 26/10 Desalting, 50 mM MES (pH 5.5), 50 mM NaCl), and subjected to ion exchange chromatography (MonoS HR 5/5: manufactured by Amersham Biosciences) ( Elution conditions: 50 mM MES (pH 5.5), 50 mM NaCl, NaCl 50-100 mM linear gradient; elution volume: 40 × column bed volume). The eluate was concentrated by centrifugation using Centricon 10 (Millipore) (3,000 g), and the buffer was exchanged with Dulbecco's PBS (-) buffer (Nissui Pharmaceutical). Centrifugal concentration and buffer exchange were repeated three times to obtain purified recombinant megsin. The chromatography apparatus used was AKTAexplorer 10s (manufactured by Amersham Bioscience), and all operations were performed at 4 ° C.
b. Immunization
For three 8 week-old female Balb / c mice, the antigen solution for immunization was mixed with Freund's complete adjuvant (made by DIFCO) 1: 1 and emulsified so that the megsin protein was about 50 μg / mouse. It was injected subcutaneously. Thereafter, approximately every 2 weeks, an antigen solution for immunization was mixed with Freund's incomplete adjuvant (manufactured by DIFCO) 1: 1 to prepare an emulsion so that the megsin protein was about 50 μg / mouse. Booster immunization was performed by injection. Three days after the second booster, blood was collected from the fundus vein and the antibody titer in the serum was measured by ELISA. About 2 weeks after the second booster immunization, mice with high antibody titers were mixed with Freund's incomplete adjuvant (manufactured by DIFCO) 1: 1 and emulsified to give megsin protein approximately Spleen cells from mice immunized were prepared by subcutaneous injection, adjusted to 50 μg / animal, and immunized 3 days later, and used for cell fusion.
c. ELISA method (direct solid phase method)
A protein solution of megsin protein prepared by the same method as that for the antigen for immunization was adjusted to 1 μg / mL with PBS and adsorbed overnight at 4 ° C. on an ELISA plate at 100 μL / well. After washing three times with a washing solution (PBS containing 0.05% tween 20 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries)), blocking was performed with Block Ace (manufactured by Snow Brand Milk Products) diluted 4-fold with PBS. After washing, the serum obtained in b above was diluted 5000 times with an antibody diluent (PBS containing 10-fold diluted Block Ace), added at 100 μL / well, and allowed to react at room temperature for 2 hours.
After washing the plate, peroxidase-labeled mouse IgG antibody (Chemicon) diluted 5000-fold was added in an amount of 100 μL / well and allowed to react at room temperature for 2 hours. 0.4 mg / mL of O-phenylenediamine (manufactured by Nacalai Tesque) in a substrate reaction solution (citrate-phosphate buffer pH 5.0 containing 0.2 μL / mL hydrogen peroxide solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries)) A substrate solution was prepared by dissolving to a concentration. The plate was washed 5 times with a washing solution, and the substrate solution was added to 100 μL / well. After reacting with the substrate solution for 30 minutes, 100 μL / well of 2N sulfuric acid was added to stop the reaction, and the absorbance at 490 nm was measured.
d. Cell fusion, hybridoma production
Three days after the final immunization, spleens were excised from 3 mice in which an increase in the antibody titer against megsin protein was observed as a result of the ELISA method, and splenocytes were prepared by a conventional method. The parental strain at the time of cell fusion was selected in advance in a medium containing 20 μg / ml of 8-azaguanine and confirmed to be a hypoxanthine / guanine / phosphoribosyltransferase (HGPRT) -deficient strain Myeloma SP2 cells derived from Balb / c mice The strain was used. SP2 cell 2 × 10⁷Individuals and splenocytes 1 × 10⁸The cells were combined, and polyethylene glycol 4000 (PEG 4000; manufactured by Merck) was used as a cell fusion promoter, and cell fusion was performed according to a conventional method.
Cells after fusion are 3.0 x 10 in terms of spleen cells⁸Suspension in a medium (HAT medium) containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine in an esculon medium (manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.) so that the number of cells / mL is 100 μL / well. did. The fused cells are CO₂Incubator (37 ° C, 5% CO₂) And culture was performed while changing the medium by half every 3 to 5 days. Only hybridomas that can be cultured in HAT medium were selectively cultured.
e. Hybridoma screening
In order to confirm the presence / absence of an antibody against the megsin protein in the culture supernatant of the well confirmed to have colony formation, c. Screening was carried out by the same ELISA method as shown in, and colonies that strongly reacted with the megsin protein were selected and subjected to cloning.
f. Hybridoma cloning
Hybridoma MS18a that produces an antibody that specifically binds to megsin protein by repeating cloning by a limiting dilution method three times for a hybridoma that produces an antibody that binds to megsin protein, and has stable growth ability A cell line was obtained. Each of these hybridoma cells was established on April 1, 2002 (original deposit date), 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki, Japan. On the other hand, it was deposited under the accession number FERM BP-8349 (Life Research Institute No. 8349).
g. Monoclonal antibody typing
The isotype was examined using Mouse Antibody Isotyping kit (Gibco BRL) using 0.5 mL of the culture supernatant of the hybridoma MS18a cell line obtained above. The isotype of the monoclonal antibody produced by the hybridoma MS18a cell line was IgG1 for the H chain and κ for the L chain.
h. Preparation and purification of monoclonal antibody (MS18a)
8 weeks old female Balb / c mice were intraperitoneally administered with 0.5 ml / unit of pristane, and 10 days later, the hybridoma MS18a cell line obtained by the cloning of d above was about 10 per mouse.⁷Cells were injected intraperitoneally at cell number / 0.5 mL / animal. Since about 10 days later, abdominal hypertrophy of the mice was observed, and ascites was collected after laparotomy. The collected ascites was centrifuged at 1000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes and then allowed to stand overnight at 4 ° C. After centrifugation at 12000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes, the obtained supernatant was purified from a monoclonal antibody (MS18a) using an affinity column Sepharose Protein A (Amersham Biosciences). The absorbance of this antibody solution at 260, 280, and 320 nm was measured, and the antibody concentration was measured by the Werburg-Christian method.
i. Confirmation of reactivity with megsin protein by Western blotting
A protein solution of megsin protein prepared in the same manner as the antigen for immunization is adjusted to 40 ng / lane with PBS, mixed with an equal amount of 2 × loading buffer (Daiichi Kagaku), and heated in a boiling bath for 5 minutes. This was used as a sample solution. The sample solution was electrophoresed on a 10-20% polyacrylamide gel (Daiichi Kagaku) using an SDS electrophoresis apparatus (Daiichi Kagaku) and Tris-Glycine buffer (Daiichi Kagaku).
On the other hand, during electrophoresis, 2 sheets of 3MM filter paper (manufactured by Whatman) for buffer B (Daiichi Kagaku), 1 sheet for buffer B (Daiichi Kagaku), and buffer C (Daiichi Kagaku) for blotting. 3 soaked in. Further, a polyvinylidene difluoride membrane (PVDF membrane, manufactured by Millipore) was immersed in methanol, and then immersed in purified water and allowed to adjust to water. For transfer of protein to PVDF membrane, the gel is removed from the apparatus after electrophoresis, two filter papers soaked in buffer A from the anode side in a blotter (manufactured by Pharmacia), one filter paper soaked in buffer B, PVDF The membrane, gel, and three filter papers soaked in buffer C were placed in the order listed and run at 80 mV for 1.5 hours. After the transfer, the PVDF membrane was blocked by shaking for 1 hour at room temperature with Block Ace (manufactured by Snow Brand Milk Products).
Thereafter, the membrane was reacted overnight at 4 ° C. with a monoclonal antibody MS18a diluted with an antibody diluent. Thereafter, alkaline phosphatase-labeled mouse IgG antibody was added, reacted for 1 hour at room temperature, and then developed with an NBT-BCIP solution. The results are shown in FIG.
Lane 1 shows plasmin, which is one of the ligands of megsin protein, lane 2 shows megsin protein, and lane 3 shows a mixture of megsin protein and plasmin. (A) is a reaction result with a monoclonal antibody having no neutralizing activity, and (b) is a reaction result with the monoclonal antibody MS18a of the present invention.
In lane 3 of (a), a band of the plasmin-megsin protein complex was confirmed, but not in the monoclonal antibody MS18a. This indicates that the monoclonal antibody MS18a reacts with the megsin protein alone but does not react with the complex of megsin protein and plasmin, which is one of the ligands of the megsin protein.
[Example 2] Neutralizing activity of megsin protein against plasmin enzyme activity inhibitory activity
Using the neutralizing activity for the reaction between megsin and plasmin, which is one of the megsin ligands, as an index, the neutralizing activity of the monoclonal antibody MS18a on the plasmin enzyme activity inhibitory action of the megsin protein was examined. For comparison, a monoclonal antibody that has been confirmed not to affect the activity of megsin was used.
A protein solution of megsin protein prepared in the same manner as the antigen for immunization was adjusted to 0.5 mg / mL with buffer P (0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8) containing 0.05% tween 20). 1 μL / well was added to a well black microplate (manufactured by NUNC), and h. 1 mg / mL of the MS18a antibody purified in step 1 was mixed at a ratio of 2: 1, 1: 1, and 1: 2 (molar ratio), and PBS was added to make a total volume of 4 μL / well. After reaction at room temperature for 1 hour, 1 μL / well of a plasmin (manufactured by SIGMA) solution prepared to 39 μg / mL with bufferP was added and mixed, and the mixture was further reacted at 37 ° C. for 30 minutes. A substrate solution (bufferP containing 0.526 mM Boc-Val-Leu-Lys-MCA (manufactured by Peptide Institute)) was added at 95 μL / well, reacted at room temperature for 1 hour, and then the fluorescence intensity (Ex 380 nm, Em 460 nm) was measured. It was measured.
In addition, plasmin only, plasmin and megsin, plasmin and MS18a, and fluorescence intensity of plasmin, megsin and MS18a minus the substrate solution only (blank) fluorescence intensity are FP, FPMeg, FP18, and FPMeg18, respectively. Thus, neutralization activity was determined. As shown in FIG. 3, monoclonal antibody MS18a neutralized the plasmin enzyme activity inhibitory action of megsin protein.
IMeg = (1-FPMeg / FP) × 100
I18 = (1-FPMeg18 / FP18) × 100
Neutralization activity (%) = (1-I18 / IMeg) × 100
[Example 3] MS18a antibody epitope mapping
a. Examination by ELISA method
A protein solution of megsin protein prepared by the same method as that for the antigen for immunization was adjusted to 1 μg / mL with PBS and adsorbed overnight at 4 ° C. on an ELISA plate at 100 μL / well. After washing 3 times with a washing solution (0.02% Tween 20 / PBS), blocking was performed with Block Ace diluted 4-fold with PBS. Separately, a peptide of 9 to 17 residues was synthesized by a conventional method centering on the cleavage site (P1-P1 ′) of the reactive loop region of the megsin protein (P17-P5 ′: EEGTEATAATGSNIVEKQLPQS / SEQ ID NO: 1) ( Table 1).
200 μg / mL of each of these peptides and h. 1 μg / mL of the monoclonal antibody MS18a purified in (1) was mixed at 1: 1 and reacted at room temperature for 30 minutes. Then, 100 μL / well of the reaction solution was added and reacted at room temperature for 2 hours. After washing the plate, 100 μL / well of alkaline phosphatase-labeled mouse IgG antibody (Chemicon) diluted 5000 times was added and allowed to react at room temperature for 2 hours.
Dissolve p-nitrophenyl phosphate disodium (SIGMA 104 phosphatase substrate) in a substrate reaction solution (9.6% diethanolamine buffer solution (pH 9.7) containing 0.5 mM magnesium chloride) to a concentration of 2 mg / mL. Then, a substrate solution was prepared. The plate was washed 5 times with a washing solution, and the substrate solution was added to 100 μL / well. After reacting with the substrate solution for 30 minutes, 100 μL of 3N NaOH was added to stop the reaction, and the absorbance at 405 nm was measured. A control was added with no peptide added and a peptide unrelated to the epitope added. A high absorbance indicates that the antibody has not reacted with the peptide. The results are shown in Table 1.

b. Examination of antibody epitope and neutralization activity by megsin inhibitory activity of monoclonal antibody MS18a
Of the peptides shown in Table 1, M107, M108, M111, and M112 were adjusted to 1 mg / mL with PBS among the peptides M107 to M112 in which a large change in absorbance was observed, and a 96-well black microplate (manufactured by NUNC) 1.5 μL / well and mixed with protein A purified monoclonal antibody MS18a (1 mg / mL, 1.5 μL / well). After reacting at room temperature for 1 hour, the protein solution of purified megsin protein was adjusted to 0.5 mg / mL with buffer P, and 1 μL / well was added and mixed. After reacting for 1 hour at room temperature, 1 μL / well of a plasmin (manufactured by SIGMA) solution prepared to 39 μg / mL with bufferP was added and mixed, and the mixture was further reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
A substrate solution (bufferP containing 0.526 mM Boc-Val-Leu-Lys-MCA (manufactured by Peptide Institute)) was added at 95 μL / well, reacted at room temperature for 1 hour, and then measured for fluorescence intensity (Ex 380 nm, Em 460 nm). did. It should be noted that plasmin alone, plasmin + megsin, plasmin + monoclonal antibody MS18a, and plasmin + megsin + monoclonal antibody MS18a fluorescence intensities obtained by subtracting the substrate solution only (blank) fluorescence intensity are FP, FPMeg, FP18, and The neutralizing activity was determined in the same manner as in Example 2 with FPMeg18 (FIG. 4).
From Table 1 and FIG. 4, the reaction with M107 and M112 decreased the neutralizing activity. This indicates that the antibody did not react with megsin but reacted with the peptide. An epitope common to M107 and M112 is NIVEKQ (SEQ ID NO: 4). Therefore, when the peptide NIVEKQ (SEQ ID NO: 4) was manipulated in the same manner as M107, M108, M111 and M112, the neutralizing activity decreased. Therefore, it was found that the epitope recognized by the monoclonal antibody MS18a of the present invention is NIVEKQ (SEQ ID NO: 4).
[Example 4] Specificity of monoclonal antibody MS18a
In order to confirm the specificity of the monoclonal antibody MS18a of the present invention for megsin protein, the reactivity of PAI-1 which is one of serpins and the monoclonal antibody MS18a was examined.
PAI-1 (manufactured by Molecular Innovations) adjusted to 0.2 mg / mL with 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8) was added to a 96-well microplate (manufactured by NUNC) at 2 μL / well, and 0.2 M Tris-HCl buffer ( 6 μL of PAI-1 antibody (manufactured by Biopool) adjusted to 5 mg / mL with pH 8) or 7 μL of monoclonal antibody MS18a adjusted to 4 mg / mL with 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8) were mixed. After reaction at room temperature for 1 hour, 0.9 μL of t-PA (Biopool) solution adjusted to 0.1 mg / mL with 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8) was added and mixed, and further reacted at 37 ° C. for 30 minutes. I let you. 200 μL of a synthetic substrate solution (1.25 mM HD-isoleucil-L-prolyl-L-arginine-p-nitroaniline dihydrochloride (manufactured by Chromogenix) was added, reacted at room temperature, and t-PA was measured at absorbance (405 nm). Enzyme activity was measured over time and the results are shown in FIG.
No color was observed in the sample obtained by adding the monoclonal antibody MS18a to PAI-1. That is, PAI-1 antibody neutralizes the ability of PAI-1 to inhibit t-PA activity, but monoclonal antibody MS18a did not show neutralizing activity against PAI-1, and PAI-1 reacted with t-PA. It was shown that.
[Example 5] Epitope mapping of anti-megsin monoclonal antibodies MS44b and 4F3 having no neutralizing activity
(1) The following E. coli expression fragmented megsin was prepared.

(2) Western blotting
The fragmented megsin prepared in (1) was electrophoresed and Western blotted to confirm bands that react with monoclonal antibodies MS44b and 4F3. The results are shown in Table 2. In the table, ◯ indicates that a band reacted with a monoclonal antibody was observed, and × indicates that no band was observed.

(3) ELISA using plates
Peptides were synthesized based on the fragmented Escherichia coli megsin data, immobilized on a plate (Kobalink NH module, manufactured by Nunk), and ELISA was performed as follows.
The synthetic peptide was solid-phased on the plate by the amine coupling method. After washing with the washing solution twice, Block Ace diluted 4 times with PBS is added for blocking. 100 μL / well of diluted antibody is added to the plate and allowed to react at room temperature for 2 hours. Furthermore, after washing | cleaning 4 times with a washing | cleaning liquid, 100 microliters / well of TMB was added, it was made to react for 30 minutes at room temperature, and the light absorbency in 450 nm was measured. The results are shown in Table 3.

(4) ELISA using competitive method
Megsin is immobilized on a 96-well ELISA plate. After washing twice with the washing solution, Block Ace diluted 4 times with PBS is added for blocking. After washing 4 times with the washing solution, the antibody (100 ng / mL) and the peptide (2 μg / mL) are mixed, 100 μL / well is added to each well, and the mixture is reacted at room temperature for 2 hours. After washing 4 times, 100 μL / well of diluted anti-mouse IgG antibody was added to the plate and reacted at room temperature for 2 hours. Further, after washing 4 times with a washing solution, TMB was added and reacted at room temperature for 30 minutes, 2N sulfuric acid was added to stop the reaction, and the absorbance at 450 nm was measured. The results are shown in Table 4.

(5) Measurement by biacore (trademark)
The peptide was immobilized on a CM5 chip by the amine coupling method, and the reactivity with the antibody was measured by biacore. The results are shown in Table 5.

From the above results, it was found that the monoclonal antibody 4F3 has an epitope in the range of 245-260, and the monoclonal antibody MS44b has an epitope in the range of 291-305. While the monoclonal antibody of the present invention having neutralizing activity recognizes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (corresponding to 343-348 in the amino acid sequence of megsin) as an epitope, the monoclonal antibody does not have neutralizing activity Was recognized as an epitope other than SEQ ID NO: 4, such as 245-260 or 291-305.
Industrial applicability
According to the present invention, a monoclonal antibody that neutralizes the activity of megsin was provided. Further, according to the present invention, it was confirmed that an antibody that binds to the reactive loop region of megsin can neutralize the activity of megsin. Megsin is a molecule that causes mesangial matrix expansion, mesangial cell proliferation, and immune complex deposition in the glomeruli. These lesions are pathological features characteristic of human mesangial proliferative glomerulonephritis. The expansion of the mesangial matrix is an important lesion in many kidney disorders, including mesangial proliferative nephritis. Therefore, monoclonal antibodies that neutralize the activity of megsin are useful in the treatment of diseases associated with mesangial substrate expansion.
The present invention also provides a therapeutic and / or prophylactic treatment of mesangial proliferative glomerulonephritis comprising a monoclonal antibody that neutralizes the activity of megsin, a variable region thereof, or an antibody variable region comprising a complementarity determining region thereof as an active ingredient. A composition is provided. As already mentioned, megsin causes mesangial proliferative glomerulonephritis. Therefore, antibodies that neutralize megsin are useful for the treatment or prevention of mesangial proliferative glomerulonephritis.
It should be noted that all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the difference in structure in three states of a reactive loop region that is an active site of serpin. (A): active type, (b): disconnected state, (c): underlying state.
FIG. 2 is a photograph of a stained image showing the results of Western blotting using the monoclonal antibody MS18a of the present invention.
FIG. 3 shows the neutralizing activity of the megsin protein against the plasmin enzyme activity inhibitory action of the monoclonal antibody MS18a of the present invention. In the figure, the vertical axis represents the ratio (%) of the enzyme activity neutralized by the monoclonal antibody, and the horizontal axis represents the mixing ratio between the type of monoclonal antibody and megsin.
FIG. 4 shows the influence of the reactive loop region peptide of megsin on the neutralizing activity of monoclonal antibody MS18a. In the figure, the vertical axis represents the ratio (%) of the enzyme activity neutralized by the monoclonal antibody, and the horizontal axis represents the type of synthetic peptide used for absorption of the monoclonal antibody.
FIG. 5 shows the reactivity of monoclonal antibody MS18a with PAI-1. (■) shows t-PA only, (●) shows t-PA + PAI-1 + PAI-1 antibody, (▲) shows t-PA + PAI-1, (♦) shows t-PA + PAI-1 + monoclonal antibody MS18a absorbance over time ( OD).

Claims (9)

メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体。A monoclonal antibody having megsin neutralizing activity. 配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体。A monoclonal antibody that recognizes an epitope constituted by a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. 請求項１または請求項２に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。A hybridoma cell line producing the monoclonal antibody according to claim 1 or 2. ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４９として寄託されたハイブリドーマＭＳ１８ａ。Hybridoma MS18a deposited as FERM BP-8349. ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４９として寄託されたハイブリドーマＭＳ１８ａが産生するモノクローナル抗体。A monoclonal antibody produced by hybridoma MS18a deposited as FERM BP-8349. ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４９として寄託されたハイブリドーマＭＳ１８ａを培養し、培養物に含まれるイムノグロブリンを回収する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。A method for producing a monoclonal antibody, comprising a step of culturing a hybridoma MS18a deposited as FERM BP-8349 and recovering an immunoglobulin contained in the culture. 次の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分の有効量を含有するメサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療、および／または予防のための組成物。
（ａ）メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｂ）配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｃ）ハイブリドーマＭＳ１８ａ株により産生されるモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｄ）（ａ）−（ｃ）のいずれかに記載の可変領域を構成する相補性決定領域を含む抗体またはその可変領域A composition for treating and / or preventing mesangial proliferative glomerulonephritis comprising an effective amount of any of the following components (a) to (d):
(A) a monoclonal antibody having megsin neutralizing activity or a variable region thereof (b) a monoclonal antibody that recognizes an epitope constituted by a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a variable region thereof (c) a hybridoma MS18a Monoclonal antibody produced by a strain or an antibody comprising the variable region according to any one of (d) (a)-(c) or an antibody comprising the variable determining region 次の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分をメグシンに接触させる工程を含む、メグシンの活性中和方法。
（ａ）メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｂ）配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｃ）ハイブリドーマＭＳ１８ａ株により産生されるモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｄ）（ａ）−（ｃ）のいずれかに記載の可変領域を構成する相補性決定領域を含む抗体またはその可変領域A method for neutralizing megsin activity, comprising the step of bringing the components according to any one of (a) to (d) below into contact with megsin.
(A) a monoclonal antibody having megsin neutralizing activity or a variable region thereof (b) a monoclonal antibody that recognizes an epitope constituted by a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a variable region thereof (c) a hybridoma MS18a Monoclonal antibody produced by a strain or an antibody comprising the variable region according to any one of (d) (a)-(c) or an antibody comprising the variable determining region 次の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分を有効成分として含有する、メグメグシンの活性中和剤。
（ａ）メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｂ）配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｃ）ハイブリドーマＭＳ１８ａ株により産生されるモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｄ）（ａ）−（ｃ）のいずれかに記載の可変領域を構成する相補性決定領域を含む抗体またはその可変領域An active neutralizing agent for megmegsin, containing as an active ingredient any of the following components (a) to (d):
(A) a monoclonal antibody having megsin neutralizing activity or a variable region thereof (b) a monoclonal antibody that recognizes an epitope constituted by a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a variable region thereof (c) a hybridoma MS18a Monoclonal antibody produced by a strain or an antibody comprising the variable region according to any one of (d) (a)-(c) or an antibody comprising the variable determining region

Images