技術分野
本発明は、水溶液中にある細胞や微生物、ウィルス等からその核酸を抽出する核酸抽出装置に関する。
背景技術
核酸を用いて、これのパターンから被検者の診断を行う遺伝子診断がある。この遺伝子診断では、被検者から採取した体液や組織等から核酸を抽出し、これのパターン解析によって診断を行う。このため、核酸の抽出が正確に行われなければならない。核酸の抽出に関する従来技術としては、例えば、「バイオ実験イラストレイテッド▲１▼分子生物学実験の基礎（１９９５，秀潤社）Ｐ１１３〜Ｐ１２２」（以下、従来技術１という）には、核酸を含む水溶液をチューブと呼ばれる小型の容器に保持し、これを手操作にて各種処理液を注入・撹拌し、遠心分離を繰り返す方法が開示されている。そして、この操作を自動化した装置として、東洋紡績株式会社（核酸自動分離装置，ＮＳ−１０００型）として発売されている。
また、従来技術２として「Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ’２０００Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ（２０００）、Ｐ２３９〜Ｐ２４２」は、樹脂製円形基板上に溶液保持用槽と反応用微細流路、発熱素子を設けて、円形基板を回転させたときに生ずる遠心力によって送液と反応を行い、全血から核酸の抽出と核酸のパターン解析を行う方法が開示されている。
上記従来技術では、次のような問題が発生し易く、これを避けることは技術的な困難が伴う。すなわち、従来技術１の核酸を含む水溶液や各種溶液をチューブと呼ばれる小型の容器に保持し処理する方法は、試料容量を多くでき簡易な処理が可能であるが、操作途中に異物の混入が生じやすいという問題があり、正確な抽出が困難である。そして、これらの操作を自動化するためにロボットシステム等複雑な機構を採用しているが、装置コストが上昇すると共に、処理のスループットを向上させることが困難である。従来技術２の樹脂製円形基板上で処理する方法は、核酸を含む水溶液や各種溶液すべてが一つの基板上に保持されており、異物の混入がなく高精度な抽出が可能であるが、溶液保持用槽と反応用微細流路が微細なものであるため試料容量を多くできないという問題があり、試料中に含まれる核酸が微量になるとこれを抽出することは困難である。そして、試料または溶液等の混合において、静止状態で油層と水相に分かれるような２液を混合することが難しいため、これらの状態のうち油層となるフェノールを用いる方法では、核酸の抽出を十分に行うことができなかった。
本発明の目的は、核酸を含む水溶液から核酸を抽出する装置において、異物が混入することなく、正確でかつ高感度の核酸抽出装置を実現し、低コストで提供することにある。
発明の開示
本発明は、回転円盤上に血液などの核酸を含む水溶液を、流路または隔壁で区分された複数の槽を備え、流路または隔壁に設けた開閉機構を動作することで各槽間を連結し、円盤の回転と開閉機構の動作により、その成分毎に順次移動させながら核酸を抽出する構成とした。
なお、流路または隔壁、開閉機構、槽の全部または一部が、タンパク質の変性作用をもつ薬品に対してその成分の一部が溶出しないプラスチック材料で構成する。さらに、複数の槽の内いずれかに蛋白質を分離するため、蛋白質に対して変性作用を持つ薬品や、核酸よりも水分子と結合が容易な薬品を予め所定量封入しておく。
ここで、タンパク質の変性作用をもつ薬品とは、グアニジンチオシアネート、フェノール、フェノールとクロロホルムとイソアミルアルコールをそれぞれ２５：２４：１に混合した溶液。または、クロロホルムとイソアミルアルコールを２４：１に混合した溶液等、核酸を内包するタンパク質でできた膜を破壊し核酸を取り出す作用のある薬品を指す。
また、核酸よりも水分子と結合が容易な薬品とは、エタノール，イソプロピルアルコール等、核酸を含む水溶液に混合することで、水に溶けていた核酸を凝集させる作用のある薬品を指す。
上記構成とすることにより、核酸を含む水溶液がその成分毎に槽に保持されるため、これらを連結した流路の単位長さあたりの容積に制限されることなく多量の核酸を含む水溶液を処理することができる。また、すべての処理を自動化できるため、異物が混入することなく正確な抽出ができる。また、水溶液を保持する槽を隔壁で分離し、この槽をプラスチックの射出整形で製作することにより、コストの低減をはかることができる。そして、一回の抽出でこれを使い切ることができるため、被測定対象の違いによる測定誤差が生じない特徴がある。また、水溶液を保持する槽を隔壁で分離しこの槽を脱着可能にすることにより、各槽での処理において最適な条件を設定することができ、効率のよい抽出が可能になる。また、核酸を含む水溶液を移動させるため、輸送能力が向上し抽出のスループットを向上させることができる。さらに、この遠心力を用いて核酸を含む水溶液として血液を処理すれば、遠心分離の効果で血清を得ることができるため、抽出のスループットを向上させることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の一実施例を図面に従い詳細に説明する。
第１図（ａ）は、核酸を含む水溶液から核酸を抽出するため、回転円盤上に形成された、開閉機構を備えた流路で連結された複数の槽を示したものである。本実施例では、特に、核酸を含む水溶液としてヒトの全血を例に述べるが、生物の体液であって核酸を含むもの、または、核酸を含む組織を水に懸濁した水溶液についても同様に抽出できる。
第１図（ｂ）は、第１図（ａ）の槽と流路の部分の拡大図である。円盤１００には複数の槽が形成されている。又、円盤１００は、駆動機構に取付けて回転させるための装着用の穴１０２が設けてある。円盤１００には、次に述べる各層が設けてある。分析用のサンプルである全血を保持するためのサンプル保持槽１０４と、全血から血清を分離するための分離槽１０６と、核酸を内包する核壁から核酸を取り出すための抽出槽１０８と、水溶液中に拡散した核酸を収集するための回収槽１１０と、抽出した核酸を保持する核酸保持槽１１２である。サンプル保持槽１０４と分離槽１０６は流路１１４で連結してある。分離槽１０６と抽出槽１０８とは流路１１６で連結してある。この流路１１６には途中に溶液の移動を制御するための開閉機構１２２を備えている。流路１１８は、抽出槽１０８と回収槽１１０とを連結し、その途中に溶液の移動を制御する開閉機構１２４を備えている。流路１２０は、回収槽１１０と核酸保持槽１１２とを連結し、その途中に溶液の移動を制御する開閉機構１２６を備えている。配線１２８、と配線１３０と、配線１３２とは各開閉機構１２２、１２４、１２６を制御するため、穴１０２を介して円盤１００の外部にある（図示しない）制御装置に接続されている。本実施例の開閉機構は電磁力で開閉する電磁弁で構成してあるが、本方式に限らず１つの駆動系で歯車等を切り替えて開閉する方式等でもよい。
サンプル保持槽１０４には、全血を注入する穴１０３が設けられている。この穴以外の各槽と各流路とは外気を遮断するため密閉されており、異物の進入を防いでいる。
第２図は、槽を含む円盤１００について、これを回転させて遠心力を発生させる機構と、円盤１００中の槽に含まれる溶液を撹拌するための機構を示したものである。円盤１００と回転軸２００およびモーター２０２は、円盤２０４に搭載される。この円盤２０４は、モーター２０８の回転軸２０６によって回転駆動される。本実施例では、円盤１００の回転軸２００中心と、円盤２０４の回転軸２０６中心とは所定の距離を開けて取付けられている。このように、間隔を開けて回転軸を設けることで、後述するように各槽に加わる遠心力を大きくすることができる。すなわち、円盤１００を保持する回転軸で回転しながら、これら全体を円盤２０４の回転軸２０６と回転軸中心をずらして駆動する所謂遊星運動をさせている。
円盤２０４には、配線２１２、２１４、２１６が設けられおり、この配線は回転円盤１００に設けた配線１２８、１３０、１３２に接続されている。また、円盤２０４上には、モーター２０２を駆動制御するための配線２１８、２２０も設けてある。円盤１００上にある各開閉機構とモーター及び円盤２０４を回転するためのモータ２０８の動作は、制御線２３２を介して制御装置２３０で集中的に制御される。
第３図（ａ）から第３図（ｆ）は、全血から核酸を抽出する動作を説明するため図である。なお、第３図（ａ）から第３図（ｆ）では、第１図又は第２図には図示していない、核酸を内包する核壁から核酸を取り出すためにタンパク質の変性作用がある薬品３００を抽出槽１０８の中に、核酸よりも水分子と結合が容易な薬品３０２を回収槽１１０の中に、予め決められた量だけ保持している。また、矢印１０００は、円盤１００が回転することによって発生する遠心力の方向を示している。
第３図（ａ）は円盤１００が静止状態にあるときを示したものである。このとき採血した全血３１０を、注入穴１０３からサンプル保持槽１０４に注入する。
次に、第３図（ｂ）は円盤１００を分離槽１０６付近において遠心力が１５００Ｇ以上になるよう回転させたときを示したものである。全血３１０はサンプル保持槽１０４から分離槽１０６に移動する。そして、この回転を５分程度続けると、分離槽１０６では遠心力によって、血清以外の物質３１４が円盤１００の外周側に、血清３１２が回転中心側に分布する。このとき、円盤１００の回転数が高いほど、分離槽１０６で血清と血清以外の成分とが分離する時間を短くできる。前述のような分離状態となるため、分離された純度の高い血清を次の抽出層１０８に送るためには、分離槽における流路１１４の出口を円盤１００の外周側に、流路１１６の入り口を円盤１００の回転中心側に設置することが望ましい。分離された血清３１２は、流路１１６を通って予め開いていた開閉機構１２２を通り抜けて抽出槽１０８に移動する。
第３図（ｃ）は、抽出槽１０８内において、血清３１２から核酸を抽出する状態を示したものである。抽出槽１０８内には、予めタンパク質の変性作用をもつ薬品３００が所定量保持されており、この薬品３００と血清１１２とが反応する。なお、タンパク質の変性作用をもつ薬品３００として、例えば、フェノールを用いた場合には、血清が送られてきたとき、抽出槽１０８内で当初フェノール３００は油層として、血清３１２は水層として分離状態にある。また、フェノール３００の量は、反応させる血清１１２と同量かそれよりも多いことが望ましい。
前述のように、血清３１２と薬品３００が分離状態にあるため、円盤１００をモータ２０２で回転している状態に加えて、円盤２０４もモータ２０８で回転させて撹拌することにした。この時、流路１１６と流路１１８の途中にあるそれぞれの開閉機構１２２、１２４は閉じている。なお、円盤１００上の抽出槽１０８において両円盤の回転によって生じる遠心力が合成される。このため、円盤１００と円盤２０４の回転数は、遠心力の方向が円盤１００の回転角度に依存しないような値にする必要がある。例えば、抽出槽１０８は回転軸２００の中心から４５ｍｍの離れた位置に設け（抽出槽１０８の直径は６ｍｍとする）、回転軸２００は、回転軸２０６から５１ｍｍの距離に配置してある。そして、円盤１００の回転数を５００ｒｐｍとした場合は、円盤２０４の回転数を２０００ｒｐｍよりも高くすればよい。なお、抽出槽１０８の形は、図１から第３図に示したような円形の他、四角形等、多角形にすれば核酸を抽出する効果が高くなる。
次に、第３図（ｄ）は、第３図（ｃ）に示した血清３１２から核酸を抽出する操作の後、第２図に示した円盤２０４の回転を停止し、円盤１００を抽出槽１０８付近において、遠心力が１５００Ｇ以上になるよう回転させたときの状態を示したものである。このとき、タンパク質の変性作用をもつ薬品３００として、例えばフェノールを用いた場合には、フェノール３００を遠心力が大きくなる部分に、核酸を含む水溶液３１６は遠心力が小さくなる部分に、その間にはフェノール３００によって変性された血清中の蛋白である（図示しない）アルブミンやグロブリンが層状に分布する。次に、流路１１８中にある開閉機構１２４を開くと、核酸を含む水溶液３１６が抽出槽１０８から回収槽１１０に移動する。
次に、第３図（ｅ）には、核酸を含む水溶液３１６から核酸濃度を高くした微量の溶液を取り出す、いわゆる遠心分離操作を示したものである。回収槽１１０には、予め、核酸よりも水分子と結合が容易な薬品３０２が保持されている。そして、薬品３００と核酸を含む水溶液３１６を反応させる。核酸よりも水分子と結合が容易な薬品３０２として、例えば、エタノールアルコールを用いると、水溶液３１６中の水分子とエタノールアルコール３０２の分子が結合し、核酸を溶かしていた水の容量が少なくなる。このため、核酸は析出する。さらに、核酸の密度が周りの水やエタノールアルコール３０２よりも大きいため、遠心力１０００の方向に沈殿する。このときの遠心力１０００は、大きいほど早く核酸が沈殿し、１００００Ｇ以上であることが望ましい。また、エタノールアルコール３０２の量は、これと反応させる水溶液３１６の２．５倍量がそれよりも多いことが望ましい。このため、回収槽１１０は、抽出槽１０８や分離槽１０６と比べて、その容積が大きくなるように、その寸法においてより深い槽となっている。ここで、核酸よりも水分子と結合が容易な薬品３０２として、例えば、イソプロピルアルコールを用れば、この量は、これと反応させる水溶液３１６の量と等量でよい。
第１図から第３図に示す構成によれば、遠心力１０００が最大になる所としては、流路１２０の途中にある開閉機構１２６付近になる。
次に、第３図（ｆ）には流路１２０の途中にある開閉機構１２６付近に沈殿した核酸を、付近の水溶液と共に核酸保持槽１１２に移動させる操作を示したものである。このときも、回収槽１１０には遠心力が１００００Ｇ以上かかっていることが望ましい。この重力下で、流路１２０の途中にある開閉機構１２６をきわめて短い時間開閉することにより、核酸濃度が高い溶液を核酸保持槽１１２に移動できる。例えば、遠心力１００００Ｇ、流路１２０の断面積が１平方ｍｍ、開閉時間１ｍ秒のとき、核酸保持槽１１２中には、５０マイクロリットルの溶液が保持できる。また、核酸保持槽１１２の容積が予め目的の容量に設定されているときには、開閉機構１２６を短時間に開閉する必要はなく、核酸保持槽１１２の中に溶液が満たされるまで開閉機構１２６を開けておけばよい。
第４図（ａ）には、各モータと、開閉機構の制御シーケンスを示したものである。すなわち、制御装置２３０が円盤１００を回転させるモーター２０２と、円盤２０４を回転させるモーター２０８と、円盤１００上の開閉機構１２２、１２４、１２６について、処理状態における動作状況を示したものである。ただし、各槽の円盤１００上での位置関係は第４図（ｂ）に示した通りである。また、回転軸２００の中心と回転軸２０６の中心との距離は５１ｍｍとしている。また、グラフの横軸は実時間ではなく、グラフ下部に記した処理内容としている。
以上述べたように、本実施例によれば、核酸保持槽１１２中の溶液に含まれる核酸の量は、サンプル保持槽１０４に注入される全血量に比例して増加する。核酸保持槽１１２中の溶液量は、流路１２０の途中にある開閉機構１２６付近に局在する溶液量に限定される。そのため、採血した全血３１０に含まれる核酸量が少ない場合には、全血量を増やすことで最終的に得られる溶液３２０中に含まれる核酸量を増やすことができ、高感度な核酸抽出を行うことができる。
逆に、全血３１０に含まれる核酸量が多い場合には、全血量を少なくすることで、最終的に得られる溶液３２０中に含まれる核酸量を調整することができ、幅広い核酸濃度をもつ全血に対応することができる。また、全血３１０から核酸を多く含む溶液３２０まで、複数の槽とこれを結ぶ流路の中で処理が行われるため、異物の進入の恐れがなく正確な抽出ができる。
以上述べた実施例では、円盤１００上に設置した各槽と、各流路と、注入口１０３は、円盤１００を形成する材料を直接くり抜いて一体形成することができる。一体形成すれば、円盤１００を小型化でき処理コストの低減を図ることができる。これは、円盤１００をディスポーザブル化が容易なことを意味し、検体間のコンタミネーションをなくすことができるという効果も得られる。円盤１００を形成する材料としては、ポリプロピレンやフッ素樹脂が適している。この他にも、全血にその成分が解け出さず、タンパク質の変性作用をもつ薬品３００に犯されない材料であれば適用可能である。さらに、槽や流路を形成する材料として、整形性の良いポリカーボネート樹脂を用いるときには、この表面をフッ素樹脂で被覆すれば、円盤１００の強度と処理における異物の混入を避けることができ、しかも、低コストで円盤１００を構成することができるという効果がある。また、槽や流路を形成する材料として、アルミニウム等３価のイオンを溶出する材料も利用することができる。前記材料を用いることで、槽等の立体的な形状をプレス加工することができ、製造コストを押さえることができる。
また、円盤１００上に設けた各槽と各流路とを、それぞれ別々にポリプロピレンの射出整形で形成し、これらを円盤１００上に配置するとともに、接着にて連結して製作してもよい。このようにして製作すると、各槽の容積を検体に応じて調整または選択でき、各槽での処理条件を最適化することができ、効率のよい核酸抽出を行うことができるという効果が得られる。
第５図に他の実施例を示す。本実施例は、先の実施例の抽出槽１０８（本実施例では第１の抽出槽称す）と回収槽１１０の間に、新たに流路１１６０と開閉機構１２２０と第２の抽出槽１０８０を設置したものである。第２の抽出槽１０８０内には、予め、タンパク質の変性作用をもつ薬品３０００としてフェノールを保持している。この第２の抽出槽１０８０では、第１の抽出槽１０８で抽出した核酸を含む水溶液を、さらに薬品３０００で再抽出を行う構成にしたものである。本構成にすることで、回収槽１１０に移動する溶液に含まれるタンパク質を、先の構成の場合に比べさらに少なくすることができ、核酸の抽出精度を向上させる効果が得られる。
第６図さらに他の実施例の構成を示す。本構成では、回収槽１１０（本実施例では第１の回収槽と称する）と核酸保持槽１１２の間に、新たに流路１２００と開閉機構１２４０と第２の槽１１００を設置した構成としたものである。第２の回収槽１１００内には、予め、第１の回収槽１１０と同様にエタノールアルコール３０２を保持しておき、第１の回収槽１１０で核酸を含む水層から核酸濃度を高くした微量の液を取り出す。その後、さらに、第２の回収槽１１００で、この微量の液とエタノールアルコール３０２を混合して遠心分離操作を行い、再度核酸濃度を高くした微量の溶液を取り出す構成とした。従って、核酸保持槽１１２に移動する溶液に含まれる糖分をさらに少なくすることができ、核酸の抽出精度を向上させる効果が得られる。
なお、上記実施例では円盤１００上にはサンプルである全血を注入する注入穴１０３とサンプル保持槽１０４から核酸保持槽１１２までの処理設備を１つ設けた例で説明したが、複数設置しても同様の効果を得ることができる。複数の処理設備を１つの円盤上に設けることで、複数の核酸を含む水溶液からそれぞれ核酸を抽出する処理において、単位時間辺りの処理数を増やす効果が得られる。
以下、本発明の他の実施例を、第７図を用いて詳細に説明する。
第７図は、核酸を含む水溶液から核酸を抽出するため、円盤上に円周方向に複数の部屋を設け、部屋の間の隔壁には開閉機構を備えた構成としたものである。本実施例では円盤は時計周りに回転するものとして説明する。
円盤７００には、回転方向および円周方向に隔壁で仕切られた複数の槽（部屋）が設けてある。円盤７００には、円盤７００を回転させるための機構（回転軸）に装着するための穴７０２が設けてある。また、円盤内には全血を保持するためのサンプル保持槽７０６と、全血から血清を分離するための分離槽７１２と、核酸を内包する核壁から核酸を取り出すための抽出槽７１８と、水溶液中に拡散した核酸を収集するための回収槽７２４と、核酸よりも水分子と結合が容易な薬品を保持する薬品槽７３０と、抽出した核酸を保持する核酸保持槽７３６とが設けてある。
図のように、サンプル保持槽７０６の外周側に設けられた分離槽７１２は、隔壁７０７で分画され、両者は開閉機構としての遠心力とバネ７１０で制御される封止子７０８で連結されている。分離槽７１２と抽出槽７１８は隔壁７１７で分画され、両者は開閉機構としての遠心力とバネ７１６で制御される封止子７１４で連結されている。抽出槽７１８と回収槽７２４は、隔壁７２３で分画され、開閉機構としての遠心力とバネ７２２で制御される封止子７２０と封止子７２１で連結されている。なお、隔壁７２３は、サンプル保持槽７０６と回収槽の隔壁としても用いられている。回収槽７２４と薬品槽７３０は隔壁７２９で分画され、両者は開閉機構としての遠心力とバネ７２８で制御される封止子７２６で連結されている。回収槽７２４と核酸保持槽７３６は、開閉機構としての遠心力とバネ７３４で制御される封止子７３２で連結されている。また、サンプル保持槽７０６の上面には全血を注入する注入穴７０４が設置されている。
次に、第８図（ａ）から第８図（ｆ）を用いて、円盤７００を用いた核酸抽出の動作を説明する。
第８図（ａ）において、円盤７００静止させた状態で、注入穴７０４から全血７５０を注入する。このとき、封止子７０８は閉じており、全血７５０がサンプル保持槽７０６に閉じ込められる。また、抽出槽７１８には、予めタンパク質の変性作用をもつ薬品７５２が、薬品槽７３０には核酸よりも水分子と結合が容易な薬品７５４が保持されている。
次に、円盤７００を回転（時計回りに回転）する。すると、第８図（ｂ）に示すように、円盤７００の最外周における遠心力が１５００Ｇ以上になる回転数に達すると、封止子７０８と封止子７１４が開き、サンプル保持槽７０６に保持されていた全血７５０は、分離槽７１２に移動する。なお封止子７１４は抽出槽７１８に全血が流れ込まない程度に外周側に向けて移動して開放状態となっている。分離槽７１２では、円盤７００の外側の遠心力が大きいところに赤血球以外の成分７５６が分布し、血清７５８はこれよりも内側に分布する。そして、全血７５０がサンプル保持槽７０６から分離槽７１２に移動するにつれて、血清７５８は封止子７１４の先端の開放部分から抽出槽７１８にあふれ出していく。このとき、赤血球以外の成分７５６は封止子７１４を越えることができないように封止子７１４の開放間隔を設定すると、抽出槽７１８へは血清のみが移動することになる。
次に、第８図（ｃ）に、血清７５８が抽出槽７１８に移動し終わり、円盤７００の回転数を下げて封止子７０８と封止子７１４が閉じた状態を示している。この抽出槽７１８内には予めタンパク質の変性作用をもつ薬品７５２が所定量保持されている。タンパク質の変性作用をもつ薬品７５２として、例えば、フェノールを用いるときには、抽出槽７１８内でフェノール７５２は油層として、血清７５８は水層として分離状態にある。ここで、フェノール７５２の量は、これと反応させる血清７５８と同量かそれよりも多いことが望ましい。
次に、血清７５８中の核酸を抽出するために、フェノール７５２と血清７５８を撹拌するする。そこで、第２図における円盤１００を円盤７００に代替して、円盤７００が回転軸２００を中心にモーター２０２で回転している状態に加えて、これらが搭載された円盤２０４を、回転軸２０６を中心にモーター２０８で回転させて遊星運動を利用して撹拌することにした。このとき、円盤７００と円盤２０４の回転数としては、抽出槽７１８の円盤７００最外周部分において円盤７００と円盤２０４が回転することによって生じる遠心力が合成され、その合成遠心力の方向が円盤７００の回転角度に依存しないような値を用いる。例えば、円盤７００の半径が５０ｍｍで、回転軸２００と回転軸２０６との距離が５３ｍｍとし、さらに円盤７００の回転数が５００ｒｐｍの場合は、円盤２０４の回転数は２０００ｒｐｍよりも高くすればよい。ただし、封止子７０８と封止子７１４が閉じた状態になる回転数にする。
この撹拌を行った後、第２図に示した円盤２０４の回転を停止しすると共に、円盤７００の回転数を高くする。これにより、抽出槽７１８内で遠心力が大きいところにフェノール７５２が分布し、核酸を含む水溶液７６０はこれよりも内側に分布し、その間にはフェノール７５２によって変性された血清中の蛋白である（図示しない）アルブミンやグロブリンが層状に分布する。
次に、第８図（ｄ）は、抽出槽７１８中に分布した核酸を多く含む水溶液７６０を、回収槽７２４に移す操作を示したものである。このとき、円盤７００は、抽出槽７１８におけるタンパク質の属性作用を持つ薬品であるフェノール７５２と、核酸を含む水溶液７６０を分離する回転数よりも、さらに、分離槽７１２において血清７５８と赤血球以外の成分７５６に分離する回転数よりも高く、およそ回収槽に３０００Ｇの遠心力が生じるようにする。このとき、抽出槽７１８と回収槽７２４を連結している封止子７２０と封止子７２１のうち、封止子７２１が遠心力に応じて移動し、封止子７２０との間に隙間を発生し、この隙間から水溶液７６０が回収槽７２４に移る。しかし、封止子７０８と封止子７１４も同時に隙間が生じるが、赤血球以外の成分７５６やタンパク質の変性作用をもつ薬品７５２はそれぞれ槽７１２と槽７１８から移動することはない。
次に、第８図（ｅ）は回収槽７２４に保持した核酸を含む水溶液７６０から、核酸濃度を高くした微量の溶液を取り出す操作を示したものである。その時の、円盤７００の回転数は、第８図（ｄ）における円盤７００の回転数よりも高くして、およそ４０００Ｇの遠心力が生じるようにする。このとき、抽出槽７１８と回収槽７２４を連結している封止子７２０と封止子７２１のうち、封止子７２１が遠心力に応じ下がり切る。それと同時に、封止子７２０が封止子７２１との隙間を閉じるよう下がり、回収槽７２４は水溶液７６０を保持したまま密閉化される。さらに、円盤７００の回転数を上げて、およそ５０００Ｇの遠心力が生じるようにする。このとき、回収槽７２４と薬品槽７３０を連結している封止子７２６が下がり、薬品槽７３０に保持されている核酸よりも水分子と結合が容易な薬品７５４が回収槽７２４に移る。それにより、水溶液７６０と反応した水溶液７６２となる。ここでは、核酸よりも水分子と結合が容易な薬品７５４として、例えば、エタノールアルコールを用いた。これにより、水溶液７６２中では、水分子とエタノールアルコールの分子が結合し核酸を溶かしていた水の容量が少なくなる。このため、核酸は析出し、さらに、核酸の密度が周りの水やエタノールアルコールよりも大きくなり、遠心力より大きな方向に沈殿する。この沈殿は、遠心力が大きいほど短い時間で行える。また、核酸濃度が低い水溶液７６０の沈殿に適用することができ、遠心力は１００００Ｇ以上であることが望ましい。また、エタノールアルコール７５４の量は、これと反応させる水溶液７６０の２．５倍量かそれよりも多いことが望ましい。このため、回収槽７２４は、抽出槽７１８や分離槽７１２に比べて、容積が大きくなるよう、その寸法においてより深い槽となっている。
次に、第８図（ｆ）は、回収槽７２４に保持された水溶液７６２中の遠心力で沈殿した核酸と、その周辺のわずかな水溶液を、核酸保持槽７３６に移動させる操作を示したものである。１００００Ｇ以上の遠心力で封止子７３２は下がり、核酸が沈殿してその濃度が高くなった溶液が核酸保持槽７３６に移動する。遠心力を１００００Ｇ以上であれば，封止子７３２は下がったままになるので、この遠心力で遠心を続ける間、核酸は核酸保持槽７３６に溜り続ける。そして、円盤７００の回転を下げ停止するときには、１００００Ｇを切った時点で封止子７３６は閉じるので、核酸保持槽７３６から核酸が再び拡散していくことはない。
第９図（ａ）は、制御装置２３０が円盤７００を回転させるモーター２０２と、円盤２０４を回転させるモーター２０８と、円盤７００上の封止子７０８と７１４と７２０と７２１と７２６と７３６の動作を示したものである。ただし、封止子７０８と７１４と７２０と７２１と７２６と７３６の円盤７００上での位置関係は第９図（ｂ）に示した通りである。ここでは、回転軸２００と回転軸２０６の距離は５３ｍｍ、円盤７００の直径は１００ｍｍとしている。また、グラフの横軸は実時間ではなく、グラフ下部に記した処理内容としている。
以上述べたように、本実施例によれば、円盤７００上に形成する槽が隔壁で分画されているため、処理する全血量をさらに多くすることができ、高感度な核酸抽出を行うことができる。また、各槽を含む円盤７００全体を、ポリプロピレン等を射出整形して製作すれば、円盤７００の製造コストを下げることができるという特徴がある。また、各槽を含む円盤７００全体をポリカーボネート樹脂で押し出し整形し、この表面をフッ素樹脂で被覆すれば、円盤７００の強度と処理における異物の混入を避けることができる。さらに、低コストで円盤７００を構成することができる。これは、処理する全血量が少ないときにも有効で、ポリカーボネート樹脂表面を型押しで各槽を形成して表面をフッ素樹脂で被覆すれば、より低コストで円盤７００を構成することができる。
なお、第２図に示した円盤７００をモーター２０２で回しながら、これ全体を乗せた円盤２０４をモーター２０８で回す撹拌工程において、抽出槽７１８内にフッ素樹脂の小片等の撹拌子を予め入れておくと、撹拌の効果が高まり、撹拌時間を短くすることができる。また、モーター２０８で円盤２０４を回すことなく、円盤７００を回すモーター２０２を間欠的に回転と停止を繰り返して撹拌すれば、装置構成を簡易にすることができ装置コストを低減することができる。
なお、円盤７００上には穴７０４とサンプル保持槽７０６から核酸保持槽７３６までの処理設備を複数設置しても同様の効果を得ることができる。複数の処理設備を設けることで、複数の核酸を含む水溶液からそれぞれ核酸を抽出する処理において、単位時間辺りの処理数を増やす効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の第１の実施例による核酸を含む水溶液から核酸を抽出するデバイスの外観図、第２図は、第１の実施例による核酸を含む水溶液から核酸を抽出するデバイスを遠心または攪拌するための機構を説明するための外観図、第３図は、第１の実施例による核酸を含む水溶液から核酸を抽出するデバイスを用いて核酸を抽出する手順を示す図、第４図は、第１の実施例による核酸を含む水溶液から核酸を抽出するデバイスにおける、これを遠心または攪拌するための機構と開閉機構の動作の関連を示す図、第５図は、第１の実施例による核酸を含む水溶液から核酸を抽出するデバイスの機能を説明する図、第６図は、第１の実施例による核酸を含む水溶液から核酸を抽出するデバイスの機能を説明する図、第７図は、本発明の第２の実施例による核酸を含む水溶液から核酸を抽出するデバイスの外観図、第８図は、第２の実施例による核酸を含む水溶液から核酸を抽出するデバイスを用いて核酸を抽出する手順を示す図、第９図は、第２の実施例による核酸を含む水溶液から核酸を抽出するデバイスにおける、これを遠心または攪拌するための機構と開閉機構の動作の関連を示す図である。Technical field
The present invention relates to a nucleic acid extraction device for extracting nucleic acids from cells, microorganisms, viruses, and the like in an aqueous solution.
Background art
There is a genetic diagnosis that uses a nucleic acid to diagnose a subject from the pattern. In this genetic diagnosis, nucleic acids are extracted from body fluids, tissues, or the like collected from a subject, and diagnosis is performed by pattern analysis of the nucleic acids. For this reason, the nucleic acid must be accurately extracted. As a conventional technique relating to nucleic acid extraction, for example, “Bio-Experiment Illustrated (1) Basics of Molecular Biology Experiment (1995, Shujunsha) P113 to P122” (hereinafter referred to as Conventional Technique 1) A method is disclosed in which an aqueous solution containing the solution is held in a small container called a tube, and various processing solutions are manually injected and stirred with the solution, and centrifugation is repeated. As a device that automates this operation, it is marketed as Toyobo Co., Ltd. (nucleic acid automatic separation device, NS-1000 type).
Further, as a prior art 2, “Micro Total Analysis System '2000 Proceedings (2000), P239 to P242”, a solution holding tank, a reaction fine flow path, and a heating element are provided on a resin circular substrate, and the circular substrate is rotated. A method is disclosed in which a centrifugal force generated at the time of the reaction causes a reaction with a liquid to be sent to extract nucleic acid from whole blood and analyze the pattern of the nucleic acid.
In the above prior art, the following problems are likely to occur, and avoiding them involves technical difficulties. That is, the method of holding and treating the aqueous solution containing nucleic acid and various solutions of the prior art 1 in a small container called a tube can increase the sample volume and perform simple processing, but foreign matter may be mixed during the operation. There is a problem that it is easy to extract, and accurate extraction is difficult. Although a complicated mechanism such as a robot system is adopted to automate these operations, it is difficult to increase the apparatus cost and to improve the processing throughput. In the method of processing on a resin circular substrate of the prior art 2, the aqueous solution containing nucleic acids and various solutions are all held on a single substrate, and high-precision extraction is possible without contamination of foreign substances. There is a problem that the sample volume cannot be increased because the holding tank and the fine reaction channel are fine, and it is difficult to extract a small amount of nucleic acid contained in the sample. In mixing a sample or a solution, it is difficult to mix two liquids that separate into an oil phase and an aqueous phase in a stationary state. Could not be done.
An object of the present invention is to realize an accurate and high-sensitivity nucleic acid extraction device that does not contaminate foreign substances in a device for extracting nucleic acid from an aqueous solution containing nucleic acid, and to provide the device at low cost.
Disclosure of the invention
The present invention includes a plurality of tanks separated by a flow path or a partition for an aqueous solution containing nucleic acid such as blood on a rotating disk, and connects the respective tanks by operating an opening / closing mechanism provided in the flow path or the partition. Then, by rotating the disk and operating the opening / closing mechanism, the nucleic acid is extracted while being sequentially moved for each component.
In addition, all or a part of the flow path or the partition, the opening / closing mechanism, and the tank are made of a plastic material from which a part of the component is not eluted with a chemical having a protein denaturing action. Further, in order to separate the protein into any of the plurality of tanks, a predetermined amount of a drug having a denaturing effect on the protein or a drug which is easier to bind to a water molecule than a nucleic acid is enclosed in advance.
Here, the chemical having a protein denaturing action is a solution in which guanidine thiocyanate, phenol, phenol, chloroform and isoamyl alcohol are mixed at a ratio of 25: 24: 1, respectively. Alternatively, it refers to a chemical having a function of breaking a membrane made of a protein containing a nucleic acid and extracting the nucleic acid, such as a solution in which chloroform and isoamyl alcohol are mixed at a ratio of 24: 1.
In addition, a drug that is easier to bind to a water molecule than a nucleic acid refers to a drug such as ethanol or isopropyl alcohol that has an action of coagulating a nucleic acid dissolved in water when mixed with an aqueous solution containing a nucleic acid.
With the above configuration, an aqueous solution containing a nucleic acid is held in a tank for each component thereof, so that an aqueous solution containing a large amount of a nucleic acid is treated without being limited to a volume per unit length of a flow path connecting these components. can do. In addition, since all processes can be automated, accurate extraction can be performed without foreign matter entering. In addition, the tank holding the aqueous solution is separated by a partition wall, and the tank is manufactured by injection molding of plastic, whereby the cost can be reduced. Then, since this can be used up in one extraction, there is a feature that a measurement error does not occur due to a difference in the object to be measured. In addition, by separating the tank holding the aqueous solution with a partition wall and making this tank detachable, optimal conditions can be set in the processing in each tank, and efficient extraction becomes possible. Further, since the aqueous solution containing the nucleic acid is moved, the transport capacity is improved, and the throughput of extraction can be improved. Furthermore, if blood is treated as an aqueous solution containing nucleic acids using this centrifugal force, serum can be obtained by the effect of centrifugation, so that the throughput of extraction can be improved.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
FIG. 1 (a) shows a plurality of tanks formed on a rotating disk and connected by a flow path having an opening / closing mechanism for extracting nucleic acids from an aqueous solution containing nucleic acids. In this example, particularly, human whole blood is described as an example of an aqueous solution containing nucleic acids, but the same applies to an aqueous body fluid of a living body containing nucleic acids, or an aqueous solution in which a tissue containing nucleic acids is suspended in water. Can be extracted.
FIG. 1 (b) is an enlarged view of a portion of the tank and the flow channel of FIG. 1 (a). A plurality of tanks are formed on the disk 100. The disk 100 also has a mounting hole 102 for mounting and rotating the disk 100 on a drive mechanism. The disk 100 is provided with the following layers. A sample holding tank 104 for holding whole blood as a sample for analysis, a separation tank 106 for separating serum from whole blood, and an extraction tank 108 for removing nucleic acid from a nuclear wall containing nucleic acid; A collection tank 110 for collecting nucleic acids diffused in the aqueous solution, and a nucleic acid holding tank 112 for holding extracted nucleic acids. The sample holding tank 104 and the separation tank 106 are connected by a channel 114. The separation tank 106 and the extraction tank 108 are connected by a flow path 116. The flow path 116 is provided with an opening / closing mechanism 122 for controlling the movement of the solution on the way. The flow path 118 connects the extraction tank 108 and the recovery tank 110, and includes an opening / closing mechanism 124 for controlling the movement of the solution in the middle thereof. The flow path 120 connects the collection tank 110 and the nucleic acid holding tank 112, and includes an opening / closing mechanism 126 in the middle thereof for controlling the movement of the solution. The wiring 128, the wiring 130, and the wiring 132 are connected to a control device (not shown) outside the disk 100 through the hole 102 in order to control the respective opening / closing mechanisms 122, 124, and 126. Although the opening / closing mechanism of this embodiment is configured by an electromagnetic valve that opens and closes with an electromagnetic force, the present invention is not limited to this method, and a system that switches gears and the like with a single drive system to open and close may be used.
The sample holding tank 104 is provided with a hole 103 for injecting whole blood. The tanks and the flow passages other than the holes are sealed to shut off outside air, thereby preventing foreign matter from entering.
FIG. 2 shows a mechanism for generating a centrifugal force by rotating the disk 100 including the tank and a mechanism for stirring the solution contained in the tank in the disk 100. The disk 100, the rotating shaft 200 and the motor 202 are mounted on the disk 204. The disk 204 is driven to rotate by a rotation shaft 206 of a motor 208. In this embodiment, the center of the rotation axis 200 of the disk 100 and the center of the rotation axis 206 of the disk 204 are attached with a predetermined distance therebetween. By providing the rotating shafts at intervals, the centrifugal force applied to each tank can be increased as described later. That is, while rotating around the rotating shaft holding the disk 100, the whole of them is in a so-called planetary motion in which the center of the rotating shaft is shifted from the rotating shaft 206 of the disk 204.
The disk 204 is provided with wirings 212, 214, 216, which are connected to wirings 128, 130, 132 provided on the rotating disk 100. In addition, wirings 218 and 220 for driving and controlling the motor 202 are provided on the disk 204. The operation of each opening / closing mechanism and the motor on the disk 100 and the operation of the motor 208 for rotating the disk 204 are intensively controlled by a controller 230 via a control line 232.
FIGS. 3 (a) to 3 (f) are diagrams for explaining the operation of extracting nucleic acids from whole blood. 3 (a) to 3 (f), a chemical not shown in FIG. 1 or FIG. 2, which has a protein denaturing action for removing nucleic acids from a nuclear wall containing nucleic acids. 300 is stored in the extraction tank 108, and a chemical 302, which is easier to bind to water molecules than nucleic acids, is stored in the recovery tank 110 by a predetermined amount. Arrow 1000 indicates the direction of centrifugal force generated by rotation of disk 100.
FIG. 3A shows a state where the disk 100 is in a stationary state. At this time, the collected blood 310 is injected into the sample holding tank 104 from the injection hole 103.
Next, FIG. 3B shows a state where the disk 100 is rotated near the separation tank 106 so that the centrifugal force becomes 1500 G or more. Whole blood 310 moves from sample holding tank 104 to separation tank 106. When this rotation is continued for about 5 minutes, substances 314 other than serum are distributed on the outer peripheral side of the disk 100 and serum 312 is distributed on the rotation center side in the separation tank 106 due to centrifugal force. At this time, as the rotation speed of the disk 100 increases, the time for separating serum and components other than serum in the separation tank 106 can be shortened. In order to send the separated high-purity serum to the next extraction layer 108 because of the above-described separation state, the outlet of the flow channel 114 in the separation tank should be located on the outer peripheral side of the Is desirably installed on the rotation center side of the disk 100. The separated serum 312 passes through the opening / closing mechanism 122 that has been opened in advance through the flow path 116 and moves to the extraction tank 108.
FIG. 3 (c) shows a state where nucleic acids are extracted from the serum 312 in the extraction tank. A predetermined amount of a drug 300 having a protein denaturing action is held in the extraction tank 108 in advance, and the drug 300 reacts with the serum 112. In the case where, for example, phenol is used as the chemical 300 having a protein denaturing effect, when serum is sent, the phenol 300 is initially separated as an oil layer and the serum 312 is separated as an aqueous layer in the extraction tank 108. It is in. The amount of phenol 300 is preferably equal to or greater than the amount of serum 112 to be reacted.
As described above, since the serum 312 and the medicine 300 are in a separated state, in addition to the state where the disk 100 is rotated by the motor 202, the disk 204 is also rotated by the motor 208 and agitated. At this time, the opening and closing mechanisms 122 and 124 in the middle of the flow path 116 and the flow path 118 are closed. The centrifugal force generated by the rotation of both disks is synthesized in the extraction tank 108 on the disk 100. For this reason, it is necessary to set the rotation speed of the disk 100 and the disk 204 to a value such that the direction of the centrifugal force does not depend on the rotation angle of the disk 100. For example, the extraction tank 108 is provided at a position 45 mm away from the center of the rotating shaft 200 (the diameter of the extracting tank 108 is 6 mm), and the rotating shaft 200 is arranged at a distance of 51 mm from the rotating shaft 206. When the rotation speed of the disk 100 is 500 rpm, the rotation speed of the disk 204 may be higher than 2000 rpm. In addition, if the shape of the extraction tank 108 is a polygon such as a square or the like as well as a circle as shown in FIG. 1 to FIG. 3, the effect of extracting nucleic acids is enhanced.
Next, FIG. 3 (d) shows that after the operation of extracting nucleic acids from the serum 312 shown in FIG. 3 (c), the rotation of the disk 204 shown in FIG. In the vicinity of 108, a state where the centrifugal force is rotated to be 1500 G or more is shown. At this time, for example, when phenol is used as the chemical 300 having a protein denaturing effect, the phenol 300 is placed in a portion where the centrifugal force is increased, the aqueous solution 316 containing nucleic acid is placed in a portion where the centrifugal force is reduced, Albumin and globulin, which are proteins (not shown) in serum modified by phenol 300, are distributed in layers. Next, when the opening / closing mechanism 124 in the flow path 118 is opened, the aqueous solution 316 containing nucleic acid moves from the extraction tank 108 to the collection tank 110.
Next, FIG. 3 (e) shows a so-called centrifugal separation operation of taking out a very small amount of the solution having a high nucleic acid concentration from the aqueous solution 316 containing the nucleic acid. The recovery tank 110 previously holds a chemical 302 that is easier to bind to water molecules than nucleic acids. Then, the chemical 300 is reacted with the aqueous solution 316 containing the nucleic acid. If, for example, ethanol alcohol is used as the chemical 302 that binds to water molecules more easily than nucleic acids, the water molecules in the aqueous solution 316 and the molecules of ethanol alcohol 302 bind, and the volume of water in which the nucleic acids are dissolved is reduced. For this reason, the nucleic acid precipitates. Further, since the density of the nucleic acid is higher than that of surrounding water or ethanol alcohol 302, the nucleic acid precipitates in the direction of centrifugal force 1000. The larger the centrifugal force 1000 at this time, the faster the nucleic acid precipitates, and it is preferable that the centrifugal force is 10,000 G or more. Further, the amount of ethanol alcohol 302 is desirably 2.5 times the amount of aqueous solution 316 to be reacted therewith. For this reason, the recovery tank 110 is a deeper tank in its dimensions so that its volume is larger than the extraction tank 108 and the separation tank 106. Here, if isopropyl alcohol is used as the chemical 302 that is easier to bind to a water molecule than a nucleic acid, for example, the amount may be equal to the amount of the aqueous solution 316 to be reacted therewith.
According to the configuration shown in FIG. 1 to FIG. 3, the location where the centrifugal force 1000 becomes maximum is near the opening / closing mechanism 126 in the middle of the flow path 120.
Next, FIG. 3 (f) shows an operation of moving the nucleic acid precipitated near the opening / closing mechanism 126 in the middle of the channel 120 to the nucleic acid holding tank 112 together with the nearby aqueous solution. At this time, it is desirable that the centrifugal force is applied to the collection tank 110 at 10,000 G or more. By opening and closing the opening / closing mechanism 126 in the middle of the flow path 120 for a very short time under the gravity, the solution having a high nucleic acid concentration can be moved to the nucleic acid holding tank 112. For example, when the centrifugal force is 10000 G, the cross-sectional area of the flow channel 120 is 1 square mm, and the opening and closing time is 1 ms, the nucleic acid holding tank 112 can hold 50 microliter of the solution. When the volume of the nucleic acid holding tank 112 is set to a target volume in advance, it is not necessary to open and close the opening / closing mechanism 126 in a short time, and open the opening / closing mechanism 126 until the solution is filled in the nucleic acid holding tank 112. You should leave it.
FIG. 4A shows a control sequence of each motor and the opening / closing mechanism. That is, the operation state of the motor 202 for rotating the disk 100, the motor 208 for rotating the disk 204, and the opening / closing mechanisms 122, 124, 126 on the disk 100 by the control device 230 in the processing state are shown. However, the positional relationship of each tank on the disk 100 is as shown in FIG. 4 (b). The distance between the center of the rotating shaft 200 and the center of the rotating shaft 206 is 51 mm. The horizontal axis of the graph is not the real time but the processing content shown at the bottom of the graph.
As described above, according to the present embodiment, the amount of nucleic acid contained in the solution in the nucleic acid holding tank 112 increases in proportion to the amount of whole blood injected into the sample holding tank 104. The amount of the solution in the nucleic acid holding tank 112 is limited to the amount of the solution localized near the opening / closing mechanism 126 in the middle of the channel 120. Therefore, when the amount of nucleic acid contained in the collected whole blood 310 is small, the amount of nucleic acid contained in the finally obtained solution 320 can be increased by increasing the amount of whole blood, and highly sensitive nucleic acid extraction can be performed. It can be carried out.
Conversely, when the amount of nucleic acid contained in whole blood 310 is large, the amount of nucleic acid contained in finally obtained solution 320 can be adjusted by reducing the amount of whole blood, and a wide range of nucleic acid concentration can be obtained. It can handle whole blood. In addition, since the processing from the whole blood 310 to the solution 320 containing a large amount of nucleic acid is performed in a plurality of tanks and a flow path connecting the tanks, accurate extraction can be performed without fear of foreign matter entering.
In the embodiment described above, each tank, each flow path, and the inlet 103 installed on the disk 100 can be integrally formed by directly hollowing out the material forming the disk 100. If formed integrally, the disk 100 can be reduced in size and the processing cost can be reduced. This means that the disc 100 can be easily made disposable, and the effect of eliminating contamination between samples can be obtained. As a material for forming the disk 100, polypropylene or a fluororesin is suitable. In addition, any material can be applied as long as its components are not dissolved in whole blood and are not violated by the drug 300 having a protein denaturing action. Furthermore, when a polycarbonate resin having good shapeability is used as a material for forming the tank and the flow path, if this surface is coated with a fluororesin, the strength of the disk 100 and the intrusion of foreign matter in the processing can be avoided, and There is an effect that the disk 100 can be formed at low cost. In addition, as a material for forming the tank or the flow path, a material that elutes trivalent ions such as aluminum can be used. By using the material, a three-dimensional shape such as a tank can be pressed, and the manufacturing cost can be reduced.
Alternatively, the tanks and the channels provided on the disk 100 may be separately formed by injection molding of polypropylene, and these may be disposed on the disk 100 and connected by bonding. When manufactured in this manner, the capacity of each tank can be adjusted or selected according to the sample, the processing conditions in each tank can be optimized, and the effect of efficient nucleic acid extraction can be obtained. .
FIG. 5 shows another embodiment. In this embodiment, a new flow path 1160, an opening / closing mechanism 1220, and a second extraction tank 1080 are newly provided between the extraction tank 108 of the previous embodiment (referred to as a first extraction tank in this embodiment) and the collection tank 110. It was installed. Phenol is previously held in the second extraction tank 1080 as a chemical 3000 having a protein denaturing action. In the second extraction tank 1080, the aqueous solution containing the nucleic acid extracted in the first extraction tank 108 is re-extracted with the chemical 3000. With this configuration, the amount of protein contained in the solution that moves to the collection tank 110 can be further reduced as compared with the case of the previous configuration, and the effect of improving nucleic acid extraction accuracy can be obtained.
FIG. 6 shows the configuration of still another embodiment. In this configuration, a flow path 1200, an opening / closing mechanism 1240, and a second tank 1100 are newly provided between the collection tank 110 (referred to as a first collection tank in this embodiment) and the nucleic acid holding tank 112. Things. In the second collection tank 1100, an ethanol alcohol 302 is held in advance similarly to the first collection tank 110, and a small amount of nucleic acid having a higher nucleic acid concentration from the aqueous layer containing nucleic acids in the first collection tank 110 is stored. Remove the liquid. After that, in the second recovery tank 1100, this small amount of the liquid and the ethanol alcohol 302 were mixed and centrifuged, and a small amount of the solution with a higher nucleic acid concentration was taken out again. Therefore, the amount of sugar contained in the solution moving to the nucleic acid holding tank 112 can be further reduced, and the effect of improving the accuracy of nucleic acid extraction can be obtained.
In the above embodiment, the disk 100 is provided with one injection hole 103 for injecting whole blood as a sample and one processing equipment from the sample holding tank 104 to the nucleic acid holding tank 112. However, the same effect can be obtained. Providing a plurality of processing facilities on a single disk has the effect of increasing the number of processes per unit time in the process of extracting nucleic acids from an aqueous solution containing a plurality of nucleic acids.
Hereinafter, another embodiment of the present invention will be described in detail with reference to FIG.
FIG. 7 shows a configuration in which a plurality of rooms are provided on a disk in a circumferential direction in order to extract nucleic acids from an aqueous solution containing nucleic acids, and a partition between the rooms is provided with an opening / closing mechanism. In this embodiment, the disk is described as rotating clockwise.
The disk 700 is provided with a plurality of tanks (rooms) partitioned by partitions in the rotation direction and the circumferential direction. The disk 700 is provided with a hole 702 for mounting on a mechanism (rotating shaft) for rotating the disk 700. The disc also includes a sample holding tank 706 for holding whole blood, a separation tank 712 for separating serum from whole blood, and an extraction tank 718 for extracting nucleic acids from a nuclear wall containing nucleic acids. A collection tank 724 for collecting nucleic acids diffused in the aqueous solution, a chemical tank 730 for holding a drug that is easier to bind to water molecules than nucleic acids, and a nucleic acid holding tank 736 for holding extracted nucleic acids are provided. .
As shown in the figure, a separation tank 712 provided on the outer peripheral side of the sample holding tank 706 is partitioned by a partition 707, and both are connected by a centrifugal force as an opening and closing mechanism and a seal 708 controlled by a spring 710. ing. The separation tank 712 and the extraction tank 718 are separated by a partition 717, and both are connected by a seal 714 controlled by a centrifugal force as an opening / closing mechanism and a spring 716. The extraction tank 718 and the recovery tank 724 are separated by a partition wall 723, and are connected by a seal 720 and a seal 721 controlled by a centrifugal force as an opening and closing mechanism and a spring 722. The partition 723 is also used as a partition for the sample holding tank 706 and the collection tank. The recovery tank 724 and the chemical tank 730 are partitioned by a partition wall 729, and both are connected by a seal 726 controlled by a centrifugal force as an opening / closing mechanism and a spring 728. The collection tank 724 and the nucleic acid holding tank 736 are connected by a seal 732 controlled by a centrifugal force as an opening and closing mechanism and a spring 734. An injection hole 704 for injecting whole blood is provided on the upper surface of the sample holding tank 706.
Next, the operation of nucleic acid extraction using the disk 700 will be described with reference to FIGS. 8 (a) to 8 (f).
In FIG. 8 (a), whole blood 750 is injected from injection hole 704 with disk 700 still. At this time, the seal 708 is closed, and the whole blood 750 is confined in the sample holding tank 706. The extraction tank 718 holds in advance a drug 752 having a protein denaturing action, and the drug tank 730 holds a drug 754 which is easier to bind to water molecules than nucleic acid.
Next, the disk 700 is rotated (rotated clockwise). Then, as shown in FIG. 8 (b), when the centrifugal force at the outermost periphery of the disk 700 reaches a rotation speed at which the rotation speed becomes 1500 G or more, the seals 708 and 714 are opened and held in the sample holding tank 706. The removed whole blood 750 moves to the separation tank 712. The sealer 714 is moved toward the outer peripheral side to the extent that whole blood does not flow into the extraction tank 718 and is in an open state. In the separation tank 712, components 756 other than red blood cells are distributed at a place where the centrifugal force is large outside the disk 700, and the serum 758 is distributed inside this. Then, as the whole blood 750 moves from the sample holding tank 706 to the separation tank 712, the serum 758 overflows from the open end of the tip of the seal 714 to the extraction tank 718. At this time, if the opening interval of the seal 714 is set so that the components 756 other than red blood cells cannot pass through the seal 714, only the serum moves to the extraction tank 718.
Next, FIG. 8 (c) shows a state in which the serum 758 has finished moving to the extraction tank 718, the rotational speed of the disk 700 has been reduced, and the seals 708 and 714 have been closed. A predetermined amount of a chemical 752 having a protein denaturing action is held in the extraction tank 718 in advance. For example, when phenol is used as the chemical 752 having a protein denaturing action, the phenol 752 is separated as an oil layer and the serum 758 is separated as an aqueous layer in the extraction tank 718. Here, the amount of phenol 752 is desirably equal to or greater than the amount of serum 758 to be reacted therewith.
Next, the phenol 752 and the serum 758 are stirred to extract nucleic acids in the serum 758. Therefore, the disk 100 in FIG. 2 is replaced with a disk 700, and in addition to the state in which the disk 700 is rotated by the motor 202 around the rotation axis 200, the disk 204 on which these are mounted is replaced with the rotation axis 206. It was rotated by a motor 208 at the center and agitated using planetary motion. At this time, centrifugal force generated by rotation of the disk 700 and the disk 204 at the outermost peripheral portion of the disk 700 of the extraction tank 718 is combined as the rotation speed of the disk 700 and the disk 204, and the direction of the combined centrifugal force is determined by the direction of the disk 700. Use a value that does not depend on the rotation angle of. For example, when the radius of the disk 700 is 50 mm, the distance between the rotation shaft 200 and the rotation shaft 206 is 53 mm, and the rotation speed of the disk 700 is 500 rpm, the rotation speed of the disk 204 may be higher than 2000 rpm. However, the number of rotations is such that the seal 708 and the seal 714 are closed.
After the stirring, the rotation of the disk 204 shown in FIG. 2 is stopped, and the rotation speed of the disk 700 is increased. As a result, the phenol 752 is distributed at a place where the centrifugal force is large in the extraction tank 718, and the aqueous solution 760 containing the nucleic acid is distributed inside the phenol 752, between which the protein in the serum denatured by the phenol 752 ( Albumin and globulin (not shown) are distributed in layers.
Next, FIG. 8 (d) shows an operation of transferring an aqueous solution 760 containing a large amount of nucleic acid distributed in the extraction tank 718 to the collection tank 724. At this time, the number of rotations at which the disk 700 separates the phenol 752, which is a chemical having a protein attribute action, and the nucleic acid-containing aqueous solution 760 in the extraction tank 718, and the components other than serum 758 and red blood cells in the separation tank 712 It is higher than the number of revolutions to be separated into 756, and approximately 3000 G of centrifugal force is generated in the collection tank. At this time, of the seals 720 and 721 connecting the extraction tank 718 and the collection tank 724, the seal 721 moves according to the centrifugal force, and a gap is formed between the seal 720 and the seal 720. Then, the aqueous solution 760 moves to the collection tank 724 from this gap. However, although a gap is also formed between the seal 708 and the seal 714 at the same time, components 756 other than red blood cells and a chemical 752 having a protein denaturing action do not move from the tanks 712 and 718, respectively.
Next, FIG. 8 (e) shows an operation of taking out a small amount of a solution having a higher nucleic acid concentration from the aqueous solution 760 containing nucleic acids held in the recovery tank 724. At this time, the rotation speed of the disk 700 is set higher than the rotation speed of the disk 700 in FIG. 8D so that a centrifugal force of about 4000 G is generated. At this time, among the seals 720 and 721 connecting the extraction tank 718 and the collection tank 724, the seal 721 is completely lowered according to the centrifugal force. At the same time, the seal 720 is lowered so as to close the gap with the seal 721, and the recovery tank 724 is sealed while holding the aqueous solution 760. Further, the rotational speed of the disk 700 is increased so that a centrifugal force of about 5000 G is generated. At this time, the seal 726 connecting the collection tank 724 and the chemical tank 730 is lowered, and the chemical 754 which is more easily bound to water molecules than the nucleic acid held in the chemical tank 730 is moved to the collection tank 724. Thus, an aqueous solution 762 reacted with the aqueous solution 760 is obtained. Here, for example, ethanol alcohol was used as the chemical 754 that is easier to bind to water molecules than nucleic acids. As a result, in the aqueous solution 762, the volume of water in which the nucleic acid is dissolved due to the combination of the water molecule and the ethanol alcohol molecule is reduced. For this reason, the nucleic acid precipitates, and the density of the nucleic acid becomes higher than that of surrounding water or ethanol alcohol, and the nucleic acid precipitates in a direction larger than the centrifugal force. This precipitation can be performed in a shorter time as the centrifugal force is larger. Further, it can be applied to precipitation of an aqueous solution 760 having a low nucleic acid concentration, and the centrifugal force is desirably 10,000 G or more. Also, the amount of ethanol alcohol 754 is desirably 2.5 times or more of the aqueous solution 760 to be reacted therewith. For this reason, the recovery tank 724 is a deeper tank in its dimensions so as to have a larger volume than the extraction tank 718 and the separation tank 712.
Next, FIG. 8 (f) shows an operation of moving the nucleic acid precipitated by the centrifugal force in the aqueous solution 762 held in the recovery tank 724 and a slight aqueous solution around the nucleic acid to the nucleic acid holding tank 736. It is. The centrifugal force of 10,000 G or more lowers the sealer 732, and the solution in which the nucleic acid precipitates and the concentration of the nucleic acid is increased moves to the nucleic acid holding tank 736. If the centrifugal force is 10,000 G or more, the sealer 732 remains down, and the nucleic acid continues to accumulate in the nucleic acid holding tank 736 while centrifuging is continued with this centrifugal force. Then, when the rotation of the disk 700 is lowered and stopped, the sealer 736 is closed at the time when the rotation of the disk 700 is cut below 10,000 G, so that the nucleic acid does not diffuse again from the nucleic acid holding tank 736.
FIG. 9 (a) shows the operation of the motor 202 for rotating the disk 700 by the control device 230, the motor 208 for rotating the disk 204, and the operation of the seals 708, 714, 720, 721, 726, and 736 on the disk 700. It is shown. However, the positional relationship of the seals 708, 714, 720, 721, 726, and 736 on the disk 700 is as shown in FIG. 9B. Here, the distance between the rotating shaft 200 and the rotating shaft 206 is 53 mm, and the diameter of the disk 700 is 100 mm. The horizontal axis of the graph is not the real time but the processing content shown at the bottom of the graph.
As described above, according to the present embodiment, since the tank formed on the disk 700 is partitioned by the partition walls, the amount of whole blood to be processed can be further increased, and highly sensitive nucleic acid extraction is performed. be able to. In addition, if the entire disk 700 including each tank is manufactured by injection molding of polypropylene or the like, the manufacturing cost of the disk 700 can be reduced. In addition, if the entire disk 700 including each tank is extruded and shaped with a polycarbonate resin and this surface is coated with a fluororesin, the strength of the disk 700 and the intrusion of foreign matter during processing can be avoided. Further, the disk 700 can be configured at low cost. This is effective even when the amount of whole blood to be treated is small. If the polycarbonate resin surface is embossed to form each tank and the surface is coated with a fluororesin, the disk 700 can be constructed at lower cost. .
In a stirring step in which the disk 204 shown in FIG. 2 is rotated by the motor 202 while rotating the disk 700 by the motor 202, a stirrer such as a small piece of fluororesin is put in the extraction tank 718 in advance. By doing so, the effect of stirring is enhanced, and the stirring time can be shortened. Further, if the motor 202 for rotating the disk 700 is intermittently rotated and stopped and stirred without rotating the disk 204 with the motor 208, the apparatus configuration can be simplified and the apparatus cost can be reduced.
Note that the same effect can be obtained even if a plurality of processing equipment from the hole 704 and the sample holding tank 706 to the nucleic acid holding tank 736 are provided on the disk 700. Providing a plurality of processing facilities has an effect of increasing the number of processes per unit time in the process of extracting nucleic acids from the aqueous solution containing a plurality of nucleic acids.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an external view of a device for extracting nucleic acids from an aqueous solution containing nucleic acids according to the first embodiment of the present invention, and FIG. 2 is a device for extracting nucleic acids from an aqueous solution containing nucleic acids according to the first embodiment. FIG. 3 is an external view for explaining a mechanism for centrifuging or stirring, FIG. 3 is a view showing a procedure for extracting nucleic acids using a device for extracting nucleic acids from an aqueous solution containing nucleic acids according to the first embodiment, FIG. The figure shows the relationship between the mechanism for centrifuging or agitating the device and the operation of the opening and closing mechanism in the device for extracting nucleic acid from the aqueous solution containing nucleic acid according to the first embodiment. FIG. 6 illustrates the function of a device for extracting nucleic acid from an aqueous solution containing nucleic acid according to an example, FIG. 6 is a diagram illustrating the function of a device for extracting nucleic acid from an aqueous solution containing nucleic acid according to the first embodiment, FIG. Is the second aspect of the present invention. FIG. 8 is an external view of a device for extracting a nucleic acid from an aqueous solution containing a nucleic acid according to the embodiment, and FIG. 8 is a diagram showing a procedure for extracting a nucleic acid using the device for extracting a nucleic acid from an aqueous solution containing a nucleic acid according to the second embodiment; FIG. 9 is a diagram showing the relationship between the mechanism for centrifuging or stirring the device and the operation of the opening / closing mechanism in the device for extracting nucleic acid from the aqueous solution containing nucleic acid according to the second embodiment.
