JPS63502456A - 電気泳動分離法に対する緩衝溶液の供給方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 電気泳動分離法に対する緩衝溶液の供給方法本発明は電気泳動の分野に関し、よ シ詳細には緩衝剤リザーバとして緩衝剤含有ゲルを用いることによル、電気泳動 に用いられる装置に特殊な緩衝剤容器を用いる必要なしに電気泳動分離法へ緩衝 溶液を供給する方法に関するものである。

電気泳動分離は、しばしば例えばアガロースもしくはポリアクリルアミドゲルな どの安定化マトリックスで行なわれる。このマトリックスは、一般に例えばプラ スチック製円盤などの形態の支持体に載置され、次いでこのマトリックスの２つ の対向側部をそれぞれ１つの電極緩衝剤へ接続する。マトリックスを例えばガラ スもしくはプラスチックのカセット内に包封する場合は、これら２つの対向側部 にてカセットが開放されているた器に挿入することができ、マトリックスへの接 続は成る種の液体ブリッジ、例えば紙片或いは緩衝剤で浸漬させうる他の物質に よって確立される。

電気泳動分離をこの種の系で行なう場合、所定量の試料をゲルマトリック寝付着 させ、次いで電極間に電界を加えること験条件は、例えばゲルマトリックス、分 子寸法もしくは粒子寸法につき分離を生ぜしめる気孔寸法の選択に関し、或いは ｐＨの調節およびそれに応じた試料成分に対する帯電の調節に応じて著しく変化 する。これら全ての技術に共通する特徴は、ゲルマトリックス中の成分の移動が 電解媒体中で生ずることである。

用いる陽極緩衝剤および陰極緩衝剤に関し重要な要件は、これらが高い緩衝能力 を持たねばならないことでおる。すなわち、これらは反応が各電極で生ずるのに も拘わらず電気泳動過程で実質的に変化を受けてはならないことである。緩衝能 力を決定する最も重要な因子は、選択される緩衝剤成分の種類、その濃度および 緩衝溶液の容積である。

上述したように電気泳動は、それぞれ所望容積の各緩衝液を満たした特殊な緩衝 液槽からなる装置を用いて行なうのが慣例である。しかしながら、成る種の用途 の場合、例えばゲルマトリックスの縁部における毛細管力によって生ずる液流の 原因で高濃度の溶液を用いるのが困難な場合がある。低い電極緩衝液濃度を維持 することによシ、例えば前記種類の液流によって生じるような分離ゲルの電界に おける上記の欠点または短絡を回避することができる。低い電極緩衝液濃度は緩 衝剤容積を増加させて補いうるが、これは勿論電気泳動装置に充分大きい緩衝剤 容器を組入むことを必要とする。しかしながらこの種の場合には、分離マトリッ クスの外部における電圧低下が著しくなる。特に比較的小さいゲルマトリックス を用いて操作する系、例えば多かれ少かれ自動化した系においては、緩衝浴液の 取扱いは実用上の問題を伴う。従って、液体容積の取扱いを最大可能限度まで減 縮させうろことが望ましい。

米国特許第３７１５２９５号はこの問題を確認し、かつ緩衝剤をこの緩衝剤が「 半固体」の状態で得られるような物質で混合することを示唆している。好適具体 例によれば、加される。選択した「半固体」形態の種類とは無関係に、その適尚 な容積を電気泳動装置の支持基板の各端部における穴部に移す。その後、分陰ゲ ルをこの基板上に位置せしめて、分離ゲルと緩衝剤との間の直接的な液体接触を 確立させる。この場合、装置は上述したように緩衝液用の余分な容器を必要とす ることに注目すべきである。常法と異なる主たる相違点は、緩衝剤が溶液で構成 されないことでおる。注目すべき事実は、この方法が１９７３年という早期に特 許が公開されたという事実にも拘わらず、大して使用されていないことである。

スエーデン特許第７１０９１１０−２号（ミリボア・コーポレーション社）には 、ゲルマトリックス用の特殊設計の容器を備えｆｃｔ気泳動装置が記載されてい る。この容器は両端部にそれぞれ陰極および陽極のためのリザーバを形成する凹 部を備える。中央部は、使用すべき分離媒体の厚さに相当する深さを有する。使 用前に適当量の水含有のゲル形性溶液をこの容器中に注ぎ込み、遁・クゲル化さ せた後に薄い中央部を有する均質なゲル片、すなわち分離領域を形成する。分離 に必要とされる電解媒体がゲル形成の際に存在し、従ってゲル中に均質に分配さ れる。従って、電極緩衝剤リザーバを構成するこれらのゲル部分にはもつと高濃 度の電解質を得ることができない。２つの電極緩衝剤リザーバにおける異なる緩 衝溶液はこのようにしては供給することができず、特殊な分離緩衝剤を所望する 場合に同じ問題が生ずる。この技術では均質なゲルが形成されるだけであるため 、不均質ゲルを必要とする例えば濃度勾配ゲル電気泳動およびその他の技術のよ うな用途には容易に使用することができない。スエーデン特許第７１０９１１０ −２号公報に記載された装置の使用は、従って免疫電気泳動における数少ない特 殊技術に限定される。

今回は緩衝性物質を、マトリックスの各端部で分離マトリックスと接触している ゲル材料に混入し、次いで慣用の種類の電極を緩衝剤ゲルに接続すれば、ずっと 簡単な方法が得られることを突き止めた。この方法は水平電気泳動法において特 に有利である。何故ならこの新規な技術は、ゲル片の形態の緩衝剤リザーバを各 端部にて分離マ）　ＩＪラックス接触させ、或いは極めて薄いマトリックスの頂 部に簡単に載置しうるからである。次いで試料を分離ゲル上に付着させる。電界 を加えると、試料成分は２種の緩衝剤ゲルによシ画成された分離ゲル領域内で電 界中を移動する。同様にこれらの緩衝剤ゲルは、マトリックスの対向端部と接触 させることによシ、他の種類の電気泳動操作にも用いる本発明によシ提案される 技術に固有の利点の１つは、電気泳動装置が、液体もしくは半固体の電極緩衝剤 のための容器を備える必要がないことである。このようにして装置は単純化され 、さらに本発明を実施するのに用いる緩衝剤ゲルは、良好な機械強度の特性を有 するという事実によシ極めて取扱い容易となる。電極緩衝剤は「固体」ゲル中に 埋め込まれているので、毛細管力によって生ずる液体の移動が生じない。この理 由で、他の方法で可能であったよシもずっと電極緩衝剤の高い濃度を用いること が可能となシ、従って緩衝剤容積を少なく保つことができる。「固体」ゲル緩衝 剤の他の利点は、電極反応の生成物が得られる結果に悪形＃を及ぼすと思われる ような分離ゲルへの到達を防止することである。電極反応は電極表面の近くで緩 衝剤組成の変化をもたらし、これらの変化は電気泳動法の過程に従かい電極表面 から遠ざかるよう拡大される。第１図は電気泳動分離の際のこの現象を示してい る。

（１）はゲル板の形態の分離マトリックスである。電極緩衝剤を含有する２種の ゲル（２）および（３）を、分離マトリックスに対しその２つの対向端部にて接 触させるように置く。２つの電極（４）および（５）はそれぞれ緩衝剤ゲル（２ ）および（３）と直接接触する。電気泳動分離は、電界をこれら電極間に加えた 際に開始する。例えば、電極反応によって生ずるような電極緩衝剤の組成変化（ ）・ツチの領域）を第１（ａ）〜（Ｃ）図に示し、これらはそれぞれ電気泳動の 全時間の０，２５および１００％進行における状態を示している。

電極緩衝剤の安定化剤として使用すべきゲル材料は、少なくとも室温にて水不溶 性であυかつそれ自身の帯電が低い条件を満たさねばならないような、それ自体 公知の重合体の広範囲な群から選択される。これは、ゲルマトリックスがいわゆ る電気浸透ポンプの役割を果たすのを避けるのに必要な要件である。

適する材料の例は、勿論、電気泳動用途に特殊に開発されかつ前記条件を満たす ような種類のアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）であり、例えばアガロースＩＥＦ（ ファルマシア　ＡＢ社、ウプサラ、スエーデン国）である。緩衝剤含有水性ゲル よりなる組成物のアガロース濃度は、好適には１〜４重量％の範囲、好ましくは 約２チである。明らかに使用しうる他の材料は、約１０％濃度かつ２〜７−の架 橋度を有するポリアクリルアミドである。

ゲル材料に混入される緩衝剤は、一般に電気泳動分離法に用いられるような種類 のものである。この種の溶液の例は、例えばトリスヒドロキシメチル・アミノメ タン（ＴＲＩＳ）とグリシンと塩酸との混合物；アラニン；酢酸；および必要に 応じドテシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加した各種の燐酸ナトリウムである 。前記材料並びにその他の例の適する濃度は、ホリアクリルアミドゲル電気泳動 、ラボラトリ−・テクニーク（ファルマシアＡＢ社、　ウプサラ、スエーデン国 ）に示されている。各ゲル片に含まれる電極緩衝剤の量は、一般に８０〜９９重 量−の範囲である。

ゲル材料における緩衝剤成分の濃度の上限は水溶液におけるこれら成分の飽和限 界によυ決定され、さらに例えばゲルマリドックスの塩析のような成る種の場合 に生ずる望ましくない反応の危険性によって決められる。これは、緩衝塩の濃度 が高い場合のアガロースである。ゲル材料における緩衝剤成分の濃度に対する下 限値は方法論の検討によシ決定することができ、例えば緩衝剤の緩衝能力が不充 分となる段階を示すような緩衝剤におけるｐＨ測定によシ決定することができる 。通常の日常試験により、当業者はゲル材料および緩衝剤成分の各種組合せにつ き個々の場合にこれらの限界を見出すことができる。

緩衝剤含有ゲルを作成する場合は、緩衝剤溶液を組成物が容易に均質混合物を例 えば高温度で生成するような条件下にゲル材料と混合する。アガロースの場合、 約ｌＯＯ℃の温度が適している。或いは緩衝剤溶液と単量体とを混合し、これに よシ重合反応を開始させる。ポリアクリルアミドゲル（電気泳動に最も一般的に 使用されるゲルの１種）の場合、これはアクリルアミドとビスアクリルアミドの 単量体と４を緩衝溶液と混合し、次いで開始剤物簀を添加した後に混合物を重合 させて行なうことができる。他の周知の単量体を反応混合物に混合しうろことは 勿論である。

この新規な技術による極めて明白な利点は、分離マトリックスおよび分離緩衝剤 を所望の電極緩衝剤と組合せて使用し、これらを電極緩衝剤ゲルを介してゲルに 施こしうろことである。

電極緩衝剤溶液の取扱いは装置内にて回避され、かつ極めて少ない電極緩衝剤ゲ ルを用いることができる。何故なら、ゲル中の緩衝剤の高濃度が容易に得られる からである。従って緩衝剤能力は高くなシ、かつボルド一時間の消費が多い分離 を、電極緩衝剤における時間依存性の変化によシ殆んど影響を受けないような電 界にて行なうことができる。

以下に本発明を幾つかの実施例によシ説明するが、これらのみに限定されない。

実施例　１ 本来の濃度勾配ゲル電気泳動用の緩衝剤溶液を作成し、その際１５２のトリスヒ ドロキシメチル・アミノメタン（ＴＲＩ　Ｓ　）と６５ｆのアラニンとを５００ ｍｔの水に溶解させた。１０ｆのアガロースを添加し、かつこの緩衝液を攪拌し ながらアガロースが溶解するまで煮沸した。この溶液を４０Ｘ１０Ｘ６ＪＩｌｌ の型に満たし、かつ冷却させた。固化したゲル緩衝剤は、これらの寸法において 、約４０Ｘ４ＱＸＱ、３ｍの寸法を有し、かつ例えば０．０２６ＭのＴＲｌ５と ０．０３３Ｍの酢酸緩衝剤とを含有する分離ゲルに適用するのに適している。

実施例　２ ＳＤＳ濃度勾配ゲル電気泳動のだめの緩衝剤溶液を作成し、その際１２．１９の トリスヒドロキシメチル・アミノメタン（ＴＲＩＳ）と１７．９　ｔのトリシン と２．８２のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ　）とを５００−の水に溶解させ た。１０ｆの７ガロースを添加し、かつこの緩衝剤を攪拌しながらアガロースが 溶解するまで煮沸した。この溶液を４０Ｘ１０Ｘ６ｍの型に満たし、かつ冷却さ せた。このように冷却すると、ゲ／Ｉ／緩衝剤は上記したような寸法の分離ゲル に適用するのに適している。

国際調査報告

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．ゲル板の形態の支持マトリックスで行なわれる水平電気泳動分離法に緩衝剤 溶液を供給する方法において、２種の電極緩衝剤をそれぞれ１つのゲル片に混入 し、これらゲル片をゲル片間のマトリックスが使用可能な分離領域を提供するよ うに支持マトリックスと接触させて置くことを特徴とする水平電気泳動分離法に 対する緩衝剤溶液の供給方法。
2. ２．ゲル片がアガロースもしくはポリアクリルアミドよりなることを特徴とする 請求の範囲１に記載の方法。
3. ３．各ゲル片における電極緩衝剤の含有量が８０〜９９重量％の範囲内であるこ とを特徴とする請求の範囲２に記載の方法。