JPS6360942A - インタ−ロイキン−２と共に免疫毒素又は抗体を用いてのコンビネ−ション治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、インターロイキン−２と腫瘍細胞に対して向
けられた免疫毒素との及びインターロイキン−２と少な
くとも１つのモノクローナル抗体との混合物及びこれら
の混合物を用いての哺乳類の治療学的又は予防学的抗腫
瘍処理に関する。

〔従来の技術〕

植物のレクチン、抗原又は他の刺激への暴露の後、Ｊ光
源又はマイトジェン刺激性子細胞の増殖を誘発する、正
常な末梢リンパ球によって産生されるリンフ才力イン、
すなわちインターロイキン−２（ＩＬ−２）が最初に、
Ｍｏｒｇａｎ、Ｄ、Ａ、、など、。

（Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９７６）、月３３　：　１００
７〜１００８ページ〕によって記載された。次に、刺激
性Ｔリンパ球の増殖を誘発するその能力のためにＴ細胞
増殖因子と呼ばれ、現在、インターロイキン−２は、イ
ンビ上旦及びインビボで免疫系細胞の種々の機能をモジ
ュレートするものとして認識されている。

ＩＬ−２は、最初に、ヒト末梢リンパ球（ＰＢＬ）又は
他Ｉ　Ｌ−２産生細胞系を培養することによって製造さ
れた。たとえば、アメリカ特許第４．４０１，７５６号
を参照のこと。組換えＤＮＡ技法がＩＬ−２を産生ずる
ためにＰＢＬ及び細胞系に代って提供されて来た。Ｔａ
ｎｉｇｕｃｈｉ＋Ｔ、など、　、　Ｎａ　Ｌｕｒｅ（１
９８３）、　　３０２：３０５〜３１０及び［１ｅｖｏ
ｓＪ、、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　（１９８３）、１１　：　４３０７〜４３２３は、
ヒトＩＬ−２ｉｆｉ伝子のクローニング及び微生物中で
のその発現を報告している。

アメリカ特許第４，５１８，５８４号は、野生型又は天
然の分子の位置１２５で通常、存在するシスティンが中
性アミノ酸、たとえばセリン又はアラニンにより交換さ
れたことを記載する。アメリカ特許第４．５３０，７８
７号及び第４，５６９，７９０号は、組換え活性ＩＬ−
２及びそれらのムティンを精製するための方法、並びに
その精製された形のＩＬ−２を開示する。

１９８６年８月５日に発行されたアメリカ特許第４．６
０４，３７７号は、微生物による酸化によって産生され
た組換えＴＬ−２から構成された、医薬的に許容される
水性ビークルにおいて再構成するために適切なＩＬ−２
組成物を開示する。ＩＬ−２は、直接の治療又は補助薬
の調整において、又は免疫調整薬、リンフ才力イン（た
とえば、ＩＬ−１、ＩＬ−３゜Ｃ５Ｆ−１及びＩＦＮ）
又は天然に存在する又は誘発性抗細胞毒素と共に、悪性
又は前悪性疾１色の処理において、細胞毒性化学療法又
は照射療法もしくは手術と一緒に有用なものとして注目
される。

Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ及び彼の共同研究者は、高投与量で
の組換えＩＬ−２の全身への投与が、マウスにおいて確
立された転移性癌の後退を引き起こしくＲｏｓｅｎｂｅ
ｒｇなど、　、ム詠ム漁ム（１９８５）　１６１　：　
１１６９〜１１８８）　、そしてヒトにおいて、リンフ
才力イン活性化キラー細胞（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ
、など、、粉ＬハＬＪ、Ｍｅｄ、　（１９８５）　３１
３　：　１４Ｂ５〜１４９２）及び腫瘍浸潤性リンパ球
（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇなど、、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９
８６）２３３　：１３１８−１３２１）と共に転移性点
の後退を引き起こすことを示して来た。

１９７０年代の中期以来、ヒを乳癌関連の抗原と相互作
用するネズミモノクローナル抗体の多くの報告が存在し
て来た。これらの報告された研究においては、マウスが
、ヒト乳脂肪球状タンパク質、乳癌細胞系又は乳癌膜抽
出物により免疫化さバ、そして追加免疫化された。免疫
肺細胞が、マウス骨髄腫と融合され、そしてハイブリド
ーマが乳抗原又は乳癌抗原に関する培養上清液のある特
異性に基づいて選択された。Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄ
ｉｍｉｔｒｉｏｕｓ、　Ｊ。

など、、　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ（１９８１）２８
　：　１７〜２１；Ｙｕａｎ、Ｄ、。

など１．ハ以（１９８２）　６８ニア１９〜７２８；Ｃ
１ｏｃｃａ、Ｄ、Ｒ，など、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、
（１９８２）　４２　：　４２５６〜４２５８゜最近、
シータスコーポレーションの研究者は、ヒト乳癌細胞に
選択的に結合し、ＩｇＧ又はＴｇＭであり、そして免疫
毒素を形成するためにリシンＡ鎖に接合される場合、約
１０ｎＭ以下の免疫毒素濃度でＭＣＦ−７，ＣＡＭＡ−
１，５ＫＢＲ−３又はＢＴ−２０細胞の少なくとも１つ
に対して５０％の対照（未処理）のタンパク質合成をも
たらす組織培養阻害投与量（Ｔ（４０５０％）を示すネ
ズミモノクローナル抗体を発見した。これらの抗体は、
１９８５年８月２８日に出願されたＲＰＣ特許出願第１
５３．１１４号により詳しく記載されている。

さらに、シータスコーポレーションの研究者は、血液細
胞に結合せず、少なくとも０．２５の乳腫瘍結合範囲を
有しくすなわち、それらは少なくとも２５％の試験され
た乳腫瘍に結合する）又は０．２５よりも高い又は等し
い乳癌細胞系結合範囲を有し、ヒト乳細胞及び／又は卵
巣細胞のために下記に定義されたような０．０９よりも
低い又は等しい正常な組織反応性を有し、ＩｇＧ又はＩ
ｇＭであり、そしてイメージング成分に接合される場合
、乳癌腫瘍をイメージするのに十分のシグナルを生成す
るネズミモノクローナル抗体を発見した。これらの抗体
は、上記のもののほとんどを含み、そして１９８７年５
月６日に出願されたヨーロッパ特許出願第２２０．８５
８号により詳しく記載されている。

毒素に接合された抗体から成る免疫毒素は、抗体が特異
的である種々の癌の治療のために使用されて来た。免疫
毒素分子は大き過ぎて、毛細管から完全に拡散しないの
で効果的に腫瘍細胞に達することができない。

ヒトにおける悪性腫瘍を治療するために複数の抗癌剤を
用いての併用化学療法が近年、研究及び診療に使用され
ている。抗癌剤とは、代謝拮抗物質、アルキル化剤、抗
生物質、一般的な毒物、等であることができる。薬物の
併用は、はとんどの癌、たとえば悪性腫瘍、黒色腫、リ
ンパ腫及び肉腫に対して相乗細胞毒性効果を得、そして
耐薬物細胞の出現を減じ又は排除し、そしておのおのの
薬物の副作用を減じるための助けとなる。

Ｄｒ、Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎなど、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、　（１９８６）　１３７　：１７３５〜１７４２は
、ｒＬ−２が血管浸透性及び器管中への血清アルブミン
拡散の速度を高めることを開示する。Ｌｏｔｚｅなど、
、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８５）　１３５：２８６
５は、可逆性流体保持問題がＩＬ−２投与に起因するこ
とを開示する。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、治療学的又は予防学的処理のために温血哺乳
類への非経口又は皮下投与のために適切な組成物を提供
し、そして該組成物は、哺乳類からの［Ｌ−２と腫瘍細
胞に対して選択的に結合する少なくとも１つの免疫毒素
との混合物又は該ＩＬ−２とヒト腫瘍細胞に選択的に結
合する少なくとも１つのモノクローナル抗体との混合物
を薬理学的に有効な量で含有する。

もう１つの観点においては、本発明は、哺乳類からのＩ
Ｌ−２と腫瘍細胞に選択的に結合する少な（とも１つの
免疫毒素との混合物又はＢｇ　Ｔ　Ｌ−２とヒト腫瘍細
胞に選択的に結合する少なくとも１つのモノクローナル
抗体との混合物を温血哺乳類宿主における腫瘍の治療学
的又は予防学的処置のために投与する方法を提供する。

好ましくは、ＩＬ−２は組換えヒトＩＬ−２であり、そ
して免疫毒素に使用されるモノクローナル抗体は、ヒト
乳癌細胞及び／又はヒト卵巣癌細胞に選択的に結合し、
そしてＧ又はＭのアイソタイプを有し、そして治療され
る腫瘍系は乳癌及び／又は卵巣癌である。

薬理学的有効量でのＩＬ−２と免疫毒素との又はＩＬ−
２と抗体との混合物は、種々の形の癌、特に乳癌及び卵
巣癌の適切な治療を提供することが予測される。

〔具体的な説明〕 “治療学的”処置とは、当業界における手段によって測
定される場合、癌が患者に進行した後（すなわち、腫瘍
が確定された後）、ＩＬ−２及び免疫毒素又はＩＬ−２
及び抗体の混合物の哺乳類宿主又は患者への投与に関す
る。処理した後、存在する腫瘍が減じられ又は排除され
なければ、その処理は治療学的であるとは思われない。

“予防学的”処置とは、治療学的処置がほどこされた後
、癌の再発現を防ぐために前記混合物を宿主又は患者に
投与することに関する。

“癌”及び“腫瘍”とは、細胞性疾患を含む肺癌性疾患
、たとえば腎細胞癌、カボシ肉腫、慢性白血病、乳癌、
肉腫、前立腺、膵臓、子宮内膜及び卵巣癌腫、直腸癌、
咽喉癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、肥満細胞腫、肺癌及
び胃腫瘍又は胃癌に関する。本発明の方法においては、
目的の腫瘍は、乳癌及び／又は卵巣癌である。

“薬理学的に有効な量”とは、有意な患者の利益、すな
わち生命の延長及び／又は疾患の減少を示すのに十分で
ある本発明の方法又は組成物のそれぞれの活性成分の合
計量に関する。本発明で定義された有効量が使用される
場合、たった１つの成分を用いるよりも混合物を用いて
、より効力が得られる。

“組換え体”とは、一般的にＩＬ−２をコードする遺伝
子が、既知組換えＤＮＡ技法によってクローン化される
組換えＤＮＡ技法によって産生されたＩＬ−２に関する
。たとえば、ヒトＩＬ−２遺伝子が、適切なりＮＡベク
ター、たとえば細菌性プラスミド、好ましくはＥ、コリ
のプラスミド中に挿入され、Ｍｌ　ｔａえプラスミドが
得られ、そしてそのプラスミドが適切な宿主を形質転換
するために使用される。その遺伝子が、宿主中に発現さ
れ、組換えタンパク質が産生される。この目的のための
適切な組換えプラスミドの例は、ｐＢＲ３２２゜ｐｃＲ
ｌ、ｐＭＢ９及びｐｓｃｌを含む。形質転換される宿主
は、真核又は原核細胞、たとえば咄乳類細胞、酵母、ア
スペルギルス（＾５ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及び昆虫細胞
であることができる。本発明の１つの好ましい態様は、
宿主として細菌細胞を使用することができるが、但しこ
れだけには限定されない。

“医薬的に許容される”とは、活性成分の生物学的活性
の有効性を妨げず、且つそれが投与される宿主に対して
毒性でない担体培地に関する。

本明細書に使用される場合、“モノクローナル抗体”と
は、均質の抗体群を有する抗体組成物を意味する。

本明細書に使用される場合、“免疫毒素”とは、抗体又
は抗体のフラグメント及び細胞毒性成分の接合体に関す
る。抗体又はそのフラグメントは、ヒト腫瘍細胞に対し
て選択的に結合し、そして免疫毒素において効果的であ
るべきである。抗体は、それが接合形において効果的で
あるかどうかを、下記のものから選択される。免疫毒素
の細胞毒性成分は、細胞毒性薬物又は細菌又は植物起源
の酵素的に活性の毒素もしくはそのような毒素の酵素的
に活性のフラグメント（“Ａ鎖”）を含む。酵素的に活
性の毒素及びそのフラグメントの例は、ジフテリアＡ鎖
、ジフテリア毒素の非結合性フラグメント、外毒素Ａ鎖
（緑膿菌からの）、リシンＡＩ￥、アブリンＡｔｆｉ、
モデシンＡ鎖、α−サルシン、ヱ士ゴび辷たん　フォル
シイ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉ）　　タンパク
質、ジアンチンタンパク質、スーＬイ」二之Ｊ−１ノ二
し１九（乃り蝕ハμ狙　リｅｒｉｃａｎａ）タンパク質
（ＰＡＰＩ、　ＰＡＰ　ＩＩ及びＰＡＩ’−３）、モモ
リジカカランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ　ｃｈａｒａｎ
ｔｉａ）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レスト
リフトシン、フェノマイシン及びエノマイシンを含む。

特に、リシンＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラ
グメント、アブリンＡ鎖及びＰＡＰ　ＩＩが好ましい。

最っとも好ましくは、リシンＡ鎖である。

本明細書に使用される場合、“ヒト腫瘍細胞への選択的
結合”とは、癌性であり又は癌増殖又は癌の他の特性を
示すヒト細胞への免疫毒素の抗体の選択的結合に関する
。免疫毒素の抗体は正常で健康な細胞に選択的に結合し
ない。そのような腫瘍細胞の例は、白血病細胞、前立腺
癌細胞、結腸癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、直腸癌細
胞、咽喉癌細胞、黒色腫細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞及
び胃腸又は胃癌細胞を含む。最っとも好ましくは、免疫
毒素の抗体は、正常で非癌性細胞への結合に対するもの
として、乳癌細胞及び／又は卵巣癌細胞に選択的に結合
する。

免疫毒素の例示されたモノクローナル抗−ヒト乳癌抗体
に関して本明細書に使用される場合、“機能的に等しい
“とは、（ａ）少なくとも０．２５の乳癌腫瘍結合範囲
又は０．２５よりも高い又はそれに等しい範囲の乳癌細
胞系を有し；　（ｂ）ヒト乳癌細胞に選択的に結合し；
　　（ｃ）Ｇ又はＭのアイソタイプを有し；そして（ｄ
）免疫沈殿法又はクロスブロッキング及びサンドインチ
イムノアッセイによって決定される場合、その例示され
たモノクローナル抗体と同じ抗原又はエピトープに結合
するモノクローナル抗体を意味する。

上記のように、本明細書に使用される場合、“機能的に
等しい”とは、４つの基準を含む。例示されたモノクロ
ーナル抗体と同じ抗原又はエピトープに結合するこれら
の基準の最後のものは、機能的に等しいモノクローナル
抗体によって、例示されたモノクローナル抗体のクロス
ブロッキングを示す実験によって示され得る。クロスブ
ロッキングは、例示された抗体の１つによって結合され
るエピトープと同じ抗原上のエピトープに結合する抗体
の結果として、又は１つのエピトープに対する抗体の結
合が２つ目のエピトープに対する抗体の結合を阻害する
、同じ抗原上にひじょうに隣接して位置する異なったエ
ピトープに結合する抗体の結果として生じる。従って、
クロスブロッキングは基準の１つであり、それによって
、機能的に等しいモノクローナル抗体が、例示されたモ
ノクローナル抗体と同じ抗原又はエピトープに結合する
ことを決定することができる。

いわゆる“サンドインチ”アッセイとは、免疫毒素の抗
体が同じ抗原又はエピトープに結合するかいづれかを決
定するためのもう１つの方法である。これらのアッセイ
において、第１モノクローナル抗体は、支持体、たとえ
ばマイクロ力価プレートのウェルの表面に結合される。

非特異的結合を妨げるための処理の後、可溶化された抗
原調製物を、その結合された抗体に添加する。続いて、
検出できるラヘル、たとえば色素性酵素を有する第二抗
体を添加する。その第二抗体が抗原に結合する場合、同
じ抗原上での異なったエピトープの特異性又は同じエピ
トープの複数コピーが指摘さる。第二抗体が結合しない
場合、同じエピトープの特異性又は異なっているが、し
かし隣接している抗原特異性のいづれかが指摘される。

クロスブロッキング及びサンドイッチアッセイの両者の
結果は、第ニジリーズの試験、たとえば免疫沈殿法又は
ウェスターン法（両抗体によって結合される抗原の分子
量を特徴化する）によってさらに定義される。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡは、目的とする腫瘍
に対してモノクローナル抗体を産生ずる、寄託さた種々
の細胞系を有する。たとえば、ヒトルー小細胞性肺癌（
ｈｕｍａｎ　ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ
　ｃａｎｃｅｒ）に対してモノクローナル抗体を産生ず
る細胞系は、７０３０４（ＡＴＣＣ番号ＨＢ８３０１と
して寄託された）を含む。ヒト黒色腫細胞に対してモノ
クローナル抗体を産生ずる細胞系は７０４Ａ１　（ＡＴ
ＣＣ番号１１８８３０２として寄託された）を含む。小
細胞性癌腫に対してモノクローナル抗体を産生ずる細胞
系は、ＡＴＣＣ，１ｌＢ８４６２及びＡＴＣＣＨＢ８７
１１として寄託された細胞系を含む。管起源の膵臓癌腫
に対する抗体を産生ずる細胞系は、ＡＴＣＣＨＢ８５０
４として寄託されたハイブリドーマを含む。冑、結腸及
び膵臓の腺癌上に存在するエピトープに結合し、そして
食道、乳及び卵巣腫瘍に結合する抗体を産生ずる細胞系
（Ｃ５ＬＥＸ　１として知られている）は、ＡＴＣＣＨ
Ｂ８５８０として寄託されている。

抗体及び細胞毒性成分の接合体は、種々の二官能価タン
パク質変性試薬を用いて製造され得る。

そのような試薬の例は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（
２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イ
ミノチオレーン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能価誘
４体、たとえばジメチルアジピミデード、ＩＩＣ／！、
活性エステル、たとえばジスクンイミジルスベレート、
アルデヒド、たとえばグルタルアルデヒド、ビス−アジ
ド化合物、たとえばビス−（ｐ−アジドベンゾイル）ヘ
キサンジアミン、ビス−ジアゾニウム誘導体、たとえば
ビス−＜ｐ−ジアゾニウム−ベンゾイル）−エチレンジ
アミン、ジイソシアネート、たとえばトリレン−２，６
−ジイソシアネート及びビス−活性弗素化合物、たとえ
ば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンを含
む。

本発明の方法は、ＩＬ−２及びヒト腫瘍細胞に選択的に
結合するｌ又はそれよりも多くの免疫毒素又はＩＬ−２
及びヒト腫瘍細胞に選択的に結合する少なくとも１つの
モノクローナル抗体の薬理学的有効量を、温血哺乳類宿
主、たとえばマウス、ラット、ウサギ、霊長類、豚又は
ヒト、好ましくはヒト患者に投与することを含む。ＩＬ
−２及び免疫毒素又はＩＬ−２及びモノクローナル抗体
は、それぞれ両者とも化学的に悪影響を及ぼされず、そ
してそれぞれ両者が有効である場合、投与する前に４７
　　ビトロで混合され得る。しかしながら、好ましくは
、それらは、順序正しく又は同時に、患者に別々に投与
される。その例は例１及び２に示され、そしてここでＩ
Ｌ−２及び免疫毒素又はＩＬ−２及びモノクローナル抗
体が別々に投与される。

投与は、いずれか適切な技法、たとえば非経口投与によ
って行なわれる。非経口投与の例として、静黒内、動脈
内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与が含まれ、そして静脈
内、筋肉内及び腹腔内投与が好ましい。

１つの例として、大タンパク質が毛細管から漏れ始まる
まで（約６日間）、ＩＬ−２活性を有する調製物により
、患者／宿主を、局部的に（腫瘍の囲り又は筋肉内注射
により）又は全身的に処理することができる。次に、免
疫毒素が規定された処理の間、ＩＬ−２と共に又はＩＬ
−２なしに投与され得る。他方、免疫毒素は処理の１日
日から投与され得る。免疫毒素作用を促進するためのＩ
Ｌ−２による局所的処置は、ＩＬ−２及び免疫毒素又は
ＩＬ−”２及び抗体の局部的（たとえば腹腔内又は静脈
内）投与に伴われる。

投与量及び投与法は、【Ｌ−２及び免疫毒素及び／又は
抗体が別々に又は混合物として投与されるかどうか、抗
体及び／又は免疫毒素のタイプ、患者／宿主及び患者の
病歴に依存するであろう。

その量は、ある腫瘍の減少又はＬＡＫ活性の増大を達成
するために有効であるべきである。投与は、１回で又は
数回に分けて行なわれる。数回に分けて投与が行なわれ
る場合、投与の頻度は、成分のタイプ、癌、投与量、宿
主、等に依存するであろう。あるタイプの癌に関しては
、毎日の投与が効果的であるが、ところが他のタイプの
癌に関しては、１日おきに又は２日おきの投与が効果的
であり、毎日の投与は効果的でない。実施者は、投与の
ルート及び投与の頻度が特定の場合において、ヒトに最
っとも効果的である臨床試験から確めることができるで
あろう。

本発明において最っとも効果的であるように思える投与
量は、１ＩＩｒＩｉｊＯサイズの退行又は腫瘍の完全な
消失又は非再出現性をもたらし、そして宿主に対して毒
性でなく、又は許容できる毒性である量である。一般的
に、熱、悪寒及び一般的な倦怠感のような状態は許容さ
れる。この最適投与量レベルは、多（の要因、たとえば
宿主のタイプ及び癌のタイプ、投与のルート、計画及び
順序、存在する腫瘍、ＩＬ−２、免疫毒素及び抗体のタ
イプ及び毒性の定義に依存するであろう。

宿主に対する毒性は、副作用の程度及びタイプによって
定義され（熱、悪寒及び一般的な倦怠感は本発明の研究
のためには許容される毒性として考慮される）、又は体
重増加又はある期間後、死によって定義され得る。ＩＬ
−２投与に起因する、体における可逆性流体保持性がＬ
ｏｔｚｅ、などＨｌｋＴｍｍｕｎｏｌ、、　１３５　：
２８６５（１９８５）によって開示されている。体重増
加が毒性のための基準である場合、典型的には１０〜２
０重量％の増加が許容され、そして２０重量％よりも高
い増加は毒性として考慮される。

許容される毒性であり、宿主が免疫担当であり、そして
投与のルートがＩＬ−２による前処理及び／又は後処理
１日目から１４日間、毎日ＩＬ−２及び同じ１日目から
１日おきに又は２日おきに抗体の同時投与である場合、
微生物により産生された組換えＩＬ−２及び抗乳癌モノ
クローナル抗体のそれぞれの投与のための投与量レベル
は、最大許容投与量研究に基づいて及び宿主の体重１　
ｋｇ当り約２５〜５０■の抗体から、好ましくは宿主の
体重１　ｋｇ当り約３〜３．７５　Ｘ　１０？〜７．５
Ｘ１０’ユニツト（Ｕ）のＩ　Ｌ　−２（３０００ユニ
ツトが１ｔ１ｇである）である。許容される毒性であり
、そして微生物により産生された組換えＩＬ−２による
前処理及び／又は後処理１日目から毎日１４日間、Ｉ　
Ｌ−２及び同じ１日目から７日間、免疫毒素の同時投与
が存在する場合、抗乳癌抗体により産生される免疫毒素
のそれぞれの投与のための投与量レベルは、宿主の体重
１　ｋｇ当り２５〜５００ｎの免疫毒素である。

ＩＬ−２レベルは上記に与えられている。宿主（すなわ
ち、遺伝子欠失を有するヌードマウス）が免疫化される
場合、最大許容投与量はより低い。

１つの好ましい態様においては、ＩＬ−２は、最大許容
投与量で１週間毎日、与えられ、続いて最大許容投与量
の免疫毒素と同時に、ＩＬ−２の最大許容投与量の半分
を与える。

非経口投与に関しては、ＩＬ−２及び抗体／免疫毒素は
、注射することができるユニット投与形（溶液、懸濁液
、エマルジョン）に、好ましくは、本質的に非毒性であ
り、且つ非治療性である、医薬的に許容される担体中に
一般的にそれぞれ配合されるであろう。そのような賦形
剤の例は、生理食塩水、リンガ−溶液、デキストロース
溶液、マンニトール及び正常な血清アルブミンを含む。

非水性賦形剤、たとえば固定されたオイル及びオレイン
酸エチルがまた使用され得る。その担体・媒体は、少量
の添加剤、たとえば等偏性、溶解性及び／又は化学的安
定性を増強する基質、たとえば緩衝液、界面活性剤及び
保存薬を含むことができる。ＩＬ−２及び抗体／免疫毒
素は、典型的には、約０．１■／−〜１００■／−１好
ましくは０．２〜１■／−の濃度でそのような担体中に
それぞれ配合されるであろう。

他方、ＩＬ−２及び抗体／免疫毒素は、殺菌され、安定
した凍結乾燥性製剤として製造され、ここで精製された
ＩＬ−２及び抗体／免疫毒素が水溶性担体、たとえばマ
ンニトール（大量の容積を提供する）及び１■のＩＬ−
２当り約５００屑の界面活性剤、たとえばドデシル硫酸
ナトリウム又は抗体がそのような濃度でなお活性である
場合、水中での組換えＩＬ−２の溶解性を確保するため
に、典型的な配合物中に界面活性剤０．０１〜０．０５
％と共そしてそれは哺乳類宿主、特にヒトにおいて安定
していて、且つ十分に許容され得る。このＩＬ−２配合
法は、１９８６年８月５日に発行されたアメリカ特許第
４．６０４，３７７号により詳しく記載されている。

１９８７年１月１５日に発行されたＰＣＴ　ＷＯ３７１
０００５６のＩＬ−２配合においては、ＩＬ−２は、界
面活性剤によってでなく、ＩＬ−２とポリエチレングリ
コールホモポリマー及びポリオキシエチル化ポリオール
（前記ポリマーは、３００〜１００．０００ドルトン、
好ましくは３５０〜４０．０００ドルトンの分子量を有
する）から選択された活性化ポリマーとを反応せしめる
ことによって溶解され得る。そのポリマーは、ＩＬ−２
の遊離アミノ基又はチオール基及びポリマーの水酸基の
両者と反応する活性化末端基である。そのようなカップ
リング剤の例として、ヒドロキシニトロベンゼンスルホ
ン酸エステル、シアヌル酸塩化物及びＮ−ヒドロキシス
クシンイミドを挙げることができる。この変法は、生理
学的ｐＨでＩＬ−２を熔解するために界面活性剤を添加
する必要性を排除する。次に、［Ｌ−２は、上記のよう
に水溶性担体及び緩衝液により直接的に配合され、そし
てその配合物は凍結乾燥せしめられ、そしてその凍結乾
燥混合物は、上記のように再構成される。

上記のように、成分を混合せず、むしろ別々にそれらを
投与した方が好ましい。配合物が複数の成分を含む場合
、それぞれの相対鼠は、得られた効力に依存して、上記
範囲内で変化することができる。

本発明におけるＪＬ−２は、組織培養から又は組換え技
法によって、及び哺乳類源、たとえばマウス、ラット、
ウサギ、霊長類、豚及びヒトから富岡製されたＩＬ−２
である。好ましくは、１１−−２はヒトからである。よ
り好ましくは、ＩＬ−２はＭｌ換え体である。

組換えＩＬ−２は、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉなど、、Ｎａｔ
ｕｒｅ＋３０２：３０５〜３１０（１９８３）及びＤｅ
ｖｏｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ
、　１１　：　４３０７〜４３２３（１９８３）によっ
て記載されているように、天然のヒト１Ｌ−２ｉｆｆ伝
子をクローニングし、そして形質転換された微生物中に
それを発現することによって得られる。それはまた、ア
メリカ特許第４，５１８，５８４号に記載のようなＩＬ
−２ムテインであり、ここで野生型又は天然の分子の位
置１２５で通常存在するシスティンが中性アミノ酸、た
とえばセリン又はアラニンによって交換され、又は野生
型又は天然の分子の位置１０４で通常存在するメチオニ
ンが中性アミノ酸、たとえばアラニンによって交換され
ている。

１つの態様において、ＩＬ−２は、ヒトｃＤＮＡ配列又
は位置５８及び１０５でのシスティンの間にジスルフィ
ド結合を形成する能力を含む、天然のヒトＩＬ−２のア
ミノ酸配列に少なくとも実質的に同一のアミノ酸配列を
有するタンパク質をコードし、そして天然のヒ）ＩＬ−
２に共通である生物学的活性を有する、ＩＬ−２の変性
されたヒトｃＤＮＡ配列により形質転換された微生物に
よって産生されるグリコジル化されていないタンパク質
である。ＩＬ−２はまた、上記のように酵母又は他の宿
主からも産生され得る。アミノ酸配列の実質的な同一性
とは、その配列が同一であるか、又は合成タンパク質と
天然のヒトＩＬ−２との間に、反対の機能的相違性を引
き起こさないｌ又はそれよりも多くのアミノ酸の変性（
欠失、付加、置換）によって異なることを意味する。そ
のような性質を有するＩＬ−２タンパク質の例は、Ｔａ
ｎｉｇｕｃｈｉなど、、Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）、　
　３０２：３０５〜３１０；Ｄｅｖｏｓ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（１９
８３）、月、：　４３０７〜４３２３゜及びヨーロッパ
特許第９１，５３９号及び第８８．１９５号；並びにア
メリカ特許第４．５１８，５８４号、藍によって記載さ
れているタンパク質を含む。最つとも好ましくは、ＩＬ
−２は、ｄｅｓ−ａｌａ＋−ＩＬ−２ｓｓｒ＋ｚｓムテ
イン（ここで天然のＩＬ−２のＮ−末端のアラニンが欠
失され、そして天然のＩＬ−２の位置１２５でのシステ
ィンがセリン残基によって交換され）　、ｄｅｓ−ａｌ
ａｌ−ＩＬ−２ａｌａ＋ｏａｓａｒ＋ｚｓムテイン（こ
こで天然のＩＬ−２の位置１０４でのメチオニンがアラ
ニン残基によって交換され、そして位置１２５でのシス
ティンがセリン残基によって交換され）又は初めの５個
のＮ−末端のアミノ酸残基のうち５個までの組合せが欠
失されている［Ｌ−２である。

ＩＬ−２は産生され、そして１９８６年２月１１日に発
行されたアメリカ特許第４．５６９，７９０号に記載の
方法によって臨床的純度に精製され得る。

本発明において有用な抗体は、抗体産生融合パートナ−
から調製されたハイブリドーマから産生される。そのよ
うな融合パートナ−は、生きているヒト癌細胞、たとえ
ば乳癌細胞又はそれらから製造された膜抽出物によりマ
ウスを免疫化することによって産生される。マウスは、
免疫原性量の細胞又は抽出物により、腹腔内に接種され
、そして次に、同じ量の免疫原により追加免疫される。

最終の追加免疫の後、数日後、免疫化されたマウスから
肺臓を集め、そして融合に使用するためにそれから、細
胞懸濁液を、調製する。

ｐｕｃｋ、ＤＪ、など、、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ（１９８２
０８：３７７〜３８１によって変性されたようなり、Ｋ
ｏｈｌｅｒ及びＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）　２５６：４９５〜４９７の
一般の体細胞ハイブリダイゼーション技法を用いて、ハ
イブリドーマを、肺細胞及びネズミ腫瘍パートナ−から
調製する。たとえば、５ａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、
Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｓｔｒｉ−ｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ
、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ
から入手できるネズミ骨髄腫系を、ハイブリダイゼーシ
ョンに使用することができる。基本的に、前記技法は、
フソゲン、たとえばポリエチレングリコールを用いて、
腫瘍細胞と肺細胞とを融合することを含む。融合した後
、細胞を融合培地から分離し、そして選択培地、たとえ
ばＨＡ　Ｔ培地で増殖せしめ、ハイブリッド形成されな
かった親細胞を排除する。所望により、そのハイブリド
ーマを拡張し、そして抗原として免疫感作剤（癌細胞又
は膜抽出物）を用いて、従来のイムノアッセイ法（たと
えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ又は
螢光イムノアッセイ）によって、上清液を抗−ヒト癌活
性について検定する。陽性クローンが、本発明の抗体の
基準を満足するかいづれか、すなわちそれらがヒト腫瘍
細胞に選択的に結合するがいづれかを、さらに決定する
ために、それらのクローンを特徴づける。

そのような抗体を産生ずるハイブリドーマを、既知方法
を用いてインビトロ又はインビボで増殖することができ
る。モノクローナル抗体を、従来の免疫グロブリン精製
法、たとえば硫酸アンモニウム沈殿法、ゲル電気泳動、
透析、クロマトグラフィー及び所望により限外濾過によ
って、場合場合で、培養培地又は体液から単離すること
ができる。

本発明における免疫毒素のための好ましいモノクローナ
ル抗体は、ヒト乳癌細胞及び／又はヒト卵巣癌細胞に選
択的に結合し、そして従って、そのような細胞は、上記
方法において免疫感作剤として使用される。

免疫毒素のための好ましいモノクローナル抗体の重要な
特性は、（１）それらの免疫グロブリンクラス、（２）
ヒト乳癌及び／又は卵巣癌細胞のためのそれらの選択性
、（３）それらが結合するヒト乳癌細胞系の範囲、及び
（４）それらが結合するヒト乳腫瘍凍結切片の範囲並び
に（５）活性免疫毒性を形成するためのそれらの能力で
ある。

免疫毒素のための得られた好ましい抗体の選択性及び範
囲は、（１）ヒト乳癌組織及び細胞及び（２）***又は
他の起源の正常なヒト組織又は細胞のパネルに対してそ
れを試験することによって決定される。好ましいクラス
の抗体を選択することにおいては、約２２　、０００個
の増殖性ハイブリドーマ培養物が、初めに免疫化乳腫瘍
膜又は細胞系、７個の正常な組織膜のパネル、線維芽細
胞系及び乳腫瘍凍結切片に対してスクリーンされた。腫
瘍性物質と反応するが、しかし正常な物質とは反応しな
いクローンを、この最初のスクリーンにおいて同定し、
そしてアイソタイプについて選択し、そして選択性及び
範囲についてさらにスクリーンした。追加のスクリーニ
ングは、１６個の正常な′ｆＦＪＡ織切片、織細片正常
な血液細胞型、１１個の非礼腫瘍切片、２１個の乳癌断
片及び１４個の乳癌細胞系を含む。

免疫毒素のための好ましい抗体に関して、“特異性”及
び“正常なＭｉ織反応性”なる用語は、交換可能的に使
用され、そして１６個の正常な組織凍結切片において染
色された下部構造体の数及び結合された血液細胞型の数
の和が、モノクローナル抗体が試験され、そして５個の
血液細胞型が試験されるすべての組織においていづれか
のモノクローナル抗体により結合された下部構造体の合
計数の和によって割り算されたものとして定義される。

“腫瘍範囲”なる用語は、試験された乳腫瘍凍結切片の
数によって割り算された、染色された乳腫瘍凍結切片の
数として定義される。乳癌“細胞系の範囲”なる用語は
、試験された乳癌細胞系の数によって割り算された、染
色された乳癌細胞系の数として定義される。本発明にお
ける免疫毒素の抗体は、好ましくは、０．０９に等しい
か又は低い正常なＭｉ織反応性、及び０．２５に等しい
か又は高い乳腫瘍結合範囲又は０．２５に等しいが又は
高い乳癌細胞系結合範囲を有する。

３３の寄託されたハイブリドーマのうち５個からの抗体
が、同じ２００　Ｋドルトンの抗原を認識することが見
出された。３３のハイブリドーマのうち４個からの抗体
が、２４０にドルトンの細胞内抗原に結合した。３個の
抗体は、１以上の高分子量ムチン（ＨＭＷ）に結合し、
そして２個の抗体は、９５にドルトンの抗原の形のトラ
ンスフェリンレセプターに結合する。本明細書に言及さ
れたすべての抗原の分子量は、当業界において既知の方
法を用いて、還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定さ
れた。

本発明における免疫毒素は、上記に定義されたカップリ
ング剤を用いて、上記のような毒素、たとえばりシンＡ
鎖を上記抗体の１つに接合することによって調製され得
る。そのような免疫毒素を調製するための技法は、１９
８５年２月８日に公開さたヨーロッパ特許出願第１５３
．１１４号に記載されている。

次の例は、本発明のＩＬ−２と共に使用される代表的な
モノクローナル抗体及び免疫毒素の調製法及び特徴の詳
細な説明を堤供する。これらの例は本発明を限定するも
のではない。例において、固体のためのすべての部及び
％は、特に指摘されなければ、重量／重量によってであ
り、そして液体のためのすべての部及び％は、特に指摘
されなければ、体積／体積である。

新鮮な手術後のヒト乳癌組織及び種々の正常なＭｉ織を
用いて、均質化及び不連続スクロースグラジェント遠心
分離によって脱油出物を調製した。

ヒト乳癌細胞系は、Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔａ
５ｋ　Ｆｏｒｃｅ。

＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）及びＯｒ。

Ｊｏｒｇｅｎ　Ｆｏｇｈ（Ｍｅｍｏｒｉａｌ　５ｌｏａ
ｎ　Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ）から得られた。その細胞を、
Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔａ５ｋ　Ｆｏｒｃｅ。

ＡＴＣＣ及びＤｒ、Ｆｏｇｈによって堆層されるように
して維持した。免疫感作のためには、１０（ｈｇのタン
パクｌｉ（Ｌｏｗｒｙアッセイ）を含む脱油出物又は−
子方の生きている乳癌細胞のいづれかを、５週才のＢａ
ｌ　ｂ／ｃマウス中に腹腔的接種した。そのマウスを、
月１回の間隔で２度、全く同じように追加免疫した。最
後の追加免疫の後、３日後、肺臓を細胞融合に使用する
ために除去した。

ハイプリドーマ法 体細胞ハイブリッドを、ネズミ骨髄腫系５ｐ−２１０／
Ａｇ１４を用いて、Ｂｕｃｋ、Ｄ、Ｗ、＋など、Ｍの方
法によって調製した。すべてのハイブリドーマ細胞系を
、限界希釈法によってクローン化した。融合体の半分は
、乳癌膜抽出物により免疫化されたマウスからの肺細胞
を使用し、そして他の半分は、生きている乳癌細胞系に
より免疫化されたマウスからの肺細胞を使用した。８３
，４２４個のウェルが、これらの融合体から生成され、
このうち２２，４５９個がハイプリドーマの増殖を示し
た。

スクリーニング汰 免疫乳癌膜抽出物による同相の酵素結合性イムノソルベ
ントアッセイ　（ＥＬＩＳＡ）又は免疫乳癌細胞系によ
る間接的免疫螢光アッセイのいづれかにより、ハイブリ
ドーマ上清液を、反応性抗体のために検定した。固相膜
ＥＩＪＳＡのためには、０．１■／−の乳癌膜クンバク
質４０μｌを、４℃で１２時間、ポリ塩化ビニル（Ｐ　
Ｖ　Ｃ）のマイクロタイターウェル中に添加する。抽出
物を７スピレートし、そしてウェルを、１％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に
より洗浄した。

次に、そのウェルを、ハイブリドーマ上清液の１：１０
希釈溶液４５ｍと共にインキュベートした。その希釈剤
は、緩衝液、１０％ウシ血清及び０、１％アジ化ナトリ
ウムを含む２５ｎ＋Ｍｉ液を有する培地であった。室温
で３０分後、そのウェルを再び洗浄し、そしてペルオキ
シダーゼ接合性ヤギ抗−マウスＩｇＧの１：２００希釈
溶液と共に３７℃で４５分間、インキュベートした。そ
の希釈剤はＰＢＳであった０次に、そのウェルを、ＰＢ
Ｓにより洗浄し、そして室温で３０分間、０．１Ｍクエ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，２）中においてｌ。

２−アジノージ（３−エチルベンズチアゾリンスルホン
酸）２００１１！と反応せしめた。光学密度を４０５ｎ
ｍで測定した。おのおのの実験のために、陽性の対照、
すなわち抗−β２ミクログロブリン（５ｎ／−）を、正
常なヒト腎臓膜と反応せしめた。これは１．０±０．１
（標準偏差）の光学密度を与えた。

そのバックグラウンドは、マウスモノクローナル抗体を
含まない培地を用いて、Ｏ±０．１の光学濃度単位（０
，０，）であった。０．７の０．０．よりも高い、乳癌
膜抽出物に基づく反応を与えるウェルを貯蔵した。

間接的免疫螢光細胞系アッセイに関しては、免疫細胞系
の１００．０００個の乳癌細胞を、８室に分けられたス
ライドのセットのそれぞれの室に、適切な培地と共に一
晩、置いた。同様に、細胞系ＣＣ９５からの１００，０
００個の繊維芽細胞を、区分されたスライドのウェル中
に一晩、インキュベートした。

その細胞を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳにより洗浄した。

乳癌及び繊維芽細胞の両者のウェルを、ハイブリドーマ
上滑液の１：１０希釈溶液と共に、４℃で３０分間、イ
ンキュベートした。その細胞を再び洗浄し、そして、フ
ルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−接合の
ヤギＦ（ａｂ’）ｚ抗−マウスＩｇの１＝５０希釈溶液
と共に４℃で３０分間、インキュベートした。その細胞
を３度洗浄し、ＰＢＳ中に１．５％ホルムアルデヒド中
に５分間、固定し、そしてチャンバーを取り出し、そし
てＰＢＳによりすすいだ０次に、そのスライドを、ポリ
ビニルアルコール、グリセロール、緩衝液及び防腐剤を
含む組成物中に置き、そして螢光顕微鏡により検査した
。乳癌細胞に対して強い螢光結合性を示すが、しかし繊
維芽細胞に対して螢光結合性を示さないハイプリドーマ
のウェルを貯蔵した。５，１５６個のハイブリドーマの
ウェルが最初のスクリーンで乳癌反応性を示した。

次に、５．１５６個の陽性のウェルからの上清液を、７
種の正常なｍ織成抽出物（肝臓、肺、腸、胃、腎臓、扁
桃腺及び牌Ｆｌｉ）と共に固相ＥＬＩＳＡで試験した。

０．３よりも高いＥＬＩＳＡ　Ｏ，０，を示すすべての
ウェルの上清液を捨てた。１，１０１個の上清液が、正
常な組織抽出物と反応しなかったことを見出された。

１．１０１個のハイプリドーマ上清液を、ヒト乳癌腫組
織の凍結切片に対して試験した。６ミクロンの切片をス
ライドに接着し、４℃でアセトン中において１０分間、
固定し、室温で１０分間、乾燥せしめ、ＰＢＳにより洗
浄し、ウマ血清により遮断し、そして適切なハイプリド
ーマ上清液１００〜２００μｌと共に室温で２０分間、
インキュベートした。そのスライドをＰＢＳにより洗浄
し、そして最後に、ペルオキシダーゼ接合のウサギ抗−
マウスＩｇの１：５０希釈溶液と共に３７℃で２０分間
、インキュベートし、再びＰＢＳにより洗浄し、そして
最後に、ｏ、ｏｉ％過酸化水素を含む０．０５ＭのＴｒ
ｉｓｉｌ街液（ｐＨ７，２）中において０．５　ｍｇ　
／　ａｆのジアミノベンジジンと共に３７℃で７．５分
間、インキュベートした。そのスライドをヘマトキシリ
ンにより染色し、脱水し、そして３５．９％のメチル／
ｎ−ブチルメタクリレートコポリマー、７．１％のブチ
ルベンジルフタレート及び０．３％２，６−シーｔｅｒ
ｔ−ブチル−ｐ−クレゾールを含む培地に置いた。１２
４個のウェルが乳癌の選択的結合性を示し、そしてクロ
ーン化された。

゛　−１びクースの°９ 乳癌選択性モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス
及びサブクラスを、ＭｃＤｏｕｇａｌなど、、ξセイと
実質的に同じイムノドツトアッセイによって決定した。

抗体はまた、０．２μＣｉの１５Ｓ−メチオニンを含む
メチオニン不含の培地中において２〜３Ｘ１０’個のハ
イブリドーマ細胞を４時間、増殖せしめることによって
、内部的にラベルされた。

３ＳＳ−ラメルされた抗体を、固定されたブドウ球菌Ａ
細胞又はウサギ抗−マウス免疫グロブリンにより前もっ
てｗｔ７！された、固定化ブドウ球菌Ａ細胞により免疫
沈殿化し、そしてその免疫沈殿物を、ＳＯＳ　−ＰＡＧ
Ｅによって分析し、Ｌ及びＨ鎖の移動度、特別な鎖の欠
乏及びブドウ球菌のプロティンＡを結合するそれぞれの
抗体の能力を決定した。

その抗体をインビボで拡張した。Ｂａｔ　ｂ／ｃ又はＦ
ｌ　（Ｃ５７Ｂ／６ＸＢａｌ　ｂ／ｃ）マウスを、プリ
スタン０．５−により腹腔内（ｉ　ｐ）感作し、そして
１０〜１４日後、ＰＢＳ中、１００万個の対数相ハイブ
リドーマ細胞により接種した。腹水を一７０℃で貯蔵し
、そして融解し、そしてさらに精製する前、０．８ミク
ロンのフィルターユニットを通して濾過した。

ブドウ球菌のプロティンＡを結合したいくらかのＩｇＧ
抗体を、アガロース、デキストラン及び／又はアクリル
アミドのいづれかを含むプロティンＡ−クロマトグラフ
ィー樹脂を充填する、ｐＨステップグラジェント マトグラフィーによって精製した。プロティン八を結合
しなかったＩｇＧ抗体を、０・Ｃで硫酸アンモニウムの
添加によって４０％飽和にすることによって、又はＤＥ
ＡＥに結合せしめることによって沈殿せしめた。他方、
ｒｇｃ抗体は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００カラム
、続いてＤＥＡＥセルロースカラムを用いるクロマトグ
ラフィーによって精製された。

その沈殿物をＰＢＳに再溶解し、２０ｎＭのＴｒｉｓ（
ｐＨ　７．　２　）に対して透析し、そして４℃でｌＩ
ＩＬ／／分の流速で、Ｌ５７？００　〜６００ｍＭのＮ
ａＣｌグラジェントによる溶離により、ジエチルアミノ
エチルセルロース（１）Ｅ牡）の１．　６　Ｘ　５　０
　Ｃｍカラムに基づいて、クロマトグラフィー処理した
。おのおのの場合、カラム画分を、ＳＯＳ　−　ＰＡＧ
Ｅによってモニターし、そして最っとも純粋な抗体画分
をプールし、１〜３■／−に濃縮し、ＰＢＳｌｏ．０２
％ＮａＮ　、に対して透析し、そして４℃で貯蔵した。

室温で、１−７分の流速でＰＢＳｌｏ．０１％アジ化ナ
トリウムによる溶離により、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−
３００又は他のゲル濾過材又はアガロース、デキストラ
ン及び／又はアクリルアミドを含む樹脂の２．６×４０
０ｍカラムに基づいて、ＩｇＭ抗体を精製した。

道訳註勿夾定 乳癌のための選択性の評価のために、精製された抗体を
、１６種の正常な組織の切片に対するイムノペルオキシ
ダーゼ切片染色によって、及び５種の血液細胞型に対す
る免疫螢光細胞選別によって試験した。イムノペルオキ
シダーゼ染色は、前記のようにして行なわれた。但し、
ＰＢＳ中、精製された抗体の１〜ｂ 溶液が、ハイブリドーマ上滑液の代わりに使用された。

その純粋な抗体を、最初に力価し、乳癌切片に対する強
いイムノペルオキシダーゼ染色を与える最少濃度を見出
し、そして次に正常な組織の試験のためにその濃度で行
なった。末梢血液細胞（血小板、リンパ球、赤血球、顆
粒球及び単球）を、多形核白血球から単球を分離する媒
体を用いて遠心分離することによって調製した。その細
胞を、４℃で３０分間、上記最適濃度で、抗体と反応せ
しめ、洗浄し、４℃で３０分間、フルオレセインイソヂ
オシアネート接合のヤギ抗ーマウス１ｇの１：５０希釈
溶液と反応せしめ、再び洗浄し、そして細胞選別機によ
り検査した。その洗浄緩衝液及び希釈剤は、１％ゼラチ
ン及び０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳであっ
た。その細胞選別機は、７６ミクロンのノズル及び４８
８ｎｍでのｌＷのアルゴンイオンレーザ−を備えられた
。

８０龍の共焦レンズが、焦点を合わせるために光学レー
ルアセンブリイ（Ｏｐｔｉｃａｌ　ｒａｉｌ　ａｓｓｅ
ｍｂｌｙ）に基づいて使用された。使用された他のフィ
ルターは、５１５ｎｍの干渉フィルター及び５１５ｎｍ
の吸光フィルター（散乱されたレーザー光線のために）
並びに前方への散乱光のためのニュートラル１．　５フ
イルターであった。前方への散乱光に対する対数のフル
オレセイン螢光の輪郭プロットが、サンプルの分析のた
めに使用された。血液細胞型は検出できる結合性を示さ
なかった。

本発明における第二クラスの好ましい抗体の結合性は、
下記の第１表に部告されている。次の略語が抗体によっ
て結合される構造体を示すために使用される！ＡＣ、腺
房；Ｔ、細管；Ｄ、管；し、管腔；Ｗ、汗腺；Ｅ、上皮
；Ｓ、脂肪腺；Ｇ「、顆粒球；Ｍｋ、巨核球；Ｍ、マク
ロファージ；Ｌｙ、リンパ球：　Ｂｆｆｉ　、基礎層；
　Ｆ　ｅ　、病巣上皮；Ａ１肺胞の内層細胞；Ｂ、ボー
マンカプセル；Ｍｕ　、筋肉；及び！、小島；Ｈ、毛包
；Ｕ、糸球；及びＶ、血管／内皮。

以下余白 ＭＡＢの 川　　　見消　食道　■　　肩−或　■　肯　囲２６６
Ｂ２　　　１Ａｃ、１Ｄ２Ｅ　　　　　０　　　　　１
Ｔ　　　　　Ｏ００：３１７Ｇ５　　１Ａｃ、１　０　
　　　０　　　　２Ｔ　　　　ＩＧ　　ＯＯ１３６９Ｆ
１００　　　　０　　　　０　　　　０　　　　０　　
１ＧＯ１３８７１’１９　　１Ｄ　　　　　０　　　０
　　　０　　　０００４２１Ｅ８　　１Ａｃ　　　　Ｉ
Ｅ　　　　ＯＩＴ　　　　０　　１Ｇ　　Ｏ１４５１Ｃ
３００２Ｍ　　　　０　　　　０　　０　　１ＶＩ。

４５２Ｅ１２０　　　　０　　　　０　　　０　　　　
０００１４５２Ｆ２０　　　　０　　　　０　　　　０
　　　　０００１４５４＾１２０　　　　０　　　　１
Ｍ　　　　０　　　　１ＧＯＯＩ４５４Ｃ１１１１１１
−２Ｅ　　ＯＩＴ　　　　ＯＯ０４５７０７０００００
１ＧＯ１ ５２０Ｃ９０００ＩＴ　　　　０００　　　・６５０Ｅ
２　　１Ａｃ、ｌ　　Ｏ１−２Ａ　　２Ｔ　　　　２Ｇ
　　０　　０　　１６９７Ｂ３０　　　　０　　　　０
　　　２Ｔ　　　　０００　　　・７４１Ｆ８　０　　
　０　　　０　　　０　　　０　０　０　１７５９Ｅ３
０　　　　０　　　　０　　　　０　　　　０００７８
ＢＧ６０　　　　０　　　　０　　　　２Ｔ　　　　０
００〇−結合しなかった　　　　　ｌ−適度の結合正常
な組織結合性 扁ｉｌｌ：　　　、！ＩＦＪＩ　　ｒｃｉ　　ＩＬＬ　
　ルＪ１　骨４＆　　住　ＷｉＪ−Ｗ、ＪＭＦｔ。

２Ｅ　　　　ＯＯＯ２Ｅ、２賀０　　０　　１Ｅ　　　
ＩＥ０２ＤＯＯＯＯＩＧＯＯ ＤｏｏｏｌＳＯＯＯＯ ＩＬｙ、２Ｅ１，１００　　１Ｖ　　　０　　２　　１
Ｇ　　　Ｏ＋０１００００１ＧＯＯ ２１、ｙ、ＩＢＩＯＯＯＯ２１Ｇ　　　０　　０Ｄ１０
０２ＳＯＯＯ２’ ０　　　０　　０　　０　　１Ｅ、１１０　　　ｌＧ　
　　ＩＥ　　　ＩＥＩＥ　　　　１０　　０　　０　　
１Ｅ、ＨＯＩＧ　　　ＩＥ　　　ＩＥ０１００２ＳＯＯ
Ｏ２ ｏ　　　　ｏｏｏｏｏｏｏ。

０２ＤＯＯＯＯ２ＧＯ１ ００，００２ＳＯ２ＬＯ２Ｌ ｏ　　　　ｏｏｏｏｏｏｏ。

ＩＥ　　　　０　　０　　０　　０　　０　　０　　０
　　０１Ｆｅ　　　ＯＯ００００００ ２−強い結合 −つＡ１− 戸　　の′七人　　ン 抗体を、１４種の乳癌細胞系に対する免疫螢光アッセイ
によって、乳癌細胞系の範囲の認知のためにさらに評価
した。下記の第２表は、第二クラスの好ましい抗体のた
めのこれらの試験の結果を報告する。

以下余白 ＭＡＢの ２Ｇ３　　　　　４　　　３　　　　３　　　　２’　
　　　４　　　２９Ｃ６３０３０４２ ３２Ａ１　　　　３　　　　２　　　　２　　　　２　
　　　２　　　２３３Ｆ８　　　　２　　　　３　　　
　２　　　　０　　　　２　　　　３３５ＥＩＯ１００
０００ ４１Ｂ４　　　　１　　　　０　　　　０　　　　０　
　　　０　　　０８７＋１７　　　　０　　　　０　　
　　　１　　　　　１　　　　　０　　　　０１０６Ａ
１０　　　３　　　　３　　　　２　　　　２　　　　
２　　　　０１１３Ｆ１　　　　３　　　　４　　　　
　２　　　　２　　　　４　　　　０１２０１＋７　　
　　３　　　　２　　　　３　　　　０　　　　３　　
　　０１４０Ａ７　　　　３　　　　２　　　　１　　
　　０　　　　２　　　０２００Ｆ９　　３　　３　　
　２　　　０　　　２　　２２０３Ｅ２　　　　４　　
　　４　　　　　３　　　　０　　　　４　　　　２２
１９Ｆ３　　　　３　　　　３　　　　４　　　　０　
　　　４　　　　３２４５Ｅ７　　　　４　　　　４　
　　　　４　　　　　２　　　　　４　　　　２２６０
Ｆ９　　　　３　　　　３　　　　３　　　　２　　　
　３　　　　２一 □じＬ−表 乳） ０　　　２　　２　　　２　　　　ＮＤ　　　４　　　
２　　　３３１７Ｇ５　　　２　　　３　　　　３　　
　　０　　　　４　　　３　　　　１３６９ＦＩＯｌ　
　　　０　　　　０　　　　０　　　　２　　　０　　
　　０３８７１＋９　　　３　　　２　　　　２　　　
　　　　　３　　　３　　　　０４２１Ｅ８　　　２　
　　　　　　　２　　　　　　　　２　　　　　　　　
０４５１Ｃ３３２２２２２ ４５２Ｅ１２　　０　　　０　　　　０　　　　　　　
　　０　　　０　　　　０４５２Ｆ２　　　０　　　１
　　　　２　　　　　　　　　２　　　２　　　　０４
５４Ａ１２　　２　　　２　　　　２　　　　　　　　
　２　　　３　　　　２４５４ＣＩＩ　　　　２　　　
２　　　　２　　　　２　　　　２　　　２　　　　１
４５７Ｄ７　　　０　　　０　　　　０　　　　　　　
　　１　　　　　　　　０５２０Ｃ９１０１２０ ６５０Ｅ２　　　３　　　２　　　　３　　　　　　　
　３　　　　　　　　０６９７Ｒ３２４３ ７４１Ｆ８　　　１　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２　　　　　　　　０７５９Ｅ３　　　０　　　　
　　　　　　　　　　　　　　２７８８Ｇ６　　　２　
　　　　　　　　　　　　　　　　　２０＝陰性　　　
ｌ＝弱い　　　２＝通度　　　３−強い２　　　２　　
　　　　　　　２　　　２　　　　。

ｏｏ　　　　　　　　　　　ｏｏ。

ｔｏ　　　　　　　　　　３２３ ４−ひじょうに強い モノクローナル−の　　ｇ　　への′七人最後に、抗体
を、１１種の非乳癌に対するイムノペルオキシダーゼ染
色法によって試験した。第二クラスの好ましい抗体のた
めの結果を、下記の第３表に報告する。数字は、第１表
において示されたものと同じである。

す下余白 −八Ｂ　　　世　Ｍ　前立豚　皿 ２Ｇ３２０２０ ９Ｃ６１０００ ３２Ａ１０００２ ３３Ｆ８０１００ ３５Ｅ１０　　　２　　２　　１　　　　　２１１３Ｆ
１　　　０　　２　　０　　　　　２１４０Ａ７　　　
０　　０　　０　　　　　１２００Ｆ９　　０　１　０
　　　０ ２０３［Ｅ２ ２１９Ｆ３　　　０　　０　　１　　　　　０２４５Ｅ
７　　　０　　２　　２　　　　　２２５４＋１９ ２６０Ｆ９　　　０　　０　　１　　　　　１第一」Ｌ
−表 ＡＢの非乳癌結合性 銘　ユ２バ且　畳　ｊＦＪ−食道　孟亘腫　姐梨ｏｏ　
　　　　ｏｏｏｏ。

２１　　　　２１．０００ 町則　　　腸　師　皿立腺　皿 ２６６Ｂ２　　　０　　１　　１　　　　　　１３１７
Ｇ５　　　１　　１　　０　　　　　０３６９ＦＩＯＯ
１１１ ８７Ｈ９ ４２１Ｅ８　　　１　　１　　１　　　　　　１４５１
Ｃ３１１１１ ４５２Ｅ１２　　０　　０　　１　　　　　０４５２Ｆ
２　　　０　　０　　０　　　　　０４５４Ａ１２　　
０　　０　　０　　　　　１４５４Ｃ１１００１１ ４５７Ｄ７　　　０　　０　　１　　　　　０５２０Ｃ
９０１１１ ６５０Ｅ２　　　２　　２　　２　　　　　２６ｇ′７
Ｂ３００００ ７４１Ｆ８　　　０　　０　　０　　　　　０７５９Ｅ
３　　　０　　１　　１　　　　　１７８８Ｇ６　　　
０　　２　　０　　　　　’０ＡＢの非乳癌結合性 ヱ音　ユノベ腫　青　！ｌｉ　食道　孟亘且　皿巣ｏｏ
　　　　　ｏｏｏｏ。

２０　　　　１１２２＋ ｏｏ　　　　　ｏｏｏｏ。

ｏｏ　　　　　ｏｏｏｏ。

ｏｏ　　　　　ｏｏｏｏ。

ｏｏ　　　　　ｏｏｏｏ。

腫瘍性乳癌の範囲、乳癌細胞の結合範囲及び血液細胞の
結合並びに選択性が第４表に要約されている。

那−ヨし一表 ＭＡＢ候補者 ＭＡＢ　　　血１豊胞　ｌ１語羽影範皿　湛択性２Ｇ３
　　　　０　　　１．００　　　１．００　　０．０７
８９Ｃ６００，８６０，５７０，０６３ ３２Ａ１　　　　０　　　０．３３　　　０．７９　　
０．０７８３３Ｆ８　　　　０　　　０．１９　　　０
．７１　　０．０６３３５Ｅ１０　　　０　　　０．６
２　　　０．１４　　０．０７０４１Ｂ４　　　　０　
　　０．６７　　　０．００　　０．０２３８７Ｈ７０
０，９５０，０００，０７８１０６Ａ１０　　　０　　
　０．８６　　　０．８６　　０．０８６１１３Ｆ１　
　　０　　　０．１４　　　０，７９　　０．０４７１
２０１１７　　　０　　　０．６７　　　０．５７　　
０．０４７１４〇八７　　　　　　　　０　　　　　　
　　０．７１　　　　　　　０．３６　　　　　０．０
７０２００Ｆ９　　　０　　　０．５２　　　０．７１
　　０．０３１２０３Ｅ２　　　０　　　　　　　　０
．８６　　０．０５５ＭＡＢ候補者 川　　皇斂廠開　■廣１則　狙胞範■　ｊ訳並２１９Ｆ
３　　　０　　　０．８６　　　０．８６　　０．０８
Ｇ２４５Ｅ７　　　０　　　１．００　　　１．００　
　０．０７０２５４＋１９　　　０　　　　　　　　０
．９２　　０．０６４２６０Ｆ９　　　０　　　０．５
２　　　０．９２　　０．０８９２６６Ｂ２　　　０　
　　０．７１　　　０．８３　　０．０７０３１７Ｇ５
　　　０　　　０．４３　　　０．７７　　０．０５５
３６９Ｆ１０　　　０　　　０．８１　　　０．１７　
　０．０２３３８７Ｈ９００，２９０，９１０，０８６
４２１Ｅ８　　　０　　　０．８１　　　０．５７　　
０．０５５４５１Ｃ３００，３８０，９１０，０７０４
５２Ｅ１２　　　０　　　０．５２　　　０．００　　
０．０２３４５２Ｆ２　　　０　　　０．２４　　　０
．５５　　０．０００４５４＾１２　　　０　　　０．
２９　　　１．００　　０．０３１４５４Ｃ１１００，
７６０，７５０゜０７８４５７Ｄ７　　　０　　　０．
５５　　　０．１０　　０．０３９５２０Ｃ９００，２
５０，４００，００８６５０Ｅ２　　　０　　　０．８
６　　　０．９Ｑ　　　Ｏ，００８６９７Ｂ３　　　０
　　　０．３１　　　０．８８　　０．０７０ＭＡＢ候
補者 艇　　血櫃忠胞　Ｉ乳■皿　旦影Ｕ皿道沢牲７４１Ｆ８
　　　　Ｑ　　　　Ｏ，１８０，６３０，０００７５９
Ｅ３　　　０　　　０．１４　　　０．７８　　０．０
０８７８８Ｇ６　　　０　　　０．６２　　　０．８３
　　０．０１６−　　　　び−　・ 本発明に使用され得る抗体のいくつかを、ヨウ素化し、
そしてＭＣＦ−７，ＣＡＭＡｌ、５ＫＢＲ３又はＺＲ７
５３０細胞に対する結合のために試験した。抗体を、約
１０μＣ１／ｎの比活性にクロラミンＴを用いて＋２Ｊ
によりラベルした。免疫放射化学的な純度を決定するた
めに、ウシ胎児血清０．５−中における、１００，００
０ｃｐｍの２種のラベルされた抗体を、連続的に、０℃
で１５分間、目的細胞の５アリコートにより吸収しく一
般的に４，０００，０００個の細胞／アリコート）、そ
してそれぞれの吸収の後、上清液中の残る放射能を決定
した。

会合定数の測定のためには、既知の濃度のラヘルされた
及びラベルされていないモノクローナル抗体を、水中で
１５分間、ウシ胎児血清中、目的細胞と共にインキュベ
ートした。次に、細胞／抗体混合物のアリコートを、ｒ
計数器で計数し又はＭｉｃｒｏｆｏｌｄフィルタープレ
ート（’Ｊ　＆　ｐ　５ｃｉｅｎｔ−ｉｆｉｃ）を通し
て濾過し、そしてそのフィルターを計数した。フィルタ
ー上の液体中に保持された非結合性抗体を説明するため
に、同し濃度の抗体（但し、細胞ではない）を含む対照
を同時に行なった。会合定数及び目的の抗体当りの抗原
コピー数を、親和性試験から計算し、そして下記の第５
表に報告する。

玉−１−表 ＭＡＢの親和性及びＭＡＢ当りの抗原コピー数用　　　
　ユ　　　　　ハ　　　　　　胤曜糸２Ｇ３　　　　３
７０００００　　９．１ｘｌＯ６ＭＣＦ７Ｃ６ ３２＾１ ３Ｆ８ ５Ｅ１０ ＭＡＢの親和性及びＭＡＢ当りの抗原コピー数門＾Ｂ　
　　　　ｎ　　　　　　Ｋａ　　　　　　　豊胞糸１Ｂ
４ ７Ｈ７ ０６Ａ１０ １１３Ｆ１　　　２３０００００　　１．Ｉ　Ｘ　１０
ｑＭＣＦ７１２０８？　　　　２１００００　　６．２
　Ｘ　１０”　　　　ＭＣＦ７４０Ａ７ ００Ｆ９ ０３Ｅ２ １９Ｆ３ ４５Ｅ７ ５４Ｈ９ ２６０Ｆ９　　　　３００００　　６．Ｏｘ　１０’　
　　　？１ＣＦ７２６６Ｂ２　　　　８００００　　２
．７　ｘ　１０’　　　　ＭＣＦ７３１．７Ｇ５　　　
３２０００００　　１．６　Ｘ　１０”　　　　ＣＡＭ
ＡＩ６９Ｆ１０ ３８７＋１９ ２１Ｅ８ ４５１Ｃ３４０００００１，４ｘ　１０”　　　　ＭＣ
Ｐ７ＭＡＢの親和性及びＭＡＢ当りの抗原コピー成用　
　　　ｎ　　　　　　Ｋａ　　　　　　　凪胞糸５２Ｅ
１２ ４５２Ｆ２　　　２５００００　　６．８　Ｘ　１０’
　　　　５ＫＢＲ３４５４Ａ１２　　　４７００００　
　１．２　Ｘ　１０”　　　　ＭＣＦ７４５４Ｃ１１３
９００００４，８Ｘ　１０’　　　　ＺＲ７５３０５７
Ｄ７ ５２０Ｃ９５０００００８，２Ｘ　１０６ＳＫＢＲ３５
０１Ｅ２ ４１Ｆ８ ５９Ｅ３ ８８Ｇ６ ｉ原の、　　の、進 モノクローナル抗体によって認識された抗原を同定する
ために、抗原の免疫沈殿法を、次の方法に従って行なっ
た。８ｍ−の直径のポリスチレンボール（Ｐｒｅｃｉｓ
ｉｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｂａ１ｌ　Ｃｏ、）を、氷酢
酸中、１０％発煙硝酸により覆い、そして５０°Ｃの水
浴中で３時間、インキュベートした。酸処理の後、その
ボールを蒸留水により３度、すすぎ、０、１　ＭのＮ　
ａ　Ｏｌｌ中、１％亜ジチオン酸ナトリウムにより覆い
、そして５０℃の水浴中で３時間、インキュベートした
。そのボールを、蒸留水により再び３度、すすぎ、０．
１％ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、０．２％スペリン酸（
ジメチルホルムアミド中に溶解されたスペリン酸）によ
り覆い、そして室温で一晩、インキュベートした。その
ボールを蒸留水により３度、すすぎ、そして確認のため
に印を付けた。

精製されたモノクローナル抗体を、２−（Ｎ−モルホリ
ノ）エタンスルホン酸緩衝液により０．２■／−に希釈
し、そして前で処理され、そして印を付けられたボール
を、個々の管内に置き、そして希釈された抗体４５０μ
！及び新鮮な１％εＤＡＣ５０ｐＺにより覆う。管にふ
たをし、そして２５℃で２４時間、インキュベートした
。このインキュベーションの後、ボールをＰＢＳにより
２度すすぎ、そして新鮮なまま使用するか又は使用の前
４℃で数日間、貯蔵するかした。

新しくラベルされた目的細胞抽出物を、Ｍａｒｃｈａｌ
ｏｎｉｓ＋Ｊ、、　　”Ａｎ　　Ｅｎｚｙｍｉｃ　　Ｍ
ｅｔｈｏｄ　　ｏｆ　　ｔｈｅＴｒａｃｅ　Ｉｏｄｉｎ
ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ　
ａｎｄ　０ｔｈｅｒＰｒｏｔｅｉｎｓ’、Ｂｉｏｃｈｅ
ａ＋、Ｊ、　　１１３：２９９”３０５（１９６９）の
ラクトペルオキシダーゼ法によって１２５−１により又
は３５−Ｓメチオニン中で増殖することによって３５−
３によりラベルされたヒト乳癌細胞系から調製した。そ
のラベルされた細胞を、可溶化緩衝液〔１％（ｖ／ｖ）
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００　、１５０ｍＭのＮａＣｊ２
　％５ＩＩＩＭのＥＤＴＡ、　２５ｍＨのＴｒｉｓ　−
１！（Ｊ！　、　ｐＨ７，５）中に溶解した。ラベルさ
れた抽出物の４重量部を、容器中において５０■／ｎｔ
ｆのウシ血清アルブミンを含む可溶化緩衝液１重量部と
共に混合し、ｌｏｍｇ／　ｓｔｆ　ＢＳＡの最終濃度を
得た。モノクローナル抗体により被覆されたボールを、
その容器中に添加し、そして振盪しながら氷上で４時間
、インキュベートした。ラベルされた抗原をその容器か
らピペットで取り、そしてそのボールを可溶化緩衝液に
よ９４度すすいだ。次にそのボールを取り出し、Ｌａｅ
ｍｍｅｌｉ　ＳＤＳゲルのサンプル緩衝液１００Ｉ１１
を有する個々の管に置き、そして熱湯中で３分間、イン
キュベートした。そのボールを取り出し、そしてサンプ
ルを、適切な標準液によりＳＤＳゲル上で試験した。

抗体に対する免疫沈殿試験は、すべてのうち５種の抗体
（４５４Ｃ１１，４５２Ｆ２．５２０Ｃ９，７４１ＦＢ
及び７５９Ｅ３）が、乳癌性組織に見出された約２００
にドルトンのタンパク買上ツマ−を結合することを指摘
した。

５種の抗体のうち２種の抗体（５２０Ｃ９及び７４１Ｆ
８）は、２００にドルトンのタンパク買上の同じエピト
ープを認識すると思われる。４５４Ｃ１１及び７５９Ｅ
３は同じ抗原上の第二エピトープを結合し、そして４５
２Ｆ２は同じ抗原上の第三エピトープを結合する。４種
の抗体（４１Ｂ４，８７Ｈ７，４５２Ｅ１２及び４５７
Ｄ７）は、２４０にドルトンの細胞内抗原に結合した。

７種の抗体（２Ｇ３．２００Ｆ９，２０３Ｅ２．２４５
Ｅ７．３６９Ｆ１０，６９７Ｂ３及び７８８Ｇ６）は、
高分子量ムチン（ＨＭＷ）に結合した。２種の抗体（４
５１Ｃ３及び４５４Ａ１２）は、９５．０００ドルトン
の抗原の形でトランスフェリンレセプターに結合した。

４５１Ｃ３又は４５４Ａ１２のいづれも、そのレセプタ
ーへのトランスフェリンの結合を■止しなかった。

本発明のモノクローナル抗体の抗原結合特性は、第６表
に要約されている。

２Ｇ３　　　　　　　　　　１１ＭＷムチン９Ｃ６７０
Ｋ ２Ａ１ ３３Ｆ８　　　　　　　　　　６６　Ｋ３５ＥＩＯ８０
に ４１Ｂ４　　　　　　　　　　２４０　Ｋ８７８７　　
　　　　　　　　２４０　Ｋ１０６＾１０　　　　　　
　　　５５　Ｋ　ａ１１３Ｆ１　　　　　　　　　４０
，６０，１００．２００　Ｋひじょうに拡散する １２０Ｈ７ＨＭ−ムチン １４０＾７　　　　　　　　　　糖脂質（五徳）ＭＡＢ
　　　　　　　　　　　　　ＬＪＩ。

２００Ｆ９　　　　　　　　　　ＨＭ−ムチン２０３Ｅ
２　　　　　　　　　　ＨＭ−ムチン１９Ｆ３ ２４５Ｅ７　　　　　　　　　　ＨＭ−ムチン５４Ｈ９ ２６０Ｆ９　　　　　　　　　　　　　　５５　Ｋ　ｂ
２６６Ｂ２　　　　　　　　　　　　　　５５　Ｋ　　
ｂ３１７Ｇ５　　　　　　　　　　　　　　　４２　　
Ｋ　ｃ３６９Ｆ１０　　　　　　　　　　ＨＭＷムチン
３８７Ｈ９４０Ｋ ４５１Ｃ３）ランスフェリン レセプター ４５２Ｅ１２　　　　　　　　　　２４０　Ｋ４５２Ｆ
２　　　　　　　　　　２００　Ｋ４５４＾１２　　　
　　　　　　　）ランスフェリンレセプター ４５４Ｃ１１２００に ４５７０７　　　　　　　　　　２４０　Ｋ川　　　　
　　　　　　亘−盃 ５２０Ｃ９２００Ｋ ６５０Ｅ２　　　　　　　　　　　　　　４２　Ｋ　ｃ
６９７８３　　　　　　　　　　　　　２００　Ｋ７５
９Ｅ３　　　　　　　　　　　　　２００　Ｋ７８８Ｇ
６　　　　　　　　　　）ＩＭＷムチンａ　＝　２６０
Ｆ９及び２６６Ｂ２によって結合されるエピトープより
も異なったエピトープ。

ｂ　＝１０６ＡｌＯによって結合されるエピトープより
も異なったエピトープ；　２６０Ｐ９及び２６６Ｂ２の
両者は、同じエピトープ　　に結合するように思われる
。

Ｃ＝お互クロスブロックする。

のアイソ　イブ 抗体のアイソタイプを次のようにして決定した：５　ｍ
１１平方のごばんの目を、ニトロセルロースシート上に
鉛筆で軽く描き、そして１−小滴の抗アイソタイプ血清
（Ｌｉｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ、Ｋｅｎｓｉｎｇ
ｔｏｎ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ＋　マウスに、λ、　ａ　、　ｒｌ　
、　ｒ２ａ、ｒ２ｂ、ｒ３及びμ鎖に対するウサギ抗血
清）を、適用し、その結果、それぞれ横列の目が、それ
ぞれのＨ及びＬ鎖試薬の１つのスポットを受けた。その
シートを、湿りチャンバー中において室温で１時間、イ
ンキュベートし、１％（Ｗ／ｖ）のＢＳＡを含むＰＢＳ
によりすばやくすすぎ、そして４℃でＰＢＳ　−ＢＳＡ
中に一晩放置した。ハサミでばらばらにストリップに切
り、そして０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ　
−ＢＳＡ中に４℃で貯蔵した。他方、ストリップを空気
乾燥せしめ、そして４℃で乾燥貯蔵した。

ハイブリドーマ培養上滑液又はＰＢＳ　−ＢＳＡにより
希釈された上清液それぞれ３ｒｄを含む、一連の小さな
管を用意した。ｌ：１０の希釈がｍｍ的に好結果をもた
らし；そしていくつかの上清液はｌ：２００に希釈され
得る。ニトロセルロースのストリップを、室温で１時間
、それぞれの管内でインキュベートした。そのストリッ
プをＰＢＳ　−ＢＳＡにより３度すすぎ、そして希釈さ
れたウサギ抗−マウスーホースラディシュペルオキシダ
ーゼ中において室温で１時間、インキュベートした。そ
のストリップをＰＢＳ　−ＢＳＡにより２度及びＴｒｉ
ｓｌ、ｌ衝液により２度すすいだ。そのストリップを、
十分な色が抗−アイソタイプのスポット上に展開するま
で（通常３〜４分）、ジアミノベンジジン及び過酸化水
素を含むＴ　ｒ　ｉ　ｓ　緩衝液中に置いた。抗体のア
イ。

ツタイブは、第７表に示されている。

呈−１−表 ＭＡＢのアイソタイプ 黒　　　　　　　　　　アイソ先１１ ２Ｇ３　　　　　　　　　　　　　　　Ｇ１９Ｃ６１１ ３２ＡＩ　　　　　　　　　　　　　　　Ｇ１３３Ｆ８
　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇ１３５Ｅ１０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｍｄ１８４Ｇ１ ８７１１７　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇ１
１０６Ａ１０　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇ１１
１３ＦＩ　　　　　　　　　　　　　　Ｇ３１２０Ｈ７
？１ ＭＡＢのアイソタイプ ＭＡＲアイソタイプ １４０Ａ７　　　　　　　　　　　　　Ｍ２Ｏ０Ｆ９　
　　　　　　　　　　　Ｇ１２０３Ｅ２　　　　　　　
　　　　　Ｇ１２１９Ｆ３　　　　　　　　　　　　Ｇ
１２４５Ｅ７　　　　　　　　　　　　Ｇ１２５４Ｈ９
Ｍ ２Ｏ０Ｆ９　　　　　　　　　　　　Ｇ１２６６８２Ｇ
１ ３１７Ｇ５　　　　　　　　　　　　Ｇ１３６９Ｆ１０
　　　　　　　　　　　　！１３８７Ｈ９Ｇ１ ４２１Ｅ８　　　　　　　　　　　　Ｇ１４５１Ｃ３Ｇ
１ ４５２Ｅ１２　　　　　　　　　　　　Ｇ１４５２Ｆ２
　　　　　　　　　　　　Ｇ１４５４Ａ１２　　　　　
　　　　　　　Ｇ１４５４Ｃ１１Ｇ２Ａ ４５７Ｄ７　　　　　　　　　　　　ＧｌＭＡＢのアイ
ソタイプ 川　　　　　　　　　アイソタイプ ５２０Ｃ９Ｇ１ ６５０Ｅ２　　　　　　　　　　　　Ｇ１６９７８３　
　　　　　　　　　　　Ｇ１７４１Ｆ８　　　　　　　
　　　　　Ｇ１７５９Ｅ３　　　　　　　　　　　　Ｇ
１７８８Ｇ６　　　　　　　　　　　　　ＧＩＬ−２ この例に使用される組換えＩＬ−２は、ｄｅｓ−ａｌａ
ｌ−ＩＬ−２ｓａｒ＋ｚｓである。このＩＬ−２のアミ
ノ酸配列は、天然のヒ）ＩＬ−２のアミノ酸配列とは異
なり、ここで本発明のＩ　Ｌ−２は天然の分子の初めの
アラニンを欠き、そして位置１２５でのシスティンがセ
リンに交換されている。このＩＬ−２を産生ずるＥ、コ
リのサンプルは、１９８３年９月２６日にＡｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ（１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ、ＵＳＡ）にシータスコーポレーシ
ョンによって寄託され、寄託番号第３９，４５２号を得
、そして１９８４年３月６日、ブダペスト条約の規定下
で寄託番号筒３９．６２６号を得た。

１９８５年３月２１日に出願されたアメリカ同時係属出
願第７１５．１５２号（この開示を参照によって本明細
書に組入れる）のテキスト及び第１図に記載されている
ようにして、ＩＬ−２を加工し、そして精製した。但し
、インビトロでのジスルフィド結合の形成は、０−ヨー
ドジベンゾエートよりもむしろアメリカ特許第４．’５
７２．７９８号に記載の塩化第二銅を用いて行なった。

ＩＬ−２をクロマトグラフィー処理段階から回収する場
合、それを凍結乾燥し、そして中性緩衝液中に再懸濁し
た。クロマトグラフィー処理段階の後、組換えＩＬ−２
の純度は、少なくとも約９５％であり、そしてＩＬ−２
は、リムルスアメーバ様細胞アッセイによって決定され
る場合、約０．０２ｎｇ／＋ｎ７以下の内毒素を含んだ
。

その精製されたＩＬ−２を、５０曙／−のマンニトール
と共に０．３■／Ｌ１１７の濃度で配合した。

ｊｊ−児 腹腔内マウス腫瘍モデル０ＶＣＡＲ３、すなわちＮａｔ
ｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ
（Ｄｒ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ）からの及び八ｍｅｒｉｃａ
ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＯから入手できるヒト由来の
卵巣細胞系を使用した。

皮下異且換柾 グループ当り５匹の雌の免疫担当マウス（Ｃｈａｒｌｅ
ｓＲｉｖｅｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、
、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を＼０ＶＣＡＲ−３モ
デルにより皮下に処理する。腫瘍を、０．３．１０．１
４及び１７日で測定する。

格−来 ＩＬ−２のみ、乳癌抗体２８００１１　、５２０Ｃ９又
は４５４Ａ１２（下記の第１０表において確認される）
の１つ及び前記抗体と共にＩＬ−２を、腫瘍移植の後筒
１臼目（第１日）又は腫瘍移植の後３日目（第３日）に
、第８表に示された投与量及びスケジュールでマウス中
に静脈内注射することができる。

以下余白 第−且一表 物二二質　　　　　　　投与量／輸　　　　　　　スケ
２玉二少［Ｌ−２の最大許容投与量は、１４日間ヌード
マウスに毎日投与される場合、５Ｏ−１００ＫＵ及び１
４日間免疫担当マウスに毎日投与される場合、１５０〜
２００ＫＵであることが見出された。

第８表に示されているような物質の組合せの投与は、研
究はそのような結果を確めるために実際に行なわれなか
ったけれども、たった１つの物質の投与よりもより腫瘍
増殖を減じるように思われる。

１０にＵのＩＬ−２及び５００■の２８００１１を用い
て、第４日日から３日間、１日２回の投与の実験がくり
返えされたが、何の効果も見られなかった。投与量及び
スケジュールは、有効な結果を得るために調整されるべ
きである。すなわち、それぞれの成分の最大許容投与量
が決定されるべきであり、そして次に少なくとも１０日
間、１日２度の投与スケジュールが行なわれるべきであ
る。癌及び抗体のそれぞれのタイプは、異なった投与量
及びスケジュールを必要とし、日常の実験によって決定
されるであろう。

第８表に与えられたもう１つのスケジュールにおいては
、ＩＬ−２の最大許容投与量が、腹腔内（ｉ　ｐ）又は
腫瘍近くの筋肉内（ｉｍ）に１週間毎日、投与され、続
いてＩＬ〜２の最大許容投与量の半分及び抗体の最大許
容投与量の半分を、別々に静脈内巨丸剤として投与され
る。

以下余白 劃−」− 精製にゆだねられ、そして細胞毒性を示すために、可溶
化を必要としない可溶性組換えリシンＡを、次のように
して調製した。リシンＡのためのコード配列が推定上の
融合ペプチドを形成するために、ｐｈｏ　Ａのリーダー
配列をコードするＤＮＡと直接的に読み枠を合わして配
列され、その結果、そのリーダー配列がリーダー／リシ
ンＡキメラのＮ末端部分である場合、そのように配列さ
れたりシンＡ配列は、可溶性細胞毒性物質をもたらす。

ｐＲＴ　３　　（１９８６年３月７日に寄託された、Ａ
ＴＣＣ寄託番号第６７．０２７号）　、ｐＲＴ１７（１
９８６年３月７日に寄託された、ＡＴＣＣ寄託番号第６
７　、０２６号）及びｐＲＴ３８（１９８６年３月７日
に寄託された、ＡＴＣＣ寄託番号第６７．０２５号）又
はそれらの突然変異誘発形に含まれる前駆体タンパク質
のための遺伝子を含む発現ベクターを、構成した。これ
らの発現ベクターによる形質転換性宿主細胞は、コード
されている前駆体タンパク質の可溶化をもたらす。ａｒ
ｇ　−ａｒｇ変性前駆体を、トリプシンにより切断した
。その前駆体のＡ及びＢ部分を、下記のようにして別々
のタンパク質として産生じた。

ｐｈｏ　Ａ発現システムにおいて、必須成分は、リシン
Ａコード配列（ここで該リシンＡコード配列はＡＴＧコ
ドンによって開始される）の上流の、近くの及びその配
列と読み枠を合わせない終結ｐｈｏＡ’Ｊ−グー配列で
ある。もちろん、この２つのコード配列は、適合できる
細菌プロモーター（該プロモーターは、リーダーに常に
関連されるｐｈｏ　Ａプロモーターである）を、供与さ
れるべきである。さらに、製造法は、Ｂ、スリンギエン
シス（Ｌ■肛釦れ並旦針の結晶タンパク質に関連する陽
性のレトロレギュレーター配列である該配列の存在下で
改良され、そしてこれは、１９８６年３月１９日に出願
されたヨーロッパ特許出願第１７４，７８５号に広く記
載されている。これは、レプリコン及び選択マーカーを
含む細菌性運搬体ベクター上に供与された。

次に、そのベクターを用いて、適切な原核宿主を形質転
換し、これを選択された特定の宿主のために適切な条件
下で、通常、発現システムの制御下に置かれたプロモー
ターを抑制する条件下で増殖した。次に、リシンＡの産
生は、選択されたプロモーターの制御下で発現をもたら
す条件を提供することによって誘発され、そしてその産
生は生成物の好ましい堆積をもたらすのに十分時間、進
行することを可能にされた０次に、そのタンパク質生成
物を、細胞を破壊することによって単離し、そしてその
細胞残骸を除去した。次に、自由な可溶性タンパク質に
適用される場合、産生されたりシンＡは、当業界におい
て既知の標準技法を用いて、さらに精製された。しかし
ながら、その抽出及び精製の効率は、フェニルセファロ
ースにより一部透明にされた抽出物を処理することによ
って高められた。音波処理物中におけるリシンＡの溶解
度（膜又は他の関連物質から分離された後）は、その音
波処理物が１００，０００ｘ　ｇの高速で３０分間、遠
心分離にゆだねられ、不溶性タンパク質が沈殿せしめら
れる場合、その上清液に残存するその能力によって示さ
れた。

この可溶性リシンＡ（９，０■／＋ｎ）の合計２−を、
新鮮なβ−メルカプトエタノール２μｌを添加しく０．
１％にする）、そして室温で一晩、インキュベートする
ことによって還元した。その還元されたりシンＡ２−を
、０．１０Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８，０）により
平衡化された脱塩性カラムに適用し、続いて緩衝液０．
５　ｍＺ中に添加し、２．５−のサンプルを製造した。

次の溶出液３．０ｄ（緩衝液が通用された）を、脱塩さ
れたりシンＡとして集めた。

Ｂ、−へのりシンへの　入 上記により詳しく記載され、５２０Ｃ９と命名された抗
−乳癌モツクローナル抗体を産生ずる細胞系を、１９８
５年１月８日、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）　、　Ｒｏ
ｃｋｖｉｌ　ｌｅ、　ＭＯに寄託し、そして寄託番号１
１８８６９６を得た。この抗体を、室温で５゜５′−ジ
チオビス−（２−ニトロ安息香酸）と反応せしめ、そし
て次に冷却し、そして次に十分な２−イミノチオラン（
ＩＴ）を添加し、抗体分子当り２．５のＩＴ分子を得た
。

合計１６６Ｊ１１のプロピレングリコールを添加し、Ｉ
Ｔ−誘導の抗体を０．８−にした。上記のりシンＡＩ３
￥２．３２−を添加し、その接合反応を開始した。

その反応混合物を、室温で２時間、インキュベートした
。

その接合反応混合物を、０．１５Ｍのリン酸ナトリウム
の溶離緩衝液（ｐＨ８，０）を用いて、サイズ（ゲル濾
過）　ＩＩＰＬｃカラムに適用した。合計７８％の回収
率の精製された免疫接合体を、カラムから得た。

Ｃ，ＩＬ−２ この例に使用される組換えＩＬ−２は、ｄｅｓ−ａｌａ
ｌ−［Ｌ−２ｓ＊ｒ＋ｚｓである。この【Ｌ−２のアミ
ノ酸配列は、天然のヒトＩＬ−２のアミノ酸配列とは異
なり、ここで本発明のＩＬ−２は天然の分子の初めのア
ラニンを欠き、そして位置１２５でのシスティンがセリ
ンに交換されている。このＩＬ−２を産生ずるＥ、コリ
のサンプルは、１９８３年９月２６日にＡｓ＋ｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ（１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ、ＵＳＡ）にシータスコーポレーシ
ョンによって寄託され、寄託番号第３９．４５２号を得
、そして１９８４年３月６日、ブダペスト条約の規定下
で寄託番号第３９，６２６号を得た。　アメリカ特許第
４．６０４．３７７号のテキスト及び第１図に記載され
ているようにして、ＩＬ−２を加工し、そして精製した
。但し、不ノ旦上ユでのジスルフィド結合の形成は、Ｏ
−ヨードジベンゾエートよりもむしろアメリカ特許第４
，５７２，７９８号に記載の塩化第二銅を用いて行なっ
た。ＩＬ−２をクロマトグラフィー処理段階から回収す
る場合、それを凍結乾燥し、そして中性緩衝液中に再懸
濁した。クロマトグラフィー処理段階の後、組換えＩＬ
−２の純度は、少なくとも約９５％であり、そしてＩＬ
−２は、リムルスアメーバ様細胞アッセイによって決定
される場合、約０．０２ｎｇ／ｍ／以下の内毒素を含ん
だ。

その精製されたＴＬ−２を、５０■／ｍ／のマンニトー
ルと共に０．３■／ｍｌの濃度で配合した。

以下余白 Ｄ−孟ｊシを 使用される目的の細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ
　Ｃｕ１−ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ、ＭＯから入手できるネズミ腫瘍Ｐ３８８白
血病細胞である。

Ｅ−臣廣■皮下庄人 １！［細胞を、培養懸濁液から収穫し、そして適切なタ
イプのマウス中に皮下（Ｓｑ）又は腹腔内（ｉ　ｐ）接
種する。

Ｆ−猪一果 ＩＬ−２のみ、上記免疫毒素のみ及びＩＬ−２＋免疫毒
素を、腫瘍移植の後筒１ロ目（第１日）に、第９表に示
された投与量及びスケジュールでマウス中に腹腔内投与
することができる。

ｐＢｓ　　　　　　　　　− 」 」 間母目 ＩＬ−２の最大許容投与量は、１４日間ヌードマウスに
毎日投与される場合、５０〜１００ＫＵ及び１４日間免
疫担当マウスに毎日投与される場合、１５０〜２００Ｋ
ｔｌであることが見出された。

第９表に示されているような物質の組合せの投与は、た
ったＬつの物質の投与よりもより腫瘍増殖を減じるよう
に思われる。

第９表に与えられたもう１つのスケジュールにおいては
、ＩＬ−２の最大許容投与量が、腹腔内（ｉｐ）又は腫
瘍近くの筋肉内（ｉｍ）に１週間毎日、投与され、続い
てＩ　Ｌ−２の最大許容投与量の半分及び免疫毒素の最
大許容投与量の半分を、別々に静脈内巨丸剤として投与
される。投与■及びスケジュールは、有効な結果を得る
ために調整される、べきである。癌及び免疫毒素のそれ
ぞれのタイプは、異なった投与量及びスケジュールを必
要とし、日常の実験によって決定されるであろう。

皿−主 免疫毒素（ＩＭＴ）を、例２におけるようにして構成し
た。但し、５２０Ｃ９の代わりに、上記に詳しく記載さ
れた、２６０Ｆ９として命名された抗−乳癌モノクロー
ナル抗体（ＡＴＣＣＩＩＢ−８４８８）を用いた。

その得られた免疫毒素を、生理的食塩水及び０．０１％
マウス血清アルブミン中に希釈した。

使用されるＩＬ−２は、例２のＩＬ−２と同じであった
。使用される目的細胞は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈから得られた、ＭＸＩと
して命名された細胞系からの乳癌腫細胞であった。

その腫瘍細胞を、ヌードマウス中に皮下移植した。

そのスケジュール及び投与量は次の通りであった。免疫
毒素を、３．５Ｊｔｇ／２０ｇのマウス及び７．０ｇ／
２０ｇのマウスで合計６回１日おきに静脈内投与した。

ＩＬ−２を、ｌ０ＫＵ／投与量及び１００ＫＵ／投与量
で９日間毎日、腹腔内投与した。

両者は０日（腫瘍の移植後７日目）で始まり、そして同
時に投与される場合、重複スケジュールを有した。その
結果は下記の第１０表に示される。

以下余白 望」」Ｌ表 月とヱ １０Ｋｕ　　　　　　　　　　　　　　　１．０３　０
１５　１５．０　　　７６１００にｕ　　　　　　　　
　　　　　　１．１４　１１５　　９．３　　　４７セ
Ｕ ”３．５躍　　　　　　　　　　　　０゜９８　０１５
　　９．４　　　４７７、０■　　　　　　　　　　　
　０．９２　０１５　　４．７　　　２４日治世− １０ＫｕｌＬ−２／３．５ｇ　　ＩＭＴ　　　　　０．
９２　０１５　１２．９　　　６５１００ＫｕｌＬ−２
／３．５ｇ　　ＩＭＴ　　　　Ｏ，９５１１５１１，３
５７１０Ｋｃ＋ＩＬ−２／７．０１１ｇ　１Ｍ丁　　　
　　　０．７５　　２１５　　　３．６　　　　　１８
１００ＫｕｌＬ−２／７．０ｇ　　ＩＭＴ　　　　Ｏ，
８６２１５０，９４ユ１］」ｖトλ止瞭１．０９　０１
５　１９．８　　１０００ΔＢＷは、処理の始めでの平
均体重（ｇ）に対する処理後、１４日での平均体重（ｇ
）の比率によって測定される体重の変化である。

ＯΔＴＷは、処理の始めでの平均腫瘍体積（龍３）に対
する処理後、１４日での平均腫瘍体積（、ｍ３）の比率
によって測定される腫瘍体重の変化である。

０−％Ｔ／Ｃは、対照の腫瘍体積に対する処理された腫
瘍体積の比率である。（たとえば、％Ｔ／Ｃ＝４０とは
、６０％の腫瘍増殖の抑制が存在したことを意味する。

）　・ その結果は、組合せの方が、その抗腫瘍効果に関してほ
ぼ付加的であり；毒性をわずかに高めたことを示す。投
与量／投与経路／スケジュールは、効率及び毒性の結果
を変えることができる。

下記に挙げられたモノクローナル抗体産生ハイプリドー
マを、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する
ブダペスト条約及びそれに基づく規則（ブダペスト条約
）に基づいて、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）又はＩｎｖｉ
ｔｒ。

Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｃ、（ＩＶＤに寄託
した。生存している培養菌の保存は、寄託の日から３０
年間保証される。。そのハイプリドーマは、ブダペスト
条約のもとで、そして適切なアメリカ特許の発行後には
、無制限の入手可能性を保証する出願人とＡＴＣＣ又は
ＩＶＩの間の契約に基づいて、寄託されたハイブリドー
マは、ＡＴＣＣ又はＩＶＩから入手可能にされるであろ
う。特許法に従っていずれかの政府の権威下で与えられ
た権利に反してこの発明を実施する許諾であると解釈し
てはならない。

第１１表の左の縦列に挙げられたそれぞれのハイブリド
ーマの名称は、命名されたモノクローナル抗体を産生ず
るモノクローナル抗体に対応する。

９Ｃ６１ＶＩ−１００５６ ４１Ｂ４　　　　　　　　　　　　　１ＶＩ−１００５
７８７８７１ＶＩ−１００５９ １０６Ａ１０　　　　　　　　　　　　１ＶＩ−１００
６０１２０Ｈ７（Ｖｌ−１００６１ ２００Ｐ９　　　　　　　　　　　　　１　Ｖ　ｌ−１
００６２２５４Ｈ９１ＶＩ−１００６３ ４２１Ｅ８　　　　　　　　　　　　　１ＶＩ−１００
６４３２Ａ１　　　　　　　　　　　　　１ＶＴ−１０
０６Ｇ３５Ｅ１０　　　　　　　　　　　　　１ＶＬ　
１００６７１４０Ａ７　　　　　　　　　　　　１ＶＩ
−１００６９■栄１聾髪４株　　　　　　　　　　±ｙ
」Ｊ■し１号２０３Ｂ２　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１ＶＩ−１００７０２１９Ｆ３　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１ＶＩ−１００７２３８７Ｈ
９１ＶＩ−１００７３ ４５２Ｅ１２　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ
ＶＩ−１００７４４５４ＡＩ２　　　　　　　　　　　
　　　　　　１ＶＩ−１００７５４５７０７１ＶＩ−１
００７６ ６９７Ｂ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ＩＶＩ−１００７７７４１Ｆ８　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１ＶＩ−１００７８７５９Ｅ３　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１ＶＩ−１００７９
７８８Ｇ６　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
ＶＩ−１００８０４５１Ｃ３１ＶＩ−１００８１ ４５２Ｆ２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
ＶＩ−１００Ｂ２６５０Ｅ２　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１ＶＩ−１００８３相ｌＩ宣へ４迩　　
　酊μＵ珪　　酊避ｍ号２６０Ｆ９　　　　　　　　　
１／２７／８４　　　　　　　ＨＢ−８４８８２Ｇ３　
　　　　　　　　　１／２７／８４　　　　　　１１Ｂ
−８４９１３３Ｆ８　　　　　　　　　１／９／８５　
　　　　　　ＪＩＢ−８６９７１１３Ｆ１　　　　　　
　　　１／２７／８４　　　　　　　ＨＢ−８４９０２
４５Ｅ７　　　　　　　　　１／２７／８４　　　　　
　１１Ｂ−８，１８９利十■聾髪４作　　　Ｍ９堅しｔ
仕　　以北２６６Ｂ２　　　　　　　　　１／２７／８
４　　　　　　　ＨＢ−８４８６３１７Ｇ５　　　　　
　　　１／２７／８４　　　　　　ＨＢ−８４８５３６
９Ｆ１０　　　　　　　　１２／１３／８４　　　　　
　ＨＢ−８６８２４５４Ｃ１１１／２７／８４　　　　
　１１Ｂ−８４８４２８００１１１／２７／８４　　　
　　　　ＪＩＢ−８４８７５２０Ｃ９１／８／８５　　
　　　　　ＨＢ−８６９６”２６０Ｆ９−ＩＣ９１１／
７／８４　　　　　１１Ｂ−８６６２＊このクローンは
、２６０Ｐ９の子孫であり、そして２６０Ｆ９よりも良
好な抗体産生体であることが見出された。

要約すれば、本発明は、抗腫瘍モノクローナル抗体及び
／又は免疫毒素及びｒＬ−２と共に、薬理学的に有効な
量を用いて、癌のためのコンビネーション治療を提供す
るように思われる。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、腫瘍の治療学的又は予防学的処理のために温血哺乳
   類への非経口又は皮下投与のために適切な組成物であっ
   て、哺乳類からのインターロイキン−２（ＩＬ−２）及
   び腫瘍細胞に選択的に結合する少なくとも１つの免疫毒
   素の混合物を薬理学的に有効な量で含有する組成物。 ２、前記ＩＬ−２がヒトＩＬ−２であり、そして前記組
   成物がＩＬ−２及び免疫毒素のために医薬的に許容され
   るキャリヤー媒体をさらに含んで成る特許請求の範囲第
   １項記載の組成物。 ３、前記ＩＬ−２が成熟したヒトＩＬ−２、ｄｅｓ−ａ
   ｌａ＿１−ＩＬ−２＿ｓ＿ｅ＿ｒ＿１＿２＿５、ｄｅｓ
   −ａｌａ＿１−ＩＬ−２＿ａ＿ｌ＿ａ＿１＿０＿４＿ｓ
   ＿ｅ＿ｒ＿１＿２＿５、ＩＬ−２＿ｓ＿ｅ＿ｒ＿１＿２
   ＿５、ＩＬ−２＿ａ＿ｌ＿ａ＿１＿０＿４、ＩＬ−２＿
   ａ＿ｌ＿ａ＿１＿０＿４＿ｓ＿ｅ＿ｒ＿１＿２＿５、ｄ
   ｅｓ−ａｌａ＿ｉＩＬ−２又はｄｅｓ−ａｌａ＿１ＩＬ
   −２＿ａ＿ｌ＿ａ＿１＿０＿４である特許請求の範囲第
   １又は２項記載の組成物。 ４、前記免疫毒素がヒト乳癌及び／又はヒト卵巣癌細胞
   に選択的に結合し、そしてＧ又はＭのアイソタイプを有
   する抗体を含んで成り、そして前記処理される癌が乳癌
   及び／又は卵巣癌である特許請求の範囲第１〜３項のい
   づれか１項記載の組成物。 ５、前記免疫毒素が、２６０Ｆ９、２８０Ｄ１１、２４
   ５Ｅ７、５２０Ｃ９、１１３Ｆ１、２６６Ｂ２、４５４
   Ｃ１１、２Ｇ３、３３Ｆ８、３１７Ｇ５、３６９Ｆ１０
   、９Ｃ６、３５Ｅ１０、１０６Ａ１０、３８７Ｈ９、４
   ２１Ｅ８、４５１Ｃ３、４５４Ａ１２、６５０Ｅ２、７
   ４１Ｆ８、７５９Ｅ３及び前記群のメンバーに機能的に
   等しい抗体から成る群から選択された抗体を含んで成り
   、そして前記免疫毒素が組換えリシンＡ鎖を含んで成る
   特許請求の範囲第１〜４項のいづれか１項記載の組成物
   。 ６、温血哺乳類における腫瘍の治療学的又は予防学的処
   理のための方法であって、哺乳類からのＩＬ−２及び腫
   瘍細胞に選択的に結合する、少なくとも１つの免疫毒素
   の混合物の薬理学的に有効な量を前記宿主に投与するこ
   とを含んで成る方法。 ７、前記ＩＬ−２及び免疫毒素の混合物が宿主に別々に
   投与される特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、前記免疫毒素が、ヒト乳癌及び／又はヒト卵巣癌細
   胞に選択的に結合し、そしてＧ又はＭのアイソタイプを
   有するモノクローナル抗体に接合された組換えリシンＡ
   鎖を含んで成り、そして前記処理される腫瘍が乳癌及び
   ／又は卵巣癌である特許請求の範囲第６又は７項記載の
   方法。 ９、前記抗体が５２０Ｃ９又は２６０Ｆ９であり、そし
   て前記宿主がヒトである特許請求の範囲第６〜８項のい
   づれか１項記載の方法。 １０、前記混合物を、くり返して投与する特許請求の範
   囲第６〜９項のいづれか１項記載の方法。 １１、腫瘍の治療学的又は予防学的処理のために温血哺
   乳類への非経口又は皮下投与のために適切な組成物であ
   って、哺乳類からのＩＬ−２及びヒト腫瘍細胞に選択的
   に結合する、少なくとも１つのモノクローナル抗体の混
   合物を薬理学的に有効な量で含有する組成物。 １２、温血哺乳類における腫瘍の治療学的又は予防学的
   処理のための方法であって、哺乳類からのＩＬ−２及び
   ヒト腫瘍細胞に選択的に結合する、少なくとも１つのモ
   ノクローナル抗体の混合物の薬理学的に有効な量を前記
   宿主に投与することを含んで成る方法。