JPS63503328A - 心臓疾患の検証の方法ならびに試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 心臓疾患の検証の方法ならびに試薬 本発明はたとえば心筋梗塞のような心筋の疾患の検証の方法および試薬、ならひ に心臓手術の際の経過チェック、心筋梗塞後のさらなる観察およびたとえは血小 板崩壊治療の際のような心臓治療のための特定の徴候の際のその使用に関する。

心臓疾患、殊に心筋梗塞の認識のために、今日では臨床の実地で個人の病歴の評 価と同時に２つの根本的な原則が利用される。これは心筋の電気的ポテンシャル の障害または血液中での酵素活性の変化に因る。心電図測定（ＥＫＧ）から梗塞 の撫々の発生段階おＪひ局在化に関する情報が得られる。心臓障害、たとえは心 筋梗塞を示す、＃素活性の変化は衰えた心筋細胞から生じる、血清中の心筋個有 の酵素の言鈑の上昇の演１ｊ足による。その際臨床実地で、クレアチンキナーゼ （ＣＫ）ないしはＣＫ−イン酵素（ＣＫ−ＭＢ　）およびラクテートデヒドロゲ ナーゼ（ＬＤＩ（）およびグルタメートーオキサルアセテートートランスアミナ ーセ゛（ＧＯＴ）の測定が非富にｌ欽である。

１１にタレアテンキナー七’　（ＡＴＰ　：クレアチン−ホスホトランスフェラ ーゼ、ｗ、ｃ、　２．７．３．２　）　ないしはそのイン酵素は背椎動物で、筋 肉−２よひ神鮭組厭中に特に高い濃度で存在する。そこではＣＫは、クレアチン の、この組織中でエネルギー富有リン酸塩の貯蔵形を戎わす、クレアチンリン酸 への変！！！１′ｆ−触媒反応する。

クレアチンリン酸はクレアチンを介する脱ホスホリル化後、クレアチニン中で非 酵素、非可逆反応に移行する。クレアチニンは哺乳動物のクレアチン−物＊ｇ謝 の異化代謝最終生成物を懺わしおよび血液から腎臓を経て尿中に排出される。

骨格−および心筋組織の疾患、殊に心筋梗塞の認識のための方法としての血清中 のクレアチンキナーゼの確定は、骨格−および心筋組織の損傷によシ増大された ＃素遊離から生じる。既に心筋梗塞の６〜８時間後、ＣＫ−活性の上昇が観察さ れ、最高値（通常の１０〜２０倍）が、約１８〜２４時間抜達成される。

血清中のラクテートデヒドロゲナーゼないしは心筋固有のＬＤＨ−イソｔ＃素の 活性の上昇は同様に損傷されたないしは破壊された心筋組織に基づく。確実な上 昇Ｆｉ９０％の場合臨床症候学の開始の１２時間披見出される。ＬＤＨ−上昇の 最大値（通常の２〜１０倍）は４８〜７２時間の間に存在する。

しはしは心臓久患の臨床診断法ではその他に付加的なパラメタとしてＧＯＴ−活 性の御ｊ足を利用する。叩Ｔ−活性の上昇はＣＫ−活性の上昇に時間的にはは平 行に行う。

心ｊｆ＃Ｉ梗塞および他の心筋損傷の検証のための上記酵素の測定の欠点はしか し血液ないしは血清中での酵素活性の注目に値する上昇は損傷の発生の約８時間 後初めて生じ、その際最高値は約８時間後達成されることである。相当する心電 図も約１５％の場合明白な、信頼できる証言を生じない。公知方法はそれによシ 心筋梗塞または心筋組織の他の損傷の初期の固有の診断のために使用するのには 制限つきでのみ過している。

固有の診断に基づきできるかぎり早く、即ち発生後約４時間までに達成された治 療のみがしかし殊に急性心筋梗塞の際治療効果を達成する。

本発明の課題はしたがって、それによシ心筋梗塞−診断学の証言力が高められる 、心筋梗塞および心筋の他の損傷の検証のために簡単な、急速に実施すべき固有 の方法を開発することを基礎とした。

このａ組は、少なくとも一株の低分子中間代謝物、たとえばクレアチン（分子３ １１３１ｇ・ｍｏｌ−１）またはクレアチンリン酸を尿、血欣、血清、血しよう 、唾液およびその限外Ｉｓ１逸物のような体液または組織抽出物の試料中で測定 することによシネ発明によシ解医する。

心臓疾患はたとえは最もしはしは急性心筋梗塞、ミクロネクローゼ（Ｍｉｋｒｏ ｎｅｋｒｏｓｅ　）、急性および浩在性心ｙｆｈ症、鈍い胸部外傷後の心臓挫傷 の形である。

概念５中間代謝物＃はここに記載された関係でクレアチン−動員代謝から生じる か１だはこの物置交換で反応された生成物ならびに可能な生物学的および化学的 前−および最終生成物ならびに人工のアーチファクトを衣わす。次の基質が例を 表わす：クレアチン、タレアゾンリン酸、クレアチニン、サルコシン、ホスホエ ノールビルバート、キルバート、ラクテート、尿素、グリシン、ホルムアルデヒ ド、心筋のアミノ酸ならびにそのわずかな分子量に基づき、心筋組織の損傷の際 増大し℃遊離される、その生化学的および化学的変換生成物。

グリシンおよびアルギニンから主に肝臓および腎臓中で合成されおよび主にクレ アチニンとして排出されるクレアチンは健康なヒトないし哺乳動物ではわずかな 濃度でのみ血清ないしは尿中に存在する（約５〜１０ダ／ｌないし２〜４ｗ／ｌ ）。

クレアチンの測定はこれまでは、クレアチン−測定とは反対に、主に臨床化学研 究のために使用された。

たとえは増加する腎臓機能不全で血液の増加されたクレアチン音量（クレアチナ −ゼ ためにたとえＦｉ特公昭５Ｂ−００９６９９号公報参照〕。

その他に溢血性貧血の患者では苦しい浴血注危期の間２４時間−尿中で約１０〜 ２０倍増大されたクレアチン１ｌｌｌｉが確定される（　Ｂｅｙｅｒその他、Ｃ １１ｎ、　Ｃｈｅｍ。

６１．１２６２〜１２３４（１９８５））。その他に骨格筋組織の種々の疾患で は血清および尿中の高められたクレアチン濃度が観察される（　Ｙａｓｕｈａｒ ａその他、Ｃ１１ｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｚａ　１　２２、１８１〜１８８（１９８ ２）　；　５ｕｚｕｋｉおよびＹｏｓｈｉｄａ　、、Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｉｎ。

Ａｃｚａ　１４０．２８９〜２９４（１９８４年））。これめに使用されること は新規である。

本発明による効果、即ち心臓疾患との体液中の高められた中間代謝物濃度の関連 の認識は非常に篤異的である。このような関連はこれまで公知にされていない。

これによシできるかぎり付加的なエネルギー備蓄がクレアチンリン酸のクレアチ ンへの変換および同時のＡＴＰ−形成下に可動性にされる。血液／血清中で８〜 ２４時間後初めて生じる、ＣＫ−活性の上昇とは反対に、本発明によシしかし、 血液ないし尿中のたとえばクレアチンのような低分子中間代謝物の上昇は既に約 １時間後に生じ、約３時間後に最高値を生じることが示される。それによシ急性 心筋梗塞または心筋の他の損傷または心臓疾患の検証のための低分子中間代謝物 の測定は生化学心臓診断学での全く新しい原則を氏わす。

そのつどの中間代謝物は体液の試料中で酵素的に、接続された＃素反応によるか 、あるいは純粋に化学的な反応によシ沖」定され、その際測光検出が有利である 。

クレアチンはたとえはタレアチンキナーゼ、ピルバートキナーゼおよび２クテー トデヒドロデナーゼとの結合された反応および最終的に生じるＮＡＤ＋のツー範 囲での測定で（Ｈ，Ｕ、　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ　、　Ｍｅｚｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅ ｎｚｙｍａ−ｚｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、３　ｚｈ　ｅｄｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ　、ＩＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、１９８５年、ＶＯｌ、８．５００〜５１ ４）ないし他の、当業者に公知の反応によシ相当する染料として確定される。酵 素クレアチナーゼ（クレアチンアミジノヒドロラーゼ、Ｅ、Ｃ，３，５，３，３ ，）およびサルコシンオキシダーゼ（ないしはサルコシンデヒドロデナーゼ）の 使用および形成したＨ２Ｏ２または消費された０２（ないしは形成されたＮＡＤ Ｈまたは消費されたＮＡＤ”　）ないしはホルムアルデヒＦの測定下のクレアチ ンの確定が可能である。本発明による方法の際、ペルオキシダーゼ（またはペル オキシダーゼ様作用物ＩＸ）および色形成系の触媒作用下のサルコシンオキシダ ーゼを用いる確定および形成したＨ２Ｏ２の測定が有利である。

しかしその他に形成したＨ２Ｏ２または消費した０２を滴定法、電位差法ならび にポーラログラフイーによシ検出することもできる。この方法も当業者に公知で ある。

心筋梗塞のような心臓疾患の際の、中間代謝物、たとえはクレアチンの本発明に よる確定は約１〜２４時間、特に２〜８時間内に行い、心臓損傷の発生の約６時 間後に最高値を達成する。急性心筋梗塞の発生後２４時間までの測定はたとえは ＣＫ−依存診断学の保りまたは場合によ）生ずる阿−梗塞の認識のような他の医 学的観察のために使用する（第１図および第２図参照）。

クレアチンの確定のための体液として、ここでクレアチンの上昇が著しくよシ高 いので、有利に尿を使用する。クレアチンの確定のために有利に心臓損傷の検証 のために、クレアチンアミジノヒドロラーゼ（クレアチナーゼ）およびサルコシ ンオキシダーゼ（Ｅ、Ｃ。

１．５．３．１．　）　の使用下にクレアチンから最終的に形成した過酸化水素 がペルオキシダーゼおよび呈色試薬と反応して染料になる、酵素方法を使用する 。サルコシンオキシダーゼの代わシにサルコシンデヒドロデナーゼも使用できお よびＮＡｐＨおよび／またはホルムアルデヒドが確定できる。

次の認識はこの際他の１要なおよび先天的にでなく必要であると予見できる本発 明の部分を表わす。これは、健康なヒトではサルコシンが−とにかく一痕跡量で のみおよびクレアチンに対し無視できる良度で血液ないしは尿中に存在するので 、サルコシンが心筋損傷の固有の条件下に、よシ大きな、クレアチンに対しｌ要 な量で血液ないし尿中で生じるという駕異的な発見にもとづく。たとえは心筋梗 塞のような心臓疾患との関連で高められたサルコシン叡度は同様にこれまで公知 でない。それによシ各々の測定評価のために他の反応を前接するかあるいは平行 に実施することが有利である。この付加的な測定はいずれにせよ、クレアチンア ミジノヒドロラーゼ（クレアチナーゼ）の存在なしに、同一に進行する。引続ぎ 測定信号の差異から真のクレアチン濃度を算出する。これによシ参照方法（高性 能液体クロマトグラフィー＝　ＨＰＬＣ）　によシ得られたクレアチン価が一致 しおよび信頼できる証言を許す。

形成した染料の強さを唯一、試料中のクレアチンないしはこれから形成した過酸 化水素の量に帰しおよび同時に存在するサルコシンまたは他のサルコシンオキシ ダーゼと反応する物質に帰さないことをまた確実にするために、各々のクレアチ ン測定のために一般に常用の９値（試料なしの水または緩衝溶液）と同時に、同 様の処置によシクレアチナーゼの添加なしに生じる、いわゆるサルコシン−空値 ′！ｉ−顯息する。クレアチンの正体含量は最初の測定からのこの空値の差し引 きによシ得られる。

クレアチンリン酸の測定の際同様に方法を行う。クレアチンキナーゼ（およびＡ ＤＰ）、クレアチンアミジノヒドロラーゼおよびサルコシンオキシダーゼの存在 でクレアチンリン酸からＨ２Ｏ２が生じる（これは和尚する最終反応で測光的に 足並化される）各々の反応のために、他のクレアチンキナーゼ（およびＡＤＰ　 ）なしの測定計ｆｉｉｌを前接してまたは平行して実施する。この際クレアチン およびサルコシンから形成されたＨ２Ｏ２を包含する。試料中のクレアチンリン 酸の正体言置は双方の確定値の差異形成によシ測定される。

本発明の他の対象は、本発明による方法、特にクレアチン−確定のために好適な 、サルコシンオキシダーゼ−反応で形成された過酸化水素の検出のための呈色試 薬である。文献には触媒としてペルオキシダーゼを用いる過酸化水素の検出のた めの指示薬として使用できる、多数の化合物が記載されている。このような指示 薬は次のようなものである：ベンチジンおよびベンチジン−誘導体、種々のフェ ノール、たとえばグアヤツク樹脂のようなポリフェノール、たとえばロイコマラ カイトグリーンのようなロイコ染料、ジクロルフェノールインドフェノール、ア ミノカルバゾール、トリアリールイミダゾール、２．７−アジノージ−〔３−エ チル−ベンズチアゾールスルホン酸−（６）〕ならびに水素ドナーおよび電子− またはラジカル−受容体を含有する染料系。最後のものがこの際特に選択された 。

本発明による呈色試薬では水素−ドナーとして殊にアニリン誘導体が適している ことが示された。その際次式のアニリン誘導体： 〔式中ｎ＆よびｍは１〜乙の数を表わし、ＸおよびＹは何種、１〜６のＣ−原子 を有するアリーレンまたはヒドロキシアルキレン基　Ｒ１およびＲ２は水素、１ 〜６のＣ−原子を有するヒドロキシ−、アルキル−またはアルコキシ基、カルボ キシル−、スルホン酸−、アセトアミド−またはＰ（０）　（ＯＲ）　ＣＩ□− 基であってよく（その際Ｐはリン原子を衣わし、Ｒは水素または１〜６のＣ−原 子を有するアルキル基およびｙはヒドロキシ−１１〜６のＣ−原子を有するアリ ール−、アルキル−またはアルコキシ基を表わしていてよい）、Ｒ３は水素、ハ ロゲン、カルボキシル−またはスルホン酸基であってよく、その際ハロゲンはフ ッ素、臭素および有利に塩素およびフッ素を包含し、Ｒ４およびＲ７は水素、１ 〜６のＣ−原子を有するアルコキシ−またはアルキル基、Ｒ５およびＲ６は水素 、１〜６のＣ−原子を有するアリール−またはアルキル基ｔ−表わしおよびＲ５ およびＲ７ないしはＲ６およびＲ′は双方の置換基がオルト位に互いにある場合 、−緒に、ヒドロキシ−またはオキソ基によジ置換されていてよい、２〜６のＣ −原子を有する飽和または不飽和炭化水素鎖を形成してよい〕のアニリン誘導体 ならびに酸および塩基とのその塩が有利である。

有利なアニリン誘導体は殊に（Ｎ−メチルアニリノ）−メタンホスホンｋ、Ｎ− エテル−Ｎ１２−ヒドロキシ−３−スルホニルゾロビル）−ｍ−）ルイシン（Ｔ ＯＯ８）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホゾロビルアニリン（ＡＩ、ＰＳ　）、Ｎ−エ チル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰ８）、Ｎ−エチル−Ｎ−ス ルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ　）、Ｎ−エテル−Ｎ−スルホゾロピ ル−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ　）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピ ル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ　）、Ｎ−スルホプロピル−３，５ −ジメトキシアニリン（）（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ− ３−スルホゾロビル）アニリン（ＡＬＯ８）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ シ−３−スルホゾロぎル）−ｒｎ−アニシジン（ＡＤＯ８）、Ｎ−エテル−Ｎ− （２−ヒドロキシ−６−スルホゾロビル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯ ８）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ”）　−３−５−ジ メトキシアニリン（ＤＡＯ８）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−６−スルホゾロビル） −３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯ８）　オよびＨ−ｘルホプロビルアニ リン（）（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−ｍ−トルイジン（ ＥＨＴ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−スルホエチル）−ｍ−トルイジン（ＪＳＴ） 、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホベンジル）　−ｍ　−）ルイジン（ＫＴＴＳ　 ）、Ｎ−（２−アセトアミＦエチル）−Ｎ−エチル−４−フルオル−６−メチル −アニリン（Ｆ　−ＥＭＡＥ）およびたとえＦ′ｉＮ−ヒドロキシ−エチル−１ ，２，３，４−テトラヒドロキノリン（ＨＲＴＣ）または１．２．３．４−テト ラヒドロキノリン−Ｎ−メタンホスホン醸（ＴＨＣＬ／Ｐ）のような相当するキ ノリン誘導体である。Ｈ２Ｏ２の検鉦のために酸化色形成反応でのカップリング 成分としての、これらのまたは類縁アニリン誘導体の使用はたとえはべの特許文 献に記載されている（西ドイツ国特許出願公開第３１２４５９４号、同第３４１ ３６９３号、同第３４２５２１９号明細書、ヨーロッパ特許出願公開第０１７５ ２５０号明細書）。

その他にたとえばフェノール誘導体２，４．６−）リプロム−３−ヒドロキシ− 安息香酸（ＴＢＨＢ　）および２．４．６−ドリヨードー３−ヒドロキシ安息香 酸を本発明による方法のために使用することができる。

を子−およびラジカル−受容体とし℃たとえば４−アミノフェナジン（４−ＡＡ Ｐ　）、３−メチル−２−ペンゾチアゾーリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）および ３−メチル−２−ペンゾチアゾーリノンヒドラゾン−６−スルホン酸（Ｓ　−Ｍ ＢＴＨ）がＸ要であシ、しかしまた他のその酸化カップリング力のために公知の 物質が同様の方法で使用できる。

酸化カップリングの際の尿−ないし血清成分に対する妨害感受性が特にわずかで あるので、４−アミノフェナジン（４−ＡＡＰ　）または６−メチル−２−ペン ゾテアゾーリノンヒドラゾン−６−スルホン＆　（Ｓ−ＭＢＴＨ）の、Ｎ−エチ ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−６−スルホゾロビル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯ８ ）とのカップリングまたは（Ｎ−メチルアニリノクーメタンホスホン酸ないしＳ −ＭＢＴＨのＴＢＨＢとのカップリングが特に有利であると示される。本発明の １訣な部分は、殊に４−ＡＡＰとの組合せでＴＯＯ３のようなアニリンのカップ リング成分がＴＢＨＢのようなフェノールのカップリング成分よシ、驚異的に高 い程度ですぐれていることが認められることから成る。

本発明による反応試薬は溶解されたまたは転線した形で存在していてよい。これ は好適な支持体、たとえばシート上に、サルコシン予備反応帯域で含浸され℃含 有されていてよい。特に濾紙、セルロースまたは合成繊維フリースを必ｇ！な、 通常試験片の製造のために使用される反応試薬の耐液でアセトンのような易揮発 性溶剤中で含浸することによシ、試験片の形での診断剤が製造できる。これは１ つまたはいくつかの含浸工程で行う。完成した試歇紙はそれ自体として使用でき るか、自体公知の方法で把手に接着させるか、特にプラスチックおよび目のつん だ網状物の間に封止される。

本発明を仄の試販結果および実施例を用いて詳述する： １、医薬部分 ａ〕　参照値 最初に健康なヒトの血清および尿中のクレアチン含量を記載部分に挙げられた方 法で酵素的に確定した。

血清クレアチン値のために年令および性別により分類した、１３８人のヒトを動 員した。５日間のタンパク質規定食後全てのヒトで血液採取を行った。４６〜８ ５才の女性および男性にとつ℃、この際血清中の５．７〜１０．４ダ／ｌクレア チンの裏皮範囲が得られた（表１参照）。

尿中のクレアチン含量の確定は１．２η／２４ｈの平均値の標準偏差で２．７■ ／２４ｈの平均値を生じた。

ｂ）心筋梗塞患者での結果 明らかな心筋梗塞兆候を伴う２２人の患者で病気の経過を心を図および通常の血 液分析により追跡した。

血清中でこれらの患者では胸骨後の苦痛の開始の約３時間後３．２η／ｌの平均 値の標準偏差で、１２．５ダ／ｉの最高良度を測定した。尿中でこれとは反対に １００〜５００η／ｌで鋭いピークを測定した。尿ピークは血清ピークよりわず かに遅くのみ生じる。尿中での２４時間析Ｌ３にこの値を換算すると、４３の平 均値の標準偏差で９４ダ／ｌの平均値が生じる。第１のおよび第２図は尿および 血清中のＣＫ−ないしＣＫ　−ＭＢ　−酵素活性およびクレアチンの典製的挙動 を示す。

その他に比較のために骨格筋（ｎ＝３）ならびに健康なヒトの（ｎ　＝　３　） および心筋梗塞損傷心筋粗織（ｎ＝３）中のクレアチン−ないしクレアチンリン 酸含量およびＣＫ−活性を確定しおよびそのつど損ｇｈされた心筋組線中の比較 、パーセント物５１ｊ損矢を計算しこ＋′Ｌは６つの試験ちれた化合物にとって 平均約６０％である〔戒２参照〕。

表１＝血清中のクレアチン含量（参照値）年令および性別で異なる、１３８人の 健康なヒトの血清試料（ｎＧ＠５．＝１３８）中で、クレアチン含量を＃累的に 確定した。

本含水量 表２：骨格筋および心筋中のクレアチン−およびクレアチンリン酸含量ならびに クレアチンキナーゼ（ＣＫ）の活性および心筋梗塞後のそのつどの比較的損失。

■０分析部分 尿中のクレアチンの確定 例１ （呈色試薬：　４−　ＡＡＰ／ＴＯＯ８）ａ）試薬 ａｘ）　１００　ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液　声＝７．９０．１５ｍＭ　４− ＡＡＰ ｉ　Ｑ　ｍｓ　ＴＯＯ８ １０μＭ　カリウムへキサシアノフエラート■３　ＫＵ／ｌ　サルコシン−オキ シダーゼ３　ＫＴＪ／ｌ　ペルオキシダーゼ １０１Ｕ／ｌ　アスコルベート−オキシダーゼａｘ）１００ｍＮリン散カリン酸 カリウム緩衝液、９１００　ＫＵ／ｌクレアチナーゼ ｂ）試肢実施： 空気に対して測定 ７２３７℃　ｄ　＝　１　ｃｘ　λ＝　Ｈｇ　５７８　ｎｍ遠心分離機−小管中 で滴定： 計算二計算のために試料の代わりに１ｍｙ／ａＪでクレアチン−標準を使用。

例２ （呈色試薬：　Ｓ−ＭＢＴＨ／ＴＯＯ３）ａｌ）　１００　ｍＭ　リン酸カリク Ａｆｆｌ１５液　−＝７．９０．１５　ｍＭ　Ｓ−ＭＢＴＨ ２ｍＭ　ＴＯＯ８ １０μＭ　カリウムへキサシアノフエレートＩｔ３　ＫＵ／ｌ　サルコシン−オ キシダーゼ３１Ｕ／ｌ　ペルオキシダーゼ １０　ＫＵ／ｌ　７スコルベートーオキシダーゼａ２）　１００　ｍＭ　リン酸 カリクム緩ｏＩＪａＰ）′ｌ＝７．ｑ１００ＫＵ／ｊクレアテンキナーゼ ｂ）試験実施： 空気に対して測定 Ｔ＝６７°Ｃｄ＝１ｃｍ　λ＝　Ｈｇ　５７８　ｎｃａ遠心分離機−小管中で滴 定： 計算二計算のために試料の代わりにＩ　Ｗ／ｃｌｌでクレアチン−標準を使用。

例３ （呈色試薬：　Ｓ　−ＭＢＴＨ／　ＴＢＨＢ　）ａ）試薬： ａｘ）　１００　ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液　−；７．９０．１５　ｍＭ　Ｓ 　−ＭＢＴＨ ｌｏ　ｍＭ　ＴＢＨＢ １０μＭ　カリ２ムへキサシアノフエレートＩ３　ｘｖ７ｔ　サルコシン−オキ シダーゼ３　Ｋｖ７ｔ　ベルオキシダーゼ １０ＫＵ／７　７スコルベートーオキシダーゼａｘ）　１００　ｍＭ　リン酸カ リクム緩衝液　−＝７．９１００ＫＵ／ｊ　クレアチナーゼ ｂ）空気に対して測定 Ｔ；３７°Ｃｄ＝１ｃｍ　λ＝　’ｋ１ｇ　５４６　ｎｍ遠心分離機−小管中で 滴定： 計算二計算のために試料のかわりＩ’Ｃ１■／ｄＪでクレアチン−＊準を使用。

確定は２０１ｎ９／１００μ尿の濃度まで線状に経過する。

同様に血液、血清、血しよう、その限外ｉ！Ｉ過物またはａｍ抽出物中のクレア チンの確定を実施する。

第１図および第２図は兆朕の発生の６６時間後までの典微的な心筋梗塞患者の血 清中のＧＫないしＣＫ−ＭＢ−活性と比較して、尿ないし血清中のクレアチン確 定の結果を示す。

第１図 症候の発生後の時間 心筋梗塞患者のクレアチン濃度およびクレアチンキナーゼ活性の経過閤＝尿中の クレアチン濃度Ｃｍ９／Ｉ−）季＝血清中のクレアチン濃度（１’１９／Ｌ）・ ＝血清中のクレアチンキナーゼ−下部単位ＭＢの活性（Ｕ／Ｌ）ムエクレアチ／ キナーゼの活性（Ｕ／Ｌ）第２図 症候の発生後の時間 心筋梗塞患者のクレアチン濃度およびクレアチンキナーゼ活性の経過 厘＝血清中のクレアチン濃度（”！９／Ｌ）羊＝血清中のクレアチンキナーゼ− 下部単位Ｍｅの活性（Ｕ／Ｌ）・＝尿中のクレアチン濃度（ｍ９／Ｌ）ム＝血清 中のクレアチンキナーゼの活性（Ｌｌ／Ｌ　）国際調査報告 −−−−ＡＰ＃ｍＰＣＴ／ＥＰ　８７１００２２３ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　 ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥ：’ＯＲＴ　ＯＮ

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１種の低分子中間代謝物を体液の試料中で確定することを特徴と する、心臓疾患の検証の方法。
2. ２．心臓疾患が急性心筋梗塞、ミクロネクローゼ、急性および潜在性心筋症また は鈍い胸部外傷後の心臓挫傷の形である、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．低分子中間代謝物がクレアチン、物質代謝中に存在する子備−または最終生 成物またはクレアチンの天然または合成アーチフアクトである、請求の範囲第１ 項または第２項記載の方法。
4. ４．低分子中間代謝物がクレアチンリン酸またはサルコシンである、請求の範囲 第３項記載の方法。
5. ５．体液が尿、血液、血清、血しょう、唾液または組織抽出物である、請求の範 囲第１項から第４項までのいずれか１項記載の方法。
6. ６．低分子中間代謝物が心臓損傷の発生後１〜２４時間内に確定される、請求の 範囲第１項から第５項までのいずれか１項記載の方法。
7. ７．低分子中間代謝物が心臓損傷の発生後２〜８時間内に確定される、請求の範 囲第１項から第６項までのいずれか１項記載り方法。
8. ８．クレアチンを酵素的にサルコシン−オキシダーゼを用いて、水素−ドナーお よび呈色素として電子−またはラジカルー受容体ないしはロイコ染料を有する過 酸化水素の形成下に確定する、請求の範囲第３項記載の方法。
9. ９．水素−ドナーがアニリン誘導体である、請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．アニリン誘導体が次の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中ｎおよびｍは１〜３の数を表わし、ＸおよびＹは価標、１〜６のＣ−原子 を有するアリーレン−またはヒドロキシアリーレン基、Ｒ１およびＲ２は水素、 １〜６のＣ−原子を有するヒドロキシ−、アルキル−またはアルコキシ基、カル ボキシル−、スルホン酸−、アセトアミド−またはＰ（Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ′） −基であつてよく（その除Ｐはリン原子を表わしおよびＲは水素または１〜６の Ｃ−原子を有するアルキル基、Ｒ′は１〜６のＣ−原子を有するヒドロキシ−、 アリール−、アルキル−またはアルコキシ基であつてよい）、Ｒ３は水素、ハロ ゲン、カルボキシルーまたはスルホン酸基であつてよく、そり除ハロゲンはヨワ 素、臭素および有利に塩素およびフツ素を包含し、Ｒ４およびＲ７は水素、１〜 ６のＣ−原子を有する有利にメタ−位にあるアルコキシ−またはアルキル基、Ｒ ５およびＲ６は水素、１〜６のＣ−原子を有するアリール−またはアルキル基を 表わしおよびＲ５およびＲ７ないしはＲ６およびＲ４は双方の置換基がオルト位 に互いに存在する場合、一緒にヒドロキシ−またはオキソ基により置換されてい てよい、２〜６のＣ−原子を有する飽和または不飽和炭化水素鎖を表わす〕の化 合物ならびに酸および塩基とのその塩である、請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．アニリン−誘導体がＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ ピル）−ｍ−トルイジンまたは（Ｎ−メチルアニリノ）−メタンホスホン酸であ る、請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．電子−またはラジカル−受容体が４−アミノフエナゾン、３−メチル−２ −ベンゾチアゾーリノンヒドラゾンまたは３−メチル−２−ベンゾチアゾーリノ ンヒドラゾン−６−スルホン酸である、請求の範囲第８項から第１１項までのい ずれか１項記載の方法。
13. １３．クレチチン−検証系が酵素クレアチンアミジノヒドロラーゼおよびサルコ シンオキシダーゼを包含する、請求の範囲第８項から第１２項までのいずれか１ 項記載り方法。
14. １４．前接されるかあるいは平行に、しかしクレアチンアミジノヒドロラーゼの 存在なしに実施される反応により得られる付加的な測定値を利用する、請求の範 囲第１３項記載の方法。
15. １５．水素−ドナーおよび電子−またはラジカル−受容体を含有する、呈色系を 用いる体液中でのクレアチンの測定法において、水素−ドナーがアニリン誘導体 であることを特徴とする、体液中でのクレアチンの測定法。
16. １６．体液が尿、血液、血清、血しよう、唾液または組織抽出物である、請求の 範囲第１５項記載の方法。
17. １７．アニリン誘導体が、次の一般式：▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中ｎおよびｍは１〜３の数を表わし、ＸおよびＹは価標、１〜６のＣ−原子 を有するアリーレン−またはヒドロキシアリーレン基、Ｒ１およびＲ２は水素、 １〜６のＣ−原子を有するヒドロキシ−、アルキル−またはアルコキシ基、カル ボキシル−、スルホン酸−、アセトアミド−またはＰ（Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ′） −基であつてよく（その除Ｐはリン原子を表わしかよびＲは水素または１〜６Ｄ Ｃ−原子を有するアルキル基、Ｒ′は１〜６のＣ−原子を有するヒドロキシ−、 アリール−、アルキル−またはアルコキシ基であつてよい）、Ｒ３は水素、ハロ ゲン、カルボキシル−またはスルホン酸基であつてよく、その除ハロゲンはヨワ 素、臭素および有利に塩素およびフツ素を包含し、Ｒ４およびＲ７は水素、１〜 ６のＣ−原子を有する有利にメタ−位にあるアルコキシーまたはアルキル基、Ｒ ５およびＢ６は水素、１〜６のＣ−原子を有するアリール−またはアルキル基を 表わしおよび、Ｒ５およびＲ７ないしはＲ６およびＲ４は双方の置換基がオルト 位に互いに存在する場合、一緒にヒドロキシ−またはオキソ基により置換されて いてよい、２〜６のＣ−原子を有する飽和または不飽和炭化水素鎖を表わす〕の 化合物ならびに酸および塩基とのその塩である、請求の範囲第１６項記載の方法 。
18. １８．アニリン−誘導体がＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ ピル）ｍ−トルイジンまたは（Ｎ−メチルアニリノ）−メタンホスホン酸である 、請求の範囲第１７項記載の方法。
19. １９．電子−またはラジカル−受容体が４−アミノフエナゾン、３−メテル−２ −ベンゾチアゾ−リノンヒドラゾンまたは３−メチル−２−ベンゾチアゾ−リノ ンヒドラゾン−６−スルホン酸である、請求の範囲第１５項から第１８項までの いずれか１項記載の方法。
20. ２０．水素ドナーおよび電子−またはラジカル−受容体を有する呈色系を含有す る、体液中のクレアチンの確定のための試薬において、水素−ドナーがアニリン 誘導体であることを特徴とする、体液中のクレアチンの確定のための試薬。
21. ２１．体液が尿、血液、血清、血しよう、唾液または組織抽出物である、請求の 範囲第２０項記載の試薬。
22. ２２．アニリン誘導体が、一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中ｎおよびｍは１〜３の数を表わし、ＸおよびＹは価標、１〜６のＣ−原子 を有するアリーレン−またはヒドロキシアリーレン基、Ｒ１およびＲ２は水素、 １〜６のＣ−原子を有するヒドロキシ−、アルキル−またはアルコキシ基、カル ボキシル−、スルホン酸−、アセトアミド−またはＰ（Ｏ）（ＯＲ）（ＯＲ′） −基であつてよく（その除Ｐはリン原子を表わしおよびＲは水素または１〜６の Ｃ−原子を有するアルキル基、Ｒ′は１〜６のＣ−原子を有するヒドロキシ−、 アリール−、アルキル−またはアルコキシ基であつてよい）、Ｒ３は水素、ハロ ゲン、カルボキシル−またはスルホン酸基であつてよく、その際ハロゲンはヨワ 素、臭素および有利に塩素およびアツ素を包含し、Ｒ４およびＲ７は水素、１〜 ６のＣ−原子を有する有利にメタ−位にあるアルコキシ−またはアルキル基、Ｒ ５およびＲ６は水素、１〜６のＣ−原子を有するアリール−またはアルキル基を 表わしおよび、Ｒ５およびＲ７ないしはＲ６およびＲ４は双方の置換基がオルト 位に互いに存在する場合、一緒にヒドロキシ−またはオキソ基により置換されて いてよい、２〜６のＣ−原子を有する飽和または不飽和炭化水素鎖を表わす〕の 化合物ならびに酸および塩基を有する塩である、請求の範囲第２０項または第２ ２項記載の試薬。
23. ２３．アニリン−誘導体がＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ ピル）−ｍ−トルイジンまたは（Ｎ−メチルアニリノ）−メタンホスホン酸であ る、請求の範囲第２０項または第２２項記載の試薬。
24. ２４．電子−またはラジカル−受容体が４−アミノフエナゾン、３−メチル−２ −ベンゾチアゾ−リノンヒドラゾンまたは３−メチル−２−ベンゾチアゾ−リノ ンヒドラゾン−６−スルホン酸である、請求の範囲第２０項から第２３項までの いずれか１項記載の試薬。
25. ２５．クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシ ダーゼおよび水素−ドナーとしてＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル ホプロピル）−ｍ−トルイジンまたは（Ｎ−メチルアニリノ）メタンホスホン酸 および電子−またはラジカル−受容体として４−アミノフエナゾン、３−メチル −２−ベンゾチアゾ−リノンヒドラゾンまたは３−メチル−２−ベンゾチアゾ− リノンヒドラゾン−６−スルホン酸を含有する、請求の範囲第２０項から第２４ 項までのいずれか１項記載の試薬。
26. ２６．心臓手術の際および／または心臓治療のための症徴の際の経過制御のため にまたは心筋梗塞後のさらなる臨床的観察のための、請求の範囲第１項から第１ ９項までのいずれか１項記載の方法の使用。