JPS63500376A - Human endogenous cancer regulators - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト内来性癌制御因子 本発明の分野 本発明は、新規な低分子ヒト内来性癌制御因子、その製造法およびそれらを含む 薬剤組成物に関する。[Detailed description of the invention] Human endogenous cancer regulators Field of the invention The present invention includes a novel small molecule human endogenous cancer regulator, a method for producing the same, and a method for producing the same. RELATED TO PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS.

本発明の背景 本発明者等は、先にヒト単球系細胞またはそのクローン株を組織培養培地で培養 し、新規な生物学的活性物質であるヒト内来性癌制御因子（Ｋｒｅｂｓ　５ｔａ ｔｉｋａ；　ＫＢＳ）を単離した。このＫＢＳには２つのタイプ、即ち相対分子 量が８２，０００±１０，０００．等電点がｐＨ６，５±０．５のものと、相対 分子量が５０，０００以上７２，０００未満の範囲、等電点がｐＨ６，０〜８． ５の範囲のものとがあった（特願昭５８−１２８８９３号及び５９−９９３７０ 号）。後者のタイプのにＢＳは等電点の違いにより更にＫＢＳ−α（約ｐｉ（６ ，５）　、　ＫＢＳ−β（約ｐＨ７，０）及びＫＢＳ−γ（約ｐＨ８，０）の３ 種類に分けられた。このＫＢＳは、ヒト細胞由来の生物活性物質の一群であり、 ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏに於て多種の腫瘍に対し強力な抗腫瘍活性 を有することから、癌の自然治癒等の際に極く微量患者生体内に産生される物質 の１つであると考えられる。Background of the invention The present inventors first cultured human monocytic cells or clones thereof in tissue culture medium. and human endogenous cancer regulator (Krebs 5ta), a novel biologically active substance. tika; KBS) was isolated. There are two types of KBS: relative molecules. The amount is 82,000±10,000. The isoelectric point of pH 6.5 ± 0.5 and the relative The molecular weight is in the range of 50,000 or more and less than 72,000, and the isoelectric point is pH 6.0 to 8. (Patent Application Nos. 58-128893 and 59-99370) issue). In the latter type, BS is further reduced to KBS-α (approximately pi (6 , 5), KBS-β (about pH 7.0) and KBS-γ (about pH 8.0) 3 divided into types. This KBS is a group of biologically active substances derived from human cells. Strong antitumor activity against various types of tumors in vitro and in vivo This substance is produced in extremely small amounts within the patient's body during natural healing of cancer, etc. It is considered to be one of the

本発明者等は、更に研究した結果、このＫＢＳを還元剤及び／又はタンパク質変 性剤で処理すると予想外に新規な生理活性物質が得られることを見い出した。Ｋ ＢＳ由来のこの新規な生理活性物質は抗腫瘍活性物質であり相対分子量が１７， ０００〜３０，０００の範囲内にあるものである。相対分子量が２０，０００〜 ３０，０００の範囲、特に２２，５００±１，５００の範囲のフラクションが最 も好ましい。本発明の抗腫瘍活性物資はＫＢＳに比べて低分子量であることから 、低分子ヒト内来性癌制御因子（ｎｉｅｄｅｒ　Ｋｒｅｂｓ　５ｔａｔｉｋａ： 　ｎ−ＫＢＳ）と命名した。As a result of further research, the present inventors discovered that this KBS can be used as a reducing agent and/or as a protein denaturant. We have unexpectedly discovered that treatment with sex agents yields novel physiologically active substances. K This novel physiologically active substance derived from BS is an antitumor active substance with a relative molecular weight of 17, 000 to 30,000. Relative molecular weight is 20,000~ The fraction in the range of 30,000, especially the range of 22,500 ± 1,500, is the most is also preferable. Since the antitumor active substance of the present invention has a lower molecular weight than KBS, , small molecule human endogenous cancer regulator (nieder Krebs 5tatika: It was named n-KBS).

本発明の開示 本発明の低分子ヒト内来性癌制御因子であるｎ−ＫＢＳは、にＢＳ（相対分子量 ５０，０００〜９２，０００、等電点ｐＨ６，０〜８．５）を還元剤及び／又は タンパク質変性剤で処理することにより製造される相対分子量が１７，０００〜 ３０，０００の範囲の抗腫瘍活性を有する新規なタンパク質である。それ故、本 発明のｎ−にＢＳは、ＫＢＳを還元剤及び／又はタンパク質変性剤で処理するこ とにより分離されたもので、ＫＢＳのタンパク質高次構造（ｈｉｇｈｅｒ−ｏｒ ｄｅｒ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆｐｒｏｔｅｉｎ）の少なくとも一部が破壊さ れたり、ジスルフィッド結合の少なくとも一部が切断されたＫＢＳを構成するサ ブユニットの一つであると考えられる。かかる本発明のｎ−ＫＢＳは、ＫＢＳと 同様にｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏに於て多種の腫瘍に対し強い抗腫瘍 活性を有し、その上ｉｎ　ｖｉｖｏで腫瘍憤死作用も示す。また、ＫＢＳと同様 ヒト細胞由来である本発明のｎ−ＫＢＳは、生体にとって異物とされず抗原抗体 反応を起こす可能性が、仮にあったとしても、著しく少ないものと考えられる。Disclosure of the invention n-KBS, which is a low-molecular human endogenous cancer regulator of the present invention, is BS (relative molecular weight 50,000-92,000, isoelectric point pH 6.0-8.5) as a reducing agent and/or The relative molecular weight produced by treatment with a protein denaturing agent is 17,000~ It is a novel protein with anti-tumor activity in the range of 30,000. Therefore, the book In the invention, BS is obtained by treating KBS with a reducing agent and/or a protein denaturing agent. The protein higher-order structure (higher-or at least a portion of the structure of protein) is destroyed. KBS with at least a portion of its disulfide bonds cleaved. It is considered to be one of the bus units. Such n-KBS of the present invention is different from KBS. Similarly, it has strong antitumor properties against various types of tumors in vitro and in vivo. It has activity and also exhibits tumor-killing effect in vivo. Also, similar to KBS The n-KBS of the present invention, which is derived from human cells, is not treated as a foreign substance by living organisms and is used as an antigen-antibody. The possibility of a reaction occurring, if any, is considered to be extremely low.

なお、本発明のｎ−ＫＢＳは、タンパク質再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　あるいはジスルフィッド結合の再形成により、もとのに ＢＳとすることも可能である。Note that the n-KBS of the present invention can be used for protein regeneration (renaturation). f protein) or by reforming disulfide bonds, the original It is also possible to use BS.

図面の簡単な説明 第１図はｎ−ＫＢＳの電気泳動後のＫＢＳ活性溶出パターンを示す（実施例１） 。図中縦軸は各ゲル切片から回収したＫＢＳ活性を、また横軸は各ゲル切片の分 取画分番号を示す。矢印は、標準蛋白質の泳動位置を示す。ＴＦはヒトトランス フェリン（分子量７６．０００）　ヲ、Ｈ５Ａハヒト血清アルフミン（分子量６ ７．０００）を、　ＯＶＡは卵白アルブミン（分子量４３，０００）を、　５Ｂ ＴＩはソイビーン　トリプシン　インヒビター（Ｓｏｙｂｅａｎ　ｔｒｙｐｓｉ ｎ　１ｎｈｉｂｉｊｏｒ　、分子量２１．５００）を、そしてＨＧはヘモグロビ ン（分子量１５，５００）をそれぞれ示す。Brief description of the drawing Figure 1 shows the KBS activity elution pattern after electrophoresis of n-KBS (Example 1) . In the figure, the vertical axis represents the KBS activity recovered from each gel section, and the horizontal axis represents the KBS activity recovered from each gel section. Indicates fraction number. Arrows indicate the migration positions of standard proteins. TF is human trans Ferrin (molecular weight 76.000), H5A human serum albumin (molecular weight 6 7.000), OVA is ovalbumin (molecular weight 43,000), 5B TI is soybean trypsin inhibitor n1nhibijor, molecular weight 21.500), and HG is hemoglobin (molecular weight 15,500).

第２図は主断片ペプチド及びｎ−ＫＢＳの５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（２−メルカプト エタノール存在下の５０５−ＰＡＧＥ）　の電気泳動図を示す（実施例１）。Figure 2 shows 5DS-PAGE of main fragment peptide and n-KBS (2-mercapto 505-PAGE in the presence of ethanol) is shown (Example 1).

またはそのクローン株を組織培養系で培養し、相対分子量が５０，０００〜９２ ，０００の範囲で、等電点がｐＨ６，０〜８．５の範囲のにＢＳを生成させ、次 いでこのＫＢＳを還元剤及び／又はタンパク質変性剤で処理することによって製 造される。更に具体的には、ＫＢＳを産生ずるヒト由来の単球系細胞の正常細胞 若しくはその癌化細胞またはそれらのクローニング株を組織培養系で培養し、第 １刺激及び第２刺激を行フて相対分子量が５０，０００〜９２，０００で等電点 がｐＨ６，０〜８．５のにＢＳを生成させ、次いでこのＫＢＳを還元剤及び／又 はタンパク質変性剤で順次処理する。Or the cloned strain is cultured in a tissue culture system, and the relative molecular weight is 50,000 to 92. ,000 to generate BS with an isoelectric point in the pH range of 6.0 to 8.5, and then Then, the KBS is produced by treating this KBS with a reducing agent and/or a protein denaturing agent. will be built. More specifically, normal human-derived monocytic cells that produce KBS Or, the cancerous cells or their cloning strains are cultured in a tissue culture system, and the The isoelectric point is reached when the relative molecular weight is 50,000 to 92,000 after 1st stimulation and 2nd stimulation. BS is generated at pH 6.0 to 8.5, and then this KBS is treated with a reducing agent and/or are sequentially treated with protein denaturants.

本発明で使用するヒト由来の単球系細胞の正常細胞またはその増殖し得るもので あれば更によい。Normal human-derived monocytic cells used in the present invention or those that can proliferate. Even better if you have it.

特に好ましいものは単球マｙアージ系の癌化細胞であり例えばＨＬ−６０、ある いはモノサイトロイケミャ（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ　Ｌｅｕｋａｅｍｉａ）由来の末 梢血白血球の臨床分離確立株より　選択株化した単球系癌化細胞であるＹＫＢＳ −７−１５、ＹＫＢＳ−７−１６、ＹＫＢＳ−７−１７、更にこれらの細胞を選 択クローニング株化したクローン株が挙げられる。Particularly preferred are cancerous cells of the monocyte Myage system, such as HL-60. It is derived from Monocyte Leukaemia. YKBS, a monocytic cancerous cell selected from established clinical isolates of peripheral blood leukocytes -7-15, YKBS-7-16, YKBS-7-17, and further selected these cells. Examples include clone strains that have been selectively cloned.

クローン株としては、例えばＹＫＢＳ−７−１５のクローン２Ａ２．２Ａ６．２ ０６．３Ａ１．３Ｂ３．３Ｂ４．３Ｃ１，３０５，４Ｂ３等が挙げられる。Examples of clone strains include YKBS-7-15 clone 2A2.2A6.2. 06.3A1.3B3.3B4.3C1, 305, 4B3 and the like.

以下にクローニングの典型的な例として、既に分離確立したＹＫＢＳ−７−１５ （特願昭５８−２３９３５５号）からの所望のクローン株のクローニング方法を 示す。As a typical example of cloning, YKBS-7-15, which has already been isolated, is shown below. (Japanese Patent Application No. 58-239355) show.

希釈法により１−２個細胞／ウェルの濃度になるように、予め１ｘ１０６個のマ ウス胸腺細胞をフィーダー細胞として播いた９６穴マイクロプレートに入れ、３ ７℃、５！に−ＣＯ２，９５！！−ａｉｒ下で培養を重ね、コロニーが見えるよ うになったとき、順次２４六マイクロプレートに移して培養増殖した。次いでＫ ＢＳ産生能の高い細胞クローンを選択した。ついで、順次スケールアップしなが ら同様の操作を重ねてにＢＳ産生能の最も高いクローン株として２Ａ２．２Ａ６ ．２Ｃ６，３Ａｌ、３Ｂ３．３Ｂ４．３Ｃ１，３０５及び４Ｂ３等を得た。Prepare 1x106 cells in advance using the dilution method to obtain a concentration of 1-2 cells/well. Place mouse thymocytes in a 96-well microplate seeded as feeder cells and incubate for 3 7℃, 5! -CO2,95! ! - After repeated cultivation under air, colonies can be seen. When the cells reached a certain stage, they were successively transferred to 246 microplates and cultured. Then K Cell clones with high BS production ability were selected. Then, we will gradually scale up After repeated similar operations, 2A2.2A6 was selected as the clone strain with the highest BS production ability. ．． 2C6,3Al, 3B3.3B4.3C1,305 and 4B3 etc. were obtained.

上述の確立細胞株”／ＫＢＳ−７−１５、ＹＫＢＳ−７−１６、’ｆｆＢｓ−７ −１７は、東京大学医科学研究所と本発明者等がヒトモノサイトロイケミア（） ｌｕｍａｎ　ｍｏｎｏｃｙｔｅ　ｌｅｕｋａｅｍｉａ）である急性単球性白血病 患者の末梢血軟層白血球より、常法により（塩化アンモニウム処理して混入赤血 球除去する処置を含む）培養株化した単球系の癌化細胞であって、ＹＫＢＳ−７ −１５はパスツール研究所のＣ，Ｎ、（：、Ｍ、に、１９８４年２月２９日にｌ −２５８として寄託されている。また、上述のＹＫＢＳ−７−１５から選択クロ ーニング株化したクローン株ＹＫＢＳ−４８３もＣ，Ｎ、ＣＪ、に、１９８４年 ７月２５日にｌ−３１９として寄託されている。The above-mentioned established cell lines '/KBS-7-15, YKBS-7-16, 'ffBs-7 -17 was developed by the Institute of Medical Science, the University of Tokyo and the present inventors to develop human monocytoleukemia (). Acute monocytic leukemia (Luman monocyte leukaemia) Contaminated red blood cells were collected from the patient's peripheral blood soft layer leukocytes using a conventional method (ammonium chloride treatment and contaminated red blood cells). YKBS-7 is a monocytic cancerous cell that has been cultured (including treatment to remove cells), and -15 to C.N. (:,M.) of the Pasteur Institute, February 29, 1984 -258. In addition, select clock from YKBS-7-15 mentioned above. The clone strain YKBS-483, which was developed as a growing stock, was also distributed to C, N, and CJ in 1984. It was deposited as l-319 on July 25th.

その他、単球マクロファージ系の癌化細胞としては、Ｍｏｎｏ−１及びＭｏｎｏ −１−２０７（Ｖｉｒｃｈｏｗ　Ａｒｃｈ、　Ａ、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ａｎａｔ −Ｈｉｓｔｏｌ、　３７１．１５（１９７６）及び史、２６９　（１９７Ｂ）） が挙げられる。Other monocyte-macrophage cancerous cells include Mono-1 and Mono -1-207 (Virchow Arch, A, Pathol, Anat -Histol, 371.15 (1976) and History, 269 (197B)) can be mentioned.

更に、これら単球系細胞には単球細胞になり得る細胞も本発明で使用することが できる。そのような細胞は最終的に単球系白血病像を示すようになる細胞であり 、例えば骨髄性悪性細胞が挙げられる。Furthermore, among these monocytic cells, cells that can become monocytic cells can also be used in the present invention. can. Such cells are the ones that eventually show signs of monocytic leukemia. , for example, myeloid malignant cells.

これらの細胞は、通常は牛脂児血清を含有する人工栄養培地中で組織培養される 。例えば、実施例１で用いた、ＹＫＢＳ−７−１５のクローン株ＹＫＢＳ−４８ ３は、１０％；ｌ’（：Ｓ　（Ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ、牛脂児血清 ）　、１５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（和光純薬）、５０ｍｇ／ｊＺカナマイシン及び ２５ｍｇ／　ｆ）、ストレプトマイシンを含有する人工栄養培地であるＰＭＩ− １６４０培地（ＧＩＢ（：Ｏ社製）において良好に増殖する。ここに用いたカナ マイシン及びストレプトマイシンの代わりに、他の抗性物質ペニシリン、ゲンタ マイシン、シソミシン等を使用することもできる。また、該細胞は血清を含まな い無血清人工栄養培地、例えばＨＢＩＯＩ”　（Ｈａｎａ　Ｂｊｏｌｏｇｉｃｓ 　Ｉｎｃ、）またはＴＳＣＯＶＥ’Ｓ培地（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）に於ても組織培養することが可能であり、更に人以外の温血動物、例えばヌー ドマウスや幼若ハムスターの腹腔内、皮下に於ても充分増殖が可能である。本発 明で使用される組織培養系にはかかる　ｉｎ　ｖｉｖｏの増殖培地も含まれる。These cells are tissue cultured in artificial nutrient medium, usually containing tallow serum. . For example, the clone strain YKBS-48 of YKBS-7-15 used in Example 1 3 is 10%;l'(:S (Fetal calf serum, beef fat serum ), 15mM HEPES (Wako Pure Chemical Industries), 50mg/jZ kanamycin and PMI-, an artificial nutrient medium containing 25 mg/f) and streptomycin. Grows well in 1640 medium (GIB (manufactured by:O). Instead of mycin and streptomycin, use other antibiotics such as penicillin and gentamicin. Mycin, sisomicin, etc. can also be used. In addition, the cells do not contain serum. Serum-free artificial nutrient medium, such as HBIOI” (Hana Bjologics Inc.) or TSCOVE'S medium (Flow Laboratories) ), it is also possible to culture tissues in warm-blooded animals other than humans, such as wild animals. It is possible to proliferate sufficiently in the abdominal cavity or subcutaneously of mice and young hamsters. Main departure Tissue culture systems used in the present invention also include such in vivo growth media.

本発明で使用する第１刺激物質としては、リンパ球系あるいはリンパ芽球系の条 件培養液（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）、　白血球を分化誘導する 化学物質あるいは自然抽出物やそれ等の組み合せが用いられる。更にある種の化 学物質例えばトリコテラセンマイコトキシンを投与した哨乳動物の免疫担当細胞 の培養上清も同様に第１刺激物質として用いられる。白血球を分化誘導する化学 物質あるいは自然抽出物としては、例えばフィトヘマグルニチン（ＰＨＡ）が挙 げられるがムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、１２−〇−テトラデカノイルフォル ボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）、１２．１３−フォルホールブチレートキ シド ファージ活性化物質が更に好ましい。The first stimulating substance used in the present invention includes lymphocyte or lymphoblastoid cells. Conditioned medium, induces differentiation of leukocytes Chemical substances or natural extracts or combinations thereof may be used. Furthermore, some kind of transformation Immunocompetent cells of mammals administered with chemical substances such as trichoteracene mycotoxin The culture supernatant of is also used as the first stimulant. Chemistry that induces leukocyte differentiation Examples of substances or natural extracts include phytohemaglunitin (PHA). Muramyl dipeptide (MDP), 12-0-tetradecanoylform Bole-13-acetate (TPA), 12.13-forphor butyrate Sid More preferred are phage activators.

更に、網内系賦活化作用を有する物質も本発明における第１刺激物質として使用 することができる。網内系賦活化作用を有する物質としては通常ダラム陽性菌、 カビ産生物質、原生動物または酵母が用いられ、生菌状態、死菌状態（例えば熱 処理やホルマリン処理後）または菌体抽出成分として用いられる。ダラム陽性菌 としては例えばＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｎｅｓ　（Ｃｏｒｙ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｉｕｍ 　ｇｒａｎｕｌｏｃｕｍ　（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｒａｎｕｌｏ ｃｕ＋＋＋）のようなＰｒｏｐｉｏｒ＋ｉ　ｂａｃｔｅｒｉａ，　Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　にａ１ｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ　（Ｂ．Ｃ．Ｇ．）、Ｍｙｃｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ　ｓｅｇｏ＋ｅｎｔｉｓのようなＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，および Ｎｏｃａｒｄｉａｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ，　Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｇａｒｄｎ ｅｒｉのようなＮｏｃａｒｄｉａが挙げられる。カビ産生物質としてはＦｕｓａ ｒｉｕｍ系の産出する毒素が挙げられる。原生動物としては、例えば、マラリア 原虫、トキソプラズマが挙げられる。酵母の場合は、通常、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどから抽出した２ｙｍｏｓａｎが用いられる 。また、ビランコーポリマーのような合成高分子を用いることもできる。Furthermore, a substance having a reticuloendothelial system activation effect can also be used as the first stimulating substance in the present invention. can do. Substances that activate the reticuloendothelial system are usually Durum-positive bacteria, Mold-producing substances, protozoa or yeast are used, and they are treated in a viable or dead state (e.g. heat treatment). (after formalin treatment) or as a bacterial cell extract component. Durham positive bacteria For example, Propionibacterium acnes (Cory nebacterium parvum), Propionibacteium granulocum (Corynebacterium granulo Propior+i bacteria, Bacillus like cu+++) us a1mette-Guerin (B.C.G.), Mycobact Mycobacteria such as erium sego+entis, and Nocardia erythropolis, Nocardia gardn Examples include Nocardia such as eri. Fusa as a mold-producing substance Examples include toxins produced by the Rium family. Examples of protozoa include malaria Examples include protozoa and Toxoplasma gondii. For yeast, usually Saccharom 2ymosan extracted from yces cerevisiae etc. is used. . Furthermore, synthetic polymers such as bilan copolymers can also be used.

本発明で使用する第２刺激物質とはグラム陰性菌またはダラム陽性菌より得られ たエンドトキシンを意味する。かかるエンドトキシンとしては、例えば大腸菌、 緑膿菌、チフス菌由来のりポボリサッカライドが挙げられる。この他、ダラム陽 性菌のりボボリサッカライドも良好な成果で用いることができる。The second stimulating substance used in the present invention is obtained from Gram-negative bacteria or Durham-positive bacteria. meaning endotoxin. Such endotoxins include, for example, E. coli, Examples include glue povosaccharides derived from Pseudomonas aeruginosa and Salmonella typhi. In addition, Duram Yang Bacterial paste Boboli saccharide can also be used with good success.

ＫＢＳは、ヒト由来の単球系細胞の正常細胞またはその癌化細胞を人工栄養培地 、血清及び他の栄養素を含む通常の組織培養培地で培養し、その培養前、培養中 あるいは培養後に第１刺激物質を作用させ、次いで第２刺激物質を作用させるこ とによって誘導生成することができるのである。このように該細胞からＫＢＳを 誘導生成させるには、通常は２回の刺激によフて行われるが、いずれか一方のみ でもあるいはまったく刺激しなくとも生成するものと考えられる。しかし乍ら、 最も普通には該細胞を通常の組織培養系で充分培養した後、その培養系に第１刺 激物質（例えばＴＰＡの場合は０、１〜１００ｎｇ／ｍｊＺ）を加えて第１刺激 を行い、更に培養例えば１２時間〜３日培養後に第２刺激物質（例えば大腸菌由 来のりボポリサッカライドの場合は０．１〜１０μｇ／ｍＩＬ）を加えて第２刺 激を行い更に培養例えば８〜２４時間培養すると培養上滑中ににＢＳが誘導生成 される。KBS is a method of growing normal human monocytic cells or their cancerous cells in an artificial nutrient medium. , cultured in normal tissue culture medium containing serum and other nutrients, before and during culture. Alternatively, after culturing, the first stimulating substance can be applied, and then the second stimulating substance can be applied. It can be induced and generated by In this way, KBS is extracted from the cells. Induced generation is usually achieved by two stimulations, but only one of them However, it is thought that it can be generated even without stimulation at all. However, Most commonly, the cells are sufficiently cultured in a conventional tissue culture system, and then the culture system is injected with the first inoculation. First stimulation by adding a harsh substance (for example, 0, 1 to 100 ng/mjZ for TPA) After further culturing for 12 hours to 3 days, a second irritant substance (e.g. derived from E. coli) is added. In the case of Kinori bopolisaccharide, add 0.1 to 10 μg/ml) to the second injection. When cultured for 8 to 24 hours, BS is induced to form in the culture medium. be done.

このようにして誘導生成したＫＢＳは、一旦採取しもしくは採取せずに還元剤及 び／又はタンパク質変性剤で処理することによって、本発明のｎ−ＫＢＳが製造 される。にＢＳを採取する場合は公知の精製、分離法、例えば透析、塩析、限外 濾過、遠心分離、濃縮、凍結乾燥などを使用することによって行われる。更に高 度の特製を必要とする場合には、例えばイオン交換体への吸着、次いで溶出、ゲ ル濾過およびコンカナバリンＡセファローズあるいは適当な抗体などを用いたア フィニティークロマトグラフィー、等電点分画、高速液体クロマトグラフィー、 蛋白用高速液体クロマトグラフィーなどを用いたクロマトフオーカシング法及び イオン交換法（例えばＦＰＬＣＭｏｎｏ−Ｐ，　Ｍｏｎｏ−Ｑカラム、７フルマ シア社製）、又はポリアクリルアミドゲルを用いたスラブ若しくは調整用電気泳 動などの方法を組合わせることができる。通常は、ＫＢＳを含有する培養上清を 遠心分離等により培地から採取し、該上滑を陰イオン交換体を用いて精製した後 、他の方法を適宜組合わせて精製する。The KBS induced and produced in this way can be collected or not treated with a reducing agent. The n-KBS of the present invention can be produced by treatment with a protein denaturant and/or a protein denaturant. be done. When collecting BS, known purification and separation methods such as dialysis, salting out, ultraviolet This is done by using filtration, centrifugation, concentration, lyophilization, etc. Even higher For example, adsorption to an ion exchanger, followed by elution, gelation, etc. is required. filtration and filtration using Concanavalin A Sepharose or an appropriate antibody. affinity chromatography, isoelectric point fractionation, high performance liquid chromatography, Chromatofocusing method using high-performance liquid chromatography for proteins and Ion exchange method (e.g. FPLC Mono-P, Mono-Q column, 7 fluma column) (manufactured by Shea), or slab or preparation electrophoresis using polyacrylamide gel. It is possible to combine methods such as motion. Usually, culture supernatant containing KBS is used. After collecting from the culture medium by centrifugation etc. and purifying the supernatant using an anion exchanger, , and other methods in combination as appropriate.

陰イオン交換体としては例えばＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０、ＤＥＡＥ− セファロースＣＬ−６８，　ＤＥＡＥセファセル、ＱＡＥ−セファデックスＡ− ５０　（以上ファルマシア社製）、ＡＩＥＣＤＥ　５２　（ワットマン社製）、 Ｓｅｒｖａｃｅｌ　ＡＥ　（セルバ社製）、　Ｃｅｌｌｅｘ　ＱＡＥ　（バイオ ランド社製）が挙げられる。Examples of anion exchangers include DEAE-Sephadex A-50, DEAE- Sepharose CL-68, DEAE Sephacel, QAE-Sephadex A- 50 (manufactured by Pharmacia), AIECDE 52 (manufactured by Whatman), Servacel AE (manufactured by Serva), Cellex QAE (Bio (manufactured by RAND Corporation).

次に、このように誘導生成したＫＢＳを還元剤及び／又はタンパク質変性剤で処 理して本発明ｎ−ＫＢＳを製造する。これらの処理手段は、当該分野で通常採用 されている手段が採用される。Next, the KBS induced and produced in this way is treated with a reducing agent and/or a protein denaturing agent. The n-KBS of the present invention is produced by the following steps. These processing means are commonly employed in the field. The methods that have been adopted will be adopted.

具体的には、還元剤としては２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、 ジチオエリスリトール、チオグリコール酸、モノチオリン酸、システィン、Ｎ− アセチルシスティン、還元型グルタチオン等のチオール系化合物ニトリ−〇ーブ チルホスフィン、トリスジエチルアミノエチルホスフィン等の第３級ホスフィン ：亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩等のばか水素化ホウ素ナトリウム等が挙げられ る。タンパク質変性剤としては、尿素、塩酸グアニジン、硫酸グアニジン、界面 活性剤等が挙げられる。界面活性剤は陰イオン性、陽イオン性及び両性のイオン 性界面活性剤だけでなく、非イオン性界面活性剤が挙げられる。具体的な界面活 性剤としては例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　、ソルビタン脂肪酸 エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエー テル、ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム、ジー２−エチルへキシルス ルホコハク酸ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウムプロミド、デオキシ リゾレシチン等が挙げられる。Specifically, the reducing agents include 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, Dithioerythritol, thioglycolic acid, monothiophosphoric acid, cysteine, N- Thiol-based compounds such as acetylcysteine and reduced glutathione, nitribe Tertiary phosphine such as tylphosphine and tris-diethylaminoethylphosphine : Sulfites such as sodium sulfite, sodium borohydride, etc. Ru. Protein denaturants include urea, guanidine hydrochloride, guanidine sulfate, and Examples include activators and the like. Surfactants are anionic, cationic and amphoteric ions. Examples include not only natural surfactants but also nonionic surfactants. Specific surface activity Examples of sex agents include sodium dodecyl sulfate (SDS) and sorbitan fatty acids. ester, glycerin fatty acid ester, polyoxyethylene nonylphenyl ether ter, sodium polyoxyethylene alkyl sulfate, di-2-ethylhexyl Sodium sulfosuccinate, dodecyltrimethylammonium bromide, deoxy Examples include lysolecithin.

処理は穏和な条件下に行われる。例えばＫＢＳを水又は適当な緩衝液に溶解した もの、あるいはＫＢＳを含有する画分に還元剤及び／又はタンパク質変性剤を添 加することによって行われる。Processing is carried out under mild conditions. For example, KBS was dissolved in water or a suitable buffer. Add a reducing agent and/or protein denaturant to the protein or the fraction containing KBS. This is done by adding

処理の条件例えば、還元剤及び／又はタンパク質変性剤の濃度、処理温度（通常 は室温）、処理時間、処理ｐ）Ｉ等は、用いるＫＢＳの濃度等により適宜選択さ れる。また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を、還元剤及び／又 はタンパク質変性剤の存在下に行うことによってにＢＳからｎ−ＫＢＳを製造す ることができる。更に、還元剤及び／又はタンパク質変性剤の共存下にデキスト ラン、ポリアクリルアミド、アガロースなどのゲル粒子（例えばセファデックス Ｇ−５０、Ｇ−７５、セファクリルＳ−２００、バイオゲル製造することができ る。Processing conditions such as concentration of reducing agent and/or protein denaturant, processing temperature (usually (room temperature), treatment time, treatment p)I, etc. are selected as appropriate depending on the concentration of KBS used, etc. It will be done. In addition, polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) can be performed using reducing agents and/or produces n-KBS from BS by performing it in the presence of a protein denaturant. can be done. Furthermore, dextrose in the presence of a reducing agent and/or a protein denaturing agent. Gel particles such as Ran, polyacrylamide, agarose (e.g. Sephadex) G-50, G-75, Sephacryl S-200, biogel can be produced Ru.

このようにして製造し、回収し、精製した本発明のｎ−にＢＳは次の特性を有す る： （１）　分子量 ２−メルカプトエタノール及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）の存在下でデ ィスクポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により測定すると、ｎ−Ｋ ＢＳ　（１）相対分子量は１７，０００〜３０，０００テある。The n-BS of the present invention produced, recovered, and purified in this manner has the following properties. Ru: (1) Molecular weight Decomposition in the presence of 2-mercaptoethanol and sodium dodecyl sulfate (SO5) n-K as determined by disk polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). BS (1) Relative molecular weight is 17,000 to 30,000.

（２）主断片ペプチド ｎ−ＫＢＳの臭化シアン分解による主断片ペプチドの相対分子量は約１８，５０ ０でる。(2) Main fragment peptide The relative molecular weight of the main fragment peptide obtained by cyanogen bromide decomposition of n-KBS is approximately 18,50. It's 0.

（３）部分アミノ酸配列 ｎ−ＫＢＳは以下の部分アミノ酸配列を有する。(3) Partial amino acid sequence n-KBS has the following partial amino acid sequence.

ＧＩｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ＡＩａ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｘ　１− Ｐｒｏ−ＡＩａ−Ｘｚ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ （式中Ｘ、と×２とは各々１個のアミノ酸残基を示す。）（４）　アミノ酸組成 ｎ−ＫＢＳはＣｙｓ及びＴｒｐに加え以下のアミノ酸を含有する：Ｌま１酸　金 １３〕ソに莢Ｌ Ａｓｐ／Ａｓｎ　９．９ Ｇｌｕ／Ｇｌｎ　Ｉｌ、３ （上記アミノ酸含量は、Ｃｙｓ及びＴｒｐを除く全アミノ酸残基に対する各アミ ノ酸残基数の割合をモル％で表わしたものである。変動係数は通常±１５％であ るが、この範囲をこえる場合もある。） （５）高速液体クロマトグラフィーでの保持時間ＴＳＫゲルＧ２０００　ＳＷカ ラム（７−５ｎ＋ｍ　ＴＤＸ６０ｃｍ）を用い、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐ Ｈ６，０）　／　５．５Ｍ塩酸グアニジンを溶出液とし、流速０．５ｍ４７ｍ１ ｎ室温で溶出させるとき、ｎ−ＫＢＳは２８分の位置に一本のピークとして認め られた。GIn-His-Leu-AIa-Lys-5er-Asn-Leu-X 1- Pro-AIa-Xz-11e-Pro-Tyr (In the formula, X and ×2 each represent one amino acid residue.) (4) Amino acid composition In addition to Cys and Trp, n-KBS contains the following amino acids: 13] Soni pod L Asp/Asn　9.9 Glu/Gln Il, 3 (The above amino acid content is for each amino acid residue for all amino acid residues except Cys and Trp. The ratio of the number of amino acid residues is expressed in mol%. The coefficient of variation is usually ±15%. However, there are cases where this range is exceeded. ) (5) Retention time in high performance liquid chromatography TSK Gel G2000 SW Using ram (7-5n+m TDX60cm), 0.1M sodium phosphate (p H6,0) / 5.5M guanidine hydrochloride as eluent, flow rate 0.5m47ml When eluted at room temperature, n-KBS was observed as a single peak at the 28 minute position. It was done.

以下に本発明のｎ−にＢＳの抗腫瘍作用を示す。The antitumor effect of n-BS of the present invention is shown below.

３ａｌｂ／［、マウスで縫代維持したマウス由来Ｍｅｔｈｙｌｃｈｏｒａｎｔｈ ｒｅｎｅ　Ａ誘発肉腫（Ｍｅｔｈ　Ａ）の５Ｘ１０５個細胞をＢａ１ｂ／Ｃマウ ス（♀、７週令）背部皮肉に移植し、７日後に腫瘍径を測定した。次いで段階希 釈した実施例１で製造した分子量２２，５００のｎ−ＫＢＳを０．５ｎ＋Ｍ静脈 注射した。3alb/[, Mouse-derived Methylchoranth with seam allowance maintained in mice 5 x 105 cells of rene A-induced sarcoma (Meth A) were added to Ba1b/C mice. The tumor was transplanted to the back of a female (female, 7 weeks old), and the tumor diameter was measured 7 days later. Then stage rare 0.5n+M of n-KBS with a molecular weight of 22,500 prepared in Example 1 was administered intravenously. Injected.

投与９日後に腫瘍径を測定した結果、全試験群で完治が認められた。更に腫瘍の 退縮が認められた全マウス例で、その後も腫瘍の退縮化が進行し、完全な退縮、 即ち移植したＭｅｔｈ　Ａは完全に脱落し、完治した。これに反して、対照群で は１９日日目は移植した腫瘍の直径は１．５ｃ［１１以上に増大し、４０日０以 降にはほぼ金側が死亡した。As a result of measuring the tumor diameter 9 days after administration, complete recovery was observed in all test groups. Furthermore, tumor In all mouse cases in which regression was observed, tumor regression progressed and complete regression was observed. That is, the transplanted Meth A completely fell off, resulting in a complete recovery. In contrast, in the control group On the 19th day, the diameter of the transplanted tumor increased to more than 1.5c [11cm], and after 40 days By the end of the day, most of the gold side had died.

本実験から明らかな様に、本発明のｎ−ＫＢＳに強力な抗腫瘍作用が認められた 。As is clear from this experiment, the n-KBS of the present invention was found to have a strong antitumor effect. .

また、本発明のｎ−ＫＢＳは、ヌードマウスで継代維持したヒト由来胃癌細朧株 ＭＫＮ−４５を移植したヌードマウスの実験腫瘍系に於て原生等の方法［日本臨 床４０巻（８号）　１８６−１９３頁（１９８２年）］に従い腫瘍壊死効果を検 討すると、強い腫瘍壊死効果を示した。更に本発明のｎ−ＫＢＳは、Ｓａｒｃｏ ｍａ　１８０、Ｅｈｒｌｉｃｈ固定癌、Ｐ３８８固型癌、Ｌｅｗｉｓ　Ｌｕｎｇ 　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ等の腫瘍に対し強力な抗腫瘍作用を有していた。In addition, the n-KBS of the present invention is derived from human gastric cancer Hoboro strain maintained in nude mice. In the experimental tumor system of nude mice transplanted with MKN-45, the method of Gen et al. The effect of tumor necrosis was examined according to Vol. 40 (No. 8), pp. 186-193 (1982)]. When tested, it showed a strong tumor necrosis effect. Furthermore, the n-KBS of the present invention is Sarco ma 180, Ehrlich fixed tumor, P388 solid tumor, Lewis Lung It had a strong antitumor effect against tumors such as Carcinoma.

本発明の低分子ヒト内来性癌制御因子（ｎ−にＢＳ）の生物活性（にＢＳ活性） は、哨乳動物由来の正常または癌化細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏによる細胞障害試験 による評価によった。すなわち、Ｃａｒｓｗｅｌ　１氏らの方法プロシーデイン ダス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブサイエンシズ　オブ　ザ　ユナイ テッド　ステイッ　オブ　アメリカ［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ　］　７２巻　（Ｎｏ、９）　３６６６〜３６７０頁（１９７５年 ）に基づき行った。試験はヌンク社製（デンマークノの９６穴マイクロプレート を使用し、１０％の牛胎児血清、さらにカナマイシン５０μｇ／ｍＩｌ、ストレ プトマイシン２５μｇ／　ｍｆｆ１、ゲンタマイシンあるいはシソミシン５０単 位／ｒｎｆＬを含むイーグルの最少必須培地（ＭＥＭ培地）とＬ　ｃｅｌｌ　（ Ｓ）を用いて行った。２．５　Ｘ　１０’個のし細胞および同容量の希釈試料を ５％炭酸ガス含有空気中、３７℃で培養し、培養４８時間後、顕微鏡下で細胞に 対する致死変性効果を観察し、力価の表示はＬ　ｃｅｌｌの５０％を殺すために 必要な生物活性量を１単位（Ｕ）とし、試料の力価はその希釈度から算出した。Biological activity (BS activity) of the small molecule human endogenous cancer regulator (n-BS) of the present invention is an in vitro cytotoxicity test of normal or cancerous cells derived from mammalian animals. Based on the evaluation by. That is, the method procedure of Carswel et al. Das of the National Academy of Sciences of the Unity Ted Stay of America [Proc, Nat, Acad, Sc i, USA] Volume 72 (No. 9) Pages 3666-3670 (1975 ). The test was performed using a 96-well microplate made by Nunc (Denmark). 10% fetal bovine serum, kanamycin 50 μg/ml, and stress Ptomycin 25 μg/mff1, gentamicin or sisomicin 50 units Eagle's minimum essential medium (MEM medium) containing position/rnfL and L cell ( S) was used. 2.5 × 10’ cells and the same volume of diluted sample The cells were cultured at 37°C in air containing 5% carbon dioxide gas, and after 48 hours of culture, the cells were examined under a microscope. Observe the lethal degenerative effect on the cells, and display the titer to kill 50% of L cells. The required amount of biological activity was taken as 1 unit (U), and the titer of the sample was calculated from its dilution.

本発明によって得られた癌制御因子を医薬として使用するには、抗腫瘍効果を完 全に発現するのに都合のよい形で投与する。本発明の癌制御因子はそのままの状 態で投与することもできるが、製薬上の慣習に従って製薬的に許容し得る希釈剤 及び／又は他の薬理作用物質との混合物として組成された状態でも提供され得る 。従って本発明の癌制御因子は、経口的又は非経口的に投与するための形態を適 宜に採り得る。例えば散剤、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル、ビル、生薬、懸濁 剤、液剤、乳剤、注射剤、エアゾール剤である。In order to use the cancer control factor obtained by the present invention as a medicine, it is necessary to complete the antitumor effect. It is administered in a form convenient for complete expression. The cancer control factor of the present invention is in its original state. It may also be administered in a pharmaceutically acceptable diluent in accordance with pharmaceutical practice. and/or may also be provided in a composition as a mixture with other pharmacological agents. . Therefore, the cancer control factor of the present invention is suitable for oral or parenteral administration. You can take it as you see fit. For example, powders, granules, tablets, sugar-coated tablets, capsules, pills, crude drugs, suspensions formulations, liquid formulations, emulsion formulations, injection formulations, and aerosol formulations.

通常は本発明の癌制御因子を予め凍結乾燥し、使用に先立ち生理食塩水、滅菌水 、無菌の注射用等張渡等により溶解し、静脈、皮下または筋肉注射などにより患 者に投与される。この製剤化は、先の凍結乾燥に先立ち各種安定化剤例えばマン ニトール、ヒト血清アルブミンなどを添加し、溶解補助剤例えばグリシンを添加 することも可能である。Usually, the cancer control factor of the present invention is freeze-dried in advance, and it is washed with physiological saline or sterile water before use. , dissolved in a sterile isotonic solution for injection, etc., and injected intravenously, subcutaneously, or intramuscularly into the patient. administered to a person. This formulation is carried out using various stabilizers, such as manganese, prior to lyophilization. Add nitol, human serum albumin, etc., and add a solubilizing agent such as glycine. It is also possible to do so.

本発明の癌制御因子の投薬量は、患者の感受性差、年令、性別、体重、投与方法 、投与の時期、間隔、病状、体調、医薬製゛剤の性質、調剤の種類等種々の原因 によって変動する。従って下記に示す投薬量は目安であり最小値より少ない量で 十分な場合もあり、又ある場合には下記投薬量をこえて投与する必要の生ずるこ ともある。しかし乍ら、通常、成人の患者に対する投薬量は１日当り１万年位以 上である。The dosage of the cancer control factor of the present invention is determined based on patient sensitivity differences, age, sex, body weight, and administration method. , administration timing, interval, medical condition, physical condition, properties of the pharmaceutical agent, type of preparation, etc. It varies depending on. Therefore, the dosage shown below is a guideline and should be used in doses less than the minimum value. In some cases this may be sufficient, and in other cases it may be necessary to administer more than the following dosages. There is also. However, the dosage for adult patients is usually about 10,000 years or more per day. It is above.

以下に処方例および実施例を示し本発明をより具体的に述べるが、本発明はこれ らの例示に限定されるものではない。The present invention will be described in more detail by showing formulation examples and examples below. The invention is not limited to these examples.

処方例（注射剤） 本発明のｎ−ＫＢＳ１００万単位を１００ｍ　ｆｔの生理食塩水に溶解し、無菌 的に濾過し、濾液を減菌したバイアル１ｍｕずつ充填し、凍結乾燥する。Prescription example (injection) Dissolve 1 million units of n-KBS of the present invention in 100 m ft of physiological saline and aseptically The filtrate is filled into sterilized vials (1 MU each) and freeze-dried.

なお、本発明において、アミノ酸を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生 化学命名委員会（Ｃ：ＢＮ）による略号あるいは当該分野における慣用略号に基 づくものとする。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に明示 しなければＬ一体を示すものとする。In the present invention, when amino acids are indicated by abbreviations, IUPAC-IUB Based on the abbreviations given by the Board of Chemical Nomenclature (C:BN) or the abbreviations commonly used in the field. shall be kept. In addition, if there is a possibility of optical isomers for amino acids, please specify If not, it shall indicate L-integrated.

Ａｓｐ　アスパラギン酸 Ｇｌｕ　グルタミン酸 Ｇｌｎ　グルタミン ｃｉｙ　グリシン Ａｌａ　アラニン Ｍｅｔ　メチオニン Ａｓｐ／Ａｓｎ　アルバラギン酸およびアスパラギンＧｌｕ／Ｇｉｎ　グルタミ ン酸およびグルタミン実施例１ ａ）　ヒト白血病患者の末梢血軟層白血球由来の確立細胞株であ？）　ＹＫＢＳ −７−１５（単球系癌化細胞）ツクローン株ＹＫＢＳ−４８３を無血清培地ＨＢ ＩＯＩ”　（Ｈａｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ　Ｉｎｃ、）　（８１）中、３７℃ で充分な期間攪拌培養後、ＴＰＡを５Ｎｇ／ｍｕ添加して第１刺激を行い、培養 ３６時間後にエンドトキシン（大腸菌０１１１：　Ｂ　４由来のりボポリサッカ ライド）１μｇ／ｍｕを加えて第２刺激を行い、培養１６時間後遠心分離により 培養上清を採取した。Asp Aspartic acid Glu Glutamic acid Gln Glutamine ciy glycine Ala Alanine Met methionine Asp/Asn Albaragic acid and Asparagine Glu/Gin Glutami acid and glutamine Example 1 a) Is it an established cell line derived from peripheral blood soft layer leukocytes of human leukemia patients? ) YKBS -7-15 (monocytic cancerous cells) clonal strain YKBS-483 was grown in serum-free medium HB. IOI” (Hana Biologics Inc.) (81) at 37°C. After stirring culture for a sufficient period of time, 5 Ng/mu of TPA was added to perform the first stimulation, and the culture was After 36 hours, endotoxin (E. coli 0111: B4-derived Noribopolisacca) A second stimulation was performed by adding 1 μg/mu of Ride), and after 16 hours of culture, the cells were cultured by centrifugation. Culture supernatant was collected.

該上清をベリコン限外濾過濃縮装置で約２０倍に濃縮後、４℃で最終５０％濃度 （Ｖ／Ｖ）になるように飽和硫酸アンモニウム水溶液を徐々に添加した。次いで ４℃で充分沈殿を熟成せしめた後、遠心分離する。得られる沈殿を０．０４　Ｍ 塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）の少量で溶解 した後、０．０４Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で充分透析した。透析後、０ ．０４Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液であらかじめ平衡化したＤＥＡＥ−セフ ァデックスＡ−５０陰イオン交換樹脂を充填したブフナー濾過器に付し、０．０ ８Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液（ｐｌ＋　７．８）で溶出した。溶出画分を 更にペリコン限外瀘Ａ濃縮装置で濃縮し、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液 にて充分透析した後凍結乾燥した。次いで乾燥粉末を少量の０．０４Ｍ塩化ナト リウムを含む同緩衝液（ｐＨ７，８）に溶解し、ウルトロゲル　へＣへ４４カラ ムに付し、ゲルクロマトグラフィーを行い相対分子量が６０，０００±１０．０ ００の活性画分を得た。The supernatant was concentrated approximately 20 times using a Vericon ultrafiltration concentrator, and then brought to a final concentration of 50% at 4°C. (V/V) A saturated aqueous ammonium sulfate solution was gradually added. then After sufficiently ripening the precipitate at 4°C, it is centrifuged. The resulting precipitate was reduced to 0.04M Dissolve in a small amount of 20mM Tris-HCl buffer (pH 7, 8) containing sodium chloride. After that, it was thoroughly dialyzed against the same buffer containing 0.04M sodium chloride. After dialysis, 0 ．． DEAE-Seph was pre-equilibrated with the same buffer containing 0.4M sodium chloride. Passed through a Buchner filter filled with Addex A-50 anion exchange resin, and Elution was performed with the same buffer (pl+7.8) containing 8M sodium chloride. elution fraction Further, it was concentrated using a Pellicon ultrafiltration A concentrator to obtain a 50mM ammonium hydrogen carbonate aqueous solution. After thorough dialysis, it was freeze-dried. The dry powder was then mixed with a small amount of 0.04M sodium chloride. Dissolve it in the same buffer solution (pH 7, 8) containing 44 colors and transfer it to Ultrogel C. gel chromatography to obtain a relative molecular weight of 60,000±10.0. 00 active fractions were obtained.

当該工程の収率は約２５％であった。［この活性画分をタンパク用高速液体クロ マトグラフィーを用いたクトマトフォーカシング（ＦＰＬＣ，Ｍｏｎｏ　Ｐカラ ム、ファルマシア社製）に付し、直線的濃度勾配法により等電点分画すると、等 電点約６．５（ＫＢＳ−α）、約７．０（ＫＢＳ−β）及び約８．０　（ＫＢＳ −γ）の位置にそれぞれにＢＳ活性が認められた。］ ｂ）　次いで当該活性画分（相対分子量６０，０００±１０，０００）を透析脱 塩濃縮後、Ｌａｅｍｍｌｉの方法［ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、Ｕムロ８０ （１９７０）］により２２ｍＭ２−メルカプトエタノール及び０．１％ドデシル 硫酸ナトリウム　（ＳＤＳ）の存在下でディスクポリアクリルアミドゲル電気泳 動（ＰＡＧＥ）　［ゲル強度１２．５％ディスク８ｃｍ］に付した。電気泳動後 、ゲルを１ｍｍ間隔に切断し、各切片からタンパクを溶出させＫＢＳ活性を測定 した結果、相対分子量が２２，５００±１，５００に相当するフラクションでＫ ＢＳ活性が回復された。その結果を第１図に示す。かくして得られたｎ−ＫＢＳ の収率は約２５％であった。The yield of the process was about 25%. [This active fraction was subjected to high-performance liquid chromatography for proteins.] Chromatofocusing using chromatography (FPLC, Mono Pcolor) (manufactured by Pharmacia) and isoelectrically fractionated using the linear concentration gradient method. Electrical point approximately 6.5 (KBS-α), approximately 7.0 (KBS-β) and approximately 8.0 (KBS -γ) BS activity was observed at each position. ] b) Next, the active fraction (relative molecular weight 60,000 ± 10,000) was dialysis-desorbed. After salt concentration, Laemmli's method [Nature, Umlo 80] (1970)] with 22 mM 2-mercaptoethanol and 0.1% dodecyl. Disk polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium sulfate (SDS) PAGE [gel strength 12.5% disk 8 cm] was applied. After electrophoresis , cut the gel into 1 mm intervals, elute protein from each section, and measure KBS activity. As a result, the fraction with a relative molecular weight of 22,500±1,500 BS activity was restored. The results are shown in FIG. The n-KBS thus obtained The yield was about 25%.

該ｎ−ＫＢＳを用いて次の検討を行った。The following study was conducted using the n-KBS.

（１）　アミノ酸組成： 該ｎ　−Ｋ　Ｂ　Ｓ　０．５〜１．Ｏｔｔｇを６Ｎ−塩酸０．１　ｍｊＺに溶解 し、減圧封管中で１１０℃２４．４８．７２時間加水分解した。加水分解後減圧 下に塩酸を除去し、０．３０〜０．３５　ａ＋ＩＬの０．０２Ｎ−塩酸を加えた ものを分析用試料とした。アミノ酸分析は日立８３５型アミノ酸分析機（日立製 作断裂）を使用しオルトフタールアルデヒドを用いる螢光法で行フた。２回の実 験結果に基づくアミノ酸組成を下記第１表に示す。(1) Amino acid composition: The n-K B S 0.5 to 1. Dissolve Ottg in 6N-hydrochloric acid 0.1 mjZ The mixture was then hydrolyzed at 110° C. for 24,48,72 hours in a vacuum sealed tube. Decompression after hydrolysis Hydrochloric acid was removed from the bottom, and 0.02N-hydrochloric acid of 0.30 to 0.35 a+IL was added. This was used as a sample for analysis. Amino acid analysis was performed using a Hitachi 835 amino acid analyzer (manufactured by Hitachi). This was done using a fluorescence method using ortho-phthalaldehyde. Twice fruit The amino acid composition based on the experimental results is shown in Table 1 below.

Ａｓｐ／Ａｓｎ　９．９±１．１ Ｔｈｒ　５．６±０．３ Ｓｅｒ　８．３　±　１．３ Ｇｌｕ／Ｇｉｎ　１１．３　±　０．７Ｐｒｏ　７．３　±　０．６ ｃｉｙ　９．８　±　０．８ Ａｌａ　７．６　±　０．１ Ｖａ１　６．１　±　０．６ Ｍｅｔ　１．５　±　０．５ １ｉｅ　３．６　±　０．６ Ｌｅｕ　９．０　±　０．７ Ｔｙｒ　３．１　±　０．３ Ｐｈｅ　３．４　±　０．８ Ｈｉｓ　３．５　±　０．３ Ｌｙｓ　７．１　±　０．５ Ａｒｇ　３．１　±　０．１ （表中の含量はＣｙｓ及びＴｒｐを除く全アミノ酸残基数に対する各アミノ酸残 基数の割合をモル％で表わしたものである。変動係数は士で表示した。） （２）　部分アミノ酸配列： ■　臭化シアン分解及び断片ペプチドの単離該ｎ−ＫＢＳの臭化シアン分解反応 を行った。即ち、８８％ギ酸中で１部の該ｎ−ＫＢＳと１０部の臭化シアンとを 使用し室温で２４時間処理した。分解反応終了後、反応液を蒸留水で希釈し、真 空下に乾固した。この乾固した標品の一部をスラブＳＤＳ／ＰＡＧＥに付し銀染 色法により蛋白質バンドを確認した。その結果、分子量２２，５００に相当する バンドは消失し、分子量約１８，５００に相当する部分を主バンドとし、その他 若干のバンドが前者より薄く検出された。Asp/Asn　9.9±1.1 Thr　5.6±0.3 Ser　8.3　±　1.3 Glu/Gin 11.3 ± 0.7 Pro 7.3 ± 0.6 ciy 9.8 ± 0.8 Ala 7.6 ± 0.1 Va1 6.1 ± 0.6 Met　1.5　±　0.5 1ie 3.6 ± 0.6 Leu　9.0　±　0.7 Tyr　3.1　±　0.3 Phe 3.4 ± 0.8 His 3.5 ± 0.3 Lys 7.1 ± 0.5 Arg　3.1　±　0.1 (The content in the table is for each amino acid residue relative to the total number of amino acid residues excluding Cys and Trp. The ratio of the number of bases is expressed in mol%. The coefficient of variation is expressed in units of . ) (2) Partial amino acid sequence: ■Cyanogen bromide decomposition and isolation of fragment peptides Cyanogen bromide decomposition reaction of the n-KBS I did it. That is, 1 part of the n-KBS and 10 parts of cyanogen bromide in 88% formic acid. It was used and treated at room temperature for 24 hours. After the decomposition reaction is complete, dilute the reaction solution with distilled water and It was dried under air. A part of this dried sample was subjected to slab SDS/PAGE and silver stained. Protein bands were confirmed by color method. As a result, the molecular weight corresponds to 22,500 The band disappeared, and the part corresponding to the molecular weight of about 18,500 became the main band, and the other Some bands were detected lighter than the former.

次いで上記乾固した標品を２ｍＭの２−メルカプトエタノール及び０．１％　Ｓ Ｏ５の存在下でＰＡＧＥ　［ゲル強度１５％、ディスク１５ｃｍ］に付し、電気 泳動後、分子量約１８，５００に相当する主バンドを切り出した。切り出したゲ ルからタンパクを電気泳動溶出法により溶出させて主断片ペプチドを単離した。Next, the dried sample was mixed with 2mM 2-mercaptoethanol and 0.1% S. PAGE [gel strength 15%, disk 15 cm] in the presence of O5, After electrophoresis, the main band corresponding to a molecular weight of about 18,500 was cut out. The cut out game The protein was eluted from the sample by electrophoretic elution to isolate the main fragment peptide.

該主断片ペプチド及び該ｎ−ＫＢＳの５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（２−メルカプトエタ ノール存在下）の電気泳動図を第２図に示す。5DS-PAGE of the main fragment peptide and the n-KBS (2-mercaptoeta Fig. 2 shows an electropherogram of the sample (in the presence of alcohol).

なお、バイオラッド社製の標準分子量マーカーも図で示される。Note that standard molecular weight markers manufactured by Bio-Rad are also shown in the figure.

■　部分アミノ酸配列の決定 該主断片ペプチドのアミノ酸配列を、気相プロテインシークエネーター（アプラ イドバイオシステムズ社製４７０Ａ型）を用いる自動エドマン分解法を適用して 、分析した。■ Determination of partial amino acid sequence The amino acid sequence of the main fragment peptide was determined using a gas phase protein sequencer Applying the automatic Edman degradation method using the Ido Biosystems Model 470A) ,analyzed.

その結果次の１５個のアミノ酸が以下の通り配列していることが確認された。As a result, it was confirmed that the following 15 amino acids were arranged as shown below.

Ｈ−Ｇｉｎ　−Ｈｉｓ　−Ｌｅｕ　−Ａｌａ　−Ｌｙｓ　−Ｓｅｒ　−Ａｓｎ　 −Ｌｅｕ−Ｘ、−Ｐｒｏ　−Ａｌａ　−Ｘ２−１１．ｅ　−Ｐｒｏ　−Ｔｙｒ［ 式中×１と×２とは各々１個のアミノ酸残基を示す。］（３）高速液体クロマト グラフィーでの保持時間ＴＳにゲルＧ　２０００　ＳＷカラム　（７，５ｍｍ　 ＩＤＸ６０ｃｍ）を用い、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ＰＨ６，０）　−５，５ Ｍ塩酸グアニジンを溶出液とし、流速０．５　ｍｕ／ｍ１Ｌｎ室温で溶出すると 本物質は２８分の位置に一本のピークとして認められた。H-Gin -His -Leu -Ala -Lys -Ser -Asn -Leu-X, -Pro -Ala -X2-11. e-Pro-Tyr [ In the formula, x1 and x2 each represent one amino acid residue. ] (3) High performance liquid chromatography Gel G 2000 SW column (7.5 mm IDX60cm), 0.1M sodium phosphate (PH6,0) -5,5 When eluted with M guanidine hydrochloride as the eluent and at a flow rate of 0.5 mu/ml at room temperature, This substance was observed as a single peak at the 28 minute position.

実施例２ ａ　）　ＹＫＢＳ−７−１５を選択クローニング株化したクローン株ＹＫＢＳ− ４８３を、通常の人工栄養培地である１０％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０ 培地（ＧＩＢＣＯ社製）　（８Ｊ２）中で３７℃、充分な期間攪拌培養後、１２ −０−テトラデカノイルフォルボール−１３−アセテート　（ＴＰＡ）を５部ｇ ／　ｍｕ添加することにより第１刺激を行い、培養３６時間後にエンドトキシン （大腸菌０１１１：　８４由来のりポボリサッカライド）１μｇ／ｍｆＬを加え て第２刺激を行い、培養１６時間後、遠心分離により培養上清を採取した。Example 2 a) Clone strain YKBS-, which is a selective cloning strain of YKBS-7-15 483 in RPM11640 containing 10% tallow serum, which is a regular artificial nutrient medium. After culturing with stirring for a sufficient period of time at 37°C in medium (manufactured by GIBCO) (8J2), 5 parts g of -0-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) /mu was added to perform the first stimulation, and after 36 hours of culture, endotoxin was added. (E. coli 0111: 84-derived paste pobolosaccharide) 1 μg/mfL was added. A second stimulation was performed, and after 16 hours of culture, the culture supernatant was collected by centrifugation.

該上滑を最終塩濃度が０．０４　Ｍ以下となるように２０ｍＭ　トリス−塩酸緩 衝液（ｐｉ　７．８）で希釈した後、０．０４Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液 （ｐ＋＋　７．８）であらかじめ平衡化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０ 陰イオン交換樹脂を充填したブフナー濾過器にバッチ方式で流し、非吸着画分を 得た。The supernatant was diluted with 20mM Tris-HCl so that the final salt concentration was 0.04M or less. After diluting with a buffer solution (pi 7.8), the same buffer containing 0.04M sodium chloride DEAE-Sephadex A-50 pre-equilibrated with (p++ 7.8) The non-adsorbed fraction was filtered in batch mode through a Buchner filter filled with anion exchange resin. Obtained.

ａ）−ｉ　このＤＥＡＥ−セファデックスへ−５０非吸着画分をペリコン限該濾 過濃縮装置を用いて濃縮した後、塩濃度を０．５Ｍ塩化ナトリウムに調整した。a)-i This DEAE-Sephadex-50 non-adsorbed fraction was filtered through a Pericon limited filter. After concentrating using a superconcentrator, the salt concentration was adjusted to 0.5M sodium chloride.

次いで、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液（ｐＨ７，８）であらかじめ平 衡化したコンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ）セファローズ樹脂カラムを用いたア フィニティークロマトグラフィーに付した。同緩衝液で充分洗浄し、非吸着画分 を除去した後、Ｃｏｎ　Ａ吸着画分をα−メチルマンノシド及び０．５Ｍ塩化ナ トリウムを含む２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）で溶出させた。Next, the solution was equilibrated in advance with the same buffer (pH 7, 8) containing 0.5M sodium chloride. Analysis using equilibrated concanavalin A (Con A) Sepharose resin column It was subjected to affinity chromatography. Wash thoroughly with the same buffer and separate the non-adsorbed fraction. After removing the Con A adsorbed fraction, α-methylmannoside and 0.5M sodium chloride were added. Elution was performed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7, 8) containing thorium.

このＣｏｎ　Ａ吸着画分を濃縮後２５ｍＭ　トリエタノールアミンーイミノ二酢 酸緩衝液（ｐ）！　８．１）で−夜透析した。その後、蛋白用高速液体クロマト グラフィーを用いたクロマトフオーカシング（ＦＰＬＣ，Ｍｏｎ。After concentrating this Con A adsorption fraction, 25mM triethanolamine-imino diacetic acid Acid buffer (p)! 8.1) - Night dialysis was performed. Then, high-performance liquid chromatography for proteins Chromatographic focusing (FPLC, Mon.

Ｐカラム、ファルマシア社製）に付し、ｐＨ８，１からｐ）１５．０の直線的濃 度勾配法により等電点分画すると等電点が約ｐ）Ｉ　７．０　（ＫＢＳ−β）と 約ｐＨ８，０以上の位置にＫＢＳ活性のピークが分離した。P column (manufactured by Pharmacia) to increase the linear concentration from pH 8.1 to p) 15.0. When the isoelectric point is fractionated using the degree gradient method, the isoelectric point is approximately p)I7.0 (KBS-β) A peak of KBS activity was separated at a position of approximately pH 8.0 or higher.

次いで、各々のＫＢＳ活性画分を集めた。ＫＢＳ−βの画分については、２５ｍ Ｍ　トリエタノールアミンーイミノニ酢酸緩衝液（ｐＨ８，１）で−夜透析後、 再度上記と同様にＦＰＬＣ，Ｍｏｎｏ　Ｐカラムによるクロマトフオーカシング に付すと、約ｐＨ７，０に一本のシャープなピークとして活性画分（にＢＳ−β ）か回収された。また、約ｐＨ８，０以上の位置にＫＢＳ活性を有する画分につ いては、２５ｍＭジェタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９，５）で−夜透析後 、再度ＦＰＬＣ，Ｍｏｎｏ　ＰカラムでｐＨ９，５からｐＨ６，８の直線的濃度 勾配法によりクロマトフオーカシングに付すと、約ｐＨ８，０に一本のシャープ なピークとして活性画分（にＢＳ−γ）が回収された。各々の活性画分のＬ　ｃ ｅｌｌに対する細胞障害活性としては、ＫＢＳ−βは合計４．０×１０’単位、 ＫＢＳ−γは合計１．ＯＸ　１０部単位であった。Then, each KBS active fraction was collected. For the KBS-β fraction, 25 m After overnight dialysis with M triethanolamine-iminodiacetic acid buffer (pH 8,1), Chromatofocusing using FPLC, Mono P column again as above When the active fraction (BS-β ) was recovered. In addition, regarding the fraction having KBS activity at a pH of approximately 8.0 or higher, After overnight dialysis with 25mM jetanolamine-hydrochloric acid buffer (pH 9.5) , linear concentration from pH 9.5 to pH 6.8 using FPLC and Mono P column again. When subjected to chromatofocusing using the gradient method, one sharp line was observed at approximately pH 8.0. The active fraction (BS-γ) was collected as a peak. L c of each active fraction In terms of cytotoxic activity against ELL, KBS-β has a total of 4.0 × 10' units, KBS-γ has a total of 1. OX was in units of 10 copies.

更に、このＫＢＳ−βの画分とＫＢＳ−γの画分の各々の一部をセファデックス Ｇ−２００（ファルマシア社製）のカラム　（φ５×１．４００ｍｍ）に付し、 分子篩法で分析したところにＢＳ−βは相対分子量６０，０００±１０，０００ 、　ＫＢＳ−γの相対分子量は６２，０００±１０．０００であった。Furthermore, a portion of each of the KBS-β fraction and KBS-γ fraction was treated with Sephadex. It was attached to a G-200 (manufactured by Pharmacia) column (φ5 x 1.400 mm), When analyzed using the molecular sieve method, the relative molecular weight of BS-β was 60,000±10,000. , the relative molecular weight of KBS-γ was 62,000±10.000.

ａ−ｉ　ｉ）一方、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０吸着画分は、０．１　Ｍ 塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）で溶出させ た。この吸着画分を濃縮した後、塩濃度を０．５Ｍ塩化ナトリカラムを用いたア フィニティークロマトグラフィーに付した。得られた（：ｏｎ　Ａ吸着画分を濃 縮し、−夜透析後、ＦＰＬＣ，Ｍｏｎｏ　ＰカラムでｐＨ８，１〜５．０の直線 的濃度勾配法によりクロマトフオーカシングに付し等電点分画すると、等電点が 約ｐＨ６，５（ＫＢＳ−α）の位置ににＢＳ活性がありだ。本活性画分のＬ　ｃ ｅｌｌに対するＫＢＳ−αの総細胞隙害活性は２．５ｘｌＯ’単位であった。a-i i) On the other hand, the DEAE-Sephadex A-50 adsorption fraction was 0.1 M Elute with 20mM Tris-HCl buffer (pH 7, 8) containing sodium chloride. Ta. After concentrating this adsorbed fraction, the salt concentration was adjusted using a 0.5M sodium chloride column. It was subjected to affinity chromatography. The obtained (:on A adsorption fraction was concentrated - After night dialysis, pH 8, 1-5.0 straight line with FPLC, Mono P column When the isoelectric point is fractionated by chromatofocusing using the concentration gradient method, the isoelectric point is BS activity is found at approximately pH 6.5 (KBS-α). Lc of this active fraction The total cytotoxic activity of KBS-α against ELL was 2.5×1O′ units.

更に、このＫＢＳ−αの画分の一部をセファデックスＧ−２００（ファルマシア 社製）のカラム（φ５　Ｘ　１．４００ｍｍ）に付し、分子篩法で分析したとこ ろにＢＳ−αの相対分子量は６０，０００±１０，０００であった。Furthermore, a part of this KBS-α fraction was treated with Sephadex G-200 (Pharmacia Co., Ltd.) column (φ5 x 1.400 mm) and analyzed using the molecular sieve method. The relative molecular weight of Roni BS-α was 60,000±10,000.

ｂ）　ＫＢＳ−βの画分を用いて、実施例１−ｂ）と同様に処理して相対分子量 が２２，５００±１，５００のｎ−ＫＢＳを得た。当該工程の収率は約２８％で あった。b) Using the fraction of KBS-β, process in the same manner as in Example 1-b) to determine the relative molecular weight. obtained an n-KBS of 22,500±1,500. The yield of this process is about 28%. there were.

また、ＫＢＳ−αの両分を用いて同様に処理しても同様にｎ−ＫＢＳを得た。In addition, n-KBS was obtained in the same manner when both parts of KBS-α were treated in the same manner.

実施例３ ａ　）　ＹＫＢＳ−７−１５のクローン株ＹＫＢＳ−４８３を無血清培地、ＨＢ 　１０１”（８１）中で３７℃、充分な期間攪拌培養後、ＴＰＡを５ｎｇ／ｍＪ Ｚ添加することにより第１刺激を行い、培養３６時間後にエンドトキシン（大腸 菌０１１１；　Ｂ４由来リポポリサッカライド）１μｇ／　ｍμを加えて第２刺 激を行い、培養１６時間後遠心分離により培養上清を採取した。Example 3 a) Clone strain YKBS-483 of YKBS-7-15 was grown in serum-free medium, HB After stirring culture for a sufficient period at 37°C in 101” (81), add 5 ng/mJ of TPA. The first stimulation was performed by adding Z, and after 36 hours of culture, endotoxin (large intestine) was added. Bacteria 0111; B4-derived lipopolysaccharide) 1μg/mμ was added to the second prick. After 16 hours of culture, the culture supernatant was collected by centrifugation.

該上滑をペリコン限外源Ａ濃縮装置で約２０倍に濃縮後、最終濃度５０％；　（ ｖ／ｖ）になるように飽和硫酸アンモニウム水溶液を徐々に添加した０次いで、 ４℃で充分沈殿を熟成せしめた後、遠心分離した２得られた沈殿を０．０４Ｍ塩 化ナトリウムを含む２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）の少量で溶解 した後、０．０４Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で上記したようにした。透析 後、０．０４Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液であらかじめ平衡化したＤＥＡＥ −セファデックスＡ−５０陰イオン交換樹脂を充填したブフナー濾過器に付し、 ０．０８Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液（ｐＨ７，８）で溶出した。After concentrating the supernatant by approximately 20 times using a Pellicon ultrasource A concentrator, the final concentration was 50%; ( Then, a saturated ammonium sulfate aqueous solution was gradually added so that the After sufficiently ripening the precipitate at 4°C, the precipitate was centrifuged. Dissolve in a small amount of 20mM Tris-HCl buffer (pH 7, 8) containing sodium chloride. After that, the same buffer containing 0.04M sodium chloride was used as described above. dialysis After that, DEAE equilibrated in advance with the same buffer containing 0.04M sodium chloride - subjected to a Buchner filter filled with Sephadex A-50 anion exchange resin, Elution was performed with the same buffer (pH 7, 8) containing 0.08M sodium chloride.

このＤＥＡＥ−セファデックスへ−５０溶出画分もベリコン限外！？。This DEAE-Sephadex-50 elution fraction is also beyond the limit of Vericon! ? .

濃縮装置を用いて濃縮した後、塩濃度を０．５Ｍ塩化ナトリウムに調整した。次 いで０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液（ｐＨ７，８）であらかじめ平衡化 したコンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ）セファローズ柑脂カラムを用いたアフィ ニティークロマトグラフィーに付した。After concentrating using a concentrator, the salt concentration was adjusted to 0.5M sodium chloride. Next Equilibrate in advance with the same buffer (pH 7, 8) containing 0.5M sodium chloride. Affiliated Concanavalin A (Con A) Sepharose Citrus Column It was subjected to nitty chromatography.

同緩衝液で洗浄し非吸着画分を得た。この（：ｏｎ　Ａ非吸着画分を濃縮後２５ ｍＭ　トリエタノールアミンーイミノニ酢酸緩衝液（ｐＨ８−１）で−夜透析し てＫＢＳ−β及びＫＢＳ−γを含む両分を得た。これらの両分をクロマトフオー カシング（ＦＰＬ（：、Ｍｏｎｏ　Ｐカラム、ファルマシア社製）に付し、直線 的濃度勾配法により等電点分画すると、等電点的７．０（ＫＢＳ−β）′Ｅ１． び約８．０（ＫＢＳ−γ）の位置にＫＢＳ活性が認められた。The non-adsorbed fraction was obtained by washing with the same buffer. After concentrating this (:on A non-adsorbed fraction) Dialyzed overnight with mM triethanolamine-iminodiacetic acid buffer (pH 8-1). Both components containing KBS-β and KBS-γ were obtained. Both parts were chromatographed. Cushing (FPL (:, Mono P column, manufactured by Pharmacia), straight line When the isoelectric point is fractionated by the concentration gradient method, the isoelectric point is 7.0 (KBS-β)'E1. KBS activity was observed at positions of approximately 8.0 and 8.0 (KBS-γ).

ｂ）　ＫＢＳ−β及びＫＢＳ−γを含む画分を用いて実施例１−ｂ）と同様に処 理して相対分子量２２．５００±１，５００のｎ−ＫＢＳを得た。b) Treat in the same manner as in Example 1-b) using fractions containing KBS-β and KBS-γ. n-KBS with a relative molecular weight of 22.500±1,500 was obtained.

溪　１　目 碇１はＩゴ）３ 写Ｌω 国際調査報告 −〜［有］−＾−一（峠ψＩＩＩＩ・ＰＣＴ／、ｆｆＰ　８６１０００１１ＡＮ ＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮτＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＳＥｌ”、ＲＣＨＲＥＰ ＯＲτ０ＮＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、　Ｐ ＣＴ／ＪＰ　８６１０００１１　（ＳＡ　１１８１８）頁の続き １■ｎｔ、Ｃ１，４識別記号　庁内整理番号明　者　里　見　信　子　東京都目 黒区大橋１−詩表１１胚３−５００３７Ｇ　（９） −１−１１−１１０３パラスト上目黒Kei 1st Anchor 1 is Igo) 3 Photograph Lω international search report -~ [Yes] -^-1 (Toge ψIII/PCT/, ffP 86100011AN NEX To THE INτERNATIONAL SEL”, RCHREP ORτ0NINTERNATIONAL APPLICATION No, P Continuation of CT/JP 86100011 (SA 11818) page 1 ■ nt, C1, 4 identification symbol Internal reference number person Nobuko Satomi Tokyo-me Kuro-ku Ohashi 1-Shijo 11 Embryo 3-50037G (9) -1-11-1103 Palast Kamimeguro

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）分子量が１７，０００〜３０，０００の範囲の低分子ヒト内来性癌制御因 子。(1) Low-molecular human endogenous cancer regulators with a molecular weight in the range of 17,000 to 30,000 Child. （２）分子量が２２，５００±１，５００の範囲である請求の範囲第（１）項に 記載の低分子ヒト内来性癌制御因子。(2) In claim (1), the molecular weight is in the range of 22,500±1,500. The described small molecule human endogenous cancer regulator. （３）臭化シアン分解で分子量約１８，５００を主断片ペプチドとし、且つ下記 の部分アミノ酸配列を有する請求の範囲第（１）項又は第（２）項に記載の低分 子ヒト内来性癌制御因子。 部分アミノ酸配列：【配列があります】（式中Ｘ１とＸ２とは各々１個のアミノ 酸残基を示す）。(3) By cyanogen bromide decomposition, the main fragment peptide has a molecular weight of approximately 18,500, and the following The lower amino acid according to claim (1) or (2), having a partial amino acid sequence of Child human endogenous cancer regulators. Partial amino acid sequence: [There is a sequence] (In the formula, X1 and X2 each represent one amino acid (indicates acid residue). （４）ヒト内来性癌制御因子を産生するヒト由来の単球系細胞またはそのクロー ン株を組織培養系で培養し、分子量が５０，０００〜９２，０００の範囲で等電 点がｐＨ６．０〜８．５の範囲のヒト内来性癌制御因子を生成させ、次いでこの ヒト内来性癌制御因子を還元剤及び／又はタンパク質変性剤で処理することを特 徴とする低分子ヒト内来性癌制御因子の製造法。(4) Human-derived monocytic cells or clones thereof that produce human endogenous cancer control factors The strain was cultured in a tissue culture system, and the isoelectric A human endogenous cancer regulator with a pH range of 6.0 to 8.5 is produced, and then this Special treatment of human endogenous cancer regulators with reducing agents and/or protein denaturing agents. A method for producing a small molecule human endogenous cancer regulator. （５）分子量が５０，０００〜９２，０００の範囲で等電点がｐＨ６．０〜８． ５の範囲のヒト内来性癌制御因子を還元剤及び／又はタンパク質変性剤で処理す ることを特徴とする低分子ヒト内来性癌制御因子の製造法。(5) The molecular weight is in the range of 50,000 to 92,000 and the isoelectric point is in the range of pH 6.0 to 8. 5 human endogenous cancer regulators are treated with reducing agents and/or protein denaturing agents. 1. A method for producing a low molecule human endogenous cancer regulatory factor. （６）請求の範囲（１）、（２）又は（３）に記載の低分子ヒト内来性癌制御因 子を含む薬剤組成物。(6) Low molecule human endogenous cancer control factor according to claim (1), (2) or (3) A pharmaceutical composition comprising a child.