JPS6394136A - 蛍光分析方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、試料液体中に含まれる共存物質が被測定物質
の蛍光強度に及ぼす影響を補正可能な蛍光分析方法及び
装置に関する。

〔従来の技術〕

従来、蛍光分析における共存物質の影響補正方法につい
ては、特開昭５５−４３４６１号公報において論じられ
ているように、濁度補正式を用いるようになっていた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記従来技術は、濁度補正式ｙ＝ｘ−ｋｚ（ｙ：懸濁液
における補正をした蛍光物質濃度、Ｘ：蛍光物質濃度の
測定値、２：濁度、ｋ：予め求めた定数）により測定試
料中の濁度を補正する方法であるが、前記濁度補正式が
成り立つ溶質及び溶媒は限られ、また、被測定物質と共
存物質が相互作用を起こすと補正式が成り立たなくなる
問題があった。

本発明の目的は、共存物質が励起光や蛍光を吸収するよ
うな透明度の低い測定試料においても、共存物質の種類
や濃度が未知のままで、被測定物質の蛍光強度を補正し
、定量することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的は、測定試料の蛍光寿命を測定して、共存物質
と被測定物質との相互作用による蛍光の量子収率の減少
を補正すると同時に、測定試料の励起波長及び蛍光波長
における吸光度を測定して、共存物質による励起光及び
蛍光の吸収に基づく蛍光減衰分を補正することにより、
達成される。

〔作用〕

パルス光源からの励起光を試料セルに照射し、その励起
光により励起された被測定物質が発するパルス状の蛍光
のピーク強度と、蛍光強度の時間的減衰を時間分解能の
良い検出器により測定し、蛍光強度及び蛍光寿命を測定
する。また、その励起光が試料セル中を透過した透過光
をもう一つの検出器で測定し、励起波長における試料液
体の吸光度を求め、更に、蛍光波長と等しい波長の光を
試料セルに照射し、その透過光を検出して、蛍光波長に
おける試料液体の吸光度を求める。測定した蛍光寿命、
励起波長及び蛍光波長における吸光度から演算処理によ
り蛍光強度を補正する。

〔実施例〕

以下、本発明の一実施例を第１図により説明する。まず
本発明の全体構成について記す。本発明は蛍光強度及び
蛍光寿命の測定に用いるパルス光源２、吸光度の測定に
用いる吸光度測定用光源５、測定試料を入れる容器であ
り、光源からの光を照射し、被測定物質の蛍光７３を発
生させる試料セル１、試料セル１から発生する蛍光７３
を集光する集光レンズ５２、集光した蛍光７３を分光す
る分光器３、分光された光を検出する時間分解能の良い
検出器４、試料セル１を透過した光を検出する検出器６
とそれらの検出器からの測定値を演算処理するデータ処
理装置７から成る。

次に個々の構成要素の特徴並びに動作について説明する
。まずパルス光源２に用いられる光源としては、蛍光寿
命を測定するためにはパルスレーザ或いはフラッシュラ
ンプが用いられる。フラッシュランプを用いる場合は、
別途に分光器を設置して光を分光して励起光を取り出す
必要があり、光の強度もパルスレーザに比べ弱いので、
パルスレーザを用いる方が検出感度が高くなる。そして
、例えば、Ｎ２レーザ等の励起用パルスレーザに色素レ
ーザを組合せて用いることによって、色素レーザにより
波長を変えられるので使用範囲を広くすることができる
。パルス光源２からのパルス発振のトリガ信号がデータ
処理装置に送られ、被測定物質の蛍光７３を検出する検
出器４の出力と同期をとり、蛍光の時間的減衰を計測し
て蛍光強度が励起光入射直後の強度の１　／　ｅに減少
するまでの時間を蛍光寿命とする。ここで用いられる検
出器４は、時間分解能の高いものが必要であるが、必要
となる時間分解能は被測定物質の蛍光寿命によってピコ
秒の分解能を要するものから、マイクロ秒オーダーのも
のまであるので、被測定物質によって検出器４の時間分
解能を選択して測定を行なう。

吸光度測定に用いる吸光度測定用光源５は、パルス光源
である必要はない。被測定物質の蛍光波長があらかじめ
わかっている場合には、その波長の光を発する色素レー
ザが用いられる。また、分光器を用いればタングステン
ランプや重水素ランプ等の連続スペクトルを持つ光源を
用いることもできる。これらのランプは、ランプのコス
トは安価であり、また光の強度はレーザに劣るが、安定
性にすぐれており、吸光度測定用として好敵な光源であ
るといえる。この吸光度測定用光源５の光が試料セル１
中を透過し、その透過光を測定することにより、蛍光波
長での測定試料の吸光度を求めるが、ここで用いる検出
器６は、時間分解能は高くなくても良い。この検出器６
は、パルス光源２の励起光７１が試料セル１中を透過す
る透過光強度も測定するような光学的手段を有し、測定
値をデータ処理装置に送り、励起波長及び蛍光波長にお
ける測定試料の吸光度を求める。

次に、本発明の原理について、第２図を用いて説明する
。第２図は成る蛍光性物質を被測定物質としその濃度を
一定にして、その蛍光を減衰させる共存物質の濃度を変
化させたときの、蛍光強度比Ｆ／Ｆ０（Ｆ：試料の蛍光
強度、Ｆ６：共存物質がないときの試料の蛍光強度）を
示したものである。　Ｆ／Ｆ、値は共存物質濃度の増加
とともに指数関数的に減少し、共存物質濃度がある濃度
（図２のＣＬ）を超えると検出強度はバックグラウンド
以下となり蛍光検出不能となる。共存物質による蛍光強
度の減衰の原因としては２つあり、１つは共存物質によ
り励起光及び蛍光が吸収されてしまうことにより蛍光強
度が減少する作用（図中ΔＱＡ）であり、もう１つは共
存物質と被測定物質が相互作業を起こし、蛍光の量子収
率φが減少する消光作用（図中ΔＱＩ）である。

まず、ΔＱＡについて検討すると、いま試料セル−の形
状が第３図のような四角セルでその光路長をＱとし、励
起光を工。、透過光をＩｔ、蛍光をＦとすれば、励起光
工。は光路長Ｑの間で、共存物質により吸収を受け、蛍
光Ｆは光路長［２の間で共存物質による吸収を受ける。

共存物質の励起波長での吸光係数をεｊ、蛍光波長での
吸光係数をｉｆとし、共存物質濃度をＭとすると、ΔＱ
Ａは、となる。ここで、透過光強度測定により求められ
る吸光度をＡｉ、Ａｆ（Ａｉは励起波長の吸光度、Ａｆ
は蛍光波長の吸光度）とすると、 Ａｉ＝εｉＭＱ　　　　　　　・・・（２）Ａｆ＝εｆ
ｔＱ　　　　　　　　・・・（３）であるから、（１）
式は ΔＱＡ＝　１−５ｘｐ　（−（Ａｉｄ−Ａ−Ｌ−）　〕
−（４）となり、Ａｉ、Ａｆの測定によりΔＱＡが求め
られる。

一方、ΔＱＩは、蛍光の量子収率の変化であるから、共
存物質がないとき及びあるときの量子収率をφ。、φと
すれば、△ＱＩは、 では共存物質があるときの蛍光寿命である。したかって
、あらかじめτ。を知っておくことにより、τを測定し
てΔＱＩを求められる。

以上をまとめると、蛍光強度比Ｆ／Ｆ０はＦ／Ｆ、＝１
−ΔＱＡ−ΔＱＩ　　　　　　・・・（７）であるから
、（４）、（６）式により、Ｆ　７　Ｆ０＝ｅｘｐ（−
（ＡｉｄＡＬ））　・Ｍす＝、（８）となる。Ａ　ｉｆ
　Ａ　ｆ　＋　　で、Ｆはすべて測定可能な議であるか
ら、求める真の蛍光強度Ｆ。は、Ｆ０＝十・ｅｘＰ（Ａ
ｉ十埜）・Ｆｌｏ、（９）となる。τ。は一定であるか
ら、τ。＝ｋ（ｋ：定数）とすると（９）式は、 となる。また、ａｘ＋　ａ、をセルの形状により決まる
定数として、（１ｏ）式を一般化すると、Ｆｏ＝　ｋｏ
ｅｘｐ　（ａ、・Ａｉ＋ａ２６Ａｆ）　・−τ　・・・
（１１） となる。したがって、共存物質の種類、′ａ度が未知の
ままで、蛍光強度を補正することが可能となる。

ところで共存物質濃度が図２’ＶＣＬを超えたときは、
蛍光検出不能となるが、希釈溶液により希釈し、検出可
能な共存物質濃度まで下げてやればよい。但し、このと
き、被測定物質の濃度も同時に下がるので、測定可能な
検出限界濃度をＬｄとすると、Ｎ倍希釈のときの検出限
界濃度はＮ−Ｌｄとなり、検出限界濃度が高くなるとい
う問題がある。しかしながら、希釈なしではもともと検
出できないのであるから、検出限界濃度以上なら測定可
能となる利点がある。通常希釈率は２〜３倍で良い。

本発明の別な実施例を第４図に示す。この実施例は試料
セル１，１′を２つ設け、前段の試料セル１′において
、測定試料の励起波長及び蛍光波長での吸光度を測定し
、その結果、 超えるか否かを、制御装置８により判断し、超えたとき
には、ある一定の希釈溶液を希釈液注入装置９に指示し
、希釈槽１０において測定試料の希釈を行なう。その後
、後段の試料セル１において、蛍光強度、蛍光寿命を測
定し、共存物質濃度の影響を補正する。したがって、こ
の実施例では、蛍光強度が検出不能なほどに共存物質濃
度が高いとき、希釈により蛍光検出可能とし、共存物質
の影響を補正できるという効果を有する。

本発明の更に別な実施例について次に説明する。

第１図、第４図に示す実施例において、光源２゜５から
試料セル１までの励起光の光伝送、そして、試料セル１
から検出器４，６までの光伝送を光ファイバで行うこと
により、プラント内部のインライン分析を行うことがで
きるという効果がある。

本発明の他の実施例を第５図に示す。本実施例では、回
転ステージ１０２上にミラー５１と波長交換セル１０１
とを設置し、回転ステージを回転させ、第５図（ａ）の
状態のときには、ミラー５１により、励起光７１が試料
セル１に照射されるので、蛍光強度、蛍光寿命、励起波
長における吸光度が測定される。回転ステージが１８０
°回転すると、励起光７１は、波長変換セル１０１によ
り波長が変えられ被測定物質の蛍光波長とし、試料セル
１に照射されて、蛍光波長での吸光度が求められる。波
長変換セルとしては、レーザ用色素等を入れたものが用
いられる。本実施例では、簡便な装置を用いることによ
り、吸光度測定用の光を得ることができるという効果が
ある。

〔発明の効果〕

本発明によれば、共存物質による蛍光及び励起光の吸収
作用を吸光度測定により補正でき、共存物質と被測定物
質の相互作用による消光作用を蛍光寿命測定によって補
正できるので、共存物質の種類や濃度が未知のままで、
共存物質の影響を補正でき、蛍光定量が可能となる効果
がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例の装置構成図、第２図は共存
物質濃度によるＦ／Ｆ、値の変化を示すグラフ、第３図
は試料セルのモデル図、第４図は本発明の別な一実施例
の装置構成図、第５図は本発明の更に他の一実施例にな
る装置構成図である。 １・・・試料セル、２・・・パルス光源、３・・・分光
器。 ４・・・検出器、５・・・吸光度測定用光源、６・・・
検出器。 ７・・・データ処理装置、８・・・制御装置、９・・希
釈液注入装置、１０・・・希釈槽、５１・・・ミラー、
５２・・・集光レンズ、５３・・・バルブ、７１・・・
励起光、７２代理人　弁理士　小　川　勝　男 牢Ｉ区 躬２図 来３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料液体に励起光を照射し、発生した測定物質の蛍
   光強度と、その減衰時間から求められる前記測定物質の
   蛍光寿命及び励起光波長に対する透過光強度を測定し、
   さらに、前記蛍光と同一波長の光を前記試料液体に照射
   してその蛍光波長に対する透過光強度を測定し、前記励
   起光波長に対する透過光強度及び蛍光波長に対する透過
   光強度から共存物質による励起光及び蛍光の吸収による
   減少率（ｉ）を求め、また、蛍光寿命から共存物質によ
   る蛍光の量子収率の減少率（ｉｉ）を求める、これら（
   ｉ）及び（ｉｉ）から、共存物質による蛍光強度の減少
   率（ｉｉｉ）を補正値として求め、前記試料液体中の蛍
   光物質濃度を定量することを特徴とする蛍光分析方法。 ２、試料液体に励起光を照射し、発生した測定物質の蛍
   光強度（Ｆ）と、その減衰時間から求められる前記測定
   物質の蛍光寿命（τ）及び透過光強度（Ｉｉ）を測定し
   、さらに、前記蛍光と同一波長の光を前記試料液体に照
   射してその透過光強度（Ｉｆ）を測定し、前記（Ｉｉ）
   及び（Ｉｆ）から吸光度（Ａｉ）及び（Ａｆ）を求め、
   かつ前記（Ｆ）、（τ）、（Ａｉ）及び（Ａｆ）から次
   式により、真の蛍光強度（Ｆ＿０）、Ｆ＿０＝ｋ・ｅｘ
   ｐ（ａ＿１・Ａｉ＋ａ＿２・Ａｆ）・Ｆ／τ（ここで、
   ｋ：定数、ａ＿１、ａ＿２：試料セルの形状による定数
   ）を求め、前記試料液体中の蛍光物質濃度を定量するこ
   とを特徴とする蛍光分析方法。 ３、希釈槽において希釈液により該試料液体を希釈し、
   共存物質の影響を小さくして被測定物質の蛍光を検出す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の蛍光分
   析方法。 ４、励起光源、励起光源からの励起光を分光するための
   分光器、前記分光器からの励起光を試料液体に導くため
   の光ファイバ、透過光強度を検出するための光検出器、
   前記試料液体を透過した透過光を前記光検出器へ導くた
   めの光ファイバ、前記蛍光強度及びその減衰時間を測定
   するための光検出器、前記試料液体から発生する蛍光を
   前記光検出器へ導くための光ファイバ、励起光波長に対
   する吸光度を求めるための演算装置、蛍光波長に対する
   吸光度を求めるための演算装置、蛍光寿命を求めるため
   の演算装置、励起光波長に対する吸光度、蛍光波長に対
   する吸光度及び蛍光寿命から共存物質による蛍光強度の
   減少率を求めるための演算装置を含むことを特徴とする
   ことを特徴とする蛍光分析装置。