JPS6367567A - クロマトカラムの洗浄方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明はクロマトカラムの洗浄方法に係り、詳しくは分
取（分！り操作を行った後、非目的成分が残留している
カラムから該非目的成分を除去して該カラムを再使用す
るための洗浄方法に関する。

［従来の技術］ クロマトグラフィー法で試料から目的成分を分難、回収
する場合、その目的成分が注入試料中、最後に溶出する
というまれなケースを除くと、分離終了時点で、目的物
質以上にカラム充填剤に保持され易い非目的成分がカラ
ム内に残存していることになる。

このような成分は、カラムを連続使用するうちに蓄積し
、分離性を低下させるだけでなく、ある時点から常時リ
ーク的に溶出するようになり、回収液の純度を下げる原
因にもなるので、悪影舌が出る前に、何らかの方法でカ
ラムを洗浄しなければならない。従来、分取用クロマト
カラムの洗浄は、溶離液を過剰にそのまま通液する方法
がとられている。

［発明が解決しようとする問題点］ カラム内に残存する非目的成分は、目的物質よりもカラ
ム充填剤への親和性の高い物質であるから、分取時に用
いた溶離液をそのまま通液しても、溶出に長時間を要し
、甚だ非効率的であると共に、溶離液も無駄になる。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は、クロマトカラムの分取時の反対方向に洗浄液
を通して洗浄するようにしたものである。

以下、本発明の構成につき、その作用と共に更に詳細に
説明する。

クロマトグラフィー法で目的成分を含む試料から目的成
分を単離、回収する場合、回収直後のカラム内には、目
的成分よりも充填剤に保持され易い成分が残存している
。その時点におけるカラム内の残存成分の分布状態の概
念図を第１図に示す。

第１図中Ａは、回収した目的成分に比べわずかに充填剤
への保持され易さが強い成分であり、Ｅは、カラム内残
存成分中で最も充填剤への保持され易さが強い成分であ
る。Ｂ％Ｃ％ＤはＡとＥの中間の保持され易さをもつ成
分である。

分離工程開始から終了（目的成分の回収終了）までにカ
ラムに通液した溶離液の量をＶとする。

溶離液をＶ流す間に、Ａ成分はａという距離だけ移動し
、同様にＢ成分はｂという距離を８勤し、Ｃ，Ｄ及びＥ
成分はＣ％ｄ、ｅという距離だけ移動した訳である。

そこで、分離終了時点から分離工程に対して向流になる
ように、分離工程の溶離液と同じものを通液すると通液
量がＶになった時に、Ａ−Ｅ各成分はａ　−ｅという距
離移動し、カラム末端（分離工程の入口）に達すること
になる。実際には、Ａ〜Ｅ各成分ともカラム内で拡散す
るので、洗浄通液量はＶだけでは不足するが、ＡＮＥ各
成分は、洗浄通液量Ｖの時にピークをもつ混合物となっ
てカラム末端′から排出される。このように、本発明に
よれば、少量の洗浄液で迅速に洗浄を行なえる。

本発明において、洗浄液としては分取に用いた溶離液で
良いが、他の液でも良い。溶離液を用いる場合、分取時
の溶離液よりも溶離力が強くなるよう溶媒の濃度を調整
したものを洗浄用薬剤として用いることができる。（Ｏ
ＤＳによる逆相クロマトや吸着樹脂、活性炭などによる
吸着クロマトでは、溶媒の濃度を高くシ、アミノプロピ
ル担持カラムによる順相クロマトやイオン交換樹脂とア
ルコールによる分配クロマトでは溶媒の濃度を低くすれ
ばよい。）この際の濃度は、カラム内の残存物質の保持
力を十分弱められる濃度であれば特に制限はない。例え
ば、吸着クロマトの場合、洗浄液として、溶離液の１０
倍程度（溶離液が２％Ｅ　ｔＯＨなら洗浄液は２０％Ｅ
ｔＯＨ）にするといった具合で行う。ただし、溶媒濃度
の変更によって、カラム内残存物質が析出等を起こさな
い範囲で行うように注意する。

分取時の溶離液をそのまま洗浄液として用いた場合の洗
浄効果は、特に洗浄用に、残存成分の溶離力を強めるよ
う濃度をかえた洗浄液を使用した場合に比べてやや劣る
が、分取目的物質の要求純度がある水準以下であれば末
男式は十分に活用できる。（例えば、目的分取回収域の
濃度がＣｐｐｍである場合、洗浄後のカラムからの残存
物質の常時リークがＣ／　１００　ｐ　ｐ　ｍ以下であ
れば、残存物質の混入による目的物質の純度低下は１％
以下となる。） 洗浄に必要な量（洗浄剤の溶離力が強いほど必要液量は
少なくて済む）を注入した後は、分離に用いる溶離液で
洗浄剤を押し出し、カラムを安定化させる。

流速は、洗浄効果が得られる範囲であれば特に制限はな
い。分離と同じ流速でもよいし、洗浄効果を上げるため
により低流速にしてもよい。押し出し後の安定化を早く
済ませたい時は、流速を適当に上げてもよい。

温度は高いほど、保持されている物質が溶離し易くなる
ので、可能であれば、洗浄時は多少高温にするのが好ま
しい。しかし分離工程と同温でもかまわない。

本発明は、カラム全体を洗浄する方法としても適用でき
るが、直列に複数個のカラムを接続した場合に最後段又
は該最後段から複数番目までの後続側カラムのみを洗浄
する方法としても適用できる。以下に、この具体的態様
について図面を参照して説明する。

第２図は２連カラムの場合の概念図である。

（１）は、目的物質回収直後のカラム内の状態を示して
いる。カラム内のＡ％Ｂ、Ｃ％Ｄはそれぞれ残存成分で
あり、充填剤への保持され易さは、Ｄ＞Ｃ＞Ｂ＞Ａ＞目
的物質の順である。

前出の自流洗浄法では、ここでＡ−Ｄすべてを洗浄して
いたが、本方式では、図に示す第２塔のみを洗浄する。

洗浄法は、前出向流洗浄法が好ましい。この時、２連力
ラム両方をまとめて洗浄する場合に比べ、流速は同等で
洗浄液（分離工程に用いた溶離液の濃度を変えたもの）
は半分の量という条件でよい。ゆえに洗浄に要する時間
は２塔とも洗浄する場合の局となる。洗浄の概念図を（
２）に、洗浄後の状態を（３）に示す。

洗浄後は前Ｒｕｎと同様に分離工程に移る。２Ｒｕｎ目
の分離工程終了（目的物質回収）直後のカラムの状態を
（４）に示す。Ａ’　、Ｂ’、Ｃ’、Ｄ’　は、各々、
Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄと同一の残存物質、ただし２Ｒｕｎ目の
分離工程に由来するものである。この時点で、ＩＲｕｎ
目の分離工程に由来する残存物質Ｃは第２洛全体にわた
って、またＤは第１塔全体にわたって分布することにな
る。このようにＣもＤもカラムから溶出しないので、２
Ｒｕｎ目の目的物質の純度を下げることはない。（実際
には、２Ｒｕｎ目の試料による押し出し効果があるので
、Ｃはわずかにカラムからリークする可能性がある。） ここで再度２塔目のみを自流洗浄すると、洗浄後は（５
）に示すような状態になる。次に３Ｒｕｎ目の分離工程
を行う。目的物質回収直後のカラムの状態を（６）に示
す。ここでもＩＲｕｎ目、２Ｒｕｎ目に由来する残存成
分が溶出することなく、目的物質の純度が保たれること
がわかる。

このように２塔式の場合は、常に後段の塔を十分に洗浄
しておけばよといえる。ただし、工塔目の残存成分（こ
こではＤ％Ｄ’、Ｄ″）が過剰に蓄積すると、１塔目の
分列性が低下するので、そうなる前に１塔目も洗浄する
ことが好ましい。この場合の洗浄は、通常の洗浄よりも
薬剤を多めに使うようにする。

また、２Ｒｕｎ目以降は２塔目にＣ成分が存在し、３Ｒ
ｕｎ目以降は２塔目にＣ及びＤ成分が存在するようにな
るので、Ｒｕｎ−１後に比較して洗浄液量を少し多口に
すると確実な洗浄ができる。

ここでは２塔直列の場合を示したが、２塔以上の直列カ
ラム使用の場合にも、もちろん応用できる（例えば４塔
の場合は、後段の２塔のみを洗浄するといった具合に。

３塔の場合には、後段の２塔を洗浄すると１塔目の残存
成分のリークが確実に防げる）。　　ノ ［実施例］ 実施例１（マルトオリゴ糖（Ｇ＋も含む）混合液から０
５を単離回収する吸着クロマト システムへの適用例） Ｇ　ｒ　−０２１程度のマルトオリゴ糖混合液を吸着樹
脂を充填したカラムでクロマト分離し、Ｇ５の分取を行
った。

注入全糖量は、８ｇ糖／１−Ｒであったのに対し、クロ
マト分離終了（Ｇｓ　１５．回収終了）までにカラムか
ら溶出した糖は、６，８ｇ糖／２−Ｒであった。注入量
と溶出量の差１．２ｇ！／λ−Ｒは、なおりラム内に残
存している糖の量であり、その内容はＧ５よりも充填剤
に吸着し易い０６〜Ｇ　２０と予想された。

洗浄例−１（比較例） 分離工程終了後、そのまま分離工程と同士〜２倍量の溶
離液を流し続けた。

このパターンで８サイクル分離工程を行ったところ、２
サイクル目から、６６以上の成分の常時リークが認めら
れ、回収Ｇ５域の純度を低下させた。１サイクル目では
９５％純度の０５を回収したが、８サイクル目では同じ
範囲（１サイクル目の９５％域）を回収したところ、そ
の０５純度は８９％であった。純度低下分は０６以上の
常時リーク成分であった。

洗浄例−２（本発明例） 分離工程終了後、溶離液の濃度を１２．５倍にしたもの
を洗浄液として、向流洗浄を行った。

分離工程溶離液：　０，８％ＩＰＡ （イソプロピルアルコール） 洗浄液　　　　：１０％ＩＰＡ 洗浄液注入量を５０ｍ１−ＩＰＡ／］−Ｒとして、注入
後、分離工程溶離液で押し出し、安定化を行った。

このパターンで分離、洗浄を繰返したところ、１０サイ
クル目においても、１サイクル目と同様の分離性が得ら
れ、９５％純度の０５の安定した回収ができた。

分離工程と洗浄工程を同流速で行ったところ、洗浄開始
からカラム安定化までに要する時間は約９時間であった
。末男式では洗浄に必要な全ＩＰＡ量は、７５．６ｍＡ
　・Ｉ　ＰＡ／Ａ　−Ｒであフた。

洗浄例−３（本発明例） 分離工程終了後、通液の向ぎだけを逆にして、分離工程
の溶離液を分離工程と同流速で流した。

この洗浄工程の糖溶出曲線を第３図に示す。

なお、分離工程は５Ｖ＝０．４Ｈ−’で７時間であった
。

第３図に示すように、分離工程と同じく、５Ｖ＝０４Ｈ
−’Ｃ−７時間（２，８Ｂ、Ｖ、）通液した時点にピー
クをもつ糖の溶出曲線が得られた。洗浄開始後１７．５
時間（７，０Ｂ、Ｖ、）で糖濃度は３０ｐｐｍを割った
。

この分離工程の回収域のｉ濃度は約３０００ｐｐｍなの
で溶離液中に３０ＰＰｍの不純物が含まれていても、そ
れによる純度低下は１％である。そこで、−このレベル
（３ｏｐｐｍ）を洗浄終了レベルとした。

分離工程とここに示す洗浄とを繰返すパターンを３サイ
クル行ったところ、分随工程回収域の０５純度は １サイクル目　９５．３％ ２　　〃　　　　　９４．５％ ３／／　　　　　　９４．６％ であった。要求純度次第では十分に適用可能な洗浄法で
あることが確認された。なお、このやり方では洗浄に必
要なＩＰＡ量は５６ｍＪ！−ＩＰＡ／Ａ−Ｒであった。

洗浄例４．５ 実施例１の洗浄例−２において、自流洗浄時の洗浄液流
入量を３０ｍ１−Ｉ　ＰＡ／−Ｒ（洗浄例−４）及び８
０ｍｕ　−Ｉ　ＰＡ／Ｊ、　−Ｒ（洗浄例−５）と変え
たこと以外は、同様にして自流洗浄を行った。

向流洗浄後のカラム溶出液の糖濃度は第１表のようにな
った。

第　　１　　表 これらから洗浄剤を５０ｍｆｔ−Ｉ　ＰＡ／１−Ｒ以上
用いて向流洗浄を行えば、カラム内に残存する糖を殆ど
なくすことができると推定できた。

第４図に洗浄剤注入量５０ｍＪ２−ＩＰＡ／β−Ｒで向
流洗浄を行った時の糖及びＩＰＡの溶出曲線を示す。

［効果］ 以上の実施例からも明らかな通り、本発明によれば少ユ
の洗浄液で短時間に効率良くカラム洗浄をなすことがで
きる。

本発明方法を分離操作の合間に適宜（分子ｆｉ［ｔ　１
〜数サイクル毎に洗浄１回）行うことにより、クロマド
カラムは清浄に保たれ、安定した分離性が確保される。

また、残存（蓄積）物質のリークによる目的物質の純度
低下も防止できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は分離工程後のカラム内の成分分布を示す模式図
、第２図は本発明の詳細な説明するカラム内の成分分布
説明図、第３図及び第４図は実施例において得られた溶
出曲線図である。 １・・・第１カラム、　　　　２・・・第２カラム。 代理人　　弁理士　　重　野　　剛 第１図

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）クロマトカラム内を洗浄する方法において、クロ
   マトカラムの分取時の通液方向と反対方向に洗浄液を通
   して洗浄することを特徴とするクロマトカラムの洗浄方
   法。
2. （２）洗浄液は分取時の溶媒である特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。
3. （３）洗浄液の溶媒は、分取時の溶媒と濃度が異なる同
   種のものである特許請求の範囲第２項に記載の方法。
4. （４）洗浄液をクロマトカラムに通液した後、分取時の
   溶媒を通液して洗浄液を押し出す特許請求の範囲第３項
   に記載の方法。
5. （５）クロマトカラムは複数のカラムが直列に接続され
   て成り、洗浄は最後段のカラムもしくは該最後段側から
   複数番目までの後続側のカラムを洗浄するものである特
   許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載
   の方法。