JPS6391100A - ポリエン抗生物質を使用して真菌と細菌とを鑑別する組成物，分析要素及び艦別方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は臨床化学に関し、更に詳しくは、生存真菌及び
生存細菌を鑑別する組成物、要素及び方法に関する。

〔従来の技術］ 微生物の検出及び同定は、健康の維持及び診断に重要で
ある。現在行われている検出及び同定操作は、微生物の
培養に基づく。このような操作は労力を要し、時間がか
かり、μ）練者及び特別の装置を必要とする。

真菌と細菌との検出及び鑑別は、一般に、例えば米国特
許第４．１４０，５８０号明細書に記載されているよう
に、選択培地中で増菌技法によって行われる。この文献
は、培地中に細菌の増殖を抑制するが、酵母及び真菌は
増殖し続け、その後の変色によって検出される特殊な成
分を使用することを教示している。

〔発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、米国特許第４，１４０，５８０号明細書
の方法を含めて、従来の方法は完了するのに１２〜１８
時間を必要とする。この時間の浪費は、病気の適切な治
療又は製造工程の調整にとって重大である。簡単に使用
され、容易に自動化することができる真菌の迅速な同定
方法を得ることは極めて望ましい。

〔問題点を解決するための手段〕

公知の鑑別方法に伴う前記の問題点は、（ａ）還元抑制
物質の不存在下に生存真菌及び細菌の両者によって還元
されて検出可能な物質（ｓｐｅｃｉｅｓ）を生成しうる
化合物、並びに （ｂ）細胞質膜の機能に作用し、真菌による還元性化合
物の還元を選択的かつ実質的に抑制するポリエン抗生物
質 を含む生存真菌と細菌とを鑑別する組成物によって回避
される。

本発明は、更に、前記の組成物を含んで成る生存真菌と
細菌とを鑑別する分析要素を提供する。

更に、生存真菌及び細菌の鑑別方法は、Ａ、生存真菌及
び細菌を含むと思われる液体を前記の組成物と混合し、
そして、 Ｂ、細菌の存在により生じる検出可能な物質を測定する 工程を含む。

〔実施態様〕

本発明は、真菌、すなわち単細胞往動、例えば酵母、及
び多細胞生物、例えばカビ類の測定に有用である。本発
明は、細菌から酵母を鑑別するために実施するのが好ま
しい。

本発明の実施に有用な抗生物質は、ポリエン抗生物質と
して従来知られているものである。しかしながら、必ず
しもすべてのポリエン抗生物質が本発明の実施に有用で
はない。を用なポリエン抗生物質は、第一に核酸又は蛋
白質の生合成を妨害するか又は細胞壁の生合成を妨害す
る抗生物質とは異なり、第一に微生物の細胞質膜の機能
に影Ｖするものである。このような物質は、Ｒ，Ｒｅ１
ｎｅｒ著、抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）　（Ｔ
ｈｉｅｍｅ−３ｔｒａｔｔｏｎ、ニューヨーク、１９８
２）　、例えば５７頁、６０頁及び１３１〜１３２頁に
詳述されている。本発明の実施に有用なポリエン抗生物
質は、一般に、多数（２個以上）の共役二重結合を有す
る抗生物質である。ポリエン抗生物質及びその合成方法
に関する更に詳細な記載は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　ａｎｄ　ＧｅｎｅｔｉｃＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ
　Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ　Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ八ｎ
ｔｉｂｉｏｔへｃｓ　　（Ｌｅｏ、　　Ｃ，Ｖｉｎｉｎ
ｇ　　ｋｌＡ’ｊｉ、　Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ
　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　、１９８３年）の８章（２０
７〜２２９頁）及びそこに記載されている参考文献に記
載されている。

本発明の実施には、下記のポリエン抗生物質が有用であ
るが、本発明の実施に使用するポリエン抗生物質をこれ
らに限定するものでないことはいうまでもない：ニスク
チン、ナタマイシン、アンホテリシンＢ１カンジシジン
、フィリピン、ハチマイシン、ベシロシン及びパートリ
シン。好ましい抗生物質は、フィリピン及びニスクチン
である。

本発明に有用な各抗生物質には、真菌の還元能を抑制し
、鑑別するため最適？農度範囲（抗生物質の純度及び力
価に依存）及び最適環境条件があることは当業者には理
解されるであろう。更に、若干の細菌又は真菌に対する
ポリエン抗生物質の選択的抑制作用には若干の例外があ
りうる。

一般に、真菌による還元性化合物の還元を選択的かつ実
質的に抑制するために必要な抗生物質の量は、１０７細
胞／　ｍｌの真菌（例えば、カンジダ・アルビカンス、
Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）　、抗生物質（１
０−’モルイ・農度）及び還元性化合物（０，００５モ
ル濃度）をｐＨ７，５で混合することによって容易に測
定することができる。還元性化合物が還元されて検出可
能な変化を生じる場合、検出可能な変化が観察されなく
なるまで、更に試験において抗生物質の■を増加する。

本発明の実施に有用な還元性化合物は、酸化された形で
、任意の還元抑制物質の不存在で生存細菌（グラム陽性
菌及びグラム陰性菌）及び真菌によって還元されて検出
可能な物質を生じうる物質である。このような物質は、
電位差滴定又は放射能測定装置を含めて任意の適当な装
置によって検出することができる。下記のように、物質
を放射能測定装置によって検出するのが好ましい。

放射能測定装置によって直接検出されうる種々の検出可
能な物質を一部分列挙すると、比色法で検出しうる物質
、例えば色原体、輻射線放出物質、例えば螢光助剤、化
学発光性物質、放射性同位元素、燐光性物質等が含まれ
る。

検出可能な物質として色素又は一般に、色素前駆物質を
使用するのが好ましい。色素又は色素前駆物質の使用は
、検出に関して数種の可能性を示す：　（１）着色した
物質が無色になるか又は吸収の移動を受けうる、（２）
無色の物質、すなわち色素前駆物質が着色した物質を形
成することができるか又は（３）移動性の、検出可能な
物質を含む物質は移動性の検出可能な物質を放出しうる
。

本発明の実施には、（３）が好ましい。

還元性化合物として使用しうる色素又は色素前駆物質は
、例えば、メチレンブルー、ジクロロインドフェノール
、レサズリン及び種々のテトラゾリウム化合物、例えば
３−　（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５
−ジフェニル−２１１＝テトラゾリウムプロミド、２．
３．５−トリフ４エニルー２Ｈ−テトラゾリウムクロリ
ド、テトラニトロブルー、テトラゾリウムクロリド及び
ニトロテトラゾリウムバイオレット及びその他、例えば
米国特許第４，５２５，４５３号明細書に記載されてい
るものを包含する。

詳述すれば、本発明に有用な還元性化合物は、構造式： ％式％） 〔式中ＣＡＲ−は置換又は非置換の芳香族又はキノン核
を表し、Ｒ１は本明細書に記載する移動性の、検出可能
な物質を含む基であり、ｎは１又は２である〕を有する
。用語“移動性の、検出可能な物質（ｓｐｅｃｉｅｓ）
”とは、還元性化合物に結合しているときは第一のスペ
クトル吸収バンドを有し、還元性化合物から放出された
ときに第二の吸収バンドを有する色原体基、又は還元性
化合物に結合されているときは第一のスペクトル吸収及
び放出ハンドを有し、放出されると、第二のスペクトル
吸収及び放出バンドを有する螢光助剤基と定義すること
ができる。このような核の例を以下に示す。

更に、Ｒ１がＨである場合には、ＣＡＲ→Ｈ）、。

は水中で測定した場合に少なくとも＋１００ｍＶ、アセ
トニトリル中で測定した場合に少なくとも一６５０ｍＶ
の１元電位（Ｅ、７□）を有する。

化合物が適切なＥｌ／□値を有するので、化合物の還元
及び検出可能な物質のその後の放出は、生理学的ｐｌ＋
　（すなわち、９以下のｐｌｌ）で達成される。

このような測定は、ポーラログラフイー又はサイクリッ
ク・ボルタメトリイー　（ｃｙｃｌｉｃ　ｖｏｌｔａｍ
ｅｔｒｙ）を使用して標準電気化学的技法により行う〔
例えば、Ｓａｗｙｅｒ及びＲｏｂｅｒｔｓ、　Ｊｒ、、
Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉＳ
ｔｒ　　ｆｏｒ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ、　Ｊｏｈｎ　Ｗ
ｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、ニューヨーク、１９７４年、参
照）＠　Ｅｌ／２値が、水中で測定して＋ｌＯＯ〜＋４
００ｍＶ、或いはアセトニトリル中で測定して一６５０
〜３００ｍＶであるのが好ましい。若干の５光性化合物
は水中で最も良く測定され、他のものはアセトニトリル
中で最も良く測定されるので、両方の範囲を示す。Ｅｌ
／□の測定に関する更に詳細なことは下記の第１表の前
に記載する。所望のＥ１７□は、ＣＡＲ−核上の適切な
電子吸引性基によって、又は核に結合した歪のある縮合
環及び両者の組み合わせによって達成される。

一実施態様においては、還元性化合物は還元されて、Ｖ
ａｎ　ｄｅ　５ａｎｄｅにより八ｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ
、　Ｉｎｔ、　Ｅｄ。

匣、２２巻１９１〜２０９頁（１９８３）及び米国特許
第、ｉ、２３２，１０７号明細書に記載されているのと
同様に、キノンメチド形成により検出可能な種（所望の
Ｅ、／２特性を存する）を生成することができる。

別の実施態様では、有用な還元性化合物は、Ｖａｎ　ｄ
ｅ　５ａｎｄｅの前掲文献の２０６頁に記載されている
ものと同様であるが、所望のＥ、７２特性を有するスル
フィルイミド及びスルフヱニルスルホンアミド類を包含
する。

好ましい実施態様では、還元性化合物は、ＲＩＮＤ化合
物、すなわち、生理学的ｐＨで分子内求核置換を受けて
、求核基が化合物の少なくとも１電子還元によって生成
する場合に１種以上の検出可能な物質を放出しうる還元
性化合物である。換言すれば、このような置換は、ＲＩ
ＮＤ化合物が必要な電子を提供する適当な還元剤（以下
に詳述する）によって還元される場合に起こる。検出可
能な物質の放出は、好ましい化合物のほどんどに関して
、少なくとも５０％の検出可能な物質がｐＨ７で３０分
以内に生じる点で極めて効率良く行われる。

用語“分子内求核置換”とは、一つの分子の求核中心が
その分子の求電子中心である別の位置で反応して、求電
子中心に結合していた基又は原子を置換する反応である
。一般に、本発明に有用なＲＩＮＤ化合物は、求核基及
び求電子基を分子の三次元構造中に近接して併有し、そ
れにより分子内反応が起こり、４〜７個、好ましくは５
又は６個の原子を有する環が形成される。

特に有用なＲＩＮＤ化合物は、構造弐二ＣＡＲ−Ｒ’ 〔式中ＣＡＩ？−は （式中ｍはＯ又はｌ、好ましくは１である）を表す〕で
表される化合物である　Ｒ５は、好まし°くは骨格の炭
素原子数１又は２の、置換又は非置換アルキレン基（例
えばメチレン基、エチレン基又はアルコキシメチレン基
）を表す。Ｒ５はメチレン基であるのが最も好ましい。

Ｑはカルボニル基又はチオカルボニル基であり、カルボ
ニル基であるのが好ましい。

Ｒ６は、好ましくは炭素原子数１〜４０の置換若しくは
非置換アルキル基（例えばメチル基、エチル’ＩＩＥ、
ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、ヘキ
シル基、デシル基、ラウリル基又はヘンシル基）、好ま
しくは炭素原子数４〜４０の置換若しくは非置換シクロ
アルキル基（例えばシクロブチル基、シクロへキシル基
又は４−メチルシクロヘキシル基）、好ましくは原子数
５〜４０個（炭素原子及びヘテロ原子）の置換若しくは
非置換へテロ環（例えばピリジル基）、又は好ましくは
炭素原子数６〜４０の置換若しくは非置換アリール基（
例えばフェニル基、キシリル基、ナフチル基、ｐ−ニト
ロフェニル基、アントリル尤、ｐ−ｔ−ブトキシフェニ
ル基又はｐ−カルボキシフェニル基）である。Ｒ６は、
前記のような置換若しくは非置換アルキル基又は置換若
しくは非置換アリール基であるのが好ましい。

ＦＲＡＧは、前記の移動性の検出可能な物質である。

ＦＲＡＧの特別な組成は、所望の検出可能な物質の種類
及び使用する特定の検出手段に応じて著しく変動しうる
。検出可能な物質は、適当な手段によって直接検出しう
る物質並びに他の物質、例えば被分析物、酵素又は他の
試薬と反応して検出可能な物質を生じうる物質であって
よい。

特に有用な検出可能な物質は、色原体及び螢光助剤であ
る。色原体の有用なものは、例えばアゾ色素、アゾメチ
ン色素、ニトロフェノール色素、インドフェノール色素
、インドアニリン色素及びトリアリールメタン色素及び
その他、従来公知のものであり、アブ色素が好ましい。

螢光助剤の有用なものは、例えばクマリン、ウンベリフ
ェロン、フェナレノン及びベンゾフェナレノン、４−オ
キソ−４−Ｈ−ベンゾ−（ｄ、ｅｌアントラセン、フル
オレセイン及びローダミン螢光色素及びその他、従来公
知のものである。フェナレノン色素が特に有用である。

有用な燐光性物質は、２°、５°−ジブロモフルオレセ
イン及び４’、５’−ショートフルオレセインのような
燐光性物質である。有用な化学発光性物質はルシフェリ
ンである。

Ｆｌ？ＡＧは、ＦＩ？ＡＧの一部である２価の一原子結
合によって単結合によってＱに結合する。１原子結合は
オキシ、チオ又はセレノであるのが好ましく、オキシで
あるのが最も好ましい。しかしながら、ＦＲＡＧが螢光
助剤である場合には、結合はオキシ又はチオである。

前記のキノン構造中のＲ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ
独立に水素、炭素原子数１〜４０の置換若しくは非置換
アルキル基（例えばメチル基、エチル基、ヒドロキシメ
チル基又はメトキシメチル基）、置換若しくは非置換ア
リール基（例えば）−ニル基、ナフチル基、メチルナフ
チル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｍ−メトキシフェニル
基又はｐ−カルボキシフェニル基）又は一般に正のハメ
ットシグマ値を有し、好ましくは０．０６より大きいシ
グマ値を有する電子吸引性基である６　Ｒ２、Ｒ’及び
Ｒ４のうち少なくとも１個は電子吸引性基である。ハメ
−／　トシグマ値は、例えば５ｔｅｒｉｃＥｆｆｅｃｔ
ｓ　：ｎ　Ｏｒ　ａｎ：ｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　　
Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、、１９
５６年、５７０〜５７４頁及びＰｒｏ　ｒｅｓｓ　ｉｎ
　Ｐｈ　５ｉｃａｌ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒ　、　２巻、Ｉｎｔｅｒｓｃ４ｅｎｃｅ　ｔ’ｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ　ｓ　１９６４年、３３３〜３３９頁に記
載されている標準的方法によって計算される。正のハメ
ットシグマ値を有する代表的電子吸引性基は、シアノ基
、カルボキシ基、ニトロ基、ハロゲン（例えば弗素、臭
素、塩素又は沃素）、トリハロメチル基（例えば、トリ
フルオロメチル基又はトリクロロメチル基）、トリアル
キルアンモニウム基、カルボニル基、カルバモイル基、
スルホニル基、スルファモイル基１、エステル及び文献
に公知の他のもの、又はこれらの電子吸引性基の１個以
上で置換されたアルキル基若しくはアリール基（前記の
もの）を包含する。好ましい電子吸引性基は、ｐ−ニト
ロフェニル基、ｍ−ニトロフェニル基、ｐ−シアノフェ
ニル基及び２．５−ジクロロフェニル基を包含する。メ
タ位にメトキシ基又はアセトアミド基を有するアリール
基も、有用である。

Ｒ３は、Ｒ１であってもよく、これによって２：１のモ
ル比の螢光染料分子二元のＲＩＮＤ化合物分子を生成し
うる。

また、Ｒ３及Ｒ４は、−緒にキノン核に結合した歪のあ
る置換又は非置換の縮合炭素同素環を完成するのに必要
な炭素原子を表すことができる。

歪のある縮合環は、従来知られている（例えばＲｉｅｋ
ｅ　ら著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　
、　　５０巻４３８１〜４３８４頁、１９６９年）。例
えば、このような環（単環又は双環式）は、骨格に４〜
８個の炭素原子を有していてよい。環は５員の単環又は
７員若しくは８員の双環式環であるのが好ましい。

特に有用な還元性化合物は、Ｍｕｒａらによって１９８
７年５月２７日に出願された欧州特許用１９ｎ第８７３
０４６８６．６号明細書に記載されている水と相溶性の
化合物である。

代表的ＲＩＮＤ化合物を下記の第１表に下記の構造式に
関連して列挙する： ＯＲ”　　Ｏ ＩＩ　　　　　　　　　　Ｉ　　　　　Ｉ＋第１表にお
けるＥｌ／Ｚ値は−ＣＴＴｚ　Ｎ　　ＣＦＲＡＧの代わ
りに水素原子を有する構造のキノン核、ずなわち、 について測定したものである。Ｅｌ、□は（得られた場
合）、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ノニオン界面活
性剤〔トリドア　（ＴＲＩＴＯＮ）　Ｘ４００）及び燐
酸ナトリウム緩衝ン夜（ｐＨ７）に？容解したキノン化
合物の水性エマルジョン中で測定した。標４（としては
、標準カロメル電極を使用した。若干のＥｌ／□値（＊
で示した）は、標準として飽和力口メル電極を使用して
、アセトニトリル中で測定した。Ｅｌ／□値が得られな
かったときは、”ＮＡ″で示した。

以下余白 ＲＩＮＤ化合物ｘｘｘｖは、本発明の実施に好ましい。

本発明の実施に有用なＲＩＮＤ化合物は、一連の個々に
公知の反応を用いて製造される。これらの化合物の製造
は、欧州特許出願公開第２１１，８９８号公報及び欧州
特許出願第８７３０４６８６．６号明細書に更に詳細に
記載されている。

別の実施態様では、還元性化合物は、欧州特許出願第８
７１１０８６３．５号明細書（１９８６年７月２８０に
出願された米国特許出願第８９０，０５１号明細書）に
記載されているようなコバルト（ＩＩＩ）１９体であっ
てよい。

組成物は、一般に９以下のｐＨを維持するように緩衝さ
れる。分散液中の緩衝剤の濃度は、広範に変動しうる。

代表的な緩衝剤は、燐酸塩及びその他、Ｇｏｏｄらによ
って一障遼劇四見じｋ、５巻４６７頁（１９６６）及び
八ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１０４巻３００頁（１
９８０）に報告されているものを包含する。

水と相溶性の還元性化合物を使用する場合、化合物を前
記の有機溶剤に溶解させ、生じる溶液を直接緩衝液に添
加することによって界面活性剤を用いないで？８液を調
製することができる。

本発明は、廃水、食料品、醸造溶液、製造溶液及び生物
学的流体を含めて任意の流体試料中のグラム陽性及びグ
ラム陰性菌からの生存真菌の鑑別に有用である。本発明
は、ヒトの生物学的流体、例えば尿、血・清、全血、痰
、髄液等中の微生物から酵母の鑑別に特に有用である。

ヒトの尿路に一般的に見られる微生物は、本発明により
有利に鑑別される。

本発明による生存微生物の鑑別は、電子移動剤の存在で
実施するのが好ましい。電子移動剤を存在させると、色
素の放出が一層迅速になる。電子移動剤は、微生物と還
元性化合物との媒介物として作用する移動性化合物であ
る。電子移動剤は、一般に還元性化合物の濃度に依存す
るン農度、好ましくはｌＸｌ０−’〜Ｉ　Ｘ　１０−３
モル濃度で存在する。

本発明の実施に有用な電子移動剤は、フェナジンメトス
ルフェート、フェナジンエトスルフェート及び当業者に
公知の類似化合物を包含する。異なる化合物の組み合わ
せを必要に応じて使用することができる。

好ましい電子移動剤は、欧州特許出願公開第１９０．７
４０号公報に記載されている。一般に、これらの化合物
は置換ベンゾキノン類及びナフトキノン類である。この
キノン類は、例えば、２．３−ジメチル−５−ヒドロキ
シメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジメトキシ
−１，４−ベンゾキノン、２，３．５−）ジメチル−１
，４−ヘンゾキノン、２．６−シメトキシー１，４−ベ
ンゾキノン、２．３−ジメトキシ−５−メチル−１゜４
−ベンゾキノン、２−ヒドロキシメチル−１゜４−ナフ
トキノン及び２−（２−ヒドロキシエチル）−１，４−
ナフトキノンを包含する。更に、置換１．２−ベンゾキ
ノン類、例えば４，５−ジメトキシ−１，２−ベンゾキ
ノンは、本発明の実施に有用である。

生存細胞の鑑別は、しばしばそれらの細胞に対する栄養
素の存在で実施されるが、その存在は必須ではない。有
用な炭素源及び場合により窒素源を含む任意の栄養培地
を使用することができる。

適切な成分及びｐ）Ｉを有する適当な栄養培地は従来良
く知られている。

ポリエン抗生物質の濃度は、使用する抗生物質及び還元
性化合物並びに鑑別する特定の微生物に応じて、グラム
陰性菌及びグラム陰性菌ではなく、真菌の還元能を抑制
するのに充分である限り広範に変動しうる。一般に、抗
生物質は、少なくとも１０４モル濃度、好ましくは１０
−４〜１０−２モル濃度の量で存在する。任意成分であ
るが、好ましい他の物質は、当業者が通常の実験により
容易に決定しうる量で存在する。

本発明方法は、実験室用の標準的ガラス器具中で、例え
ば、試験管、微量滴定プレート又はスライドを用いて実
施するのが便利である。液体試料中の真菌及び細菌を還
元性化合物、ポリエン抗生物質及び必要に応じて他の物
質と混合する。微生物による還元性化合物の還元のため
適切な時間の後、還元により生じる検出可能な物質の量
を適当な装置及び操作を用いて測定する。この場合に、
必要に応じて、検出可能な種の量を、液体試料を還元性
化合物と混合したが、抗生物質を省いた対照試験におい
て生じた量と比較することができる。

好ましい実施態様では、微生物の存在を測定するため、
まず、液体試料を還元性化合物で試験する。次いで、こ
れを本発明のポリエン抗生物質組成物を用いて試験して
真菌と細菌とを層別し、続いてグラム陽性菌とグラム陰
性菌とを鑑別する。

この細菌鑑別は、任意の適当な技法を用いて実施するこ
とができる。好ましい技法は、昭和６２年９月２２日付
で出）１１された日本特許出願の明細書（１９８６年９
月２４日に出願された米国特許出願第９１０，９１７号
明細書）及び昭和６２年９月２４日に出願された日本特
許出願の明細書（１９８６年９月２４日出願された米国
特許出願第９１０，７０３号明細書）に記載されている
。

若干の場合には、還元性化合物と混合する前の前処理工
程で真菌及び細菌を含む試験試料及び抗生物質を混合し
、培養するのが望ましい。この工程は、抗生物質中の不
純物の存在により若干の分析で起こるバックグラウンド
？農度の量を減少させることができる。妨害物質を排除
する別の前処理工程が望ましいこともある。

本発明方法は、また、試験試料を含む多孔性吸収性物質
、例えば紙ストリップを還元性化合物及びポリエン抗生
物質の分散液と接触させることによって実施することも
できる。試験試料中の微生物は分散液と混合し、鑑別に
必要な分析反応を開始する。

一つの実施態様では、溶液分析で計量した量の試薬を試
験溶液に運ぶのに便利な方法として試験ストリップを使
用することができる。試験ストリップを、既に測定すべ
き被分析物を含む溶液中に置く。試薬は試験ストリップ
から溶液中に溶解して反応溶液を形成する。本発明の試
験ストリップの好ましい実施態様では、試薬を水溶性結
合剤中に担持させる。試験ストリップを溶液中に浸漬す
ると、結合剤は熔解して試薬を放出する。有用な水溶性
ポリマーは、ポリ　（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）及
びポリ　（アクリルアミド−ツーＮ−ビニル−２−ピロ
リドン）（９０：１０重量比）を包含する。

また、本発明方法を乾式分析要素と共に実施することが
できる。このような要素は、還元性化合物及び抗生物質
又はその乾燥残渣を含む吸収性担体物質、すなわち、自
立性吸収性又は吸水性物質のン１し）シー］・又はス１
−リップであってよし１゜このような要素は、試験スト
リップ、診断要素、ディツプスティック又は診断剤等と
して従来知られている。

乾式分析要素に使用する場合、本明細書に記載する還元
性化合物及び抗生物質を適当な吸収性担体物質中に吸収
又は含浸によって混入させるが又は適当な吸収性物質上
に塗布することができる。

有用な担体物質は不溶性であり、水又は生理学的流体、
例えば尿又は面清にさらされたときに、その構造ヒの一
体性を維持するものである。有用な担体物質は、紙、多
孔性粒状構造体、セルロース、多孔性ポリマーフィルム
、ガラス繊維、織布及び不織布（合成及び非合成）等か
ら製造することができる。このような要素を作製するた
め有用な物質及び操作は、例えば米国特許第３，０９２
，４６５号、同第３，８０２，８４２号、同第３，９１
５．６４７号、同第３．９１７，４５３号、同第３，９
３６，３５７号、同第４，２４８，８２９号、同第４，
２５５，３８４号及び同第４，２７０，９２０号明細書
並びに英国特許第２，０５２，０５７号明細書によって
周知である。

一つの実施態様において、分析要素は、吸収性担体物質
として少なくとも１個の多孔性拡散帯域をその上に有す
る非多孔性支持体を含む。ζ光性化合物又は抗生物質は
、拡散帯域又は異なる帯域く例えば試薬帯域、記録帯域
又は親水性帯域）に存在することができる。拡散帯域は
、任意の適当な繊維若しくは非繊維状物質又はその一方
若しくは両者の混合物から製造することができる。

拡散帯域は、米国特許第４，２９２，２７２号明細書に
記載されているような、適当な結合剤と混合したか又は
布に織った繊維状物質を使用して、米国特許第３．９９
２．１５８号、同第４，２５８，００１号及び同第４．
４３０，４３６号明細書及び特開昭５７（１９８２）　
−１０１７６０号公報に記載されているようなポリマー
組成物又は粒状物質（結合接着剤を含むか又は含まない
）から製造することができる。

要素は、多数の帯域を有していてよく、帯域は、重ねら
れた層であるか又は同一層中の異なる領域であってもよ
い。還元性化合物、抗生物質及び他の任意の試薬は、要
素内の同−又は異なる帯域に存在することができる。要
素の構造は、例えば前記の特許明細書に記載されている
ように、従来良く知られている。

本発明により、異なる種々の要素を製造することができ
る。任意の所望の幅の長いテープ、シート、スライド又
はチップを含めて種々の形で要素を形成することができ
る。

要素を用いて実施する方法は、手操作で又は自動的にす
ることができる。一般に、要素を供給ロール、チップ包
装物又は他の供給源から採取し、試験すべき液体試料（
例えば２００μｌ以下）と、試料が要素中の試薬と混合
するように接触させることによって鑑別を行う。このよ
うな接触は、任意の適当な方法で、例えば要素を試料中
に浸漬するか、又は好ましくは適当な分配手段を用いて
一滴以上の試料を手又は機械で要素に落とすことによっ
て達成される。

試料を施した後、要素をコンディショニング、例えばイ
ンキュベーション、加熱等、任意の試験結果を得るのを
促進又は容易にするのに望ましい処理に付す。生存真菌
細胞の検出は、還元された還元性化合物の量を測定し、
抗生物質の不存在下に生成した検出可能な物質と対比す
る場合に達成される。若干の場合には、抗生物質及び試
験試料を混合し、混合物を還元性化合物を含む要素に施
す前に前処理（溶液分析について記載した）することが
できる。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を示すが、本発明の範囲をこれら
の実施例に限定するものではないことばいうまでもない
。

本発明方法を実施する際には、下記の操作を実施した： 大腸菌（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）及び黄色ブドウ球菌（鉦ａ
ｕｒｅｕｓ）は、ＢＨＩブロス中で３７℃で一夜培養し
た。カンジダ・アル１丸にス（四　へＵ状岨旦）及び黄
色アスベルギル’；ｌ　（Ａ、　　ｆｌａｖｕｓ）は、
ＳＡＢブロス中で２５’ＣＴ：振盪しながら一夜培養し
た。

細胞を遠心分離によって集め、洗浄し、０．０５モル？
４度Ｎ−２−ヒトロキシエチルビベラジンーＮ″−２−
エタンスルホン酸（ＩＩＥＰＥｓ）緩衝ン（’ｊ、　（
ｐＨ７，８）中に再懸濁した。

例えば、前記の第１表のＲＩＮＤ■をＮ、Ｎ−ジメチル
ホルムアミド中に、）８剤ｌ　ｍｌ当たり化合物１６ｍ
ｇの割合で）岩屑させることによってＲＩＮＤ化合物を
含む分１；々液を製造した。得られた溶液の既知量（２
５０μｌ）をトリトン（Ｔｌｌ！ＴＴＯＮ）　　Ｘ−１
００ノニオン界面活性剤５００μβに添加した。この混
合物を次に０．０５モル渭度ＨＩＦ、　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝
液２５滅に攪ｆＴ　Ｌながら滴加した。０．　］％硫酸
で酸性にしたＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中に化合物
を溶解するく溶剤１　ｍｌ当たりＲＩＮＤ化合物１６ｍ
ｇ）ことによって、水と相溶性のＲＩＮＤ化合物（例え
ば、ＲＩＮＤＸＸＸＶ化合物）を含む溶液を調製した。

９０−：　紅肌≧旦且ζｑル圀。

この例は、溶液中の生存グラム陽性菌及びグラム陰性閑
と生存酵母とを鑑別するため本発明の詳細な説明するも
のである。

この例には、下記の物質を使用した：前記のようにして
調製したＲＩＮＤＩＸ化合物のストック溶液、グルコー
ス（水中１０％）、トリメチル−１゜４−ベン゛ゾキノ
ン（メタノール１−当たり１．５ｍｇ）及び抗生物質（
ジメチルスルホキシドｌ　ｍｌ当たり２５ｍｇ、ただし
、フィリピンは溶剤ｌ　ｍｌ当たり１２．５ｍｇ）。細
菌及び酵母を前記のように増殖させた。分析混合物中の
概算の最終細胞）１度は、大腸菌４．２Ｘ１０’細胞／
　ｍｌ　、黄色ブドウ球菌７．１×１０６細胞／ｄ、カ
ンジダ・アルビカー乙２．７×１０５細胞／　ｍｌであ
った。

試験を下記のように行った。

方法１： 緩衝液１．２ｍｌ、グルコース溶液５０μ＋２．ＲＩＮ
ＤＩＸ分散？（ｌ、　１．５　ｍｌ、抗生物質溶液１０
０ＡＩＡ、細胞懸濁液１００μ！及び電子移動剤溶液２
５μｌを順次添加することによって試験溶液を調製した
。細胞対照溶液は、抗生物質以外の全試薬を含む。バッ
クグラウンド対照は、緩衝液及び溶液対照から成る。緩
衝液対照は、抗生物質及び細胞以外の全試薬を含む。溶
液対照は、細胞以外の全試薬を含む。試験溶液及び対照
溶液について０分及び３７℃で３０分培養した後に６３
５ｎｍで光学濃度の読み（ＯＤ）を測定し、濃度の変化
（ΔＯＤ）を測定した。下記の第■表には、ＲＩＮＤ化
合物の還元の補正抑制率として表した結果を挙げる。

補正抑制率を、抗生物質を含まない細胞対照から得られ
たΔＯＤと試験溶液のΔ○Ｄとの差を抗生物質を含まな
い細胞対照のΔＯＤで割ることによ′って算出する。す
べての読みを適切なバックグラウンド対照の読みの減算
によって補正した。

方法２： 緩衝液２．９　ＴＮｉ、抗生物質溶液５０μｌ及び細胞
溶液１００ＩＪｌを含む溶液を３７°Ｃで３０分培養し
、１０分間遠心分離し、デカントした。次いで、得られ
たペレットを緩衝液１．４　ｍｌ、グルコース溶液５０
μＩＲＩＮＤＩＸ分散液１，５ｍｆ及び電子移動剤溶液
２５μ！で処理し、良く混合し、方法ｌに記載したよう
にして光学濃度を記録した。補正抑制率のデータを方法
１に記載したようにして算出した。

第■表のデータは、ポリエン抗生物質がグラム陽性菌及
びグラム陰性菌から酵母を鑑別するのに有効であること
を示す。

（以下余白） 開Ｉ：　　　　）”　　　びカビの一寸この例は、水と
相溶性のＲＩＮＤ化合物を使用してグラム陰性菌及びグ
ラム陽性菌から酵母及びカビを鑑別するための本発明の
詳細な説明するものである。鑑別は、微量滴定プレート
中で実施した。

１００μβのＲＩＮＤ　　ＸＸＸＶ溶液（酸性にしたＮ
、Ｎ−ジメチルホルムアミド ＲＩＮＤ化合物１６ｍｇ）、２００μＪのグルコース溶
液（水中１０％）、２００μｌのトリメチル−１．４−
ベンゾキノン電子移動剤溶液（メタノール１−当たり１
．５ｍｇ）及びｌＱａ＋１の緩衝液から組成物を調製し
た。

下記の試薬を使用して試験溶液を調製した。

５０μｌの緩衝液、５０μｌのフィリピンポリエン抗生
物質（ジメチルスルホキシド１−当たり１　２、　５　
ｍｇ）　　（＄！衝液及び抗生物質溶液の希釈列を作っ
て種々の抗生物質濃度を得た）、５０μｌの適切な細胞
懸濁液、すなわち大１！ＩＩ（約１０”細胞／ｍ１）、
黄色ブドウ球菌（約ｔｏ”細胞／，！１り、カンジダ・
アルビカンス（約１０７細胞／ｎＲ）及び黄色アスペル
ギルス、及び２００−の前記のＲＥＮＤ組成物。

例１に記載したようにして対照溶液を調製した。

励起５４０ｎｎ＋及び発光６２０ｎｍで読み取るように
変形したグイナテソク・マイクロフルオル・リーダー（
Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＭＩＣＲＯＦＬＵＯＲ　Ｒｅａｄｅ
ｒ）を使用して０時及び３７℃で３０分培養した後に相
対酌量光度を測定した。相対酌量光度の変化を２つの値
の差として測定した。

下記の第■表には、得られた結果を、例１に記載したよ
うに計算したＲＩＮＤ化合物の還元の補正抑制率として
示す。

これらの結果は、本発明が細菌から真菌（例えば、カビ
及び酵母）を鑑別するのに有用であることを示す。

（以下余白） 第■表 ０、２６　　　　０　　　　　７．５　　　５６．８　
　３１．９０、５２　　　　０　　　　　８．６　　　
７１．０　　４２．５１、０４　　　　２．０　　　１
４．８　　　Ｂｏ．７　　４９．８２、０８　　　１７
．６　　　１８．２　　　８６．８　　６４．９この例
は、還元性化合物としてテトラゾリウム塩を使用して本
発明の詳細な説明するものである。

微量滴定プレート中で細菌からの酵母及びカビの鑑別を
実施した。使用した細胞懸濁液は、例２に記載したのと
同様であった。使用した還元性化合物は、３−　（４．
５−ジメチル−２−チアゾリル）−２．５−ジフェニル
−２Ｈ−テトラゾリウムプロミドであった。該テトラゾ
リウムプロミドを含む組成物を下記の成分を用いて調製
した：２００μｌのフ゛ロミド？容液（メタノール１−
当たり５ｍｇ）、２００μｌのグルコース溶液（水中１
０％グルコース、２００μｌのトリメチル−１。

４−ベンゾキノン及び１２−の緩衝液（０．０５モル、
ｐＨ７．８）。

下記の試薬を使用して試験溶液を調製した。

５０μｌの緩衝液、５０μｌのフィリピンポリエン抗生
物質（ジメチルスルホキシド１−当たり１’２．５ｍｇ
）　　（緩衝液及び抗生物質溶液の希釈列を作って種々
の抗生物質濃度を得た）、５０μにの適切な細胞懸濁液
、すなわち大腸菌（約１０”細胞／ＩＲ１）、黄色ブド
ウ球菌（約１０８細胞／Ｉｎｌ）、カンジダ・アルビカ
ンス（約１０７細胞／ｍｌ＞及び黄色アスペルギルス、
及び２００−の前記のテトラゾリウム塩組成物。細胞対
照は、抗生物質以外の全試薬を含む，バンクグラウンド
は緩衝剤を用いて測定した。溶液対照は、細胞以外の全
試薬を含む。

市販の分光光度計を用いて５４０ｎｍで光学濃度を測定
し、３７℃で３０分後に光学濃度の変化（ΔＯＤ）を測
定した。下記の第■表には、結果を前記の例１に記載し
たようにして計算した補正抑制率として示す。これらの
結果は、本発明が細菌から酵母及びカビを鑑別するのに
有用であることを示す。酵母の鑑別に有効な濃度は、カ
ビに対するものとは異なることは明らかである。しかし
、所定の試験に対して適切な濃度を決定することは当業
者の熟練の範囲内である。

第■表 ０．２６　　　　０　　　０　　１０．３　　　００．
５２　　　　０　　　０　　５０．０　　１０．３１．
０４　　　　０　　　０　　６０．３　　１９．０２．
０８　　　　０　　　０　　１００　　９８．３±↓：
　免ＪＪＬ（麦月ｊソ」１叫及１１印トカ１淵この例は
、乾式分析要素を使用して酵母及び細菌を鑑別するため
の本発明の詳細な説明するものである。

市販の３璽真のクロマトグラフィーペーパーのストリッ
プをアセトンで２回洗浄し、次いで、下記の成分を含む
試験溶液中に浸漬した：５ｒｎｌのメタノール、■−の
ＲＩＮＤＸＸＸＶ溶液（前記のようにして調製した、酸
性にしたＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドｌ　ｍｌ当たり
１６ｍｇ）　、ｌ　ｍｌの２，３−シメトキシー５−メ
チル−１，４−ベンゾキノン溶液（メタノールｌ　ｍｌ
当たり１．８２ｍｇ）　、１　ｍｌのグルコース溶液（
水中１０％）及び１−のフィリピンポリエン抗生物質溶
液（ジメチルスルホキシド１−当たり２５ｍｇ）。抗生
物質以外は同じ成分を含む対照溶液を調製し、分離した
ストリップをその溶液中に浸漬した。次いで、すべての
ストリップを２５℃で１時間暗所で乾燥した。

乾燥したストリップから標準ペーパーパンチを使用して
円形要素（直径約０．６ｃｍ）を裁断した。

次いで、要素を微量滴定プレート中に置いた。細胞）懸
濁液（すなわち、カンジダ・アルビカンス、約５Ｘ１０
’細胞／　ｍｌ、大腸菌、約５Ｘ１０８細胞／　ｍｌ及
び黄色ブドウ球菌、約５Ｘ１０”細胞／ｍｌ）を試験溶
液及び対照要素に施した。緩衝液をバックグラウンド測
定のため別の要素に施した。

ダイナチック・マイクロフルオル・リーダーを用いて、
ゼロ時及び３７°Ｃで３０分培養した後に相対的螢光度
（励起５４０ｎｍ及び発光６２０ｎｍ）を測定し、相対
的螢光度の変化を測定した。下記の第Ｖ表には、得られ
た結果を、例１に記載したように計算したＲｒＮＤ化合
物の還元の補正抑制率として示す。これらの結果は、乾
式要素を使用した分析により本発明により細菌と酵母と
が鑑別されたことを示す。

第ｖ表 容体　　　　　　　　刊」」叫糾岸ユ 黄色ブドウ球菌（グラム＋）　　　　　　Ｏ大腸菌（グ
ラム−）１８ カンジダ・アルビカンス（酵母）７６ 〔発明の効果〕 本発明は、生存細菌から生存真菌を鑑別するための迅速
、簡単で、かつ比較的に安価な手段を提供する。本発明
によれば、公知の技法の不所望に時間のかかる性質が回
避される。更に、広範な還元性化合物を使用することが
でき、これにより分析に著しい柔軟性が与えられる。例
えば、このような柔軟性により、感度が高く、生存材料
に対して毒性が低いか又は生物学的流体若しくは他の流
体中に見られる潜在的妨害物質によって形容されないス
ペクトル領域で検出することができる色素を使用するこ
とが可能になる。これらの利点は、還元性化合物と共に
真菌の細胞質膜に選択的に作用するポリエン抗生物質を
使用することによって達成される。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）還元抑制物質の不存在下に生存真菌及び細菌
   の両者によって還元されて検出可能な物質を生成しうる
   化合物、並びに （ｂ）細胞質膜に作用し、真菌による還元性化合物の還
   元を選択的かつ実質的に抑制するポリエン抗生物質 を含む生存真菌と細菌とを鑑別する組成物。 ２、（ａ）還元抑制物質の不存在下に生存真菌及び細菌
   の両者によって還元されて検出可能な物質を生成しうる
   化合物、並びに （ｂ）細胞質膜に作用し、真菌による還元性化合物の還
   元を選択的かつ実質的に抑制するポリエン抗生物質 を含む生存真菌と細菌とを鑑別する分析要素。 ３、Ａ、生存真菌及び生存細菌を含むと思われる液体を
   （ａ）還元抑制物質の不存在下に生存真菌及び細菌の両
   者によって還元されて検出可能な物質を生成しうる化合
   物、並びに（ｂ）細胞質膜に作用し、真菌による還元性
   化合物の還元を選択的かつ実質的に抑制するポリエン抗
   生物質と混合し、そして Ｂ、細菌の存在により生じる検出可能な物質を測定する 工程を含む生存真菌と細菌とを鑑別する方法。