JPS6379593A - tPAを精製する方法 - Google Patents
tPAを精製する方法Info
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、組織ブラスミノーゲンアクチベータ−(tP
A)の精製法に関する。
A)の精製法に関する。
さらに詳しくは、種々のtPAの分子種を含む粗製のt
PAを反応色素と結合した樹脂と接触させることにより
分子量約7万ダルトンtPAを分離精製して得る方法に
関する。
PAを反応色素と結合した樹脂と接触させることにより
分子量約7万ダルトンtPAを分離精製して得る方法に
関する。
本発明においてtPAとは、高等動物の組織で産生され
るものであって、フィブリンに特有な分解酵素であるプ
ラスミンの前駆物質であるプラスミノーゲンを賦活化さ
せる蛋白質である。
るものであって、フィブリンに特有な分解酵素であるプ
ラスミンの前駆物質であるプラスミノーゲンを賦活化さ
せる蛋白質である。
これを含む液とは、ヒトメラノーマ細胞培養液、ヒト正
常細胞培養液及び遺伝子組み換え技法を用いヒト tP
A遺伝子を組み込んだ細胞の培養液等がある。またtP
Aを含む液として、上記培養液を部分精製した液でもよ
い。
常細胞培養液及び遺伝子組み換え技法を用いヒト tP
A遺伝子を組み込んだ細胞の培養液等がある。またtP
Aを含む液として、上記培養液を部分精製した液でもよ
い。
本発明で使用する親和試薬には、プロジオンレッド、チ
バクロンブルー等のトリアジン環を含む反応性色素を固
形担体に結合したものが挙げられ、固形担体としてはア
ガロース、セルロース、ポリアクリルアミド粒子が使用
できる。
バクロンブルー等のトリアジン環を含む反応性色素を固
形担体に結合したものが挙げられ、固形担体としてはア
ガロース、セルロース、ポリアクリルアミド粒子が使用
できる。
本発明の特徴は抗ヒト tPA抗体と反応する分子量の
異なる種々の蛋白の中から選択的に分子)7万ダルトン
のtPAを取得することにある。
異なる種々の蛋白の中から選択的に分子)7万ダルトン
のtPAを取得することにある。
つまりtPAを生産する細胞を培養し、tPAを得よう
とする際、その培養液中には抗ヒl−tPA抗体と反応
する蛋白質として分子量3万から4,5万ダルトンのも
の、5万から8万ダルトンのもの及び10万ダルトン以
上のものが存在する。これら多種類のtPA分子分子色
種の不純タンパクを含む液の中から分子量約7万ダルト
ンのtPAだけを分離精製する方法である。
とする際、その培養液中には抗ヒl−tPA抗体と反応
する蛋白質として分子量3万から4,5万ダルトンのも
の、5万から8万ダルトンのもの及び10万ダルトン以
上のものが存在する。これら多種類のtPA分子分子色
種の不純タンパクを含む液の中から分子量約7万ダルト
ンのtPAだけを分離精製する方法である。
分子量の異なる蛋白質を分離する方法としてはゲル口過
法が一般に使用され得る。
法が一般に使用され得る。
これとは異なり、本発明者らは、分子量の異なるtPA
分子種と反応性色素との反応性を調べたところ、各々の
tPA分子分子量中応性色素への親和性に差のあること
を見出し、この性質を利用して多種類のtPA分子分子
量中から分子量7万ダルトンtPAを取得する方法を考
案した。
分子種と反応性色素との反応性を調べたところ、各々の
tPA分子分子量中応性色素への親和性に差のあること
を見出し、この性質を利用して多種類のtPA分子分子
量中から分子量7万ダルトンtPAを取得する方法を考
案した。
本発明ではtPAを含む水性媒体を、反応性色素が担体
に結合している親和試薬層へ通過させ、tPAを吸着さ
せ次いでその層を洗浄し、その後tPAを例えば0.6
M以下のチオシアン酸塩溶液で脱着させ、脱着したtP
Aを層から洗い出す。層はカラムの形状をしていてよい
。
に結合している親和試薬層へ通過させ、tPAを吸着さ
せ次いでその層を洗浄し、その後tPAを例えば0.6
M以下のチオシアン酸塩溶液で脱着させ、脱着したtP
Aを層から洗い出す。層はカラムの形状をしていてよい
。
脱着は例えば、チオシアン酸塩、グアニジンおよびその
誘導体、尿素およびその誘導体、ヒドロキシルアミン、
ヒドラジンが使用できる。
誘導体、尿素およびその誘導体、ヒドロキシルアミン、
ヒドラジンが使用できる。
即ち、多種類のtPA分子分子量中他の不純蛋白を含む
液を反応性色素を担体に結合した親和試薬に吸着する為
に、弱酸性、中性または弱アルカリ性になるように調整
する。
液を反応性色素を担体に結合した親和試薬に吸着する為
に、弱酸性、中性または弱アルカリ性になるように調整
する。
前記の親和試薬と接触させるとほとんどすべてのtPA
分子分子量中着させられる。次に1M以下の食塩濃度又
は0.3?’l以下のチオシアン酸塩水溶液で石を洗浄
すると不純蛋白及び分子量約3万〜3.5万ダルトンt
PAが?6出される。
分子分子量中着させられる。次に1M以下の食塩濃度又
は0.3?’l以下のチオシアン酸塩水溶液で石を洗浄
すると不純蛋白及び分子量約3万〜3.5万ダルトンt
PAが?6出される。
分子量4万〜6万ダルトンtPAを0.6Mチオシアン
酸塩水溶液で溶出させた後1.OMチオシアン酸塩水溶
液を用い分子量7万ダルトンtPAを溶出させることが
できる。
酸塩水溶液で溶出させた後1.OMチオシアン酸塩水溶
液を用い分子量7万ダルトンtPAを溶出させることが
できる。
〔実施例1〕
ボウズ(Bothes )メラノーマ細胞(ATCCC
RL1424 G361 ”)を10%熱不活性化(5
6℃、30分間)胎児牛血清(FCS)を補充したRP
MI−1640組織培養媒体中で培養後、培養物を一度
洗い、血清を含まない媒体中で24時間培養後、媒体を
集め、新しい媒体を加えた。収穫液21を0.15M食
塩を含む0.05Mリン酸緩衝液(pH7,2)で平衡
化したレッドセファローズ(ファルマシア社製)カラム
5rMlに通した。
RL1424 G361 ”)を10%熱不活性化(5
6℃、30分間)胎児牛血清(FCS)を補充したRP
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洗い、血清を含まない媒体中で24時間培養後、媒体を
集め、新しい媒体を加えた。収穫液21を0.15M食
塩を含む0.05Mリン酸緩衝液(pH7,2)で平衡
化したレッドセファローズ(ファルマシア社製)カラム
5rMlに通した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定したが活性は検出されなかった。
性を測定したが活性は検出されなかった。
全培養液をカラムに通過させた後、0.6Mチオシアン
酸アンモニウムを含む0.05Mリン酸緩衝液(pH7
,5)でカラムを洗った。洗液にはカラムにかけた活性
の約10χが検出されSDSポリアクリルアミドゲル電
気電気移動後イモグラフ上で分子量約3万〜6万のバン
ドがプラスミノーゲンアクチベーターとして確認された
。
酸アンモニウムを含む0.05Mリン酸緩衝液(pH7
,5)でカラムを洗った。洗液にはカラムにかけた活性
の約10χが検出されSDSポリアクリルアミドゲル電
気電気移動後イモグラフ上で分子量約3万〜6万のバン
ドがプラスミノーゲンアクチベーターとして確認された
。
吸着した蛍白質を、1.0Mチオシアン酸アンモニウム
を含む0.0団リン酸緩衝液(pH7,5)を用いて溶
出したところ、この方法によりカラムにかけたプラスミ
ノーゲン依存フィブリン溶解活性の約85%が検出され
、ザイモグラフ上で分子量約7万ダルトンのバンドが確
認された。
を含む0.0団リン酸緩衝液(pH7,5)を用いて溶
出したところ、この方法によりカラムにかけたプラスミ
ノーゲン依存フィブリン溶解活性の約85%が検出され
、ザイモグラフ上で分子量約7万ダルトンのバンドが確
認された。
〔実施例2〕
人胎児肺細胞(ATCCパRC−5CCL−171)培
養液〔10χ熱不活性化(56℃、30分間)胎児生血
・清及び20KItl/if!アプロチニンを含む〕
22を抗ヒトtPA抗体カラム20−に通した。
養液〔10χ熱不活性化(56℃、30分間)胎児生血
・清及び20KItl/if!アプロチニンを含む〕
22を抗ヒトtPA抗体カラム20−に通した。
流出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定したが、この画分の活性はカラムにかけた活性
の約40χを示したものの、抗ヒトウロキナーゼ抗体と
交叉反応させた後のプラスミノーゲン依存フィブリン溶
解活性は検出されなかったので、この活性はウロキナー
ゼによるものと判断された。
性を測定したが、この画分の活性はカラムにかけた活性
の約40χを示したものの、抗ヒトウロキナーゼ抗体と
交叉反応させた後のプラスミノーゲン依存フィブリン溶
解活性は検出されなかったので、この活性はウロキナー
ゼによるものと判断された。
吸着されている蛋白質は1.0M食塩を含む0.05M
リン酸緩衝液(p)l 7.5)で洗浄後2.0Mチオ
シアン酸カリウムを含む0.05Mリン酸緩衝液(pH
7,5)で溶離した。
リン酸緩衝液(p)l 7.5)で洗浄後2.0Mチオ
シアン酸カリウムを含む0.05Mリン酸緩衝液(pH
7,5)で溶離した。
溶出液の活性はカラムにかけた活性の約5ozを示した
。この両分をSDSポリアクリルアミドゲル電気電気移
動後イモグラフィーで調べると分子量約3万〜15万ダ
ルトンの範囲で多数のバンドが検出され、抗ヒトtPA
抗体で処理したフィブリンアガープレートを用いると上
記のバンドが検出されないことがらtPAと確認された
。
。この両分をSDSポリアクリルアミドゲル電気電気移
動後イモグラフィーで調べると分子量約3万〜15万ダ
ルトンの範囲で多数のバンドが検出され、抗ヒトtPA
抗体で処理したフィブリンアガープレートを用いると上
記のバンドが検出されないことがらtPAと確認された
。
この溶出液を0.05M リン酸緩衝液(pH7,5)
で4倍希釈し、0.5Mチオシアン酸カリウムを含む0
゜05Mリン酸緩衝液(pH7,5)で平衡化したブル
ーセファローズ(ファルマシマ社製) 5ml’に通
した。
で4倍希釈し、0.5Mチオシアン酸カリウムを含む0
゜05Mリン酸緩衝液(pH7,5)で平衡化したブル
ーセファローズ(ファルマシマ社製) 5ml’に通
した。
溶出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定した。カラムに通した活性の約5%が確認され
、ザイモグラフ上で3万〜6万ダルトンのバンドが検出
された。
性を測定した。カラムに通した活性の約5%が確認され
、ザイモグラフ上で3万〜6万ダルトンのバンドが検出
された。
吸着されている蛋白を0,1Mアルギニンを含む上記平
衡化緩衝液により溶離したところ、溶出液の活性はカラ
ムにかけた活性の約90%を示し、ザイモグラフ上で分
子量約7万ダルトンのバンドをしめした。
衡化緩衝液により溶離したところ、溶出液の活性はカラ
ムにかけた活性の約90%を示し、ザイモグラフ上で分
子量約7万ダルトンのバンドをしめした。
〔実施例3〕
ヒト tPA遺伝子を組み込んだチャイニーズハムスタ
ー卵母(CHO)細胞(Dr、Chasin、Colo
mbia口n1versity Departmen
t Of Biological 5cienc
e)培養液〔1oz熱不活性化(56℃、30分間)胎
児牛血清及び40KIU/7!アプロチニン含む〕21
!を抗ヒトtPA抗体カラム50m1に通した。1.0
M食塩を含む0.05M リン酸緩衝液(pH7,5)
で洗浄後、2.0Mチオシアン酸アンモニウムを含む0
.1Mグリシン−塩酸緩衝液(pH3,5)で吸着した
蛋白を溶離した。
ー卵母(CHO)細胞(Dr、Chasin、Colo
mbia口n1versity Departmen
t Of Biological 5cienc
e)培養液〔1oz熱不活性化(56℃、30分間)胎
児牛血清及び40KIU/7!アプロチニン含む〕21
!を抗ヒトtPA抗体カラム50m1に通した。1.0
M食塩を含む0.05M リン酸緩衝液(pH7,5)
で洗浄後、2.0Mチオシアン酸アンモニウムを含む0
.1Mグリシン−塩酸緩衝液(pH3,5)で吸着した
蛋白を溶離した。
溶出液を集め、プラスミノーゲン依存フィブリン溶解活
性を測定したところ、カラムに通した活性の約95%が
確認された。
性を測定したところ、カラムに通した活性の約95%が
確認された。
この画分をSDSポリアクリルアミド電気電気移動後イ
モグラフィーで調べると分子量3万〜15ダルトンの範
囲にバンドが確認された。
モグラフィーで調べると分子量3万〜15ダルトンの範
囲にバンドが確認された。
この両分を0.05Mリン酸緩衝液(pH7,5)で4
倍希釈し、Procion C,1,R+pactiv
e Yellow LSepharose 5mに通し
た。
倍希釈し、Procion C,1,R+pactiv
e Yellow LSepharose 5mに通し
た。
流出液の活性はカラムに通した活性の約10%を示した
。分子量3万〜6万の範囲にバンドがザイモグラフ上で
確認された。
。分子量3万〜6万の範囲にバンドがザイモグラフ上で
確認された。
吸着した蛋白は0.2Mヒドロキシルアミン及び0゜釘
食塩を含む0.05M トリス塩酸緩衝液(pH8,5
)を用い溶離した。溶出液の活性はカラムに通した活性
の約80%であった。
食塩を含む0.05M トリス塩酸緩衝液(pH8,5
)を用い溶離した。溶出液の活性はカラムに通した活性
の約80%であった。
ザイモグラフ上の分子量約7万ダルトンの位置にtPA
がバンドとして認められた。
がバンドとして認められた。
〔実施例4〕
ヒト tPA遺伝子を組み込んだマウス線維芽細胞(M
ouse C1271ATCCCRL 1616 )培
養液〔2χ熱不活性化(56℃、30分間)胎児牛血清
及び40KIU/dアプロチニンを含む)2ffをリン
酸でpH4,5に調整し、0.15M食塩を含む0.0
5リン酸2水素1ナトリウム(pH4,5)で平衡化し
たカルボキシメチル(CM)セファロースl0m1に通
した。
ouse C1271ATCCCRL 1616 )培
養液〔2χ熱不活性化(56℃、30分間)胎児牛血清
及び40KIU/dアプロチニンを含む)2ffをリン
酸でpH4,5に調整し、0.15M食塩を含む0.0
5リン酸2水素1ナトリウム(pH4,5)で平衡化し
たカルボキシメチル(CM)セファロースl0m1に通
した。
吸着した蛋白を含む樹脂は50mM食塩を含む25mM
リン酸緩衝液(pH6,4)で洗浄後、0.5M食塩を
含む50mMリン酸緩衝液(pH6,4)を用い蛋白を
溶離した。
リン酸緩衝液(pH6,4)で洗浄後、0.5M食塩を
含む50mMリン酸緩衝液(pH6,4)を用い蛋白を
溶離した。
溶出液のプラスミノーゲン依存フィブリン)6解活性を
測定するとカラムにかけた活性の約90%を示した。
測定するとカラムにかけた活性の約90%を示した。
この百分をSOSポリアクリルアミド電気泳動後のザイ
モグラフィーで調べると分子量3万〜15万ダルトンの
範囲でtPAのバンドとして517zされた。
モグラフィーで調べると分子量3万〜15万ダルトンの
範囲でtPAのバンドとして517zされた。
この溶出液を0.5M食塩を含む50mMリン酸緩衝液
(pH6,4)で平衡化したProcion C,1,
ReactiveOrange l−5epharos
eに通した。
(pH6,4)で平衡化したProcion C,1,
ReactiveOrange l−5epharos
eに通した。
0.3Mチオシアン酸アンモニウムを含む0.05M
トリス塩酸緩衝液(pH8,0)で洗浄後、4M尿素
を含む0.05M )リス塩酸緩衝液(pH8,0)
で蛋白を溶離した。
トリス塩酸緩衝液(pH8,0)で洗浄後、4M尿素
を含む0.05M )リス塩酸緩衝液(pH8,0)
で蛋白を溶離した。
溶出液の活性はカラムにかけた活性の約90%を示し、
ザイモグラフ上で分子量約7万ダルトンの位置にtPA
が確認された。
ザイモグラフ上で分子量約7万ダルトンの位置にtPA
が確認された。
〔実施例5〕
ヒト tPA遺伝子を組み込み形質転換された宿主酵母
細胞は(Pr1nciples and Practi
ce ofRocombinant DNA Re
5earch with Yeast)in T
heMolecular Biology of Ye
ast Saccharomyces :Metabo
lism and Gene Expression、
PP 603−636+Co1d Spring Ha
rbor La1oratory、Co1d Spri
ngHarbor、NY(1982)に記載された方法
を通常用いる標準酵母培養培地で増殖させた。
細胞は(Pr1nciples and Practi
ce ofRocombinant DNA Re
5earch with Yeast)in T
heMolecular Biology of Ye
ast Saccharomyces :Metabo
lism and Gene Expression、
PP 603−636+Co1d Spring Ha
rbor La1oratory、Co1d Spri
ngHarbor、NY(1982)に記載された方法
を通常用いる標準酵母培養培地で増殖させた。
細胞はガラスピーズにより破砕され、そノ110゜02
χTween 80 及び0.15FI食塩を含む0
.05Mリン酸緩衝液(pH7,5,20KIU、4の
アプロチニンを含む)でtPAを抽出し、抽出液を遠心
分離しその上澄液を実施例3と同様の方法で、つまり抗
tPA抗体セファロースとそれにVt < Proc
ion C,I 。
χTween 80 及び0.15FI食塩を含む0
.05Mリン酸緩衝液(pH7,5,20KIU、4の
アプロチニンを含む)でtPAを抽出し、抽出液を遠心
分離しその上澄液を実施例3と同様の方法で、つまり抗
tPA抗体セファロースとそれにVt < Proc
ion C,I 。
Reactive Yellow 1−セファロースに
通してtPAを精製した。
通してtPAを精製した。
精製したtPAは分子量約7万ダルトンを示し、抽出液
からの活性の回収は約75%であった。
からの活性の回収は約75%であった。
Claims (1)
- 抗ヒトtPA抗体と反応し、かつ分子量約7万ダルトン
以外の分子量をもつ蛋白を不純物として含む粗tPAを
固定化反応性色素を含んでなる親和試薬と密接に接触さ
せ、これにより選択的に分子量7万ダルトンtPAを取
得することを特徴とするtPAを精製する方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP22211386A JPS6379593A (ja) | 1986-09-22 | 1986-09-22 | tPAを精製する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP22211386A JPS6379593A (ja) | 1986-09-22 | 1986-09-22 | tPAを精製する方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6379593A true JPS6379593A (ja) | 1988-04-09 |
Family
ID=16777350
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP22211386A Pending JPS6379593A (ja) | 1986-09-22 | 1986-09-22 | tPAを精製する方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6379593A (ja) |
-
1986
- 1986-09-22 JP JP22211386A patent/JPS6379593A/ja active Pending
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