JPS636560B2

JPS636560B2 -

Info

Publication number: JPS636560B2
Application number: JP53019564A
Authority: JP
Inventors: Sarantakisu Jimitoriosu
Original assignee: AMERIKAN HOOMU PURODAKUTSU CORP
Current assignee: AMERIKAN HOOMU PURODAKUTSU CORP
Priority date: 1977-02-22
Filing date: 1978-02-21
Publication date: 1988-02-10
Also published as: GB1578402A; MY8400115A; CH633524A5; JPS53130659A

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

本発明はソマトスタチン同族体、さらに詳しく
は、ソマトスタチンのペプチド誘導体、その製
法、該誘導体を含有する医薬組成物および該誘導
体製造に用いる中間体に関する。ソフトスタチンとして知られる環状ソマトトロ
ピン放出抑制因子（SRIF）はブラゾウら
〔Brazeau et al.、Science、179、77（1973）〕に
より報告されており、式：で示される構造を有し、全てのアミノ酸は天然も
しくはＬ−配置である。リビエル〔Rivier、J.Am.Chem.Soc.、96、
2986（1974）〕の固相法、サランタキスら
〔Sarantakis et al.、Biochem.Biophys.Res.
Comm.、54、234（1973）〕およびイムマーら
〔Immer et al.、Helv.Chim.Acta.、57、730
（1974）〕の溶液法を含め、ソマトスタチンを合成
するいくつかの方法が文献に報告されており、ま
た、その構造を合成的に変化させてソマトスタチ
ンの薬理作用を強めることを目的としたペプチド
の研究も行なわれている。ソフトスタチンの還元型（開鎖型、RS）は
式：で示される鎖状テトラデカペプチドである。該還元型〔Ｂ〕は全合成によつて製造され
（Rivier et al.、C.R.Acad.Sci.Ser.p.Sci.Natur.
（Paris）、276、2737（1973）ならびにSarantakis
およびMcKinley、Biochem.Biophys.Res.
Comm.、54、234（1973）参照〕、還元型〔Ｂ〕は
酸化により、テトラデカペプチドの２個のシステ
イニルアミノ酸残基の２個のスルフヒドリル間に
架橋結合を形成させ、ソマトスタチン〔Ａ〕に変
えることができる。これまで、ソマトスタチンの構造的変形と考え
られる種々のポリペプチドが合成され、化学文献
に報告されている。これらのポリペプチドはソマ
トスタチンと共通するある種の構造的特徴を有
し、かつ、本来ソマトスタチン分子中に存在して
いる特定のアミノ酸残基または官能基がなくなつ
たり、あるいは他のアミノ酸残基または官能基と
置き換えられている点でソマトスタチンと異な
る。本発明はソマトスタチンの構造的変形と考えら
れる生物学的に活性な新規合成ポリペプチドを提
供するもので、本発明のポリペプチドはつぎの点
でソマトスタチンと異なる。 (a) 該Ala¹−Gly²セグメントが存在しない。 (b) 該Lys⁴残基がArgまたはHisに置換されてい
る。 (c) 該Asn⁵残基がHisまたはGluに置換されてい
る。 (d) 該Trp⁸残基がＤ−Trpに置換されている。本明細書において、全ての光学活性アミノ酸残
基およびアミノ酸は特に断らない限りＬ−配置の
ものである。本発明のポリペプチドは式：〔式中、Ａは水素または２個のＡ基は該２個の硫
黄原子間に形成された架橋結合を意味する；Ｘは
水素；X₁はHisまたはArg；X₂はHisまたは
Glu；X₃はＤ−Trp；X₄はCysまたはＤ−Cysを
意味する］で示される化合物またはその医薬上許容される塩
である。しかして、本発明には鎖状の式〔〕の化合
物、すなわち、式：で示される２個の遊離スルフヒドリル基を有する
非環状還元型化合物またはその非毒性の医薬上許
容される酸付加塩が包含される。本明細書で用いるアミノ酸およびポリペプチド
中のアミノ酸残基を示す記号はユーパツク−IUB
コミツテイ・オン・バイオケミカル・ノーメンク
レイチユア・レコメンデイシヨン〔IUPAG−
IUB Committee on Biochmical
Nomenclatuve Recommendation（1971）；
Archives of Biochemistry and Biophysics、
150、１〜８（1972）〕に従つたものである。本発明の化合物は白〜淡黄褐色固体で、クロロ
ホルム、ベンゼンなどには溶解せず、水および塩
酸、酢酸のような水性酸溶液には溶解する。本発
明の化合物は明確に識別できる融点を示さず、例
えば、クロマトグラフイーによつて精製できる。
本発明の化合物を、例えば、4Nメタンスルホン
酸中で加水分解してそのアミノ酸含量を測定する
と前記の構造と一致する。本発明の化合物は薬効を有し、ことに、標準的
な薬理テストで示されるように、ソマトトロピ
ン、グルカゴン、インシユリンのごとき１種また
はそれ以上のホルモンの放出抑制の適用特性を有
する。用量を調節することにより、内因性インシ
ユリン分泌濃度に影響を及ぼすことなく、選択的
にソマトトロピンおよびグルカゴンの放出を抑制
することができる。ことに好ましい化合物はつぎのとおりである。および、ならびにこれらの還元（開鎖）型化合物であ
る。本発明の化合物は、式：［式中、Ｒはカルボキシ保護基（例えば、アルキ
ル、アラルキル）またはメチレン基を介して結合
したポリスチレン樹脂担体（すなわち、
The present invention relates to somatostatin analogues, and more particularly to peptide derivatives of somatostatin, methods for producing the same, pharmaceutical compositions containing the derivatives, and intermediates used in the production of the derivatives. Cyclic somatotropin release inhibitory factor (SRIF), known as softstatin, was reported by Brazeau et al., Science, 179, 77 (1973) and has the formula: , with all amino acids in the natural or L-configuration. Rivier [Rivier, J.Am.Chem.Soc., 96,
2986 (1974)], the solid-phase method of Sarantakis et al. [Sarantakis et al., Biochem.Biophys.Res.
Comm., 54, 234 (1973)] and Immer et al., Helv.Chim.Acta., 57, 730
(1974)] have been reported in the literature to synthesize somatostatin, including the solution method of Research is also being conducted. The reduced form (open chain form, RS) of softstatin has the formula: It is a linear tetradecapeptide shown by The reduced form [B] is produced by total synthesis (Rivier et al., CRAcad.Sci.Ser.p.Sci.Natur.
(Paris), 276, 2737 (1973) and Sarantakis
and McKinley, Biochem.Biophys.Res.
Comm., 54, 234 (1973)], the reduced form [B] is oxidized to form a cross-link between the two sulfhydryls of the two cysteinyl amino acid residues of the tetradecapeptide, and the somatostatin [A ] can be changed to To date, various polypeptides considered to be structural variants of somatostatin have been synthesized and reported in the chemical literature. These polypeptides have certain structural features in common with somatostatin, and may lack certain amino acid residues or functional groups originally present in the somatostatin molecule, or may lack other amino acid residues or functional groups. It differs from somatostatin in that it has a functional group replaced. The present invention provides a biologically active novel synthetic polypeptide considered to be a structural modification of somatostatin, and the polypeptide of the present invention differs from somatostatin in the following points. (a) The Ala ¹ -Gly ² segment is absent. (b) The Lys ⁴ residues are substituted with Arg or His. (c) The Asn ⁵ residue is substituted with His or Glu. (d) The Trp ⁸ residue is substituted with D-Trp. All optically active amino acid residues and amino acids herein are in the L-configuration unless otherwise specified. The polypeptide of the invention has the formula: [In the formula, A is hydrogen or two A groups mean a crosslink formed between the two sulfur atoms; X is hydrogen; X ₁ is His or Arg; X ₂ is His or
Glu; _X3 means D-Trp; _X4 means Cys or D-Cys] or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Therefore, the present invention includes a linear compound of the formula [], that is, the formula: Included are acyclic reduced compounds having two free sulfhydryl groups represented by the formula or non-toxic pharmaceutically acceptable acid addition salts thereof. The symbols used herein for amino acids and amino acid residues in polypeptides are Upack-IUB.
Committee on Biochemical Nomenclature Your Recommendations [IUPAG-
IUB Committee on Biochmical
Nomenclature Recommendation (1971);
Archives of Biochemistry and Biophysics,
150, 1-8 (1972)]. The compounds of the present invention are white to light tan solids that are insoluble in chloroform, benzene, etc., but soluble in water and aqueous acid solutions such as hydrochloric acid and acetic acid. The compounds of the invention do not exhibit clearly discernible melting points and can be purified, for example, by chromatography.
When the compound of the present invention is hydrolyzed in, for example, 4N methanesulfonic acid and its amino acid content is determined, it is consistent with the above structure. The compounds of the present invention have medicinal properties and, in particular, have the indicated property of inhibiting the release of one or more hormones such as somatotropin, glucagon, insulin, etc., as shown in standard pharmacological tests. By adjusting the dose, the release of somatotropin and glucagon can be selectively inhibited without affecting endogenous insulin secretion levels. Particularly preferred compounds are as follows. and, and reduced (open chain) compounds thereof. Compounds of the invention have the formula: [wherein R is a polystyrene resin support bonded via a carboxy protecting group (e.g. alkyl, aralkyl) or a methylene group (i.e.

【式】）；R¹はα−アミノ保護基；B₁は[Formula]); R ¹ is α-amino protecting group; B ₁ is

【式】または[expression] or

【式】R²は水素またはヒスチジンのイミダゾール窒素原子保護基；
R³はアルギニンの側鎖窒素原子保護基；B₂は前
記[Formula] R ² is hydrogen or histidine imidazole nitrogen atom protecting group;
R ³ is a side chain nitrogen atom protecting group of arginine; B ₂ is the above-mentioned

【式】または[expression] or

【式】R⁴はグルタミン酸の側鎖カルボキシ基保護基；R⁵はリジンの側鎖アミノ基
保護基；R⁶、R⁷およびR⁸は、各々、スレオニン
およびセリンのヒドロキシ基保護基；X₃はＤ−
Trp；X₄はCysまたはＤ−Cys；αおよびβは、
各々、スルフヒドリル保護基または水素あるいは
αおよびβは該２個の硫黄原子間に形成された架
橋結合を意味する〕で示される中間体化合物から製造される。 R¹としてのα−アミノ保護基の例としては(1)
ホルミル、トリフルオロアセチル、フタリル、ｐ
−トルエンスルホニル（トシル）、ニトロフエニ
ルスルフエニルなどのようなアシル型保護基、(2)
ベンジルオキシカルボニル、置換ベンジルオキシ
カルボニル（例えば、ｐ−クロロベンジルオキシ
カルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニ
ル）のような芳香族ウレタン型保護基、(3)ｔ−ブ
トキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカル
ボニル、イソプロピルオキシカルボニル、アリル
オキシカルボニル、２・２・２−トリクロロエト
キシカルボニル、アミロキシカルボニルのような
脂肪族ウレタン型保護基、(4)シクロペンチルオキ
シカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、
シクロヘキシルオキシカルボニルのようなシクロ
アルキルウレタン型保護基、(5)フエニルチオカル
ボニルのようなチオウレタン型保護基、(6)トリフ
エニルメチル（トリチル）のようなアルキル型保
護基、(7)トリメチルシランのようなトリアルキル
シラン型保護基が挙げられる。もつとも好ましい
α−アミノ保護基はｔ−ブトキシカルボニルであ
る。 R³の例としてはニトロ、トシル、ベンジルオ
キシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル
またはｔ−ブトキシカルボニルが挙げられ、トジ
ルが好ましい。ニトロまたはトシル基による保護はアルギニン
のN〓またはN〓′窒素原子の保護で、オキシカル
ボニル型保護基は該N〓窒素原子と、N〓または
N〓′窒素原子のいずれかを保護する。 R²の例としてはトシル、ベンジルオキシカル
ボニル、アダマンチルオキシカルボニルまたはｔ
−ブトキシカルボニルが挙げられ、トシルが好ま
しい。リジンの側鎖アミノ保護基であるR⁵の例とし
てはトシル、ｔ−アミロキシカルボニル、ｔ−ブ
トキシカルボニル、ジイソプロピルオキシカルボ
ニル、ベンジルオキシカルボニル、ハロベンジル
オキシカルボニル、ニトロベンジルオキシカルボ
ニルなどが挙げられ、２−クロロベンジルオキシ
カルボニルが好ましい。スレオニンおよびセリンのヒドロキシ保護基で
あるR⁶、R⁷およびR⁸の例としてはアセチル、ベ
ンゾイル、ｔ−ブチル、ベンジルが挙げられ、ベ
ンジルが好ましい。 R⁴の例としてはベンジルおよびｔ−ブチルが
挙げられる。システイニルアミノ酸残基のスルフヒドリル保
護基であるαおよびβの例としてはベンジル、置
換ベンシル（置換基は少なくとも１つのメチル、
メトキシ、ニトロまたはハロゲン、例えば、３・
４−ジメチルベンジル、ｐ−メトキシベンジル、
ｐ−クロロベンジル、ｐ−ニトロベンジルなど）、
トリチル、ベンジルオキシカルボニル、ベンズヒ
ドリル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニ
ル、ベンジルチオメチル、エチルカルバモイル、
チオエチル、テトラヒドロピラニル、アセトアミ
ドメチル、ベンゾイル、Ｓ−スルホン酸塩などが
挙げられ、ｐ−メトキシベンジル基が好ましい。本発明はまたこれらの化合物の製法も提供する
ものである。式〔〕の化合物は前記式〔〕の化合物から
全ての保護基と、存在すればポリスチレン樹脂担
体を離脱させ、所望により、生成物を酸化または
還元して環状または鎖状の型に変え、さらに所望
により、遊離塩基として、または医薬上許容され
る塩として単離することにより製造できる。保護基の離脱は、各保護基につき公知の方法で
行なえる。好ましくは、保護基の離脱はアニソー
ルの存在下、フツ化水素を用いるような１工程で
行なう。ポリスチレン樹脂担体は、例えば、アニソール
の存在下、フツ化水素を用いて保護基の離脱と同
時に開裂させることができ、あるいはエステル交
換してＲがエステル基の式〔〕のカルボキシ保
護中間体を得ることにより開裂できる。例えば、
メタノリシスによりＲがメチルの式〔〕のメチ
ルエステル中間体が得られる。このようなエステ
ルを加水分解すると、所望のＣ−末端カルボキシ
基が得られる。保護基を適宜選択することにより、保護基αお
よびβは式〔〕の化合物から選択的に離脱され
て、αおよびβが水素の式〔〕の遊離ジスルフ
ヒドリル誘導体が得られる。例えば、αおよびβ
がトリチルまたはアセトアミドの場合、これらは
水銀または銀塩の作用により選択的に離脱されて
対応するジスルフヒドリル誘導体の水銀またはジ
銀塩が得られる。この塩に硫化水素を作用させる
と対応する遊離の式〔〕のジスルフヒドリル誘
導体が得られる。式〔〕および〔〕の遊離のジスルフヒドリ
ル誘導体は、各々、ヨウ素、酸素（例えば、空
気）、１・２−ジヨードエタンまたはフエリシア
ン化ナトリウムもしくはカリウムのような酸化剤
を用いて酸化することにより環化することがで
き、２個のＡ基が架橋結合を形成する対応する式
〔〕の化合物あるいはαおよびβが架橋結合を
形成する式〔〕の化合物が得られる。該ポリペプチド最終生成物および該中間体は、
例えば、メリイフイルド〔Merrifield、J.Am.
Chem.Soc.85、2149（1963）〕が記載するような公
知の固相法または古典的合成法によつて製造でき
る。しかして、固相合成法条件下でクロロメチル
化またはヒドロキシメチル化樹脂担体に必要な、
適宜保護および／または活性化されたアミノ酸を
順次カツプリングさせて、αおよびβが保護基で
Ｒがポリスチレン樹脂担体である式〔〕の化合
物が得られる。別法として、αおよびβが保護基
でＲがカルボキシ保護基の式〔〕の化合物はペ
プチド結合を形成させて所望のアミノ酸鎖を得る
公知の方法により、必要な適宜保護および／また
は活性化されたアミノ酸をカツプリングさせて製
造できる。ついで、該αおよびβ保護基を選択的
に離脱し、その生成物を酸化してαおよびβが架
橋結合を形成する式〔〕の環状ジスルフイドが
得られる。カツプリングに先だつてアミノ酸を活性化する
方法およびカツプリング法自体は公知である（例
えば、後記のSchroderおよびLubkeのテキスト
参照）。本発明のペプチド合成において用いる側鎖保護
基の選択はつぎの規準に従つて行なう。 (a) 側鎖保護基は合成の各工程におけるα−アミ
ノ保護基離脱のための試薬および反応条件に対
して安定でなければならない。 (b) 該保護基はその保護性能を持続しなければな
らない（すなわち、カツプリング条件下で離脱
しないこと）。 (c) 該側鎖保護基は所望のアミノ酸鎖の合成が完
了したら、該ペプチド鎖を変化させない反応条
件下で離脱されなければならない。本発明の化合製造に古典的方法を用いる場合、
所望のペプチドはアミノ酸またはアミノ酸群を、
要すれば適宜保護して縮合させて製造される。こ
の縮合反応はペプチドおよびペニシリン化学にお
けるアミド結合の形成に公知の方法を用いて行な
うことができる。アミノ酸の縮合を促進させるた
めに縮合剤を用いることが好ましい。縮合剤の例
としてはＮ・N′−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（DCC）、Ｎ・N′−ジイソプロピルカルボジ
イミド（DIC）のようなカルボジイミド類が挙げ
られる。別法として、この縮合は一方または両方
の末端基を活性化することにより行なえる。末端
カルボキシ基の活性型の例としては酸塩化物、無
水物、アジドおよび活性エステルが挙げられる。
この縮合を行なう方法はアミノ酸の保護基と適合
しなければならない。古典的方法によつて分子を形成させる方法で
は、式：で示される保護ペプチドを式：で示される保護ペプチドと縮合させて式〔〕の
化合物を得、脱保護および環化をさせることが好
ましい〔式中、Ｒはカルボキシ保護基（好ましく
はベンジル）；R¹、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、B₁、B₂、
X₃およびX₄は前記と同じ；αおよびβは保護基
（好ましくはｐ−メトキシベンジル）を意味す
る〕。本発明の化合物製造に固相法を用いる場合、ま
ず、α−アミノおよびスルフヒドリル保護システ
インをクロロメチル化ポリスチレン樹脂に結合さ
せ、ついで、塩化メチレン中トリフルオリ酢酸、
トリフルオロ酢酸単独またはジオキサン中塩化水
素でα−アミノ保護基を離脱させる。この脱保護
は約０℃〜室温の温度で行なわれる。シユローダ
ーおよびルブケ〔SchroderおよびLubke、The
Peptides、１、72〜75（Academic Press1965）〕
が記載するようなα−アミノ保護基を離脱させる
他の標準的な開裂剤および条件も使用できる。α
−アミノ保護基を離脱させた後、この樹脂に担持
された鎖に順次、つぎの所望の保護アミノ酸を
個々にカツプリングさせる。別法として、例え
ば、溶液法によつて小さなペプチドフラグメント
を製造し、これを所望の順序で固相反応器に導入
することもできる。各保護アミノ酸またはアミノ
酸鎖は約４倍過剰で固相反応器に導入する。カツ
プリングはジメチルホルムアミド、塩化メチレン
またはこれらの混合液中で行なわれる。合成の各
工程における各カツプリング反応の成否はイー・
カイザーら〔E.Kaiser et al.、Analyt.
Biochem.、34、595（1970）〕が記載するようなニ
ンヒドリン反応で判定する。カツプリングが不完
全な場合、つぎのアミノ酸またはアミノ酸鎖導入
のためのα−アミノ保護基離脱前に、この反応を
くり返す。好ましいカツプリング剤は１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾールおよびジイソプロピルカルボジイ
ミドで、かかる試薬の他のものも公知である。所望のアミノ酸鎖が合成された後、得られたポ
リペプチドを、例えば、フツ化水素およびアニソ
ールで処理して樹脂担体を離脱させて完全に脱保
護された鎖状のポリペプチドを得る。対応する環
状ジスルフイドは空気酸化あるいは、例えば、フ
エリシアン化カリウムによる酸化で製造できる。該鎖状および環状ポリペプチドの非毒性付加塩
は塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、ポリリン
酸、マレイン酸、酢酸、クエン酸、安息香酸、コ
ハク酸、マロン酸、アスコルビン酸などから公知
の方法によつて製造される。酢酸塩が好ましい。固相合成に用いる保護基はよく知られている。
前記のごとく、最終のポリペプチドの順序に従つ
て導入される各アミノ酸のα−アミノ基は(1)ホル
ミル、トリフルオロアセチル、フタリル、ｐ−ト
ルエンスルホニル（トシル）、ニトロフエニルス
ルフエニルなどのアシル型保護基、(2)ベンジルオ
キシカルボニル、置換ベンジルオキシカルボニル
（例えば、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、
ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル）のような
芳香族ウレタン型保護基、(3)ｔ−ブトキシカルボ
ニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソ
プロピルオキシカルボニル、アリルオキシカルボ
ニル、２・２・２−トリクロロエトキシカルボニ
ル、アミロキシカルボニルのような脂肪族ウレタ
ン型保護基、(4)シクロペンチルオキシカルボニ
ル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキ
シルオキシカルボニルのようなシクロアルキルウ
レタン型保護型、(5)フエニルチオカルボニルのよ
うなチオウレタン型保護基、(6)トリフエニルメチ
ル（トリチル）のようなアルキル型保護基、(7)ト
リメチルシランのようなトリアルキルシラン保護
基で保護できる。ｔ−ブトキシカルボニルが好ま
しい。 N^imで示されるヒスチジンのイミダゾール窒素
はトシル、ベンジルオキシカルボニル、アダマン
チルオキシカルボニルまたはｔ−ブトキシカルボ
ニル、好ましくはトシルで保護できる。リジンの側鎖アミノ基はトシル、ｔ−アミルオ
キシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、ジイ
ソプロピルオキシカルボニル、ベンジルオキシカ
ルボニル、ハロベンジルオキシカルボニル、ニト
ロベンジルオキシカルボニルなどで保護でき、２
−クロロベンジルオキシカルボニル基が好まし
い。 N^gで示されるアルギニンの側鎖窒素原子はニ
トロ、トシル、ベンジルオキシカルボニル、アダ
マンチルオキシカルボニルまたはｔ−ブトキシカ
ルボニル、好ましくはトシルで保護できる。ニト
ロまたはトシル基はN〓またはN〓′窒素原子を保
護し、オキシカルボニル型の保護基はN〓と、N〓
またはN〓′窒素原子の一方を保護する。スレオニンおよびセリンのヒドロキシ基はアセ
チル、ベンゾイル、ｔ−ブチル、ベンジルで保護
でき、ベンジルが好ましい。システイニルアミノ酸残基のスルフヒドリル基
はベンジル、置換ベンジル（置換基は少なくとも
１個のメチル、メトキシ、ニトロまたはハロゲ
ン、例えば、３・４−ジメチルベンジル、ｐ−メ
トキシベンジル、ｐ−クロロベンジル、ｐ−ニト
ロベンジルなど）、トリチル、ベンジルオキシカ
ルボニル、ベンズヒドリル、ｐ−メトキシベンジ
ルオキシカルボニル、ベンジルチオメチル、エチ
ルカルバモイル、チオエチル、テトラヒドロピラ
ニル、アセトアミドメチル、ベンゾイル、Ｓ−ス
ルホン酸塩などで保護でき、ｐ−メトキシベンジ
ル基が好ましい。前記のごとく、本発明の化合物はソマトスタチ
ン自体と同様に開鎖型（いわゆる還元型）単量体
として、または環状型（いわゆる酸化型）単量体
として存在できる。これらはソマトスタチンの対
応する型を製造するのと実質的に同じ方法で製造
でき、これらの方法は公知である。ここに還元型
とはＡが水素のもの、すなわち、２個のCysアミ
ノ酸残基に遊離のチオール基がある構造をいう。
また、酸化型とは２個のＡが架橋結合を形成する
もの、すなわち、２個のCysアミノ酸残基の硫黄
原子間に単結合があり、環状単量体を形成する構
造をいう。本発明のペプチドはソマトスタチンと同様、先
端巨大症および糖尿病の治療に有用な薬効を有す
る。該ペプチドは機能障害の程度に応じた量を医
師の指示に従つてソマトスタチンや関連するポリ
ペプチドと同様の通常の経路で投与することがで
きる。該ペプチドは単独で、あるいは通常の医薬
担体やアジユバントと合して投与単位形で投与で
きる。先端巨大症、若年糖尿病および真性糖尿病の治
療用薬剤として使用する場合、治療は該化合物の
最適用量より少ない量から開始する。ついで、状
況に従つて最適用量まで用量を少しづつ増加させ
る。一般に、本発明の化合物は有害な副作用を何
ら生じない有効量を投与する（本発明の化合物
は、いずれも、後記実施例における40〜50μｇ／
Kgの用量で人間において何ら重篤な副作用は示さ
ない）しかし、用量は実際の患者の状態および実
際に用いる化合物によつて変化しうる。所望によ
り、１日の総用量を分け、１日数回投与すること
が都合よい。しかして、本発明のさらに他の態様は式〔〕
の化合物またはその医薬上許容される塩を医薬担
体と合してなる医薬組成物を提供することであ
る。該医薬組成物は投与単位形が好ましく、ま
た、生理食塩水で等張化した通常の注射液等の剤
形で、皮下等の非経口投与することも好ましい。つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説
明する。実施例１ｔ−ブトキシカルボニル−Ｓ−ｐ−メトキシベ
ンジル−Ｌ−システイニル−N^im−トシル−Ｌ
−ヒスチジル−N^im−トシル−Ｌ−ヒスチジル
−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニルアラニ
ル−Ｄ−トリプトフイル−N〓−２−クロロベ
ンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル−Ｏ−ベ
ンジル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニ
ル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニル−Ｏ−ベン
ジル−Ｌ−セリル−Ｓ−ｐ−メトキシベンジル
−Ｌ−システイニルヒドロキシメチルポリスチ
レンエステルジビニルベンゼンで１％架橋したクロロメチル
化ポリスチレン樹脂（Lab Systems、Inc.）を、
ギシン〔Gisin、Helv.Chim.Acta、56、1976
（1973）〕の方法に従つてBoc−Cys−（SMBzl）
OHでエステル化する。このポリスチレン樹脂エ
ステルにつぎの工程表Ａの処理をくり返してBoc
−Ser〔Bzl〕−OH、Boc−Thr（Bzl）−OH、Boc
−Phe−OH、Boc−Thr（Bzl）−OH、Boc−Lys
（Clz）OH、Boc−Ｄ−Trp−OH、Boc−Phe−
OH、Boc−Phe−OH、Boc−His（Tos）−OH、
Boc−His（Tos）−OHおよびBoc−Cys−
（SMBzl）−OHを結合させて表記のペプチド樹脂
を得る。工程表Ａ１ CH₂Cl₂で３回洗浄。２５％１・２−エタンジチオール含有トリフル
オロ酢酸（TFA）−CH₂Cl₂（１：1V／Ｖ）で５
分間処理。３前記２項と同様に25分間処理。４ CH₂Cl₂で３回洗浄。５ジメチルホルムアミド（DMF）で洗浄。６ DMF中12％トリエチルアミン（TEA）で２
回、３分間処理。７ DMFで洗浄。８ CH₂Cl₂で３回洗浄。９ CH₂Cl₂−DMF中、４当量の対応するアミノ
酸誘導体で撹拌しながら５分間処理。 10 CH₂Cl₂に溶解した５当量のDICを２回に分
け、30分を要して加え、６時間反応させる。 11 DMFで３回洗浄する。 12 CH₂Cl₂で３回洗浄する。 13 カイザーら〔Kaiser et al.、Annal.
Biochem.、34、595（1970）〕に従つてニンヒド
リンテストを行なう。反応が不完全な場合、前
記９〜13項をくり返す。実施例２Ｌ−システイニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ヒス
チジル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニル
アラニル−Ｄ−トリプトフイル−Ｌ−リジル−
Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−
スレオニル−Ｌ−セリル−Ｌ−システイン環状
（１→12）ジスルフイド前記実施例１のペプチド樹脂９ｇをアニソール
18mgと混合し、氷浴中、液化フツ化水素180mlで
45分間処理する。過剰のフツ化水素を真空下でで
きるだけ速かに除去（約１時間）し、残渣を脱気
した2M氷酢酸で抽出し、過する。溶液をエー
テルで洗浄し、水性層をPH７でフエリシアン化カ
リウムで酸化する。イオン交換樹脂（Bio Rad
AG−３）で過剰の酸化剤を除去し、ペプチドを
イオン交換樹脂（Bio Rex70）に吸着させ、PH
７に緩衝させたピリジンで溶出させ、凍結乾燥し
て粗生成物1.5ｇを得る。この生成物をセフアデ
ツクスG15のカラム（2.5cm×160cm）にのせ、15
％水性酢酸で溶出する。5.2mlづつフラクシヨン
を捕集し、88〜90番目のフラクシヨンを合し、凍
結乾燥して表記の化合物174mgを得る。 TLC：R_f＝0.45（BWA−４：１：１）、R_f＝0.64
（BWAP−30：24：６：20）アミノ酸分析：Thr(2)1.87、Ser(1)0.89、Cys(2)
1.16、Phe(3)３、Lys(1)1.05、His(2)1.76、Trp
N.D. 実施例３前記実施例２で得られたドデカペプチドのin
vivo薬理作用はつぎのテストによつて示される。生長ホルモンの抑制生理食塩水に溶解もしくは懸濁させたペプチド
を非絶食の雄ラツト（Charles River CD）に皮
下注射する。食塩水対照溶液を皮下注射したラツ
トを各実験ラツトについての対照動物として供給
する。ラツトを別々の檻に入れ、テスト期間の終
了20分間に50mg／Kgのネムブタールを腹腔内注射
する。心臓穿刺により血液試料をとり、血漿を分
離して生長ホルモン（GH）濃度（ｎｇ／ml）の
ラジオイムノアツセイを行なう。末梢循環系の
GH濃度を抑制するペプチドの持続活性をテスト
するためには２および４時間のテスト期間を採用
する。各時間の対照動物および実験動物間のGH
値の比較はスチユーデントのｔテストで評価し、
活性の指標として統計的指標（ｐ）が0.05か、そ
れより低いかを用いる。[Formula] R ⁴ is a side chain carboxyl group protecting group of glutamic acid; R ⁵ is a side chain amino group protecting group of lysine; R ⁶ , R ⁷ and R ⁸ are hydroxy group protecting groups of threonine and serine, respectively _; is D-
Trp; X ₄ is Cys or D-Cys; α and β are
Each is prepared from a sulfhydryl protecting group or hydrogen or an intermediate compound of the formula [alpha] and [beta] refer to the bridge formed between the two sulfur atoms. Examples of α-amino protecting groups as R ¹ are (1)
formyl, trifluoroacetyl, phthalyl, p
-acyl-type protecting groups such as toluenesulfonyl (tosyl), nitrophenylsulfenyl, etc., (2)
Aromatic urethane type protecting groups such as benzyloxycarbonyl, substituted benzyloxycarbonyl (e.g. p-chlorobenzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl), (3) t-butoxycarbonyl, diisopropylmethoxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl , allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, aliphatic urethane type protecting groups such as amyloxycarbonyl, (4) cyclopentyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl,
cycloalkylurethane-type protecting groups such as cyclohexyloxycarbonyl, (5) thiourethane-type protecting groups such as phenylthiocarbonyl, (6) alkyl-type protecting groups such as triphenylmethyl (trityl), (7) trimethyl Included are trialkylsilane type protecting groups such as silane. The most preferred α-amino protecting group is t-butoxycarbonyl. Examples of R ³ include nitro, tosyl, benzyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl or t-butoxycarbonyl, with tosyl being preferred. The protection by nitro or tosyl group is the protection of N〓 or N〓′ nitrogen atom of arginine, and the oxycarbonyl type protecting group protects the N〓 nitrogen atom and N〓 or
N〓′protects one of the nitrogen atoms. Examples of ^R2 include tosyl, benzyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl or t
-butoxycarbonyl, and tosyl is preferred. Examples of R ⁵ which is a side chain amino protecting group of lysine include tosyl, t-amyloxycarbonyl, t-butoxycarbonyl, diisopropyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, halobenzyloxycarbonyl, nitrobenzyloxycarbonyl, etc. 2-chlorobenzyloxycarbonyl is preferred. Examples of R ⁶ , R ⁷ and R ⁸ which are hydroxy protecting groups for threonine and serine include acetyl, benzoyl, t-butyl and benzyl, with benzyl being preferred. Examples of R ⁴ include benzyl and t-butyl. Examples of sulfhydryl protecting groups α and β for cysteinyl amino acid residues include benzyl, substituted benzyl (substituents include at least one methyl,
methoxy, nitro or halogen, e.g.
4-dimethylbenzyl, p-methoxybenzyl,
p-chlorobenzyl, p-nitrobenzyl, etc.),
trityl, benzyloxycarbonyl, benzhydryl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, benzylthiomethyl, ethylcarbamoyl,
Examples include thioethyl, tetrahydropyranyl, acetamidomethyl, benzoyl, S-sulfonate, and p-methoxybenzyl group is preferred. The invention also provides methods for making these compounds. The compound of formula [] is obtained by removing all protecting groups and the polystyrene resin carrier, if any, from the compound of formula [], optionally oxidizing or reducing the product to convert it into a cyclic or chain form, and further If desired, it can be prepared by isolating it as a free base or as a pharmaceutically acceptable salt. Removal of the protecting group can be carried out by a known method for each protecting group. Preferably, removal of the protecting group is carried out in one step, such as with hydrogen fluoride in the presence of anisole. The polystyrene resin support can be cleaved simultaneously with the removal of the protecting group, for example using hydrogen fluoride in the presence of anisole, or transesterified to obtain a carboxy-protected intermediate of formula [ ] where R is an ester group. It can be cleaved by for example,
Methanolysis yields a methyl ester intermediate of formula [ ] where R is methyl. Hydrolysis of such esters provides the desired C-terminal carboxy group. By appropriately selecting the protecting groups, the protecting groups α and β can be selectively removed from the compound of the formula [] to obtain a free disulfhydryl derivative of the formula [] in which α and β are hydrogen. For example, α and β
When is trityl or acetamide, these are selectively eliminated by the action of mercury or silver salts to yield the mercury or disilver salts of the corresponding disulfhydryl derivatives. When this salt is treated with hydrogen sulfide, the corresponding free disulfhydryl derivative of the formula [] is obtained. Free disulfhydryl derivatives of formulas [] and [] can be cyclized by oxidation with oxidizing agents such as iodine, oxygen (e.g. air), 1,2-diiodoethane or sodium or potassium ferricyanide, respectively. A corresponding compound of the formula [ ] in which the two A groups form a cross-linking bond or a compound of the formula [ ] in which α and β form a cross-linking bond can be obtained. The final polypeptide product and the intermediate are:
For example, Merrifield [Merrifield, J.Am.
Chem. Soc. 85, 2149 (1963)] by known solid phase methods or classical synthetic methods. Therefore, under solid phase synthesis conditions, chloromethylated or hydroxymethylated resin supports require
Sequential coupling of appropriately protected and/or activated amino acids yields a compound of formula [ ] in which α and β are protecting groups and R is a polystyrene resin carrier. Alternatively, compounds of formula [ ] in which α and β are protecting groups and R is a carboxy protecting group may be protected and/or activated as necessary by known methods to form a peptide bond to obtain the desired amino acid chain. It can be produced by coupling together amino acids. Then, the α and β protecting groups are selectively removed and the product is oxidized to obtain a cyclic disulfide of the formula [ ] in which α and β form a crosslink. Methods for activating amino acids prior to coupling and coupling methods themselves are known (see, for example, the text of Schroder and Lubke below). The side chain protecting group used in the peptide synthesis of the present invention is selected according to the following criteria. (a) The side chain protecting group must be stable to the reagents and reaction conditions for α-amino protecting group removal at each step of the synthesis. (b) The protecting group must maintain its protective properties (ie, not cleave under coupling conditions). (c) The side chain protecting group must be removed upon completion of the synthesis of the desired amino acid chain under reaction conditions that do not alter the peptide chain. When using classical methods for the preparation of the compounds of the present invention,
The desired peptide contains an amino acid or group of amino acids,
It is produced by condensation with appropriate protection if necessary. This condensation reaction can be carried out using methods known for the formation of amide bonds in peptide and penicillin chemistry. It is preferred to use a condensing agent to promote condensation of amino acids. Examples of condensing agents include carbodiimides such as N.N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N.N'-diisopropylcarbodiimide (DIC). Alternatively, this condensation can be accomplished by activating one or both end groups. Examples of activated forms of terminal carboxy groups include acid chlorides, anhydrides, azides and active esters.
The method of performing this condensation must be compatible with the protecting groups of the amino acids. In the classical method of forming molecules, the formula: The protected peptide shown by the formula: Preferably, the compound of the formula [] is obtained by condensation with a protected peptide represented by [], followed by deprotection and cyclization [wherein R is a carboxy protecting group (preferably benzyl); R ¹ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ , R ⁸ , B ₁ , B ₂ ,
X ₃ and X ₄ are the same as above; α and β mean a protecting group (preferably p-methoxybenzyl)]. When using a solid phase method to prepare the compounds of the present invention, the α-amino and sulfhydryl protected cysteines are first attached to a chloromethylated polystyrene resin, followed by trifluoroacetic acid in methylene chloride.
The α-amino protecting group is removed with trifluoroacetic acid alone or hydrogen chloride in dioxane. This deprotection is carried out at temperatures from about 0°C to room temperature. Schroder and Lubke, The
Peptides, 1, 72-75 (Academic Press1965)]
Other standard cleavage agents and conditions for removing the α-amino protecting group can also be used, such as those described by . α
After removal of the -amino protecting group, the next desired protected amino acid is individually coupled to the resin-supported chain in sequence. Alternatively, small peptide fragments can be prepared, for example by solution methods, and introduced into the solid phase reactor in the desired order. Each protected amino acid or amino acid chain is introduced into the solid phase reactor in approximately 4-fold excess. Coupling is carried out in dimethylformamide, methylene chloride or a mixture thereof. The success or failure of each coupling reaction in each step of the synthesis is determined by E.
E. Kaiser et al., Analyt.
Biochem., 34, 595 (1970)]. If coupling is incomplete, this reaction is repeated before removing the α-amino protecting group to introduce the next amino acid or amino acid chain. Preferred coupling agents are 1-hydroxybenzotriazole and diisopropylcarbodiimide; other such reagents are also known. After the desired amino acid chain is synthesized, the resulting polypeptide is treated with, for example, hydrogen fluoride and anisole to remove the resin carrier and obtain a completely deprotected chain polypeptide. The corresponding cyclic disulfides can be prepared by air oxidation or, for example, by oxidation with potassium ferricyanide. Non-toxic addition salts of the linear and cyclic polypeptides are known from hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, polyphosphoric acid, maleic acid, acetic acid, citric acid, benzoic acid, succinic acid, malonic acid, ascorbic acid, etc. Manufactured by the method of Acetate is preferred. Protecting groups used in solid phase synthesis are well known.
As mentioned above, the α-amino group of each amino acid introduced according to the order of the final polypeptide is (1) formyl, trifluoroacetyl, phthalyl, p-toluenesulfonyl (tosyl), nitrophenylsulfenyl, etc. acyl-type protecting group, (2) benzyloxycarbonyl, substituted benzyloxycarbonyl (e.g., p-chlorobenzyloxycarbonyl,
(3) t-butoxycarbonyl, diisopropylmethoxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, amyloxycarbonyl aliphatic urethane type protecting groups such as (4) cycloalkyl urethane type protecting groups such as cyclopentyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl, (5) thiourethane type protecting groups such as phenylthiocarbonyl, (6) It can be protected with an alkyl-type protecting group such as triphenylmethyl (trityl) or (7) a trialkylsilane protecting group such as trimethylsilane. t-Butoxycarbonyl is preferred. The imidazole nitrogen of histidine represented by N ^im can be protected with tosyl, benzyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl or t-butoxycarbonyl, preferably tosyl. The side chain amino group of lysine can be protected with tosyl, t-amyloxycarbonyl, t-butoxycarbonyl, diisopropyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, halobenzyloxycarbonyl, nitrobenzyloxycarbonyl, etc.
-Chlorobenzyloxycarbonyl group is preferred. The side chain nitrogen atom of arginine, denoted N ^g , can be protected with nitro, tosyl, benzyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl or t-butoxycarbonyl, preferably tosyl. The nitro or tosyl group protects the N〓 or N〓′ nitrogen atom, and the oxycarbonyl type protecting group protects the N〓 and N〓
or N〓′protect one of the nitrogen atoms. The hydroxy groups of threonine and serine can be protected with acetyl, benzoyl, t-butyl, benzyl, with benzyl being preferred. Sulfhydryl groups of cysteinyl amino acid residues are benzyl, substituted benzyl (substituents include at least one methyl, methoxy, nitro or halogen, e.g. 3,4-dimethylbenzyl, p-methoxybenzyl, p-chlorobenzyl, p -nitrobenzyl, etc.), trityl, benzyloxycarbonyl, benzhydryl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, benzylthiomethyl, ethylcarbamoyl, thioethyl, tetrahydropyranyl, acetamidomethyl, benzoyl, S-sulfonate, etc. -methoxybenzyl group is preferred. As mentioned above, the compounds of the invention, like somatostatin itself, can exist as open-chain (so-called reduced) monomers or as cyclic (so-called oxidized) monomers. These can be manufactured in substantially the same manner as the corresponding forms of somatostatin are manufactured, and these methods are known. Here, the term "reduced type" refers to a structure in which A is hydrogen, that is, a structure in which two Cys amino acid residues have free thiol groups.
Furthermore, the oxidized type refers to a structure in which two A's form a crosslink, that is, a single bond exists between the sulfur atoms of two Cys amino acid residues, forming a cyclic monomer. The peptides of the present invention, like somatostatin, have medicinal properties useful in the treatment of acromegaly and diabetes. The peptide can be administered in an amount appropriate to the degree of functional impairment according to a physician's instructions, using the same conventional route as somatostatin and related polypeptides. The peptides can be administered alone or in combination with conventional pharmaceutical carriers and adjuvants in dosage unit form. When used as a drug for the treatment of acromegaly, juvenile diabetes and diabetes mellitus, treatment is initiated with less than the optimal dose of the compound. The dose is then increased in small increments according to the situation until the optimum dose is reached. Generally, the compounds of the present invention are administered in an effective amount that does not cause any harmful side effects (all of the compounds of the present invention are administered in an amount of 40 to 50 μg/g in the Examples below).
(Kg dose does not show any serious side effects in humans) However, the dose may vary depending on the actual patient condition and the actual compound used. If desired, it may be convenient to divide the total daily dose and administer it several times per day. Accordingly, still another aspect of the present invention is the formula []
An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising a compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof in combination with a pharmaceutical carrier. The pharmaceutical composition is preferably in a dosage unit form, and is also preferably administered parenterally, such as subcutaneously, in the form of a conventional injection solution made isotonic with physiological saline. Next, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples. Example 1 t-Butoxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N ^im -tosyl-L
-Histidyl-N ^im -Tosyl-L-Histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopyl-N-2-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl- O-Benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinylhydroxymethyl polystyrene ester Chloromethylated polystyrene resin 1% crosslinked with divinylbenzene (Lab Systems, Inc.) )of,
Gisin, Helv.Chim.Acta, 56, 1976
(1973)] Boc−Cys−(SMBzl)
Esterify with OH. This polystyrene resin ester is subjected to the following process chart A to obtain Boc.
−Ser[Bzl]−OH, Boc−Thr(Bzl)−OH, Boc
−Phe−OH, Boc−Thr(Bzl)−OH, Boc−Lys
(Clz)OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-
OH, Boc−Phe−OH, Boc−His(Tos)−OH,
Boc−His(Tos)−OH and Boc−Cys−
(SMBzl)-OH is coupled to obtain the indicated peptide resin. Process chart A 1 Wash 3 times with CH ₂ Cl ₂ . 2 5% 1,2-ethanedithiol-containing trifluoroacetic acid (TFA)-CH ₂ Cl ₂ (1:1 V/V)
Processed in minutes. 3. Treat for 25 minutes in the same way as in item 2 above. 4 Wash 3 times with CH ₂ Cl ₂ . 5 Wash with dimethylformamide (DMF). 6 2 with 12% triethylamine (TEA) in DMF
Process for 3 minutes. 7 Wash with DMF. 8 Wash 3 times with CH ₂ Cl ₂ . 9 Treatment with 4 equivalents of the corresponding amino acid derivative in _CH2Cl2 _- DMF for 5 minutes with stirring. 5 equivalents of DIC dissolved in 10 CH ₂ Cl ₂ are added in two portions over 30 minutes and allowed to react for 6 hours. 11 Wash 3 times with DMF. Wash 3 times with 12 CH ₂ Cl ₂ . 13 Kaiser et al., Annal.
Biochem., 34, 595 (1970)]. If the reaction is incomplete, repeat steps 9 to 13 above. Example 2 L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopyl-L-lysyl-
L-threonyl-L-phenylalanyl-L-
Threonyl-L-seryl-L-cysteine cyclic (1→12) disulfide 9 g of the peptide resin of Example 1 was added to anisole
Mix with 18mg and 180ml of liquefied hydrogen fluoride in an ice bath.
Process for 45 minutes. Excess hydrogen fluoride is removed under vacuum as quickly as possible (approximately 1 hour) and the residue is extracted with degassed 2M glacial acetic acid and filtered. The solution is washed with ether and the aqueous layer is acidified with potassium ferricyanide at PH7. Ion exchange resin (Bio Rad
AG-3) to remove excess oxidant, adsorb the peptide to an ion exchange resin (Bio Rex70), and PH
Elution with pyridine buffered at 7 and lyophilization yields 1.5 g of crude product. This product was placed on a Sephadex G15 column (2.5 cm x 160 cm), and
Elute with % aqueous acetic acid. Collect fractions of 5.2 ml each, combine fractions 88 to 90, and freeze-dry to obtain 174 mg of the title compound. TLC: R _f =0.45 (BWA-4:1:1), R _f =0.64
(BWAP-30:24:6:20) Amino acid analysis: Thr(2)1.87, Ser(1)0.89, Cys(2)
1.16, Phe(3)3, Lys(1)1.05, His(2)1.76, Trp
ND Example 3 In of the dodecapeptide obtained in Example 2 above
The in vivo pharmacological effects are demonstrated by the following tests. Suppression of Growth Hormone A peptide dissolved or suspended in physiological saline is injected subcutaneously into non-fasted male rats (Charles River CD). A rat injected subcutaneously with a saline control solution serves as a control animal for each experimental rat. Rats are placed in separate cages and given an intraperitoneal injection of 50 mg/Kg Nembutal 20 minutes at the end of the test period. Blood samples are taken by cardiac puncture and plasma is separated for radioimmunoassay of growth hormone (GH) concentration (ng/ml). peripheral circulatory system
Two and four hour test periods are employed to test the sustained activity of the peptides in suppressing GH concentrations. GH between control and experimental animals at each time
Comparison of values was evaluated using Student's t test.
A statistical index (p) of 0.05 or lower is used as an indicator of activity.

【表】生長ホルモン、グルカゴンおよびインシユリン
の抑制アルビノ（Albino）雄ラツトを３群（９尾／
群）に分け、50mg／Kgのネムブタールを腹腔内注
射する。ネムブタール注射15分後、各群に、(a)テ
スト化合物、代表的には10〜2000μｇ／Kg、(b)
SRIF200μｇ／Kgまたは(c)生理食塩水を腹腔内注
射する。10分後、アルギニン0.5ml（300mg／ml、
PH7.2）を心臓に注射する。アルギニン注射５分
後、ラツトを断頭し、トラシロール−EDTA中
に採血する。ついで適当量を用いて生長ホルモ
ン、グルカゴン（GLUN）およびインシユリン
（INS）の分析を行なう。活性な化合物は食塩水
対照と比べるとこれらのホルモンのいずれかの血
漿濃度を著しく変化させる。対照群と実験群の間
の値の比較は分散分析法により統計的に評価し、
活性の指標として統計的有意（ｐ）が0.05か、そ
れより低いかを用いる。[Table] Suppression of growth hormone, glucagon, and insulin Three groups of male albino rats (9 rats/
50 mg/Kg of Nembutal was injected intraperitoneally. 15 minutes after Nembutal injection, each group received (a) the test compound, typically 10-2000 μg/Kg; (b)
Inject 200 μg/Kg of SRIF or (c) physiological saline intraperitoneally. After 10 minutes, add 0.5 ml of arginine (300 mg/ml,
PH7.2) is injected into the heart. Five minutes after arginine injection, rats are decapitated and bled in trasylol-EDTA. Growth hormone, glucagon (GLUN) and insulin (INS) are then analyzed using appropriate amounts. Active compounds significantly alter plasma concentrations of either of these hormones compared to saline controls. Comparison of values between the control group and the experimental group was statistically evaluated by analysis of variance method.
Statistical significance (p) of 0.05 or lower is used as an indicator of activity.

【表】実施例４ｔ−ブトキシカルボニル−Ｓ−ｐ−メトキシベ
ンジル−Ｌ−システイニル−N^gn−トシル−Ｌ
−アルギニル−N^im−トシル−Ｌ−ヒスチジル
−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニルアラニ
ル−Ｄ−トリプトフイル−N〓−２−クロロベ
ンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル−Ｏ−ベ
ンジル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニ
ル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニル−Ｏ−ベン
ジル−Ｌ−セリル−Ｓ−ｐ−メトキシベンジル
−Ｌ−システイニルヒドロキシメチルポリスチ
レンエステルジビニルベンゼンで１％架橋したクロロメチル
化ポリスチレン樹脂（Lab Systems、Inc.）をギ
シン〔Gisin、Helv.Chim.Acta、56、1976
（1973）〕の方法に従つてBoc−Cys（SMBzl）−
OHでエステル化する。このポリスチレン樹脂エ
ステルに前記工程表Ａの処理をくり返してBoc−
Ser（Bzl）−OH、Boc−Thr（Bzl）−OH、Boc−
Phe−OH、Boc−Thr（Bzl）−OH、Boc−Lys
（Clz）−CH、Boc−Ｄ−Trp−OH、Boc−Phe−
OH、Boc−Phe−OH、Boc−His（Tos）−OH、
Boc−Arg（Tos）−OHおよびBoc−Cys（SMBzl）
−OHを結合させて表記のペプチド樹脂を得る。実施例５Ｌ−システイニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−ヒス
チジル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニル
アラニル−Ｄ−トリプトフイル−Ｌ−リジル−
Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−
スレオニル−Ｌ−セリル−Ｌ−システイン環状
（１→12）ジスルフイド前記実施例４のペプチド樹脂8.5ｇをアニソー
ル16mlと混合し、液化フツ化水素10mlで45分間処
理する。過剰のフツ化水素を真空下でできるだけ
速かに除去し、残渣を25％水性酢酸中にとる。重
合体担体を去し、液をエーテルで洗浄する。
水性層を水3.5に注ぎ、水酸化アンモニウムで
PH７に調整し、ついでこのスルフヒドリル化合物
をフエリシアン化カリウムで酸化する。氷酢酸で
PHを５に調整し、イオン交換樹脂（Bio Rad
AG3）で無機酸化剤を除去する。ペプチド物質
をイオン交換樹脂（Bio Rex70）に吸着させ、
PH７に緩衝させたピリジンで溶出させて粗化合物
２ｇを得る。これをセフアデツクスＧ−15のカラ
ム（2.5cm×160cm）に通し、15％水性酢酸で溶出
させる。5.2mlづつフラクシヨンを捕集し、47〜
93番目のフラクシヨンの物質886mgをCM−セフ
アデツクスＧ−25カラムにのせ、酢酸アンモニウ
ムで段階的に溶出させて（0.1〜0.3モル酢酸アン
モニウム）、表記の化合物を得る。この物質をセ
フアデツクスLH20のカラム（2.5cm×92cm）にの
せ、10％水性酢酸で溶出させる。純粋な表記の化
合物は55〜63番のフラクシヨン（各、4.1ml）に
溶出する（収量159mg）。 TLC：R_f＝0.46（BWA−４：１：１）、R_f＝0.65
（BWAP−30：24：６：20）アミノ酸分析：Thr(2)1.94、Ser(1)0.91、Cys(2)
1.79、Phe(3)３、His(1)1.02、Lys(1)0.85、Arg
(1)0.95、TrpN.D. 実施例６前記実施例５で得られたペブチドのin、vivo薬
理作用はつぎのテストによつて示される。生長ホルモン、グルカゴンおよびインシユリン
の抑制アルビノ雄ラツトを２群に分け（９尾／群）、
ネムブタール50mg／Kgを腹腔内注射する。ネムブ
タール注射15分後、各群にテスト化合物または生
理食塩水を皮下注射する。10分後、アルギニン
（300mg／ml、PH7.2）0.5mlを心臓に注射する。ア
ルギニン注射５分後、ラツトを断頭し、トラシロ
ール−EDTA中に採血する。ついで適当量を用
いて生長ホルモン（GH）、グルカゴン（GLUN）
およびインシユリン（INS）の分析を行なう。活
性化合物は食塩水対照群に比べ、これらのホルモ
ンのいずれかの血漿濃度が著しく変化する。対照
群と実験群の間の値の比較は分散分析法により統
計的に評価し、活性の指標として統計的有意
（ｐ）が0.05か、それより低いかを用いる。[Table] Example 4 t-Butoxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N ^gn -tosyl-L
-Arginyl-N ^im -Tosyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-N-2-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl- O-Benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinylhydroxymethyl polystyrene ester Chloromethylated polystyrene resin 1% crosslinked with divinylbenzene (Lab Systems, Inc.) ) Gisin, Helv.Chim.Acta, 56, 1976
(1973)] Boc−Cys(SMBzl)−
Esterify with OH. Boc-
Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-
Phe−OH, Boc−Thr(Bzl)−OH, Boc−Lys
(Clz)-CH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-
OH, Boc−Phe−OH, Boc−His(Tos)−OH,
Boc−Arg(Tos)−OH and Boc−Cys(SMBzl)
-OH is attached to obtain the indicated peptide resin. Example 5 L-cysteinyl-L-arginyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopyl-L-lysyl-
L-threonyl-L-phenylalanyl-L-
Threonyl-L-seryl-L-cysteine cyclic (1→12) disulfide 8.5 g of the peptide resin of Example 4 above is mixed with 16 ml of anisole and treated with 10 ml of liquefied hydrogen fluoride for 45 minutes. Excess hydrogen fluoride is removed as quickly as possible under vacuum and the residue is taken up in 25% aqueous acetic acid. The polymer carrier is removed and the liquid is washed with ether.
Pour the aqueous layer into 3.5 liters of water and add ammonium hydroxide to
The pH is adjusted to 7 and the sulfhydryl compound is then oxidized with potassium ferricyanide. with glacial acetic acid
Adjust the pH to 5 and use ion exchange resin (Bio Rad
AG3) to remove the inorganic oxidizer. Adsorb the peptide substance onto an ion exchange resin (Bio Rex70),
Elution with pyridine buffered to PH7 gives 2 g of crude compound. This is passed through a Sephadex G-15 column (2.5 cm x 160 cm) and eluted with 15% aqueous acetic acid. Collect fractions in 5.2 ml portions, 47~
886 mg of the material of the 93rd fraction is loaded onto a CM-Sephadex G-25 column and eluted stepwise with ammonium acetate (0.1-0.3 mole ammonium acetate) to give the title compound. This material is loaded onto a Sephadex LH20 column (2.5 cm x 92 cm) and eluted with 10% aqueous acetic acid. The pure named compound elutes in fractions #55-63 (4.1 ml each) (yield 159 mg). TLC: R _f =0.46 (BWA-4:1:1), R _f =0.65
(BWAP-30:24:6:20) Amino acid analysis: Thr(2)1.94, Ser(1)0.91, Cys(2)
1.79, Phe(3)3, His(1)1.02, Lys(1)0.85, Arg
(1)0.95, TrpN.D. Example 6 The in and vivo pharmacological effects of the peptide obtained in Example 5 are shown by the following tests. Suppression of growth hormone, glucagon and insulin Male albino rats were divided into two groups (9 animals/group).
Nembutal 50 mg/Kg is injected intraperitoneally. Fifteen minutes after Nembutal injection, each group will receive a subcutaneous injection of test compound or saline. After 10 minutes, 0.5 ml of arginine (300 mg/ml, PH 7.2) is injected into the heart. Five minutes after arginine injection, rats are decapitated and bled in trasylol-EDTA. Then, use appropriate amounts of growth hormone (GH) and glucagon (GLUN).
and insulin (INS) analysis. The active compound significantly alters plasma concentrations of either of these hormones compared to the saline control group. Comparison of values between the control group and the experimental group is statistically evaluated by analysis of variance, and statistical significance (p) of 0.05 or lower is used as an indicator of activity.

【表】実施例７ｔ−ブトキシカルボニル−Ｓ−ｐ−メトキシベ
ンジル−Ｌ−システイニル−N^im−トシル−Ｌ
−ヒスチジル−N^im−トシル−Ｌ−ヒスチジル
−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニルアラニ
ル−Ｄ−トリプトフイル−N〓−２−クロロベ
ンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル−Ｏ−ベ
ンジル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニ
ル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニル−Ｏ−ベン
ジル−Ｌ−セリル−Ｓ−ｐ−メトキシベンジル
−Ｄ−システイニルヒドロキシメチルポリスチ
レンエステルジビニルベンゼンで１％架橋したクロロメチル
化ポリスチレン樹脂（Lab Systems、Inc.）を前
記と同様にBoc−Ｄ−Cys（SMBzl）−OHでエス
テル化する。このポリスチレン樹脂に前記工程表
Ａの処理をくり返してBoc−Ser（Bzl）−OH、
Boc−Thr（Bzl）−OH、Boc−Phe−OH、Boc−
Thr−（Bzl）−OH、Boc−Lys（Clz）−OH、Boc
−Ｄ−Trp−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Phe
−OH、Boc−His−（Tos）−OH、Boc−His
（Tos）−OHおよびBoc−Cys−（SMBzl）−OHを
結合させて表記のペプチドを得る。実施例８Ｌ−システイニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ヒス
チジル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニル
アラニル−Ｄ−トリプトフイル−Ｌ−リジル−
Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−
スレオニル−Ｌ−セリル−Ｄ−システイン環状
（１→12）ジスルフイドジ酢酸塩前記実施例７のペプチド樹脂10ｇをアニソール
20mlと混合し、排気しながら氷浴中で45分間液化
フツ化水素150mlで処理する。真空下で過剰の液
化フツ化水素を除去し、残渣を50％水性酢酸とな
る。混合液を過し、液を水3.5で稀釈する。
稀水酸化アンモニウムでPH７に調整し、このジス
ルフヒドリルペプチドをフエリシアン化カリウム
で酸化して環状ジスルフイドとする。混合液のPH
を氷酢酸で５に調整し、イオン交換樹脂（Bio
Rad AG3）で処理する。ペプチド物質をイオン
交換樹脂（Bio Rex70、H⁺型）に吸着させ、ピ
リジン緩衝液（ピリジン−水−酢酸、30：66：
4V／Ｖ）で溶出させる。ペプチド物質を含有す
るフラクシヨンを集め、凍結乾燥し、粗生成物
1.6ｇを得る。これをセフアデツクスLH−20のカ
ラム（2.5cm×90cm）にのせ、10％水性酢酸で溶
出させる（各フラクシヨン5.8ml）。97〜101番目
のフラクシヨンを合し、凍結乾燥して表記のドデ
カペプチド171mgを得る。 TLC：アビセル・プレコート・ガラス・プレー
ト、R_f＝0.32（BWA−４：１：1V／Ｖ）、R_f＝
0.56（BWAP−30：24：６：20V／Ｖ）アミノ酸分析：Thr(2)1.85、Ser(1)0.84、Cys(2)
1.29、Phe(3)３、Lys(1)1.05、His(2)1.41、Trp
(1)0.75 このドデカペプチドのin vivo薬理作用を前記
実施例３と同様な方法でテストした結果をつぎに
示す。生長ホルモンの抑制[Table] Example 7 t-Butoxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N ^im -tosyl-L
-Histidyl-N ^im -Tosyl-L-Histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopyl-N-2-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl- O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-D-cysteinylhydroxymethyl polystyrene ester Chloromethylated polystyrene resin 1% crosslinked with divinylbenzene (Lab Systems, Inc.) ) is esterified with Boc-D-Cys(SMBzl)-OH in the same manner as above. Boc-Ser(Bzl)-OH,
Boc−Thr(Bzl)−OH, Boc−Phe−OH, Boc−
Thr−(Bzl)−OH, Boc−Lys(Clz)−OH, Boc
-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe
−OH, Boc−His−(Tos)−OH, Boc−His
(Tos)-OH and Boc-Cys-(SMBzl)-OH are combined to give the indicated peptide. Example 8 L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopyl-L-lysyl-
L-threonyl-L-phenylalanyl-L-
Threonyl-L-seryl-D-cysteine cyclic (1→12) disulfide diacetate 10 g of the peptide resin of Example 7 was mixed with anisole
Mix with 20 ml and treat with 150 ml of liquefied hydrogen fluoride for 45 min in an ice bath with evacuation. Remove excess liquefied hydrogen fluoride under vacuum and the residue becomes 50% aqueous acetic acid. Filter the mixture and dilute the liquid with 3.5 parts of water.
The pH is adjusted to 7 with dilute ammonium hydroxide, and the disulfhydryl peptide is oxidized with potassium ferricyanide to form a cyclic disulfide. PH of mixed liquid
was adjusted to 5 with glacial acetic acid and treated with ion exchange resin (Bio
Rad AG3). The peptide substance was adsorbed on an ion exchange resin (Bio Rex70, H ⁺ type), and pyridine buffer (pyridine-water-acetic acid, 30:66:
Elute at 4V/V). The fractions containing the peptide material were collected and lyophilized to yield the crude product.
Obtain 1.6g. This was loaded onto a Sephadex LH-20 column (2.5 cm x 90 cm) and eluted with 10% aqueous acetic acid (5.8 ml for each fraction). Fractions 97 to 101 were combined and lyophilized to obtain 171 mg of the indicated dodecapeptide. TLC: Avicel pre-coated glass plate, R _f =0.32 (BWA-4:1:1V/V), R _f =
0.56 (BWAP-30:24:6:20V/V) Amino acid analysis: Thr(2)1.85, Ser(1)0.84, Cys(2)
1.29, Phe(3)3, Lys(1)1.05, His(2)1.41, Trp
(1)0.75 The in vivo pharmacological action of this dodecapeptide was tested in the same manner as in Example 3, and the results are shown below. Suppression of growth hormone

【表】生長ホルモン、グルカゴンおよびインシユリン
の抑制[Table] Suppression of growth hormone, glucagon and insulin

【表】この結果から明らかなように、実施例８のペプ
チドは低用量でインシユリンの分泌に影響を及ぼ
すことなく特異的にグルカゴンおよび生長ホルモ
ンを抑制する。実施例９ｔ−ブトキシカルボニル−Ｓ−ｐ−メトキシベ
ンジル−Ｌ−システイニル−N^gn−トシル−Ｌ
−アルギニル−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミル
−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニルアラニ
ル−Ｄ−トリプトフイル−N〓−２−クロロベ
ンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル−Ｏ−ベ
ンジル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニ
ル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニル−Ｏ−ベン
ジル−Ｌ−セリル−Ｓ−ｐ−メトキシベンジル
−Ｌ−システイニルヒドロキシメチルポリスチ
レンエステルクロロメチル化ポリスチレン樹脂を前記と同様
にBoc−Cys（SMBzl）−OHでエステル化する。
このアミノ酸樹脂エステルを前記工程表Ａに従
い、第９項の工程で保護アミノ酸としてBoc−
Ser（Bzl）−OHを用いて処理する。ついで、工程
表Ａの処理をくり返し、該ペプチド樹脂に順次
Boc−Thr（Bzl）−OH、Boc−Phe−OH、Boc−
Thr（Bzl）−OH、Boc−Lys−（Clz）−OH、Boc
−Ｄ−Trp−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Phe
−OH、Boc−Glu（OBzl）−OH、Boc−Arg
（Tos）−OHおよびBoc−Cys（SMBzl）−OHを結
合させる。実施例 10 Ｌ−システイニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−グル
タミル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニル
アラニル−Ｄ−トリプトフイル−Ｌ−リジル−
Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−
スレオニル−Ｌ−セリル−Ｌ−システイン環状
（１→12）ジスルフイド前記実施例９のペプチド樹脂8.5ｇをアニソー
ル16mlに懸濁し、氷浴中、液化フツ化水素で45分
間処理する。ついで真空中で過剰のフツ化水素を
除去し、残渣を10％水性酢酸で抽出する。過
し、液をエーテルで洗浄し、水性層を水５に
注ぐ。稀水酸化アンモニウムでPH７に調整し、混
合液を開放雰囲気下で48時間撹拌する。PHを氷酢
酸で５に調整し、ペプチドをアンバーライトCG
−50（H⁺型）に吸着させる。ペプチド物質を50％
水性酢酸で溶出させ、凍結乾燥させて固体850mg
を得る。この粗生成物をセフアデツクスLH20のカラム
（2.5cm×150cm）にのせ、10％酢酸で溶出させる。
94〜130番目のフラクシヨンを合し、凍結乾燥さ
せて生成物を483mgを得る。これをセフアデツク
スG25のカラム（1.5cm×115cm）にのせ、10％水
性酢酸で溶出する。43〜53番目のフラクシヨンを
合し、凍結乾燥して表記のペプチド286mgを得る。 TLC：アビセル・プレコート・ガラス・プレー
ト、R_f＝0.40（BWA−４：１：1V／Ｖ）、R_f＝
0.65（BWAP−30：24：６：20V／Ｖ）アミノ酸分析：Thr(2)1.92、Ser(1)0.89、Glu(1)
1.03、Cys(2)1.49、Phe(3)３、Lys(1)1.05、Trp
(1)0.81、Arg(1)1.02 実施例 11 ｔ−ブトキシカルボニル−Ｓ−ｐ−メトキシベ
ンジル−Ｌ−システイニル−N^im−トシル−Ｌ
−ヒスチジル−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミル
−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニルアラニ
ル−Ｄ−トリプトフイル−N〓−２−クロロベ
ンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル−Ｏ−ベ
ンジル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニ
ル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニル−Ｏ−ベン
ジル−Ｌ−セリル−Ｓ−ｐ−メトキシベンジル
−Ｌ−システイニルヒドロキシメチルポリスチ
レンエステルクロロメチル化ポリスチレン樹脂を前記と同様
にBoc−Cys（SMBzl）−OHでエステル化する。
このアミノ酸樹脂エステルを前記工程表Ａに従
い、第９項の工程で保護アミノ酸としてBoc−
Ser（Bzl）−OHを用いて処理する。ついで工程表
Ａの処理をくり返し、該ペプチド樹脂に順次Boc
−Thr（Bzl）−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Thr
（Bzl）−OH、Boc−Lys（Clz）−OH、Boc−Ｄ−
Trp−OH、Boc−Phe−OH、Boc−Phe−OH、
Boc−Glu（OBzl）−OH、Boc−His（Tos）−OH、
Boc−Cys（SMBzl）−OHを結合させる。実施例 12 Ｌ−システイニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−グル
タミル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニル
アラニル−Ｄ−トリプトフイル−Ｌ−リジル−
Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−
スレオニル−Ｌ−セリル−Ｌ−システイン環状
（１→12）ジスルフイド前記実施例11のペプチド樹脂８ｇを前記実施例
10と同様にして液化乾燥フツ化水素で処理し、得
られた鎖状ジスルフヒドリルドデカペプチドを高
度に稀釈下、PH7.3で、フエリシアン化カリウム
で酸化して環化する。氷酢酸でPH５とし、混合液
をイオン交換樹脂（Bio Rad AG3−X4Cl型）で
処理し、ついでアンバーライトCG50（H⁺型）に
吸着させる。ペプチド物質を30％水性酢酸で溶出
し、凍結乾燥して粗生成物500mgを得る。これを
セフアデツクスLH20のカラム上でクロマトグラ
フイーに付し、表記のドデカペプチドを得る。 TLC：アビセル・プレコート・ガラス・プレー
ト、R_f＝0.43（BWA−４：１：1V／Ｖ）、R_f＝
0.74（ｔ−AmOH−Py−Ｗ−７：７：6V／Ｖ）アミノ酸分析：Thr(2)1.92、Ser(1)0.93、Glu(1)
0.94、Cys(2)1.59、Phe(3)３、Lys(1)1.02、His
(1)0.91、Trp(1)0.81 実施例 13 前記実施例10および12のペプチドの薬理作用を
つぎの方法により測定した。アルビノ雄ラツトに50mg／Kgのネムブタールを
腹腔内投与する。15分後、テスト化合物または生
理食塩水を投与する。10分後、アルギニン0.5ml
（300mg／ml、PH7.2）を心臓に注射する。アルギ
ニン投与５分後、ラツトを断頭し、トラシロール
−EDTA中に採血する。この適当量を用い、ラ
ジオイムノアツセイにより生長ホルモン（GH）、
インシユリン（INS）およびグルカゴン
（GLUN）を分析する。結果はつぎのとおりであ
る。[Table] As is clear from the results, the peptide of Example 8 specifically suppresses glucagon and growth hormone at low doses without affecting insulin secretion. Example 9 t-Butoxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl- ^Ngn -tosyl-L
-Arginyl-γ-benzyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-N-2-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O -Benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinylhydroxymethyl polystyrene ester Chloromethylated polystyrene resin was treated with Boc-Cys(SMBzl)-OH in the same manner as above. esterify.
This amino acid resin ester is used as a protected amino acid in the step of item 9 according to the above process table A.
Treat with Ser(Bzl)-OH. Then, repeat the process in process chart A, and apply the peptide resin sequentially to the peptide resin.
Boc−Thr(Bzl)−OH, Boc−Phe−OH, Boc−
Thr(Bzl)-OH, Boc-Lys-(Clz)-OH, Boc
-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe
−OH, Boc−Glu(OBzl)−OH, Boc−Arg
(Tos)-OH and Boc-Cys(SMBzl)-OH are combined. Example 10 L-cysteinyl-L-arginyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopyl-L-lysyl-
L-threonyl-L-phenylalanyl-L-
Threonyl-L-seryl-L-cysteine cyclic (1→12) disulfide 8.5 g of the peptide resin of Example 9 above is suspended in 16 ml of anisole and treated with liquefied hydrogen fluoride in an ice bath for 45 minutes. Excess hydrogen fluoride is then removed in vacuo and the residue is extracted with 10% aqueous acetic acid. Filter, wash the liquid with ether and pour the aqueous layer into water 5. Adjust the pH to 7 with dilute ammonium hydroxide and stir the mixture under open atmosphere for 48 hours. Adjust the pH to 5 with glacial acetic acid and add the peptide to Amberlite CG.
Adsorb to -50 (H ⁺ type). 50% peptide material
Elute with aqueous acetic acid and lyophilize to 850 mg solid.
get. This crude product was loaded onto a Sephadex LH20 column (2.5 cm x 150 cm) and eluted with 10% acetic acid.
Fractions 94-130 are combined and lyophilized to yield 483 mg of product. This was loaded onto a Sephadex G25 column (1.5 cm x 115 cm) and eluted with 10% aqueous acetic acid. Fractions 43-53 were combined and lyophilized to yield 286 mg of the indicated peptide. TLC: Avicel pre-coated glass plate, R _f =0.40 (BWA-4:1:1V/V), R _f =
0.65 (BWAP-30:24:6:20V/V) Amino acid analysis: Thr(2)1.92, Ser(1)0.89, Glu(1)
1.03, Cys(2)1.49, Phe(3)3, Lys(1)1.05, Trp
(1)0.81, Arg(1)1.02 Example 11 t-Butoxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N ^im -tosyl-L
-Histidyl-γ-benzyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-N-2-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O -Benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinylhydroxymethyl polystyrene ester Chloromethylated polystyrene resin was treated with Boc-Cys(SMBzl)-OH in the same manner as above. esterify.
This amino acid resin ester is used as a protected amino acid in the step of item 9 according to the above process table A.
Treat with Ser(Bzl)-OH. Next, repeat the process in process chart A, and apply Boc to the peptide resin in sequence.
−Thr(Bzl)−OH, Boc−Phe−OH, Boc−Thr
(Bzl)-OH, Boc-Lys(Clz)-OH, Boc-D-
Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH,
Boc−Glu(OBzl)−OH, Boc−His(Tos)−OH,
Combine Boc-Cys(SMBzl)-OH. Example 12 L-cysteinyl-L-histidyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopyl-L-lysyl-
L-threonyl-L-phenylalanyl-L-
Threonyl-L-seryl-L-cysteine cyclic (1→12) disulfide 8 g of the peptide resin of Example 11 was added to the
Treat with liquefied dry hydrogen fluoride in the same manner as in 10, and the obtained chain disulfhydryl dodecapeptide is oxidized and cyclized with potassium ferricyanide at pH 7.3 under highly diluted conditions. The pH is brought to 5 with glacial acetic acid, the mixture is treated with an ion exchange resin (Bio Rad AG3-X4Cl type) and then adsorbed onto Amberlite CG50 (H ⁺ type). The peptide material is eluted with 30% aqueous acetic acid and lyophilized to yield 500 mg of crude product. This was subjected to chromatography on a Sephadex LH20 column to obtain the indicated dodecapeptide. TLC: Avicel pre-coated glass plate, R _f =0.43 (BWA-4:1:1V/V), R _f =
0.74 (t-AmOH-Py-W-7:7:6V/V) Amino acid analysis: Thr(2)1.92, Ser(1)0.93, Glu(1)
0.94, Cys(2)1.59, Phe(3)3, Lys(1)1.02, His
(1)0.91, Trp(1)0.81 Example 13 The pharmacological effects of the peptides of Examples 10 and 12 were measured by the following method. Albino male rats are given 50 mg/Kg of Nembutal intraperitoneally. After 15 minutes, test compound or saline is administered. After 10 minutes, arginine 0.5ml
(300mg/ml, PH7.2) is injected into the heart. Five minutes after arginine administration, rats are decapitated and blood collected in trasylol-EDTA. Using this appropriate amount, growth hormone (GH) was detected by radioimmunoassay.
Analyze insulin (INS) and glucagon (GLUN). The results are as follows.

【表】この結果が示すように、本発明の他の代表的な
ペプチドである実施例10および12のペプチドは、
各々、40μｇ／Kgおよび50μｇ／Kgの用量でイン
シユリン濃度に実質的な影響を及ぼすことなく、
生長ホルモンおよびグルカゴンを減少させるのに
有効な薬剤である。また、ネムブタールで処理したラツトにおい
て、実施例10および12のペプチドの生長ホルモン
分泌に対する効果の持続性をテストしたところ、
実施例10のペプチドは1000mg／Kg（皮下）の用量
で少なくとも４時間、生長ホルモンの著しい抑制
を示した。実施例12のペプチドは２時間および４
時間において生長ホルモンの著しい抑制は何ら示
さなかつた。本発明の化合物は糖尿病の治療における血清グ
ルコース調節のため、人間や他の温血動物に静脈
内、皮下、筋肉内または経口のいずれかの経路で
投与できる。必要な用量は治療条件、症状の程度
および治療期間によつて変化する。該活性成分は単独でも、あるいは医薬担体また
は賦形剤と合した組成物としても投与できる。適
当な医薬組成物は当該分野の技術者にとつて明ら
かであろう。実施例 14 Ｌ−システイニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ヒス
チジル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニル
アラニル−Ｄ−トリプトフイル−Ｌ−リジル−
Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−
スレオニル−Ｌ−セリル−Ｌ−システイン環状
（１→12）ジスルフイドの古典的合成 (a) Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−N^im−ベン
ジルオキシカルボニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−
フエニルアラニンメチルエステル(1) CH₂Cl₂ 1000ml中Ｚ−His（Ｚ）−OH42.3ｇ
（0.1モル）およびＨ−Phe−OMe−HCl（98％）
21.8ｇ（0.1モル）の懸濁液を０℃に冷却し、
DCC22ｇ（0.12モル）およびTEA10.1ｇ（0.10
モル）を加える。この混合液を室温で一夜放置
する。分離したジシクロヘキシルウレアを去し、
液を濃縮し、ガム状物を得る。これを酢酸エ
チルに溶解し、不溶物を去する。この酢酸エ
チルを５％クエン酸、水、氷冷５％重炭酸ナト
リウム溶液、ついで水で洗浄する。有機層を硫
酸ナトリウムで乾燥し、1/3に濃縮し、溶液が
混濁するまでエーテル500mlを加え、冷所に一
夜放置する。形成した白色固体を分離し、乾燥
する（32ｇ）。融点131〜133℃ TLC：シリカゲルＦ−254、CH₂Cl₂−メタノー
ル（９：１）、R_f＝0.8 (b) N^im−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ヒス
チジル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル
ジ臭化水素酸塩(2) Ｚ−His（Ｚ）−Phe−OMe(1)30ｇ（0.5モル）
をHBr−酢酸（32％）300mlに溶解し（溶液は
２分後に混濁する）、この混合液を室温で30分
間放置し、エーテルを加えて沈澱を形成させ
る。軟い固体を取し、一夜乾燥して固体32ｇ
を得る。融点135〜137℃ TLC：移動せず。 (c) Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−N^im−ベン
ジルオキシカルボニル−Ｌ−ヒスチジル−N^im
−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ヒスチジル
−Ｌ−フエニルアラニンメチルエステル(3) Ｈ−His（Ｚ）−Phe−OMe・2HBr(2)30.5ｇ
（0.05モル）、Ｚ−His（Ｚ）−OH21.7ｇ（0.05モ
ル）のCH₂Cl₂ 500ml中懸濁液を０℃に冷却す
る。ついでDCC11ｇおよびTEA10.1ｇ（0.10モ
ル）を加え、一夜室温で放置する。生成したジシクロヘキシルウレアを去し、
液を濃縮してガラス様物質を得る。残渣を酢
酸エチルに溶解し、この溶液を10％クエン酸、
水、氷冷５％重炭酸ナトリウム溶液、ついで水
で洗浄する。この酢酸エチル溶液を硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、1/3に濃縮し、エーテルを加え
て混濁させ、冷所に放置する。白色固体29.5ｇ
を分離する。 (d) Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−フエ
ニルアラニンメチルエステルトリ塩酸塩(4) Ｚ−His（Ｚ）−His（Ｚ）−Phe−OMe(3)29ｇ、
濃塩酸10.8ml、メタノール180mlおよび10％パ
ラジウム−炭素薬匙２杯の混合物をパー水素添
加装置を用いて５時間水素添加する。過後、このメタノールを濃縮して油を得、
エーテルを加えて固体を生成させる。粗生成物
18ｇをさらに精製することなくつぎの反応に用
いる。 (e) ｔ−ブトキシカルボニル−Ｓ−ｐ−メトキシ
ベンジル−Ｌ−システイニル−Ｌ−ヒスチジル
−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−フエニルアラニンメチ
ルエステル(5) Boc−Cys（MBzl）−OH13ｇ（0.038モル）、
ヒドロキシベンズトリアゾール5.4ｇ（0.040モ
ル）およびDCC8.3ｇ（0.040モル）を氷冷
CH₂Cl₂ １中で30分間撹拌する。Ｈ−His−
His−Phe−OMe.3HCl(4)19.5ｇ（0.0345モル）
およびＮ−メチルモルホリン10.5ml（0.096モ
ル）を加え、この混合液を室温で一夜混合す
る。この懸濁液を過してジシクロヘキシルウ
レア（DCU）を除去して、液を順次、水、
10％炭酸、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥
する。過後、真空下で溶媒を除去し、粗生成
物21.0ｇを得る。この物質をアセトニトリル
100mlと共に室温で30分間撹拌し、過する。
沈澱をアセトニトリル、ついでエーテルで洗浄
し、乾燥する。収量11ｇ TLC：シリカゲル60、CHCl₃−メタノール−
酢酸（９：１：0.5V／Ｖ）R_f＝0.12 該アセトニトリル抽出液の液は目的の生成
物と不純物を含有し、他の粗製バツチの抽出に
用いることができる。 (f) ｔ−ブトキシカルボニル−Ｓ−ｐ−メトキシ
ベンジル−Ｌ−システイニル−Ｌ−ヒスチジル
−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−フエニルアラニン(6) Boc−Cys（MBzl）−His−His−Phe−OMe
(5)11.0ｇ（0.0142モル）をメタノール200mlに
溶解し、1N水酸化カリウム30mlを加える。こ
の溶液を室温で２時間撹拌し、真空下でメタノ
ールを除去する。残渣を水200mlで稀釈し、
過する。液を10％クエン酸でPH５に調整し、
ガム状沈澱を放置して結晶させる。生成物を
取し、水洗し、真空下、五酸化リンで乾燥す
る。収量7.3ｇ（67％） TLC：シリカゲル60.、ｎ−ブタノール−酢酸
エチル−酢酸−水−（１：１：１：1V／Ｖ）
R_f＝0.52；シリカゲル60、ｔ−アミルアルコ
ール−ピリジン−水（７：６：7V／Ｖ）R_f
＝0.43 (g) Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジル
−Ｌ−スルオニル−Ｌ−フエニルアラニンメチ
ルエステル(7) Boc−Ｌ−Thr（Bzl）−OH61.8ｇ（0.2モル）
およびＮ−メチルモルホリン22.4ml（0.2モル）
のテトラヒドロフラン（THF）中溶液を−15
℃に冷却する。温度を−15〜−10℃に保持して
クロロギ酸イソブチル26.2ml（0.2モル）を少
しづつ加える。−15℃で15分撹拌後、−10〜−５
℃に保持してＬ−Phe−OMe.HCl43.1ｇ（0.2
モル）とＮ−メチルモルホリン22.4ml（0.2モ
ル）のDMF中冷混合液を少しづつ加える。こ
の混合液を０℃で２時間、ついで室温で一夜撹
拌する。反応混合液を過し、真空下で濃縮
し、残渣を酢酸エチルにとる。この酢酸エチル
溶液を５％KHSO₄、５％KHCO₃、食塩水で順
次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥する。真空下
で濃縮し、得られた油を放置して結晶させる。
固体をイソプロピルエーテル−ヘキサンから再
結晶させる（74.9ｇ、80％）。融点78〜81℃、
〔α〕²⁴ _D＋10.75゜（ｃ＝1.023、メタノール）、R_f
（CHCl₃）＝0.35 元素分析：C₂₆H₃₄N₃O₆（4470.55）として、計算値(%)：Ｃ、66.36；Ｈ、7.28；Ｎ、5.95 実測値(%)：Ｃ、66.72；Ｈ、7.32；Ｎ、5.85 (h) Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジル
−Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニン(8) Boc−Thr（Bzl）−Phe−OMe(7)23.5ｇ（0.05
モル）をメタノール−ジオキサン（１：１）
100mlに溶解し、1N水酸化ナトリウム55mlで３
時間処理する（出発物質がTLCで検知されな
くなるまで）。真空下、大部分の溶媒を蒸発さ
せ、残渣を水で稀釈し、５％クエン酸と酸性と
する。分離したガム質を酢酸エチルにとり、水
（食塩水）で洗浄し、蒸発乾固させる。残渣を
エチルエーテル−ヘキサンから再結晶させる
（19.8ｇ、87％）。融点118〜119℃、R_f＝0.80
（CHCl₃−メタノール−氷酢酸、85：10：５） (i) Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジル
−Ｌ−スレオニル−Ｏ−ベンジルセリンメチル
エステル(9) Boc−Thr（Bzl）−OH30.9ｇ（0.1モル）を乾
燥THF200ml（−20℃に冷却）に溶解し、Ｎ−
メチルモルホリン11ml、ついでクロロギ酸イソ
ブチル13.4mlで処理する。この冷反応混合液を
−20℃で５分間撹拌し、Ｈ−Ser（Bzl）−OMe.
HCl25ｇ（約0.1モル）のＮ−メチルモルホリ
ン11mlを含有するDME中溶液で処理し、室温
で一夜放置する。真空下で溶媒を除去し、残渣を水および酢酸
エチル間で分配させる。有機層を５％クエン
酸、水、水性KHCO₃、水で洗浄し、硫酸マグ
ネシウムで乾燥する。蒸発乾固させ、油状残渣
をジエチルエーテル−ヘキサンから結晶させ、
ゼリー状固体29ｇを得る。R_f＝0.85（CHCl₃−
メタノール、25：１）、R_f＝0.65（酢酸エチル−
ヘキサン、１：１） (j) Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジル
−スレオニル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン(10) Boc−Thr（Bzl）−Ser（Bzl）−OMe(9)28.2ｇ
（0.0563モル）をメタノール約50mlに溶解し、
1N水酸化ナトリウム75mlで、室温で1.5時間処
理する。このアルカリ性溶液を10％クエン酸で
PH７に中和し、メタノールの大部分を真空下で
除去する。残渣を少量の水で稀釈し、５％水性
KHSO₄で酸性とし、酢酸エチルで抽出する。
有機層を水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸
発乾固させて油を得る（定量的収率）。R_f＝
0.15（長いスポツト）（酢酸エチル−ヘキサン
１：１） (k) Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジル
−１−スレオニル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリル
−Ｓ−ｐ−メトキシベンジル−Ｌ−システイン
ベンジルエステル(11) Boc−Thr（Bzl）−Ser（Bzl）−OH(10)24.3ｇ
（50ミリモル）をアセトニトリル−CH₂Cl₂
（２：３）250mlに溶解し、Ｈ−Cys−（SMBzl）
−Bzl−Tos−OH25ｇ（50ミリモル）、ついで
TEA6.8mlおよびＮ−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール6.8ｇと混合し、この混合液を氷浴中で
冷却する。 DCC11ｇ（53ミリモル）のアセトニトリル
50ml中溶液を加え、反応混合液を冷時２時間つ
いで室温で２日間撹拌する。分離したDCUを
去し、液を蒸発乾固させる。油状残渣を酢
酸エチルおよび水の間で分配させ、有機層を10
％クエン酸、水、５％KHCO₃、食塩水で洗浄
し、硫酸ナトリウムで乾燥させる。溶媒を蒸発
させ、油状残渣をエチルエーテル−ヘキサンか
ら結晶させて白色固体24.5ｇを得る。融点87〜
90℃ TLC：R_f＝0.54、0.4（痕跡）および0.3（痕跡）
（CHCl₃−メタノール、25：１）；R_f＝0.64お
よび0.25（痕跡）（ヘプタン−酢酸エチル）、
I₂陽性〔α〕²⁵ _D−14.7゜（ｃ＝0.98、DMF）元素分析：C₄₄H₅₂N₂SO₉（798.9）として、計算値(%)：Ｃ、66.15；Ｈ、6.56；Ｎ、5.26 実測値(%)：Ｃ、66.22；Ｈ、6.95；Ｎ、5.29 (l) Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニル−Ｏ−ベンジ
ル−Ｌ−セリル−Ｓ−ｐ−メトキシベンジル−
Ｌ−システインベンジルエステルトリフルオロ
酢酸塩(12) Boc−Thr（Bzl）−Ser（Bzl）−Cys（SMBzl）
−OBzl(11)８ｇ（10ミリモル）をアニソール100
ミリモルと混合し、TFA100mlで45分間処理す
る。真空下で溶媒を蒸発させ、残渣を乾燥エチ
ルエーテルに溶解し、ついで高真空下で蒸発乾
固させ、油状化合物7.2ｇ（90％）を得る。R_f
＝0.9（ｎ−ブタノール−水−氷酢酸、４：１：
１）、R_f＝0.0〜0.1（ヘプタン−酢酸エチル）
（長いスポツト）、I₂およびニンヒドリ陽性 (m) Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｏ−ベンジ
ル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニル−
Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニル−Ｏ−ベンジル
−Ｌ−セリル−Ｓ−ｐ−メトキシベンジル−Ｌ
−システインベンジルエステル（13） Boc−Thr（Bzl）−Phe−OH(8)9.2ｇ（20ミリ
モル）をDMF100mlに溶解し、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド3.4ｇおよびＨ−Thr（Bzl）−
Ser（Bzl）−Cys（SMBzl）OBzl・TFA塩(12)20
ミリモルのTEAでPH７に中和したDMF20ml中
溶液と混合する。混合液を氷浴中で冷却し、冷
時DCC4.5ｇで２時間、ついで室温で２日間処
理する。DCUを去し、液を蒸発乾固させ
る。残渣を水でトリチユレートし、得られた沈
澱を酢酸エチルにとり、５％クエン酸、水、５
％炭酸ナトリウム、水で洗浄し、硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、蒸発乾固させる。残渣をエチルエ
ーテル−ヘキサンで固化させる。これはメタノ
ールから結晶でき、CHCl₃にきわめてよく溶解
する。収率17.3ｇ（70％）、融点105〜107℃、
R_f＝0.90（CHCl₃−メタノール、10：１）、〔α〕²⁵ _D＝−3.6゜（ｃ＝１、DMF）元素分析、C₆₄H₇₅N₅SO₁₂H₂O（1156.2）として、計算値(%)：Ｃ、66.46；Ｈ、6.71；Ｎ、6.05 実測値(%)：Ｃ、66.68；Ｈ、6.59；Ｎ、6.20 (n) ｔ−ブトキシカルボニル−Ｄ−トリプトフ
イル−N〓−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
リジルメチルエステル（14） Boc−Ｄ−Trp−OH30.4ｇ（0.1モル）、Ｈ−
Lys（Ｚ）−OMe・HCl33ｇ（0.1モル）および
TEA13.6mlをDMF400mlに溶解し、氷浴中で
冷却し、DCC22ｇを加え、室温で一夜放置す
る。分離したDCUを去し、液を少量に濃
縮し、過剰の水を加えてガム質を得る。これを
酢酸エチルにとり、10％水性クエン酸、水、飽
和重炭酸ナトリウム溶液、ついで水で洗浄し、
硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させる。残
渣をエーテル、ついでヘキサンでトリチユレー
トし、結晶固体28ｇを得る。 TLC：シリカゲルＧ、ヘキサン−酢酸エチル
（１：1V／Ｖ）R_f＝0.3 (o) ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−フエニルア
ラニル−Ｄ−トリプトフイル−N〓−ベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−リジン（15）１ Boc−Ｄ−Trp−Lys（Ｚ）−OMe22ｇ（44
ミリモル）を、あらかじめ冷却したTFA220
mlおよびアニソール25mlの混合液に加え、氷
浴中で30分間撹拌する。ロータリー・エバポ
レータ上、27℃でTFAを速やかに蒸発させ、
残つた油をヘキサン−エーテル（２：１）で
数回トリチユレートし、デカンテーシヨン
し、最後にポンプで吸引してガム質21.3ｇ
（36ミリモル）を得る。２ Boc−Phe−OH9.6ｇ（36ミリモル）、Ｎ−
ヒドロキシベンゾトリアゾール5.3ｇ（39ミ
リモル）およびDCC8ｇ（39ミリモル）を冷
CH₂Cl₂ 500ml中で20分間撹拌する。CH₂Cl₂
200ml中Ｈ−Ｄ−Trp−Lys（Ｚ）−OMe・
TFA塩21.3ｇ（36ミリモル）、ついでＮ−メ
チルモルホリン4.25ml（39ミリモル）を加え
る。反応混合液を室温で一夜撹拌する。
DCCを去し、液を水で２回、10％クエ
ン酸で２回、飽和重炭酸ナトリウムで２回、
水で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥す
る。過し、蒸発させて、残渣21.4ｇ（82
％）を得、これはさらに精製することなく使
用する。 TLC：シリカゲルＦ−254（CHCl₃−メタノ
ール−酢酸（９：１：0.5）R_f＝0.76＋痕
跡の不純物３ Boc−Phe−Ｄ−Trp−Lys（Ｚ）−
OMe22.9ｇ（31.4ミリモル）をｐ−ジオキサ
ン450mlおよびメタノール100mlに溶解し、
1N水性水酸化カリウム39mlを加え、室温で
一夜撹拌する。この溶液をロータリー・エバ
ポレータで蒸発させ、残渣を温水500mlに溶
解し、10％クエン酸でPH３の酸性とし、30分
間撹拌し、過する。真空下で一夜乾燥し、、
生成物21.6ｇ（96％）を得る。融点85〜90
℃、〔α〕²⁶ _D＋7.09（ｃ＝0.987、メタノール） TLC：シリカゲルＦ−254（CHCl₃−メタノ
ール−酢酸、９：１：0.5）R_f＝0.63 (p) ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−フエニルア
ラニル−Ｄ−トリプトフイル−N〓−ベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−リジル−Ｏ−ベンジル
−Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｏ
−ベンジル−Ｌ−スレオニル−Ｏ−ベンジル−
Ｌ−セリル−Ｓ−ｐ−メトキシベンジル−Ｌ−
システインベンジルエステル（16）１ Boc−Thr（Bzl）−Phe−Thr（Bzl）−Ser−
（Bzl）−Cys（SMBzl）−OBzl（13）40.5ｇ
（35ミリモル）をTFA400mlおよびアニソー
ル40mlの***液に加え、冷時30分間撹拌す
る。ロータリー・エバポレータでTFAを蒸
発させ、残渣をエーテル−ヘキサン（１：
１）１でトリチユレートして白色粉末を得
る。過し、エーテル−ヘキサンで洗浄し、
真空下、五酸化リンおよび水酸化ナトリウム
顆粒で乾燥する。収量34.6ｇ（82％）、融点
136〜139℃（軟化120℃）、〔α〕²⁶ _D−9.93゜（ｃ
＝1.04、メタノール） TLC：シリカゲル（CHCl₃−メタノール−
酢酸、９：１：0.05）R_f＝0.63、少量のよ
り極性の不純物R_f＝0.53 ２ Boc−Phe−Ｄ−Trp−Lys（Ｚ）−OH20.0
ｇ（27.9ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール4.15ｇ（30.8ミリモル）および
DCC6.3ｇ（30.8ミリモル）を冷CH₂Cl₂ 2.0
中氷浴中で30分間撹拌する。Ｈ−Thr
（Bzl）−Phe−Thr（Bzl）−Ser（Bzl）−Cys
（SMBzl）−OBzl・TFA塩32.6ｇ（27.9ミリ
モル）、ついでＮ−メチルモルホリン3.35ml
（30.8ミリモル）を加え、室温で一夜撹拌す
る（TLCは２時間後、実質的に反応が完了
したことを示した。）。この混合物を過し液を水、10％クエン
酸、水、飽和重炭酸ナトリウム溶液、ついで
水で洗浄し、乾燥する。過し、蒸発する
と、TLCは目的とする生成物とより極性の
不純物を示し、これは粗生成物を温DMF200
mlに溶解し、２％水性重炭酸ナトリウム１
を加えて除去できる。生成物を取し、稀重
炭酸ナトリウム溶液および水で洗浄し、真空
下、五酸化リンで乾燥する。収量36.5ｇ（75
％）、融点182〜184℃（収縮150℃）、〔α〕²⁶ _D
±0゜（ｃ＝0.988、CHCl₃） TLC：シリカゲル（CHCl₃−メタノール−
酢酸、９：１：0.05）R_f＝0.76（単一スポ
ツト）。 (q) Ｌ−フエニルアラニル−Ｄ−トリプトフイ
ル−N〓−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リ
ジル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−フ
エニルアラニル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニ
ル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリル−Ｓ−ｐ−メト
キシベンジル−Ｌ−システイントリフルオロ酢
酸塩（17） Boc−Phe−Ｄ−Trp−Lys（Ｚ）−Thr（Bzl）
−Phe−Thr（Bzl）−Ser（Bzl）−Cys（SMBzl）
−OBzl32ｇおよびアニソール33mlをCH₂Cl₂
50mlに溶解し、TFA100mlを加え、室温で30分
間撹拌する。この溶液をロータリー・エバポレ
ータ上、30℃で蒸発させる。残渣を乾燥エーテ
ルでトリチユレートし、固体を取し、エーテ
ルで洗浄し、真空下、五酸化リンおよび水酸化
ナトリウム顆粒で乾燥する。 TLC：シリカゲル60（CHCl₃−メタノール−酢
酸、９：１：0.5）R_f＝0.65（単一スポツト） HNMR：ｔ−ブチルのピーク示さず。 (r) ｔ−ブトキシカルボニル−Ｓ−ｐ−メトキ
シベンジル−Ｌ−システイニル−Ｌ−ヒスチジ
ル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−フエニルアラニル−
Ｌ−フエニルアラニル−Ｄ−トリプトフイル−
N〓−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル
−Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニ
ルアラニル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニル−
Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリル−Ｓ−ｐ−メトキシ
ベンジル−Ｌ−システインベンジルエステル
（18） Boc−Cys（SMBzl）−His−His−Phe−
OH5.5ｇ（7.2ミリモル）、１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール−水化物1.07ｇ（7.9ミリモル）
およびDCC1.65ｇ（7.9ミリモル）を乾燥
DMF100ml中、氷浴中で30分間撹拌する。Ｈ−
Phe−Ｄ−Trp−Lys（Ｚ）−Thr（Bzl）−Phe−
Thr−（Bzl）−Ser（Bzl）−Cys（SMBzl）−
OBzl・TFA塩12.5ｇ（7.2ミリモル）およびＮ
−メチルモルホリン0.855ｇ（7.65ミリモル）
を加え、室温で一夜撹拌する。この懸濁液を
過してDCUを除去し、溶液を50mlに蒸発させ、
飽和水性重炭酸ナトリウム溶液500mlで稀釈す
る。生成した固体を取し、水洗し、DMF200
mlに再溶解する。この溶液を５％水性クエン酸
１で稀釈し、過する。固体を水洗し、
DMF200mlに溶解し、飽和重炭酸ナトリウム溶
液１で沈澱させる。沈澱を取し、水洗し、
真空下、室温で五酸化リンで乾燥する。収量15
ｇアミノ酸分析：His1.66（2.0）、Lys1.05（1.0）、
Phe（3.0）、Ser1.02（1.0）Thr2.2（2.0） (s) Ｌ−システイニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−
ヒスチジル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエ
ニルアラニル−Ｄ−トリプトフイル−Ｌ−リジ
ル−Ｌ−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニル−
Ｌ−スレオニル−Ｌ−セリル−Ｌ−システイン
環状（１→12）ジスルフイド（19） Boc−Cys（SMBzl）−His−His−Phe−Phe
−Ｄ−Trp−Lys（Ｚ）−Thr（Bzl）−Phe−Thr
（Bzl）−Ser−（Bzl）−Cys（SMBzl）−OBzl5ｇ
をアニソール10mlと混合し、液化フツ化水素
100mlで、排気条件下、氷浴中で60分間処理す
る。真空下、過剰のフツ化水素を除去し、残渣
を10％水性酢酸200mlにとり、脱気した水７
に注ぐ。稀水酸化アンモニウムでPH７に調整
し、開放雰囲気下で24時間撹拌する。氷酢酸で
PH５とし、この溶液をアンバーライトCG50
（H⁺型）のカラムに通す。該イオン交換樹脂に
吸着されたペプチド物質を50％水性酢酸で溶出
させ、ペプチドを含有するフラクシヨンを合
し、凍結乾燥して粗生成物２ｇを得る。この粗
ドデカペプチドをセフアデツクスＧ−25のカラ
ムクロマトグラフイーに付し、10％水性酢酸、
で溶出させ、ついで、ｎ−ブタノール−水−氷
酢酸（４：５：1V／Ｖ）２相系を用いてセフ
アデツクスＧ−25の分配クロマトグラフイーに
付し精製する。 TLC：シリカゲル・メルクA.G.塩素ペプチ
ド・スプレー〔D.E.Nitecki et al.、
Biochem.5、665（1966）〕、R_f＝0.45（BWA−
４：１：１）、R_f＝0.64（BWAP−30：24：
６：20）アミノ酸分析：Thr(2)1.85、Ser(1)0.79、Phe(3)
３、Lys(1)1.02、His(2)1.75、CysおよびTrp
N.D. この実施例14の古典的合成法においては、当該
分野の技術者に明らかなように、別のカツプリン
グ剤および保護基を用いることもできる。さら
に、別の順序のアミノ酸残基を用いて所望のペプ
チドを得ることもできる。これらも全て本発明範
囲のものである。[Table] As shown by this result, the peptides of Examples 10 and 12, which are other representative peptides of the present invention,
without substantially affecting insulin concentrations at doses of 40 μg/Kg and 50 μg/Kg, respectively.
It is an effective drug in reducing growth hormone and glucagon. In addition, the sustainability of the effects of the peptides of Examples 10 and 12 on growth hormone secretion was tested in rats treated with Nembutal.
The peptide of Example 10 showed significant inhibition of growth hormone for at least 4 hours at a dose of 1000 mg/Kg (s.c.). The peptide of Example 12 was tested for 2 hours and 4 hours.
There was no significant suppression of growth hormone over time. The compounds of the present invention can be administered to humans and other warm-blooded animals either intravenously, subcutaneously, intramuscularly or orally for the regulation of serum glucose in the treatment of diabetes. The required dose will vary depending on the condition being treated, the severity of the symptoms and the duration of treatment. The active ingredient can be administered alone or in a composition with a pharmaceutical carrier or excipient. Suitable pharmaceutical compositions will be apparent to those skilled in the art. Example 14 L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopyl-L-lysyl-
L-threonyl-L-phenylalanyl-L-
Classical synthesis of threonyl-L-seryl-L-cysteine cyclic (1→12) disulfide (a) N-benzyloxycarbonyl-N ^im -benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-
Phenylalanine methyl ester (1) Z-His(Z)-OH42.3g in 1000ml CH ₂ Cl ₂
(0.1 mol) and H-Phe-OMe-HCl (98%)
A suspension of 21.8 g (0.1 mol) was cooled to 0°C,
DCC22g (0.12mol) and TEA10.1g (0.10
mol). This mixture is left at room temperature overnight. Remove the separated dicyclohexylurea,
Concentrate the liquid to obtain a gum. This was dissolved in ethyl acetate and the insoluble materials were removed. The ethyl acetate is washed with 5% citric acid, water, ice-cold 5% sodium bicarbonate solution, then water. Dry the organic layer over sodium sulfate, concentrate to 1/3, add 500 ml of ether until the solution becomes cloudy, and leave in a cool place overnight. The white solid formed is separated and dried (32 g). Melting point 131-133°C TLC: Silica gel F-254, CH ₂ Cl ₂ -methanol (9:1), R _f =0.8 (b) N ^im -benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phenylalanine methyl ester di Hydrobromide (2) Z-His(Z)-Phe-OMe(1) 30g (0.5mol)
is dissolved in 300 ml of HBr-acetic acid (32%) (the solution becomes cloudy after 2 minutes), the mixture is left at room temperature for 30 minutes and ether is added to form a precipitate. Take the soft solid and dry it overnight to get 32g of solid.
get. Melting point 135-137°C TLC: No migration. (c) N-benzyloxycarbonyl-N ^im -benzyloxycarbonyl-L-histidyl-N ^im
-Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phenylalanine methyl ester (3) H-His(Z)-Phe-OMe・2HBr(2) 30.5g
A suspension of 21.7 g (0.05 mol) of Z-His(Z)-OH (0.05 mol) in 500 ml _of _CH2Cl2 is cooled to 0<0>C. Then, 11 g of DCC and 10.1 g (0.10 mol) of TEA are added and left overnight at room temperature. Remove the generated dicyclohexylurea,
Concentrate the liquid to obtain a glass-like material. Dissolve the residue in ethyl acetate and add this solution to 10% citric acid,
Wash with water, ice-cold 5% sodium bicarbonate solution, then water. Dry this ethyl acetate solution over sodium sulfate, concentrate to 1/3, add ether to make it cloudy, and leave it in a cool place. 29.5g white solid
Separate. (d) L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanine methyl ester trihydrochloride (4) Z-His(Z)-His(Z)-Phe-OMe(3) 29 g,
A mixture of 10.8 ml of concentrated hydrochloric acid, 180 ml of methanol, and 2 tablespoons of 10% palladium on carbon is hydrogenated for 5 hours using a Parr hydrogenator. After filtration, the methanol is concentrated to obtain an oil,
Add ether to form a solid. crude product
18 g is used in the next reaction without further purification. (e) t-butoxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanine methyl ester (5) Boc-Cys(MBzl)-OH13g (0.038 mol),
5.4 g (0.040 mol) of hydroxybenztriazole and 8.3 g (0.040 mol) of DCC were cooled on ice.
Stir in CH ₂ Cl ₂ 1 for 30 minutes. H-His-
His-Phe-OMe.3HCl(4) 19.5g (0.0345mol)
and 10.5 ml (0.096 mol) of N-methylmorpholine are added and the mixture is mixed overnight at room temperature. This suspension was filtered to remove dicyclohexylurea (DCU), and the solution was sequentially washed with water and
Wash with 10% carbonic acid, water and dry with sodium sulfate. After filtration, the solvent is removed under vacuum to obtain 21.0 g of crude product. Add this substance to acetonitrile
Stir for 30 minutes at room temperature with 100 ml and filter.
The precipitate is washed with acetonitrile and then with ether and dried. Yield 11g TLC: silica gel 60, CHCl ₃ -methanol-
Acetic acid (9:1:0.5V/V) R _f =0.12 The acetonitrile extract liquid contains the desired product and impurities and can be used to extract other crude batches. (f) t-Butoxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanine (6) Boc-Cys(MBzl)-His-His-Phe-OMe
(5) Dissolve 11.0g (0.0142mol) in 200ml of methanol and add 30ml of 1N potassium hydroxide. The solution is stirred at room temperature for 2 hours and the methanol is removed under vacuum. Dilute the residue with 200ml of water,
pass Adjust the liquid to PH5 with 10% citric acid,
The gummy precipitate is allowed to crystallize. The product is taken, washed with water and dried over phosphorus pentoxide under vacuum. Yield 7.3g (67%) TLC: Silica gel 60., n-butanol-ethyl acetate-acetic acid-water-(1:1:1:1V/V)
R _f =0.52; silica gel 60, t-amyl alcohol-pyridine-water (7:6:7V/V) R _f
=0.43 (g) N-t-butoxycarbonyl-O-benzyl-L-sulonyl-L-phenylalanine methyl ester (7) Boc-L-Thr(Bzl)-OH61.8g (0.2 mol)
and 22.4 ml (0.2 mol) of N-methylmorpholine
A solution of -15 in tetrahydrofuran (THF)
Cool to ℃. 26.2 ml (0.2 mol) of isobutyl chloroformate are added in portions, maintaining the temperature at -15 to -10°C. After stirring at -15℃ for 15 minutes, -10 to -5
℃ and L-Phe-OMe.HCl43.1g (0.2
mol) and N-methylmorpholine (22.4 ml (0.2 mol)) in DMF is added little by little. The mixture is stirred at 0° C. for 2 hours and then at room temperature overnight. The reaction mixture is filtered and concentrated under vacuum and the residue is taken up in ethyl acetate. The ethyl acetate solution is washed sequentially with 5% KHSO ₄ , 5% KHCO ₃ and brine, and dried over sodium sulfate. Concentrate under vacuum and leave the resulting oil to crystallize.
The solid is recrystallized from isopropyl ether-hexane (74.9 g, 80%). Melting point 78-81℃,
[α] ²⁴ _D +10.75゜(c=1.023, methanol), R _f
(CHCl ₃ ) = 0.35 Elemental analysis: C ₂₆ H ₃₄ N ₃ O ₆ (4470.55) Calculated value (%): C, 66.36; H, 7.28; N, 5.95 Actual value (%): C, 66.72; H , 7.32; N, 5.85 (h) N-t-butoxycarbonyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanine (8) Boc-Thr(Bzl)-Phe-OMe(7) 23.5 g (0.05
mol) to methanol-dioxane (1:1)
Dissolve in 100ml and add 3.5ml with 55ml of 1N sodium hydroxide.
Process for an hour (until no starting material is detected by TLC). Most of the solvent is evaporated under vacuum and the residue is diluted with water and acidified with 5% citric acid. The separated gum substance is taken up in ethyl acetate, washed with water (saline solution), and evaporated to dryness. The residue is recrystallized from ethyl ether-hexane (19.8 g, 87%). Melting point 118-119℃, R _f =0.80
(CHCl ₃ -methanol-glacial acetic acid, 85:10:5) (i) N-t-butoxycarbonyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzylserine methyl ester (9) Boc-Thr(Bzl)-OH30 Dissolve .9 g (0.1 mol) in 200 ml of dry THF (cooled to -20°C) and add N-
Treat with 11 ml of methylmorpholine and then with 13.4 ml of isobutyl chloroformate. The cold reaction mixture was stirred at -20°C for 5 min and the H-Ser(Bzl)-OMe.
It is treated with a solution of 25 g of HCl (approximately 0.1 mol) in 11 ml of N-methylmorpholine in DME and left overnight at room temperature. The solvent is removed under vacuum and the residue is partitioned between water and ethyl acetate. The organic layer is washed with 5% citric acid, water, aqueous KHCO ₃ , water and dried over magnesium sulfate. Evaporate to dryness and crystallize the oily residue from diethyl ether-hexane.
29 g of jelly-like solid are obtained. R _f = 0.85 (CHCl ₃ −
methanol, 25:1), R _f =0.65 (ethyl acetate)
Hexane, 1:1) (j) N-t-butoxycarbonyl-O-benzyl-threonyl-O-benzyl-L-serine (10) Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-OMe(9) 28.2 g
(0.0563 mol) in about 50 ml of methanol,
Treat with 75 ml of 1N sodium hydroxide for 1.5 hours at room temperature. Add this alkaline solution to 10% citric acid.
Neutralize to pH 7 and remove most of the methanol under vacuum. Dilute the residue with a small amount of water to make 5% aqueous
Acidify with KHSO ₄ and extract with ethyl acetate.
The organic layer is washed with water, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness to give an oil (quantitative yield). R _f =
0.15 (long spot) (ethyl acetate-hexane 1:1) (k) N-t-butoxycarbonyl-O-benzyl-1-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteine Benzyl ester (11) Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-OH(10)24.3g
(50 mmol) in acetonitrile - CH ₂ Cl ₂
(2:3) dissolved in 250ml, H-Cys-(SMBzl)
−Bzl−Tos−OH25g (50 mmol), then
Mix with 6.8 ml of TEA and 6.8 g of N-hydroxybenzotriazole and cool the mixture in an ice bath. DCC11g (53mmol) acetonitrile
50 ml of the solution are added and the reaction mixture is stirred in the cold for 2 hours and then at room temperature for 2 days. Remove the separated DCU and evaporate the liquid to dryness. The oily residue was partitioned between ethyl acetate and water and the organic layer was diluted for 10 min.
Wash with % citric acid, water, 5% KHCO ₃ , brine and dry over sodium sulfate. The solvent is evaporated and the oily residue is crystallized from ethyl ether-hexane to give 24.5 g of a white solid. Melting point 87~
90℃ TLC: R _f = 0.54, 0.4 (trace) and 0.3 (trace)
( _CHCl3 -methanol, 25:1); _Rf = 0.64 and 0.25 (trace) (heptane-ethyl acetate),
I ₂ positive [α] ²⁵ _D -14.7゜ (c = 0.98, DMF) Elemental analysis: C ₄₄ H ₅₂ N ₂ SO ₉ (798.9) Calculated value (%): C, 66.15; H, 6.56; N, 5.26 Actual value (%): C, 66.22; H, 6.95; N, 5.29 (l) O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-
L-cysteine benzyl ester trifluoroacetate (12) Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)
-8 g (10 mmol) of OBzl(11) in 100 g of anisole
Mix with mmol and treat with 100 ml of TFA for 45 min. The solvent is evaporated under vacuum and the residue is dissolved in dry ethyl ether and then evaporated to dryness under high vacuum to give 7.2 g (90%) of an oily compound. R _f
= 0.9 (n-butanol-water-glacial acetic acid, 4:1:
1), R _f = 0.0 to 0.1 (heptane-ethyl acetate)
(long spot), _I2 and Ninhydri positive (m) N-t-butoxycarbonyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-
O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L
-Cysteine benzyl ester (13) Boc-Thr(Bzl)-Phe-OH (8) 9.2g (20 mmol) was dissolved in DMF 100ml, N-hydroxysuccinimide 3.4g and H-Thr(Bzl)-
Ser(Bzl)−Cys(SMBzl)OBzl・TFA salt(12)20
Mix with a solution in 20 ml of DMF neutralized to pH 7 with mmol of TEA. The mixture is cooled in an ice bath and treated cold with 4.5 g of DCC for 2 hours and then at room temperature for 2 days. Remove the DCU and evaporate the liquid to dryness. The residue was tritiated with water and the resulting precipitate was taken up in ethyl acetate and diluted with 5% citric acid, water, 5%
% sodium carbonate, water, dry over sodium sulfate and evaporate to dryness. The residue is solidified with ethyl ether-hexane. It can be crystallized from methanol and is very soluble in CHCl ₃ . Yield 17.3g (70%), melting point 105-107℃,
R _f = 0.90 (CHCl ₃ -methanol, 10:1), [α] ²⁵ _D = -3.6° (c = 1, DMF) Elemental analysis, C ₆₄ H ₇₅ N ₅ SO ₁₂ H ₂ O (1156.2), Calculated value (%): C, 66.46; H, 6.71; N, 6.05 Actual value (%): C, 66.68; H, 6.59; N, 6.20 (n) t-Butoxycarbonyl-D-tryptophyl-N-benzyl Oxycarbonyl-L-
Lysyl methyl ester (14) Boc-D-Trp-OH30.4g (0.1 mol), H-
Lys(Z)-OMe・HCl33g (0.1mol) and
Dissolve 13.6 ml of TEA in 400 ml of DMF, cool in an ice bath, add 22 g of DCC, and leave at room temperature overnight. Remove the separated DCU, concentrate the liquid to a small volume and add excess water to obtain a gum. This was taken up in ethyl acetate and washed with 10% aqueous citric acid, water, saturated sodium bicarbonate solution, then water,
Dry with sodium sulfate and evaporate to dryness. Trituration of the residue with ether and then hexane gives 28 g of a crystalline solid. TLC: Silica gel G, hexane-ethyl acetate (1:1 V/V) R _f =0.3 (o) t-butoxycarbonyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-N-benzyloxycarbonyl-L-lysine (15) 1 Boc-D-Trp-Lys(Z)-OMe22g(44
mmol), pre-chilled TFA220
ml and 25 ml of anisole and stir in an ice bath for 30 minutes. Rapidly evaporate TFA at 27 °C on a rotary evaporator.
The remaining oil was tritiated several times with hexane-ether (2:1), decanted, and finally pumped to give 21.3 g of gum.
(36 mmol) is obtained. 2 Boc-Phe-OH9.6g (36 mmol), N-
5.3 g (39 mmol) of hydroxybenzotriazole and 8 g (39 mmol) of DCC are
Stir in 500 ml of CH ₂ Cl ₂ for 20 minutes. _CH2Cl2 _{_}
HD-Trp-Lys(Z)-OMe in 200ml
21.3 g (36 mmol) of TFA salt is added followed by 4.25 ml (39 mmol) of N-methylmorpholine. The reaction mixture is stirred at room temperature overnight.
The DCC was removed and the solution was washed twice with water, twice with 10% citric acid, and twice with saturated sodium bicarbonate.
Wash twice with water and dry with sodium sulfate. Filtration and evaporation left a residue of 21.4 g (82
%), which is used without further purification. TLC: Silica gel F-254 (CHCl ₃ -methanol-acetic acid (9:1:0.5) R _f =0.76 + trace impurities 3 Boc-Phe-D-Trp-Lys (Z)-
Dissolve 22.9 g (31.4 mmol) of OMe in 450 ml of p-dioxane and 100 ml of methanol,
Add 39 ml of 1N aqueous potassium hydroxide and stir overnight at room temperature. The solution is evaporated on a rotary evaporator, the residue is dissolved in 500 ml of warm water, acidified to pH 3 with 10% citric acid, stirred for 30 minutes and filtered. Dry under vacuum overnight,
21.6 g (96%) of product are obtained. Melting point 85-90
°C, [α] ²⁶ _D +7.09 (c = 0.987, methanol) TLC: Silica gel F-254 (CHCl ₃ -methanol-acetic acid, 9:1:0.5) R _f =0.63 (p) t-butoxycarbonyl-L -Phenylalanyl-D-tryptopyl-N-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O
-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-
L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-
Cysteine benzyl ester (16) 1 Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser-
(Bzl) - Cys (SMBzl) - OBzl (13) 40.5g
(35 mmol) is added to a cold solution of 400 ml of TFA and 40 ml of anisole and stirred for 30 minutes while cold. The TFA was evaporated on a rotary evaporator and the residue was purified with ether-hexane (1:
1) Tritulate in 1 to obtain a white powder. filtered, washed with ether-hexane,
Dry under vacuum with phosphorus pentoxide and sodium hydroxide granules. Yield 34.6g (82%), melting point
136-139℃ (softening 120℃), [α] ²⁶ _D -9.93゜(c
= 1.04, methanol) TLC: Silica gel (CHCl ₃ -methanol-
acetic acid, 9:1:0.05) R _f =0.63, a small amount of more polar impurity R _f =0.53 2 Boc-Phe-D-Trp-Lys(Z)-OH20.0
g (27.9 mmol), N-hydroxybenzotriazole 4.15 g (30.8 mmol) and
6.3 g (30.8 mmol) of DCC in cold CH ₂ Cl ₂ 2.0
Stir for 30 minutes in a medium ice bath. H-Thr
(Bzl)−Phe−Thr(Bzl)−Ser(Bzl)−Cys
(SMBzl)-OBzl・TFA salt 32.6 g (27.9 mmol), then 3.35 ml N-methylmorpholine
(30.8 mmol) and stirred at room temperature overnight (TLC showed essentially complete reaction after 2 hours). The mixture is filtered and washed with water, 10% citric acid, water, saturated sodium bicarbonate solution, then water, and dried. Upon filtration and evaporation, TLC showed the desired product and a more polar impurity, which caused the crude product to be heated to 200 ml of DMF.
2% aqueous sodium bicarbonate dissolved in 1 ml
can be added and removed. The product is taken, washed with dilute sodium bicarbonate solution and water, and dried over phosphorus pentoxide under vacuum. Yield 36.5g (75
%), melting point 182-184℃ (shrinkage 150℃), [α] ²⁶ _D
±0° (c=0.988, CHCl ₃ ) TLC: Silica gel (CHCl ₃ -methanol-
Acetic acid, 9:1:0.05) R _f =0.76 (single spot). (q) L-phenylalanyl-D-tryptopyl-N-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl- S-p-methoxybenzyl-L-cysteine trifluoroacetate (17) Boc-Phe-D-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)
−Phe−Thr(Bzl)−Ser(Bzl)−Cys(SMBzl)
−32 g of OBzl and 33 ml of anisole in CH ₂ Cl ₂
Dissolve in 50 ml, add 100 ml of TFA, and stir at room temperature for 30 minutes. The solution is evaporated on a rotary evaporator at 30°C. The residue is tritiated with dry ether, the solid taken off, washed with ether and dried under vacuum over phosphorus pentoxide and sodium hydroxide granules. TLC: Silica gel 60 (CHCl ₃ -methanol-acetic acid, 9:1:0.5) R _f =0.65 (single spot) HNMR: No peak of t-butyl. (r) t-Butoxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-
L-phenylalanyl-D-tryptopyl-
N〓-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-
O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteine benzyl ester (18) Boc-Cys(SMBzl)-His-His-Phe-
OH5.5g (7.2mmol), 1-hydroxybenzotriazole hydrate 1.07g (7.9mmol)
and DCC 1.65 g (7.9 mmol) dried
Stir in 100 ml of DMF in an ice bath for 30 minutes. H-
Phe−D−Trp−Lys(Z)−Thr(Bzl)−Phe−
Thr−(Bzl)−Ser(Bzl)−Cys(SMBzl)−
OBzl・TFA salt 12.5 g (7.2 mmol) and N
- Methylmorpholine 0.855 g (7.65 mmol)
and stir overnight at room temperature. The DCU was removed by straining the suspension and the solution was evaporated to 50 ml.
Dilute with 500 ml of saturated aqueous sodium bicarbonate solution. Take the generated solid, wash it with water, and add it to DMF200.
Redissolve in ml. The solution is diluted with 1 part of 5% aqueous citric acid and filtered. Wash the solid with water,
Dissolve in 200 ml of DMF and precipitate with 1 part of saturated sodium bicarbonate solution. Remove the precipitate, wash with water,
Dry over phosphorus pentoxide at room temperature under vacuum. yield 15
g Amino acid analysis: His1.66 (2.0), Lys1.05 (1.0),
Phe (3.0), Ser1.02 (1.0) Thr2.2 (2.0) (s) L-cysteinyl-L-histidyl-L-
Histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-
L-threonyl-L-seryl-L-cysteine cyclic (1→12) disulfide (19) Boc-Cys (SMBzl)-His-His-Phe-Phe
−D−Trp−Lys(Z)−Thr(Bzl)−Phe−Thr
(Bzl)-Ser-(Bzl)-Cys(SMBzl)-OBzl5g
Mix with 10 ml of anisole and liquefy hydrogen fluoride.
Treat with 100 ml for 60 min in an ice bath under evacuated conditions. Excess hydrogen fluoride was removed under vacuum and the residue was taken up in 200 ml of 10% aqueous acetic acid and diluted with degassed water.
Pour into. Adjust the pH to 7 with dilute ammonium hydroxide and stir under open atmosphere for 24 hours. with glacial acetic acid
Adjust the pH to 5 and add this solution to Amberlite CG50.
(H ⁺ type) column. The peptide material adsorbed on the ion exchange resin is eluted with 50% aqueous acetic acid, and the peptide-containing fractions are combined and lyophilized to obtain 2 g of crude product. This crude dodecapeptide was subjected to column chromatography on Sephadex G-25, 10% aqueous acetic acid,
The product is then purified by partition chromatography on Sephadex G-25 using a two-phase n-butanol-water-glacial acetic acid (4:5:1 V/V) system. TLC: Silica gel Merck AG chloride peptide spray [DENitecki et al.,
Biochem.5, 665 (1966)], R _f =0.45 (BWA−
4:1:1), R _f =0.64 (BWAP-30:24:
6:20) Amino acid analysis: Thr(2)1.85, Ser(1)0.79, Phe(3)
3, Lys(1)1.02, His(2)1.75, Cys and Trp
ND In this classical synthesis of Example 14, other coupling agents and protecting groups can also be used, as will be apparent to those skilled in the art. Additionally, other orders of amino acid residues can be used to obtain the desired peptide. All of these are also within the scope of the present invention.

Claims

【特許請求の範囲】１式：［式中、Ａは水素または２個のＡ基は該２個の硫
黄原子間に形成された架橋結合を意味する；Ｘは
水素；X₁はHisまたはArg；X₂はHisまたは
Glu；X₃はＤ−Trp；X₄はCysまたはＤ−Cysを
意味する］で示される化合物またはその医薬上許容される
塩。２２個のＡ基が架橋結合を形成している前記１
項の化合物。３Ｌ−システイニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ヒ
スチジル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニル
アラニル−Ｄ−トリプトフイル−Ｌ−リジル−Ｌ
−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−スレ
オニル−Ｌ−セリル−Ｌ−システイン環状（１→
12）ジスルフイドである前記１項の化合物。４Ｌ−システイニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−ヒ
スチジル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニル
アラニル−Ｄ−トリプトフイル−Ｌ−リジル−Ｌ
−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−スレ
オニル−Ｌ−セリル−Ｌ−システイン環状（１→
12）ジスルフイドである前記１項の化合物。５Ｌ−システイニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ヒ
スチジル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニル
アラニル−Ｄ−トリプトフイル−Ｌ−リジル−Ｌ
−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−スレ
オニル−Ｌ−セリル−Ｄ−システイン環状（１→
12）ジスルフイドである前記１項の化合物。６Ｌ−システイニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−グ
ルタミル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニル
アラニル−Ｄ−トリプトフイル−Ｌ−リジル−Ｌ
−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−スレ
オニル−Ｌ−セリル−Ｌ−システイン環状（１→
12）ジスルフイドである前記１項の化合物。７Ｌ−システイニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−グ
ルタミル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−フエニル
アラニル−Ｄ−トリプトフイル−Ｌ−リジル−Ｌ
−スレオニル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−スレ
オニル−Ｌ−セリル−Ｌ−システイン環状（１→
12）ジスルフイドである前記１項の化合物。８塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、
ポリリン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸
塩、安息香酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩および
アスコルビン酸塩からなる群から選ばれる医薬上
許容される酸付加塩の形である前記１〜７項いず
れか１つの化合物。９ペプチド中のアミノ酸残基に１個またはそれ
以上の保護側鎖および／または末端アミノ基およ
びカルボキシ基に保護基を有する対応する化合物
を脱保護することを特徴とする式：［式中、Ａは水素または２個のＡ基は該２個の硫
黄原子間に形成された架橋結合を意味する；Ｘは
水素；X₁はHisまたはArg；X₂はHisまたは
Glu；X₃はＤ−Trp；X₄はCysまたはＤ−Cysを
意味する］で示される化合物またはその医薬上許容される塩
の製法。１０式：［式中、Ｒはカルボキシ保護基またはメチレン基
を介して結合したポリスチレン樹脂担体；R₁は
α−アミノ保護基；B₁は【式】または【式】 R²は水素またはヒスチジンのイミダゾール窒素
原子保護基；R³はアルギニンの側鎖窒素原子保
護基；B₂は【式】または【式】R⁴はグルタミン酸の側鎖カルボキシ基保護基；R⁵はリジンの
側鎖アミノ基保護基；R⁶、R⁷およびR⁸は、各々、
スレオニンおよびセリンのヒドロキシ基保護基；
X₃はＤ−Trp；X₄はCysまたはＤ−Cys；αおよ
びβは、各々、スルフヒドリル保護基または水素
あるいはαおよびβは該２個の硫黄原子間に形成
された架橋結合を意味する］で示される化合物の全ての保護基および、存在す
る場合はポリスチレン樹脂担体を離脱させ、所望
により、得られた後記式［］の化合物を酸化ま
たは還元し、さらに遊離塩基または医薬上許容さ
れる塩に変えることを特徴とする式：［式中、Ａは水素または２個のＡ基は該２個の硫
黄原子間に形成された架橋結合を意味する；Ｘは
水素；X₁はHisまたはArg；X₂はHisまたは
Glu；X₃はＤ−Trp；X₄はCysまたはＤ−Cysを
意味する］で示される化合物またはその医薬上許容される塩
の製法。１１ポリスチレン樹脂担体および／または保護
基を、アニソールの存在下、フツ化水素で処理し
て１工程で離脱させる前記１０項の製法。１２Ａが水素の対応する式［］の化合物を酸
化して２個のＡ基が硫黄原子間で架橋結合を形成
する式［］の化合物を得る前記１０項の製法。１３固相合成条件下、適宜保護および／または
活性化された必要なアミノ酸を順次クロロメチル
化またはヒドロキシメチル化樹脂担体にカツプリ
ングさせてαおよびβが保護基、Ｒがポリスチレ
ン樹脂担体の式［］の化合物を得る前記１０項
の製法。１４ αおよびβが、各々、水素の式［］の化
合物を酸化した、αおよびβが架橋結合を形成し
ている対応する式［］の化合物を得る前記１０
項の製法。１５フエリシアン化カリウムを用いて酸化を行
なう前記１０、１２または１４項の製法。１６ αおよびβがトリチルまたはアセトアミド
の式［］の化合物からスルフヒドリル保護基を
選択的に離脱させてαおよびβが水素の対応する
式［］の化合物を得る前記１０項の製法。１７適宜保護および／または活性化されたアミ
ノ酸またはアミノ酸群を所望の順序にカツプリン
グさせてアミド結合を形成させ、αおよびβが保
護基、Ｒがカルボキシ保護基の式［］の化合物
を得る前記１０項の製法。１８式：［式中、Ａは水素または２個のＡ基は該２個の硫
黄原子間に形成された架橋結合を意味する；Ｘは
水素；X₁はHisまたはArg；X₂はHisまたは
Glu；X₃はＤ−Trp；X₄はCysまたはＤ−Cysを
意味する］で示される化合物またはその医薬上許容される塩
と医薬担体からなることを特徴とする先端巨大症
治療用医薬組成物。１９投与単位形である前記１８項の医薬組成
物。２０式：［式中、Ａは水素または２個のＡ基は該２個の硫
黄原子間に形成された架橋結合を意味する；Ｘは
水素；X₁はHisまたはArg；X₂はHisまたは
Glu；X₃はＤ−Trp；X₄はCysまたはＤ−Cysを
意味する］で示される化合物またはその医薬上許容される塩
と医薬担体からなることを特徴とする糖尿病治療
用医薬組成物。２１投与単位形である前記２１項の医薬組成
物。[Claims] 1 Formula: [wherein A is hydrogen or two A groups mean a crosslink formed between the two sulfur atoms; X is hydrogen; X ₁ is His or Arg; X ₂ is His or
Glu; _X3 means D-Trp; _X4 means Cys or D-Cys] or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 2 Said 1 in which two A groups form a crosslinking bond
compound of term. 3 L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopyl-L-lysyl-L
-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cysteine cyclic (1→
12) The compound of item 1 above which is a disulfide. 4 L-cysteinyl-L-arginyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopyl-L-lysyl-L
-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cysteine cyclic (1→
12) The compound of item 1 above which is a disulfide. 5 L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopyl-L-lysyl-L
-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-D-cysteine cyclic (1→
12) The compound of item 1 above which is a disulfide. 6 L-cysteinyl-L-arginyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopyl-L-lysyl-L
-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cysteine cyclic (1→
12) The compound of item 1 above which is a disulfide. 7 L-cysteinyl-L-histidyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopyl-L-lysyl-L
-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cysteine cyclic (1→
12) The compound of item 1 above which is a disulfide. 8 hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate,
1, which is in the form of a pharmaceutically acceptable acid addition salt selected from the group consisting of polyphosphate, maleate, acetate, citrate, benzoate, succinate, malonate and ascorbate; A compound according to any one of Items 7 to 7. 9 A formula characterized by deprotecting a corresponding compound having one or more protected side chains on amino acid residues in the peptide and/or protecting groups on the terminal amino and carboxy groups: [wherein A is hydrogen or two A groups mean a crosslink formed between the two sulfur atoms; X is hydrogen; X ₁ is His or Arg; X ₂ is His or
Glu; X ₃ _is D-Trp; 10 Formula: [Wherein, R is a polystyrene resin carrier bonded via a carboxy protecting group or a methylene group; R ₁ is an α-amino protecting group; B ₁ is [Formula] or [Formula] R ² is hydrogen or the imidazole nitrogen atom of histidine Protecting group; R ³ is a side chain nitrogen atom protecting group of arginine; B ₂ is [Formula] or [Formula] R ⁴ is a side chain carboxyl group protecting group of glutamic acid; R ⁵ is a side chain amino group protecting group of lysine; R ⁶ , R ⁷ and R ⁸ are each
Threonine and serine hydroxy protecting groups;
X ₃ is _D -Trp; All protecting groups and the polystyrene resin carrier, if present, of the compound represented by are removed, and if desired, the resulting compound of formula [] is oxidized or reduced, and further free base or pharmaceutically acceptable salt The expression characterized by changing to: [wherein A is hydrogen or two A groups mean a crosslink formed between the two sulfur atoms; X is hydrogen; X ₁ is His or Arg; X ₂ is His or
Glu; X ₃ _is D-Trp; 11. The method of item 10 above, in which the polystyrene resin carrier and/or the protecting group are treated with hydrogen fluoride in the presence of anisole to be removed in one step. 12. The method according to item 10 above, which comprises oxidizing the corresponding compound of formula [] in which A is hydrogen to obtain a compound of formula [] in which two A groups form a cross-linking bond between sulfur atoms. 13 Under solid-phase synthesis conditions, the necessary amino acids, protected and/or activated as appropriate, are sequentially coupled to a chloromethylated or hydroxymethylated resin carrier to obtain the formula [] where α and β are protecting groups and R is a polystyrene resin carrier. The manufacturing method of item 10 above for obtaining the compound. 14 A compound of the formula [] in which α and β are each hydrogen is oxidized to obtain a compound of the corresponding formula [] in which α and β form a crosslink bond.
Manufacturing method. 15. The method of item 10, 12 or 14 above, wherein the oxidation is carried out using potassium ferricyanide. 16. The method of item 10 above, in which a sulfhydryl protecting group is selectively removed from a compound of formula [] where α and β are trityl or acetamide to obtain a corresponding compound of formula [] where α and β are hydrogen. 17 Properly protected and/or activated amino acids or amino acid groups are coupled in a desired order to form an amide bond to obtain a compound of the formula [ ] in which α and β are protecting groups and R is a carboxy protecting group. Manufacturing method. 18 Formula: [wherein A is hydrogen or two A groups mean a crosslink formed between the two sulfur atoms; X is hydrogen; X ₁ is His or Arg; X ₂ is His or
Glu; X ₃ means D-Trp _; thing. 19. The pharmaceutical composition of item 18 above, which is in dosage unit form. 20 formula: [wherein A is hydrogen or two A groups mean a crosslink formed between the two sulfur atoms; X is hydrogen; X ₁ is His or Arg; X ₂ is His or
_Glu ; X ₃ is D-Trp; 21. The pharmaceutical composition of item 21 above, which is in dosage unit form.