JPS6384490A - Production enhancing method for plasminogen activator precursor - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To increase the activity ratio of a plasminogen activator precursor, by cultivating a human kidney-derived established cell transformed with a vector containing a DNA sequence capable of coding the plasminogen activator in a culture medium containing a neutral amino acid. CONSTITUTION:A human kidney-derived established cells transformed by using a vector containing a DNA sequence capable of coding a plasminogen activator precursor are cultivated in a culture medium containing at least a neutral amino acid. The aimed plasminogen precursor is recovered from the culture medium by using a means, e.g. centrifugation, concentration under reduced pressure, salting out, fractionation, etc. The vector for expressing the precursor is constituted of, e.g. enhancer, initial promoter, etc., derived from SV-40 as an expression system gene. Glycine, alanine, leucine, etc., are cited as the neutral amino acid contained in the culture medium.

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ブラスミノーゲンアクチベーター前駆体（以
下、前駆体という）の産生増強方法に関する。更に詳し
くは、本発明は、ブラスミノーゲンアクチベーター前駆
体をコードするＤＮＡ配列を組み込んだベクターを用い
て形質転換させたヒト腎由来株化細胞を培養して、ブラ
スミノーゲンアクチベーター前駆体を生産するに際して
、培地に少なくとも中性アミノ酸を含むことを特徴とす
るブラスミノーゲンアクチベーター前駆体の産生増強方
法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention relates to a method for enhancing the production of a blasminogen activator precursor (hereinafter referred to as precursor). More specifically, the present invention involves culturing a human kidney-derived cell line transformed with a vector incorporating a DNA sequence encoding a blasminogen activator precursor to produce a blasminogen activator precursor. The present invention relates to a method for enhancing production of a plasminogen activator precursor, characterized in that the medium contains at least a neutral amino acid.

［従来の技術］ 本発明の前駆体はそのままでは不活性であるが、プラス
ミン処理することにより酵素活性を発現する、いわゆる
チモゲンの一種である。この前駆体はヒト腎細胞の無血
清培地中にて生成できる。本前駆体はアミノ酸４１１個
の鎖状構造を有しており、分子ｆｉ　５４．０００、フ
ィブリンに特異的な親和性を示し、従来のウロキナーゼ
とは全く異なる性質を有する。また、合成基質法では活
性が認められず、平板法で活性を示す（特開昭６Ｏ−６
２９８１）。[Prior Art] The precursor of the present invention is inactive as it is, but is a type of so-called zymogen that expresses enzymatic activity when treated with plasmin. This precursor can be produced in serum-free medium of human kidney cells. This precursor has a chain structure of 411 amino acids, has a molecular fi of 54,000, exhibits a specific affinity for fibrin, and has properties completely different from conventional urokinase. In addition, no activity was observed in the synthetic substrate method, but activity was shown in the plate method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-6
2981).

本前駆体は最近、遺伝子工学を応用した産生方法が展開
しつつある。例えば、本前駆体をコードするＤＮＡ配列
（特開昭６０−１８０５９１）　、そのＤＮＡ配列を組
み込んだベクターを用いて形質転換させた動物細胞（特
願昭６０−１７９６９１、そのＤＮＡ配列を組み込んだ
ベクターを用いて形質転換させたヒト腎由来株化細ｖｉ
（特願昭ｆ３（１−２９０３２５＞などが知られている
。Recently, methods for producing this precursor using genetic engineering are being developed. For example, a DNA sequence encoding this precursor (Japanese Unexamined Patent Publication No. 60-180591), an animal cell transformed using a vector incorporating the DNA sequence (Japanese Patent Application No. 60-179691, a vector incorporating the DNA sequence) Human kidney-derived cell line vi transformed using
(Patent application Sho f3 (1-290325) etc. are known.

［本発明が解決しようとする問題点］ ところが、これらの形質転換細胞、特に大賢由来の株化
細胞を宿主に用いても、本前駆体の産生効率は充分であ
るとは言えない。また、ヒト以外の由来細胞を用いるこ
とは、異種蛋白が混入し除去しにくく、本来の糖鎖とは
異なるものがつく可能性があるため好ましくない。[Problems to be Solved by the Present Invention] However, even when these transformed cells, especially the established cell line derived from Daiken, are used as hosts, the production efficiency of the present precursor cannot be said to be sufficient. Furthermore, it is not preferable to use cells derived from non-humans because foreign proteins may be mixed in and difficult to remove, and sugar chains different from the original sugar chains may be attached.

そこで発明明各らは、上記目的を解決するために、前駆
体の産生増強について鋭意検討した結果、前駆体をコー
ドするＤＮＡ配列を組み込んだベクターを用いて形質転
換させたヒト腎由来株化細胞の培養培地中に、少なくと
も中性アミノ酸を含ませることにより、前駆体の産生を
向上できることを見いだし、本発明を完成した。Therefore, in order to solve the above-mentioned object, the inventors conducted intensive studies on enhancing the production of the precursor, and as a result, developed a human kidney-derived cell line transformed using a vector incorporating a DNA sequence encoding the precursor. The present invention was completed based on the discovery that the production of precursors can be improved by including at least a neutral amino acid in the culture medium of the present invention.

［問題点を解決するための手段］ （＋）　　前駆体産生細胞の：ｌ製 前駆体産生細胞の原料（宿主）としてヒト腎由来株化細
胞を用いる。[Means for Solving the Problems] (+) A human kidney-derived cell line is used as a raw material (host) for the precursor-producing cells produced by: l.

この宿主細胞の核内に前駆体発現用ベクターを挿入する
ことにより形質転換が行なわれる。Transformation is performed by inserting a precursor expression vector into the nucleus of this host cell.

前駆体発現用ベクターは、発現系遺伝子として例えば５
Ｖ−４０に由来するエンハンサ−１初期プロモーター、
ポリアゾニレ−ジョンシグナル及び前駆体をコードする
遺伝子から構成される。又他の動物ウィルスや動物細胞
に由来するプロモーターなども使用できる。The precursor expression vector contains, for example, 5 as an expression system gene.
Enhancer-1 early promoter derived from V-40,
It is composed of a gene encoding a polyazonylation signal and a precursor. Furthermore, promoters derived from other animal viruses and animal cells can also be used.

形質転換は、シャーレに約５〜７　ｘ　１１０５ｃａｌ
ｌｓ１０　／　１００朧ｄｉｓｈの割合で宿主細胞を調
製し、これに前駆体発現用ベクターをＤＮＡ　ｉとして
２〜４μび加える。ＤＮＡを宿主細胞にとりこまぜた後
、培養を行い形質転換細胞の選別をおこなった。選別さ
れた細胞は、好ましくは、繊維状・粒状の細胞が付着可
能な培養用担体によって増殖される。Transformation is performed using approximately 5-7 x 1105 cal in a Petri dish.
Host cells are prepared at a ratio of ls10/100 dishes, and 2 to 4 μ of the precursor expression vector is added thereto as DNAi. After the DNA was incorporated into host cells, they were cultured and transformed cells were selected. The selected cells are preferably grown on a culture carrier to which fibrous/granular cells can adhere.

担体は、より好ましくは、プラスに荷電処理されたガラ
ス、ダクロン、テフロン、ナイロン、オルロン等が例示
される。この担体は、通常培地に対して、０．００１〜
０．５ｇ／Ｊ　、好ましくは０．０１〜０．２０グ／　
ｃｔｔｒ　３程度の密度で培養器に充填する。More preferable examples of the carrier include positively charged glass, Dacron, Teflon, nylon, orlon, and the like. This carrier has a ratio of 0.001 to
0.5g/J, preferably 0.01-0.20g/J
Fill the culture vessel at a density of about cttr 3.

（２）　　　前　　培　　養 コ（１）種細胞を２０万〜３０万ｃｅｌｌｓ　／ｌｄ植
え込み、培地（たとえば、ｔ＋ａｙｍｏｕｔｈ培地ある
いはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄＢｉｅｄ　ＨＥＭ培
地に熱不活化牛胎児血清２〜５　ｗ／ｖ％を添加したも
の）を用いて２〜３日間培養を続けた後、必要ならば培
地を新しく交換して継代培養し、細胞数を１００万〜２
００万ｃｅｌｌｓ　／ｌｄに調整する。(2) Pre-culture (1) Inoculate 200,000 to 300,000 cells/ld of seed cells and add 2 to 5 w/v% heat-inactivated fetal bovine serum to a medium (for example, T + aymouth medium or Dulbecco's modBied HEM medium). After culturing for 2 to 3 days, if necessary, replace the medium with a new one and subculture to increase the number of cells to 1 million to 2.
Adjust to 1,000,000 cells/ld.

（３）　　　本　　培　　養 基本培地としては、たとえばＷａｙｍｏｕｔｈ培地ある
いは０ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＨＥＭ
培地にＯ，ＯＳ　〜０．２Ｗ／Ｖ％ヒト血清アルブミン
を添加した無血清培地が用いられる。(3) As the basic culture medium, for example, Waymouth medium or Oulbecco's modified HEM
A serum-free medium is used in which O,OS ~0.2 W/V% human serum albumin is added to the medium.

これに本発明の特徴である、中性アミノ酸が添加される
。中性アミノ酸としてはグリシン、アラニン、ロイシン
、イソロイシン、フェニルアラニン等の脂肪族アミノ酸
などが例示されるが、好適にはグリシンが用いられる。A neutral amino acid, which is a feature of the present invention, is added to this. Examples of neutral amino acids include aliphatic amino acids such as glycine, alanine, leucine, isoleucine, and phenylalanine, but glycine is preferably used.

添加量としては０．１〜２　Ｗ／Ｖ％が例示される。添
加量が、０．１％以下では産生能が十分上がらず、また
、３％以上では、毒性が上がって産生能向上にはマイナ
スとなるためである。また、有機酸またはその塩を併用
してもよい。An example of the amount added is 0.1 to 2 W/V%. This is because if the amount added is less than 0.1%, the productivity will not be sufficiently increased, and if the amount added is more than 3%, the toxicity will increase, which will have a negative effect on improving the productivity. Further, an organic acid or a salt thereof may be used in combination.

有ｍ酸としては炭素数３〜１８のものであれば特に限定
されない。通常は、カルボン酸、特に飽和または不飽和
脂肪族カルボン酸（就中、モノカルボン酸またはジカル
ボン酸）が好適に使用される。The m-acid is not particularly limited as long as it has 3 to 18 carbon atoms. Usually, carboxylic acids, especially saturated or unsaturated aliphatic carboxylic acids (especially monocarboxylic acids or dicarboxylic acids) are preferably used.

当該有ｉ酸は置換基として、たとえば水酸基等を有して
いてもよい。かかる有機酸としては、フマル酸、コハク
酸、リンゴ酸、クエン酸、ステアリン酸、オレイン酸、
リノール酸、バルミチン酸、リルン酸、ミリスチン酸な
どが例示される。特に好適には、コハク酸などの脂肪族
ジカルボン酸が使用される。上記有ｎ酸の塩としては、
生理的に受は入れられる塩、たとえばアルカリ金属塩（
ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩
（カルシウム塩など）などを用いることができる。これ
らの有機酸もしくはその塩の添加Ｍとしては０，１〜３
　ｗ／ｖ％が例示される。The ionic acid may have, for example, a hydroxyl group or the like as a substituent. Such organic acids include fumaric acid, succinic acid, malic acid, citric acid, stearic acid, oleic acid,
Examples include linoleic acid, valmitic acid, lylunic acid, myristic acid, and the like. Particular preference is given to using aliphatic dicarboxylic acids such as succinic acid. As the salt of the above-mentioned n-acid,
Physiologically acceptable salts, such as alkali metal salts (
Sodium salts, potassium salts, etc.), alkaline earth metal salts (calcium salts, etc.), etc. can be used. The addition M of these organic acids or their salts is 0.1 to 3.
An example is w/v%.

また他に添加物として公知であるラクトアルブミン氷解
物、トランスフェリン、インシュリン等のホルモンなど
を添加してよい。In addition, known additives such as lactalbumin thawed product, transferrin, hormones such as insulin, etc. may be added.

培養は、例えば前駆体産生細胞５０万〜２００万ｃｅｌ
ｌｓ／ｍを一定に維持しながら、上記培地中で行って、
前駆体を産生させ、２〜３日毎に培養培地を新しく交換
する。そしてこの交換した培地中に存在する前駆体を回
収する。The culture is carried out using, for example, 500,000 to 2,000,000 precursor producing cells.
carried out in the above medium while maintaining a constant ls/m,
The precursors are produced and the culture medium is freshly replaced every 2-3 days. The precursors present in this replaced medium are then recovered.

なお、この培地中には空気（Ａｉｒ９５％、ＣＯ２５％
）を適宜導入（流速：１０〜５００ｍ／分）することが
好ましく、温度は２０〜３７℃が好ましい。Note that this medium contains air (95% Air, 25% CO2).
) is preferably introduced as appropriate (flow rate: 10 to 500 m/min), and the temperature is preferably 20 to 37°C.

培地からの前駆体の回収は公知の手段を用いて行えばよ
く、例えば当該培地を遠心分離、減圧濃縮、塩析分画、
ゲル濾過、濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィーを、適宜組み合わせること
によって行われる。The precursor may be recovered from the culture medium using known means, such as centrifugation, vacuum concentration, salting-out fractionation,
This is carried out by appropriately combining gel filtration, concentration, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.

［発明の効果］ 本発明の方法により、本前駆体の産生は従来の方法に比
べて活性比で約１．２〜２倍程度増強することができる
。[Effects of the Invention] By the method of the present invention, the production of the present precursor can be enhanced by about 1.2 to 2 times in terms of activity ratio compared to conventional methods.

［実施例］ 以下に本発明を具体的に説明する。しかし、本発明はこ
れらに限定されるものではない。[Example] The present invention will be specifically described below. However, the present invention is not limited thereto.

参考例１（組換えＨＫＧ細胞の調製〉 （１）　　ｍＲＮ　Ａの単離・精製 ■　使用細胞 ウロキナーゼを産生ずるヒト腎由来株化細胞から全ＲＮ
Ａを抽出するため、まずこの細胞を５％ＦＣ３を含むダ
ルベツコのＭＥＭ培地中で培養し辷後、培地を１％ＦＣ
８を含むダルベツコのＭＥＭ培地に変換し、さらに１０
〜１５時間の培養を行った。この時期の細胞２〜５　Ｘ
　１０９個をトリプシン処理によって集め、全ＲＮＡを
抽出した。Reference Example 1 (Preparation of recombinant HKG cells) (1) Isolation and purification of mRNA ■ Cells used Total RN from a human kidney-derived cell line that produces urokinase
In order to extract A, the cells were first cultured in Dulbecco's MEM medium containing 5% FC3, and then the medium was diluted with 1% FC.
Convert to Dulbecco's MEM medium containing 8 and then 10
Culture was performed for ~15 hours. Cells 2-5X at this stage
109 cells were collected by trypsinization and total RNA was extracted.

■ＩＩＩＲＮ　Ａの回収 特開昭５８−１４８８９９　（出願人　株式会社ミドリ
十字）において開示された方法を用い、アフリカッメガ
エル卵母細胞へのインジェクションによりウロキナーゼ
の活性がみられた１９〜２０ｓの大きさのｍＲＮＡを精
製した。■Recovery of IIIRNA A. Using the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-148899 (applicant: Midori Jujii Co., Ltd.), a large sample of 19 to 20 seconds in which urokinase activity was observed was injected into African frog oocytes. The mRNA of Sa was purified.

（２）−重鎖ｃＤ　Ｎ　Ａの合成 ｃＤ　Ｎ　Ａの合成は、主としてＨａｒｕｉｎ、　Ｐ、
　Ｉｔ４．　ｅｔａｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ
、、　　２５３．２４８３−２４９５　（１９７８）及
びＨａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ。(2) - Synthesis of heavy chain cDNA The synthesis of cDNA is mainly carried out by Haruin, P.
It4. etat, J., Biol, Chew
, 253.2483-2495 (1978) and Haniatis et al.
lar cloning.

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、
　１９８２．の報告を基に行った。A Laboratory manual, Col.
Spring Harbor Laboratory,
1982. This was done based on the report.

■　表１に示した反応混合液に６５℃、５分間加熱後氷
上にて急冷したウロキナーゼｍＲＮＡを２０μり加え、
エツベンドルフチューブ内でよく混ぜた後、氷上に放置
した。■ To the reaction mixture shown in Table 1, add 20 μl of urokinase mRNA, which was heated at 65°C for 5 minutes and then rapidly cooled on ice.
After mixing thoroughly in an Etzbendorf tube, the mixture was left on ice.

（以下余白） 表　　　　１ ■　４６℃、１０分〜１２分の反応により、−本鎖目の
ＣＤ　Ｎ　Ａの合成を行った。(The following is a margin) Table 1 ① - Main strand CD N A was synthesized by a reaction at 46° C. for 10 to 12 minutes.

■　この反応混合液に０．５　ＨＥＤＴＡ　　（１）Ｈ
８，０）、２０μβを加えることにより反応を終了させ
た。■ Add 0.5 HEDTA (1)H to this reaction mixture.
8,0), and the reaction was terminated by adding 20 μβ.

■　反応混合液に等ｌ　（２００μｇ）のフェノール／
クロロホルム溶液を加え、ポルテックスにて攪拌後、１
０．ＯＯＯｒｐｍ　１３分間の遠心を行い、その上層（
水層）を分取した。下層のフェノール層にはざらに等損
のセファデックスＧ　−１００緩衝液（１０１１Ｈトリ
ス−ＨＣρ　ｐＨ８，０，１ｍＨＥＤＴＡ　、　１００
ｍＨＮａ　ＣｆＪ）を加え、再度抽出を行った。両者の
水層を混合し、この反応液に８０％グリセリンを６０μ
ｇ加えた。■ Add equal l (200 μg) of phenol/
After adding chloroform solution and stirring with portex, 1
0. Centrifuge at OOOrpm for 13 minutes and remove the upper layer (
The aqueous layer) was separated. The lower phenol layer was filled with Sephadex G-100 buffer (1011H Tris-HCρ pH 8, 0, 1 mHEDTA, 100%
mHNa CfJ) was added and extraction was performed again. Mix both aqueous layers and add 60μ of 80% glycerin to this reaction solution.
g added.

■　セファデックスＧ　−１００カラムに反応混合液を
アプライし、Ｇ　−１００緩衝液で溶出した。(2) The reaction mixture was applied to a Sephadex G-100 column and eluted with G-100 buffer.

溶出液は１フラクション５滴ずつ分画した。The eluate was fractionated into 5 drops per fraction.

■　各フラクションをチェレンコフ　カウントで測定し
、放射活性のピーク部分を集めた。■ Each fraction was measured by Cerenkov counting, and the peak radioactivity was collected.

■　１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、１０μ３
のｔＲＮＡ、２容のエタノールを添加し、−８０℃で２
０分冷却した。■ 1/10 volume of 3M sodium acetate buffer, 10μ3
of tRNA, 2 volumes of ethanol, and incubated at -80°C for 2 hours.
Cooled for 0 minutes.

■　遠心（１５，ＯＯｒｐｍ、１０分）にて沈澱を集め
、これを減圧上乾燥した。(2) A precipitate was collected by centrifugation (15,000 rpm, 10 minutes) and dried under reduced pressure.

■　沈澱ヲ３００μＪｌの０．ＩＮ　　ＮａＯＨ溶液に
溶解し、７０℃、２０分間インキュベートした後水冷し
た。■ 0.300μJl of precipitation. It was dissolved in IN NaOH solution, incubated at 70°C for 20 minutes, and then cooled with water.

（ＩＤ　　ＩＮ　　ＨＣｊ溶液（約３０μＮ）を添加し
て中和した。中和後、２μρをサンプリングしてその放
射活性を測定した。(ID IN HCj solution (approximately 30 μN) was added to neutralize. After neutralization, 2 μρ was sampled and its radioactivity was measured.

■　１０μｑのｔＲＮＡを添加し、エタノール沈澱を行
った。遠心後沈澱を集め、これを減圧下で乾燥した。■ 10μq of tRNA was added and ethanol precipitation was performed. After centrifugation, the precipitate was collected and dried under reduced pressure.

［株］　かくして−重鎖ｃＤ　Ｎ　Ａの合成が完成した
。[Stock] Thus, the synthesis of heavy chain cDNA was completed.

−重鎖ＣＤＮＡの合成ωは、−重鎖ｃＤ　Ｎ　Ａ−ＩＩ
ＲＮＡハイブリッドをＧ−１００カラムクロマトグラフ
イーによって回収し、これをアルカリ熱処理してｌｌｌ
ＲＮＡを分解除去した後求めた。その結果、３．６５μ
ｑのウロキナーゼ−重鎖ｃＤＮΔを得た。-Synthesis ω of heavy chain cDNA is -heavy chain cDNA-II
The RNA hybrid was collected by G-100 column chromatography and subjected to alkaline heat treatment.
It was determined after decomposing and removing RNA. As a result, 3.65μ
Urokinase-heavy chain cDNA Δ of q was obtained.

（３）二本鎖目のＤＮＡの合成 二本鎖目のＤＮＡの合成は、まずＤＮＡポリメラーゼＩ
でＤＮＡ合成し、その後逆転写酵素を用い、ＤＮＡ鎖の
延長を行った。(3) Synthesis of second-strand DNA The synthesis of second-strand DNA begins with DNA polymerase I.
DNA was synthesized, and then the DNA chain was elongated using reverse transcriptase.

■　−重鎖ＣＤＮＡ１００μｇを２×反応混合液（表２
）で懸濁した。- 100 μg of heavy chain CDNA was added to the 2x reaction mixture (Table 2
).

表　　　　２ ■　６０℃で２分間インキュベートした後、遠心（１５
，００Ｏｒ１１ｍ　、　　２．５分）し、上清を取った
。Table 2 ■ After incubating at 60°C for 2 minutes, centrifuge (15
,00Or11m, 2.5 minutes) and the supernatant was taken.

■　沈澱に５０μｇの水を加え、■の操作を繰り返し、
両者の上清を混合した。■ Add 50 μg of water to the precipitate and repeat the operation of ■.
Both supernatants were mixed.

■　ＤＮＡポリメラーゼｌ　クリノーフラグメント５０
ＵｎｉｔＳを添加し、全はを２００μＮとした。■ DNA polymerase l Klino Fragment 50
UnitS was added to give a total force of 200 μN.

■　１５℃で一夜インキユベートした。■ Incubate overnight at 15°C.

■　０．２８　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）溶液を２０μ
ρ添加して反応を停止した後、等容（２２０μｍ）のフ
ェノール／クロロホルム溶液を加え、混合し遠心した。■ 20μ of 0.28 EDTA (pH 8,0) solution
After stopping the reaction by adding ρ, an equal volume (220 μm) of phenol/chloroform solution was added, mixed, and centrifuged.

上層を分取し、フェノール層を２２０μρのＴＥＷ衝液
（１０ｍＨトリスーＨＣｆＪｐＨ８，０、１ｍＨＥＤＴ
Ａ）ｔ’再抽出シタ。The upper layer was separated, and the phenol layer was washed with a 220 μρ TEW solution (10 mH Tris-HCfJ pH 8,0, 1 mHEDT
A) t' re-extracted.

■　両者の水層を集め、８０％グリセリンを６０μｇ添
加した。(2) Both aqueous layers were collected and 60 μg of 80% glycerin was added.

■　セファデックスＧ−１００カラムにアプライし、Ｇ
　−１００緩衝液で溶出した。溶出液は、１フラクショ
ン５滴ずつ分画した。■ Apply to Sephadex G-100 column and
Elution was done with -100 buffer. The eluate was fractionated into 5 drops per fraction.

■　各フラクションをチェレンコフカウントで測定し、
放射活性のピーク部分を集めた。この液２μｍを１０ｄ
のＡＣ８ＩＩに混ぜ、放射活性を測定し、残りの液に５
μ９のｔＲＮＡ、１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝
液を添加し、エタノール沈澱を行った。■ Measure each fraction by Cerenkov count,
The peak portion of radioactivity was collected. 10d of 2μm of this liquid
of AC8II, measure the radioactivity, and add 5% to the remaining solution.
μ9 tRNA and 1/10 volume of 3M sodium acetate buffer were added, and ethanol precipitation was performed.

［株］　遠心（１５，ＯＯＯｒｐｍ　、１０分）にて沈
澱を集め、これを減圧下で乾燥し、ｄｓｃＤＮＡを得た
。[Co., Ltd.] The precipitate was collected by centrifugation (15,000 rpm, 10 minutes) and dried under reduced pressure to obtain dscDNA.

ｄｓｃＤＮＡの収量は、５．３μ９であった。The yield of dscDNA was 5.3 μ9.

以下逆転写酵素を用いた二本鎖目ＤＮＡの合成延長を行
った。The second strand DNA was synthesized and elongated using reverse transcriptase.

（４）逆転写酵素を用いた二本鎖目ＤＮＡの合成延長 ■　得られたｄｓｃＤＮＡを２０μｍの水に溶かし、更
に表３の反応混合液３０μ９を加え、両者を混合した。(4) Extension of synthesis of double-stranded DNA using reverse transcriptase ■ The obtained dscDNA was dissolved in 20 μm of water, 30 μm of the reaction mixture shown in Table 3 was added, and both were mixed.

（以下余白） 表　　　　３ ■　この混合液を４２℃で６０分間インキュベートした
。(Margin below) Table 3 ■ This mixture was incubated at 42°C for 60 minutes.

■　０．２８　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）溶液を５μρ
加え、反応を終了させた。■ 5 μρ of 0.28 EDTA (pH 8,0) solution
was added to terminate the reaction.

■　等信（５５μｇ）のフェノール／クロロホルム溶液
を加え、除蛋白を行った。■ A phenol/chloroform solution of Toshin (55 μg) was added to remove protein.

■　これ以後ポリメラーゼ■を用いたｄｓＣＤ　Ｎ　Ａ
の合成と同様〔（３）の■〜［相］〕の操作を行い、次
の５ｈｅｎｋ、　Ｔ、　Ｅ、等に準じたＳ１ヌクレアー
ゼによる一本鎖ＤＮＡ部分の消化処理（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　７２゜９
８９　（１９７５）参照）へと進んだ。■ From now on, dsCD N A using polymerase ■
Perform the same operations as in the synthesis of [(3) ■ to [phase]], and digest the single-stranded DNA portion with S1 nuclease according to the following 5henk, T, E, etc. (Proc, N
atl, ^cad, Sci, USA, 72°9
89 (1975)).

（５）８１ヌクレアーゼによる一本鎖ＤＮＡ部分の消化 ■　ｄｓｃＤＮＡを１００μρの８１ヌクレアーゼ用緩
衝液（０，３Ｍ　　Ｎａ　ＣｆＪ、　３０ｍＭ酢酸ナト
リウム（ｐｔ１４．５）、３ｍＨ２ｎＣＪ１２）に懸濁
し、３７℃、３０分間の保温にて完全にｄｓ　ＣＤＮＡ
を溶かした後、０．５ユニツトの８１ヌクレアーゼ（Ｐ
Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１社製）を添加した。(5) Digestion of single-stranded DNA by 81 nuclease ■ Suspend dscDNA in 100μρ of 81 nuclease buffer (0.3M NaCfJ, 30mM sodium acetate (pt14.5), 3mH2nCJ12) and incubate at 37°C for 30 minutes. ds cDNA is completely converted by keeping it warm.
After dissolving 0.5 units of 81 nuclease (P
L Biochemica 1) was added.

■　３７℃、３０分間の反応後、さらに２ユニツトの８
１ヌクレアーゼを加え、さらに１５分間反応さけた。■ After 30 minutes of reaction at 37°C, two more units of 8
1 nuclease was added and the reaction was allowed to proceed for an additional 15 minutes.

■　０．２８　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）溶液を２０μｐ
加え反応を停止し、さらに１２０μｍのフェノール／ク
ロロホルム溶液を加え、除蛋白を行った。■ 20 μp of 0.28 EDTA (pH 8,0) solution
The reaction was stopped, and a 120 μm phenol/chloroform solution was further added to remove protein.

■　フェノール層をＴＥｕｉ液を用い再抽出した後、両
者の水層を混合し、エタノール沈澱を行い、ｄｓＣＤＮ
Ａを得た。■ After re-extracting the phenol layer using TEui solution, both aqueous layers were mixed, ethanol precipitation was performed, and dsCDN
I got an A.

（６）　ｄｓ　ｃＤ　Ｎ　Ａのシヨ糖密度勾配遠心処理
得られたｄｓｃＤＮＡを次いでショ糖密度勾配遠心（３
８，００Ｏｒｐｍ　、　４℃）にかけて分子堡の大きな
両分だけを集めた。第２図にウロキナーゼｄｓ　ｃＤＮ
Ａ　（（図中６−＠Ｔ−表示した）の超遠心沈降パター
ンを示した。同時にマーカーとして、グロビンｄｓｃＤ
ＮＡ（図中ムームで表示した）の沈降パターンも示した
。フラクション６〜１５の大きなＣＤＮＡ画分を集め、
これをラージｄｓ　ｃＤＮＡとした。このラージｄｓｃ
ＤＮ／Ｍ２には７２２ｎｇであった。(6) Sucrose density gradient centrifugation of ds cDNA The obtained dscDNA was then subjected to sucrose density gradient centrifugation (3
Only the large portions of the molecular barrier were collected at 8,000 rpm and 4°C. Figure 2 shows urokinase ds cDNA.
It shows the ultracentrifugal sedimentation pattern of A ((indicated as 6-@T- in the figure). At the same time, as a marker, globin dscD
The sedimentation pattern of NA (indicated by muum in the figure) is also shown. Collect large CDNA fractions from fractions 6 to 15,
This was designated as large ds cDNA. This large dsc
DN/M2 had 722 ng.

（７）　ｄｓ　ｃＤ　Ｎ八へのポリ（Ｃ）ティルの付加
ウロキナーゼｄｓｃＤＮＡの大きさは平均１，５００ｂ
ｐｒあると想定し、Ｎｅ１ｓｏｎ　ａｎｄ　Ｂｒｕｔｌ
ａｇ（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、旦４１
−５０．１９７９）の方法に準じてＣ−テイル反応を行
った。Ｃ−ティル反応は、ｄｓＣＤＮＡの３′ＯＨ末端
に、１５〜２０個のポリ（ｃ）テイルが付加されるのが
理想である。水油穴では、５ユニツトのターミナルトラ
ンスフェラーゼを用い、３７℃にて反応を行った。その
結果、約２０個のＣ−テイルが付加した。(7) Addition of poly(C)til to ds cD N8 The average size of urokinase dscDNA is 1,500 b
Assuming that there is pr, Ne1son and Brutl
ag(Methods in Enzymol,, Dan 41
-50.1979), the C-tail reaction was performed. Ideally, the C-til reaction adds 15 to 20 poly(c) tails to the 3'OH end of dsCDNA. In the water/oil hole, reaction was carried out at 37°C using 5 units of terminal transferase. As a result, about 20 C-tails were added.

別に調製した大腸菌プラスミドｌ）Ｂ　Ｒ３２２のＰｓ
ｔＩ部位に同様に約１５個のポリ（Ｇ）ティルを付加し
た。さらにこれら両者を等モル混合し、高いイオン強度
下で７０℃から３７℃へ緩やかな冷却によりアニーリン
グを行った。Separately prepared E. coli plasmid l) B R322 Ps
Approximately 15 poly(G) tills were similarly added to the tI site. Furthermore, both of these were mixed in equimolar amounts and annealed by slow cooling from 70° C. to 37° C. under high ionic strength.

（８）トランスフォーメーション アニーリングしたＤＮＡをＬｅｄｅｒｂｅｎｇ　ａｎｄ
Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｒｉｏｌ、　１１９．１
０７２〜１０７４　（１９７４）の方法に準じて大腸菌
ＲＲＩ株に導入しトランスフオーメーションを行い、約
７０．０００個のテトラサイクリン耐性株が得られた。(8) Transformation annealed DNA was subjected to Lederbeng and
Cohen, J. Bactriol, 119.1
According to the method of 072-1074 (1974), it was introduced into E. coli RRI strain and transformed, and about 70,000 tetracycline-resistant strains were obtained.

得られたトランスフォーマントのアンピシリン感受性を
レプリカ法で調べた。その結果、全トランスフォーマン
トの９０％以上、約６０，０００コロニーが、ｃＤＮＡ
が挿入されたと考えられるＡＩ）、ＴＣを示した。The sensitivity of the obtained transformant to ampicillin was examined using the replica method. As a result, more than 90% of all transformants, approximately 60,000 colonies, had cDNA
AI), which is thought to have been inserted, showed TC.

（９）ウロキナーゼ遺伝子のクローニングウロキナーゼ
ｃＤ　Ｎ　Ａをり色−ニングするため、公知の床高分子
量型ウロキナーゼのアミノ酸配列（ＧＩＪｎＺｌ（！ｒ
　ｅｔ　ａｌ、、　　ＨＯＤＤｅ　ｓｅｙ＋ｅｒ’ｓ　
Ｚ　Ｐｈｌ／ＳｉＯＩＣｈｅｍ、　　３６３．　１１５
６〜１１６５　（１９８２）、　５ｔｅｆｆｅｕｓ　ｅ
ｔａｌ、　　Ｈｏｐｐｅ　５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　　
Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　　３６３゜１０４３−１
０５８．１９８２）に基づいてオリゴデオキシリボヌク
レオチドを合成し、これをハイブリダイゼーションプロ
ーブとしてトランスフォーマントのスクリーニングを行
った。(9) Cloning of urokinase gene In order to colorize the urokinase cDNA, the amino acid sequence of the known high molecular weight urokinase (GIJnZl(!r
et al,, HODDe sey+er's
Z Phl/SiOIChem, 363. 115
6-1165 (1982), 5teffeus e
tal, Hoppe 5eyler's Z,
Physiol Chem, 363°1043-1
058.1982) and used this as a hybridization probe to screen for transformants.

■　合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブ プローブとして用いた１４−塩基の合成オリゴデオキシ
リボヌクレオチド混合物（以下プローブと呼ぶ）は、日
本ゼオン社より購入した。(2) Synthetic oligodeoxyribonucleotide probe The 14-base synthetic oligodeoxyribonucleotide mixture used as the probe (hereinafter referred to as probe) was purchased from Nippon Zeon Co., Ltd.

表４は、用いたプローブの塩基配列とこれに対応するウ
ロキナーゼのアミノ酸配列を示している。Table 4 shows the base sequence of the probe used and the corresponding amino acid sequence of urokinase.

用いたプローブは人尿高分子量型ウロキナーゼＢ鎖のア
ミノＭ７３〜７７に対応する。又、表４から明らかな様
にプローブは８種のオリゴヌクレオチドの混合物である
。The probe used corresponds to amino acids M73-77 of human urine high molecular weight urokinase B chain. Furthermore, as is clear from Table 4, the probe is a mixture of eight types of oligonucleotides.

（以下余白） 表　　　４ ヒトウロキナーゼｃＤＮＡの単離用の プローブ アミノ酸　　　　７３　７４　７５　７６　７７配　　
列　　　　　ＮＨ２−Ｇｌｕ　　−Ｎｅｔ　　−Ｌｙｓ
　　−Ｐｈｅ　　−Ｇｌｕ　−Ｃ００ＩＩ ＧＡＡ　−３’ ４−ｍａｒ 混合物　　　３’　　−ＣＴ’　−ＴＡＣづ■１−＾Ａ
６−ＯＣＡ ＣＴ−５’ （注）中段にはアミノ酸配列に対応するｍＲＮＡの可能
な全配列を示す。下段は、このｆｆ１ＲＮ　Ａに相補的
なプローブＤＮＡの塩基配列を示す。(Left below) Table 4 Probe amino acids for isolation of human urokinase cDNA 73 74 75 76 77 sequences
Column NH2-Glu -Net -Lys
-Phe -Glu -C00II GAA -3' 4-mar mixture 3'-CT' -TACzu■1-^A
6-OCA CT-5' (Note) The middle row shows all possible sequences of mRNA corresponding to the amino acid sequence. The lower row shows the base sequence of probe DNA complementary to this ff1RNA.

なお、プローブのアミノ１１７７　（Ｇ　Ｉｕ）コドン
のうち、第三塩基はプローブＤＮＡに含まれていない。Note that the third base of the amino 1177 (G Iu) codon of the probe is not included in the probe DNA.

■　５′末端を３２ｐでラベルしたプローブの調製ω　
プローブ５′−末端の３２Ｐラベルプローブは５’　−
ＯＨとして合成されているので〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰ（
アマ−ジャム、ＰＢ１０２１８）と、Ｔ４−ポリヌクレ
オチドキナーゼとで５′末端を３２ｐでラベルした。■ Preparation of probe with 5' end labeled with 32pω
The 32P-labeled probe at the 5'-end of the probe is 5'-
Since it is synthesized as OH, [γ-32P)ATP(
The 5' end was labeled with 32p using Amarjam, PB10218) and T4-polynucleotide kinase.

ラベル条件は、　Ｐ−ＡＴＰと５′　−ＯＨ末端のモル
比を５：１として以下の様な反応系で行った。The labeling conditions were such that the molar ratio of P-ATP and 5'-OH end was 5:1, and the following reaction system was used.

反応液 プローブＤＮＡ　　　６〜８０ｐｍｏ１５’　　−０ｆ
ｆ末端※１１０×キナーゼ緩衝液　　　　　　　　２μ
ｐＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ　　１μｍ※２（７
−３２Ｐ）ＡＴＰ　　５’　　ＯＨ末Ｇ１１ｆ（７）５
ＸＩＩＩＯ＋ Ｈ２Ｏ総量２０μｐとする量 反応は３７℃で６０〜１２０分間行う。反応終了後、１
μρの０．５ＨＥＤＴＡ溶液（１）［８，０）、３５μ
ρの１Ｍ塩化ナトリウム（１０ｍＨトリスー）Ｉ　ＣＪ
Ｉ　、ｐｌ＋７．２．１　ｍＨＥＤＴＡ溶液中）および
１０．５μｊｌの１　ｒＩｔｇ／ｄｔＲＮ　Ａ溶液を加
えて終量３５μｍとし、７０℃、３分間の熱処理でポリ
ヌクレオチドキナーゼを失活させて反応を終了させた。Reaction liquid probe DNA 6-80pmo15'-0f
f-terminus*110x kinase buffer 2μ
pT4-polynucleotide kinase 1 μm *2 (7
-32P) ATP 5' OH terminal G11f(7)5
The reaction is carried out at 37° C. for 60 to 120 minutes in a total amount of XIIIO+H2O of 20 μp. After the reaction is complete, 1
μρ 0.5HEDTA solution (1) [8,0), 35μ
ρ of 1M Sodium Chloride (10mH Tris) I CJ
I, pl+7.2.1 mHEDTA solution) and 10.5 μjl of 1 rItg/dtRNA solution were added to make a final volume of 35 μm, and the reaction was terminated by heat treatment at 70°C for 3 minutes to inactivate the polynucleotide kinase. Ta.

（０）　　３２Ｐ−ラベル化プローブの精製０項で調製
した反応混合物をＮＡＣ３−５２のミニ−カラム（ＢＲ
Ｌ）にかけて、３２Ｐ−ラベル化プローブを精製した。(0) Purification of 32P-labeled probe The reaction mixture prepared in Section 0 was purified using a NAC3-52 mini-column (BR
L) to purify the 32P-labeled probe.

この様にして精製したプローブＤＮＡの比活性は約１．
Ｏｘ　１０９ｃｐＨ／μｇＤＮＡである。The specific activity of the probe DNA purified in this way is approximately 1.
Ox 109 cpH/μg DNA.

■　コロニーハイブリダイゼーション 前記作成したプローブを用い、Ｈａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ
ａｌ、　Ｈｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。■ Colony hybridization Using the probe prepared above, Haniatis et al.
al, Holecular cloning, A
Laboratory Manual.

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、　１９８２の方法に準じてコロニーハイブ
リダイゼーションを行い、ウロキナーゼＣＤＮＡのスク
リーニングを行った。Co1d Spring 1larbor Labor
Colony hybridization was performed according to the method of J. Atory, 1982, and urokinase CDNA was screened.

前記的７０，０００個のトランスフォーマントのうち約
１０．０００個について、〔γ−３２Ｐ〕でラベルした
合成プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーション
を行った結果、比較的強くハイブリダイズしていると思
われる６５コロニーを選出した。これらの６５コロニー
をフィルターに再度固定し、同一のプローブを用いて再
スクリーニングを行った結果、４つのコロニーがプロー
ブＤＮＡと極めて強くハイブリダイズした。この様にし
て選出された４コロニーにライて、Ｂｉｒｎｂｏｉｍと
Ｄｏｌｙの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｃｓ、
、ヱ、　１５１３．１９７９）に準じてプラスミドＤＮ
Ａ　（各々をｐＵＫｌ、２．３及び４と命名）を調製し
、ＣＤＮＡの大きさを判定した。ｐＵ　Ｋ　１は４コロ
ニー中最大のｃＤＮＡを有し、約１，９００ｂ１１であ
った。１）ＵＫ３及び４はこれより小さく、それぞれ約
１　、３００ｂｐと約１，１５０ｂｐであった。又、ｐ
Ｕ　Ｋ　２は最小のｃＤ　Ｎ　Ａで約１７０ｂｐであっ
た。About 10,000 of the 70,000 target transformants were subjected to colony hybridization using a synthetic probe labeled with [γ-32P], and as a result, it appears that they hybridized relatively strongly. Sixty-five colonies were selected. These 65 colonies were fixed on the filter again and rescreened using the same probe. As a result, 4 colonies hybridized extremely strongly with the probe DNA. Based on the four colonies selected in this way, Birnboim and Doly's method (Nucleic Ac1d Rcs,
, E, 1513.1979).
A (designated pUKl, 2.3 and 4, respectively) were prepared and the size of the cDNA was determined. pU K 1 had the largest cDNA among the four colonies, approximately 1,900 b11. 1) UK3 and 4 were smaller, about 1,300 bp and about 1,150 bp, respectively. Also, p
U K 2 was the smallest cDNA, approximately 170 bp.

（１０）制限酵素地図の作成 前項で選択した４個のコロニーが保持する各プラスミド
のうち、ＣＤＮＡの大きなｐｌＪ　Ｋ　１　。(10) Creation of restriction enzyme map Among the plasmids carried by the four colonies selected in the previous section, plJ K 1 has the largest CDNA.

ｐＵ　Ｋ　３及びｐＵ　Ｋ　４の３つのプラスミドＤＮ
Ａに含まれるｃＤＮＡの制限酵素地図を作成し比較検討
した。Three plasmid DNAs pU K 3 and pU K 4
A restriction enzyme map of the cDNA contained in A was created and compared.

使用した制限酵素は、ＡｃｃＩ　、　Ａ　ＩｕＩ　、　
ＡｖａＩ　。The restriction enzymes used were AccI, AIuI,
AvaI.

ＡｖａＩ［、ＢａｍＨｌ、　Ｂｃｌｌ、　Ｂ（ＩＩｌ、
　Ｂ（ＩＩＩＩ。AvaI[, BamHl, Bcll, B(IIl,
B(III.

ＢｓｔＥＩ［、Ｃ１ａ１．ＥｃｏＲＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ。BstEI[, C1a1. EcoRI, Fnu4HI.

ＨａｅＩ［［、Ｈｉｎｃ　Ｉ［、Ｈｉｎｄ　Ｉ［［、Ｋ
ｐｎｌ、　ＮｃｏＩ。HaeI[[, Hinc I[, Hind I[[, K
pnl, NcoI.

ＭｌｕＩ、Ｐｓｔｌ、Ｐｖｕｎ、ＲｓａＩ、５ａｃＩ。MluI, Pstl, Pvun, RsaI, 5acI.

５ａｌＩ、５ａｕ９６Ｉ、５ｃａＩ、Ｓｍａｌ、５ｔｕ
Ｉ。5alI, 5au96I, 5caI, Small, 5tu
I.

Ｘｂａｌ、ＸｈｏＩであり、反応時に使用した各制限酵
素の緩衝液を表５に示した。The restriction enzymes were Xbal and XhoI, and the buffer solutions of each restriction enzyme used during the reaction are shown in Table 5.

なお、ＡｖａＩはＲｓａ工緩画液、ＳａＣ■はＫｐｎ緩
衝液、５ｔｕＩ、Ｓａｔ及びＸｈｏＩはＢａｍＨＴ緩函
液、ＮＣ０Ｉ及び５ＣａＩはＢ（ＩＩＩ緩衝液、そして
ＭｌｕＩはｌ−１ｉｎｄｌｌＩ緩衝液を使用した。Note that Rsa buffer solution was used for AvaI, Kpn buffer solution was used for SaC, BamHT buffer solution was used for 5tuI, Sat, and XhoI, B (III buffer solution was used for NC0I and 5CaI, and l-1indllI buffer solution was used for MluI.

（以下余白） 表　　　５ まず、各プラスミドを種々の制限酵素で切り、次に各制
限酵素部位の距離を求めた。各プラスミドをＥＣ０ＲＩ
で切断すると、ｐＵＫｌとｐＵ　Ｋ　４では全く同じ大
きさの断片（４２０ｂｐ）が見られ、またＢａｍ１−Ｉ
ＩとＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩとｐＳｔＩの２重消化を
行うと、ｐ　ＵＫｌとｐＵ　Ｋ　３に全く同じ大きさの
断片が見られた。そこでｐＵＫｌとｐＵ　Ｋ　４におい
てはＥｃｏＲＩ部位を重ねて、またｐＵ　Ｋ　１とｐＵ
　Ｋ　３においてはＢａｌｌｌＨＩ部位を基準にとって
、伯の制限酵素部位を調べていくと、ｐＵ　Ｋ　１とｐ
ＵＫ３及びｐすに４のｃＤＮＡ上の制限酵素部位の位置
が一致した（第３図）。(Margin below) Table 5 First, each plasmid was cut with various restriction enzymes, and then the distance between each restriction enzyme site was determined. EC0RI each plasmid
When pUKl and pUK4 were cut with
When double digestion was performed with I and EcoRI and BamHI and pStI, fragments of exactly the same size were found in pUKl and pUK3. Therefore, in pUKl and pU K 4, the EcoRI site overlaps, and in pU K 1 and pU
In K3, when we examine the restriction enzyme site of Ball using the BallHI site as a standard, we find that pU K1 and p
The positions of the restriction enzyme sites on the UK3 and psuni4 cDNAs matched (Figure 3).

これらの結果から、Ｉ）ＵＫｌ、０ＵＫ３及びｐＵ　Ｋ
　４に挿入されているｃＤＮＡは制限酵素地図からみて
同一のものであると考えられる。そこで１）ＵＫｌおよ
びｐＵ　Ｋ　４の一部のＤＮＡ塩基配列を決定し、アミ
ノ酸配列を検討した。その結果、その配列は公知の床高
分子量型ウロキナーゼのアミノ酸配列と一致した。From these results, I) UKl, 0UK3 and pU K
The cDNA inserted in No. 4 is considered to be the same cDNA as seen from the restriction enzyme map. Therefore, 1) the DNA base sequences of UKl and pU K4 were determined, and the amino acid sequences were examined. As a result, the sequence was consistent with the amino acid sequence of a known high-molecular-weight urokinase.

（１１）ウロキナーゼｃＤ　Ｎ　Ａの塩基配列の決定前
項によってプラスミドがウロキナーゼＣＤＮＡを含むこ
とが確認できたので、次にＨａｘａｎ＋　−Ｇｉｌｂｅ
ｒｔ　　（Ｖクサムーギルバート）法（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５６０
〜．１９７７）を用いてＣＤＮＡ塩基配列及びアミノ酸
配列を決定した（配列工）。得られたＣＤ　Ｎ　Ａ塩基
配列から考えられる可能なアミノ酸配列を既知の人尿ウ
ロキナーゼのアミノ酸配列と比較した結果、次項で詳細
に記述する様にこれらのＣＤ　Ｎ　Ａが２０アミノ酸か
ら成るシグナルペプチドを含む総計４３１個のアミノ酸
から成るｐｒｅｐｒｏ−ウロキナーゼをコードする、ｃ
ＤＮＡであることが明らかとなった。(11) Determination of base sequence of urokinase cDNA Since we have confirmed that the plasmid contains urokinase cDNA in the previous section, we next determined the base sequence of Haxan+-Gilbe.
rt (V Kusamu Gilbert) method (Proc, N
atl, Acad, Sci, USA 74.560
~． The CDNA base sequence and amino acid sequence were determined using (Sequence Engineering) (1977). As a result of comparing the possible amino acid sequences considered from the obtained CD N A base sequences with the known amino acid sequence of human urine urokinase, we found that these C N A's contain a signal peptide consisting of 20 amino acids, as described in detail in the next section. c encoding prepro-urokinase consisting of a total of 431 amino acids including
It turned out to be DNA.

（１２）ウロキナーゼのアミノ酸配列 （ａ）　　ｃＤ　Ｎ　Ａが真にウロキナーゼｃＤＮＡで
あるか否かの判定は、得られた塩基配列からアミノ酸配
列を求めて（配列■）、これを既知の人尿ウロキナーゼ
のアミノ酸配列と照合することで行った。(12) Amino acid sequence of urokinase (a) To determine whether cDNA is truly urokinase cDNA, determine the amino acid sequence from the obtained base sequence (sequence ■), and compare this with known human urine urokinase. This was done by comparing the amino acid sequence of

下記配列（Ｉｒ）は人尿高分子量型ウロキナーゼの八−
及びＢ−鎖の全アミノ酸配列を示している。The following sequence (Ir) is a human urine high molecular weight urokinase.
and the complete amino acid sequence of the B-chain.

海　工　勇　へ湧　寸至　ｊと　φ己　曲と　凶Ｅ＋ｌ
？ｃ−１＋　へら　！弓　Φロ　　Ｑω　０の一部　　
−−＜〉−一一一 シーフェンシングによって得られたｃＤ　Ｎ　Ａ塩基配
列を人尿ウロキナーゼのアミノ酸配列〔配列（■）〕と
比較した結果、ｐＬＩＫｌ及び４はいずれもウロキナー
ゼ前駆体ｃＤＮ△の一部を含んでいることが明らかとな
った。Sea craftsman Yu to spring to the end J and φself song and evil E + l
? c-1+ spatula! Bow Φro Qω Part of 0
--<>- As a result of comparing the cDNA base sequence obtained by 111 sea fencing with the amino acid sequence [sequence (■)] of human urine urokinase, it was found that both pLIKl and 4 are part of the urokinase precursor cDNΔ. It has become clear that it includes parts.

下記配列（Ｉ［ｌ）は、個々のフラグメントのシーフェ
ンシングの結果に基づいて作製したウロキナーゼアミノ
酸配列をコードするｃＤＮ△の５′−末端から３′−ノ
ンコーディング　リージョンまでの全塩基配列を示して
いる。The sequence (I[l) below shows the entire base sequence from the 5'-end to the 3'-non-coding region of cDNΔ encoding the urokinase amino acid sequence, which was created based on the results of sea fencing of individual fragments. There is.

（以下余白） （ｂ）以下本発明によって得られたウロキナーゼアミノ
酸配列をコードするｃＤ　Ｎ　Ａの構造について述べる
。(Blank below) (b) The structure of the cDNA encoding the urokinase amino acid sequence obtained by the present invention will be described below.

（イ）　５′−ノンコーディング　リージョンとシグナ
ルシーフェンス 配列（Ｉ＞及び（１）から明らかなように、蛋白合成の
開始］トンであるＡＴＧ（Ｍｅｔ）の上流には、少なく
とも７９ｂａｓｅｓから成る５′−ノンコーディング　
リージョンがある。又、Ｍｅｔ（ＡＴＧ）から始まる最
初の２０アミノ酸は、人尿ウロキナーゼのアミノ酸配列
〔配列（■）〕には見られないことから、ウロキナーゼ
分子の細胞外への分泌に必要なシグナルペプチドである
と判明した。(b) 5'-non-coding region and signal sequence (as is clear from I> and (1), protein synthesis initiation] upstream of ATG (Met), a 5'-non-coding region and signal sequence consisting of at least 79 bases. −Non-coding
There is a region. Furthermore, since the first 20 amino acids starting with Met (ATG) are not found in the amino acid sequence of human urine urokinase [sequence (■)], it is believed that this is a signal peptide necessary for the secretion of the urokinase molecule to the outside of the cell. found.

更に、２１番目のアミノ酸、Ｓｅｒに始まるアミノ酸配
列は、人尿ウロキナーゼの八−鎖のアミノ酸配列に一致
した。Furthermore, the amino acid sequence starting from the 21st amino acid, Ser, matched the amino acid sequence of the 8-chain of human urine urokinase.

このことから、今回得られたｃＤＮ△は、２０アミノ酸
から成るシグナルペプチドを有するウロキナーゼ前駆体
（ｐｒｅｐｒＱ−ｔｌｒｏｋ　ｉ　ｎａｓｅ、以下ｐｒ
ｅ　−ＵＫと略す）をコードするＣＤＮＡ　（ｐｒｅ　
−ＬＪＫＣＤ　Ｎ　Ａ　）であることが明らかである。From this, the cDNΔ obtained this time is a urokinase precursor (preprQ-tlrokinase, hereinafter referred to as prprQ-tlrokinase) having a signal peptide consisting of 20 amino acids.
CDNA (abbreviated as e-UK) encoding (pre
-LJKCDNA).

（ロ）ウロキナーゼ前駆体の開裂部位 人尿つ０キナーゼは、Ａ−及びＢ−鎖の二本鎖であるが
、これは当初ｐｒｏ−ＬＩＫとして合成されたつＯキナ
ーゼ前駆体分子が細胞外へ分泌された後、プロテアーゼ
などの作用によって２次的に二本鎖へ開裂するものと考
えられる。ｐＵ　Ｋ　１のＣＤＮＡのシーフェンシング
によりこのことが確かめられた。(b) Cleavage site of urokinase precursor Human urokinase is a double-stranded A- and B-chain, and this is because the urokinase precursor molecule, which was originally synthesized as pro-LIK, is secreted outside the cell. After that, it is thought to be secondarily cleaved into double strands by the action of protease or the like. This was confirmed by sea fencing of the pU K1 cDNA.

配列（ｎ）において、人尿ウロキナーゼのＡ鎖のカルボ
キシル末端のアミノ酸配列（配列（ＩＩ）の１５７番目
のアミノ酸であるｐＨｅ）に続いてＬＶＳが存在し、更
にＢ−鎖のアミノ末端である１１〇−Ｉ　ｌｅ−Ｇ　ｌ
ｙ−Ｇ　Ｉｙ−・・・のアミノ酸配列が認められる。In sequence (n), there is an amino acid sequence at the carboxyl terminal of the A chain of human urine urokinase (pHe, which is the 157th amino acid in sequence (II)), followed by LVS, and 11 at the amino terminal of the B chain. 〇-I le-G l
The amino acid sequence of y-G Iy-... is recognized.

このことは、人尿ウロキナーゼが当初はしｙｓを介して
八−及びＢ−鎖の結合した一重鎖ウロキナーゼ（ｓｉｎ
ｇｌｅ−ｃｈａｉｎ　ｐｒｏ−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）と
して合成され、Ａｒｇ−ｐｈｅ−しｙｓ−１ｌｅ−１ｌ
ｅ部で開裂すること、開裂に際してＬｙｓは欠失するこ
とを示している。This suggests that human urine urokinase was originally a single-chain urokinase (sin) with eight- and B-chains linked via the ys.
gle-chain pro-Urokinase), Arg-phe-ys-1le-1l
This shows that it is cleaved at the e portion and that Lys is deleted upon cleavage.

Ｑ９　　カルボキシル末端とＣＤＮＡの３′−ノンコー
ディング　リージョン 配列（Ｉ）及び（Ｉｌｌ）には本発明より得たＣＤＮＡ
の５′−ノンコーディング　リージョン、コーディング
　リージョン及び３′−ノンコーディング　リージョン
の一部を示している。配列（Ｉ）及び（ＩＩＩ）に示す
ように、この塩基配列ではＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａ−
Ｌ　ｅｕといった人尿高分子固型ウロキナーゼＢ−鎖の
カルボキシル末端に一致するアミノ酸配列が読み取られ
、その下流に蛋白合成終止コドンであるＴＧＡが存在す
る。従って、人尿高分子母型ウロキナーゼのカルボキシ
ル末端と本発明によって得られたそれは同一で、プロセ
シングにより欠失されるようなポリペプチドは存在しな
いと考えられた。Q9 The carboxyl terminus and 3'-non-coding region sequences (I) and (Ill) of the CDNA contain the CDNA obtained from the present invention.
The 5'-non-coding region, the coding region and part of the 3'-non-coding region are shown. As shown in sequences (I) and (III), this base sequence has Gly-Leu-A Ia-
An amino acid sequence corresponding to the carboxyl terminus of a human urine polymeric solid urokinase B-chain such as Leu was read, and TGA, a protein synthesis stop codon, is located downstream thereof. Therefore, it was considered that the carboxyl terminus of human urine macromolecular parent urokinase and that obtained by the present invention are the same, and that there is no polypeptide that would be deleted during processing.

一方、３′−ノンコーディング　リージョンは制限酵素
地図から考えて、長大と思われる３′−ノンコーディン
グ　リージョンについてはそのごく一部しかシーフェン
シングを行っていないが、現在得られている３′−ノン
コーディング　リージョンは約８５０ｂｐである。しか
し、この中には真核生物のｍＲＮＡの３′−末端に特徴
的なｐｏｌｙ（八）配列が含まれていないことから、３
′−ノンコーディング　リージ゛ヨンはもっと長大であ
ると考えられる。On the other hand, the 3'-non-coding region is considered to be long based on the restriction enzyme map, but sea-fencing has only been performed on a small portion of the 3'-non-coding region. The coding region is approximately 850 bp. However, since this does not contain the characteristic poly(8) sequence at the 3'-end of eukaryotic mRNA,
′-Non-coding regions are considered to be much longer.

（１３）ウロキナーゼ全コーディング　リージョンを含
むプラスミドの作成 １）Ｕ　Ｋ　１およびｐＵ　Ｋ　４を制限酵素ト１ｉｎ
ｄｌ。(13) Construction of a plasmid containing the entire urokinase coding region 1) Digest U K 1 and pU K 4 with restriction enzymes.
dl.

ＢｇｌＩＩで消化した。）（ｉｎｄｌＩＩ及びＢｏｌＩ
Ｉによる消化は３７℃、１〜２時間行った。ｐＵＫｌが
らは約５．３ｋｂの断片を単離し、一方、ｐＵ　Ｋ　４
がらは約１．２ｋｂの断片を！１１Ｉ！ｔシた。次に７
４−ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（６６ＩＩＩＨトリス−
ＨＣＮ　　ｐＬｌ７．６．６６１１１８　　Ｍ（］　Ｃ
ｊ　２　、１０ｍＨジチオスレイトー）Ｌｔ、０．５ｍ
ＨＡＴＰ）と１０ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ中で
前記の断片を２０℃で２時間反応させＩｉｇａｔｉｏｎ
シた。以上の工程は第４図に示した。第４図に於いて、
ＥはＥＣ０ＲＩを、Ｈは）ｌｉｎｄＩ［Ｉを、Ｂは３μ
ｍＨＩを表す。Digested with BglII. ) (indlII and BolI
Digestion with I was carried out at 37°C for 1-2 hours. A fragment of approximately 5.3 kb was isolated from pUKl, whereas pUK4
It's a fragment of about 1.2kb! 11I! It was. Next 7
4-DNA ligase reaction buffer (66IIIH Tris-
HCN pLl7.6.661118 M(]C
j 2 , 10 mH dithiothreitol) Lt, 0.5 m
HATP) and 10 units of T4-DNA ligase at 20°C for 2 hours.
Shita. The above steps are shown in FIG. In Figure 4,
E is EC0RI, H is)lindI[I, B is 3μ
Represents mHI.

（１４）ヒト腎由来株化ｍ胞におけるウロキナーゼの産
生 （ａ）細胞における発現用ベクターの作製原料プラスミ
ドとして、Ｏｋａｙａｍａ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ（Ｈｏｌ
ｅｃ、　ａｎｄ　ｃｅｌｌ、　Ｒｉａｌ、、　３．２８
０−２８９　（１９８３））によって創作されたｐｃＤ
Ｖｌ及びｐＬｌ（第５図）を用いて、ｐｓＶ−Ｇｌ（第
６図）を作成した。(14) Production of urokinase in human kidney-derived cell line (a) Production of expression vector in cells As a raw material plasmid, Okayama and Berg (Hol.
ec, and cell, Rial, 3.28
0-289 (1983))
psV-Gl (Fig. 6) was created using Vl and pLl (Fig. 5).

ｐｃＤ　Ｖ　１とｐＬ”Ｎ、ｔ、ｆｌＢＲ３２２ＤＮＡ
と５Ｖ４０ＤＮＡとのハイブリッドプラスミドであり、
ＰＬ、　Ｂｉｏｃｈｅｎｉｃａｌｓ　（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）社より入手した。pcD V 1 and pL”N, t, flBR322DNA
It is a hybrid plasmid of and 5V40 DNA,
PL, Biochemicals (Pharmac
Obtained from ia) company.

これらプラスミドへのウロキナーゼをコードするｃＤ　
Ｎ　Ａの挿入を容易にするため、ｐｃＤＶｌの）−１ｉ
ｎｄ　ＩＩＩ−ＫｐｎＩ部位にｐＬｌのＨｉｎｄｌＩ［
−ＰｓｔＩ断片を挿入し１）ＳＶ−Ｇ１を作製した。cD encoding urokinase to these plasmids
)-1i of pcDVl to facilitate insertion of NA
nd III-KpnI site of pLl [
-PstI fragment was inserted to create 1) SV-G1.

すなわち、１）Ｌｌ　　４μグを表５の反応条件でｐｓ
ｔＩで消化後、突出する３′−末端をＴ４−Ｄ　Ｎ　Ａ
　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで削ってｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ　
　（平滑末端）に変更した。その際の反応は反応混合液
（ｐＬ１４ｕ’ｉ、１０ｘ　Ｔ４　ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ　ｂｕｙｅｒ　８μＢ　、　２ｒｎＨｄＮＴＰｓ溶液
４．０μｍ、ｄＨ２０７６μｐ）を６５℃、３分間、加
熱後急冷した後、Ｔ４　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
４　ｕ　ｆＪ　　（１０ｔＪ　）を加え、終１ａｏμｎ
とし、３７℃で５分間反応させた。反応終了後０．２５
８　ＥＤＴ八（ｐＨ８，０）８μｍ、！ｌ：　ｄＨ２０
８０，ｃｌ　ヲ加え、７エ／−ル処理を１回行った後、
水層を回収した。エタノール沈澱で、ＤＮＡを回収し、
減圧乾燥して、ＫｐｎＩ　　ｔｉｎｋｅｒ　Ｉｉｇａｔ
ｉｏｎに供した。ｌｉｇａｔｉｏｎ反応は、反応混合液
（ｄｒｉｅｄ　ＤＮＡ４ｕ９．５′−ＰＫｐｎＩ　　ｔ
ｉｎｋｅｒ　２ｕｆＪ　　（２μｇ）　、１０ｘｌｉｇ
ａｓｅｂｕｙｅｒ　２．ＯμｆＪ　ｄＨ２０）１８］ｕ
を６５℃、３分間加熱後徐冷し、Ｔ４　ＤＮＡ　　Ｉｉ
ｇａｓｅ　２μｆＩ（５ｔＪ）を加えて、１６℃で一夜
反応させた。反応終了後ＫｐｎＩ、ついでＨｉｎｄｌ［
［による消化を行い、５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＰＡＧＥ　）にかけて約６００ｂＤのＤＮＡ４ｕ
９片を回収した。That is, 1) 4 μg of Ll was added to ps under the reaction conditions shown in Table 5.
After digestion with tI, the protruding 3'-end was converted into T4-DNA
Cut with polymerase and blunt end
(blunt end). The reaction at that time was carried out using a reaction mixture (pL14u'i, 10x T4 polymeras
After heating 8μB, 2rnHdNTPs solution 4.0μm, dH2076μp) at 65°C for 3 minutes and rapidly cooling, T4 DNA polymerase
Add 4 u fJ (10tJ) and add 1aoμn
The mixture was reacted at 37°C for 5 minutes. 0.25 after completion of reaction
8 EDT 8 (pH 8,0) 8μm,! l: dH20
After adding 80,cl and processing 7 el/- once,
The aqueous layer was collected. DNA was recovered by ethanol precipitation,
Dry under reduced pressure to obtain KpnI tinker Iigat.
ion. The ligation reaction was performed using a reaction mixture (dried DNA4u9.5′-PKpnIt
inker 2ufJ (2μg), 10xlig
asebuyer 2. OμfJ dH20)18]u
was heated at 65°C for 3 minutes, then cooled slowly, and the T4 DNA Ii
2 μfI (5 tJ) of gas was added, and the mixture was allowed to react at 16° C. overnight. After the reaction was completed, KpnI, then Hindl [
The DNA was digested with
Nine pieces were collected.

一方、ＨｉｎｄＩ［ＩとＫｐｎＩでｐｃＤＶｌを消化し
、１％Ａｇａｒｏｓｅ　ｏｅｌテ、約２．７ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片を：５！４製し、そのうち１１００ｎを前記ｐ
Ｌ１由来の約６００ｂｌ）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片とＩｉｇａ
ｔｉｏｎした。ｌｉｇａｔｉｏｎ反応は、反応混合液（
ｐＬ１断片Ｄ　Ｎ　Ａ　１５０ｎｇ、ｐｃＤＶ１断片Ｄ
ＤＮＡ１００ｎ　、１ｏｘＴ＋　ＤＮＡｌｉｇａｓｅ　
ｂｕｆｆｅｒ　１．０　ｕｆＪ　、　ｄＨ２０８μｐ）
にＴ　４−　Ｄ　Ｎ　Ａ　１ｉｏａｓｅ２　ｕｆＪ　（
５，６ＬＩ　）を加え、１６℃で−夜反応させた。反応
液の　／２量を用いて大腸菌ＨＢＩＯ１の形質転換を行
った。Meanwhile, pcDVl was digested with HindI[I and KpnI, and approximately 2.7 kbp of D
5!4 NA fragments were prepared, of which 1100n was added to the p
Approximately 600 bl) DNA fragment derived from L1 and Iiga
It was done. The ligation reaction is performed using a reaction mixture (
pL1 fragment DNA 150ng, pcDV1 fragment D
DNA100n, 1oxT+ DNA ligase
buffer 1.0ufJ, dH208μp)
to T4-DNA1ioase2ufJ (
5,6LI) was added thereto, and the mixture was reacted at 16° C. overnight. Escherichia coli HBIO1 was transformed using 1/2 volume of the reaction solution.

得られた形質転換体のうち１２コロニーを用いてプラス
ミドＤＮＡを調製し、各種制限酵素で消化して調べたと
ころ、いずれも目的のプラスミドをを含んでいる事がわ
かったので、そのうち１株からプラスミドＤＮＡを大量
調製して　ｐｓＶ−Ｇ１とし、その制限酵素地図の作製
（第６図）、ならびに５ａｌＩ−ＢｃｌＩ断片のＤＮＡ
塩基配列を求めた（下記配列（ＩＶ）参照〕。この結果
、得られたｐＳＶ−Ｇ１は、ＫｐｎＩ部位をクローニン
グ部位として上流に５Ｖ−４０ＤＮＡのｅａｒｌｙ　ｅ
ｎｈａｎｃｅｒ／　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｅｌｅｍｅｎｔ
および１ａｔｅ　５’　−ｓｐｌｉｃｉｎｇｊｕｎｃｔ
ｉｏｎが、下流には１ａｔｅ　ｐｏｌｙ（Ａ）ｓｉｇｎ
ａｌがそれぞれ配列し、初物細胞中での機能的なＩＩＩ
ＲＮ　Ａの合成に関与する諸要素が欠失なく配列されて
いると判定できた。Plasmid DNA was prepared using 12 colonies of the obtained transformants, and when examined by digestion with various restriction enzymes, it was found that all of them contained the desired plasmid. A large amount of plasmid DNA was prepared as psV-G1, and its restriction enzyme map was prepared (Fig. 6), and the DNA of the 5alI-BclI fragment was prepared.
The nucleotide sequence was determined (see sequence (IV) below). As a result, the obtained pSV-G1 had the early e of 5V-40 DNA upstream with the KpnI site as the cloning site.
nhancer/promoter element
and 1ate 5'-splicingjunct
ion, downstream is 1ate poly(A)sign
al is arranged respectively, and functional III in the primary cell.
It was determined that the various elements involved in RNA synthesis were sequenced without any deletions.

８１　　　８　　　　　　Ｓ 調　　　　　　　３　＝　　　　５　　　　　８（ｂ）
ベクターへのウロキナーゼｃＤ　Ｎ　Ａ配列の挿入 （１３）で得たｐＵ　Ｋ　３３をｐｓｔ工で部分消化し
、１．７にｂｐ断片を単離してｐｓＶ−０１に挿入した
。81 8 S key 3 = 5 8(b)
Insertion of the urokinase cDNA sequence into a vector (13) pU K 33 obtained from the procedure (13) was partially digested with pst engineering, and a 1.7 bp fragment was isolated and inserted into psV-01.

１．７Ｋｂｐ断片の単離は、反応混合液（ＩＩＵ　Ｋ　
３３１０μ９．１０Ｘ　ＰＳｔＩｂｕｒｒｅｒ　５０μ
、１１　、ＰＳｔＩ　１０μＪ）、（６０Ｕ）、ｄｌ−
１ｚｏを加えて終但５００μｍ〕を、３７℃に保ち、反
応開始後、１０分、１５分および２０分で、それぞれ約
１６０μｍサンプリングし、６５℃、５分間加熱処理後
、それぞれの、反応液を混合して、１％アガロースゲル
にて電気泳動にかけ、１．７にｂｐ断片を約１０μ３回
収した。回収された約１．７にｂｐのうち約５μ３を用
い、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ処理で切断末端をｂｌｕ
ｎｔ　ｅｎｄ　　（平滑末端）にかえ）（ｐ、ｎｌｌ１
ｎｋｅｒをｌ１ＯａｔｉＯｎした。その後Ｋｌ）ｎＩテ
消化したｐｓＶ−ＧｌとＩｉｇａｔｉｏｎして、大腸菌
Ｈ８１０１を形質転換して、ｐＳＶ−Ｇ１−ｐｒｅ　Ｕ
　Ｋ　（第７図）を得た。Isolation of the 1.7 Kbp fragment was performed using the reaction mixture (IIU K
3310μ9.10X PStIburrer 50μ
, 11, PStI 10 μJ), (60 U), dl-
1zo was added for a final time of 500 μm] and kept at 37°C. After the start of the reaction, samples of approximately 160 μm were taken at 10, 15, and 20 minutes, and after heat treatment at 65°C for 5 minutes, each reaction solution was The mixture was mixed and subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel, and about 10 μ3 of bp fragments were recovered at 1.7 bp. Using approximately 5 μ3 of the approximately 1.7 bp recovered, the cut end was treated with T4-DNA polymerase to make it blue.
nt end (blunt end)) (p, nll1
nker was turned on. After that, E. coli H8101 was transformed with psV-Gl digested with Kl)nI and transformed into pSV-G1-pre U.
K (Fig. 7) was obtained.

ｐｓ　Ｖ　−Ｇ　１−　ｐｒｅｕ　Ｋは、第８図に示す
様に、Ｓ　Ｖ　−４０のｍＲＮ　Ａ転写調節域の下流に
ｐｒｅ−ＵＫｃ　ＤＮＡの５’　−ｎｏｎ　ｃｏｄｉｒ
＋ｇｒｅｇｉｏｎ。As shown in Fig. 8, ps V-G1-preu K has the 5'-non codir of pre-UKc DNA located downstream of the mRNA transcription regulatory region of SV-40.
+gregion.

ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ、　ｃｏｄｉｎｇ　ｒ
ｅｇｉｏｎ及び３′−ｎｏｎ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉ
ｏｎが挿入されており、ヒト腎由来株化細胞などの適当
な受容量胞へＤＮＡを導入することでヒト−ｐｒｏ−Ｕ
ｒｏｋｉｎａｓｅの産生を行いつる。signal 5equence, coding r
egion and 3'-non coding regi
on has been inserted, and by introducing the DNA into an appropriate recipient cell such as a human kidney-derived cell line, human-pro-U
The vine produces rokinase.

（ｃ）　Ｄｏｍｉｎａｎｔ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｍａ
ｒｋｅｒを含むプラスミドＤＮＡの調製 上記ｐＳＶ−Ｇ１を用いて培養細胞を形質転換する際の
Ｄｏｍｉｎａｎｔ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｍａｒｋｅｒ
として用いるプラスミドであるｐｓＶ−Ｇ１−Ｎｅｏ’
は、以下の様にして作製した。(c) Dominant 5election Ma
Preparation of plasmid DNA containing rker Dominant 5 selection marker when transforming cultured cells using the above pSV-G1
psV-G1-Neo', a plasmid used as
was produced as follows.

Ｔｎ５由来のネオマイシン耐性遺伝子がクローニングさ
れているプラスミドＤＮ　Ｅ　Ｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ。Plasmid DNEO (Southern) into which the Tn5-derived neomycin resistance gene has been cloned.

Ｐ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｐ、　Ｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｈｏ１ｅ
ｃ、　ａｎｄ　ＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔ、、　　１．
　３２７−３４１　　（１９８２））　　　（ＰＬ−Ｂ
ｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｃａ１社）をＢａ１１ＨＩと）ｌｉ
ｎｄＩ［［ｔ’消化後、ネオマイシン耐性遺伝子を含む
１．５ｋｂＤのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ
は４６ＮＴＰｓ存在下でＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ−ｐｏ
＋ｙｍｅｒａｓｅ　ｒ、　＋ａｒｇｅ　ｒｒａｇ＋ｎｅ
ｎｔ（にｌｅｎｏｗ　ｒｒａｇｍｅｎｔ）で切断末端を
平滑末端に変更した後にＴ４−ＤＮＡＩｉｑａｓｅによ
る反応でその末端に前述の様にしてＫ　ｐｎＩ　ｌ１ｎ
ｋｅｒを付加した。P, J, and P, Berg, J, Hole.
c, and AppliedGenet, 1.
327-341 (1982)) (PL-B
ioche+++1ca1 company) with Ba11HI)li
After ndI[[t' digestion, a 1.5 kbD DNA fragment containing the neomycin resistance gene was recovered. Recovered DNA
In the presence of 46NTPs, E. coli DNA-po
+ymerase r, +arge rrag+ne
After changing the cut end to a blunt end with nt (lenow rragment), K pnI l1n was added to the end by reaction with T4-DNAIiqase as described above.
ker was added.

Ｋ　ｐｎｌ：　ｌ１ｎｋｅｒ　Ｉｉｇａｔｉｏｎ後、Ｋ
１１ｎＩ　　６１ＪｒＤＮＡ［片を完全に消化し、ｌ１
ｎｋｅｒの付加された目的の約１．５ｋｂネオマイシン
耐性遺伝子を回収した。K pnl: After l1nker induction, K
11nI 61JrDNA [piece completely digested, l1
The desired approximately 1.5 kb neomycin resistance gene to which nker was added was recovered.

回収したＤＮＡ断片は、そのうちｉｓｎｇを前述の様に
してＫｐｎＩで切断したｐＳ　Ｖ　−Ｇ　１２０ｎｇと
ｌｉｇａｔｅＬ、大腸菌１−１１３１０１を形質転換し
て目的のプラスミドｐｓｖ−Ｇ　１−Ｎｅｏ’　ｔＡＪ
り＜Ｆ７図）。The recovered DNA fragment was used to transform Escherichia coli 1-113101 with 120 ng of pSV-G whose isng was cut with KpnI as described above and ligate L to obtain the target plasmid psv-G 1-Neo' tAJ.
(Fig. F7).

（ｄ）受容細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ　ｃｅｌｌ）の調
製受容１８ｆ１１として、ヒト胎児腎より得たｐｒｉｍ
ａｒｙｃｕｌｔｕｒｅを継代培養して得られたヒト腎由
来株化細胞（ｎ−ＨＫＧ）を用いた。ＤＮＡのトランス
フェクションに用いる細胞はトリプシン−ＥＤＴＡ処理
で細胞を集めた後培養液（５％ＦＣ８を含むダルベツコ
のＭＥＭ培地）に懸濁し、ファルコン＃　３００３（１
００ｒＩｖＲ＞培養シャーレに７　ｘ　１０５　ｃｅｌ
ｌｓ／　１０ａｅ　／　１００ｍシャーレで植え込んだ
。２４時間５％ＣＯ２−９５％ａｉｒのＣＯ２−１ｎｃ
ｕｂａｔｏｒで培養後、形質転換に用いた。この条件下
では、受容細胞として用いるヒト腎由来株化ｗｉ胞のウ
ロキナーゼ産生量は、２６．５ＩＵ／ｍｉ！／ｄａｙ　
（５例平均）である。(d) Preparation of recipient cells Prim obtained from human embryonic kidney as recipient 18f11
A human kidney-derived cell line (n-HKG) obtained by subculturing aryculture was used. Cells used for DNA transfection were collected by trypsin-EDTA treatment, suspended in culture medium (Dulbetzco's MEM medium containing 5% FC8), and transfected with Falcon #3003 (1
00rIvR>7 x 105 cells in culture dish
ls/10ae/100m Petri dish. 24 hours 5% CO2-95% air CO2-1nc
After culturing in ubator, it was used for transformation. Under these conditions, the amount of urokinase produced by the human kidney-derived cell line used as recipient cells was 26.5 IU/mi! /day
(average of 5 cases).

（ｅ）形質転換 長円等の方法（蛋白質核酸・酵素、２８　（１４）　。(e) Transformation Method of ellipses etc. (Protein Nucleic Acids/Enzymes, 28 (14).

１５６９〜１５８１．１９８３）に準じて調製したプラ
スミドＤＮＡ　（１）ＳＶ−Ｇ１−ＰｒｅＵＫ及びｐＳ
Ｖ−Ｇ１−Ｎ［ｌ　　（混合比率は１００：１））をＤ
ＮＡ量として２〜４１１’Ｊ／ｄおよびｃａｒｒｉｅｒ
　Ｄ　Ｎ　ＡとしテＳａ１ｍｏｎ　ｓｐｅｒｍ　　Ｄ　
Ｎ　Ａ　（ＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１社）を２０１
１９／ｒｄ含有するＤＮＡ−Ｃａ　ＰＯ４微小沈澱液を
（ｄ）で調製したシャーレあたり１ｄずつ加えた。シャ
ーレを十字に動かして静置し、ＤＮＡ−Ｃａ　ＰＯ４微
小沈澱を細胞に吸着させた後、再び１ｎｃｕｂａｔｏｒ
で培養を開始した。６〜９時間時間項培地交換い、さら
に４８時間以上培養して、形質転換細胞の選別を行った
。1569-1581.1983) (1) SV-G1-PreUK and pS
V-G1-N[l (mixing ratio is 100:1)) as D
2 to 411'J/d and carrier as NA amount
D N A Toshite Sa1mon sperm D
N A (PL-Biochemica1) to 201
1 d of DNA-Ca PO4 microprecipitate containing 19/rd was added to each petri dish prepared in (d). Move the petri dish crosswise and let it stand still to allow the DNA-Ca PO4 microprecipitate to adsorb to the cells, then add 1 incubator again.
Culture was started. The medium was replaced every 6 to 9 hours, and the cells were further cultured for 48 hours or more to select transformed cells.

（ｆ）形質転換細胞の選別 ウロキナーゼ遺伝子は、自身では５ｅｌｅｃｔａｂｌｅ
ではないため、真核細胞において、Ｇ−４１８耐性を与
えるＴｎ５由来のネオマイシン耐性遺伝子をｄｏｍｉｎ
ａｎｔ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒとして用い
（前述のｐｓ　Ｖ　−Ｇ　１−　Ｎ　ｅｏ’　）Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ等の方法（Ｊ、　Ｈｏ１ｃｃ、　ａｎｄ　Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔ、、　１．３２７−３４１゜
１９８２　）に準じて細胞をＧ　−４１８含有培地（４
００μＪ／ｄ）で培養することによってトランスフェク
ションした細胞の選別を行った。なお、Ｇ　−４１８は
ＧｉｂＣＯ社１　（Ｇｅｎｅｔ　ｉｃ　ｉ　ｎ■）を用
いた。(f) Selection of transformed cells The urokinase gene is 5 selectable by itself.
Therefore, in eukaryotic cells, the neomycin resistance gene derived from Tn5, which confers G-418 resistance, is
used as ant 5 selection marker (the above psV-G1-Neo')
The method of Thern et al. (J, Ho1cc, and A
The cells were grown in a G-418-containing medium (4 ml) according to Genet, pplied Genet, 1.327-341°1982
Transfected cells were selected by culturing at 00 μJ/d). As for G-418, GibCO 1 (Genetic in ■) was used.

４日おきに培地を交換し、Ｇ　−４１８耐性コロニーを
生育させ、１４日目に５０コロニー（Ｃｏ１ｏｎｉｅｓ
）を得た。これらの形質転換細胞を５％ＦＣ８を含むダ
ルベツコのＭＥＭ培地で生育させ、順次選別を行ってつ
Ｏキナーゼの産生量の高いと思われる細胞株を選択した
。G-418-resistant colonies were grown by replacing the medium every 4 days, and 50 colonies (Colonies) were grown on the 14th day.
) was obtained. These transformed cells were grown in Dulbecco's MEM medium containing 5% FC8, and sequentially selected to select cell lines that seemed to produce a high amount of O-kinase.

実施例　１ 参考例１により調製した組み換え１１にＧ細胞（ｒ−Ｉ
ＩＫＧ）を２０ｘ　１０４ｃｅｌｌｓ　／戒の濃度で熱
不活化ウシ胎児血清５　ｗ／ｖ％含有Ｗａｙｍｏｕｔｈ
培地に植え込み、３日間培養後、細胞数が１００　Ｘｌ
０４ｃｅｌｌｓ　／ｍｇトなった時点で、さらに、０．
１ｗ／ｖ％ヒト血清アルブミン、０．５Ｗ／Ｖ％グリシ
ン、０．５ｗ／ｖ％コハク酸ナトリウム含有Ｗａｙｍｏ
ｕｔｈ培地（無血清培地）に上記前駆体産生ｍ胞１００
　ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ　／ｒｔｄｌを植え直し、こ
の濃度を維持しつつ３日間培養した。培養液を遠心分離
し、沈澱には新しい培地を添加して培養を続けた。上清
中には前駆体く活性は１−当たり３００Ｕに相当）が含
まれていた。Example 1 Recombinant 11 prepared according to Reference Example 1 was injected with G cells (r-I
Waymouth containing 5% w/v of heat-inactivated fetal bovine serum (IKG) at a concentration of 20x 104 cells/Kai.
After planting in the medium and culturing for 3 days, the number of cells reached 100 Xl.
0.04 cells/mg, further increase the amount by 0.04 cells/mg.
Waymo containing 1w/v% human serum albumin, 0.5w/v% glycine, 0.5w/v% sodium succinate
100 m cells producing the above precursor in uth medium (serum-free medium)
x 10' cells/rtdl was replanted and cultured for 3 days while maintaining this concentration. The culture solution was centrifuged, fresh medium was added to the precipitate, and culture was continued. The supernatant contained precursor activity (equivalent to 300 U per 1 ml).

本発明により得られた前駆体は、特開昭５８−１７０３
５４で開示したｒＩＩｍ素溶解酵素前駆体」と全く同一
の性質を有していた。The precursor obtained according to the present invention is disclosed in JP-A-58-1703.
It had exactly the same properties as the rIIm lytic enzyme precursor disclosed in No. 54.

参考例　２ 実施例１により得られた前駆体を含む培養上清をｐＨ５
，５に調整した後、ＣＭ−５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−５０
に接触した。０．１６Ｍリン酸！！！ｉ液（ｐＨ５，５
）で吸着していた前駆体を溶出させた。Reference Example 2 The culture supernatant containing the precursor obtained in Example 1 was adjusted to pH 5.
, 5, CM-5ephadex C-50
came into contact with. 0.16M phosphoric acid! ! ! i liquid (pH 5.5
) was used to elute the adsorbed precursor.

一方、前駆体で予め免疫しておいたマウスＢへＬＢ／Ｃ
の牌臓細胞とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリ
コールにより融合させたハイブリドーマのうち、前駆体
に対する抗体産生の高いクローンを選択した。この融合
細胞の培養液から、前駆体モノクローナル抗体を回収し
た。このモノクローナル抗体をＣＮＢｒ活性化５ｃｐｈ
ａｒｏｓｅ　４　Ｂ（Ｐｈａｒｎ＋ａｃｉａ社）に固定
した。On the other hand, LB/C to mouse B, which had been immunized with the precursor in advance
Among the hybridomas obtained by fusing spleen cells and mouse myeloma cells using polyethylene glycol, clones with high antibody production against the precursor were selected. A precursor monoclonal antibody was recovered from the culture solution of this fused cell. This monoclonal antibody was activated by CNBr to 5cph.
It was fixed on arose 4 B (Pharn+acia).

このモノクローナル抗体カラムを０．４ＭＮａ　（：、
ｎ含有０．ＩＭＩＪン酸緩衝液（ｐｔ１７．ｏ）　テ平
衡化し、これに前記の前駆体を含有する溶出液を接触し
た。０．４Ｍ　　ｐＪａ（：、ｎ含有０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）でカラムを洗浄した後、吸着してい
た当該前駆体を０．５Ｍ　　ＮａＣＪ）含有０．２Ｍグ
リシン−ＨＣＪ水溶液（ｐＨ２，５）で溶出させた。溶
出液を除菌濾過した後、凍結乾燥し比活性が少なくとも
８０，０ＯＯＬＩ　／＃ｌ！Ｊの高度精製前駆体を得た
。This monoclonal antibody column was coated with 0.4 MNa (:,
Contains 0. IMIJ acid buffer (pt17.o) was equilibrated and contacted with the eluate containing the precursor. After washing the column with a 0.1M phosphate buffer (pH 7,0) containing 0.4M pJa (:,n), the adsorbed precursor was removed with a 0.2M glycine-HCJ aqueous solution (0.5M NaCJ) containing ( It was eluted at pH 2,5). After the eluate is sterilized and filtered, it is lyophilized and the specific activity is at least 80.0OOLI/#l! A highly purified precursor of J was obtained.

なお、この精製品は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法より分子ｆｎ　５４．０００の１本の帯を示し
た。This purified product showed one band with a molecule fn of 54.000 by 5DS-polyacrylamide gel electrophoresis.

実験例　１ 本発明による前駆体産生増強効果を見るために、前駆体
の産生量の比較実験を行った。第６表に示したようにグ
リシンの添加量はＯ〜３．Ｏｗ／ｖ％の範囲で設定した
。それ以外の条件は実施例１に準じて各群とも同様に行
った。産生量の指標として活性を測定した。Experimental Example 1 In order to examine the effect of enhancing precursor production according to the present invention, an experiment was conducted to compare the production amount of precursors. As shown in Table 6, the amount of glycine added is 0 to 3. It was set within the range of Ow/v%. The other conditions were the same as in Example 1 for each group. Activity was measured as an indicator of production amount.

活性量の測定は、ｐ　−ＨＣＡ法により以下のように行
った。即ち、検体０．１ｍとプラスミン溶液（０，２ｃ
ｕ／　ｍｌ、ゼラチン緩衝液（ｐＨ８，６）でｉＩ製し
たもの）　　０．１１ｎ１を混合後、３７℃で１０分間
インキュベーションし、ｐ　−ＨＣＡ溶液（０，１ｍＨ
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ　−＾ｒｇ　−ＨＣＡ）　１−を加え、
さらに３７℃で２０分間インキュベーションし、１８Ｖ
／Ｖ％酢酸を加えて反応を止めた後、ＥＸ（励起波長）
　　３７０ｎＩＲ，Ｅｍ（Ｉ光波長）４６０　ｎｍにて
螢光強度を測定した。その結果は、第６表および第１図
に示す通りであり、特に、ｒ−ＨＫＧはｎ−１１にＧに
比べ０．５％グリシン添加で高い添加効果が認められた
。The amount of activity was measured by the p-HCA method as follows. That is, 0.1 m of specimen and plasmin solution (0.2 c
After mixing 0.11n1 of p-HCA solution (0.1mH
Add Glu-Gly -＾rg-HCA) 1-,
Further incubate for 20 minutes at 37°C and
/V% After stopping the reaction by adding acetic acid, EX (excitation wavelength)
Fluorescence intensity was measured at 370nIR, Em (I light wavelength) 460nm. The results are as shown in Table 6 and FIG. 1, and in particular, a higher effect of adding 0.5% glycine to n-11 was observed with r-HKG than with G.

なお単位はＵ／−を用いた。ＵはつＯキナーゼ国際単位
であり、ＩＵ／蔵は検体１−につきプラスミン処理によ
って発現する繊Ｎ素溶解活性が１Ｕに相当することを意
味する。Note that the unit is U/-. U is the international unit of O-kinase, and IU/unit means that the fibrinolytic activity expressed by plasmin treatment is equivalent to 1 U per sample.

第　　　　６　　　　表Table 6

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図　グリシンの添加効果。○はｒ　−ＨＫＧ　。 ・はｎ　−ＩＩＫＧを表わす。 第２図　ｃＤＮＡの超遠心沈降パターン。 第３図ｐＵＫ　１　、　ｐＵＫ　３．　ｐＵＫ　４中に
挿入されている各ｃＤＮＡの制限酵素地図。 第４図　ｐＵＫ　ｉとｐＵＫ　４のｌｉｇａｔｉｏｎ　
（リゲーション）のフローシート。ＥはＥｃｏＲＩを、
Ｈは１Ｉｉｎｄｌ［ｌを、ＢはＢａｍＨ■を表わす。 第５図　ｐｃＤＶｌとＩ）ＬｌとのＩｉｇａｔｉｏｎ　
（リゲーション）フローシート。 第６図　ｐｓＶｌ−Ｇｌ制限酵素地図。 第７図　ｐＳＶ　１−０１−１）ｒｅＵＫ　及ｆｆ１）
ＳＶ　−０１−Ｎｅｏ　　の制限酵素地図。 第８図　１）ＳＶ　１−Ｇｌ−ｐｒｅｕにのｐｒｅＵＫ
　−ｃＤＮＡ近辺の構造。 ＮＣ：　ｎｏｎ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎＳＳ：　
ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅＳＪ　：　５ｐｌｉｃ
ｉｎａ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ第１図 ２゛９ンンＡミＩＣ１（−（Ｗ／Ｖ））第　　２　　図 トツア　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ＴＦＸ外ム第　　４　　図 第５図 （３２５にｂｐ） 第　　６　　図 第　　７　　図 ５Ｖ−４０Ａ（ｎ） 第　　８　　図 手続ネｆｌｉ正獣を 昭和６１年１１月１ｚ日Figure 1 Effect of adding glycine. ○ is r-HKG. * represents n-IIKG. Figure 2 Ultracentrifugation sedimentation pattern of cDNA. Figure 3 pUK 1, pUK 3. Restriction enzyme map of each cDNA inserted into pUK4. Figure 4 Ligation of pUK i and pUK 4
(ligation) flow sheet. E stands for EcoRI,
H represents 1Iindl[l, and B represents BamH■. Figure 5 Iigation between pcDVl and I)Ll
(ligation) flow sheet. Figure 6 psVl-Gl restriction enzyme map. Figure 7 pSV 1-01-1) reUK and ff1)
Restriction enzyme map of SV-01-Neo. Figure 8 1) preUK to SV 1-Gl-preu
-Structure near cDNA. NC: non-coding regionSS:
signal 5equenceSJ: 5plic
ina junctionFigure 1 2゛9nnAmi IC1 (-(W/V))Figure 2
TFX external program Figure 4 Figure 5 (325 bp) Figure 6 Figure 7 Figure 5V-40A(n) Figure 8 Procedure Nefli Seiju November 1z, 1985

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] ブラスミノーゲンアクチベーター前駆体をコードするＤ
ＮＡ配列を組み込んだベクターを用いて形質転換させた
ヒト腎由来株化細胞を培養して、ブラスミノーゲンアク
チベーター前駆体を生産するに際して、培地に少なくと
も中性アミノ酸を含むことを特徴とするブラスミノーゲ
ンアクチベーター前駆体の産生増強方法。D encoding blasminogen activator precursor
Blasminogen, which is characterized in that the culture medium contains at least a neutral amino acid when producing a blasminogen activator precursor by culturing a human kidney-derived cell line transformed using a vector incorporating an NA sequence. Method for enhancing production of activator precursor.