JPWO2003054545A1 - 抗テロメラーゼ抗体の検出方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、疾患マーカーとなり得る抗テロメラーゼ抗体の検出方法の提供を目的とする。本発明の要旨は、テロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ、又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片と、生体試料中の抗テロメラーゼ抗体とを反応せしめ、反応生成物を解析することを特徴とする抗テロメラーゼ抗体の検出法に存する。生体試料中の抗テロメラーゼ抗体力価は、各種疾患の患者で健常者より有意に高く、病態を反映する疾患マーカーとなり得ることが明らかとなった。
Description
技術分野
本発明は、抗テロメラーゼ抗体の検出方法に関する。
背景技術
テロメアは、真核細胞の線状染色体末端の特殊な構造であり、染色体長の維持と染色体の安定性の維持に必須の役割を果たしている。テロメア構造は、テロメア反復配列と呼ばれるＴＴＡＧＧＧ配列が反復されてなる染色体の末端領域と、特異なＤＮＡ結合タンパク質とから構成される。テロメア配列部分のＤＮＡ複製は、通常の染色体複製とは異なり、テロメラーゼと呼ばれるＲＮＡタンパク質複合体によるＲＮＡ依存ＤＮＡ合成反応すなわち逆転写により行われる。
テロメラーゼは、正常細胞ではその活性が厳密に抑制されているが、癌細胞の９０％以上で活性が認められる。テロメラーゼ活性の律速因子であると同時にテロメラーゼ触媒成分であるテロメラーゼ逆転写酵素は、正常細胞への導入で細胞の不死化を誘導し、ある種の癌遺伝子との共導入により正常上皮細胞の悪性形質転換を引き起こす。この様に、テロメラーゼ逆転写酵素は、細胞の不死化と癌化に強い関わりがある。また、臨床的にも肝細胞においては前癌病変から癌に至る過程で有意にテロメラーゼ逆転写酵素の発現が上昇していることが報告されており、臨床的にも分子生物学的にも発癌過程におけるテロメラーゼ逆転写酵素の重要性が示唆されている。
テロメラーゼは特異的逆転写酵素である。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（以下これを「ｈＴＥＲＴ」と略称することがある）はテロメラーゼの触媒活性サブユニットとして同定され、その活性には鋳型ＲＮＡとしてヒトテロメラーゼＲＮＡサブユニット（以下これを「ｈＴＲ」と略称することがある）を必要とすることが知られている。しかし、これまで組換え型精製ｈＴＥＲＴとｈＴＲを用いたイン・ビトロ再構成系が報告されていなかったため、ｈＴＥＲＴとｈＴＲのみがテロメラーゼ活性の必要最少成分であるかどうか明らかではなかった。
本発明者等は先に、昆虫細胞発現系を用いて、可溶性組換え型ｈＴＥＲＴの発現・精製を行い、組換え型精製ｈＴＥＲＴを生化学的な方法を用いて分画し、約１２７ＫＤａの単一バンドとして精製した。精製ｈＴＥＲＴは、イン・ビトロで合成され精製したｈＴＲの存在下で量依存的なテロメラーゼ活性を示した。またｈＴＲプローブとしたゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）で、ｈＴＥＲＴはｈＴＲと量依存的に特異的複合体を形成することが示された。これらの結果より、ｈＴＥＲＴとｈＴＲの二つのサブユニットがテロメラーゼ活性の最少成分であることがイン・ビトロ再構成系で確認された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５；２２５６８−２２５７３（２０００））。
発明の開示
本発明は、生物学的機能を有する組換え型ヒトテロメラーゼ逆転写酵素の臨床応用、例えば該組換え型ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を抗原として用いる血中抗テロメラーゼ抗体の検出方法等の提供を目的としてなされたものである。
本発明者等は、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、担癌患者では、健常人と比較し、有意に血中抗ヒトテロメラーゼ抗体が高値であることを見出した。また、慢性肝疾患患者の血中抗ヒトテロメラーゼ抗体は、慢性肝炎、肝硬変、肝癌と、病気が進行するに従い、有意に上昇することを見出した。また、他の疾患での検討を行ったところ自己免疫疾患患者において高い抗体反応性が見出された。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
即ち、本発明によれば、（１）テロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ、又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片と、生体試料中の抗テロメラーゼ抗体とを反応せしめ、反応生成物を解析することを特徴とする抗テロメラーゼ抗体の検出方法が提供される。
この発明の好ましい態様により、（２）テロメラーゼを構成するタンパク質が、テロメラーゼ逆転写酵素である上記（１）に記載の方法；（３）反応生成物の解析が、ウエスタンブロッティング法又は免疫酵素抗体法により行われる上記（１）又は（２）に記載の方法；（４）抗テロメラーゼ抗体の検出結果を疾患マーカーとして用いる上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法；（５）疾患マーカーが、腫瘍マーカーである上記（４）に記載の方法、（６）疾患マーカーが、自己免疫疾患マーカーである上記（４）に記載の方法が提供される。
また、本発明の別の態様により、（７）少なくともテロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ、又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片を含んでなる上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法を行うための試薬キットが提供される。
この発明の好ましい態様により、（８）テロメラーゼを構成するタンパク質が、テロメラーゼ逆転写酵素である上記（７）に記載の試薬キットが提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明で抗原として用いられるテロメラーゼは、抗テロメラーゼ抗体と反応し得るものであれば如何なる由来のものでも良いが、具体的には、テロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ、又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片が挙げられる。テロメラーゼは、テロメア反復配列を複製し得る能力を有するものであれば、如何なるものでも用いることができる。テロメラーゼを構成するタンパク質としては、例えばテロメラーゼ逆転写酵素が挙げられ、この逆転写酵素を抗原として用いるのが好ましい。テロメラーゼ逆転写酵素としては、例えばＭａｔｔｈｅｗ Ｍｅｙｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．９０，７８５−７９５，Ａｕｇｕｓｔ ２２，１９９７に記載されている配列を有するものが挙げられる。これらの中で、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するものが特に好ましい。
ここで、本明細書における「テロメラーゼ逆転写酵素」には、生物（動物、植物、及び微生物を含む）由来の天然のテロメラーゼ逆転写酵素（すなわち、鋳型ＲＮＡ（ＴＲ）と一緒になってテロメラーゼを構成するタンパク質であって、しかも、鋳型ＲＮＡ（ＴＲ）の存在下において逆転写触媒活性を有し、テロメア反復配列を複製する能力を有するタンパク質）が含まれる。また、例えば、それらの機能的等価改変体［すなわち、天然のテロメラーゼ逆転写酵素のアミノ酸配列において１又はそれ以上（好ましくは１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、天然テロメラーゼ逆転写酵素と同じ機能を有するタンパク質］、あるいは、天然のテロメラーゼ逆転写酵素の部分断片、機能的等価改変体の部分断片、あるいは、天然のテロメラーゼ逆転写酵素又はそれらの機能的等価改変体と融合用パートナー（例えば、検出用タンパク質、例えばＦＬＡＧペプチド又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）との融合タンパク質等が含まれる。
抗原として用いるテロメラーゼ逆転写酵素は、それをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し、該ベクターを有する形質転換体を培養して、タンパク質を発現させることにより調製できる。
該ＤＮＡのベクターへの導入は、それ自体既知の通常用いられる方法、例えばＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｍ．Ｃｏｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９８）１６，１２１７−１２２２に記載されている方法により行うことができる。かくして調製されるテロメラーゼ逆転写酵素をコードするＤＮＡを有するベクターとして、例えばｐＣＩ−ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴ−ＨＡ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９８）１６，１２１７−１２２２）、ｐＣＩ−Ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５；２２５６８−２２５７３（２０００））等が挙げられる。これらのベクターは、配列番号１に記載のＤＮＡを有するものである。
テロメラーゼ逆転写酵素の発現方法は、特に限定されるものではなく、イン・ビトロトランスレーション法や組換え体による発現法等の如何なる方法を用いても良い。発現産物がテロメラーゼの生理活性を維持していれば、テロメラーゼ活性の測定で真の抗体やその抗体の状況を判断することが可能となる。テロメラーゼの生理学的特徴から、従来のコンストラクションや通常の動物細胞での発現では、機能性のあるテロメラーゼ或いはテロメラーゼ触媒成分ｈＴＥＲＴの量的な精製が困難であった。しかし、本発明者等により開発された昆虫細胞を用いる発現方法、中でも下記のコンストラクションおよび調製方法（ＷＯ０１／５７２２７号公報）を用いれば、生物学的機能を有する物が取得できる。
具体的には、例えば、昆虫細胞を用いてテロメラーゼ逆転写酵素を発現させることによりテロメラーゼ逆転写酵素を合成する工程（以下「合成工程」と称することがある）と、昆虫細胞内で発現されたテロメラーゼ逆転写酵素を、特定の界面活性剤を用いて可溶化する工程（以下「可溶化工程」と称することがある）とを含む方法により調製できる。
合成工程に用いることのできるバキュロウイルスは、通常のバキュロウイルス発現系に用いることのできるバキュロウイルスである限り、特に限定されるものではなく、例えば、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ；以下、「ＮＰＶ」と称する）（ＢｍＮＰＶ）又はカリフォルニアギンウワバ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）を挙げることができる。
テロメラーゼ逆転写酵素をコードするＤＮＡを含む組換えバキュロウイルスを調製するために使用するバキュロウイルス発現ベクター（すなわち、トランスファーベクター）としては、バキュロウイルス由来のトランスファーベクター、例えば、ｐＶＬ１３９２又はｐＶＬ１３９３等を挙げることができる。
合成工程に用いることのできる宿主は、通常のバキュロウイルス発現系に用いることのできる昆虫細胞である限り、特に限定されるものではなく、例えば、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）由来培養細胞、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来培養細胞、又はカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）由来培養細胞を挙げることができる。
より高い発現量を達成することができる点で、イラクサギンウワバ由来培養細胞が好ましく、イラクサギンウワバの卵細胞に由来する培養細胞がより好ましく、イラクサギンウワバの卵細胞を、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，８，３９１−３９６，１９９２又はＩｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．＆Ｄｅｖ．，２９Ａ，３８８−３９０，１９９３に記載の方法に従って処理することにより得られる培養細胞が更に好ましく、Ｈｉｇｈ５細胞（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，８，３９１−３９６，１９９２；Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．＆Ｄｅｖ．，２９Ａ，３８８−３９０，１９９３）が特に好ましい。Ｈｉｇｈ５細胞は、例えば、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社（商品番号：ＢＴＩ−ＴＮ−５ＢＩ−４）から市販されている。
上記トランスファーベクターに、テロメラーゼ逆転写酵素をコードするＤＮＡを導入することにより、テロメラーゼ逆転写酵素をコードするＤＮＡを含むトランスファーベクターを構築した後、常法に従って、前記ベクターとバキュロウイルスとの相同組換えを実施することにより、テロメラーゼ逆転写酵素をコードするＤＮＡを含むバキュロウイルスを調製することができる。
合成工程における感染の際の感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ｍ．ｏ．ｉ．）は特に限定されるものではないが、例えば、０．１〜１０、好ましくは０．１〜０．３又は５〜１０、より好ましくは０．１〜０．３になるように感染を実施することができる。なお、通常のバキュロウイルス発現系においては、５〜１０が至適条件であるとされている。
合成工程では、感染後の培養期間も特に限定されるものではないが、例えば、２〜８日間、好ましくは４〜６日間培養を行なうことができる。なお、通常のバキュロウイルス発現系においては、２〜３日間が至適条件であるとされている。
合成工程において昆虫細胞内で発現されたテロメラーゼ逆転写酵素は、不溶性の状態で細胞内に蓄積しており、単に、緩衝液中で細胞を破砕しても、不溶状態のままであって、そのままでは精製操作を実施することはできない。
可溶化工程では、上記合成工程で得られた昆虫細胞、あるいは、その細胞破砕物を、Ｎ−Ｄ−グルコ−Ｎ−メチルアルカンアミドを含有する水溶液（以下「可溶化溶液」と称することがある）で処理することにより可溶化する。可溶化工程で用いるＮ−Ｄ−グルコ−Ｎ−メチルアルカンアミドには、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−８）、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−９）、及びｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０）が含まれる。
可溶化工程で用いるＮ−Ｄ−グルコ−Ｎ−メチルアルカンアミドの濃度は、テロメラーゼ逆転写酵素を可溶化することのできる濃度である限り、特に限定されるものではないが、例えば、０．５〜２重量％、好ましくは０．５〜１重量％であることができる。
上記可溶化溶液は、所望により、塩、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、及び／又はグリセロールなどを更に含有することができる。ここで、塩としては、タンパク質精製に一般に用いられる塩、例えば、アルカリ金属又はアルカリ土類金属のハロゲン化物を挙げることができる。プロテアーゼ阻害剤としては、例えば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチン、アンチパイン、フェナンスロリン、又はベンズアミドを挙げることができる。また、還元剤としては、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又は２−メルカプトエタノールを挙げることができる。
可溶化溶液における塩、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、グリセロール等の濃度は、テロメラーゼ逆転写酵素を可溶化することのできる濃度である限り、特に限定されるものではない。また、可溶化溶液のｐＨは、テロメラーゼ逆転写酵素の生物学的活性を消失することのないｐＨである限り、特に限定されるものではないが、中性付近のｐＨ（例えば、ｐＨ７．２〜７．８）であることが好ましい。
可溶化工程において、可溶化の対象である昆虫細胞又はその細胞破砕物を、前記可溶化溶液で処理する方法は、前記可溶化対象物に含まれるテロメラーゼ逆転写酵素を可溶化することができる限り、特に限定されるものではない。
例えば、可溶化対象物が懸濁液である場合には、その懸濁液と可溶化溶液とを一緒にした後、充分に混合することにより行なうことができる。また、可溶化対象物が固形物（例えば、遠心した後、上清を除去することにより得られる沈殿物）である場合には、その固形物と可溶化溶液とを一緒にした後、充分に混合することにより行なうことができる。
上記可溶化工程により得られた溶液には、可溶化されたテロメラーゼ逆転写酵素が含まれている。この溶液をそのままテロメラーゼ逆転転写酵素含有画分として用いることもできるし、あるいは、公知のタンパク質精製方法（例えば、硫安塩析、クロマトグラフィー、透析、及び／又は凍結乾燥等）を用いて、更にテロメラーゼ逆転写酵素を精製することもできる。
テロメラーゼ逆転写酵素の精製には、それ自体既知の上記タンパク質精製方法以外にも、例えば、ヘパリンセファロース又はポリ（Ｕ）−セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。
テロメラーゼ逆転写酵素の調製において、合成工程で得られた昆虫細胞又はその細胞破砕物に対して、予備処理（例えば、部分精製処理）を実施することなく、そのまま、可溶化工程を実施することもできるし、あるいは、昆虫細胞の細胞破砕物を部分精製処理することにより得られた細胞破砕物に関して分画処理を行ない、得られた画分に対して、可溶化工程を実施することもできる。可溶化工程に先だって、適当な部分精製処理を実施すると、可溶化工程により得られるテロメラーゼ逆転転写酵素含有溶液に対して実施する精製操作を省略又は簡略化することができる。
例えば、合成工程で得られた昆虫細胞を破砕した後、その細胞破砕物を遠心して上清を除去し、残った沈澱に対して、可溶化工程を実施することができる。この場合には、細胞破砕物に含まれていた可溶性タンパク質が、前記上清と一緒にほとんど除去されるので、前記沈澱を可溶化処理して得られるタンパク質画分（テロメラーゼ逆転写酵素を含む画分）を更に精製する際に、可溶性タンパク質を分離する操作を省略又は簡略化することができる。
あるいは、合成工程で得られた昆虫細胞を破砕した後、その細胞破砕物を遠心して第１の上清を除去し、残った第１の沈澱を、Ｎ−Ｄ−グルコ−Ｎ−メチルアルカンアミド以外の界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００、ＮＰ−４０、又はＣＨＡＰＳ（３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））を含む緩衝液で処理した後、再び、遠心して第２の上清を除去し、残った第２の沈澱に対して、可溶化工程を実施することができる。この場合には、細胞破砕物に含まれていた可溶性タンパク質が前記第１の上清と一緒にほとんど除去され、続いて、前記第１の沈澱に残っていた前記界面活性剤により可溶化するタンパク質も前記第２の上清と一緒にほとんど除去されるので、前記第２の沈澱を可溶化処理して得られるタンパク質画分（テロメラーゼ逆転写酵素を含む画分）を更に精製する際に、可溶性タンパク質及び前記界面活性剤により可溶化するタンパク質を分離する操作を省略又は簡略化できる。
このようにして得られたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）と、別に調製した鋳型ＲＮＡ（ＲＴ）とを、例えば、イン・ビトロで一緒にすることにより、テロメラーゼを再構成することができる。かくして、生物学的機能を有するテロメラーゼ逆転写酵素を調製することができる。
本発明の抗テロメラーゼ抗体の検出方法は、前記の通り、少なくともテロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ、又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片と、生体試料中の抗テロメラーゼ抗体とを反応せしめ、反応生成物を解析することを特徴とするものである。
抗体の検出に用いることができる生体試料としては、全血、血清、血漿、腹水、胸水、脊髄液、組織や細胞およびそれらの培養物、尿等が挙げられる。
抗テロメラーゼ抗体の検出に用いられる抗原としては、上記の通り、少なくともテロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ、又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片が挙げられる。これらの中で、テロメラーゼ逆転写酵素又はその部分断片がより好ましい。また、抗原として用いるテロメラーゼ逆転写酵素は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するものが特に好ましい。
上記抗原と生体試料に加えて、生体試料中の抗テロメラーゼ抗体とを反応せしめ、その反応生成物を解析、即ち反応生成物を検出又は定量する方法としては、それ自体既知の通常用いられる免疫学的な検出又は定量法が用いられる。
免疫学的検出又は定量法としては、免疫酵素抗体法［Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）］、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、赤血球凝集反応法、ラテックス凝集反応法、リポソーム凝集法等が挙げられる。また、抗原に対しての抗体の結合を非ラベルで表面プラズモン共鳴や水晶発振機を用いて直接的に検出する方法等も用いることができる。さらには、生体試料、例えば血清や尿の前処理を行うことにより一層感度を上げることができる。抗体の検出又は定量は、たとえば最終的な反応を酵素反応、蛍光、化学発光、放射能等からの信号を検出又は定量することにより行えばよい。これらの方法は、例えば単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック、１９８７年）、続生化学実験講座５免疫生化学研究法（東京化学同人、１９８６年）の記載に準じて容易に実施することができる。
具体的には、例えば、免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）とは、上記抗原と生体試料中の抗テロメラーセ抗体を反応させ、反応生成物に、さらにペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識などを施した抗体あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）とは、上記抗原と生体試料中の抗テロメラーゼ抗体を反応させ、さらに反応生成物に、放射線標識を施した抗体あるいは結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
ウェスタンブロッティング法とは、上記抗原をＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜等にブロッティングし、該膜に生体試料を添加して抗テロメラーゼ抗体と反応させ、さらに反応生成物に、ＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗体あるいは結合断片を反応させた後、確認する方法である。
上記した本発明の方法を用いて、ヒト血中の抗テロメラーゼ抗体を解析した結果、担癌患者、自己免疫疾患の患者では健常者に比し、有意に血中抗テロメラーゼ抗体が高値であることが本発明者等により始めて確認された。従って、血中抗テロメラーゼ抗体は、各種の疾患のマーカー、例えば腫瘍マーカー、自己免疫疾患マーカーとなり得ると考えられる。また、生体試料中の抗テロメラーゼ抗体を検出又は定量し、健常者の値と比較し、例えば健常者より有意に高値である場合は、例えば、発癌状態、自己免疫疾患である可能性があると判定できる。
上記した本発明の抗テロメラーゼ抗体の検出法に用いる試薬キットは、少なくとも抗原としてテロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ、又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片を含み、通常の免疫反応を利用したキットと同様の構成によって提供される。抗原としては、テロメラーゼ逆転写酵素又はその部分断片が好ましい。また、抗原として用いるテロメラーゼ逆転写酵素は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するものが特に好ましい。本発明の試薬キットは、少なくとも上記抗原を含み、さらに任意の要素として、試料希釈液、洗浄液、標識化抗体、色素、陽性コントロール用の抗体等を含んでいてもよい。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の調製
（１）プラスミドの構築
ｈＴＥＲＴのｃＤＮＡ（配列番号１）を含むプラスミドｐＣＩ−Ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５；２２５６８−２２５７３（２０００））を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及び制限酵素ＳａｌＩで切断することにより、上記ｈＴＥＲＴ−ｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ−ＤＮＡ断片を得た。このＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ−ＤＮＡ断片を、プラスミドｐＮＫＦＬＡＧＺのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＮＫＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴを構築した。前記プラスミドｐＮＫＦＬＡＧＺは、プラスミドｐＮＫＦＬＡＧ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１５４７９−１５４８６，１９９８）のＦＬＡＧ配列ｃＤＮＡの３’端がイン・フレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）となってＥｃｏＲＩとＳａｌＩ部位に接続する配列に改変したものである。
得られたプラスミドｐＮＫＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴは、ｈＴＥＲＴのＮ末端にＦＬＡＧペプチドが標識されたＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質（ＦＬＡＧ標識ｈＴＥＲＴ）をコードするＤＮＡを含む。
上記プラスミドｐＮＫＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴを、制限酵素ＮｏｔＩ及び制限酵素ＢｇｌＩＩで切断することにより、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩ−ＤＮＡ断片を得た。このＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩ−ＤＮＡ断片を、バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）のＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＢＹＫ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴを構築した。
（２）組換え型バキュロウイルスの作成
組換え型バキュロウイルスの作成は、市販のキット［ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄスターターパッケージ（Ｓｆ９昆虫細胞及びＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ線状化バキュロウイルスＤＮＡを含む）；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社］を用いて、以下の手順で実施した。
すなわち、１０％のウシ胎児血清を添加したＴＮＭ−ＦＨ昆虫細胞培養液（シグマ社）中で、Ｓｆ９細胞を懸濁培養した後、トランスフェクションの３０分前に、９ｃｍ２シャーレ当たり１０６個になるようにＳｆ９細胞をシャーレに蒔種した。続いて、前記キットに添付の説明書に従って、上記実施例１（１）で調製したプラスミドｐＢＹＫ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ（２．５μｇ）と、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ線状化バキュロウイルスＤＮＡ（０．２５μｇ）との混合液を用いて、共トランスフェクションを行なった。共トランスフェクションを実施した後、２７℃で５日間培養し、その培溶液上清を回収した。回収した培養液上清とＳｆ９細胞とを用いて、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質を発現する組換え型バキュロウイルスＢＶＫＭ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ株の増幅を行なった。Ｓｆ９細胞を用いたウイルスの力価の測定は、キットに添付の説明書に基づいて実施した。以下の実験には、高力価（１．０×１０７ｐｆｕ／ｍＬ以上）の組換え型バキュロウイルスＢＶＫＭ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ株を使用した。組み換え型バキュロウイルスＢＶＫＭ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ株は、４℃保存下で約６か月以上は安定であり、その後、ウイルスの力価は減少した。
（３）種々の昆虫細胞におけるＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の発現量の評価
昆虫細胞として、実施例１（２）で用いたのと同じＳｆ９細胞と、Ｈｉｇｈ５細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とを用いて、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の発現レベルを比較した。Ｓｆ９細胞の培地としては、前記実施例１（２）で用いたのと同じ１０％ウシ胎児血清含有ＴＮＭ−ＦＨ昆虫細胞培養液を使用し、Ｈｉｇｈ５細胞の培地としては、市販の培地（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ無血清培地；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１０％ウシ胎児血清を添加したものを使用した。前記実施例１（２）で調製した組換え型バキュロウイルスＢＶＫＭ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ株を、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）が２となるように感染させ、感染後、２７℃で３日間培養した。
（４）感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）及び感染後の培養時間の各至適条件の決定
昆虫細胞としてＨｉｇｈ５細胞を用いて、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）及び感染後の培養時間の各至適条件を決定した。
一般的に、組み換え型バキュロウイルスの感染時の感染多重度は、５〜１０が至適であるとされている。しかし、異なる感染多重度で組換え型バキュロウイルスＢＶＫＭ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ株を感染させた場合、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の発現量は、感染時の感染多重度が０．２の条件において、感染多重度が５〜１０の場合と同程度であるか、あるいは、より高かった。感染多重度が０．２より更に低い０．１〜０．０２となった場合には、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の収量が低下したので、最適な感染多重度は約０．２近辺と思われた。
感染多重度が０．２となるように感染させた後、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、又は１４４時間培養した各昆虫細胞の全細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分画し、ＣＢＢにより染色した。その結果、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の発現レベルが最高となるのは、感染後４〜６日後であった。
（５）ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の発現及び精製
市販の培地（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ無血清培地；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養したＨｉｇｈ５昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、１．０×１０７個になるように５×２５ｃｍ２シャーレに蒔種した後、実施例１（２）で調製した組換え型バキュロウイルスＢＶＫＭ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ株を、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）が０．２となるように感染させた。感染後、２７℃で５日間培養した。
感染後、５日間培養した前記細胞をシャーレから剥がし、リン酸緩衝化生理食塩水［以下、「ＰＢＳ（−）」と称する］に懸濁し、４，０００回転で１０分間遠心した。
以下、本工程の全ての操作は４℃で行ない、使用した全ての緩衝液には、１ｍｍｏｌ／Ｌフッ化フェニルメチルスルフォニル（シグマ社）、１０ｍｇ／ｍＬペプスタチンＡ（シグマ社）、１０ｍｇ／ｍＬロイペプチン（シグマ社）、１０ｍｇ／ｍＬアプロチニン（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＩＭ社）、１０ｍｇ／ｍＬフェナンスロリン（Ｓｉｇｍａ）、１６ｍｇ／ｍＬベンズアミド（Ｓｉｇｍａ）、及び１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール（Ｎａｋａｒａｉ社）を添加した。また、コントロールとして、組換え型バキュロウイルスＢＶＫＭ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ株非感染の昆虫細胞についても、同様の精製操作を実施した。
遠心により回収した前記細胞を、ＰＢＳ（−）で一度洗浄した後、バッファーＡ［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２０％グリセロール，０．１％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，１０ｍｍｏｌ／Ｌ−β−メルカプトエタノール］５ｍＬに懸濁し、超音波破砕（１０秒間）を３回行なった。１０，０００ｇで１０分間遠心した後に、上清（以下、「Ｓ１画分」と称する）を分取し、沈降物を再びバッファーＡ（５ｍＬ）に懸濁した。
上記懸濁液を１０，０００ｇで１０分間遠心した後に、上清（以下、「Ｓ２画分」と称する）を分取し、沈降物をライシス（ｌｙｓｉｓ）バッファーＢ［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０％グリセロール，０．５％ＭＥＧＡ−９，５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，１０ｍｍｏｌ／Ｌ−β−メルカプトエタノール］１ｍＬに懸濁し、超音波破砕（１０秒間）を３回行なった。
得られた懸濁液を、再び、１０，０００ｇで１０分間遠心した後、上清（以下、「Ｓ３画分」と称する）を分取し、残った沈降物をライシスバッファーＣ［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０％グリセロール，０．５％ＭＥＧＡ−９，１０００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，１０ｍｍｏｌ／Ｌ−β−メルカプトエタノール］１ｍＬに懸濁し、超音波破砕（１０秒間）を３回行なった。
得られた懸濁液を、１０，０００ｇで１０分間遠心した後、上清（以下、「Ｓ４画分」と称する）を分取し、先に分取したＳ３画分と、このＳ４画分とを一緒にした。この混合液を、バッファーＤ［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０％グリセロール，０．５％ＭＥＧＡ−９，１ｍｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール（ＤＴＴ）］を用いて、塩化ナトリウムの最終濃度が３００ｍｍｏｌ／Ｌになるように希釈した（以下、「Ｓ５画分」と称する）。
このＳ５画分を、バッファーＥ［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０％グリセロール，０．５％ＭＥＧＡ−９，３００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＤＴＴ］で平衡化したＤＮＡセファロース（ＬＫＢ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）カラム（１．０ｍＬパック量）に通した。その通過液画分を、前記バッファーＥで平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ及びセファロースＣＬ−６Ｂ混合物（ヘパリン−セファロースＣＬ−ＢとセファロースＣＬ−６Ｂとを１：１の重量比で混合したもの：以下、単に「ヘパリン−セファロース」と称する）１ｍＬと混合し、４℃で３〜４時間回転撹拌を行なった。
ヘパリン−セファロースに結合したタンパク質を低速遠心で回収した後、バッファーＥで洗浄し、バッファーＢ（２ｍＬ）で溶出することにより、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の精製品を得た。タンパク質を定量するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分画し、ＣＢＢで染色した。タンパク質濃度を測定する標準標品としては、牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社）を用いた。
得られた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ゲル濃度＝８％）で分画した後、ＣＢＢ染色又は抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロットを行ない、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の検出を行った。
その結果、昆虫細胞のタンパク質の殆どは、低濃度のＮＰ−４０、グリセリン、及び塩化ナトリウムを含む緩衝液（バッファーＡ）で溶出された（Ｓ１画分及びＳ２画分）。一方、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質は、ＭＥＧＡ−９及び高塩濃度を含む緩衝液（ライシスバッファーＢ）を用いた場合にのみ、効率的に溶出された（Ｓ３画分）。
実施例２：テロメラーゼのイン・ビトロ再構成及びテロメラーゼ活性の測定
（１）テロメラーゼのイン・ビトロ再構成
実施例１で調製した組換え型ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質が、ヒトテロメラーゼの触媒活性を有することを直接的に証明するために、前記ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質と、精製したヒトテロメアＲＮＡ（ｈＴＲ）とが、イン・ビトロで再構成してテロメラーゼ活性を示すかどうかを評価した。なお、テロメラーゼ活性は、異なる２種類の方法、すなわち、市販のキット（ＴｅｌｏＣｈａｓｅｒ；東洋紡）を用いるテロメア反復配列増幅プロトコール法（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ Ｒｅｐｅａｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ａｓｓａｙ；以下、「ＴＲＡＰアッセイ」と称する）と、市販のＥＬＩＳＡテロメラーゼ測定キット（ＴＲＡＰＥＺＥキット；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社）を用いるＴＲＡＰ−ＥＬＩＳＡ法とにより実施した。２種類の前記方法の内、後者のＴＲＡＰ−ＥＬＩＳＡ法は、テロメラーゼ活性を相対的活性として定量化することが可能である。
まず、ｈＴＲ−ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＧＲＮ１６４（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，１２３６−１２４１，１９９５）を鋳型として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるイン・ビトロ転写系により、ｈＴＲを合成した。
得られたｈＴＲと、前記実施例１で調製したＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質とを、種々の量で、再構成緩衝液Ａ［最終濃度：１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０），１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，２５％グリセリン，１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム，３ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム，０．１ｍｍｏｌ／Ｌフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ），１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＤＴＴ，１０Ｕ／μｌリボヌクレアーゼインヒビター（ＲＮａｓｉｎ）］２０μｌ中で、１０分間反応させる（温度＝３３℃）ことにより、イン・ビトロ再構成を行なった。
（２）ＴＲＡＰアッセイによるテロメラーゼ活性の測定
市販のキット（ＴｅｌｏＣｈａｓｅｒ；東洋紡）を用いてＴＲＡＰアッセイを行った。なお、ＴＲＡＰアッセイは、前記キットに添付の説明書に従って実施し、得られたＰＣＲ産物を、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動により分画した後、染色試薬［ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社］で可視化した。
その結果、テロメラーゼ活性は、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質とｈＴＲとを加えた場合にのみ観察され、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質のみではテロメラーゼ活性を示さなかった。この結果は、この２成分の機能的再構成によりテロメラーゼ活性が観察されたことを明示する。また、この結果は、ｈＴＥＲＴとｈＴＲとがテロメラーゼ活性に充分で最少限の成分であることを明らかに示した。
さらに、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質（１２０ｎｇ）とｈＴＲ（２００ｎｇ）とを用い、上記（１）に記載の方法に準じて、異なる反応時間でイン・ビトロ再構成を行い、ＴＲＡＰアッセイを実施した。
その結果、３３℃の条件下において、テロメア合成は約１０分後に観察され、その後、１時間は見かけ上直線的に持続した。プライマーと基質なしに前もって３３℃処理を行なった場合も、同様のテロメア合成の潜伏時間が観察されたことは、プライマーと基質が加えられた後にＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の重要な構造変換が起きることを示唆している。
ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の触媒活性は、３０℃〜３７℃の間で、ｐＨは８．０近傍で最高であり、３ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオンを要求した。ＴＩＧ３細胞抽出液を用いた相補実験でＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質によるテロメラーゼ活性の反応でも、同一の至適条件であった。
（３）ＴＲＡＰ−ＥＬＩＳＡ法によるテロメラーゼ活性の測定
上記（２）で実施したＴＲＡＰアッセイは、感度が良いが、テロメラーゼの定量には適さないので、異なった量比のＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質とｈＴＲとの存在下でイン・ビトロで再構成されたテロメラーゼ活性の定量を、市販のキット（ＴＲＡＰＥＺＥキット；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社）を用いるＴＲＡＰ−ＥＬＩＳＡ法により行なった。ＴＲＡＰ−ＥＬＩＳＡ法は、キットに添付の説明書に従って、以下に示す手順で実施した。
すなわち、イン・ビトロ再構成を、再構成緩衝液Ｂ［最終濃度：１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０），１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，２５％グリセリン，１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム，３ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＰＭＳＦ，１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＤＴＴ，１０Ｕ／μｌ−ＲＮａｓｉｎ，２ｎｇ／μｌ−ＴＳ−プライマー，１ｍｍｏｌ／Ｌ未標識ｄＡＴＰ，１ｍｍｏｌ／Ｌ未標識ｄＴＴＰ，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未標識ｄＧＴＰ，０．１μＣｉ／ｎＬ［α−３２Ｐ］標識ｄＧＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）］２０μｌ中で、３３℃で１時間行なった後、反応液中の１０μｌを採取してＤＥ８１フィルターにスポットし、続いて、フィルターを洗浄し、フィルターに結合した放射能を既に報告されている方法に従って測定した。
その結果、テロメラーゼ活性は、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質及びｈＴＲの２成分が当モル比の場合に最高であった。このことは、２成分の効率的な複合体形成を示唆している。
以上の通り、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質は、テロメラーゼ活性を有することが確認された。
実施例３；血中抗ヒトテロメラーゼ抗体の検出（１）
（１）患者および使用血清
総数８３人（年齢４０〜８２歳）の患者血清および健常者血清を用いて、抗体の検出を行った。これらには肝細胞癌３０症例、１６症例の肝硬変、７症例の慢性肝炎と、悪性疾患１２症例を含む。なお、対象コントロールとして健常人ボランティア１８人の血清を使用した。なお、採血に際しては、インフォームドコンセントを、書面を用いて得た。患者群と健常人群との間で、年齢性別による有意な差異は認められなかった。
（２）ｈＴＥＲＴタンパク質
実施例１で調製した組換え型精製ｈＴＥＲＴ（ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ）を抗原として用いて、抗体の検出を行った。
（３）ウエスタンブロティング
ウエスタンブロティングは、常法に従って行い、陽性コントロールとして抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（シグマ社）を用いた。患者由来血清由来の分画蛋白の抗ｈＴＥＲＴ抗体をウエスタンブロティング法により次の通り検出した。
トランスファー（転写）蛋白をＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５０倍希釈した患者血清で３０分反応後、２０分洗浄した。その後、ＴＢＳＴで１０００倍希釈したＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）コンジュゲートＩｇＧ（アマシャム社ＮＡ９３３）で２０分間反応させた。
（４）精製蛋白による患者血清の吸収実験
患者血清（１００μｌ）に対し３５μｇの精製ｈＴＥＲＴ（ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ）を加え、２時間室温で反応させ、１０，０００ｘＧで１０分遠心し、ＨＲＰを用いたウエスタンブロッティングを行った。
（５）ＥＬＩＳＡ
９６ｗｅｌｌプレート（ヌンク社）に０．２μｇのＣ末ＦＬＡＧｈタグのＴＥＲＴ（ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ）を４℃オーバーナイトでインキュベーションしてコーティングした。ブロッキングは、プレートに１００μｌの１％ＢＳＡを含むブロッキングバッファー（（９．６ｍＭ ＰＢＳ，ｐＨ７．３，１％ＢＳＡ、以下「ＰＢＳＢ」と略す）を加え、３７℃１時間で行った。吸光度測定のための反応は、ＰＢＳＢで１：１００に希釈した患者血清１００μｌを各ウエルに加え、１時間３７℃でインキュベーションした。５回洗浄後、ＰＢＳＢを用い１：２０００に希釈した１００μｌのＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧを各ウエルに添加した。プレートを洗浄後、ＡＢＴＳ基質（２，２’−Ａｚｉｎｏｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ；Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ．ｆｒｏｍ Ｎａｋａｒａｉ ＥＬＩＳＡ ＰＯＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ Ｋｉｔ、Ｃｏｄｅ １４３５１−８０）を加え、マイクロタイタープレートリーダー、４０５ｎｍフィルターで測定した。
（６）統計解析
全てのデーターは平均値±標準誤差で表示した。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔＴ検定とχ２テストを用いた。
（７）結果
癌患者における抗ｈＴＥＲＴ抗体の検出は、精製ｈＴＨＥＲ（ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ）を用いて行った。まず最初に、患者血清を用いて精製蛋白をウエスタンブロッティングによって検出した。患者血清の反応は約１２７ｋＤａの精製蛋白に特異的な反応が認められた。一方、健常人血清での反応では検出されなかった。この患者血清中の反応は精製ｈＴＥＲＴを添加する事で吸収された。この結果はウエスタンブロッティングによる癌患者由来血清のシグナルが特異的であることを示している。
次に、ＥＬＩＳＡ法で血清のスクリーニングとＳｔｕｄｅｎｔＴ検定とχ２テストによる統計解析を行った。抗Ｍ２と抗マウスＩｇＧ抗体の濃度により濃度依存的に吸光度が増加したことから、抗原とＭ２抗体の反応が特異的で有ることが判明した。
肝細胞癌３０症例、肝硬変１６症例、慢性肝炎７症例、健常人１８例および他の悪性疾患（癌）１２症例の吸光度（ＯＤ）は、それぞれ０．３６５±０．０２１、０．３２５±０．０１９、０．２５６±０．０２０、０．２３９±０．０１３および０．３１９±０．０２７であった（図１）。肝癌と健常人、他の悪性疾患と健常人の差違は統計的に有意であった（それぞれＰ＜０．０００１およびＰ＜０．０１）（図１）。さらにｈＴＥＲＴに対する自己抗体量は慢性肝疾患における病状の進行度に対応して増加した。対照的に、無関係な蛋白であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する抗体は、患者並びに健常人血清中に見いだされなかった。
同一患者における異なる時期でのｈＴＥＲＴ抗体力価を測定し、これらの患者の中で非癌状態から癌のステージまでの間での変化を検討した。肝硬変段階に患者がある時は、かすかなバンドの検出が認められ、この抗ｈＴＥＲＴ抗体のシグナルは患者が肝癌に進行した後において増加した。この結果は、少なくともある患者においてはｈＴＥＲＴに反応する新規の免疫反応が悪性化の過程において生じており、それは循環抗ｈＴＥＲＴ自己抗体として検出される事を示唆している。
実施例４；血中抗ヒトテロメラーゼ抗体の検出（２）
自己免疫疾患患者１０名での抗ｈＴＥＲＴ抗体の測定値を、健常人９例の抗体の測定値と比較検討した。
採血に際しては、実施例３（１）と同様にインフォームドコンセントを、書面を用いて得た。抗ｈＴＥＲＴ抗体の測定は、実施例３（５）と同様に、ＥＬＩＳＡ法で行い、同様に統計解析を行った。その結果、自己免疫疾患患者が高い抗ｈＴＥＲＴ抗体価を有していた。すなわち健常人が０．２８６±０．０２２であるのに対して、自己免疫疾患患者では０．５０３±０．０７４であり、自己免疫疾患患者で有意に高値であった（図２）。このことは肝疾患、肝癌のみならず、他の疾患でも抗ｈＴＥＲＴ自己抗体を測定することが可能で、かつ病態を反映する情報が得られることを示している。
産業上の利用可能性
本発明により、生体試料中の抗テロメラーゼ抗体の検出法が提供される。本発明の方法を用いて、例えば患者血清の抗テロメラーゼ抗体を検出することにより、各種の疾患、例えば肝癌等の癌、自己免疫疾患等の検出が可能となる。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００１年１２月２１日の日本特許出願（特願２００１−３９００５０号）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容もここに参照として取り込まれる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例３における、血中抗ヒトテロメラーゼ抗体の検出結果を示す図である。図中、ＨＣＣは肝細胞癌、ＬＣは肝硬変、ＣＨは慢性肝炎、Ｎｏｒｍａｌは健常人、Ｏｔｈｅｒｓは他の悪性疾患（癌）を示し、ｎは症例数を示す。
図２は、実施例４における、血中抗ヒトテロメラーゼ抗体の検出結果を示す図である。図中、ＡＮＡ ｐｏｓｉｔｉｖｅは抗核抗体陽性患者（自己免疫疾患患者）、Ｎｏｒｍａｌは健常人を示す。
本発明は、抗テロメラーゼ抗体の検出方法に関する。
背景技術
テロメアは、真核細胞の線状染色体末端の特殊な構造であり、染色体長の維持と染色体の安定性の維持に必須の役割を果たしている。テロメア構造は、テロメア反復配列と呼ばれるＴＴＡＧＧＧ配列が反復されてなる染色体の末端領域と、特異なＤＮＡ結合タンパク質とから構成される。テロメア配列部分のＤＮＡ複製は、通常の染色体複製とは異なり、テロメラーゼと呼ばれるＲＮＡタンパク質複合体によるＲＮＡ依存ＤＮＡ合成反応すなわち逆転写により行われる。
テロメラーゼは、正常細胞ではその活性が厳密に抑制されているが、癌細胞の９０％以上で活性が認められる。テロメラーゼ活性の律速因子であると同時にテロメラーゼ触媒成分であるテロメラーゼ逆転写酵素は、正常細胞への導入で細胞の不死化を誘導し、ある種の癌遺伝子との共導入により正常上皮細胞の悪性形質転換を引き起こす。この様に、テロメラーゼ逆転写酵素は、細胞の不死化と癌化に強い関わりがある。また、臨床的にも肝細胞においては前癌病変から癌に至る過程で有意にテロメラーゼ逆転写酵素の発現が上昇していることが報告されており、臨床的にも分子生物学的にも発癌過程におけるテロメラーゼ逆転写酵素の重要性が示唆されている。
テロメラーゼは特異的逆転写酵素である。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（以下これを「ｈＴＥＲＴ」と略称することがある）はテロメラーゼの触媒活性サブユニットとして同定され、その活性には鋳型ＲＮＡとしてヒトテロメラーゼＲＮＡサブユニット（以下これを「ｈＴＲ」と略称することがある）を必要とすることが知られている。しかし、これまで組換え型精製ｈＴＥＲＴとｈＴＲを用いたイン・ビトロ再構成系が報告されていなかったため、ｈＴＥＲＴとｈＴＲのみがテロメラーゼ活性の必要最少成分であるかどうか明らかではなかった。
本発明者等は先に、昆虫細胞発現系を用いて、可溶性組換え型ｈＴＥＲＴの発現・精製を行い、組換え型精製ｈＴＥＲＴを生化学的な方法を用いて分画し、約１２７ＫＤａの単一バンドとして精製した。精製ｈＴＥＲＴは、イン・ビトロで合成され精製したｈＴＲの存在下で量依存的なテロメラーゼ活性を示した。またｈＴＲプローブとしたゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）で、ｈＴＥＲＴはｈＴＲと量依存的に特異的複合体を形成することが示された。これらの結果より、ｈＴＥＲＴとｈＴＲの二つのサブユニットがテロメラーゼ活性の最少成分であることがイン・ビトロ再構成系で確認された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５；２２５６８−２２５７３（２０００））。
発明の開示
本発明は、生物学的機能を有する組換え型ヒトテロメラーゼ逆転写酵素の臨床応用、例えば該組換え型ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を抗原として用いる血中抗テロメラーゼ抗体の検出方法等の提供を目的としてなされたものである。
本発明者等は、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、担癌患者では、健常人と比較し、有意に血中抗ヒトテロメラーゼ抗体が高値であることを見出した。また、慢性肝疾患患者の血中抗ヒトテロメラーゼ抗体は、慢性肝炎、肝硬変、肝癌と、病気が進行するに従い、有意に上昇することを見出した。また、他の疾患での検討を行ったところ自己免疫疾患患者において高い抗体反応性が見出された。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
即ち、本発明によれば、（１）テロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ、又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片と、生体試料中の抗テロメラーゼ抗体とを反応せしめ、反応生成物を解析することを特徴とする抗テロメラーゼ抗体の検出方法が提供される。
この発明の好ましい態様により、（２）テロメラーゼを構成するタンパク質が、テロメラーゼ逆転写酵素である上記（１）に記載の方法；（３）反応生成物の解析が、ウエスタンブロッティング法又は免疫酵素抗体法により行われる上記（１）又は（２）に記載の方法；（４）抗テロメラーゼ抗体の検出結果を疾患マーカーとして用いる上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法；（５）疾患マーカーが、腫瘍マーカーである上記（４）に記載の方法、（６）疾患マーカーが、自己免疫疾患マーカーである上記（４）に記載の方法が提供される。
また、本発明の別の態様により、（７）少なくともテロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ、又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片を含んでなる上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法を行うための試薬キットが提供される。
この発明の好ましい態様により、（８）テロメラーゼを構成するタンパク質が、テロメラーゼ逆転写酵素である上記（７）に記載の試薬キットが提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明で抗原として用いられるテロメラーゼは、抗テロメラーゼ抗体と反応し得るものであれば如何なる由来のものでも良いが、具体的には、テロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ、又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片が挙げられる。テロメラーゼは、テロメア反復配列を複製し得る能力を有するものであれば、如何なるものでも用いることができる。テロメラーゼを構成するタンパク質としては、例えばテロメラーゼ逆転写酵素が挙げられ、この逆転写酵素を抗原として用いるのが好ましい。テロメラーゼ逆転写酵素としては、例えばＭａｔｔｈｅｗ Ｍｅｙｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．９０，７８５−７９５，Ａｕｇｕｓｔ ２２，１９９７に記載されている配列を有するものが挙げられる。これらの中で、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するものが特に好ましい。
ここで、本明細書における「テロメラーゼ逆転写酵素」には、生物（動物、植物、及び微生物を含む）由来の天然のテロメラーゼ逆転写酵素（すなわち、鋳型ＲＮＡ（ＴＲ）と一緒になってテロメラーゼを構成するタンパク質であって、しかも、鋳型ＲＮＡ（ＴＲ）の存在下において逆転写触媒活性を有し、テロメア反復配列を複製する能力を有するタンパク質）が含まれる。また、例えば、それらの機能的等価改変体［すなわち、天然のテロメラーゼ逆転写酵素のアミノ酸配列において１又はそれ以上（好ましくは１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、天然テロメラーゼ逆転写酵素と同じ機能を有するタンパク質］、あるいは、天然のテロメラーゼ逆転写酵素の部分断片、機能的等価改変体の部分断片、あるいは、天然のテロメラーゼ逆転写酵素又はそれらの機能的等価改変体と融合用パートナー（例えば、検出用タンパク質、例えばＦＬＡＧペプチド又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）との融合タンパク質等が含まれる。
抗原として用いるテロメラーゼ逆転写酵素は、それをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し、該ベクターを有する形質転換体を培養して、タンパク質を発現させることにより調製できる。
該ＤＮＡのベクターへの導入は、それ自体既知の通常用いられる方法、例えばＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｍ．Ｃｏｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９８）１６，１２１７−１２２２に記載されている方法により行うことができる。かくして調製されるテロメラーゼ逆転写酵素をコードするＤＮＡを有するベクターとして、例えばｐＣＩ−ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴ−ＨＡ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９８）１６，１２１７−１２２２）、ｐＣＩ−Ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５；２２５６８−２２５７３（２０００））等が挙げられる。これらのベクターは、配列番号１に記載のＤＮＡを有するものである。
テロメラーゼ逆転写酵素の発現方法は、特に限定されるものではなく、イン・ビトロトランスレーション法や組換え体による発現法等の如何なる方法を用いても良い。発現産物がテロメラーゼの生理活性を維持していれば、テロメラーゼ活性の測定で真の抗体やその抗体の状況を判断することが可能となる。テロメラーゼの生理学的特徴から、従来のコンストラクションや通常の動物細胞での発現では、機能性のあるテロメラーゼ或いはテロメラーゼ触媒成分ｈＴＥＲＴの量的な精製が困難であった。しかし、本発明者等により開発された昆虫細胞を用いる発現方法、中でも下記のコンストラクションおよび調製方法（ＷＯ０１／５７２２７号公報）を用いれば、生物学的機能を有する物が取得できる。
具体的には、例えば、昆虫細胞を用いてテロメラーゼ逆転写酵素を発現させることによりテロメラーゼ逆転写酵素を合成する工程（以下「合成工程」と称することがある）と、昆虫細胞内で発現されたテロメラーゼ逆転写酵素を、特定の界面活性剤を用いて可溶化する工程（以下「可溶化工程」と称することがある）とを含む方法により調製できる。
合成工程に用いることのできるバキュロウイルスは、通常のバキュロウイルス発現系に用いることのできるバキュロウイルスである限り、特に限定されるものではなく、例えば、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ；以下、「ＮＰＶ」と称する）（ＢｍＮＰＶ）又はカリフォルニアギンウワバ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）を挙げることができる。
テロメラーゼ逆転写酵素をコードするＤＮＡを含む組換えバキュロウイルスを調製するために使用するバキュロウイルス発現ベクター（すなわち、トランスファーベクター）としては、バキュロウイルス由来のトランスファーベクター、例えば、ｐＶＬ１３９２又はｐＶＬ１３９３等を挙げることができる。
合成工程に用いることのできる宿主は、通常のバキュロウイルス発現系に用いることのできる昆虫細胞である限り、特に限定されるものではなく、例えば、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）由来培養細胞、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来培養細胞、又はカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）由来培養細胞を挙げることができる。
より高い発現量を達成することができる点で、イラクサギンウワバ由来培養細胞が好ましく、イラクサギンウワバの卵細胞に由来する培養細胞がより好ましく、イラクサギンウワバの卵細胞を、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，８，３９１−３９６，１９９２又はＩｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．＆Ｄｅｖ．，２９Ａ，３８８−３９０，１９９３に記載の方法に従って処理することにより得られる培養細胞が更に好ましく、Ｈｉｇｈ５細胞（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，８，３９１−３９６，１９９２；Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．＆Ｄｅｖ．，２９Ａ，３８８−３９０，１９９３）が特に好ましい。Ｈｉｇｈ５細胞は、例えば、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社（商品番号：ＢＴＩ−ＴＮ−５ＢＩ−４）から市販されている。
上記トランスファーベクターに、テロメラーゼ逆転写酵素をコードするＤＮＡを導入することにより、テロメラーゼ逆転写酵素をコードするＤＮＡを含むトランスファーベクターを構築した後、常法に従って、前記ベクターとバキュロウイルスとの相同組換えを実施することにより、テロメラーゼ逆転写酵素をコードするＤＮＡを含むバキュロウイルスを調製することができる。
合成工程における感染の際の感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ｍ．ｏ．ｉ．）は特に限定されるものではないが、例えば、０．１〜１０、好ましくは０．１〜０．３又は５〜１０、より好ましくは０．１〜０．３になるように感染を実施することができる。なお、通常のバキュロウイルス発現系においては、５〜１０が至適条件であるとされている。
合成工程では、感染後の培養期間も特に限定されるものではないが、例えば、２〜８日間、好ましくは４〜６日間培養を行なうことができる。なお、通常のバキュロウイルス発現系においては、２〜３日間が至適条件であるとされている。
合成工程において昆虫細胞内で発現されたテロメラーゼ逆転写酵素は、不溶性の状態で細胞内に蓄積しており、単に、緩衝液中で細胞を破砕しても、不溶状態のままであって、そのままでは精製操作を実施することはできない。
可溶化工程では、上記合成工程で得られた昆虫細胞、あるいは、その細胞破砕物を、Ｎ−Ｄ−グルコ−Ｎ−メチルアルカンアミドを含有する水溶液（以下「可溶化溶液」と称することがある）で処理することにより可溶化する。可溶化工程で用いるＮ−Ｄ−グルコ−Ｎ−メチルアルカンアミドには、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−８）、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−９）、及びｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０）が含まれる。
可溶化工程で用いるＮ−Ｄ−グルコ−Ｎ−メチルアルカンアミドの濃度は、テロメラーゼ逆転写酵素を可溶化することのできる濃度である限り、特に限定されるものではないが、例えば、０．５〜２重量％、好ましくは０．５〜１重量％であることができる。
上記可溶化溶液は、所望により、塩、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、及び／又はグリセロールなどを更に含有することができる。ここで、塩としては、タンパク質精製に一般に用いられる塩、例えば、アルカリ金属又はアルカリ土類金属のハロゲン化物を挙げることができる。プロテアーゼ阻害剤としては、例えば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチン、アンチパイン、フェナンスロリン、又はベンズアミドを挙げることができる。また、還元剤としては、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又は２−メルカプトエタノールを挙げることができる。
可溶化溶液における塩、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、グリセロール等の濃度は、テロメラーゼ逆転写酵素を可溶化することのできる濃度である限り、特に限定されるものではない。また、可溶化溶液のｐＨは、テロメラーゼ逆転写酵素の生物学的活性を消失することのないｐＨである限り、特に限定されるものではないが、中性付近のｐＨ（例えば、ｐＨ７．２〜７．８）であることが好ましい。
可溶化工程において、可溶化の対象である昆虫細胞又はその細胞破砕物を、前記可溶化溶液で処理する方法は、前記可溶化対象物に含まれるテロメラーゼ逆転写酵素を可溶化することができる限り、特に限定されるものではない。
例えば、可溶化対象物が懸濁液である場合には、その懸濁液と可溶化溶液とを一緒にした後、充分に混合することにより行なうことができる。また、可溶化対象物が固形物（例えば、遠心した後、上清を除去することにより得られる沈殿物）である場合には、その固形物と可溶化溶液とを一緒にした後、充分に混合することにより行なうことができる。
上記可溶化工程により得られた溶液には、可溶化されたテロメラーゼ逆転写酵素が含まれている。この溶液をそのままテロメラーゼ逆転転写酵素含有画分として用いることもできるし、あるいは、公知のタンパク質精製方法（例えば、硫安塩析、クロマトグラフィー、透析、及び／又は凍結乾燥等）を用いて、更にテロメラーゼ逆転写酵素を精製することもできる。
テロメラーゼ逆転写酵素の精製には、それ自体既知の上記タンパク質精製方法以外にも、例えば、ヘパリンセファロース又はポリ（Ｕ）−セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。
テロメラーゼ逆転写酵素の調製において、合成工程で得られた昆虫細胞又はその細胞破砕物に対して、予備処理（例えば、部分精製処理）を実施することなく、そのまま、可溶化工程を実施することもできるし、あるいは、昆虫細胞の細胞破砕物を部分精製処理することにより得られた細胞破砕物に関して分画処理を行ない、得られた画分に対して、可溶化工程を実施することもできる。可溶化工程に先だって、適当な部分精製処理を実施すると、可溶化工程により得られるテロメラーゼ逆転転写酵素含有溶液に対して実施する精製操作を省略又は簡略化することができる。
例えば、合成工程で得られた昆虫細胞を破砕した後、その細胞破砕物を遠心して上清を除去し、残った沈澱に対して、可溶化工程を実施することができる。この場合には、細胞破砕物に含まれていた可溶性タンパク質が、前記上清と一緒にほとんど除去されるので、前記沈澱を可溶化処理して得られるタンパク質画分（テロメラーゼ逆転写酵素を含む画分）を更に精製する際に、可溶性タンパク質を分離する操作を省略又は簡略化することができる。
あるいは、合成工程で得られた昆虫細胞を破砕した後、その細胞破砕物を遠心して第１の上清を除去し、残った第１の沈澱を、Ｎ−Ｄ−グルコ−Ｎ−メチルアルカンアミド以外の界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００、ＮＰ−４０、又はＣＨＡＰＳ（３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））を含む緩衝液で処理した後、再び、遠心して第２の上清を除去し、残った第２の沈澱に対して、可溶化工程を実施することができる。この場合には、細胞破砕物に含まれていた可溶性タンパク質が前記第１の上清と一緒にほとんど除去され、続いて、前記第１の沈澱に残っていた前記界面活性剤により可溶化するタンパク質も前記第２の上清と一緒にほとんど除去されるので、前記第２の沈澱を可溶化処理して得られるタンパク質画分（テロメラーゼ逆転写酵素を含む画分）を更に精製する際に、可溶性タンパク質及び前記界面活性剤により可溶化するタンパク質を分離する操作を省略又は簡略化できる。
このようにして得られたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）と、別に調製した鋳型ＲＮＡ（ＲＴ）とを、例えば、イン・ビトロで一緒にすることにより、テロメラーゼを再構成することができる。かくして、生物学的機能を有するテロメラーゼ逆転写酵素を調製することができる。
本発明の抗テロメラーゼ抗体の検出方法は、前記の通り、少なくともテロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ、又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片と、生体試料中の抗テロメラーゼ抗体とを反応せしめ、反応生成物を解析することを特徴とするものである。
抗体の検出に用いることができる生体試料としては、全血、血清、血漿、腹水、胸水、脊髄液、組織や細胞およびそれらの培養物、尿等が挙げられる。
抗テロメラーゼ抗体の検出に用いられる抗原としては、上記の通り、少なくともテロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ、又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片が挙げられる。これらの中で、テロメラーゼ逆転写酵素又はその部分断片がより好ましい。また、抗原として用いるテロメラーゼ逆転写酵素は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するものが特に好ましい。
上記抗原と生体試料に加えて、生体試料中の抗テロメラーゼ抗体とを反応せしめ、その反応生成物を解析、即ち反応生成物を検出又は定量する方法としては、それ自体既知の通常用いられる免疫学的な検出又は定量法が用いられる。
免疫学的検出又は定量法としては、免疫酵素抗体法［Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）］、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、赤血球凝集反応法、ラテックス凝集反応法、リポソーム凝集法等が挙げられる。また、抗原に対しての抗体の結合を非ラベルで表面プラズモン共鳴や水晶発振機を用いて直接的に検出する方法等も用いることができる。さらには、生体試料、例えば血清や尿の前処理を行うことにより一層感度を上げることができる。抗体の検出又は定量は、たとえば最終的な反応を酵素反応、蛍光、化学発光、放射能等からの信号を検出又は定量することにより行えばよい。これらの方法は、例えば単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック、１９８７年）、続生化学実験講座５免疫生化学研究法（東京化学同人、１９８６年）の記載に準じて容易に実施することができる。
具体的には、例えば、免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）とは、上記抗原と生体試料中の抗テロメラーセ抗体を反応させ、反応生成物に、さらにペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識などを施した抗体あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）とは、上記抗原と生体試料中の抗テロメラーゼ抗体を反応させ、さらに反応生成物に、放射線標識を施した抗体あるいは結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。
ウェスタンブロッティング法とは、上記抗原をＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜等にブロッティングし、該膜に生体試料を添加して抗テロメラーゼ抗体と反応させ、さらに反応生成物に、ＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗体あるいは結合断片を反応させた後、確認する方法である。
上記した本発明の方法を用いて、ヒト血中の抗テロメラーゼ抗体を解析した結果、担癌患者、自己免疫疾患の患者では健常者に比し、有意に血中抗テロメラーゼ抗体が高値であることが本発明者等により始めて確認された。従って、血中抗テロメラーゼ抗体は、各種の疾患のマーカー、例えば腫瘍マーカー、自己免疫疾患マーカーとなり得ると考えられる。また、生体試料中の抗テロメラーゼ抗体を検出又は定量し、健常者の値と比較し、例えば健常者より有意に高値である場合は、例えば、発癌状態、自己免疫疾患である可能性があると判定できる。
上記した本発明の抗テロメラーゼ抗体の検出法に用いる試薬キットは、少なくとも抗原としてテロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ、又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片を含み、通常の免疫反応を利用したキットと同様の構成によって提供される。抗原としては、テロメラーゼ逆転写酵素又はその部分断片が好ましい。また、抗原として用いるテロメラーゼ逆転写酵素は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するものが特に好ましい。本発明の試薬キットは、少なくとも上記抗原を含み、さらに任意の要素として、試料希釈液、洗浄液、標識化抗体、色素、陽性コントロール用の抗体等を含んでいてもよい。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の調製
（１）プラスミドの構築
ｈＴＥＲＴのｃＤＮＡ（配列番号１）を含むプラスミドｐＣＩ−Ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５；２２５６８−２２５７３（２０００））を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及び制限酵素ＳａｌＩで切断することにより、上記ｈＴＥＲＴ−ｃＤＮＡを含むＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ−ＤＮＡ断片を得た。このＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ−ＤＮＡ断片を、プラスミドｐＮＫＦＬＡＧＺのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＮＫＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴを構築した。前記プラスミドｐＮＫＦＬＡＧＺは、プラスミドｐＮＫＦＬＡＧ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１５４７９−１５４８６，１９９８）のＦＬＡＧ配列ｃＤＮＡの３’端がイン・フレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）となってＥｃｏＲＩとＳａｌＩ部位に接続する配列に改変したものである。
得られたプラスミドｐＮＫＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴは、ｈＴＥＲＴのＮ末端にＦＬＡＧペプチドが標識されたＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質（ＦＬＡＧ標識ｈＴＥＲＴ）をコードするＤＮＡを含む。
上記プラスミドｐＮＫＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴを、制限酵素ＮｏｔＩ及び制限酵素ＢｇｌＩＩで切断することにより、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩ−ＤＮＡ断片を得た。このＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩ−ＤＮＡ断片を、バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）のＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＢＹＫ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴを構築した。
（２）組換え型バキュロウイルスの作成
組換え型バキュロウイルスの作成は、市販のキット［ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄスターターパッケージ（Ｓｆ９昆虫細胞及びＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ線状化バキュロウイルスＤＮＡを含む）；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社］を用いて、以下の手順で実施した。
すなわち、１０％のウシ胎児血清を添加したＴＮＭ−ＦＨ昆虫細胞培養液（シグマ社）中で、Ｓｆ９細胞を懸濁培養した後、トランスフェクションの３０分前に、９ｃｍ２シャーレ当たり１０６個になるようにＳｆ９細胞をシャーレに蒔種した。続いて、前記キットに添付の説明書に従って、上記実施例１（１）で調製したプラスミドｐＢＹＫ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ（２．５μｇ）と、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ線状化バキュロウイルスＤＮＡ（０．２５μｇ）との混合液を用いて、共トランスフェクションを行なった。共トランスフェクションを実施した後、２７℃で５日間培養し、その培溶液上清を回収した。回収した培養液上清とＳｆ９細胞とを用いて、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質を発現する組換え型バキュロウイルスＢＶＫＭ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ株の増幅を行なった。Ｓｆ９細胞を用いたウイルスの力価の測定は、キットに添付の説明書に基づいて実施した。以下の実験には、高力価（１．０×１０７ｐｆｕ／ｍＬ以上）の組換え型バキュロウイルスＢＶＫＭ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ株を使用した。組み換え型バキュロウイルスＢＶＫＭ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ株は、４℃保存下で約６か月以上は安定であり、その後、ウイルスの力価は減少した。
（３）種々の昆虫細胞におけるＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の発現量の評価
昆虫細胞として、実施例１（２）で用いたのと同じＳｆ９細胞と、Ｈｉｇｈ５細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とを用いて、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の発現レベルを比較した。Ｓｆ９細胞の培地としては、前記実施例１（２）で用いたのと同じ１０％ウシ胎児血清含有ＴＮＭ−ＦＨ昆虫細胞培養液を使用し、Ｈｉｇｈ５細胞の培地としては、市販の培地（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ無血清培地；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に１０％ウシ胎児血清を添加したものを使用した。前記実施例１（２）で調製した組換え型バキュロウイルスＢＶＫＭ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ株を、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）が２となるように感染させ、感染後、２７℃で３日間培養した。
（４）感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）及び感染後の培養時間の各至適条件の決定
昆虫細胞としてＨｉｇｈ５細胞を用いて、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）及び感染後の培養時間の各至適条件を決定した。
一般的に、組み換え型バキュロウイルスの感染時の感染多重度は、５〜１０が至適であるとされている。しかし、異なる感染多重度で組換え型バキュロウイルスＢＶＫＭ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ株を感染させた場合、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の発現量は、感染時の感染多重度が０．２の条件において、感染多重度が５〜１０の場合と同程度であるか、あるいは、より高かった。感染多重度が０．２より更に低い０．１〜０．０２となった場合には、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の収量が低下したので、最適な感染多重度は約０．２近辺と思われた。
感染多重度が０．２となるように感染させた後、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、又は１４４時間培養した各昆虫細胞の全細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分画し、ＣＢＢにより染色した。その結果、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の発現レベルが最高となるのは、感染後４〜６日後であった。
（５）ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の発現及び精製
市販の培地（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ無血清培地；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養したＨｉｇｈ５昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、１．０×１０７個になるように５×２５ｃｍ２シャーレに蒔種した後、実施例１（２）で調製した組換え型バキュロウイルスＢＶＫＭ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ株を、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）が０．２となるように感染させた。感染後、２７℃で５日間培養した。
感染後、５日間培養した前記細胞をシャーレから剥がし、リン酸緩衝化生理食塩水［以下、「ＰＢＳ（−）」と称する］に懸濁し、４，０００回転で１０分間遠心した。
以下、本工程の全ての操作は４℃で行ない、使用した全ての緩衝液には、１ｍｍｏｌ／Ｌフッ化フェニルメチルスルフォニル（シグマ社）、１０ｍｇ／ｍＬペプスタチンＡ（シグマ社）、１０ｍｇ／ｍＬロイペプチン（シグマ社）、１０ｍｇ／ｍＬアプロチニン（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＩＭ社）、１０ｍｇ／ｍＬフェナンスロリン（Ｓｉｇｍａ）、１６ｍｇ／ｍＬベンズアミド（Ｓｉｇｍａ）、及び１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール（Ｎａｋａｒａｉ社）を添加した。また、コントロールとして、組換え型バキュロウイルスＢＶＫＭ−ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ株非感染の昆虫細胞についても、同様の精製操作を実施した。
遠心により回収した前記細胞を、ＰＢＳ（−）で一度洗浄した後、バッファーＡ［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２０％グリセロール，０．１％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，１０ｍｍｏｌ／Ｌ−β−メルカプトエタノール］５ｍＬに懸濁し、超音波破砕（１０秒間）を３回行なった。１０，０００ｇで１０分間遠心した後に、上清（以下、「Ｓ１画分」と称する）を分取し、沈降物を再びバッファーＡ（５ｍＬ）に懸濁した。
上記懸濁液を１０，０００ｇで１０分間遠心した後に、上清（以下、「Ｓ２画分」と称する）を分取し、沈降物をライシス（ｌｙｓｉｓ）バッファーＢ［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０％グリセロール，０．５％ＭＥＧＡ−９，５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，１０ｍｍｏｌ／Ｌ−β−メルカプトエタノール］１ｍＬに懸濁し、超音波破砕（１０秒間）を３回行なった。
得られた懸濁液を、再び、１０，０００ｇで１０分間遠心した後、上清（以下、「Ｓ３画分」と称する）を分取し、残った沈降物をライシスバッファーＣ［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０％グリセロール，０．５％ＭＥＧＡ−９，１０００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，１０ｍｍｏｌ／Ｌ−β−メルカプトエタノール］１ｍＬに懸濁し、超音波破砕（１０秒間）を３回行なった。
得られた懸濁液を、１０，０００ｇで１０分間遠心した後、上清（以下、「Ｓ４画分」と称する）を分取し、先に分取したＳ３画分と、このＳ４画分とを一緒にした。この混合液を、バッファーＤ［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０％グリセロール，０．５％ＭＥＧＡ−９，１ｍｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール（ＤＴＴ）］を用いて、塩化ナトリウムの最終濃度が３００ｍｍｏｌ／Ｌになるように希釈した（以下、「Ｓ５画分」と称する）。
このＳ５画分を、バッファーＥ［２０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０％グリセロール，０．５％ＭＥＧＡ−９，３００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＤＴＴ］で平衡化したＤＮＡセファロース（ＬＫＢ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）カラム（１．０ｍＬパック量）に通した。その通過液画分を、前記バッファーＥで平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ及びセファロースＣＬ−６Ｂ混合物（ヘパリン−セファロースＣＬ−ＢとセファロースＣＬ−６Ｂとを１：１の重量比で混合したもの：以下、単に「ヘパリン−セファロース」と称する）１ｍＬと混合し、４℃で３〜４時間回転撹拌を行なった。
ヘパリン−セファロースに結合したタンパク質を低速遠心で回収した後、バッファーＥで洗浄し、バッファーＢ（２ｍＬ）で溶出することにより、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の精製品を得た。タンパク質を定量するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分画し、ＣＢＢで染色した。タンパク質濃度を測定する標準標品としては、牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社）を用いた。
得られた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ゲル濃度＝８％）で分画した後、ＣＢＢ染色又は抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロットを行ない、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の検出を行った。
その結果、昆虫細胞のタンパク質の殆どは、低濃度のＮＰ−４０、グリセリン、及び塩化ナトリウムを含む緩衝液（バッファーＡ）で溶出された（Ｓ１画分及びＳ２画分）。一方、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質は、ＭＥＧＡ−９及び高塩濃度を含む緩衝液（ライシスバッファーＢ）を用いた場合にのみ、効率的に溶出された（Ｓ３画分）。
実施例２：テロメラーゼのイン・ビトロ再構成及びテロメラーゼ活性の測定
（１）テロメラーゼのイン・ビトロ再構成
実施例１で調製した組換え型ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質が、ヒトテロメラーゼの触媒活性を有することを直接的に証明するために、前記ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質と、精製したヒトテロメアＲＮＡ（ｈＴＲ）とが、イン・ビトロで再構成してテロメラーゼ活性を示すかどうかを評価した。なお、テロメラーゼ活性は、異なる２種類の方法、すなわち、市販のキット（ＴｅｌｏＣｈａｓｅｒ；東洋紡）を用いるテロメア反復配列増幅プロトコール法（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ Ｒｅｐｅａｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ａｓｓａｙ；以下、「ＴＲＡＰアッセイ」と称する）と、市販のＥＬＩＳＡテロメラーゼ測定キット（ＴＲＡＰＥＺＥキット；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社）を用いるＴＲＡＰ−ＥＬＩＳＡ法とにより実施した。２種類の前記方法の内、後者のＴＲＡＰ−ＥＬＩＳＡ法は、テロメラーゼ活性を相対的活性として定量化することが可能である。
まず、ｈＴＲ−ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＧＲＮ１６４（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，１２３６−１２４１，１９９５）を鋳型として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるイン・ビトロ転写系により、ｈＴＲを合成した。
得られたｈＴＲと、前記実施例１で調製したＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質とを、種々の量で、再構成緩衝液Ａ［最終濃度：１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０），１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，２５％グリセリン，１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム，３ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム，０．１ｍｍｏｌ／Ｌフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ），１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＤＴＴ，１０Ｕ／μｌリボヌクレアーゼインヒビター（ＲＮａｓｉｎ）］２０μｌ中で、１０分間反応させる（温度＝３３℃）ことにより、イン・ビトロ再構成を行なった。
（２）ＴＲＡＰアッセイによるテロメラーゼ活性の測定
市販のキット（ＴｅｌｏＣｈａｓｅｒ；東洋紡）を用いてＴＲＡＰアッセイを行った。なお、ＴＲＡＰアッセイは、前記キットに添付の説明書に従って実施し、得られたＰＣＲ産物を、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動により分画した後、染色試薬［ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社］で可視化した。
その結果、テロメラーゼ活性は、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質とｈＴＲとを加えた場合にのみ観察され、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質のみではテロメラーゼ活性を示さなかった。この結果は、この２成分の機能的再構成によりテロメラーゼ活性が観察されたことを明示する。また、この結果は、ｈＴＥＲＴとｈＴＲとがテロメラーゼ活性に充分で最少限の成分であることを明らかに示した。
さらに、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質（１２０ｎｇ）とｈＴＲ（２００ｎｇ）とを用い、上記（１）に記載の方法に準じて、異なる反応時間でイン・ビトロ再構成を行い、ＴＲＡＰアッセイを実施した。
その結果、３３℃の条件下において、テロメア合成は約１０分後に観察され、その後、１時間は見かけ上直線的に持続した。プライマーと基質なしに前もって３３℃処理を行なった場合も、同様のテロメア合成の潜伏時間が観察されたことは、プライマーと基質が加えられた後にＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の重要な構造変換が起きることを示唆している。
ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質の触媒活性は、３０℃〜３７℃の間で、ｐＨは８．０近傍で最高であり、３ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオンを要求した。ＴＩＧ３細胞抽出液を用いた相補実験でＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質によるテロメラーゼ活性の反応でも、同一の至適条件であった。
（３）ＴＲＡＰ−ＥＬＩＳＡ法によるテロメラーゼ活性の測定
上記（２）で実施したＴＲＡＰアッセイは、感度が良いが、テロメラーゼの定量には適さないので、異なった量比のＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質とｈＴＲとの存在下でイン・ビトロで再構成されたテロメラーゼ活性の定量を、市販のキット（ＴＲＡＰＥＺＥキット；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社）を用いるＴＲＡＰ−ＥＬＩＳＡ法により行なった。ＴＲＡＰ−ＥＬＩＳＡ法は、キットに添付の説明書に従って、以下に示す手順で実施した。
すなわち、イン・ビトロ再構成を、再構成緩衝液Ｂ［最終濃度：１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０），１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，２５％グリセリン，１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム，３ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＰＭＳＦ，１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＤＴＴ，１０Ｕ／μｌ−ＲＮａｓｉｎ，２ｎｇ／μｌ−ＴＳ−プライマー，１ｍｍｏｌ／Ｌ未標識ｄＡＴＰ，１ｍｍｏｌ／Ｌ未標識ｄＴＴＰ，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未標識ｄＧＴＰ，０．１μＣｉ／ｎＬ［α−３２Ｐ］標識ｄＧＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）］２０μｌ中で、３３℃で１時間行なった後、反応液中の１０μｌを採取してＤＥ８１フィルターにスポットし、続いて、フィルターを洗浄し、フィルターに結合した放射能を既に報告されている方法に従って測定した。
その結果、テロメラーゼ活性は、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質及びｈＴＲの２成分が当モル比の場合に最高であった。このことは、２成分の効率的な複合体形成を示唆している。
以上の通り、ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ融合タンパク質は、テロメラーゼ活性を有することが確認された。
実施例３；血中抗ヒトテロメラーゼ抗体の検出（１）
（１）患者および使用血清
総数８３人（年齢４０〜８２歳）の患者血清および健常者血清を用いて、抗体の検出を行った。これらには肝細胞癌３０症例、１６症例の肝硬変、７症例の慢性肝炎と、悪性疾患１２症例を含む。なお、対象コントロールとして健常人ボランティア１８人の血清を使用した。なお、採血に際しては、インフォームドコンセントを、書面を用いて得た。患者群と健常人群との間で、年齢性別による有意な差異は認められなかった。
（２）ｈＴＥＲＴタンパク質
実施例１で調製した組換え型精製ｈＴＥＲＴ（ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ）を抗原として用いて、抗体の検出を行った。
（３）ウエスタンブロティング
ウエスタンブロティングは、常法に従って行い、陽性コントロールとして抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（シグマ社）を用いた。患者由来血清由来の分画蛋白の抗ｈＴＥＲＴ抗体をウエスタンブロティング法により次の通り検出した。
トランスファー（転写）蛋白をＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５０倍希釈した患者血清で３０分反応後、２０分洗浄した。その後、ＴＢＳＴで１０００倍希釈したＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）コンジュゲートＩｇＧ（アマシャム社ＮＡ９３３）で２０分間反応させた。
（４）精製蛋白による患者血清の吸収実験
患者血清（１００μｌ）に対し３５μｇの精製ｈＴＥＲＴ（ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ）を加え、２時間室温で反応させ、１０，０００ｘＧで１０分遠心し、ＨＲＰを用いたウエスタンブロッティングを行った。
（５）ＥＬＩＳＡ
９６ｗｅｌｌプレート（ヌンク社）に０．２μｇのＣ末ＦＬＡＧｈタグのＴＥＲＴ（ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ）を４℃オーバーナイトでインキュベーションしてコーティングした。ブロッキングは、プレートに１００μｌの１％ＢＳＡを含むブロッキングバッファー（（９．６ｍＭ ＰＢＳ，ｐＨ７．３，１％ＢＳＡ、以下「ＰＢＳＢ」と略す）を加え、３７℃１時間で行った。吸光度測定のための反応は、ＰＢＳＢで１：１００に希釈した患者血清１００μｌを各ウエルに加え、１時間３７℃でインキュベーションした。５回洗浄後、ＰＢＳＢを用い１：２０００に希釈した１００μｌのＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧを各ウエルに添加した。プレートを洗浄後、ＡＢＴＳ基質（２，２’−Ａｚｉｎｏｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ；Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ．ｆｒｏｍ Ｎａｋａｒａｉ ＥＬＩＳＡ ＰＯＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ Ｋｉｔ、Ｃｏｄｅ １４３５１−８０）を加え、マイクロタイタープレートリーダー、４０５ｎｍフィルターで測定した。
（６）統計解析
全てのデーターは平均値±標準誤差で表示した。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔＴ検定とχ２テストを用いた。
（７）結果
癌患者における抗ｈＴＥＲＴ抗体の検出は、精製ｈＴＨＥＲ（ＦＬＡＧ−ｈＴＥＲＴ）を用いて行った。まず最初に、患者血清を用いて精製蛋白をウエスタンブロッティングによって検出した。患者血清の反応は約１２７ｋＤａの精製蛋白に特異的な反応が認められた。一方、健常人血清での反応では検出されなかった。この患者血清中の反応は精製ｈＴＥＲＴを添加する事で吸収された。この結果はウエスタンブロッティングによる癌患者由来血清のシグナルが特異的であることを示している。
次に、ＥＬＩＳＡ法で血清のスクリーニングとＳｔｕｄｅｎｔＴ検定とχ２テストによる統計解析を行った。抗Ｍ２と抗マウスＩｇＧ抗体の濃度により濃度依存的に吸光度が増加したことから、抗原とＭ２抗体の反応が特異的で有ることが判明した。
肝細胞癌３０症例、肝硬変１６症例、慢性肝炎７症例、健常人１８例および他の悪性疾患（癌）１２症例の吸光度（ＯＤ）は、それぞれ０．３６５±０．０２１、０．３２５±０．０１９、０．２５６±０．０２０、０．２３９±０．０１３および０．３１９±０．０２７であった（図１）。肝癌と健常人、他の悪性疾患と健常人の差違は統計的に有意であった（それぞれＰ＜０．０００１およびＰ＜０．０１）（図１）。さらにｈＴＥＲＴに対する自己抗体量は慢性肝疾患における病状の進行度に対応して増加した。対照的に、無関係な蛋白であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する抗体は、患者並びに健常人血清中に見いだされなかった。
同一患者における異なる時期でのｈＴＥＲＴ抗体力価を測定し、これらの患者の中で非癌状態から癌のステージまでの間での変化を検討した。肝硬変段階に患者がある時は、かすかなバンドの検出が認められ、この抗ｈＴＥＲＴ抗体のシグナルは患者が肝癌に進行した後において増加した。この結果は、少なくともある患者においてはｈＴＥＲＴに反応する新規の免疫反応が悪性化の過程において生じており、それは循環抗ｈＴＥＲＴ自己抗体として検出される事を示唆している。
実施例４；血中抗ヒトテロメラーゼ抗体の検出（２）
自己免疫疾患患者１０名での抗ｈＴＥＲＴ抗体の測定値を、健常人９例の抗体の測定値と比較検討した。
採血に際しては、実施例３（１）と同様にインフォームドコンセントを、書面を用いて得た。抗ｈＴＥＲＴ抗体の測定は、実施例３（５）と同様に、ＥＬＩＳＡ法で行い、同様に統計解析を行った。その結果、自己免疫疾患患者が高い抗ｈＴＥＲＴ抗体価を有していた。すなわち健常人が０．２８６±０．０２２であるのに対して、自己免疫疾患患者では０．５０３±０．０７４であり、自己免疫疾患患者で有意に高値であった（図２）。このことは肝疾患、肝癌のみならず、他の疾患でも抗ｈＴＥＲＴ自己抗体を測定することが可能で、かつ病態を反映する情報が得られることを示している。
産業上の利用可能性
本発明により、生体試料中の抗テロメラーゼ抗体の検出法が提供される。本発明の方法を用いて、例えば患者血清の抗テロメラーゼ抗体を検出することにより、各種の疾患、例えば肝癌等の癌、自己免疫疾患等の検出が可能となる。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００１年１２月２１日の日本特許出願（特願２００１−３９００５０号）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容もここに参照として取り込まれる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例３における、血中抗ヒトテロメラーゼ抗体の検出結果を示す図である。図中、ＨＣＣは肝細胞癌、ＬＣは肝硬変、ＣＨは慢性肝炎、Ｎｏｒｍａｌは健常人、Ｏｔｈｅｒｓは他の悪性疾患（癌）を示し、ｎは症例数を示す。
図２は、実施例４における、血中抗ヒトテロメラーゼ抗体の検出結果を示す図である。図中、ＡＮＡ ｐｏｓｉｔｉｖｅは抗核抗体陽性患者（自己免疫疾患患者）、Ｎｏｒｍａｌは健常人を示す。
Claims (8)
- テロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片と、生体試料中の抗テロメラーゼ抗体とを反応せしめ、反応生成物を解析することを特徴とする抗テロメラーゼ抗体の検出方法。
- テロメラーゼを構成するタンパク質が、テロメラーゼ逆転写酵素である請求項１に記載の方法。
- 反応生成物の解析が、ウエスタンブロッティング法又は免疫酵素抗体法により行われる請求項１又は２に記載の方法。
- 抗テロメラーゼ抗体の検出結果を、疾患マーカーとして用いる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 疾患マーカーが、腫瘍マーカーである請求項４に記載の方法。
- 疾患マーカーが、自己免疫疾患マーカーである請求項４に記載の方法。
- 少なくともテロメラーゼを構成するタンパク質、鋳型ＲＮＡ、又はそれらの複合物若しくはそれらの部分断片を含んでなる請求項１〜６のいずれかに記載の方法を行うための試薬キット。
- テロメラーゼを構成するタンパク質が、テロメラーゼ逆転写酵素である請求項７に記載の試薬キット。
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| JP2001390050 | 2001-12-21 | ||
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