JPS6367139B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は試料中の過酸化反応性活性物質の測定
に関する。更に詳しくは、本発明は試料中に存在
することがあるアスコルビン酸により起り得る悪
影響に抵抗する、前記のような測定用の試験具に
関する。 尿、糞便懸濁物、及び胃腸管内容物のような試
料中の過酸化反応性活性物質の存在を検出するの
に、現在利用できる方法は数多い。ヘモグロビン
やその誘導体は、ペルオキシダーゼ酵素と同じ様
に挙動するので、かかる「過酸化反応性活性」物
質の典型である。このような物質は、擬ペルオキ
シダーゼ（pseuperoxidases）とも呼ばれてい
る。過酸化反応性活性物質は、過酸化物と、ベン
ジジン，ｏ−トリジン、３，3′，５，5′−テトラ
メチルベンジジン、２，７−ジアミノフルオレン
あるいは類似の指示薬物質のような指示薬化合物
との間のレドツクス（酸化還元）反応を触媒し、
それにより変色のような検出可能な応答を生ずる
点において、酵素に似ている。したがつて、試料
中の潜血の存在を測定する方法のほとんどは、こ
の擬ペルオキシダーゼ活性によつている。 発色指示薬の過酸化反応性酸化に対する酵素様
触媒作用に基づくいくつかの方法が、ここ数年に
わたつて開発された。これらは、主として、湿式
の化学的手法と「浸漬−読取り」式の試薬担持試
験片を含んでいる。前者の典型例は、リツチヤー
ド・エム・ヘンリーほかの『ケミカル・ケミスト
リー・プリンシプルズ・アンド・テクニークス』
（ハガースタウン、メリーランド：ハーパー・ア
ンド・ロー、1974）、1124〜1125頁〔Richard M.
Henry，et al.，Chemical Chemistry
Principles and Techniques（Hagerstown，
Maryland：Harper and Row，1974），pp.1124
−1125〕に記されている。この方法は、氷酢酸
（緩衝剤）、ジフエニルアミン（指示薬）及び過酸
化水素の使用を伴う。このような湿式法は良い分
析能力を示したが、それにも拘らず明らかな欠点
を伴つた。それらのうち小さからざるものが、試
薬の安定性が乏しいこと、感度が不十分なこと、
及びアスコルビン酸塩の妨害を受け易いことであ
る。 過酸化反応性活性物質を測定する第２の方法で
あつて、現在ほとんどの臨床の試験者や分析者に
より好まれているものは、所謂「浸漬−読取り」
試薬片を利用している。このような試験具の典型
が、マイルス・ラボラトリーズ・インコーポレー
テツド（Miles Laboratories，Inc.）のエーム
ス・デイビジヨン（Ames Division）で製造さ
れ、ヘマステイツクス（HEMASTIX ）の商
標名で販売されている試薬片である。これらは、
本質的に、プラスチツクの細片即ち把手にはり付
けられた多孔性の紙マトリツクスからなる。この
マトリツクスには、有機ヒドロペルオキシドとｏ
−トリジンの緩衝化された混合物が含浸されてい
る。ヘモグロビン、ミオグロビン、赤血球、ある
いは他の擬ペルオキシダーゼを含む液に浸漬する
と、マトリツクスに青色が発現し、その強度は試
料中の過酸化反応性活性物質の濃度に比例する。
そこで、マトリツクスに発現した色を標準色票と
比較することによつて、試験者は試料中に存在す
る分析対象物の量を半定量的に測定することがで
きる。 試薬片の湿式の化学方法に対する利点は、主と
して二つある。即ち、試薬片は試薬の調製も付属
の装置も不必要なので使用が容易であること、並
びに試薬の非常に高い安定性が得られ、その結果
精度、感度及び経済性が改善されることである。 しかし尿分析の場合、最近普及しているダイア
ツトが高単位のビタミンＣ（アスコルビン酸）を
含んでいるために、潜血のような尿成分の分析上
重大な問題が招来されるに至つた。というのは、
このような食事をとる患者の尿中アスコルビン酸
塩のレベルが異常に高くなつており、かつ、アス
コルビン酸塩がこの試験を妨害するからである。 アスコルビン酸塩のような還元剤の悪影響は、
早くも1938年に、Ｒ・コーン（R.Kohn）とＲ・
Ｍ・ワトラス（R.M.Watrous）−Journal of
Biological Chemistry，124，163−168（1938）−
により認められていた。同じ問題がなおこの分野
の分析を悩ましていることが、尿中の潜血（擬ペ
ルオキシダーゼ）分析を行う際に潜血測定の精度
を計測するためにアスコルビン酸塩の分析を同時
に行うべきだという1979年の提案により、証明さ
れた。Ｌ・ニールセン、Ｐ・Ｊ・ジヨルゲンセン
及びＡ・Ｃ・ハンセン、『ウゲスクリフト・フオ
ー・レーゲル』、141，791−793（1973）〔L.
Nielsen，P.J.Jorgensen and A.C.Hansen，
Ugeskrift for Laeger，141，791−793（1979）。〕 他の試験系、例えばグルコース感応性試験系に
関してアスコルビン酸塩の妨害を除去する試みが
多数文献に報告されているが、過酸化反応性活性
物質の測定がこれらの悪影響を免れるのに成功し
たという試みは今日までまつたく報告されていな
い。グルコース感応性の系に関して、アスコルビ
ン酸塩が試薬に到達する前に去することから、
アスコルビン酸塩をその場で分解するために酵素
を利用することにまでわたつて種々の試みがなさ
れている。 1970年６月16日にダールクビスト（Dahlqvist）
に発行されたカナダ国特許第844564号は、尿又は
他の媒体中のグルコース測定用試験具であつて、
通常のグルコース応答性試薬が含浸された多孔質
部分のほかに、尿試料を受ける付加部分を備えた
試験具を開示している。試料受容部分はイオン交
換材料から成り、その試験具におけるそのただひ
とつの機能は尿試料中に存在することがあるアス
コルビン酸塩を吸収することである。 アスコルビン酸塩の妨害を軽減する別の方法が
米国特許第4168205号に示されているが、これは
1979年９月18日にダンニンガー（Danninger）ほ
かに発行された。この引用例はアスコルビン酸オ
キシダーゼを試薬配合物中に含ませることを教示
しており、その理論は、もし試料中にアスコルビ
ン酸塩が存在しても、それは酵素によりデヒドロ
アスコルビン酸塩即ち所望の分析に悪影響を及ぼ
さない化合物に酸化されるということである。 1968年11月19日にクー（Ku）に発行された米
国特許第3411887号には、グルコースオキシダー
ゼのような酵素的酸化性物質に基づく試薬系を用
いてアスコルビン酸塩の妨害を除去する方法が記
載されている。これには、アスコルビン酸塩“捕
促系”が使用されている。これは、“イオン化し
た状態の時に、酸化還元電位E゜_redがレドツクス
指示薬染料のそれと……アスコルビン酸塩のそれ
との間になる、イオン化可能な重金属化合物”を
含んでいる。コバルト、鉄、水銀及びニツケルを
初めとする、多くの金属が例としてあげられてい
る。 これらの研究に加え、グルコース試験に関する
アスコルビン酸塩の問題に対する考慮が、次の
人々により明らかにされている。 １ Ｈ・ギフオード（H.Gifford）ほか、J.
Amer.Med.Assoc．，178，149〜150（1961）． ２ Ｐ・オゴルマン（P.O′Gorman）ほか、Brit.
Med.J.，603〜606（1960）． ３ Ｒ・ブラント（R.Brandt）ほか、Clin.
Chem.Acta，51，103〜104（1974）． ４ Ｒ・ブラント（R.Brandt）ほか、Am.J.
Clin.Pathol．，68，592〜594（1977）． 上に引用したクーの米国特許と同様に、他の引
用例もコバルトを使用する、アスコルビン酸塩の
錯化や酸化を扱つている。G.ブラガノーロ（G.
Braganolo）は、アスコルビン酸の溶液は金属コ
バルトの存在下で酸化されることを報告した
（Ann.Chim.Applicata，31，350〜368，1941）。
類似の作用が、Co（NH₃）₆Cl₃についてトモキ
チ・イワサキ（Tomokichi Iwasaki）により、
ジヤーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサエテイ・
オブ・ジヤパン、63巻、820−826頁（1942）
〔Jornal of the Chemical Society of Japan，
63，820−826（1942）〕に報告されている。 注目すべきことには、先行技術がグルコース分
析を広範に取扱つているにも拘らず、ペルオキシ
ダーゼや潜血（ヘモグロビン）のような過酸化反
応性活性物質の測定に伴うアスコルビン酸塩妨害
の問題の解決策に関しては、提案がなされていな
いように思われる。米国特許第3411887号（上述
参照）の開示にもかかわらず、先行技術は、金属
イオン、例えば、Co（）が事実上擬ペルオキシ
ダーゼであることを、はつきりと示している。例
えば、酢酸コバルト（）は、クメンヒドロベル
オキシドを触媒的に分解するのに、実際に用いら
れている。メルク・インデツクス９版（The
Merck Index，9th Ed.），311頁（1976）。一連
のCo（）錯体が過酸化物を触媒的に分解するこ
とが、Kh.ロース（Kh.Lohs.）により報告されて
いる。（Monatsber.Deut.Akad.Wiss.Berlin，８，
657−659（1966））（Chemical Abstracts，67，
120383z，1967参照）。 上述したように、本発明は、過酸化反応性活性
物質の測定系として現在の技術水準にあるものの
改良に関している。このような測定系は、クメン
ヒドロペルオキシドのような有機ヒドロペルオキ
シド、およびｏ−トリジン又は３，3′，５，5′−
テトラメチルベンジジンのようなレドツクス指示
薬を必ず備えている。分析対象物は、酵素ペルオ
キシダーゼに似ているため、指示薬と有機ペルオ
キシド間の呈色反応を生起させるが、その呈色の
強さは分析対象物の濃度の指標となる。Co（）
錯体により示されるペルオキシダーゼ活性を、先
行技術が明確に示していることに照らせば、当業
者がかかる物質が過酸化物／指示薬系と共存し得
ることを予測し得ないことは明らかである。分析
対象物の存在下で変色するように設計されたまさ
にそのような試薬組成物に分析対象物を加えたな
らば、誤つた正の結果が得られるであろうことが
予測される。これらの結論にも拘らず、驚くべき
ことに、過酸化反応性活性のCo（）錯体が誤つ
た正の結果を与えないばかりか、試薬系を事実上
改善して一層信頼できるものとすること、すなわ
ち、精度不良をもたらすアスコルビン酸塩の妨害
に対してより不感応なものとすることが、わかつ
た。 簡単に述べると、本発明は、試料中の過酸化反
応性活性物質の存在を検出する試験具に関し、そ
の構成は試料中に存在するアスコルビン酸の妨害
作用に抵抗するものである。更に、この試験具の
製造方法も、同様に、ここの開示する発明の範囲
に属する。この試験具は、有機ヒドロペルオキシ
ドと、過酸化反応性活性物質及び過酸化物の存在
下で変色のような検出可能な応答を呈することが
できる指示薬とが含浸された担体マトリツクスか
らなる。更に、このマトリツクスは、Co（）の
錯体と次式の構造： （式中、Ｒは置換された又は非置換の炭素環式
又は複素環式残基である。この環は４〜７個の原
子を有する。） を有する化合物であつて、６−メトキシキノリ
ン、５，６−ベンゾキノリン、４−アザフルオレ
ン、10H−ピリド［３，２−ｂ］−［１，４］ベン
ゾチアジン、６−ヒドロキシキノリン又はこれら
の混合物が包含されている。 試験組成物に使用されるべき有機ヒドロペルオ
キシドは、多くの周知の有機ヒドロペルオキシド
から選択することができる。しかし、それは、指
示薬の存在下で過酸化反応性活性物質と相互作用
して、変色あるいは試験組成物により吸収されも
しくは反射される光量の変化のような検出可能な
応答を生ずることができるものでなければならな
い。ヒドロペルオキシドの中で、ｔ−ブチルヒド
ロペルオキシド、クメンヒドロペルオキシド、ジ
イソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、２，
５−ジメチルヘキサン−２，５−ジヒドロペルオ
キシド、パラメタンヒドロペルオキシド又はこれ
らの混合物が好適であるとわかつた。これらの中
でも、クメンヒドロペルオキシドが最も好ましい
ことがわかつた。 有機ヒドロペルオキシド及び過酸化反応性活性
物質の存在下で検出可能な応答を生ずることがで
き、それ故、本発明の使用に適する指示薬は多数
存在する。これらの大部分は、所謂“ベンジジン
型”の化合物である。これらの典型的なものが、
ベンジジン，ｏ−トリジン、３，3′，５，5′−テ
トラ（低級アルキル）ベンジジン、２，７−ジア
ミノフルオレン又はこれらの多様な割合の混合物
である。上記の“低級アルキル”は、炭素原子数
１〜６個を有するアルキル基を意味し、メチル、
エチル、ｎ−プロピル、及びイソプロピル、更に
種々の、ブチル、ペンチル及びヘキシルの異性体
を含む。 本発明に有用なCo（）錯体には、Co
（NH₃）₆Cl₃，アセチルアセトナトコバルト（）、
〔Co（NH₃）₅H₂O〕Cl₃，〔Co（NH₃）₅CO₃〕NO₃，
〔Co（NH₃）₄CO₃〕NO₃・3H₂Oなどが含まれる。
勿論、多くの他のコバルト（）錯体がここに開
示する発明に適用できることがわかつている。
Co（NH₃）₆Cl₃が優れた結果を与え、アスコルビ
ン酸塩による妨害を低減させるのに好ましい錯体
であることがわかつた。本発明の好ましい実施態
様においては、組成物はクメンヒドロペルオキシ
ド、３，3′，５，5′−テトラメチルベンジジン及
びCo（NH₃）₆Cl₃からなる。 本発明の縮合化合物は、次の構造： を有するものであつて、該構造式におけるＲに関
する片側部分が次式： のものである。 試験具の製造には、組成物を適切な担体マトリ
ツクスに包含させることを含んでおり、後者のマ
トリツクスは種々の形態をとることが可能であ
る。すなわち、米国特許第3846247号はフエルト、
多孔質セラミツク片、及びグラスフアイバーの織
布又は不織布の使用を示している。更に、米国特
許第3552928号は、木片、布、海綿質材料及び陶
土質の物質の使用を教示している。合成樹脂のフ
リース及びグラスフアイバーのフエルトを担体マ
トリツクスとして使用することが、英国特許第
1369139号に示されている。別の英国特許第
1349623号は、下地層の紙マトリツクスの被覆と
して、細繊維からなる光透過性網の使用を提案し
ている。ポリアミド繊維がフランス国特許第
2170397号に教示されている。しかし、本発明に
対するこれらの教示の有用性にも拘らず、当該技
術において担体マトリツクスとして専ら使用され
る材料であつて、本発明に特に適するものは、
紙のような吸収性の紙である。このようにして担
体マトリツクスとして使用する適切な材料につい
ては広範な選択の余地があつて、更にマトリツク
スは様々な物理的形態をとることができる。これ
らの型のすべてが本発明の範囲内にあるものであ
る。 本発明の諸成分は、様々な方法で担体マトリツ
クスに包含させることができる。それらは、水、
ジメチルホルムアミド、クロロホルム、メチレン
クロリド、メタノール、シクロヘキサン、又はそ
れらの混合物のような適当な溶媒に溶解しあるい
は懸濁させることができる。それから、このよう
な溶液又は懸濁液は、(a)紙に含浸させるため
に、又は(b)試薬を適当なマトリツクスに捺染する
インクとして使用することができ、あるいは(c)担
体マトリツクスを、例えば、ドクター・ブレード
を用いて組成物で被覆することができる。担体マ
トリツクスに接触させるこれらの方法及び他の方
法は、本願発明の範囲内にある。 現在のところ好ましい方法は、紙に組成物の
溶液又は懸濁液を含浸させる方法であり、好まし
い溶媒は単独で使用されあるいはジメチルホルム
アミドと混合して使用される蒸留水又は脱イオン
水である。含浸は、紙片を適切な溶液に浸し、
次いで浸した紙を空気浴内で乾燥することによ
り行うことができる。次に、乾燥した紙を一辺約
0.5cm寸法の正方形に切断し、寸法約0.6×10cmの
ポリスチレンフイルム片の一端に貼り付ける。貼
り付けは、両面接着テープ、例えばスリーエム社
（3M Co.）から入手できダブルステイツク
（Double Stick）として知られるもの、を使用し
て行うことができる。 試験具の構成上、有機ヒドロペルオキシドと指
示薬を第１の混合物すなわち溶液として紙に導
入する方法が特に好ましい。続いて、Co（）錯
体と縮合環化合物を第２の水性混合物すなわち溶
液として適用するが、各溶液の適用後乾燥を行な
う。アスコルビン酸塩に対する抵抗性は、Co
（）錯体を第１浸漬として適用するか、あるい
は全成分を一緒に混合して単一の浸漬液とするよ
うな方法によつても得られるが、前記のような２
回浸漬法、すなわちCo（）錯体を第２浸漬液と
して担体マトリツクスに含浸する方法が好ましい
ことがわかつた。 ここに開示した発明の概念及び利点を更に説明
するために、次に実施例を示す。これらは本発明
の実施方法及び使用方法を示すものであり、本発
明が実現したアスコルビン酸に対する抵抗性の改
善を実証する比較データを示し、またこれらは、
本発明の現に好ましい実施態様を説明している。
しかし、これらの実施例は、本発明の範囲をどの
ような意味においても限定するものとは解釈され
るべきではない。 実施例 本発明の試験具を製造するのに、種々のCo
（）錯体と同様、種々の縮合環化合物を使用し
た。そして、これらを、種々の濃度のアスコルビ
ン酸塩と潜血を含んでいる尿試料について試験
し、試験具の有効性に対するアスコルビン酸塩の
影響を測定した。最後に、試薬を担体マトリツク
スに適用する順序とそれがアスコルビン酸塩の妨
害に対する試験具の抵抗性に及ぼす影響を検討す
るために実験を行つた。 Ａ 種々の縮合環化合物 実施例 ６−ヒドロキシキノリン この実験は、６−ヒドロキシキノリンを使用す
る試験具の製造を説明する。 Co（NH₃）₆Cl₃0.12ｇを蒸留水80mlに混合して第
１浸漬溶液を調製した。次に、４×４インチ
（10.2×10.2cm）寸法の正方形のイートン・アン
ド・ダイクマン（Eaton and Dikeman）紙
（No.222）を第１浸漬溶液に浸漬し、空気浴中で95
℃、10分間乾燥させた。 第２浸漬溶液を、次の成分を列記した順序で混
合することにより調製した。 蒸留水 35ml^* クエン酸ナトリウム 1.50ｇ^** クエン酸 1.92ｇ トリエタノール・ホウ酸塩 3.5ｇ エチレンジアミン四酢酸（四ナトリウム塩）
0.10ｇ メチルスルホン 4.66ｇ ドデシル硫酸ナトリウム 0.52ｇ ジメチルホルムアミド 35ml^*** ３，3′，５，5′−テトラメチルベンジジン
0.42ｇ^*** クメンヒドロペルオキシド 1.4ｇ ＊ ミリリツトル ＊＊ グラム ＊＊＊ これらの成分は混合物に加える前に一
緒にした。 この溶液10mlに、６−ヒドロキシキノリン
0.036ｇを加えた。 次いで第１の浸漬残渣を含む方形状紙を第２
浸漬溶液10mlに浸漬し、空気浴中で、95℃、10分
間乾燥させた。 含浸乾燥させた一辺0.6cmの正方形の紙を、
0.6×10cm寸法のポリスチレンフイルム片の一端
に、両面接着テープ（3M Company，Double
Stick415）を用いて貼りつけ、試験具を組立て
た。 試験具をヘモグロビンとアスコルビン酸塩の両
方を含む尿中で試験すると、種々のヘモグロビン
濃度に対応した、容易に識別できる発色強度が得
られた。 実施例 ６−メトキシキノリン 実施例の手順にしたがつて、６−メトキシキ
ノリン（6MQ）を含む試験具を製造した。６−
ヒドロキシキノリンを用いる代りに、6MQ0.040
ｇを第２浸漬溶液10mlに加えた。ヘモグロビンと
アスコルビン酸塩の両方を含む尿中で試験具を試
験したところ、ヘモグロビン濃度に対応する、識
別可能な発色強度が得られた。 実施例 ５，６−ベンゾキノリン ６−ヒドロキシキノリンを使用する代りに５，
６−ベンゾキノリン0.045ｇを第２浸漬溶液10ml
に加えた以外は、実施例の手順に従つて試験具
を製造した。得られた試験具をヘモグロビンとア
スコルビン酸塩の両方を含む尿で試験すると、ヘ
モグロビン濃度に対応した、容易に識別可能な発
色強度が認められた。 実施例 ４−アザフルオレン ６−ヒドロキシキノリンを用いる代りに４−ア
ザフルオレン0.042ｇを第２浸漬溶液10mlに加え
た以外は、実施例の手順に従つて試験具を製造
した。得られた試験具をヘモグロビンとアスコル
ビン酸塩の両方を含む尿で試験すると、ヘモグロ
ビン濃度に対応した、容易に識別可能な発色強度
が認められた。 実施例 10−ピリド〔３，２−ｂ〕〔１，４〕
ベンゾチアジン ６−ヒドロキシキノリンを用いる代りに10H−
ピリド〔３，２−ｂ〕〔１，４〕ベンゾチアジン
0.050ｇを第２浸漬溶液10mlに加えた以外は、実
施例の手順に従つて試験具を製造した。得られ
た試験具をヘモグロビンとアスコルビン酸塩の両
方を含む尿で試験すると、ヘモグロビン濃度に対
応した、容易に識別可能な発色強度が認められ
た。 実施例 種々のCo（）錯体 尿中の潜血分析におけるアスコルビン酸塩の妨
害を低減する上で、種々のCo（）錯体の有効性
を調べるために一連の実験を行つた。そこで、実
施例におけるようにして、試験具を製造した。
２つの浸漬溶液の配合は次のとおりであつた。 第１浸漬溶液 Co（）錯体（下記参照） 0.0056^M* 蒸留水 100ml^** 第２浸漬溶液 蒸留水 50ml クエン酸ナトリウム 2.13ｇ^*** クエン酸 2.77ｇ トリエタノールアミン・ホウ酸塩 5.00ｇ メチルスルホン 6.67ｇ ラウリル硫酸ナトリウム 0.75ｇ エチレンジアミン四酢酸 0.13ｇ ジメチルホルムアミド 50.0ml ６−メトキシキノリン 0.4ml クメンヒドロペルオキシド 2.0ml ３，3′，５，5′−テトラメチルベンジジン
0.60ｇ ＊ 第１浸漬溶液をCo（）錯体0.0056M
にするのに十分な量 ＊＊ ミリリツトル ＊＊＊ グラム 第１浸漬溶液に使用したCo（）錯体がそれぞ
れCo（NH₃）₆Cl₃、アセチルアセトナトコバルト
（）、〔Co（NH₃）₅H₂O〕Cl₃、〔Co（NH₃）₅CO〕
NO₃、又は〔Co（NH₃）₄CO₃〕NO₃・3H₂Oであ
る試験具を別々に製造した。ヘモグロビンとアス
コルビン酸塩の両方を含む尿について試験を行つ
たところ、各々のCo（）錯体について得られた
試験具は、いずれも、アスコルビン酸塩の妨害に
対して改良された抵抗性を示した。 Ｂ アスコルビン酸塩に対する抵抗性試験 実施例 種々の縮合環化合物の効果 本発明の試験具に対するアスコルビン酸塩の影
響を検討するために一連の実験を行つた。 試験具を実施例−に記載したようにして製
造した。更に、コバルト錯体を抜いたこと、即ち
紙の担体マトリツクスに含浸するのに第２浸漬
溶液のみを用いたこと以外は、実施例と厳密に
同じ方法で対照試験具を作製した。これらの試験
具を、血液やアスコルビン酸を含まない尿からな
る試料、及びその一定量にヒトの全血あるいはア
スコルビン酸あるいはその両方を加えたものに浸
漬することにより評価した。 １分後に発色を肉眼で観察し、数字で段階づけ
られた相対標準色強度値に帰属させた。対照試験
片を、種々の濃度でヘモグロビンを含むがアスコ
ルビン酸塩を含まない尿試料に浸漬した。標準色
強度値は、次のように帰属された。 【表】 このように、ヘモグロビンが全く存在しない尿
試料に浸漬させた時に対照試験具に形成された着
色を、色値０に帰属させた。一方、100ミリリツ
トル当り0.405ミリグラムのヘモグロビンを含む
尿によつて発現させられる着色を40の色値に帰属
させた。 結果は次のとおりである。 【表】 ＊ 異常値
上記データからわかるように、種々の縮合環化
合物を用いて作製した試験具はすべてアスコルビ
ン酸塩に対して優れた抵抗性を同様に有するが、
対照試験具は、アスコルビン酸塩の妨害に鋭敏な
感受性を示している。 実施例 種々のCo（）錯体の効果 実施例の実験と同様の実験を、実施例で作
製した試験具について行つた。 実施例で行つた肉眼観察法を用いる代りに、
“ラピツドスキヤンナー”（迅速走査機）として知
られる装置を用いて、発色を追跡した。この装置
は、デジタル・エクウイツプメント・コーポレー
シヨン（Digital Equipment Corporation）から
得たPDP−12コンピユータにインターフエース
で接続した走査型反射分光光度計である。この装
置は、可視領域における反射スペクトルの迅速測
定に用いられる。コンピユータは、スペクトルの
データの保存及び計算を可能にする。ラピツドス
キヤンナー内での試薬片の性能の測定には、同じ
試薬片の肉眼による観察にくらべ次のような利点
がある。 １ 光源及び試料周囲の状態を固定しておける。
肉眼による読みでは、光源が波長成分において
のみならず、試薬片を観察する場所にも関連し
て変わるおそれがある。 ２ ラピツドスキヤンナーでは、検知器特性が一
定になる。肉眼による観察では、検知器（即
ち、観察者の肉眼）が人によつて変わるし、同
一人でも日によつて変わる。 ３ ラピツドスキヤンナーによれば、データの定
量的評価を人間の観察よりもより正確に行うこ
とができ、これにより諸結果間の比較を肉眼観
察によるよりもより積極的に行うことができ
る。 ラピツドスキヤンナーの装置は、米国インジア
ナ州エルクハート（Elkhart）のマイルスラボラ
トリーズ・インコーポレーテツドのエームス・デ
イビジヨン（Ames Division of Miles
Laboratories，Inc.）において製造されたもの
で、ここから構造や性能の特性に関する完全な情
報を入手することができる。 ラピツドスキヤンナーから得た三刺激値を、
「エクララージユ国際委員会報告No.15、比色分析
（E.−1.3.1）に対する補遣No.２」（Supplement
No.2to Commission Internationale de
L′Eclairage（Paris，France）Publication No.
15Colorimetry，（E.−1.3.1），1971）に含まれて
いる約束にしたがつて色差値（color difference
values）（△Ｅ）を計算するのに用いた。したが
つて、この装置から得られたデータは、△Ｅすな
わち色差単位（color difference units）として
記録される。 このようにして、実施例におけるように、
Co（）錯体を全く含まない対照試験具を、種々
のCo（）錯体を含んだ実施例で得られた試験
具と比較した。種々の濃度でヘモグロビンを含
み、アスコルビン酸塩は含みあるいは含まない尿
を用いて、比較を行つた。 ラピツドスキヤンナーにより得られる色差単位
（△Ｅ）は、次のとおりにヘモグロビン濃度（ア
スコルビン酸塩が存在しない場合）に対応する。 【表】 このデータは、対照試験具即ちCo（）錯体が
全く存在しない点を除き実施例と同様に作製し
た試験具を用いて、ラピツドスキヤンナーから得
た。 種々のコバルト（）錯体を含む、実施例の
試験具を、0.135mg％のヘモグロビンを含み、ア
スコルビン酸塩を含む、あるいは含まない尿試料
中で試験したところ、結果は次のとおりであつ
た。 【表】 この表は、Co（）錯体及び縮合環化合物の存
在により、アスコルビン酸塩の妨害に対する感受
性が驚異的に減少することを証明するデータを表
している。 実施例 コバルト（）が過酸化反応性活性を有するこ
とを先行技術が示しているので、実施例におけ
るようにCo（NH₃）₆Cl₃を用いて作製した試験具
と対照試験具（コバルト錯体が存在しない以外
は、実施例におけると同様に作製した）を、安
定性について試験した。組成物中のクメンヒドロ
ペルオキシドがCo（）の存在により急速に分解
することが当然予想されるにも拘らず、この実験
は二つの試験具間の安定性の相異を実質上示さな
かつた。 コバルトを含む試験具及び対照試験具を50℃の
空気浴中に二週間保存することによつて促進試験
に付した。これらの促進試験に付された試験具、
並びに促進試験に付されなかつた試験具を次に、
血液もアスコルビン酸も含まない尿と、これにヒ
トの全血を種々の量で添加した尿とに浸漬した。
発色を実施例におけるように、即ち１分間に肉
眼で観察することにより評価した。データは次の
とおりである。 【表】 上記データからわかるように、50℃で２週間保
存した後でさえ、過酸化物Co（）との間に不調
和が存在しないことが明らかである。更に、コバ
ルト含有の試験具は、コバルト（）が存在しな
い対照試験具と感度が同等である。 Ｄ 試験具の製造方法。 実施例 順序の定めた適用の効果 試験具の製造方法を研究し、試薬を担体マトリ
ツクスに適用する順序を変えることによる効果を
調べるために実験を行つた。Co（）錯体を第１
浸漬溶液として適用（実施例）して試験具を製
造すると、アスコルビン酸塩に対する優れた抵抗
性が認められる。しかし、適用の順序を逆にする
とすなわち錯体を第２浸漬溶液として適用する
と、アスコルビン酸塩に対する抵抗性が減少する
ことがわかつた。縮合環化合物を第２浸漬溶液で
Co（）と一緒にすると、意外なことに、アスコ
ルビン酸塩に対する抵抗性が実施例におけるよ
うに製造した試験具のレベルに戻る。 ３セツトの試験具を製造した。セツト(a)は、
Co（NH₃）₆Cl₃を第１浸漬溶液として紙マトリ
ツクスに含浸させ、縮合環化合物を含む残りの成
分を第２浸漬溶液として適用することにより製造
した。セツト(b)の試験具は、セツト(a)とは逆の添
加順序で、即ちコバルト錯体を第２浸漬溶液とし
て適用し、他の成分を第１浸漬溶液に含ませて、
製造した。セツト(c)は、第２浸漬溶液がコバルト
錯体と縮合環化合物の両方を含むものとして製造
した試験具である。 セツト(a) Co（）が第１浸漬溶液中にあるもの Co（NH₃）₆Cl₃を水性の第１浸漬溶液として加
えて試験具を製造した。この第１溶液は、0.13ｇ
のCo（NH₃）₆Cl₃を10mlの蒸留水に溶解して調製
した。この溶液を、実験用紙（イートン・アン
ド・ダイクマンNo.237（Eaton＆Dikeman No.
237））片に含浸するのに用い、次いで95℃の空気
浴中で10分間乾燥した。 次の成分を列記した順序で一緒にして、第２浸
漬溶液を調製した。 蒸留水 25ml クエン酸ナトリウム 1.07ｇ クエン酸 1.38ｇ トリエタノールアミン・ホウ酸塩 3.33ｇ メチルスルホン 3.33ｇ ジメチルホルムアミド 25.0ml ６−メトキシキノリン 200μl クメンヒドロペルオキシド 1.0ml ３，3′，５，5′−テトラメチルベンンジジン
0.30ｇ この溶液20mlに、 ラウリル硫酸ナトリウム 0.20ｇ エチレンジアミン四酢酸 0.01ｇ を加えて、四ナトリウム塩の第２浸漬溶液を作つ
た。 コバルトを含浸し乾燥させた紙を第２浸漬溶
液に浸漬し、前記のようにして95℃で10分間乾燥
した。 この方法で製造した試験具を、尿中のヘモグロ
ビン分析に用いた時の、アスコルビン酸塩の妨害
に対する抵抗性を検討するために、以下に示すよ
うに試験した。結果は次のとおりである。 【表】 このデータは、アスコルビン酸塩に対する良好
な抵抗性、即ちヘモグロビン分析への比較的小さ
な妨害を示している。 セツト(b) Co（）が第２浸漬溶液中にあるもの コバルト錯体を第２浸漬溶液として適用した、
試験具の第２のセツトを製造した。 この実験では、セツト(a)に用いた上記紙片を
第２浸漬溶液に浸漬し、乾燥し、次いでコバルト
を含有する第１浸漬溶液に浸漬し再び乾燥した。
この方法は、適用の順序を逆にしたほかは、セツ
ト(a)に用いた方法と同じである。 実施例におけるように、ヘモグロビン及び／
又はアスコルビン酸塩を含む、あるいは含まない
尿について試験を行つたところ、結果は次のとお
りであつた。 【表】 このデータは、試料中に存在するアスコルビン
酸塩による妨害に対する著しい感受性を示してい
る。 セツト(c) Co（）と縮合環化合物が第２浸漬溶
液中にあるもの 第２浸漬溶液がコバルト錯体と縮合環化合物の
両方を含んだ、試験具の第３のセツトを製造し
た。 次の成分を列記した順序で一緒にして、第１浸
漬溶液を調製した。 蒸留水 50ml クエン酸ナトリウム 2.13ｇ クエン酸 2.77ｇ トリエタノールアミン・ホウ酸塩 6.67ｇ エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩
0.07ｇ メチルスルホン 6.67ｇ ラウリル硫酸ナトリウム 1.00ｇ この溶液10mlにジメチルホルムアミド10mlクメ
ンヒドロペルオキシド0.4ｇ及び３，3′，５，5′−
テトラメチルベンジジン0.12ｇを加えた。 実験用紙片（Eaton＆Dikeman No.222）を
第１浸漬溶液に浸漬し、空気浴中で95℃、10分間
乾燥させ、乾燥した紙を直ちに第２浸漬溶液に
浸漬した。 第２浸漬溶液は、Co（NH₃）₆Cl₃0.24ｇを蒸留水
80mlに溶かして調製した。この溶液10mlに、ジメ
チルホルムアミド10mlを加え、続いて６−メトキ
シキノリン80μlを加えた。第２浸漬溶液への浸漬
に続いて、紙を95℃で10分間再び乾燥した。 この試験紙を、ヘモグロビンを含み、アスコル
ビン酸塩を含みあるいは含まない尿に浸漬したと
ころ、次のデータを得た。 【表】 このデータは、尿中ヘモグロビンの分析に使用
した時、セツト(c)の試験具がアスコルビン酸塩の
妨害に対して著しく高度な抵抗性を有することを
示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試料中の過酸化反応性活性物質の存在を測定
   するのに有用な試験具で、試料中に存在するアス
   コルビン酸塩の妨害作用に抵抗する試験具であつ
   て、Co（）錯体と、６−メトキシキノリン、
   ５，６−ベンゾキノリン、４−アザフルオレン、
   10H−ピリド［３，２−ｂ］−［１，４］ベンゾチ
   アジン、６−ヒドロキシキノリン又はこれらの混
   合物とが包含された担体マトリツクスからなるこ
   とを特徴とする試験具。 ２ 特許請求の範囲第１項記載の試験具であつ
   て、Co（）錯体がCo（NH₃）₆Cl₃、アセチルアセ
   トナトコバルト（）、［Co（NH₃）₅H₂O］Cl₃、
   ［Co（NH₃）₅Co］NO₃、［Co（NH₃）₄Co₃］NO₃・
   3H₂O、又はこれらの混合物である試験具。 ３ 特許請求の範囲第１項記載の試験具であつ
   て、Co（）錯体がCo（NH₃）₆Cl₃であるもの。 ４ 特許請求の範囲第１項記載の試験具であつ
   て、縮合環化合物が６−メトキシキノリンである
   もの。 ５ 試料中の過酸化反応性活性物質の存在を測定
   するのに有用な、試料中に存在するアスコルビン
   酸塩の妨害作用に抵抗する試験具の製造方法であ
   つて、 適当な溶媒中にある有機ヒドロペルオキシド
   と、ヒドロペルオキシド及び過酸化反応性活性物
   質の存在下で検出可能な応答を示し得る指示薬と
   からなる第１の試薬混合物を調製する工程、 第１の試薬混合物を担体マトリツクスに接触さ
   せる工程、 該担体マトリツクスを乾燥して、それに有機ペ
   ルオキシドと指示薬を含浸させる工程、及び Co（）錯体と、６−メトキシキノリン、５，
   ６−ベンゾキノリン、４−アザフルオレン、10H
   −ピリド［３，２−ｂ］−［１，４］ベンゾチアジ
   ン、６−ヒドロキシキノリン又はこれらの混合物
   の水溶液から成る第２の試薬混合物を調製する工
   程をこの順序で具備することを特徴とする方法。 ６ 特許請求の範囲第３項記載の試験具の製造方
   法であつて、Co（）錯体がCo（NH₃）₆Cl₃、アセ
   チルアセトナトコバルト（）、［Co
   （NH₃）₅H₂O］Cl₃、［Co（NH₃）₅CO］NO₃、［Co
   （NH₃）₄CO₃］NO₃・3H₂O、又はこれらの混合物
   である方法。 ７ 特許請求の範囲第５項記載の試験具の製造方
   法であつて、Co（）錯体がCo（NH₃）₆Cl₃である
   もの。 ８ 特許請求の範囲第５項記載の試験具の製造方
   法であつて、縮合環化合物が６−メトキシキノリ
   ンであるもの。