JPS6377870A - １，５―アンヒドログルシトール誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は糖尿病の診断マーカーとして期待される１、５
−アンヒドログルシトール（以下ｒｌ、５−ＡＧＪとい
う）の定量方法、その測定に使用する抗体及び１．５−
ＡＧ誘導体番で関する。

〔従来の技術〕

１．５−ＡＧはヒト髄液及び血漿中に存在しある種の疾
患、特に糖尿病において血漿中の量が低下することが報
告されている化合物である。この１．．５−ＡＧと反応
する抗体の作成が可能であることは知られておらず、従
来、１．５−ＡＧの測定は主にガスクロマトグラフィー
によりおこなわれていた。

〔発明が解決すべき問題点〕

しかし、従来の方法では試料の前処理及び分析機器の維
持、管理に高度の技術を必要とし、簡便な１．５−ＡＧ
の測定法が要望されていた。

〔問題点ン解決するための手段〕

本発明者らは１．５−ＡＧの簡便な測定法を鋭意研究し
た結果、一般にハプテン抗体作成が困難とされている低
分子化合物で、かつ血清成分である１、５−ＡＧに特異
的に反応する抗体の作成が可能であることぞ見い出し、
この作成した抗体を１，５　　ＡＧの定量に応用し本発
明を、完成した。即ち、本発明は、＋１）　１．５−ア
ンヒドログルシトール含有被検液に、１．５−アンヒド
ログルシトールに’ｌ？　Ａ　反応性を有する抗体と、
標識した１、５−アンヒドログルシトールと乞加えて免
役反応せしめ次いで、免疫反応によって生じた標識した
１゜５−アンヒドログルシトールと該抗体との結合物と
、未結合の標識した１、５−アンヒドログルシトールと
を分離後、分離されたもののいづれか一方の標識？測定
することによって該被検液中の１，５−アンヒドログル
シトールを定量することを特徴とする１、５−アンヒド
ログルシトールの定量方法 （２１），５−アンヒドログルシトールに特異反応性を
有する抗体、及び （３）一般弐山 〔式中、Ｘ、　Ｙ、　Ｚのいづれか１つが弐へ−アルキ
レンーＢ−であり、他の２つは−ＯＨを示す。コ；Ｃテ
Ａ　＆’！、　、　　ＮＨ２又Ｇ’：　、　　Ｃ０ＯＨ
ヲ示し、Ｂは一〇−又は、−ＣＯＯ−を示し、アルキレ
ンとしては炭素数１〜１２のものを示す。〕で表わされ
る新規１，５−アンヒドログルシトール誘導体に関する
。

本発明で用いられる被検液としては、■、５−ＡＧの濃
度乞測定したいものであれば特に制限はなく、例えば髄
液、血漿、血清や尿及び１．５−ＡＧｄ１度乞測足しや
すいようにこれらの被検液を処理した処理液などがあげ
られる。

本発明で用いられる特異反応性２有する抗体とは、血清
に存在することが知られている糖類との反応性が、１．
５−ＡＧと比較して。

無視し得ろ程度か、又は全く反応しないものである。１
．５−ＡＧの免疫測定法においては特に、血清に多量に
存在し、１．５−ＡＧと類似した構造乞有するグルコー
スなどが問題となる。グルコースの場合、これに対する
反応性が１．５−ＡＧの１０％以下、さらに好ｌしくに
、１％以下である抗体が望ましい。

本発明で用いられる標識した１、５　　ＡＧとしては、
通常の−・ブテンの免疫測定法に用いられている様な標
識化の方法で標識した１、５−ＡＧがあげられる。これ
１で、標識体２用いる免疫測定法として、標識物質（ト
レーサー）の種類により、多数の方法が提案されてきた
が、これらのいづれの方法を用いてもよい。−例乞あげ
れば、トレーサーが放射性物質である放射免疫測定法（
ＲＩＡ）においては１．５−ＡＧそのものの構成元素？
放射性同位体で置換したものが利用できる。また、１，
５−ＡＧの３位、４位、又は６位の水酸基に放射活性な
ヨウ素を導入した側鎖２有する１、５−ＡＧ誘導体も含
ぼれる。

具体的なトレーサーの導入例としては、１，５−ＡＧの
１位にトリチウム（３Ｈ）や　Ｃ洒導入したものがあげ
られる。

トレーサーが酵素である酵素免疫測定法（ＥＩＡ）にお
いては、標識する酵素及び１，５−ＡＧとの結合方法の
選択が問題となる。本発明のＥＩＡに使用し得る酵素は
、一般にＥＩＡに使用されているものであればいづれで
あり”１ｍモ良＜、ホースラディツシュペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、及びβ−ガラクトシダー
ゼなどが使用し得る。１．５−ＡＧとの結合方法につい
ては、１．５−ＡＧ誘導体である一般式（１）の化合物
乞用い、側鎖の官能基Ａのアミン基やカルボキシル基を
介して直接又は間接に酵素タンパク質に結合することが
できる。これらＥＩＡ用の酵素に必要とされる条件及び
結合の方法に関しては、放香等（たとえば、酵素免疫測
定法、石川栄治等編集医学書院出版）で詳細に述べられ
ている。

である一般式（１）の化合物を用い、側鎖の官能基への
アミン基やカルボキシル基χ介して結合できケイ光強度
が強く、安定なものであれば、いづれであっても良い。

また、ケイ光物質の標識密度７高くするために、適当な
担体？介して１分子の１，５〜ＡＧ誘導体に多数のケイ
光物質を結合しても良い。具体的なケイ光物質としては
、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、
ダンジルクロライド、クマリンなどが使用し得る。

トレーサーが発光物質である発光免疫測定法（ＬＩＡ）
においては、１．５−ＡＧ誘導体である一般式け）の化
合物乞用い、側鎖の官能基Ａのアミノ基やカルボキシル
基乞介してイソルミノール化合物等乞化学結合させたも
のが使用し得る。

また、上述の各免疫測定法における１、５−ＡＧと標識
化合物の結合に、アビジンとビオチンの結合反応を介す
る各種方法も利用できる。

定法で使用されているＢＦ分離操作が適宜使用される。

例えば、抗体ン固相担体上に固定せしめた「面相法」と
称するものを利用する場合には、固相担体の表面上に、
物理的、化学的又は免疫学的に結合した。１．５−ＡＧ
に特異的に反応する抗体に対して、被検液中の１．５−
ＡＧ（抗原〕と標識した１、５　　ＡＧを競争的に免疫
反応（競合法）させた後、固相担体を洗浄することによ
って、抗体に結合した標識したＬ５−ＡＧを得ることが
できる。

一方、未結合の標識した１、５−ＡＧは、免疫反応した
液乞集めれば良い。一般に使用されている固相担体とし
ては、各種合成樹脂使用いて成形されたビーズ、マイク
ロタイタープ知られているが、いづれも使用し得る。

本発明で用いられろ標識を定量する方法としては、各種
標識物質χ高感度に測定できる方法であれば、いづれで
あっても良く、測定原理及び装置により限定されろもの
ではない。

用される抗原とは、１．５−ＡＧＫ特異的に反応する抗
体を作成するために必要な動物感作用の抗原、即ち免疫
原であり、一般式（Ｔｌで表わされる１、５−ＡＧ誘導
体に抗原性キャリア物質Ｚ化学結合したものである。抗
原性キャビから選択することができる。大部分の抗原性
蛋白質及びポリペプチドは、５，０００〜１０．０００
，０００好葦しくは１５，０００以上、更に好１しくに
５０，０００以上の分子量７有する。

一般に、ある動物種から採取した蛋白質は他種の血流中
に導入された場合に抗原となる。

特に有用な蛋白質には、アルブミン、グロブリン、酵素
、ヘモシアニン、グルテリン、かなりの非蛋白質成分２
有する蛋白質（例えばＳ蛋白質〕などがある。分子ｆｚ
　３０，０００〜２００．０００のアルブミン及びグロ
ブリンが特に好フしい。合成ポリペプチドを使用しても
よい。従来の抗原性キャリア物質に関する技術を示す他
の参考文献としては、以下のものが挙げられる。

７　：　１−２４　（１９７５）　：　Ｗｅｉｎｒｙｂ
ａｎｄ　５ｈｒｏｆｆ、　ＤｒｕｇＭｅｔａｂ−Ｒｅｖ
、１０：２７１−２８３（１９７５）：Ｂｒｏｕｇｈｔ
ｏｎ　ａｎｄ　Ｓｔｒｏｎｇ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ
−２２：　７２６−７３２　（１９７６）　；　ａｎｄ
　Ｐｌａｙｆａｉｒ、ｅｔａｌ、　Ｂｒ−Ｍｅｄ。

Ｂｕｌｌ、　３０　：　２４−３１　（１９７４）抗原
決定基（エビトープノ密度、すなわちキャリアに結合し
たハブテン部分の平均数は理論的には１選択されたキャ
リア分子上の有効な結合部位数によってのみ制限される
。しかしながら、キャリアがアルブミンの如き天然蛋白
質であるような通常の場合は、平均して、１〜約５０、
より普通には２〜約２０である。

結合の方法については、前述したＥＩＡ用の酵素標識１
．５−ＡＧの作成法の場合と全く同様の方法で実施する
ことができる。

本発明で用いられる１、５−ＡＧ誘導体から誘導される
抗原を用いて抗体ン作成する方法は、いかなる従来技術
に従っても良いが、（例えば、パーカー（Ｐａｒｋｅｒ
　）のＲａｄ　ｉｏ　ｉｍｍｕｎｏａ−戊 ３ｇ５ｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　Ａｃｔｉ
ｖｅ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、　Ｐｒｅｎｔｉｃｅ　−Ｈ
ａｌｌ　（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ　Ｃ１）ｆｆｓ、　Ｎｅ
ｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　ＵＳＡ−１９７６）参照） 通常の場合、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモット（ｇｕ
ｉｎｅａ　Ｐｉｇ　）及びウマのような宿主動物に、免
疫原複合体を、通常、アジ−パントと混合した上で、１
以上の各種部位に注射する。

更に、同−又は異なる部位から規則的又は不規則的間隔
で注射を行い、しかる後、採血して、最適な力価に達し
たことか測定される１で抗体力価を調べる。宿主動物か
ら採血して適切な容量の特定の抗血清を得る。所望であ
れば、実際の分析を行う際に使用する抗血清として適切
であるか否かを判断する前に、精製工程において、非特
異的抗体のような望１しくない物質を除去してもよい。

抗体（例えば、通常、モノクローン抗体と称される抗体
）は、体細胞交配（融合）技術（ｓｏｍａｔｉｃ＆ｅｌ
ｌ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ　）により得ることもできる。（Ｌｙｍｐｈｏｏｙｔ
ｅ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、　ｅｄ−Ｍｅｌｃｈｅｒ％
ｅｔ　ａｌ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　（Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７８　）Ｎａｔｕｒｅ２６６　：
　４９５　（１９７７）、　５ｂｉｅｎｃｅ２０８　：
６９２（１９８０）、及び、Ｍｅｔｂｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ７３（ＰａｒｔＢ）’３−４６（１
９８１）参照）本発明で用いられる１、５−ＡＧ誘導体
は、一般式（１）で示される１、５−ＡＧの３位、４位
又は６位の一〇Ｈ基を介して側鎖乞導入した新規化合物
である。

Ｃ式中、Ｘ、　Ｙ、　Ｚのいずれか１つが弐Ａ−アルキ
レン−Ｂ−であり、他の２つは−ＯＨを示す。ここで、
Ａは−ＮＨ２又は−ＣＯＯＨを示しＢは一〇−又は−Ｃ
ＯＯ−を示し、アルキレンとしては炭素数が１〜１２の
もの乞示す。〕一般式げ）において、 アルキレンとしては、例えば、メチレン、エチレン、プ
ロピレン、ブチレンなど炭素数１〜１２程度のものがあ
げられる。これらは分枝していてもよく、炭素数２〜１
０程度のものが好１しく、より好１しぐは、エチレン、
プロピレン、ブチレンなどがあげられる。

本発明の一般式（１）の化合物としては１例えば１次の
第−表の化合物があげられる。

本発明のこれら化合物は次のようにして合成される。

即ち一般式（２） 〔式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３のいづれか−っが式Ａ−アル
キレン−Ｂ−であり、他の２つ及びＲ４はＡは−ＮＨ−
ＣＢ　Ｚ　、　−ＣＯＯＨ、又は−ＣＯＯＢｎ　？示し
Ｂは−〇−又は−〇〇〇−示し、アルキレンとしては炭
素数が１〜１２のものＺ示す。

’ｚり、ＣＢＺはベンジルオキシカルボニル、Ｂｎはベ
ンジル、Ｔｒはトリフェニルメチル、ＴＨＰはテトラヒ
ドロピラニルヲ表ス。〕で表わされる化合物を必要に応
じて酸加水分解あるいは接触還元に付し保護基ビ除去す
ることにより一般式（１）の１．５−ＡＧ誘導体乞得る
ことができる。

酸加水分解は、水溶媒中酸の存在下に２０〜１００°Ｃ
１好１しくは２５〜６０で１〜５時間時間桁えばよい。

酸としては、塩酸、硫酸などの鉱酸、ギ酸、酢酸、トリ
フルオロ酢酸などの０１〜Ｃ４の低級脂肪酸などが使用
でき、好）しいものは塩酸、酢酸などである。酸の添加
量は、鉱酸を使用する場合は反応液中の濃度が０．０１
〜５Ｎ、好ましくは０．１〜２Ｎ程度になるように、又
、脂肪酸を使用する場合は反応液中の濃度が５０％以上
、好１しくに６０〜８０％程度になるように添加すれば
よ（）。

接融還元は、通常溶媒中、触媒の存在下にノール、エタ
ノｑ客どのアルコール類、テトラヒドロフラン、ジオキ
サンなどのエーテル類、水、ジメチルホルムアミド、酢
酸などを必要に応じて単独もしくは混合して使用でき好
フしいものはメタノール、エタノールなどである。

ｌた触媒としては、パラジウム炭素、パラジウム黒、塩
化パラジウム、水酸化パラジウムなどが使用でき、好１
しぐはパラジウム黒。

塩化パラジウムなどである。触媒量は、原料化合物量の
１０〜２０％程度添加すればよい。

原料として使用される一般式皿の代表的化合物を次に示
す。

１だ、一般式■の化合物は、次の（■）。

（ＩＶ）　、　（Ｖ）のいずれかの反応経路７経て合成
される。

Ｂｎ ＯＲ３ 本発明の一般式（Ｔ）の化合物は１反応液より通常の方
法で単離、精製され遊離酸、遊離塩基として得られる、 〔効　果〕 次に本発明の効果につき実験例により説明する。

実験例　検量線の作成 試験管に、１．５　　ＡＧ又はグルコースの標品ｙｏ、
１％ＢＳＡ乞含むＰＢＳで連続希釈したサンプル０．１
　ｆｆ１ｌ、化合物４とＢＳＡの結合物を家兎に免疫し
て作成した１、５−ＡＧ抗抗血ビン０．１％Ｂ　Ｓ　Ａ
７含むＰＢＳで１０００倍希釈した溶液０．１ｍｌ、化
合物２とＨＲＰの結合物ｔ、）、Ｏ，Ｘ％ＢＳＡ’＆含
むＰＢＳで１０００倍希釈した溶液０．１　ｍｌ及び上
記の０．３％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキング処理し
たＤＡＳＰビーズ１個を加え４℃で一夜免疫反応した。

反応後ビーズを、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで４回洗
浄後−０，０５％のｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン
酸とｏ、ｏｏｔ％の過酸化水素を含む０．０５Ｍリン酸
緩衝１（ｐＨ７，０）（基質液）１ｍｌを入れた新しい
試験管に移し、３７℃で１時間酵素反応を行った。この
反応液に１．５％アジ化ソーダを含む０．２５　Ｎ水酸
化す）　ＩＪウム溶液（ストッパー　）　０．１　ｍ１
３加え反応停止後、ケイ光測定装置（富士レビオ社製、
Ａｕｔｏ　ＦＰ−１）　’ｉ用い、励起波長３１３ｒＩ
ｒｒ１）．検出波長４０５朋で反応液のケイ光強度を測
定し第１図の如く検量線を作成した。

第１図の１．５−ＡＧの検量線から明らかな様にこの測
定法での１．５−ＡＧの検出限界は０．１μｇ／ｍｌで
あり、充分臨床サンプル測定に応用できる感度乞もって
いた。

また、抗体のグルコースとの交差反応性はわずか０．２
％であった。

従って本発明の定量法は１．５−ＡＧの実用的な定量法
として利用できる。

なお上記実験例中で使用した化合物２とＨＲＰの結合物
は次の方法により作成した。

化合物２．　６．７■、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
７．３■及びＤＣＣ８，４Ｉｎｇを０．４　ｍｌ　ノジ
オキサンに溶解し、室温下に攪拌しながら５時間反応し
た。活性エステル化反応によって生じたウレイド乞濾過
によって除去し、さらに濾過残渣Ｙ　０．０５　ｍｌの
ジオキサン洗浄することにより、化合物２の活性エステ
ルのジオキサン溶液を得た。次に、　ＨＲＰ　（東洋紡
製、ＲＺ＝３．４１　）　２５−２■を０１）Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，５）　４．２　ｍｌで溶解した溶液に
、上記活性エステル溶液乞加え、室温下に攪拌しながら
５時間反応した。反応液中の沈殿物を遠心分離によって
除いてから、０．９％塩化ナトリウムを含む０．　ＯＩ
　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）（以下ＰＢＳというつ
に対して透析し、目的の結合物ビ得た。次にこの結合物
の溶液を限外濾過膜ＰＭＩＯをセフ）した濃縮装置？用
いて濃縮し、０．２μｍの濾過滅菌を行って１゜５−Ａ
ＧのＨＲＰ標識体４．４　ｍｌ　（ＨＲＰａ度６．１）
１）ｇ／ｍ１．タンパク回収率１００％、ＨＲＰ活性回
収率１００％）を得た。

又、ＤＡＳＰビーズは次の方法で作成した。

ＥＩＡ用ポリスチレンビーズ（積木製、６．５１７１）
１）’　）３００個を２％濃度のスコアロール９００（
花王製）に、室温下−夜浸漬した。次に、気泡が出なく
なる１で水洗し、水を十分切ってから濾紙上に広げ風乾
した。アフィニティー精製ヤギ抗ウサギＩｇＧＣＨ＆Ｌ
）抗体（ジャクソンイムノリサーチ社製）２■を、０．
１％アジ化ソーダを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，５）　１００ｍｌに溶解した溶液に、上記洗浄ビー
ズを漬け、室温下に２日間放置して抗体を物理吸着させ
た。

この様にして作成した第二抗体固相化ビーズ（以下ＤＡ
ＳＰビーズという）は使用前に０．３％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳ溶液に漬け、４５℃で１０時間インキュベートする
ことにより非特異吸着をブロッキングしＥＩＡに供した
。

以下、１．５−ＡＧ誘導体の作成、抗原の作成。

抗体の作成、１．５−ＡＧ免疫測定法の順に、具体例に
より本発明を詳述する。

実施例１．　１．５−アンヒドロ−６−０−グリシル−
Ｄ−グルシトール（表１の化合物１）の製造 参考例１に示した方法で得た１、５−ＡＧ誘導体（ｆｆ
Ｄ　４３４■とベンジルオキシカルボニルグリシン塩化
物３９７１）１ｇをジオキサン溶媒、ピリジンの存在下
、室温で２０時間攪拌した。反応液ヲ減圧下濃縮し、シ
リカゲルクロマトグラフィーにて精製を行い、２６６■
の油状物質を得た。このものは、重クロロホルムン用い
たＩＨ−ＮＭＲにおいて７．３　ｐｐｍに芳香族水素白
米の２０Ｈ分に相当するプロトンが観測された。マトリ
ックスとしてグリセリンおよびＤＭＳＯの混合物を用い
て正イオンおよび負イオンＦ　Ａ　Ｂ　−ＭＳを測定し
たところ、（λｉ＋Ｈ）に相当する６２６および、ＣＭ
　−Ｈ）−に相当する６２４を、おのおのの基準ピーク
として観測した。

次いで上記化合物２５０ｍｇをメタノール、酢酸、水の
混合液中、パラジウム黒暑触媒に用い接触還元ビ行い、
重水？用いた’Ｈ−ＮＭＲにてベンジルエーテル、ベン
ジルオキシカルボニル基に白米する芳香族水素の除去さ
れた標記化合物１０４ｍｇ乞得た。

化合物１は、マトリックスにグリセリンおよびＤＭＳＯ
の混合物を用い、正イオンＦＡＢ　−ＭＳ　Ｙ測定した
ところ、ＣＭ＋Ｈ）に相当する２２２に駁 基準ビークｙｔｍ測した。又、薄膜法によるＩＲにおい
て、１７５０　ｃｍ−’にエステルに基づく吸収、１６
３０　ｃｍ−’にアミンノ吸収、他ニ、１５１０、１４
２０．１２４０．１）００．１０５０ｃｍにそれぞれ吸
収が観測された。

実施例２．　１．５−アンヒドロ−６−０−（３−カル
ボキシ−プロピオニル）　−Ｄ−グルシトール（表１の
化合物２）の製造 ベンジルコハク酸クロリド３．１７ｇに３．５ｇの１．
５−ＡＧのＤＭＦ溶液（１０ｍｌ）乞０℃で加え、次い
で１．７ｇのジメチルアミノピリジン７加え、室温で１
５時間攪拌した。反応液を氷水で希釈し、酢酸エチル７
５ｍ１で２回抽出後、１規定塩酸洗い、水洗を行い、硫
酸ナトリウムで乾燥した。次いでシリカゲルクロマトグ
ラフィーにて精製７行い、６８０■の油状物質を得た。

上記化合物６５０ｍｇχ、メタノール、酢酸、水の混合
液中、パラジウム黒を触媒として接触還元を行い、標記
化合物４８０１）１ｇ乞得た。

化合化合は、実施例１と同様に正イオンＦＡＢ−ＭＳで
（Ｍ＋Ｊに相当する２６５に基準ビーフン、負イオンＦ
ＡＢ−ＭＳで（Ｍ−Ｈ）−に相当する１　０８０　ｃｍ
””にそれぞれ吸収が観測された。

実施例３．　１．５−アンヒドロ−６−０−力ルボキシ
メチルーＤ−グルシトール（表工の化合物３）の製造 二頭フラスコに水素化ナトリウム５３■ンとり、窒素気
流下、ＤＭＦ　］　Ｏｍｌを加え、攪拌しながら、参考
例１の方法で得られた１、５−ＡＧ誘導体（ＩＩＩ）　
４３０　ｆｆｌを加える。３０分攪拌後、クロル酢酸１
）３■乞加え、室温にて１５時間攪攪拌性った。反応液
に水７５ｍ１を加え、酢酸エチルで２回抽出を行った後
、飽和食塩水、次いで水で洗浄を行い、シリカゲルクロ
マトグラフィーにて精製を行い、１７０■の油状物質を
得た。このものは、正イオンＦＡＢ−ＭＳでＣＭ＋Ｈ釘
に相当する４９３に基準ピーク乞、負イオンＦＡＢ−Ｍ
ＳでＣＭ−Ｈ）−に相当する４９１に基準ピークを観測
した。

上記化合物１４０１）１ｇをメタノール、酢酸、水の混
合液中、パラジウム黒を触媒として接触還元を行い、標
記化合物５５ｒｒ＠を得た。

化合物３は、正イオンＦ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓで（Ｍ＋Ｈ
）”に相当する２２３に基準ピークを、負イオンＦＡＢ
−ＭＳでＣＭ−Ｈ）　　に相半する２２１に基準ピーク
を観測した。

又、薄膜法によるＩＨにおいて、３３５０゜２９３０．
１７４０．１２５０．Ｌｌ、００，１０６０ｃｍ”−’
にそれぞれ吸収が観測された。

実施ｆ９Ｕ　４．　１．５−アンヒドロ−６−０−（３
−カルボキシ−プロピル）−Ｄ−グルシトール（表１の
化合物４）の製造 二頭フラスコに水素化ナトリウム１．８０ｆｆ１ｇヲと
り、窒素気流下、ＤＭＦ　２０　ｍｌ　７加え、撹拌し
ながら、参考例１に示した方法で得た１、５−ＡＧ誘導
体（ＩＩＩ）　１．３　ｇを滴下する。３０分攪拌後５
−ブロムー１−ペンテン６７１■ヲ加工、室温にて１５
時間攪拌した。反応液に水７５ｍ１を加え２酢酸エチル
７５ｍ１で２回抽出を行った後飽和食塩水、次いで水洗
２行い、シリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行い
、１．０１ｇの油状物質？得た。

上記化合物９８０ｒｎｇを８　ｍｌのアセトンに溶解し
、攪拌を行いながら、１０ｍ１の水およびＢ　ｍｌのア
セトンに溶解した２、４ｇのＮａ　Ｉ　０４を滴下する
。次いで０℃に冷却しながら、４ｍ１の水に溶解した８
０ｑのＫＭｎ　０４ビ茄え、室温で１時間攪拌後、さら
に６００ｒｎｇのＮａＩＯ４を加え、１時間攪拌を行っ
た。反応液に１００ｍ１の水Ｚ加え、酢酸エチル７５ｍ
１で２回抽出乞行った後、飽和食塩水、次いで水洗後、
シリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行い、６６０
■の油状物質を得た。

上記化合物６３０ｍｇを、メタノール、酢酸。

水の混合液中、パラジウム黒を触媒に用い接触還元を行
い、標記化合物２９０１）１ｇを得た。

化合物４は、正イオンＦＡＢ−ＭＳで（Ｍ＋Ｈ）”に相
当する２５１に基準ピークを、負イオンＦ　Ａ　Ｂ　　
ｈｉ　Ｓで（Ｍ−Ｈ）　　に相半する２４９に基準ピー
クを観測した。

又、薄膜法によるＩＲにおいて、２９３０゜１７２０．
１４２０．１３７０，１２６０．１０８１０８Ｏ’にそ
れぞれ吸収が観測された。

実施例５．　１．５−アンヒドロ−４−０−（３−カル
ボキシ−プロピル）−Ｄ−グルシトール（表１の化合物
５）の製造 二頭フラスコに水素化ナトリウム１６９■をとり、窒素
気流下、ＤＭＦ　１０　ｍｌ　”；を加え、祷拌しなが
ら、化合物（ｆｖ）　１．２４　ｇを滴下する。３０分
攪拌後、５−７’ロム−１−ペンテン６３０■を加え、
室温にて１５時間攪拌した。反応液に冷水５０　ｍｌ　
ｔｇ加え、酢酸エチル７５ｍ１で２回抽出を行った後、
シリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行い、８５０
ｍｇの油状物質を得た。

上記化合物８２０Ｑ！を８　ｍｌのアセトンに溶解し、
撹拌を行いながら、１０ｍ１の水およびｆ３　ｍｌのア
セトンに溶解した１、４ｇのＮａ　Ｉ　０４　’ａ’滴
下する。次いで０℃に冷却しながら、４ｍｌの水に溶解
した５０■のＫＭｎ　Ｏ４を加え、室温で１時間攪拌後
、さらに、３５０ｍｇのＮａ　Ｉ　０４を加え、１時間
攪拌を行った。反応液を塩酸酸性にして酢酸エチルで抽
出を行った後、シリカゲルクロマトグラフィー７行い６
００■の油状物質を得た。

上記化合物５６０１）１ｇに８０％酢酸を加え。

６５℃で２時間攪拌乞行った。反応液に５０ｍ１の水馨
加え、酢酸エチル抽出を行った後、シリカゲルクロマト
グラフィーにて精Ｈｗ行い。

３２０■の油状物質化合た。

上記化合物２８０ｍｇ乞メタノール、酢酸、水の混合液
中、パラジウム黒？触媒に用いて接触還元を行い、標記
化合物１５０１）１ｇを得た。

化合物５は、正イオンＦ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓで（Ｍ＋Ｈ
）”に相当する２５１に基準ピークを、負イオンＦＡＢ
−ＭＳでＣＭ−Ｈ）−に相当する２４９に基準ピークを
観測した。

又、薄膜法によるＩＲにおいて、２９３０゜１７２０．
１４６０．１３８０ｃｍ”−’にそれぞれ吸収が観測さ
れた。

実施例６．　１．５−アンヒドロ−３−０−（３−カル
ボキシ−プロピル）−Ｄ−グルシトール（表１の化合物
６）の製造 二頭フラスコに水素化ナトリウム２００■をとり、窒素
気流下、ＤＭＦ　１０　ｍｌ　Ｙ加え、攪拌しながら、
化合物（Ｖ１７２０■を滴下する。３０分攪拌後、５−
ブロム−１−ペンテフッ４４ｍｇ？加え、室温にて１５
時間攪拌した。反応液に冷水５０ｍ１ｉ加え、酢酸エチ
ル７５ｍ１で２回抽出ビ行った後、シリカゲルクロマト
グラフィーにて精ｗｙｔ行い、５６０１）１ｇの油状物
質ン得た。

くり返し合成した上記化合物１．３ｇを、エタノールに
溶解し、触媒量の１）−）ルエンスルホン酸の存在下、
６５℃で１時間攪拌を行い、保護基を除去した。次いで
、参考例２と同様の方法で、２位、４位、６位の水酸基
馨ベンジル化した後、実施例４．５と同様に、　Ｎａ　
Ｉ　０４　、　Ｋ　Ｍｎ　０４処理乞行った後、パラジ
ウム熱触媒Ｚ用いて、接触還元？行い、標記化合物９０
■を得た。

化合物６は、負イオンＦＡＢ−ＭＳで（Ｍ−Ｈ）−に相
当する２４９に基準ピーク？観測した。

又、薄膜法によるＩＲにおいて、２９５０゜１７２０、
１２５０　ｃｍ−’にそれぞれ吸収が観測された。

実施例７．　１．５−アンヒドロ−６−０−（６−アミ
ノ−へキサノイル）−Ｄ−グルシトール（表１の化合物
７）の製造 参考例１に示した化合物（ＩＩＩ）　４３４■をピリジ
ン１０ｍ１に溶解し、室温にて、ベンジルオキシカルボ
ニル−ε−アミノカプロン酸クロリド５３５■Ｚ滴下す
る。室温にて１５時間撹拌した後、反応液に水７５１Ｔ
ＩＩ　’Ｑ加え、酢酸エチルで２回抽出７行い、シリカ
ゲルクロマトグラフィーにて精製馨行い、３６６■の油
状物質ビ得た。

得られた化合物を、メタノール、酢酸、水の混合液中、
パラジウム黒を触媒に用い接か還元ビ行い、標記化合物
１０４■を得た。

化合物７は、正イオンＦＡＢ−ＭＳで（Ｍ＋Ｈ）”に相
当する２７８に基準ピークを観測した。

又、薄膜法によるＩＲにおいて、１７４０゜１４６０．
１）００ｃｍ”−’にそれぞれ吸収が観測された。

実施例８．　１．５−アンヒドロ−６−０−（１）−ア
ミノ−ウンデカノイル）−Ｄ−グルシトール（表１の化
合物８）の製造 実施例７のベンジルオキシカルボニル−ε−アミノカプ
ロン酸クロリドをベンジルオキシカルボニル−１）−ア
ミノ−ウンデカン酸クロリド６３７■に変える以外、全
く同様に反応させ標記化合物４００１！Ｉｇを得た。

化合物７は、゛正イオンＦ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓで（Ｍ＋
Ｈ）＋に相当する３４８に基準ピークン観測した。

また、薄膜法によるＩＲにおいて、２９２５゜１７４０
．１４６０ｃｍ−’にそれぞれ吸収が観測された。

（２）抗原の作成 ハプテン抗原の作成法については、上述の様に種々の方
法が知られているが、ここでは−例として、抗原性キャ
リア物質としてウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す
）乞用い、１．５−ＡＧ誘導体げ）ン化学結合した場合
の例χ示す。

化学結合の方法は、１．５−ＡＧ誘導体（１）の導入側
鎖末端基〔一般式（１）のＡ〕によって異なるが、Ａが
アミノ基の場合は水溶性カルボジイミド法を用い、カル
ボキシル基の場合は活性エステル法によって直接ＢＳＡ
に結合した。しかし、化学結合の方法は、これによって
制限されろものではない。また、末端基ＡとＢＳＡの結
合に低分子化合物のスペーサーを介しても良い。

参考例１．　１．５−アンヒドロ−６−０−グリシドー
ル（化合物１）とＢＳＡ結合物の作成化合物１．１６１
ｎｇとＢ５Ａ２３．９　ｍｇを１．６　ｍｌ　ノ１／１
５Ｍ’）ン酸緩衝液（ｐＨ５，６）に溶解した。

これに、室温下に攪拌しながら、水溶性カルボジイミド
の塩酸塩２０８１）１８χ数回に分けてｍえｐＨ５〜６
乞保ちながら反応させた。さらに、室温下で一夜反応の
後、反応物乞生理食塩水に対して透析し、目的の結合物
ぞ得た。次に、これを限外濾過膜ＰＭＩＯ（アミコン社
製）乞セットした濃縮装置ビ用いて濃縮し、０．２μｍ
の濾過滅菌（ミリボア社製〕を行って免疫用の抗原とし
た。全工程でのタンパク回収率は８８％であった。

同様の方法を用いて化合物７及び化合物８のＢＳＡ結合
物も作成した。

参考例２．　１．５−アンヒドロ−６−０−（３−カル
ボキシ−プロピル）−Ｄ−グリシドール（化合物４）と
ＢＳＡ結合物の作成 化合物４，１４５．８ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミド１３４■、及びＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣ）１８０．３■を３．５ｍｌのジオキサ
ンに溶解し、室温下に撹拌しながら３〜４時間反応した
。活性エステルｆヒ反応によって生じたウレイド％濾過
によって除去し、さらに濾過残渣’４２　ｍｌのジオキ
サ／洗浄することにより、化合物・１の活性エステルの
ジオキサン溶液を得た。次に、ＢＳＡ’Ｙ　１５■／ｍ
ｌ濃度になる様に０．１　Ｍ　！ｊン酸緩衝液ｔｐＨ７
，５）で溶解したＢＳＡ溶Ｒ２５，７ｍｌに、上記活性
エステル溶液χ加え、室温下に攪拌しながら１夜反応し
た。

反応液中の沈殿物を遠・し・分離によって除いてから生
理食塩水に対して透析し、目的の結合物を得た。次に、
この結合物の溶液を限外濾過膜ＰＭ１０’＆セントした
濃縮装置？用いて濃縮し、０．２μｍの濾過滅菌ケ行っ
て、免疫用の抗原とした。全工程乞通してのタンパク回
収率は、９８％であった。

また、同様の方法により、化合物２．３．５及び６０Ｂ
ＳＡ結合物も作成した。

（３）抗体の作成 免疫原として参考例２、参考例３及びそれらの方法に準
じて作成した表１に示す一般式（１）のＢＳＡ結合物乞
用いて、家兎より公知の方法にてその１．５−ＡＧ抗体
？作成した。

実施例９゜ 隘４の化合物のＢＳＡ結合物を生理食塩水で希釈し、２
■／　ｍｌ濃度になる様に調整した。この溶ａ　１．５
　ｍｌに、１．５　ｍｌのＦｒｅｕｎｄｓ　ｃｏｍｐｌ
ｅｔｅ　Ａｄｊｕ−ｖａｎｔ　乞加えてよく混和し、こ
れ乞家兎（各抗原２〜３羽づつ）にｉｍｌ／羽づつ皮下
注射（１週間間隔、４回投与、その後２週間間隔、３回
投与）し充分に感作せしめ、その２週間後に採血し、こ
れを３０００　ｒｐｍ　Ｘ　１５分間遠心してその血清
ビ得、これを６０℃Ｘ３０分間熱処理した後−２０℃に
て保存し、各免疫原に対応する１、５−ＡＧ抗血清乞化
合。この血清に１．５−ＡＧに対する抗体が存在するこ
とはＢＳＡ？ｒ固定した樹脂に吸収させた後、ドントイ
ムノパインディングアノセイ法により確認した。

気１〜３．５〜８の化合物のＢＳＡ結合物を用い上記と
同様にして１．５−ＡＧ抗血清と得た。

（４１），５−Ａ　Ｇ免疫測定法 免疫測定法としては、上記のごとく、ＲＩＡ。

ＥＩＡ、、ＦＩＡ、ＬＩＡ等１等身種々法で測定可能で
あるが、ここでは−例として、ＥＩＡに応用した場合の
実施例を示し、また、ＥＩＡでの測定法としては、いわ
ゆる第二抗体固相法で競合法と云われるものの１例を示
した。

実施例１０゜ グルコースと１．５−ＡＧをそれぞれ１０μｇ／ｍ１，
１μｇ／ｍｌ含有するモデル被検液乞作成した。

これを実験例に示した「競合法による１、５−ＡＧのＥ
　Ｉ　ＡＪの方法に従って測定し、第１図の検量線ビ用
いて定量したところ、１．５−ＡＧの濃度は１，１重ｇ
／ｍｌであった。

一般式（２）の化合物の原料である一般式回の合成に心
機な化合物（Ｊｍ）、■）　、　（Ｖ）は、たとえば、
以下に示した反応式に従がって合成した。具体例として
（ｍ）の化合物の合成例馨示す。

参考例３．　１．５−アンヒドロ−２，３，４−トリー
〇−ベンジルーＤ−グルシトール（ｍ）　ノＭｌ　造１
．５−ＡＧ　３．２８　ｇ’ｆ２０ｍｌのピリジ／に溶
解し、水冷下、攪拌しながら、塩化トリチル６、１．２
　ｇχ滴下した。水冷下で１時間さらに室温で１５時間
攪拌した。反応液を２００　ｍｌの水で希釈し、１５０
ｍ１の酢酸エチルで２回抽出？行った後シリカゲルクロ
マトグラフィーにて精製を行い、７．４４ｇの６−ドリ
チルー１．５−ＡＧＶ得た。このものは、重クロロホル
ムヲ用いた’Ｈ−ＮＭＲで１．５−ＡＧのシグナルに加
え、７．３〜７．９　ｐｐｍに芳香族水素由来の１５Ｈ
分のプロトンが観察された。

二頭フラスコに水素化ナトリウム９００■をとり、窒素
気流下ＤＭＦを４０ｍ１加え、攪拌しながら、上記化合
物４．０６ｇを滴下する。３０分間室温にて攪拌後、５
．２　ｍｌの塩化ベンジル７滴下し、１５時間攪拌した
。反応液に水２００　ｍｌ乞加えて希釈し、４００ｍ１
の酢酸エチルで抽出７行った後、シリカゲルクロマトグ
ラフィーにて精製を行い、５．２７ｇの２．３．４−　
）ジベンジル−６−トリチル−１，５−ＡＧを得た。こ
のものは重クロロホルム７用いた’Ｈ−ＮＭＲで７．０
〜７、８　ｐｐｍに計３０Ｈ分の芳香族プロトンが観測
された。

上記化合物３．３３ｇを２０ｍ＋の８０％酢酸に溶解し
、６５℃で２時間攪拌した。

反応液？減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーに
て精製後、酢酸エチル、ｎ−ヘキサンより再結晶を行う
ことにより、１．４８ｇの無色針状結晶χ得た。

該化合物は融点８５〜８６°Ｃ乞示し１重クアポホルム
乞用いた’ＨＮＭＲにてδ１．８にＤ２０を加えると消
失するＩＲ分のプロトン、δ３．０〜４．２に８Ｈ分の
プロトン、δ４．４〜５．１に６Ｈ分のプロトン、δ７
．２８に１５Ｈ分のプロトンが観測された。又、ＫＢｒ
を用いたＩＲで、３３００．２９８０，２８７５．１５
００．１５０５．１）００にそれぞれ吸収アポした。

【図面の簡単な説明】

第１図は、１．５−ＡＧ抗体を用いたＥＩＡによる１、
５−ＡＧ及びグルコースの検量線を示したものである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）１，５−アンヒドログルシトール含有被検液に、
   １，５−アンヒドログルシトールに特異反応性を有する
   抗体と、標識した１，５−アンヒドログルシトールとを
   加えて免疫反応せしめ次いで、免疫反応によって生じた
   標識した１，５−アンヒドログルシトールと該抗体との
   結合物と、未結合の標識した１，５−アンヒドログルシ
   トールとを分離後、分離されたもののいづれか一方の標
   識を測定することによって該被検液中の１，５−アンヒ
   ドログルシトールを定量することを特徴とする１，５−
   アンヒドログルシトールの定量方法
2. （２）１，５−アンヒドログルシトールに特異反応性を
   有する抗体、
3. （３）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中、Ｘ、Ｙ、Ｚのいづれか１つが式Ａ−アルキレン
   −Ｂ−であり、他の２つは−ＯＨを示す。ここでＡは、
   −ＮＨ＿２又は、−ＣＯＯＨを示し、Ｂは−Ｏ−又は−
   ＣＯＯ−を示し、アルキレンとしては炭素数１〜１２の
   ものを示す。〕で表わされる新規１，５−アンヒドログ
   ルシトール誘導体。